專利名稱：：初級微rna表達(dá)盒的制作方法初級微RNA表達(dá)盒
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及病毒基因表達(dá)的抑制。具體而言，本發(fā)明涉及采用RNA序列抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的方法。在該方法中采用含有來自于內(nèi)源微RNAs(miRs)序列的表達(dá)構(gòu)建體以產(chǎn)生對HBV序列特異性沉默的序列。RNA干擾(RNAi)是對雙鏈RNA的保守進(jìn)化生物反應(yīng)，其已在植物[1]，無脊椎動物[24]和哺乳動物細(xì)胞[5]中描述過。RNAi功能為直接抑制與內(nèi)源或引入的RNAi效應(yīng)子具有同源序列的基因表達(dá)[6]而對無關(guān)序列的基因沒有影響[7，8]。RNAi被認(rèn)為是一個古老的響應(yīng)途徑，其在調(diào)控蛋白編碼基因的表達(dá)中發(fā)揮作用[8]并介導(dǎo)了對內(nèi)源寄生和外源病原核酸的抗性。天然存在的能激活RNAi的小RNAs是微RNAs(miRs)復(fù)合網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的一部分，其是在實現(xiàn)基因表達(dá)沉默之前由Drosha和Dicer加工而成。這些miRs通過調(diào)控特定細(xì)胞mRNAs的翻譯而發(fā)揮其影響[9]。Dicer對'rogue'雙鏈病毒和細(xì)胞RNA的加工也可導(dǎo)致短干擾RNAs的形成[10-12]。這些siNRAs通常是21_23bp并在3'端具有2個核苷酸突出[13]且激活RNAi以實現(xiàn)潛在有害RNA的沉默。首先采用PolII轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列和RNA聚合酶II將miR序列從細(xì)胞DNA序列轉(zhuǎn)錄成初級miRs(pri-miRs)。Drosha對pri-miRs的加工形成了前體miRs(pre-miRs)，其在成熟miRs(大約22nt長度)誘導(dǎo)基因表達(dá)沉默之前被胞內(nèi)Dicer切開。Drosha和Dicer都是RNAi途徑正常功能化所必需的RNaseIII酶[14]。已經(jīng)報道了RNAi的轉(zhuǎn)錄后沉默作用比核酶或反義RNA作用都更有效[15]。為引起基因沉默，將miRs或siRNA的一條鏈引入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)中。在其他亞單位[17，18]中RISC包括Ago2(—種RNA內(nèi)切核酸)和解旋酶[16]。利用miR或siRNA的反義鏈作為雜交指導(dǎo)序列，RISC識別靶mRNA[lO，19]。通常地，如果指導(dǎo)序列與其同源物完全互補(bǔ)，會發(fā)生靶的裂解。如果在RISC內(nèi)雜交存在錯配，則會發(fā)生翻譯的抑制。在哺乳動物細(xì)胞中也表現(xiàn)出由siRNA介導(dǎo)的啟動子DNA序列的甲基化的基因沉默會降低基因的轉(zhuǎn)錄[20]。時至今日，在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行RNAi仍是一個難題。長于30個堿基對的雙鏈RNAs可觸發(fā)非特異性的干擾素響應(yīng)途徑，該途徑是由dsRNA依賴的蛋白激酶(PKR)[21]和2'，5'-低聚腺苷酸合成酶(2'5'0AS)[22]的活化所介導(dǎo)的。該響應(yīng)途徑造成翻譯的全面抑制并最終導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡[23]。為誘導(dǎo)特異性的和明顯的基因沉默，精確大小的siRNA或短發(fā)夾RNA(shRNA)片段的細(xì)胞內(nèi)遞送或產(chǎn)生是很重要的。通過將以短合成退火低聚核苷酸(<30bp)的siRNAs直接導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞中，Tuschl和同事能夠成功地繞開干擾素途徑并在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中實現(xiàn)RNAi[15]。許多實現(xiàn)了基因沉默的研究中都采用了預(yù)合成的RNAs。通常地，在體外將互補(bǔ)RNA低聚核苷酸退火以產(chǎn)生外源的siRNA用于遞送至細(xì)胞內(nèi)。因為合成的低聚核糖核苷酸不會天然地在于細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)充，為保持足夠的胞內(nèi)濃度以具有持續(xù)活性，需要定期給予這些分子?？蓪铣傻牡途酆颂呛塑账徇M(jìn)行化學(xué)修飾以保持其在生理流體內(nèi)的壽命。但是，這種修飾可能在體內(nèi)具有毒副作用[24]。大量的研究結(jié)果表明siRNA在體內(nèi)被表達(dá)成獨立的正義和反義RNA鏈[25，26]，shRNAs[27-31]或天然存在miRs的衍生物[32，33]。miR基6因的轉(zhuǎn)錄會自然產(chǎn)生pri-miR序列，其在核內(nèi)被Drosha酶加工形成pre-miR。然后通過輸出蛋白5的途徑將pre-miR轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)中，在那其被Dicer加工形成成熟的miR。因為對參與miR表達(dá)的啟動子所知甚少，大部分研究都采用U6核內(nèi)小RNA[34]啟動子[27]或更緊密的的HI啟動子[8]或tRNAVal啟動子[35]。這些啟動子可被RNA聚合酶III識別，并能在結(jié)構(gòu)上形成RNAi的效應(yīng)子。PolIII啟動子具備包含所有轉(zhuǎn)錄起始位點上游控制元件的優(yōu)勢，這能形成可產(chǎn)生確定長度的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)盒。但是，PolIII啟動子轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)活化特性可引起正常細(xì)胞RNAi途徑的飽和和生成毒性[36]。PolIII啟動子可誘導(dǎo)組織或細(xì)胞類型特異性的RNA表達(dá)，但在轉(zhuǎn)錄起始位點下游控制元件的要求上不具有優(yōu)勢。從而除了有效治療RNA之外，來自調(diào)控元件的附加序列也包含在轉(zhuǎn)錄物中。之前的研究顯示了這些附加序列抑制傳統(tǒng)shRNA分子的功能[37]。事實上，轉(zhuǎn)錄shRNAs，或單獨的正義和反義siRNA鏈的沉默作用是被存在于5'端的在轉(zhuǎn)錄啟動位點和21個堿基對發(fā)夾之間的小至9個額外堿基所破壞導(dǎo)致的[37]。目前無法實現(xiàn)由PolII轉(zhuǎn)錄方便地產(chǎn)生功能性RNAi效應(yīng)子?；瘜W(xué)合成RNA，體外轉(zhuǎn)錄和采用基于PolIII的表達(dá)盒目前都是產(chǎn)生精確長度的短RNA的優(yōu)選方法。除非另外指明，此處所用術(shù)語具有本領(lǐng)域公知的意義。根據(jù)它們的用途，以下術(shù)語具有如下定義。轉(zhuǎn)錄由DNA模板產(chǎn)生RNA的過程。核酸術(shù)語"核酸"表示單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有限定，包括以類似于天然存在核苷酸的方式與核酸雜交的天然核苷酸的類似物。除非另外指明，特定核酸序列包括其互補(bǔ)序列。表達(dá)盒"重組表達(dá)盒"或簡稱的"表達(dá)盒"是與允許細(xì)胞中特定核酸轉(zhuǎn)錄的核酸元件重組或合成形成的核酸結(jié)構(gòu)。重組表達(dá)盒可以是質(zhì)粒，病毒或核酸片段的一部分。通常地，重組表達(dá)盒包括要轉(zhuǎn)錄的核酸，可操作的連接啟動子。在一些實施方式中，表達(dá)盒還可包括復(fù)制起點和/或染色體整合元件(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR)?？刹僮鞯倪B接術(shù)語"可操作的連接"表示在核酸表達(dá)控制序列(例如啟動子，增強(qiáng)子或一組轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點)和第二核酸序列之間的功能性連接，其中表達(dá)控制序列指導(dǎo)對應(yīng)于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。啟動子啟動子是一組DNA控制序列，其參與了RNA聚合酶的結(jié)合以啟動核酸轉(zhuǎn)錄。如此處所用的，啟動子包括接近轉(zhuǎn)錄啟動位點的必需核酸序列。啟動子還任選地包括遠(yuǎn)側(cè)增強(qiáng)子或阻遏子元件，其可位于離轉(zhuǎn)錄啟動位點長達(dá)幾千個堿基對之處。PolII啟動子PolII啟動子是包括可被RNA聚合酶II識別以便由該酶啟動轉(zhuǎn)錄的元件。PolII啟動子通常包括特征元件，如TATA盒。PolIII啟動子PolIII啟動子是包括可被RNA聚合酶III識別以便由該酶啟動轉(zhuǎn)錄的元件。轉(zhuǎn)錄終止信號轉(zhuǎn)錄終止信號是終止轉(zhuǎn)錄的DNA序列。這些元件對于RNA聚合酶II和RNA聚合酶III是不同的。RNA干擾該過程是雙鏈核酸(包括miR、siRNA、shRNA)的表達(dá)引起互補(bǔ)RNA的序列特異性降解，序列特異性翻譯抑制或轉(zhuǎn)錄基因沉默。耙點識別序列如此處所使用的，術(shù)語"靶點識別序列"是指來自于基因的序列，在本發(fā)明中該序列被設(shè)計成可抑制，阻斷或防止基因表達(dá)，酶活性或與其它細(xì)胞或病毒因子的相互作用。指導(dǎo)序列被并入RISC的來自于RNAi效應(yīng)子，例如miR、siRNA、shRNA的短單鏈RNA片段，其負(fù)責(zé)靶RNA在靶點識別序列的序列特異性降解或翻譯抑制。RNAi效應(yīng)子能弓I發(fā)RNAi的包含其前體的任何RNA序列(例如，shRNA、miR和siRNA)。RNAi效應(yīng)子加工單元包括RNA效應(yīng)子以及加工單元(例如錘頭核酶)序列的RNA。RNAi效應(yīng)子加工盒具有可操作連接啟動子的RNAi效應(yīng)子加工單元。RNAi前體被加工形成指導(dǎo)序列，然后被并入RISC并實現(xiàn)RNAi的任何RNA種類。Dicer—種RNAaseIII酶，其消化雙鏈RNA并負(fù)責(zé)RNAi前體的成熟。例如，Dicer是負(fù)責(zé)作用于pre-miRs以形成成熟miR。DroshaDrosha是能形成可識別特異性pri-miR二級結(jié)構(gòu)以切除和釋放大約60_80nt的pre-miR序列的核微處理器復(fù)合物部分的RNaseIII酶。RNAi編碼序列當(dāng)其表達(dá)時可引發(fā)RNA干擾的核酸序列。Pri-miRPri-miR通常是來自于PolII轉(zhuǎn)錄的初級miR轉(zhuǎn)錄物。這些序列可源于獨立miR轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄物包括大于一個的miR前體或內(nèi)含miR前體。這些序列通常被細(xì)胞核內(nèi)的Drosha力口工以產(chǎn)生pre-miR。Pre-miRPre-miR是由Drosha加工pri-miR的產(chǎn)物。pre-miRs通常是60_80nt的長度。pre-miRs是由輸出蛋白_5從細(xì)胞核輸出的。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRs由Dicer加工以形成成熟miR。miRmiRs是大約22nt長度的小RNA分子，其來自于pri-miR和之后的pre-miR序列的加工。miR表達(dá)盒miR表達(dá)盒是指能編碼可模仿內(nèi)源miR的DNA序列。pri-miR轉(zhuǎn)錄物是由該盒產(chǎn)生的并由細(xì)胞機(jī)制加工以產(chǎn)生pre-miR和成熟miR。Pri-miR表達(dá)盒編碼pri-miR序列的核酸結(jié)構(gòu)。shRNA短發(fā)夾RNA(shRNA)是由自身回疊以使來自兩個分離片段的核苷酸形成堿基對的短序列單鏈RNA，得到的結(jié)構(gòu)形如其名。shRNA是Dicer的底物并實現(xiàn)RNAi(發(fā)夾的雙鏈結(jié)構(gòu)區(qū)可包含堿基錯配即非AU或GC對)。siRNA小干擾RNA(siRNA)是由短雙鏈RNA分子組成。siRNA分子通常含有在3'端具有2nt的突出的19bp雙螺旋區(qū)。一條鏈被并入細(xì)胞質(zhì)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)。這指導(dǎo)由RISC實現(xiàn)的序列特異性RNA切除。siRNA指導(dǎo)和其靶點之間的錯配可引起翻譯抑制以取代RNA切除。siRNA可被合成或來自于Dicer對前體的加工。shRNA前體shRNA前體是由Dicer胞內(nèi)加工以產(chǎn)生shRNA分子的發(fā)夾RNA序列。多聚體盒單體單元的串聯(lián)排列，其可包括miR的編碼序列。電子的(insilico)電子的是指在試管(或相當(dāng)?shù)娜萜?中進(jìn)行反應(yīng)且不存在活體細(xì)胞的實驗室條件。單體單元編碼一個RNAi效應(yīng)子序列的成分的核酸序列。子序列在本文中特定核酸序列的術(shù)語"子序列"表示等于或小于所述特定核酸，或其部分的核酸區(qū)。體外轉(zhuǎn)錄采用含有RNA聚合酶和RNA前體的實驗室培養(yǎng)基將DNA分子轉(zhuǎn)錄成RNA分子。胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄在活體細(xì)胞內(nèi)DNA分子轉(zhuǎn)錄成RNA分子。體內(nèi)轉(zhuǎn)錄在活生物體內(nèi)DNA分子轉(zhuǎn)錄成RNA分子。雜交所要求保護(hù)的核酸可在足夠嚴(yán)謹(jǐn)度條件下特異性地與此處公開的核酸雜交。特異性或選擇性雜交是核酸與靶核酸的結(jié)合具有最小背景的雜交，并且對非靶核酸進(jìn)行非特異性雜交。實現(xiàn)選擇性雜交的雜交嚴(yán)謹(jǐn)度通常是比Tm(—半分子與其配對鏈解鏈的熔解溫度)低大約5t:-2(rc，但其由溶液的鹽濃度和介電常數(shù)進(jìn)一步確定。雜交溫度通常高于DNA-RNA和RNA-RNA雜交。如本領(lǐng)域所知的，清洗溫度可類同用于實現(xiàn)選擇性嚴(yán)謹(jǐn)度的(Sambrooketal.，1987)。發(fā)明才既述本發(fā)明描述了可通用方法，該方法將天然存在miRs的特征并入表達(dá)盒內(nèi)，以允許由PolII或PolIII啟動子形成RNAi效應(yīng)子。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供的pri-miR表達(dá)盒包括含有預(yù)定長度的調(diào)控包含在pri-miR序列內(nèi)的靶基因表達(dá)的RNAi效應(yīng)子序列的pri—miR序歹廿。pri-miR表達(dá)盒可在細(xì)胞內(nèi)由PolII或PolIII啟動子表達(dá)。換而言之，廣泛地提供了pri-miR表達(dá)盒，其包括選擇以產(chǎn)生RNAi效應(yīng)子序列的單體單元，禾口可以由PolII或PolIII啟動子表達(dá)的所述的表達(dá)盒。RNAi效應(yīng)子序列可以是miR編碼序列或shRNA編碼序列。pri-miR表達(dá)盒可以是多聚體RNA表達(dá)盒?？刹捎每刹僮鬟B接的PolII或PolIII啟動子表達(dá)RNA表達(dá)盒。單體單元可包括miR-30、miR-31-或miR-122衍生序列。在一個優(yōu)選實施方式中，RNA表達(dá)盒可包括編碼RNAi效應(yīng)子以選擇耙點的所述的miR-30、miR-31-或miR-122衍生序列。RNA表達(dá)盒可包括任意數(shù)量的單體單元。RNA表達(dá)盒可包括除了第一pri-miR衍生序列外，至少一個另外的pri-miR衍生序列；禾口在不同于pri-miR序列的情況下，至少一個另外的編碼RNAi效應(yīng)子的序列。pri-miR表達(dá)盒可包括離散的編碼引發(fā)序列特異性翻譯抑制的RNAi效應(yīng)子分子的序列組。pri-miR表達(dá)盒可包括離散的編碼引發(fā)序列特異性轉(zhuǎn)錄沉默的RNAi效應(yīng)子分子的序列組。實現(xiàn)序列特異性翻譯抑制的siRNA序列或RNAi前體分子可包括來自于乙型肝炎病毒(HBV)X基因(HBx)或丙型肝炎病毒(HCV)的靶點識別序列。所述靶點識別序列可來自于HBVHBx基因的至少兩個特異性位點。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了分離的編碼本發(fā)明pri-miR表達(dá)盒的核酸序列。所述核酸序列可包括選自由SEQIDNos:3、4、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、38、39和106，其互補(bǔ)序列(SEQIDNO:109-131和169-171)或其RNA序列(SEQIDNO:135-163、167、168和172)組成的組中的至少一個序列。所述核酸序列可包括SEQIDNO:3或135;與SEQIDNO:3或135互補(bǔ)的核酸序列；與SEQIDNO:3或135特異性雜交的核酸序列；嗜肝DNA病毒的同源序列；或與所述序列之一具有至少90%序列同一性的核酸序列。所述核酸序列可包括SEQIDNO:4或136;與SEQIDNO:4或136互補(bǔ)的核酸序列；與SEQIDNO:4或136特異性雜交的核酸序列；嗜肝DNA病毒的同源序列；或與所述序列之一具有至少90%序列同一性的核酸序列。優(yōu)選地，所述核酸序列與所述序列具有至少95%的序列同一性。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了編碼靶序列的核酸序列，其中所述核酸序列是5'_CCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTG-3'(SEQIDNO:38);互補(bǔ)的核酸序列；與所述序列特異性雜交的核酸序列；或與所述序列之一具有至少90%的序列同一性的核酸序列。核酸序列與所述序列具有至少95%的序列同一性。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了編碼靶序列的核酸序列，其中所述核酸序列是5'_TGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGT-3'(SEQIDNO:39);互補(bǔ)的核酸序列；與所述序列特異性雜交的核酸序列；或與所述序列之一具有至少90%的序列同一性的核酸序列。所述核酸序列與所述序列具有至少95%的序列同一性。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了抑制至少一個具有至少一個靶點識別序列的靶RNA轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的方法，該方法包括如下步驟提供編碼具有本發(fā)明pri-miR表達(dá)盒的表達(dá)結(jié)構(gòu)的核酸序列，其中miRs特異性識別位點的RNAi效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域在耙點內(nèi)；表達(dá)編碼pri-miR表達(dá)盒的核酸序列以產(chǎn)生成熟miR;使加工的RNAi效應(yīng)子分子接觸至少一個靶RNA轉(zhuǎn)錄物，以RNAi效應(yīng)子分子指導(dǎo)靶RNA轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的抑制。表達(dá)所述核酸序列的步驟，使切除RNAi效應(yīng)子分子或其前體以接觸至少一個靶RNA轉(zhuǎn)錄物并抑制耙RNA轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的步驟可基本同時發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，提供了并入編碼本發(fā)明pri-miR表達(dá)盒的核酸序列的載體。所述載體可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適宜載體，例如病毒或非病毒載體。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，提供了包括本發(fā)明載體和生理可接受介質(zhì)的組合物。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，提供了包括編碼本發(fā)明RNAi效應(yīng)子序列或其前體的RNA序列的細(xì)胞。本發(fā)明還擴(kuò)展至包括編碼可衍生出本發(fā)明RNAi效應(yīng)子分子的RNA序列的DNA的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包括上述載體的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了調(diào)控DNA表達(dá)的方法，該方法包括如下步驟將并入編碼本發(fā)明pri-miR表達(dá)盒的核酸序列的載體導(dǎo)入細(xì)胞，其中RNAi效應(yīng)子序列，或其子序列識別含有至少一個靶點識別序列或其子序列的至少一個靶RNA轉(zhuǎn)錄物；和使載體表達(dá)編碼pri-miR表達(dá)盒的核酸序列，并在表達(dá)時將RNA表達(dá)盒或其子序列被切割成其RNAi效應(yīng)子，因此加工的RNAi效應(yīng)子識別靶RNA轉(zhuǎn)錄物，從而抑制靶序列或其子序列的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了體內(nèi)抑制DNA表達(dá)的方法，該方法包括如下步驟將載體導(dǎo)入生物體內(nèi)，其中所述載體中并入了編碼本發(fā)明pri-miR表達(dá)盒的核酸序列，其中RNAi效應(yīng)子序列，或其子序列識別含有包含RNA干擾識別位點的至少一個靶點識別序列或其子序列的至少一個靶RNA轉(zhuǎn)錄物；禾口使載體表達(dá)編碼pri-miR表達(dá)盒或其子序列的核酸序列，并在表達(dá)時將RNA表達(dá)盒或其子序列切割成其RNAi效應(yīng)子前體序列，因此RNAi效應(yīng)子識別靶RNA轉(zhuǎn)錄物，從而抑制靶序列或其子序列的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了體內(nèi)抑制DNA表達(dá)的方法，該方法包括如下步驟將載體導(dǎo)入生物體內(nèi)，其中所述載體中并入了編碼本發(fā)明pri-miR表達(dá)盒的核酸序列，其中RNAi效應(yīng)子序列，或其子序列識別含有包含抑制識別位點的至少一個靶點識別序列或其子序列的至少一個靶DNA序列；禾口使載體表達(dá)編碼pri-miR表達(dá)盒或其子序列的核酸序列，并在表達(dá)時將RNA表達(dá)盒或其子序列切割成RNAi效應(yīng)子前體序列，因此RNAi效應(yīng)子抑制靶序列的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了體外抑制DNA表達(dá)的方法，該方法包括如下步驟將載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，其中所述載體中并入了編碼本發(fā)明pri-miR表達(dá)盒或其子序列的核酸序列，其中RNAi效應(yīng)子序列，或其子序列識別含有包含RNA干擾識別位點的至少一個耙點識別序列或其子序列的至少一個耙RNA轉(zhuǎn)錄物；禾口使載體表達(dá)編碼pri-miR表達(dá)盒或其子序列的核酸序列，并在表達(dá)時將RNA表達(dá)盒或其子序列切割成RNAi效應(yīng)子前體序列，因此RNAi效應(yīng)子識別靶RNA轉(zhuǎn)錄物，從而抑制靶序列的表達(dá)。多聚體pri-miR表達(dá)盒可包括任意數(shù)量的單體單元。靶點識別序列可來自于乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)的HBx開放式讀碼框。具體而言，RNAi效應(yīng)子序列的靶點識別序列可來自于位于HBV的HBx開放式讀碼框之內(nèi)的至少兩個區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了此處所述的pri-miR表達(dá)盒在制備治療乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染，或由此而引起的疾病的制劑中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于治療乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染，或由此引起的疾病的方法中的組合物，所述組合物包括此處所述的pri-miR表達(dá)盒，所述方法包括給予有效治療劑量的所述組合物。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了治療乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染，或由此引起的疾病的方法，所述方法包括將有效治療劑量的本發(fā)明pri-miR表達(dá)盒給予受試者?，F(xiàn)在將參照所附圖片通過非限制實施例的方式描述本發(fā)明。在附圖中圖1A顯示了具有由典型抗HBVmiRs耙向位點的乙型肝炎病毒(HBV)基因組的結(jié)構(gòu)。基因組的核苷酸協(xié)調(diào)與單個EcoRI限制酶切位點有關(guān)。部分雙鏈HBVDNA包含具有粘性互補(bǔ)5'端的+和-鏈。調(diào)整HBV轉(zhuǎn)錄的順式元件由圓形和矩形符號指示。緊靠的圍繞箭頭表示包括整個基因組的病毒開放式讀碼框(具有起始密碼子)。四個外周箭頭指示了HBV轉(zhuǎn)錄物，其具有包含HBx的普通3'端。圖IB顯示了抗HBVmiRDNA表達(dá)盒的示意圖(未按比例)。指示了PolII(CMV)或PolIII(U6)啟動子、miR-31/5-或miR-122/5-編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列的排列。并圖示了初級miR(pri-miR)、前體miR(pre-miR)和miR轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生和加工。圖2顯示了pri-miR-31和pri-miR-122以及典型的抗HBV衍生物pri-miR-31/5和pri-miR-122/5的結(jié)構(gòu)和序列的示意圖。Drosha加工后產(chǎn)生的推定pre-miRs的序列以彩色(紫色和紅色)指示，而Dcier加工和由RISC鏈選擇之后產(chǎn)生的成熟加工指導(dǎo)序列僅用紅色表示。pri-miR-31/5的抗HBV指導(dǎo)靶向HBV等同物(coordinate)1575-1595，而pri-miR-122/5耙向HBV等同物(coordinate)1575-1597。圖3顯示了從用編碼所示miR或shRNA盒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染之后的HEK293細(xì)胞中提取的表達(dá)miR穿梭序列的Northern印跡雜交分析。雜交是放射性標(biāo)記探針與推定成熟抗HBV指導(dǎo)5鏈的互補(bǔ)。典型的雜交信號檢測成熟miRs的前體。將印跡剝離并和與內(nèi)源U6snRNA互補(bǔ)的探針再雜交以證實細(xì)胞RNA的等量負(fù)載(a、b、c的下面的組)。圖4顯示了采用NORTHERN印跡分析檢測由表達(dá)抗HBVmiRs產(chǎn)生的加工siRNA序列。雜交是放射性標(biāo)記探針與成熟miR-31/5序列的互補(bǔ)(上面的組)。從被含有所示的CMV(PolII)或U6(PolIII)pri-miR表達(dá)盒的質(zhì)粒載體所轉(zhuǎn)染的被轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞中提取RNA。將印跡剝離并和與內(nèi)源U6snRNA互補(bǔ)的探針再雜交以證實細(xì)胞RNA的等量負(fù)載(下面的組)。圖5顯示了采用NORTHERN印跡分析檢測由表達(dá)抗HBVmiRs產(chǎn)生的加工siRNA序列。雜交是放射性標(biāo)記探針與成熟miR-122/5序列的互補(bǔ)(上面的組)。從被含有所示的CMV(PolII)或U6(Polin)表達(dá)盒的質(zhì)粒載體所轉(zhuǎn)染的被轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞中提取RNA。將印跡剝離并和與內(nèi)源U6snRNA互補(bǔ)的探針再雜交以證實細(xì)胞RNA的等量負(fù)載(下面的組)。圖6顯示了從轉(zhuǎn)染Huh7肝細(xì)胞的HBsAg分泌物。圖6A圖示了具有開放式讀碼框和位于pCH-9/3091耙載體內(nèi)位點的HBV基因組結(jié)構(gòu)，所述pCH-9/3091耙載體是與miR-31/5和miR-122/5表達(dá)載體的加工產(chǎn)物互補(bǔ)的病毒序列靶點。四個平行箭頭指示了HBV轉(zhuǎn)錄物，其含有普通的3'端，并包含miR-31/5和miR-122/5靶點。圖6B顯示了由以所示miR-或shRNA編碼質(zhì)粒和HBV靶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞分泌的HBsAg相關(guān)數(shù)據(jù)。以定量ELISA的HBsAg測量值作為對應(yīng)于模擬處理細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)平均值。結(jié)果來自于4次獨立轉(zhuǎn)染而線條指示了平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)。圖7A圖示了具有HBV序列以及螢火蟲熒光素酶開放式讀碼框的pCH螢火蟲Luc耙載體的結(jié)構(gòu)。由miR-31/5和miR-122/5耙向的位點以箭頭指示。圖7B顯示了在以所示miR編碼質(zhì)粒和組成型活性海腎(Renilla)熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶報告基因活性。以給出的測量值作為螢火蟲與Renilla熒光素酶活性的標(biāo)準(zhǔn)化比值(±SEM)，其是由3次獨立實驗測量而得。圖8顯示了在HBV復(fù)制的動力進(jìn)樣模型中miR序列對HBV復(fù)制的標(biāo)記的影響。在用pCH-9/3091HBV耙點和CMVmiR-31/5、CMVmiR_122/5或U6shRNA5質(zhì)粒對小鼠動力進(jìn)樣之后3和5天測量血清HBsAg濃度。將對應(yīng)于模擬處理小鼠的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化并以來自至少5只小鼠的值表示為平均值(士SEM)。圖9顯示了在HBV復(fù)制的動力進(jìn)樣模型中miR序列對HBV復(fù)制的的標(biāo)記影響。在用pCH-9/3091HBV耙點和CMVmiR_31/5、CMVmiR-122/5或U6shRNA5質(zhì)粒對小鼠動力進(jìn)樣之后3和5天測量病毒顆粒等效物(VPEs)。采用具有Euroh印校對標(biāo)準(zhǔn)的實時PCR測定循環(huán)基因組等效物的數(shù)量。將對應(yīng)于模擬處理小鼠的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化并以來自至少5只小鼠的值表示為平均值(士SEM)。圖IO顯示了由經(jīng)歷HDI程序(下面的組)的每組小鼠中的2只代表動物中提取的HBVDNA復(fù)制中間體的Southern印跡雜交分析。小鼠被注射了所示的質(zhì)粒和pCH9/3091HBV復(fù)制子感受態(tài)耙。僅在模擬處理動物中可檢測到HBV雙鏈(DS)和單鏈(SS)復(fù)制中間體，而在一起注射了CMVmiR-31/5、CMVmiR-122/5或U6shRNA5質(zhì)粒的任何小鼠中都檢測不到。在模擬處理小鼠中檢測到的HBVDNA帶與任意pCH9/3091帶的大小都不相對應(yīng)。下面的組是表示溴化乙啶染色后且Southern轉(zhuǎn)移和雜交之前分離的DNA。圖11顯示了在感染HEK293細(xì)胞中干擾素響應(yīng)的分析。用所示的miR編碼盒或用聚(I:C)感染細(xì)胞。24小時后從細(xì)胞中提取RNA，然后進(jìn)行定量實時PCR以檢測OAS1、IFN-P、p56和GAPDHmRNA的濃度。由三次獨立實驗表示IFN-P、p56或OAS1與GAPDHmRNA標(biāo)準(zhǔn)化比值的平均值(士SEM)。聚(I:C)陽性對照證實了在此處所采用條件下在細(xì)胞中誘導(dǎo)了干擾素響應(yīng)。圖12顯示了獨立RNAi介導(dǎo)的沉默衰減的分析，該分析是通過用肝源Huh7細(xì)胞和表達(dá)所示shRNA或miR盒的質(zhì)粒以及pCMVmiR-31/8和psi-CHECK_8T二元熒光素酶載體共轉(zhuǎn)染而實現(xiàn)的。報告質(zhì)粒包含在Renilla熒光素酶0RF的獨立HBVmiR-31/8同源序列(cognatesequence)下游。Renilla:螢火蟲熒光素酶活性的測量值用于評估shRNA5、miR-31/5或miR-122/5表達(dá)質(zhì)粒對其自身獨立靶點miR-31/8沉默的影響。圖13顯示了轉(zhuǎn)染pU6HBVshRNA5的量對CMVmiR-31/8沉默衰減的影響。用所示比值的pCMVmiR-31/8與pU6HBVshRNA5載體和psi-CHECK_8T載體共轉(zhuǎn)染。Renilla:螢火蟲熒光素酶活性的再次測量值(±SEM)用于評估pU6HBVshRNA5的減少量對其自身獨立耙點miR-31/8沉默的影響。圖14顯示了用減少量的pU6HBVshRNA5轉(zhuǎn)染之后Huh7細(xì)胞HBsAg分泌物的抑制效價。用所示比值的pU6HBVshRNA5與HBV復(fù)制感受態(tài)pCH_9/3091載體轉(zhuǎn)染并在此后48小時測定培養(yǎng)物上清液中的HBsAg濃度。以來自ELISA法的0D讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化相對平均值(±SEM)表示。圖15顯示了在體內(nèi)miR穿梭對獨立沉默的影響的評估。用psi-CHECK_8T載體以及所示RNAi表達(dá)盒對小鼠進(jìn)行HDI。其中，CMVmiR_31/5、CMVmiR-122/5和U6shRNA5與CMVmiR-31/8載體的比值表示在圓括號中。注射質(zhì)粒3天之后，在肝勻槳中測定Renilla:螢火蟲熒光素酶活性的標(biāo)準(zhǔn)化平均值(士SEM)。圖16顯示了產(chǎn)生肝特異性表達(dá)載體的克隆策略示意圖。在pTZ衍生載體中增殖的肝特異性啟動子以綠色箭頭指示且表示為從5'端到3'端。圖17顯示了螢火蟲熒光素酶在用所示表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)。顯示了在肝源細(xì)胞(黑條)和腎源細(xì)胞(灰條)中螢火蟲熒光素酶活性的相對平均值。誤差線表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。圖18顯示了在不同表達(dá)載體中pri-miR-122穿梭的表達(dá)。顯示了螢火蟲熒光素酶活性相對于Renilla熒光素酶活性的平均值。黑條表示在Huh7細(xì)胞中的表達(dá)，而灰條表示在116細(xì)胞中的表達(dá)。誤差線表示SEM。圖19顯示了三聚體抗HBVpri-miR31表達(dá)盒的示意圖。由含有3個pri-miR序列的CMVPol11啟動子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物被加工以形成獨立的pre-miRs，其依次是可耙向HBV獨立位點的成熟miR指導(dǎo)序列的前體。圖20顯示了從用所示抗HBVRNAi激活表達(dá)盒或用不含miR序列(模擬)的骨架pClneo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)肝源細(xì)胞中提取的RNA的NORTHERN印跡分析。用與推定指導(dǎo)5序列互補(bǔ)的低聚核苷酸做探針探查電泳分辨的RNA(上面的組)。U6質(zhì)粒含有驅(qū)動shRNA5或miR31/5表達(dá)的PoilIIU6啟動子。還采用在三聚體盒內(nèi)具有單獨的primiRs的每一個可能排序組合的載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞。由來自于pClneo質(zhì)粒的CMV啟動子表達(dá)這些多聚體pri-miR穿梭。為控制等量負(fù)載和RNA轉(zhuǎn)移，將印跡剝離并以與U6snRNA互補(bǔ)的低聚核苷酸再次探查(下面的組)。圖21顯示了從用所示抗HBVRNAi激活表達(dá)盒或用不含miR序列(模擬)的骨架pClneo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)肝源細(xì)胞中提取的RNA的NORTHERN印跡分析。以與推定指導(dǎo)8序列互補(bǔ)的低聚核苷酸做探針探查電泳分辨的RNA(上面的組)。U6質(zhì)粒含有驅(qū)動shRNA8或miR31/8表達(dá)的PolIIIU6啟動子。還采用在三聚體盒內(nèi)具有單獨的primiRs的每一個可能排序組合的載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞。由來自于PClneo質(zhì)粒的CMV啟動子表達(dá)這些多聚體pri-miR穿梭。為控制等量負(fù)載和RNA轉(zhuǎn)移，將印跡剝離并以與U6snRNA互補(bǔ)的低聚核苷酸再次探查(下面的組)。圖22顯示了從以所示抗HBVRNAi激活表達(dá)盒或以不含miR序列(模擬)的骨架pClneo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)肝源細(xì)胞中提取的RNA的NORTHERN印跡分析。以與推定指導(dǎo)9序列互補(bǔ)的低聚核苷酸做探針探查電泳分辨的RNA(上面的組)。U6質(zhì)粒含有驅(qū)動shRNA9或miR31/9表達(dá)的PolniU6啟動子。還采用在三聚體盒內(nèi)具有單獨的primiRs的每一個可能排序組合的載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞。由來自于PClneo質(zhì)粒的CMV啟動子表達(dá)這些多聚體pri-miR穿梭。為控制等量負(fù)載和RNA轉(zhuǎn)移，將印跡剝離并以與U6snRNA互補(bǔ)的低聚核苷酸再次探查(下面的組)。圖23顯示了采用二元熒光素酶試驗評估報告基因表達(dá)的下調(diào)。以含有與指導(dǎo)序列5、8和9互補(bǔ)的所示靶序列的PsiCHECK衍生質(zhì)粒和三聚體pri-miR穿梭表達(dá)質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞。采用在三聚體盒內(nèi)具有單獨的primiRs的每一個可能排序組合的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞。模擬處理的細(xì)胞接受psiCHECK載體以及不含抗HBV序列的pClneo骨架質(zhì)粒。在所有轉(zhuǎn)染中，細(xì)胞以RNAi效應(yīng)子與psiCHECK衍生質(zhì)粒為10:l質(zhì)量比接受質(zhì)粒。測量了Renilla與螢火蟲熒光素酶活性的比值并用于測定下調(diào)效力。圖24顯示了由轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的HBsAg的下調(diào)評估。將pCH9/3091HBV復(fù)制感受態(tài)靶質(zhì)粒與單聚體或三聚體pri-miR穿梭表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞。模擬處理的細(xì)胞接受pCH9/3091載體以及不含抗HBV序列的pClneo骨架質(zhì)粒。陰性細(xì)胞不接受pCH9/3091因而僅以pClneo骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。U6質(zhì)粒含有驅(qū)動單聚體shRNA5、primiR31/5、primiR31/8或primiR31/9表達(dá)序列的PolIIIU6啟動子。以U6shRNA5載體與pCH9/3091為10:l和l:1比值進(jìn)行試驗，但對于所有其它的組合，RNAi表達(dá)載體對pCH9/3091的比值為10:1。PolII單聚體質(zhì)粒由CMV啟動子產(chǎn)生了primiR31/5、primiR31/8或primiR31/9。再次將由CMV表達(dá)的在三聚體盒內(nèi)具有單獨的primiRs的每一個可能排序組合的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞。為評估這些RNAi效應(yīng)子對HBsAg分泌的影響，在轉(zhuǎn)染后48小時測定了培養(yǎng)物上清液中這種病毒抗原的濃度。圖25顯示了由在線軟件mF0LD預(yù)測的miR_30二級結(jié)構(gòu)。圖26顯示了由在線軟件mF0LD預(yù)測的miR31二級結(jié)構(gòu)。圖27顯示了由在線軟件mF0LD預(yù)測的sh260靶向HCV5'UTR二級結(jié)構(gòu)。圖28顯示了由在線軟件mF0LD預(yù)測的miR260耙向HCV5'UTR二級結(jié)構(gòu)。圖29(A)pGEM-T-UTR和pGEM-T-LUC的克隆瓊脂糖電泳圖，其中Benchtoplkb標(biāo)記(第1道)和HCV5'UTR的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(第2道)和螢火蟲熒光素酶(第3道)；(B)EcoRI-限制性推定pGEM-T-UTR的瓊脂糖電泳圖，其中Benchtoplkb標(biāo)記(第1道)，來自克隆1的未限制性質(zhì)粒DNA(第2道)，和來自克隆1-10的EcoRI-限制性質(zhì)粒DNA(第3-12道)；和(C)EcoRI-限制性推定pGEM-T-LUC的瓊脂糖電泳圖，其中來自克隆l的未限制性質(zhì)粒DNA(第1道)，和來自克隆1-10的EcoRI-限制性質(zhì)粒DNA(第2-11道)。圖30顯示pCineoUTRLUC克隆Benchtoplkb標(biāo)記(第1道)，來自克隆1的未限制性質(zhì)粒DNA(第2道)，和來自克隆1-22的Sphl-限制性質(zhì)粒DNA(第3-24道)的。圖31(A)pTz57R-sh260的克隆，兩步法PCR反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖，其中Benchtoplkb標(biāo)記(第1道)和第一次sh260PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物(第2道)和第二次sh260PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物(第3道)；(B)PCR篩選推定pTz57R-sh260質(zhì)粒DNA的瓊脂糖電泳圖，其中Benchtoplkb標(biāo)記(第1道)，克隆1_6的PCR篩選的PCR產(chǎn)物(第2_7道)；和(C)SalI-限制性推定pTz57R-sh260質(zhì)粒DNA的瓊脂糖電泳圖，其中BenchtoplOObp標(biāo)記(第1道)，和來自克隆3的Sail-限制性質(zhì)粒DNA。圖32(A)pTz57R-miR260的克隆，兩步法PCR反應(yīng)產(chǎn)物的第一步的瓊脂糖電泳圖，其中BenchtoplOObp標(biāo)記(第1道)和第一次miR260PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物(第8道)；(B)兩步法PCR反應(yīng)產(chǎn)物的第二步的瓊脂糖電泳圖，其中BenchtoplOObp標(biāo)記(第1道)和第二次miR260PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物(第8道)；和(C)SalI-限制性推定(restrictedputative)pTz57R-miR260質(zhì)粒DNA的瓊脂糖電泳圖，其中Benchtoplkb標(biāo)記(第1道)和來自克隆1-4的SalI-限制性質(zhì)粒DNA(第1-4道)。圖33是顯示以耙構(gòu)建體pCineoUTRLUC和pCMV-Ren轉(zhuǎn)染并以pTz57R_miR118、pTz57R-sh260或pTz57R-miR260共轉(zhuǎn)染的HuH_7細(xì)胞相對熒光素酶活性(螢火蟲/Renilla)的條線圖，其中結(jié)果是來自于三次重復(fù)進(jìn)行的2個實驗中的一次代表試驗(線表示平均值±SD)。圖34人類PRMIR31圖35人類PRMIR122圖36PRMIR31/5圖37PRMIR122/5圖38U6啟動子圖39HBV基因組登錄號AY233296圖40PRMIR31/8圖41PRMIR31/9圖42PR皿R122/6圖43PR皿R122/10圖44HBV1575圖45HBV1581圖46HBV1678圖47HBV1774圖48HBV59圖49HBV62圖50HBV220圖51HBV228圖52HBV239圖53HBV251圖54HBV423圖55HBV1261圖56HBV1774圖57HBV1826圖58HBV1868圖59HBV1899圖60HBV2312圖61HBV2329圖62HBV2393圖63HBV2456圖64HBV2458圖65HBV158圖66HBV332圖67HBV登錄號Y13184圖68人類MIR30圖69shRNA260圖70MIR260圖71耙序列圖72耙序列圖73PRIMIR31/5互補(bǔ)物圖74PRIMIR122/5互補(bǔ)物圖75HBV1575互補(bǔ)物圖76HBV1581互補(bǔ)物圖77HBV1678互補(bǔ)物圖78HBV1774互補(bǔ)物圖79HBV59互補(bǔ)物圖80HBV62互補(bǔ)物圖81HBV220互補(bǔ)物圖82HBV228互補(bǔ)物圖83HB3V239互補(bǔ)物圖84HBV251互補(bǔ)物圖85HBV423互補(bǔ)物圖86HBV1261互補(bǔ)物圖87HBV1774互補(bǔ)物圖88HBV1826互補(bǔ)物圖89HBV1868互補(bǔ)物圖90HBV1899互補(bǔ)物圖91HBV:2312互補(bǔ)物圖92HBV2329互補(bǔ)物圖93HBV2393互補(bǔ)物圖94HBV2456互補(bǔ)物圖95HBV2458互補(bǔ)物圖96HBV158互補(bǔ)物圖97HBV332互補(bǔ)物圖98HBV登錄號Y3184互補(bǔ)物圖99人類PRIMIR31RNA圖100人類PRIMIR122RNA圖101PRIMIR31/5RNA圖102PRIMIR122/5RNA圖103PRIMIR31/8RNA圖104PRIMIR31/9RNA圖105PRIMIR122/6RNA圖106PRIMIR122/10RNA圖107HBV1575RNA圖108HBV1581RNA圖109HBV1678RNA圖110HBV1774RNA圖111HBV59RNA圖112HBV62RNA圖113HBV220RNA圖114HBV228RNA圖115HBV239RNA圖116HBV251RNA圖117HBV423RNA圖118HBV1261RNA圖119HBV1774RNA圖120HBV1826RNA圖121HBV1868RNA圖122HBV1899RNA圖123HBV2312RNA圖124HBV2329RNA圖125HBV2393RNA圖126HBV2456RNA圖127HBV2458RNA圖128HBV158RNA圖129HBV332RNA圖130人類MIR30RNA圖131shRNA260RNA圖132MIR260RNA圖133耙序列RNA圖134耙序列RNA圖135耙序列互補(bǔ)物圖136耙序列互補(bǔ)物圖137革巴10圖138革巴10互補(bǔ)物圖139革巴10RNA發(fā)明詳述已積極提出將激活RNAi途徑以實現(xiàn)特異性基因沉默應(yīng)用于基于核酸的HBV治療的可能性。RNAi涉及通過RNAi效應(yīng)子及其靶點之間的可預(yù)料的互補(bǔ)作用特異性和強(qiáng)烈地使基因沉默。天然地RNAi在通過加工內(nèi)源miRs來調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，其控制了包括器官發(fā)生，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生的幾個細(xì)胞過程。miRs由PolII轉(zhuǎn)錄成pri-miR發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，然后其在核內(nèi)被加工形成前體miRs(pre-miRs)。該步驟由Drosha(—種RNAseIII酶)和DiGeorge臨界區(qū)8蛋白(DGCR8)共同催化，其是它的雙鏈RNA結(jié)合(dsRBD)對象。一些內(nèi)源miRs是多順反子的且是多于一個成熟miR，具有由單個轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生的區(qū)別。從核輸出之后，pre-miRs被Dicer與結(jié)合的dsRBDTARRNA結(jié)合蛋白加工。在選擇一條鏈作為成熟miR指導(dǎo)之前，制得的19-24bp雙螺旋被交付于RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)。miR通常不會與其耙點完全互補(bǔ)并結(jié)合到同源mRNA的3'非翻譯區(qū)以誘導(dǎo)翻譯抑制。當(dāng)指導(dǎo)與靶點之間的堿基配對完美匹配時，RISC的Ago2組分通過位點特異性切除指導(dǎo)互補(bǔ)物實現(xiàn)沉默。已提出將由RNAi誘導(dǎo)的特異性和強(qiáng)烈基因沉默用于研究基于RNAi的治療形式以抑制致病基因的表達(dá)，所述致病基因包括這些病毒，例如HBV和丙型肝炎病毒(HCV)。通常地，外源RNAi誘導(dǎo)序列是合成短干擾RNA(siRNA)雙螺旋或表達(dá)的shRNA序列。合成siRNAs類似于Dicer切除產(chǎn)物并通過直接激活RISC引起基因沉默。shRNAs在早期進(jìn)入RNAi途徑并充當(dāng)pre-miR模擬物。組成型激活PolIII啟動子優(yōu)選轉(zhuǎn)錄shRNAs，因為在轉(zhuǎn)錄編碼序列內(nèi)調(diào)控元件的最低要求下它們能夠產(chǎn)生短的，確定轉(zhuǎn)錄物。HBV基因組的幾個位點已被合成的和表達(dá)的RNA序列所靶定并顯示出病毒復(fù)制標(biāo)記的強(qiáng)烈下調(diào)。但是，由于內(nèi)源miR途徑的飽和U6PolIII表達(dá)的抗HBVshRNAs在體內(nèi)引發(fā)嚴(yán)重毒性的最新論證是表達(dá)RNAi序列治療用途的重要關(guān)注點。因此組織特異性和可誘導(dǎo)PolII啟動子對于PolIII調(diào)控元件是優(yōu)選的，因為它們提供了表達(dá)RNAi效應(yīng)子的轉(zhuǎn)錄控制和劑量調(diào)整的更優(yōu)方式。一些報道已證實由PolIIRNAi表達(dá)盒可實現(xiàn)有效沉默，但是該途徑被常規(guī)發(fā)夾序列的不可預(yù)測和不定沉默效力所牽制。被并入PolII衍生轉(zhuǎn)錄物的發(fā)夾序列上游和下游可干擾沉默基因的加工。為改善有效治療序列的轉(zhuǎn)錄控制，我們利用細(xì)胞miRs的天然PolII介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄控制?？笻BV序列被并入編碼pri-miR-31或pri-miR-122模擬物的表達(dá)盒中。當(dāng)抗HBVpri-miR穿梭表達(dá)盒被置于PolII肝特異性啟動子控制下時在體內(nèi)和體外都實現(xiàn)了病毒復(fù)制標(biāo)記的有效沉默。此外，這些穿梭序列可產(chǎn)生能同時靶向不同序列的多聚體沉默序列。本發(fā)明描述了采用編碼并入肝炎病毒的一個或多個靶序列的初級微RNAs模擬物的表達(dá)盒抑制或沉默肝炎病毒(尤其是乙型或丙型肝炎病毒)表達(dá)的方法。抗肝炎初級微RNA(pri-miR)表達(dá)盒通常包括編碼模擬天然存在的miR序列(例如miR-30，miR-31和mi-R-122)的人工(即工程化)pri-miR序列的DNA序列，以耙向肝炎病毒的序列所置換的天然存在pri-miR序列的指導(dǎo)序列(和指導(dǎo)序列的互補(bǔ)序列)。表達(dá)盒包括PolII啟動子，其可以是組成型啟動子，例如CMV，或組織特異性啟動子，例如肝特異性組織啟動子a-l-抗胰蛋白酶(A1AT)啟動子，因子VIII(FVIII)啟動子，HBV基本核心啟動子(BCP)和PreS2啟動子。表達(dá)盒還可包括啟動子/轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列和/或終止信號。用于針對乙型肝炎病毒(HBV)的靶點的選擇是基于所有HBV基因型之中的序列保守性，還基于所預(yù)測的靶點對短發(fā)夾RNAs(shRNAs)沉默的易感性。通過CityofHopeHospital(Duarte，CA)(Healeetal[45])在線提供的算法對此進(jìn)行分析。盡管乙型肝炎病毒是相對非常保守的，存在許多不同的已知基因型，仍要求是實施例中所描述的靶序列90%和95%序列以便還覆蓋其他基因型中的耙點。表達(dá)盒可被并入病毒或非病毒載體中，其可用于將表達(dá)盒導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物體中。欲將表達(dá)盒用于治療或預(yù)防尤其是人的肝炎感染，其可被并入藥物組合物中，例如還包含藥物可接受佐劑和/或載體的抗肝炎藥物。將通過以下實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。但是這些實施例不應(yīng)解釋為以任何方式限制本發(fā)明的實質(zhì)或范圍。以miRs沉默乙型肝炎靶點5，6，8，9和10，而本文所述的其他靶點進(jìn)行更簡單的shRNA沉默試驗。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解如果shRNAs可以則miRs也可以。實施例1:抗HBVpri-miR表達(dá)質(zhì)粒的設(shè)計和增殖1.設(shè)計通過以指導(dǎo)序列耙向HBV序列(SEQIDNO:11/109/141)置換天然存在的miR-31(SEQIDN0s:1/107/133)和miR-122(SEQIDNO:2/108/134)來設(shè)計pri-miR表達(dá)盒。編碼抗HBVprimiR序列的完整序列如SEQIDNO:3(135)和4(136)所給出的。盡可能地維持miR的野生型序列且轉(zhuǎn)錄物二級結(jié)構(gòu)的計算機(jī)輔助預(yù)測[38]不會明顯區(qū)別于相應(yīng)的野生型miRs的。最終的表達(dá)盒含有與pre-miR任一端側(cè)接的野生型序列的51個核苷酸(Zeng和Cullen，2005)。為利于miR的克隆，分別在其5'和3'端引入NheI和SpeI限制性酶切位點。圖l中顯示了HBV的靶基因組位點以及pri-miR表達(dá)盒的示意圖。圖2顯示了野生型pri-miR-31和miR122序列以及它們的抗HBV衍生物(pri_miR-31/5和miR122/5)的結(jié)構(gòu)。1.生成編碼靶向HBV的miR序列的盒miR衍生抗HBV序列。通過成對的pre_miR31/5和pre_miR-122/5正向和反向低20聚核苷酸的引物延伸生成了編碼含有靶向乙型肝炎病毒(HBV調(diào)配物1781-1801)(SEQIDNO:3和4)(圖1)的指導(dǎo)序列的pre-miR-31和pre-miR-122的DNA。編碼miR序列的低聚脫氧核苷酸是采用亞磷酰胺(phosphoramidite)化學(xué)法(InqabaBiotech,南非)合成的。如PCR采用Promega'sPCRMasterMix(Promega，WI，USA)—樣進(jìn)行引物延伸。熱循環(huán)條件如下94°C5分鐘起始變性，之后94°C10秒變性，5(TC10秒退火并在72t:延伸10秒循環(huán)30次以及72°C10分鐘的最終延伸步驟。編碼靶向HBV調(diào)配物1781-1801的miR盒的低聚核苷酸序列是Pre-miR-31/5正向5'-GTAACTCGGAACTGGAGAGGGGTGAAGCGAAGTGCACACGGGTTGAACTGGGAACGACG-3'(SEQIDNO:40)Pre-miR-31/5反向5'-CTGCTGTCAGACAGGAAAGCCGTGAATCGATGTGCACACGTCGTTCCCAGTTCAACCCTG-3'(SEQIDNO:41)Pre-miR-122/5正向5'-GAGTTTCCTTAGCAGAGCTGGAGGTGAAGCGAAGTGCACACGGGTCTAAACTAACGTGTGCA-3'(SEQIDNO:42)Pre-miR-122/5反向5'-GGATTGCCTAGCAGTAGCTAGGTGTGAAGCTAAGTGCACACGTTAGTTTAGACCCGTGTGCA-3，(SEQIDNO:43)將引物延伸產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(1%凝膠)，切離并采用Qiagen'sMinElute凝膠提取試劑盒(Qiagen，德國)從凝膠切塊中提取。以大約lOOng的純化pre-miR-31/5和pre-miR-122/5作為模板并以正向和反向pri-miR-31和pri-miR-122引物進(jìn)行擴(kuò)增。Pri-miR-31正向5'-GCTAGCCATAACAACGAAGAGGGATGGTATTGCTCCTGTAACTCGGAACTGGAGAGG-3，(SEQIDNO:44)Pri-miR-31反向5'-AAAAAAACTAGTAAGACAAGGAGGAACAGGACGGAGGTAGCCAAGCTGCTGTCAGACAGGAAGC-3'(SEQIDNO:45)Pri-miR-122正向5'-GACTGCTAGCTGGAGGTGAAGTTAACACCTTCGTGGCTACAGAGTTTCCTTAGCAGAGCTG-3'(SEQIDNO:46)Pri-miR-122反向5'-GATCACTAGTAAAAAAGCAAACGATGCCAAGACATTTATCGAGGGAAGGATTGCCTAGCAGTAGCTA-3，(SEQIDNO:47)U6P0IIII啟動子序列的擴(kuò)增。還以下列引物擴(kuò)增U6啟動子U6F5'-GATCAGATCTGGTCGGGCAGGAAGAGGGCC—3'(SEQIDNO:48)禾PU6R5'-GCTAGCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3'(SEQIDNO:49)。熱循環(huán)參數(shù)如上。以擴(kuò)增子進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(1%凝膠)，將其切離并采用Qiagen的MinElute凝膠提取試劑盒從凝膠切塊中提取。21miR和U6序列的增殖。將編碼pri_miR-31/5、pri-miR-122/5(SEQIDNO:3和4)和U6啟動子(SEQIDNO:5)的DNA片段連接到pTZ_57R/T(InsTAclonePCR克隆試劑盒，F(xiàn)ermentas，Hanover，MD，USA)上以分別生成pTZ-57R/Tpri_miR-31/5和pTZ_57R/Tpri-miR-122/5。類似地通過將擴(kuò)增的U6P0IIII啟動子序列插入到pTZ中生成pTZ-U6。按照供應(yīng)商的說明進(jìn)行連接和選擇。簡而言之，在22t:溫育2-3小時進(jìn)行連接反應(yīng)。以連接混合物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌，并將其涂布在氨芐青霉素，IPTG，X-gal陽性的LB瓊脂平板上，將平板在37t:溫育過夜。按照標(biāo)準(zhǔn)雙脫氧鏈終止法(I叫abaBiotechnology,南非)對插入陽性克隆及其相反方向(相對于P-半乳糖苷酶基因)進(jìn)行測序?？笻BVmiR表達(dá)盒。為生成PolIII驅(qū)動pri-miR載體，將pri-miR-31/5和pri-miR-122/5的編碼序列克隆到U6啟動子下游。為生成U6pri_miR-31/5，通過Nhel和SeaI消化從pTZ-57R/Tpri-miR-31/5切離的pri_miR-31/5，并將其插入以SpeI和SeaI消化的pTZ-U6中。通過NheI和EcoRI消化從pTZ_57R/Tpri-miR-122/5切離的pri-miR-122/5并將其插入以SpeI和SeaI消化的pTZ_U6中以生成U6pri_miR-122/5。pHBxshRNA5的生成如之前所述[39]，其涉及兩步PCR反應(yīng)，其中U6PolIII啟動子與下游發(fā)夾編碼序列一起被擴(kuò)增，然后被插入pTZ-57R/T(InsTAcloneTMPCR克隆試劑盒，F(xiàn)ermentas,WI，USA)中。通過克隆pCI-neo(Promega，WI，USA)的CMV啟動子的下游pri-miR-31/5和pri-miR-122/5序列生成了PolII驅(qū)動pri-miR載體。通過SalI和NheI從pTZ_57R/Tpri-miR-31/5切離的pri-miR-31/5并將其連接到以XhoI和XbaI消化的pCI-neo上以生成CMVpri-miR-31/5。通過NheI禾PXbaI消化從pTZ-57R/Tpri_miR-122/5切離的pri-miR-122/5之后連接到以相同限制性酶消化的pCI-neo上生成CMVpri_miR-122/5按照類似的程序生成了耙向HBx開放式讀碼框內(nèi)不同位點(位點8和9)的表達(dá)盒。由這些盒靶向的HBV序列(SEQIDNO:6，登錄號AY233296)調(diào)配物(co-oridinate)如下pTZ-57R/Tpri-miR-31/8革E向HBV1678—1698(SEQIDNO:7(137))，pTZ—57R/Tpri-miR-31/9耙向HBV1774—1794(SEQIDNO:8(138)，pTZ-57R/Tpri_miR-122/6耙向HBV1678-1700(SEQIDNO:9(139))和pTZ-57R/Tpri_miR-122/10革巴向HBV1774-1796(SEQIDNO:10(140))。實施例2:來自pTZ-57R/Tpri-miR-31/5和pTZ-57R/Tpri_miR-122/5的抗HBV序列在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。以編碼miR-31/5和miR122/5的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞。在添加了10%FCS，青霉素(50IU/ml)和鏈霉素(50yg/ml)(GibcoBRL，UK)的DMEM中增殖HEK293細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前一天，將1500000HEK293細(xì)胞種入直徑為10em的培養(yǎng)皿中。按照供應(yīng)商的說明采用陽離子脂質(zhì)體(Invitrogen，CA，USA)以10yg的shRNA-或miR-表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。RNA印跡分析。在轉(zhuǎn)染之后第4天收集HEK293細(xì)胞，并采用Tri試劑(Sigma，MI，USA)按照供應(yīng)商說明提取總RNA。在尿變性12.5%聚丙烯酰胺凝膠中分辨20ygRNA并將其印染在尼龍膜上。放射性標(biāo)記的DNA低聚核苷酸在細(xì)胞RNA旁邊以作為大小指示劑。印染是與設(shè)計成推定成熟miR-31/5和miR-122/5產(chǎn)物特異性的探針的雜交。該探針低聚核苷酸的序列是5'GACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCA3'(SEQIDNO:50)。為確認(rèn)泳道具有細(xì)胞RNA的等量負(fù)載，將印染剝離并以與內(nèi)源U6snRNA互補(bǔ)的低聚核苷酸再次探查。U6snRNA探針的序列是5'TAGTATATGTGCTGCCGAAGCGAGCA3'(SEQIDNO:51)。按照標(biāo)準(zhǔn)程序采用聚核苷酸激酶和Y—32PATP對所有探針進(jìn)行放射性標(biāo)記。加工序列的檢測。圖3，4和5顯示了從用來自于抗HBV表達(dá)盒的miR-31(圖3和4)和miR-122(圖3和5)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取的RNA的RNA印染分析之后獲得的雜交信號。主要的加工產(chǎn)物是可檢測到的大約21nt大小的條帶，其與天然存在的成熟miR-31和miR-122產(chǎn)物[40，41]具有相似長度。U6shRNAHBVshRNA5表達(dá)盒被包含作為高水平發(fā)夾表達(dá)的陽性對照。與shRNA5表達(dá)載體相比，在miR-31和miR-122載體表達(dá)背景下加工的指導(dǎo)miR的量以低得多的濃度而存在(達(dá)85倍低濃度)。令人感興趣的是，對應(yīng)于長度20和22ntRNA的條帶在以CMVmiR-31/5和U6miR-31/5轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中也檢測到(圖3)，這意味著在miR-31穿梭背景下抗HBV指導(dǎo)鏈的加工可以是異源的。在以含U6啟動子載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取的RNA中檢測到更大分子量的miR/shRNA中間體，但在表達(dá)CMVmiR-31/5或CMVmiR-122/5盒的細(xì)胞中未檢到。這表明CMVPolII轉(zhuǎn)錄物的完全加工比PolIII表達(dá)RNA的效率更高。令人感興趣的是，來自U6盒的miR衍生指導(dǎo)的胞內(nèi)濃度低于U6shRNA5的，其可能是由于更長的miR-122/5和miR-31/5序列的更低PolIII轉(zhuǎn)錄效力。檢到的指導(dǎo)鏈信號是特異的，因為當(dāng)探針雜交到從以相似靶向不同HBV位點(圖4和5)的pri-miR表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中提取的RNA上時檢測不到條帶。通過相似的U6snRNA探針信號強(qiáng)度證實了在每條泳道內(nèi)為等量負(fù)載的細(xì)胞RNA。實施例3:在HBV復(fù)制的細(xì)胞培養(yǎng)物模型中miR序列的抗HBV效力試驗靶質(zhì)粒。pCH-9/3091如前所述[42]。它含有大于基因組長度的HBV序列，其類似于HBVAl亞基因型共有序列(consensus)，由它的CMV啟動子產(chǎn)生了3.5kbHBV前基因組轉(zhuǎn)錄物。通過以螢火蟲熒光素酶編碼DNA置換pCH-9/3091的preS2/S0RF，按之前所述的與生成pCHGFP所采用的相似程序[43]制備了pCH螢火蟲Luc載體。簡而言之，采用PCR從psiCheck2(Promega，WI，USA)中擴(kuò)增螢火蟲熒光素酶序列。擴(kuò)增螢火蟲熒光素酶序編碼區(qū)的引物組合是5，ACTGCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGTGAGCAAGGGCG3，(正向；SEQIDNO:52);和5'ACGTTCTAGAGTATACGGACCGTTACTTGTACAGCTC3'(反向；SEQIDNO:53)。正向引物含有與來自于調(diào)配物129-159的HBV序列互補(bǔ)的序列(包括天然存在的XhoI限制性酶切位點)和5'螢火蟲熒光素酶序列。在該引物中，螢火蟲熒光素酶起始密碼子的位置等同于中間HBs蛋白的翻譯起始密碼子的位置。反向引物包括與螢火蟲熒光素酶0RF的3'端互補(bǔ)的序列以及SpeI限制性酶切位點。PCR引物序列如下熒光素酶正向5'-ACTGCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGAAG-3'(SEQIDNO:54);和熒光素酶反向5'-ACTGACTAGTTTACACGGCGATCTTTCC-3'(SEQIDNO:55)通過引物并入的XhoI和SpeI位點以粗體指示。將PCR產(chǎn)物克隆至pTZ_57R/T(InsTAclonePCR克隆試劑盒，F(xiàn)ermentas，WI，USA)中。然后以Xhol和Spel從pCI-EGFP上切離螢火蟲熒光素酶序列并將其插入pCH-9/3091的XhoI和Spel位點以生成pCH-螢火蟲Luc。將XhoI-NotI消化的來自于pCI-neoHBx[44]的HBx片段直接插入質(zhì)粒psiCheck2(Promega，WI，USA)來制備psiCheck-HBx耙質(zhì)粒以便HBx0RF處于Renilla熒光素酶盒的3'未翻譯區(qū)(UTR)。細(xì)胞培養(yǎng)。將Huh7細(xì)胞維持在添加了2.5%胎牛血清(FCS)，青霉素(50IU/ml)和鏈霉素(50iig/ml)(GibcoBRL，UK)的RPMI培養(yǎng)基中。并在添加了10%FCS，青霉素(50IU/ml)和鏈霉素(50iig/ml)(GibcoBRL，UK)的DMEM中增殖HEK293細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前一天，將250000HEK293細(xì)胞和150000Huh7細(xì)胞種入直徑2cm的孔中。采用陽離子脂質(zhì)體(Invitrogen，CA，USA)按照供應(yīng)商說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。為檢測miR-31/5和miR122/5_編碼質(zhì)粒的影響，以6iigpCH-9/3091[42]或pCH螢火蟲Luc靶載體和2iigmiR-31/5和miR122/5pTZ-衍生質(zhì)粒或缺乏miR盒的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞。在以pCH螢火蟲Luc靶載體轉(zhuǎn)染的情況下，包括在CMV啟動子控制下組成性產(chǎn)生Renilla熒光素酶的質(zhì)粒以控制轉(zhuǎn)染效力(pCMV-Ren載體，其由DrjohnRossi，CityofHopeHospital，Duarte，CAUSA所捐贈)。采用Monolisa(ELISA)免疫試劑盒(BioRad，CA，USA)檢測被分泌至培養(yǎng)物上清液中的HBV表面抗原(HBsAg)。在每個共轉(zhuǎn)染中還包括組成性產(chǎn)生EGFP.[43]的質(zhì)粒載體，通過熒光顯微鏡法證實了相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染效力。以二元熒光素酶檢測試劑盒(Promega，WI，USA)并采用Veritas二元注射光度計(TurnerBioSystems，CA，USA)測量Renilla和螢火蟲熒光素酶的活性。miR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌HBV抗原(HBsAg)的抑制。首先，為在體外評估針對HBV的效力，以miR-31/5-和miR-122/5-表達(dá)載體以及pCH-9/3091HBV靶質(zhì)粒[42]共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞。HBx序列是所有HBV轉(zhuǎn)錄物(圖6A)共有的且HBsAg分泌的抑制與RNAi介導(dǎo)的HBV復(fù)制沉默是相關(guān)聯(lián)的[39、43、44]。對照含有U6shRNA編碼質(zhì)粒(U6shRNA5)，其如之前所示可有效針對HBV[39]以及由CMV啟動子控制shRNA5序列表達(dá)的載體。與模擬處理細(xì)胞相比，通過U6shRNA5、miR-31/5-和miR-122/5表達(dá)載體實現(xiàn)了95_98%病毒抗原的下調(diào)(圖6B)。在U6Po1III以及CMVPolIImiR-31/5-和miR-122/5表達(dá)載體中都觀察到這種影響。CMVmiR-122/5影響略低于其他miR載體(下調(diào)85_90%)。編碼來自于CMV啟動子的shRNA5的載體可實現(xiàn)至少大約60%的有效沉默。miR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶活性的抑制。采用報告基因質(zhì)粒(pCH螢火蟲Luc)確證來自于轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌HBsAg的分析(圖6)數(shù)據(jù)以測量原位的下調(diào)效力(圖7)。在pCH螢火蟲Luc中，以螢火蟲熒光素酶0RF置換pCH-9/3091的preS2/S序列，其具有保持完整的靶向HBx0RF。pCH螢火蟲Luc和miR編碼載體的共轉(zhuǎn)染可通過測定熒光素酶報告基因活性方便地在原位定量測量抗HBV序列。分析表明了螢火蟲熒光素酶活性被含U6shRNA5、U6miR-31/5、U6miR-122/5、CMVmiR-31/5和CMVmiR-122/5載體明顯降低。每個這類載體都實現(xiàn)了相對于對照大約75%的下調(diào)(圖7B)。CMVshRNA5載體未明顯抑制螢火蟲熒光素酶活性。與圖6所示結(jié)果放在一起，這些數(shù)據(jù)表示了miR-31或miR-122的miR樣結(jié)構(gòu)的并入能夠由PolII或PolIII啟動子表達(dá)沉默序列且不影響沉默效力。此外，圖3、4和5所列的數(shù)據(jù)顯示了由降低很多的RNAi效應(yīng)子濃度所引起的沉默效力。對總共23個革巴點(SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32和33(RNASEQIDNO:141-163))進(jìn)行了評估。這些序列的長度為21_25nt，開始于HBV核苷酸調(diào)配物1575、1581、1678、1774、59、62、220、228、239、251、423、1261、1774、1826、1868、1899、2312、2329、2393、2456、2458、158和332。對HBV耙點的鑒別依靠評估基24因型之間的保守性以及根據(jù)Healeetal[45]所述算法評估的RNAi介導(dǎo)沉默的適應(yīng)性。[O333]實施例4:采用HBV復(fù)制的動力進(jìn)樣模型在體內(nèi)試驗miR序列的抗HBV效力小鼠的動力進(jìn)樣。采用鼠動力尾部靜脈注射(HDI)法測定miR質(zhì)粒載體對體內(nèi)HBV基因表達(dá)的景》口向。按照UniversityoftheWitwatersrandAnimalEthicsScreeningCommittee核準(zhǔn)的方案進(jìn)行動物實驗。在5_10秒內(nèi)由尾部靜脈注射為小鼠體重10%的鹽水溶液。該鹽水溶液包含三個質(zhì)粒載體的組合5iig靶DNA(pCH-9/3091);5yg缺乏HBV序列的pCI-neo質(zhì)粒DNA(PromegaWI，USA)或5iig抗HBV序列(pU6shRNA5、pCMVmiR-31/5或pCMVmiR-122/5質(zhì)粒)；和5iigpCIneoEGFP(肝DNA遞送的對照，其組成性表達(dá)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(eGFP)標(biāo)記基因[43])。在中止未進(jìn)行最佳注射的動物研究之后，每個實驗組含有5-8只小鼠。在HDI之后的第3和5天在麻醉下通過眶后穿剌收集血液。采用Monolisa(ELISA)免疫試劑盒(BioRad，CA，USA)按照供應(yīng)商說明測量血清HBsAg濃度。為測量miR穿梭序列對病毒顆粒等效物(VPEs)循環(huán)的影響，在HDI之后的第3和5天從50ii1小鼠血清中分離總DNA，并按照之前所述的方法[39]采用定量PCR測定病毒DNA。簡而言之，采用RocheDiagnostics的總核酸分離試劑盒和MagNApure設(shè)備從從50iU小鼠血清中分離總DNA。對照包括空白水和HBV陰性血清。采用SYBRgreenTaq即用預(yù)混物(readymix)(Sigma，M0，USA)對從8y1小鼠血清等效物中提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。利用交叉點分析測量病毒體DNA濃度并采用EuroH印校準(zhǔn)器[45]生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。HBV表面引物組是HBV表面正向5'-TGCACCTGTATTCCATC-3'(SEQIDNO:56)和HBV表明反向5，-CTGAAAGCCAAACAGTGG-3，(SEQIDNO:57)。采用RocheLightcyclerV.2進(jìn)行PCR。毛細(xì)管反應(yīng)體積是20ii1而熱循環(huán)參數(shù)是由95°C30秒熱啟動之后57°C10秒，72°C7秒循環(huán)50次然后95°C5秒所組成。通過溶解曲線分析和瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)PCR產(chǎn)物的特異性。HDI之后第5天處死小鼠后收集肝。按照標(biāo)準(zhǔn)程序[46]從肝中提取總DNA。沒有進(jìn)行限制性消化將DNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳，之后加工以采用R即id-hyb緩沖液(Amersham，UK)進(jìn)行Southern印跡分析。為產(chǎn)生探針，以下列探針擴(kuò)增HBVX開放式讀碼框DNA:HBx正向5'-GATCAAGCTTTCGCCAACTTACAAGGCCTTT-3'(SEQIDNO:58)和HBx反向5'-GATCTCTAGAACAGTAGCTCCAAATTCTTTA-3'(SEQIDNO:59)。純化PCR產(chǎn)物作為模板以HexaLabel"DNA標(biāo)記試劑盒(Fermentas，MD，USA)按照供應(yīng)商說明進(jìn)行隨機(jī)引物標(biāo)記。處理固定冷凍肝部分以按照標(biāo)準(zhǔn)程序檢測eGFP。圖8顯示了在以所示質(zhì)粒進(jìn)行HDI程序的小鼠血清中檢測到的HBsAg濃度。pU6shRNA5，pCMVmiR-31/5和pCMVmiR-122/5質(zhì)粒每個都使病毒抗原下調(diào)至少95%。這可在HDI之后的第3和5天進(jìn)行的測量中觀察到。在3個質(zhì)粒載體中，含有U6shRNA5的是最有效的而在以該質(zhì)粒注射的小鼠血清中檢測不到HBsAg濃度。也可在第3和5天采用定量實時PCR測量在相同小鼠中循環(huán)VPEs的數(shù)量。這些數(shù)據(jù)如圖9所示。結(jié)果確證了HBsAg測定值(圖8)，其中pU6shRNA5、pCMVmiR-31/5和pCMVmiR-122/5質(zhì)粒每個都使循環(huán)VPEs的數(shù)量下調(diào)至少95%。在第3和5天，在模擬處理動物中VPEs的數(shù)量大約是每毫升血清中分別為1.3X10，P2.1X106。在pU6shRNA5、pCMVmiR-31/5和pCMVmiR-122/5處理動物中循環(huán)VPEs大約低10倍，為每毫升血清0.5-2.5X105。在這種復(fù)制標(biāo)記的下調(diào)上pU6shRNA5和pCMVmiR-31/5具有大約相等的效力，且兩種載體效力都略高于pCMVmiR-122/5。在來自經(jīng)過了HDI實驗的每組2個動物的代表性肝組織中測量HBVDNA復(fù)制中間體。分析結(jié)果如圖10所示。僅在模擬處理動物中檢測到HBV雙螺旋線性(DL)和松弛環(huán)狀(RC)復(fù)制中間體，而在共注射了CMVmiR-31/5、CMVmiR-122/5或U6shRNA5質(zhì)粒的任何小鼠中都檢測不到。在模擬處理小鼠中檢到的HBVDNA條帶在大小上與pCH9/3091的任何條帶都不相對應(yīng)，這表明檢到的DL和RCHBVDNA不同于輸入質(zhì)粒DNA。在Southern轉(zhuǎn)移之前以溴化乙啶對分離DNA進(jìn)行染色，雜交證實了加載至每條泳道中的細(xì)胞DNA是等量的。從而泳道的不等量負(fù)載不作為所觀察到的HBVDNA復(fù)制中間體濃度差異的考慮因素。綜合地，圖8-10中的數(shù)據(jù)顯示了CMVmiR-31/5和CMVmiR-122/5表達(dá)盒是高度有效的HBV基因表達(dá)的沉默子，且它們的效力約等于含U6shRNA5的載體。實施例5:抗HBVmiR穿梭對非特異性誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)基因的誘導(dǎo)試驗細(xì)胞培養(yǎng)物、轉(zhuǎn)染和RNA提取。如上所述培養(yǎng)HEK293細(xì)胞并轉(zhuǎn)染。簡而言之，將細(xì)胞維持在添加了10%FCS、青霉素(50IU/ml)和鏈霉素(50yg/ml)(GibcoBRL，UK)的DMEM中。在轉(zhuǎn)染前的一天，將250000HEK293細(xì)胞種入直徑2cm的培養(yǎng)皿中。采用陽離子脂質(zhì)體(Invitrogen，CA，USA)按照供應(yīng)商說明以800ngshRNA-或miR-表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。作為誘導(dǎo)IFN反應(yīng)的陽性對照，還以800ng聚(I:C)(Sigma，MI，USA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染之后2天，以Tri試劑(Sigma，MI，USA)按照供應(yīng)商說明提取RNA。干擾素反應(yīng)基因的實時定量PCR。采用Song等[47]所述的程序擴(kuò)增低聚腺苷酸合成酶-1(OAS-1)、干擾素(IFN-13)、p56和磷酸甘油醛_3脫氫酶(GAPDH)cDNA。采用RocheLightcyclerV.2進(jìn)行所有的qPCRs。對照包括空白水和未進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的RNA提取物。采用Taqreadmix(即用預(yù)混物)禾PSYBRgreen(Sigma，MO，USA)進(jìn)行擴(kuò)增并檢測反應(yīng)中的DNA。熱循環(huán)參數(shù)包括95°C30秒熱啟動之后58°C10秒，72°C7秒循環(huán)50次然后95°C5秒。通過溶解曲線分析和瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)PCR產(chǎn)物的特異性。用于擴(kuò)增人HEK293細(xì)胞IFN反應(yīng)相關(guān)mRNA的引物組合如下IFN-P正向5'TCCAAATTGCTCTCCTGTTGTGCT3'，IFN-P反向5'CCACAGGAGCTTCTGACACTGAAAA3'，GAPDH正向5，AGGGGTCATTGATGGCAACAATTCCA3'，GAPDH反向5'TTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGTG3'，OAS1正向5'CGAGGGAGCATGAAAACACATTT3'，OAS1反向5'GCAGAGTTGCTGGTAGTTTATGAC3'，p56正向5'-CCCTGAAGCTTCAGGATGAAGG-3'禾口p56反向5'-AGAAGTGGGTGTTTCCTGCAAG-3'圖ll顯示了OAS-l、p56和IFN-l3基因與持家基因GAPDH的濃度比值的比較結(jié)果。在以聚(I:C)處理細(xì)胞24小時之后IFN基因表達(dá)增加了，這證實了在所用實驗條件下激活了IFN反應(yīng)。未觀察到從以pU6shRNA5、pCMVmiR_31/5、pCMVmiR_122/5、pU6miR_31/5或pU6miR-122/5載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中提取的RNA可誘導(dǎo)IFN-PmRNA。這些數(shù)據(jù)表明了miR表達(dá)盒對HBV標(biāo)記復(fù)制的沉默作用不可能是由干擾素的非特異性誘導(dǎo)和所導(dǎo)致的程序性細(xì)胞死亡(細(xì)胞調(diào)亡)而引發(fā)的。實施例6:由HBVmiR穿梭減弱獨立RNAi介導(dǎo)的沉默的評估細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和RNA提取。如上所述培養(yǎng)HEK293細(xì)胞和Huh7細(xì)胞并轉(zhuǎn)染。在26轉(zhuǎn)染前的一天，將250000HEK293細(xì)胞種入直徑2cm的培養(yǎng)皿中。為評估m(xù)iR-31/5-和miR-122/5表達(dá)質(zhì)粒對獨立RNAi介導(dǎo)沉默的影響，以35-40%的密度將細(xì)胞種入24孔培養(yǎng)皿中，然后以80ngpsi-CHECK-8T、40ngpCMVmiR-31/8和780ngshRNA5或miR5表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過0-10iig范圍的pU6shRNA5轉(zhuǎn)染測定pU6shRNA5質(zhì)粒劑量對pCMVmiR-31/8獨立沉默的影響。類似地，為測定pU6shRNA5對pCH-9/3091的沉默能力，以0-10iig范圍的pU6shRNA5進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在每個孔中以恒定量的1PgpCMVmiR-31/8和pCH-9/3091轉(zhuǎn)染。在所有情況下都包含骨架質(zhì)粒以確保轉(zhuǎn)染等量的總質(zhì)粒DNA。組成性產(chǎn)生eGFP[43]的質(zhì)粒載體也包括在每次共轉(zhuǎn)染中，以采用熒光顯微鏡法確認(rèn)等量轉(zhuǎn)染效率。采用陽離子脂質(zhì)體(Invitrogen，CA，USA)按照供應(yīng)商說明以800ngshRNA-或miR-表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。為生成含有miR8靶點的psi-CHECK-8T，利用引物8T正向5'-CAATGTCAACGACCGACCTT-3'和引物8T反向5'-ACTAGTGCCTCAAGGTCGGT-3'擴(kuò)增HBV基因組的核苷酸1678-1702，并在擴(kuò)增子的3'端引入SpeI位點。將純化片段連接到pTZ-57R/TPCR克隆載體中，并以SalI和SpeI移除插入物再連接到psi-CHECK2.2(Promega，WI，USA)的XhoI和SpeI位點中，以生成在Renilla熒光素酶0RF下游具有HBV耙點的psi-CHECK-8T。按照標(biāo)準(zhǔn)雙脫氧鏈終止法(I叫abaBiotechnology,南非)確認(rèn)所有質(zhì)粒序列。miR穿梭對獨立RNAi介導(dǎo)沉默的影響的評估。為測定miR表達(dá)載體對獨立RNAi介導(dǎo)基因沉默的影響，將含有Renilla熒光素酶0RF下游獨立HBVmiR-31/8耙序列的二元熒光素酶報告質(zhì)粒(psi-CHECK-8T)與pCMVmiR-31/8和每個shRNA5_、miR-31/5-或miR-122/5表達(dá)載體一起進(jìn)行轉(zhuǎn)染(圖12)。符合之前觀察到的由U6PolIH啟動子過量表達(dá)shRNA引起內(nèi)源miR途徑的破壞[36]，在pU6HBVshRNA5的存在下由pCMVmiR-31/8耙向的psi-CHECK-8T沉默降低了。然而以miR-122/5-或miR-31/5-表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染時未觀察到這種影響。這樣的結(jié)果可能是依賴于RNAi效應(yīng)子濃度的，這符合我們所發(fā)現(xiàn)的胞內(nèi)pri-miR衍生指導(dǎo)序列以低于U6shRNA5指導(dǎo)而存在(圖3、4和5)。為確證這一假定，以減少濃度的pU6HBVshRNA5質(zhì)粒和恒定量的CMVmiR-31/8和psi-CHECK_8T耙進(jìn)行共轉(zhuǎn)染(圖13)。在低濃度的pU6HBVshRNA5下實現(xiàn)了有效的miR-31/8介導(dǎo)下調(diào)。然而，當(dāng)pU6HBVshRNA5的量增加時，針對HBV耙點8的效力減弱。相似范圍的pU6HBVshRNA5濃度和pCH-9/3091HBV復(fù)制感受態(tài)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染證明了通過HBV耙點5實現(xiàn)了HBsAg分泌的有效沉默(圖14)。這些數(shù)據(jù)還支持了表達(dá)shRNA5的濃度影響pU6HBVshRNA5對獨立pCMVmiR-31/8沉默的破壞的觀點。重要的是，當(dāng)以抗HBVmiR穿梭表達(dá)盒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時未觀察到對獨立沉默的破壞。實施例7:在體內(nèi)評估抗HBVmiR穿梭對獨立RNAi介導(dǎo)沉默的毒性和破壞小鼠的動力進(jìn)樣和肝熒光素酶活性的測量。為在體內(nèi)測定miR對報告基因活性的影響，使BALB/c小鼠接受0.5iig報告革巴DNA(psi-CHECK-8T)，5ygpCH_9/3091，抗HBV質(zhì)粒(pCMVmiR-31/8、pU6shRNA5、pCMVmiR-31/5或pCMVmiR-122/5)的組合或模擬(pCI-neo骨架)。HDI之后第3天將小鼠處死，收集其肝臟，并在磷酸緩沖鹽溶液中均質(zhì)，再按如上所述測定Renilla和螢火蟲熒光素酶的活性。評估獨立RNAi介導(dǎo)沉默的毒性和破壞。為評估獨立RNAi介導(dǎo)沉默可能的破壞，以及pri-miR穿梭在體內(nèi)對肝細(xì)胞的毒性，還以psi-CHECK-8T二元熒光素酶報告質(zhì)粒和多種抗HBV表達(dá)盒注射小鼠(圖15)。HDI之后第3天測量肝勻漿中的螢火蟲和Renilla熒光素酶活性。以pCMVmiR-31/8實現(xiàn)了選擇性的和有效的Renilla熒光素酶活性沉默。這種下調(diào)未被共注射20倍過量U6shRNA5、CMVmiR-122/5或CMVmiR-31/5所減弱，這表明了在此處所述實驗條件下獨立沉默不受miR穿梭表達(dá)的影響。采用HDI模型，注射程序本身所固有的酶標(biāo)記釋放對肝細(xì)胞的損壞使直接評估由miR模擬物引起的肝毒性變得復(fù)雜。作為由pri-miR穿梭引起對肝細(xì)胞的損害的替代的指示劑，在小鼠組中獨立計算未靶定的和組成型激活psi-CHECK-8T-衍生螢火蟲熒光素酶活性。與未接受RNAi效應(yīng)子的動物相比，在那些接受miR穿梭的小鼠中的肝勻漿中未觀察到螢火蟲熒光素酶活性的減弱。綜合地，這些數(shù)據(jù)顯示了由CMVmiR-31/5和CMVmiR-122/5生成的miR模擬物是體內(nèi)HBV復(fù)制的特異性沉默子且對獨立RNAi介導(dǎo)沉默幾乎無影響。而且，miR表達(dá)盒的效力約等于U6shRNA5序列的效力。實施例8:肝特異性啟動子的miRNA穿梭表達(dá)盒的特征采用表1的引物組從Huh7細(xì)胞中提取的總基因組DNA中擴(kuò)增人a-1抗胰蛋白酶(A1AT)和因子VIII(FVIII)啟動子。采用表1的引物組從質(zhì)粒pCH-9/3091中擴(kuò)增HBV基本核心啟動子(BCP)和PreS2啟動子。通過標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)法(InqabaBiotechnology,南非)合成所有低聚核苷酸。設(shè)計引物以便在擴(kuò)增子的5'端擴(kuò)增引入BglII位點(若為AIAT則是BclI)，在3'端引入HindIII位點。采用高保真延伸(ExpandHighFidelity)PCRpms系統(tǒng)(Roche，德國)按照供應(yīng)商說明擴(kuò)增啟動子序列。在50iU反應(yīng)混合物中建立PCRs，并添加5XExpandHiFiPLUS緩沖液(含MgCl2)，0.2mMdNTPs(dGTP、dATP、dTTP和dCTP)、分別0.5iiM的正向和反向引物、2.5UExpandHiFi腦酶混合物和含lOOpg質(zhì)粒DNA的50ng基因組DNA。PCR條件如下在94°C2分鐘啟動變性；94°C30秒變性，55°C30秒退火并在72t:延伸3分鐘循環(huán)30次(在20-30個循環(huán)期間每個循環(huán)延伸時間增加10秒)；72。C最終延伸7分鐘。表1:擴(kuò)增肝特異性啟動子的低聚核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>限制性酶切位點以粗體表示。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并采用MinElute凝膠提取試劑盒(Qiagen，德國)進(jìn)行洗提。將純化片段連接到PCR克隆載體pTZ57R/T(InsTAclonePCRCloningKit,Fermentas，WI，USA)。將摩爾比為l:3的載體和插入物在16。C連接過夜。以連接混合物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌(XLl-Blue，Invitrogen，CA，USA)，并將其涂布在含氨節(jié)青霉素、X-gal-和IPTG的LuriaBertani瓊脂平板上，然后37。C溫育過夜。選擇插入陽性克隆(白色菌落)進(jìn)行質(zhì)粒純化。將質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化并對產(chǎn)生所需結(jié)果的克隆進(jìn)行測序(I叫abaBiotechnology,南非)。接著，以肝特異性啟動子序列取代pCl-neo內(nèi)的CMV立即早期增強(qiáng)子啟動子序列(圖16)。因此所建立的新表達(dá)載體會在肝特異性啟動子而不是組成型激活CMV啟動子下運行。以Bglll和Hindi11的限制性將編碼FVIII、BCP和PreS2啟動子從它們相應(yīng)的質(zhì)粒(pTZ-FVIII、pTZ-BCP和pTZ-PreS2)消化出。Bell對甲基化很敏感，因此通過dcm-和dam-甲基化酶缺陷株大腸桿菌、GM2929增殖pTZ-AlAT。然后以Bell和Hindi11從pTZ-AlAT中限制性切離編碼A1AT啟動子的序列。用Hindi11和EcoRI消化pCl-neo以產(chǎn)生3815bp、1317bp和340bp片段。其次，用EcoRI和Bglll消化pCl-neo以產(chǎn)生4371bp和llOlbp片段。將肝特異性啟動子序列與340bpHindlII-EcoRI和4371bpEcoRI-Bglll片段連接以產(chǎn)生新肝特異性表達(dá)載體(pCI-AlAT、pCI-FVIII、pCI-BCP和pCI-PreS2)。Bell和Bglll產(chǎn)生的互補(bǔ)末端可使A1AT啟動子序列被連接到pCl-neo骨架上。肝特異性表達(dá)載體功能性評估為評估肝特異性表達(dá)載體的功能性，將編碼螢火蟲熒光素酶的序列克隆到啟動子序列下游。以Nhel和Smal從pCl-neoFLuc中消化出螢火蟲熒光素酶序列，并將其連接到肝特異性表達(dá)載體的等效位點中以生成pCI-AlATFLuc、pCI-FVIIIFLuc、pCI_BCPFLuc和pCI-PreS2FLuc。組織培養(yǎng)將人肝瘤細(xì)胞株、Huh7和人胚腎衍生物、116細(xì)胞維持在添加了10%胎牛血清(GibcoBRL，區(qū))的DMEM生長培養(yǎng)基中(Sigma，M0，USA)。在轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞按40%密度種入24孔培養(yǎng)皿中(CorningInc.，NY，USA)。以100ng不同螢火蟲熒光素酶表達(dá)載體，100ngphRL-CMV和100ngpCI-neoeGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將質(zhì)粒DNA與50iUOpti-MEM(Invitrogen，CA，USA)混合并在室溫下溫育5分鐘。將額外的50ii10pti-MEM與0.5ii1陽離子脂質(zhì)體2000(Invitrogen,CA，USA)混合，也在室溫下溫育5分鐘。溫育期過后，將DNA:0pti-MEM和陽離子脂質(zhì)體Opti-MEM混合物組合，并在室溫下再溫育20分鐘以形成脂質(zhì)DNA復(fù)合物。第二次溫育期之后，往24孔培養(yǎng)皿的每孔中添加100iil轉(zhuǎn)染混合物。將轉(zhuǎn)染重復(fù)三次。將細(xì)胞在37t:和5%0)2下溫育5小時。其后以新鮮培養(yǎng)基替換生長培養(yǎng)基，并將細(xì)胞溫育48小時。熒光素酶試驗采用二元熒光素酶試驗系統(tǒng)(Promega，WI，USA)對轉(zhuǎn)染后48小時的細(xì)胞進(jìn)行原位熒光素酶活性試驗。簡而言之，去除生長培養(yǎng)基，以lOOiU被動性裂解緩沖液在攪動下裂解細(xì)胞15分鐘。將10微升細(xì)胞裂解物分散在光度計平板上，采用Veritas二元注射光度計(TurnerBioSystems，CA，USA)測量螢火蟲熒光素酶和Renilla熒光素酶活性。肝特異性miRNA穿梭載體的生成為生成肝特異性miRNA穿梭載體，以Nhel和Smal從pCI_miR-122/5、pCI-miR-122/6和pCI-miR-122/10中消化出pri-miR-122穿梭，并將其連接到pCI-AIAT、pCI-FVIII、pCI-BCP和pCI-PreS2的等效位點中。肝特異性miRNA穿梭載體功能性評估在轉(zhuǎn)染之前24小時，將細(xì)胞以40%密度種入24孔培養(yǎng)皿中。以80ng耙質(zhì)粒(pCH-FLuc)、800ng不同miRNA穿梭載體、50ngphRL-CMV和50ngpCI-neoeGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞。質(zhì)粒DNA被制成共liig含有pCI-neo，并以50ii1Opti-MEM進(jìn)行稀釋。將一微升陽離子脂質(zhì)體2000稀釋在50ii1Opti-MEM中。如上所述進(jìn)行轉(zhuǎn)染并測量螢火蟲和Renilla熒光素酶活性。構(gòu)建的表達(dá)載體能夠組織特異性表達(dá)螢火蟲熒光素酶以表達(dá)螢火蟲熒光素酶的載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞可實現(xiàn)作為以下兩方面的指示劑的熒光素酶的方便測量(i)構(gòu)建載體功能性和(ii)載體表現(xiàn)組織特異性能力。包括表達(dá)螢火蟲熒光素酶的泛宿主和組成型激活CMV啟動子作為表達(dá)的陽性對照。圖17說明了由不同啟動子原位表達(dá)螢火蟲熒光素酶活性。CMV立即早期啟動子增強(qiáng)子是強(qiáng)大的，組成型激活啟動子，而且如預(yù)期地可在多種細(xì)胞類型中強(qiáng)烈表達(dá)螢火蟲熒光素酶。如所預(yù)期地，在以pCI-neoFLuc轉(zhuǎn)染的Huh7以及116細(xì)胞中的螢火蟲熒光素酶表達(dá)相對于未接受螢火蟲熒光素酶載體(陰性)的細(xì)胞，顯示出高水平的螢火蟲熒光素酶活性。肝特異性表達(dá)載體無一表現(xiàn)出與由pCI-neoFLuc在Huh7細(xì)胞中實現(xiàn)的相同程度。最強(qiáng)表達(dá)是由pC-BCPFLuc實現(xiàn)的，其大約比由CMV啟動子表達(dá)低3倍。由pCI-FVIIIFLuc、pCI-AlATFLuc和pCI-PreS2的表達(dá)大約比pCI-neoFLuc表達(dá)低50、7和25倍。但是，在116細(xì)胞中這些載體的螢火蟲熒光素酶表達(dá)明顯減弱。表達(dá)載體能夠組織特異性表達(dá)miRNA穿梭已證實載體的組織特異性表達(dá)，下一步就是檢測這些載體是否能以組織特異性方式沉默HBV復(fù)制?？笻BVpri-miR-122衍生穿梭被克隆在肝特異性啟動子下游并檢測了它們僅選擇性地在肝源細(xì)胞中抑制HBV標(biāo)記復(fù)制的能力。圖18顯示了通過之前顯示出最佳表達(dá)水平(即pCI-AlAT和pCI-BCP，圖17)的兩個載體下調(diào)螢火蟲熒光素酶活性(如HBV復(fù)制的測量)。在報告載體中，將HBV靶插入如實施例3和圖7所述的螢火蟲熒光素酶開放式讀碼框下游。CMVmiRNA在Huh7細(xì)胞和116細(xì)胞中都下調(diào)HBV復(fù)制，然而pCI-AlAT和pCI-BCPmiRNA載體沉默HBV限于Huh7細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)證實了表達(dá)載體可組織特異性表達(dá)miRNA穿梭。而且在Huh7細(xì)胞中由pCI-AlAT和pCI-BCP表達(dá)載體實現(xiàn)的下調(diào)水平相當(dāng)于由更強(qiáng)大CMV表達(dá)盒所實現(xiàn)的。實施例9:多聚體抗HBVpri-miR31穿梭質(zhì)粒的設(shè)計和增殖原理。通過生成能同時靶向多個HBV位點的盒應(yīng)該可改善病毒復(fù)制的沉默效力。而且，作用于病毒不同源位點的RNAi效應(yīng)子的組合會限制病毒逃逸的幾率并抵抗抗HBVpri-miR穿梭的抑制效力。在圖19中顯示了產(chǎn)生此處用于針對HBV的三聚體pri-miR盒的盒示意圖。miR衍生抗HBV序列。通過成對正向和反向低聚核苷酸的引物延伸生成了含有指導(dǎo)序列靶HBV調(diào)配物1775-1797(靶5)(SEQIDNO:3(135))、1678-1700(耙8)(SEQIDNO:7(137))和1574-1596(耙9)(SEQIDNO:8(138))的pre-miR-31模擬物的編碼DNA。采用亞磷酰胺化學(xué)法(InqabaBiotech,南非)合成了編碼pre-miR序列的低聚脫氧核苷酸。如PCR采用Promega'sPCRMasterMix(Promega，WI，USA)—樣進(jìn)行引物延伸。熱循環(huán)條件如下94°C5分鐘起始變性，之后94°C10秒變性，5(TC10秒退火并在72t:延伸10秒循環(huán)3030次，以及72°C10分鐘的最終延伸步驟。編碼抗HBVmiR穿梭的低聚核苷酸序列是Pre-miR-31/5正向IDNO:78)Pre-miR-31/5反向QIDNO:79)Pre-miR-31/8正向IDNO:80)Pre-miR-31/8反向QIDNO:81)Pre-miR-31/9正向IDNO:82)Pre-miR-31/9反向QIDNO:83)將引物延伸產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳(1%凝膠)，切離并采用Qiagen'sMinEluteTM凝膠提取試劑盒(Qiagen，德國)從凝膠切塊中提取。以大約lOOng的純化擴(kuò)增子作為模板并以具有以下序列的通用正向和反向pri-miR-31引物進(jìn)行擴(kuò)增。Pri-miR-31正向5'-GCTAGCCATAACAACGAAGAGGGATGGTATTGCTCCTGTAACTCGGAACTGGAGAGG-3，(SEQIDNO:84)Pri-miR-31反向5'-AAAAAAACTAGTAAGACAAGGAGGAACAGGACGGAGGTAGCCAAGCTGCTGTCAGACAGGAAGC-3'(SEQIDNO:85)將純化DNA片段連接到pTZ-57R/T(InsTAcloneTMPCR克隆試劑盒，F(xiàn)ermentas，Hanover，MD，USA)上，以分別生成pTZ-57R/Tpri-miR-31/5和pTZ-57R/Tpri_miR-122/5。按照供應(yīng)商的說明進(jìn)行連接和選擇。簡而言之，在22t:溫育2-3小時進(jìn)行連接反應(yīng)。以連接混合物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌，并將其涂布在氨芐青霉素、IPTG、X-gal陽性的LB瓊脂平板上，將平板在37t:溫育過夜。按照標(biāo)準(zhǔn)雙脫氧鏈終止法(InqabaBiotechnology,南非)對插入陽性克隆及其相反方向(相對于P-半乳糖苷酶基因)進(jìn)行測序。通過將pri-miR-31/5、-31/8和31/9序列組合插入CMV立即早期啟動子增強(qiáng)子下游而形成由RNA聚合酶II啟動子表達(dá)的多聚體pri-miR穿梭盒(圖19)。將該盒設(shè)計成包括在5'-3'順序上所有可能組合的單個復(fù)制所有三個單聚體pri-miR模擬物。從而生成總6個三聚體盒(pri-miR-31/5/8/9、-5/9/8、-8/5/9、-8/9/5、-9/5/8和-9/8/5)。為生成pri-miR-31/5/8/9盒，首先以Nhel和EcoRI從pTZpri-miR-31/8上切離pri_miR-31/8，并將其連接到以Spel禾PEcoRI消化的pTZpri-miR-31/5上以構(gòu)建pTZpri-miR-31/5/8。其后，以Nhel和EcoRI從pTZpri-miR-31/9上切離編碼pri-miR-31/9的序列，并將其連接到以Spel和EcoRI消化的pTZpri-miR-31/5/8上。成功的連接生成pTZpri_miR-31/5/8/9。通過類似克隆策略生成其他5個三聚體盒。將以Nhel和Xbal切離的三聚體pri_miR-31盒克隆到pCI-neo(Promega，WI，USA)的等效位點中以生成基于CMVpri-miR-31多聚體質(zhì)粒Northern印跡分析以10iigRNAi效應(yīng)子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染匯合率為40%的10cm直徑培養(yǎng)皿2天之后收集HEK283細(xì)胞，并采用Tri試劑按照供應(yīng)商說明提取總RNA(Sigma，MI，USA)。在尿變性12.5%聚丙烯酰胺凝膠中分辨30gRNA，并將其印染到尼龍膜上。印染是雜交到三個與抗HBV指導(dǎo)5、8和9互補(bǔ)的DNA低聚核苷酸上。以[a-32p]ATP和T4多聚核酸激酶標(biāo)記探針的5'端。采用標(biāo)準(zhǔn)程序純化后，將它們與固定RNA雜交，并曝光于X光膠片，然后剝離并再探查。以與U6snRNA互補(bǔ)的低聚核苷酸序列作為等量負(fù)載的細(xì)胞RNA的對照。探針低聚核苷酸序列是以前和上文描述過pCH-9/3091質(zhì)粒[42]。如上所述進(jìn)行Huh7和HEK293系的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染[39]。如上所述采用Monolisa(ELISA)免疫試劑盒(BioRad，CA，USA)進(jìn)行HBsAg的測量。以10:1禾P1:l比例的U6shRNA5載體和pCH9/3091進(jìn)行試驗，但對于所有其他組合，RNAi表達(dá)載體與pCH9/3091的比例是10:1。采用12孔培養(yǎng)皿格，細(xì)胞接受100ngpCH9/3091和liigRNAi效應(yīng)子質(zhì)粒。組成性產(chǎn)生eGFP[43]的質(zhì)粒載體也包括在每次共轉(zhuǎn)染中，并通過熒光顯微鏡證實相等的轉(zhuǎn)染效率。評估多聚體miR穿梭介導(dǎo)的沉默。為測定miR表達(dá)載體對報告基因沉默的影響，將含獨立靶序列的二元熒光素酶報告質(zhì)粒(psi-CHECK-5T、psi-CHECK-8T和psi-CHECK-9T)與pri-miR穿梭表達(dá)載體一起進(jìn)行轉(zhuǎn)染。組成性產(chǎn)生eGFP.[43]的質(zhì)粒載體也包括在每次共轉(zhuǎn)染中，以利用熒光顯微鏡證實相等的轉(zhuǎn)染效率。以二元熒光素酶分析試劑盒(Promega，WI，USA)并采用Veritas二元注射光度計(TurnerBioSystems，CA，USA)測量Renilla和螢火蟲熒光素酶活性。統(tǒng)計分析。采用student's配對雙尾t-檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)顯著性差異的分析。以Gr即hPadPrism軟件包(GraphPadSoftwareInc.，CA，USA)進(jìn)行計算。以三聚體miR表達(dá)盒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的RNA的Northern印染分析以探針探查與每個指導(dǎo)HBV靶點5、8和9互補(bǔ)的指導(dǎo)序列后從以三聚體表達(dá)盒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中提取RNA進(jìn)行Northern印染雜交，如圖20、21和22所示。在從以每個三聚體pri-miR表達(dá)盒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提取的RNA中可檢測到耙向HBV位點5的推定指導(dǎo)序列(圖20)。檢測到的條帶的大小在長度上大約是20-22個堿基，這表明了對表達(dá)序列存在異源加工。重要地，指導(dǎo)序列的濃度約等于每個三聚體盒且pri-miR5序列的位置不影響加工。除成熟加工指導(dǎo)鏈之外，也可檢測到更大分子量的前體，這表明了轉(zhuǎn)錄物的不完全加工。指導(dǎo)靶向HBV序列8的探針探查也揭示了大約21nt長度的待加工指導(dǎo)(圖21)。不同于pri-miR5衍生指導(dǎo)，成熟序列的大小是均勻的，在Northern印染分析中檢測不到不完全加工前體。重要地，濃度等于除含CMVmiR5-9-8和CMVmiR9_8_5盒的質(zhì)粒之外以每個三聚體盒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)顯示了當(dāng)緊鄰pri-miR9RNA下游時指導(dǎo)8序列的加工是折衷的。采用與序列9互補(bǔ)的探針的類似northern印染雜交分析揭示了在所有分析樣品中都存在加工指導(dǎo)序列(圖22)。但是若觀察的與探針5和8雜交信號相比時濃度明顯下降。檢測的指導(dǎo)9序列濃度也有變化，可在以CMVpri-miR9、CMVpri-miR5-9-8和CMVpri-miR9-8-5轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測到的量產(chǎn)生了最高濃度的指導(dǎo)9耙。然而即使有，這些變化的顯著性也是不明顯的。評估多聚體miR表達(dá)盒的效力為評估下調(diào)的效力，對以表達(dá)pri-miR表達(dá)盒的質(zhì)粒和在Renilla熒光素酶開放式讀碼框下游插入單個HBV耙點的psiCHECK衍生載體共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物進(jìn)行二元熒光素酶試驗(圖23)。對照(模擬處理細(xì)胞)是以報告基因質(zhì)粒和無pri-miR穿梭的骨架pCIneo載體tat共轉(zhuǎn)染。利用Reni1la與組成性表達(dá)的螢火蟲熒光素酶活性的計算比值測定下調(diào)效力，并將對照組值標(biāo)準(zhǔn)化為l。圖23顯示了由此分析獲得的數(shù)據(jù)。當(dāng)與psi-CHECK-5T共轉(zhuǎn)染時所有6個三聚體pri-miR穿梭盒都能夠明顯沉默Renilla熒光素酶活性。實現(xiàn)了大約85-90%的下調(diào)效力。當(dāng)采用psi-CHECK-8T耙載體時，6個三聚體表達(dá)質(zhì)粒的4個實現(xiàn)了有效沉默(大約90%)。然而CMVmiR5-9-8和CMVmiR9_8_5盒不能實現(xiàn)沉默，Renilla熒光素酶活性等于模擬處理細(xì)胞的活性。重要地，這個觀察與Northern印染分析的結(jié)果一致，這顯示了針對靶點8的指導(dǎo)序列沒有效力(圖21)。因此如所預(yù)期的，低的RNAi效應(yīng)子生成效力與沉默不足直接相關(guān)。當(dāng)估計共轉(zhuǎn)染對來自psi-CHECK-9T質(zhì)粒的Renilla熒光素酶活性的影響時，效力低于以psi-CHECK-5T和psi-CHECK-8T靶報告所實現(xiàn)的。這些細(xì)胞的Renilla熒光素酶活性大約為模擬處理細(xì)胞的45-75%。這又與Northern印染的數(shù)據(jù)一致，33其中與序列5和8指導(dǎo)相比，加工指導(dǎo)序列的量是下降的(圖22)。而且，以CMVmiR5-9-8和CMVmiR9-8-5載體實現(xiàn)了最佳沉默(大約75%)，其也是可生成最大量的成熟指導(dǎo)9序列的盒(圖20)。還測定了多聚體pri-miR表達(dá)盒對培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞分泌HBsAg的影響(圖24)。每個三聚體盒都可以抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌HbsAg，且可實現(xiàn)的下調(diào)為〉90X。這個高效力的下調(diào)幾乎等于模擬處理細(xì)胞的本底信號。因此，在培養(yǎng)細(xì)胞中，三聚體盒可以有效沉默HBV復(fù)制的標(biāo)記。獵綜合地，這些數(shù)據(jù)證實了三聚體pri-miR表達(dá)盒能夠生成單個抗HBV指導(dǎo)序列，該序列含HBV靶點的報告基因構(gòu)建體的有效沉默子。指導(dǎo)序列生成的效率是不均一的，可能取決于miR穿梭(例如由pri-miR9穿梭實現(xiàn)較低的加工和沉默)以及外周pri-miRs(例如當(dāng)緊鄰primiR9序列下游時實現(xiàn)更低的pri-miR8沉默)的固有序列特征。實施例10:由外源病毒基因HCV5'UTR轉(zhuǎn)錄物的下調(diào)實現(xiàn)的基于miR31的發(fā)夾設(shè)計材料和方法克隆到pTAG-A的HCV5'UTR區(qū)的DNA序列是由英國格拉斯哥大學(xué)病毒研究所的RichardM.Elliot教授捐贈的。pGL3-Basic、二元Glo熒光素酶分析系統(tǒng)、和pGEM-TEasy載體試劑盒是來自Promega，USA。BenchToplkbDNAladder、InsTAclonePCR克隆試劑盒和PCRMasterMix(2X)是來自立陶宛Fermentas。低聚核苷酸引物是來自IDT，USA。限制性內(nèi)切酶PstI、EcoRI、Xhol和Xbal是來自NewEnglandBiolabs，USA。a-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)、氨芐青霉素、陽離子脂質(zhì)體200()TM是來自Sigma，區(qū)。QIApr印Spin小量制備試劑盒和QIAGENEndofree大量制備試劑盒是來自德國Qiagen。RPMI、FCS、青霉素/鏈霉素和OptiMEM是來自Gibco，UK。Nucleospin試劑盒是來自德國Machery-Nagel。Veritas微板光度計是來自T證erBiosystems，USA。HCV5'UTR靶序列和螢火蟲熒光素酶編碼序列的亞克隆以質(zhì)粒構(gòu)建體pTAG-A作為模板，正向引物F5'UTRXhoI(ATTACTCGAGTTCACGCAGAAAGCGTC;SEQIDNO:96)和反向引物R5，UTREcoRI(ATTAGAATTCGAACTTGACGTCCTGTGG;SEQIDNO:97)通過PCR擴(kuò)增HCV5'UTR區(qū)(SEQIDNO:34)的DNA序列。F5'UTRXhoI和R5'UTREcoRI由4個間隔子5'-末端核苷酸、ATTA、分別識別用于以后定向克隆和篩選目的的Xhol和EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶的6-nt序列，和分別與其中包括了第一個351nt的HCV轉(zhuǎn)錄物的HCV5'UTR區(qū)5'禾P3'端互補(bǔ)的序列所組成。類似地以pGL-3-Basic為模板，正向引物FLucEcoRI(ATTAGAATTCATGGAAGACGCCAAAAAC;SEQIDNO:98)和反向引物RLucXbal(ATTATCTAGATTACACGGCGATCTTTCC;SEQIDNO:99)擴(kuò)增螢火蟲熒光素酶的編碼區(qū)。FLucEcoRI和RLucXbal是由4個間隔子5'-末端核苷酸、ATTA、分別識別用于以后定向克隆和篩選目的的EcoRI和Xbal限制性內(nèi)切核酸酶的6-nt序列，和分別與其中包括了1653nt全長的螢火蟲熒光素酶編碼序列的5'和3'端互補(bǔ)的序列所組成。PCR反應(yīng)在50ii1終體積的溶液中進(jìn)行，該溶液含有模板DNA[2ii1，100ng]、正向引物[ly1100iiM]、反向引物[lii1100iiM]、PCRMasterMix(2X)[25ii1]。PCR反應(yīng)條件為94°C2分鐘；94。C30s，55。C1分鐘，72。C2.5分鐘，30個循環(huán)；72。C10分鐘。通過如實施例1所述的瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)PCR產(chǎn)物的長度。分辨BenchToplkbDNAladder作為分子標(biāo)記。在UV射線下顯現(xiàn)分辨好的PCR產(chǎn)物。采用pGEM(D"TEasy載體試劑盒，在終體積ioyl的含有2x快速連接緩沖液]和T4連接酶[3U，liU]連接反應(yīng)液中，將來自HCV5'UTR和螢火蟲熒光素酶PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物[1ii1]連接到pGEM-T[lii1]上以分別產(chǎn)生pGEM-T-UTR和pGEM-T-LUC。將連接反應(yīng)液在15t:溫度過夜之后轉(zhuǎn)化到[5iU]感受態(tài)埃希式大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5a[50y1]。將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液[55y1]在冰上溫育30分鐘，并在42。C熱激2分鐘，冰上溫育2分鐘之后涂布在含0.lmg/ml氨芐青霉素并散布有a_D_吡喃半乳糖苷(X-gal)[40iil，在匿S0的20mg/ml]的2xYT肉湯瓊脂平板上。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案制備感受態(tài)大腸桿菌DH5a細(xì)胞。將平板在37。C溫育16小時。采用實施例1所述的QIApr印Spin小量制備試劑盒通過改良標(biāo)準(zhǔn)堿性裂解法從顯示為pGEM-T-UTR和pGEM-T-LUC轉(zhuǎn)化的白色克隆的轉(zhuǎn)化株大腸桿菌培養(yǎng)物中提取推定質(zhì)粒DNA。然后在供應(yīng)商提供的緩沖液中以實施例1所述的5UEcoRI限制性酶切篩選推定質(zhì)粒DNA。將顯示出預(yù)期長度的DNA片段的質(zhì)粒DNA用于進(jìn)一步的克隆?？寺CV5，UIR耙表達(dá)構(gòu)建體(pCineoUTRLUC)批量(bulk)限制內(nèi)切核酸酶消化制備pGEM-T-UTR、pGEM-T-LUC和pCineoHBX質(zhì)粒DNA。以Xhol和EcoRI限制pGEM-T-UTR，以EcoRI和Xbal限制pGEM+LUC，并以Xhol和Xbal限制pCineoHBX。利用pCineoHBX替換pCineo以更好地分離雙限制性pCineo載體片段。體積消化液是由質(zhì)粒DNA[60iil，200ng/ia]、10XEcoRI緩沖液，、第一種酶[20U，4iU]、第二種酶[20U，4iU]和水[22iU]組成的。將批量(bulk)消化液在37"溫度1.5小時，如上通過瓊脂糖凝膠電泳分辨和凝膠純化。對于凝膠純化將適宜條帶從凝膠中切離并采用Nucleospin試劑盒提取。簡而言之，將緩沖BT[300iU]添加到凝膠切片中并將瓊脂糖樣品在5(TC溫育IO分鐘且頻繁顛轉(zhuǎn)。將融化的瓊脂糖樣品加載至Nucleospin柱中并在12000xg離心30秒。然后以緩沖NT3[700將Nucleospin柱離心洗滌兩次。通過加入洗脫緩沖液NE[50iil，5mMTris-HCl，pH8.5]之后在12000xg離心1分鐘以洗脫結(jié)合DNA。在終體積為21ii1的含有2x快速連接緩沖液[10ii1]和T4連接酶[3U，1yl]的連接反應(yīng)液中按l:3:3比例的5'UTR:LUC:pCineo[liil:3iU:3iU]將洗脫DNA片段連接在一起。將連接反應(yīng)液在15t:溫育過夜并如上轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5a。如上以在lxBufferTango[3.3mMTris乙酸、pH7.9at37°C、lmM醋酸鎂、6.6mM醋酸鉀、0.lmg/mlBSA]的5USphl通過限制性酶切提取和篩選推定質(zhì)粒DNA。批量DNA的制備如實施例1所示。sh260和miR260的電子(insilico)設(shè)計以miR-30(圖25)和miR-31(圖26)[41]的結(jié)構(gòu)作為基礎(chǔ)設(shè)計耙向HCV5'UTR的miR-30樣(SEQIDNO:35(164))和miR-31樣(SEQIDNO:1(133))發(fā)夾。簡而言之，發(fā)夾設(shè)計途徑如下將在Yokotaetal.(2003)[48]中公開為"siRNA331"的siRNA改造成HCV鏈5a特異性的sh30-260和miR31_260設(shè)計以分別產(chǎn)生sh260和miR31_260，采用標(biāo)準(zhǔn)生物信息學(xué)軟件電子定位(insilico)使錯配發(fā)生在正義鏈中。將U6啟動子起始序列的鳥嘌呤堿基電子定位插入miR-30樣(sh260，圖27，SEQIDNO.36(165))和miR-31樣(miR260，圖28，SEQIDNO.37(166))發(fā)夾的開始且在3'端插入由一排六個尿嘧啶堿基組成的終止序列。將sh260和miR260的RNA序列轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的DNA序列并電子定位插入到U6啟動子DNA序列的下游以形成sh260和miR260表達(dá)盒。克隆sh260和miR260表達(dá)構(gòu)建體(pTz57R-sh260和pTz57R-miR260)在兩步PCR反應(yīng)中將U6啟動子的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，期間sh260或miR260的DNA序列被插入到U6啟動子的下游。對于sh260:在所有PCR步驟中使用與24_nt的U6啟動子5'端互補(bǔ)的正向引物，F(xiàn)U6(ATTAGAATTCAAGGTCGGGCAGGAAGAG)(SEQIDNO:100)和4個間隔子5'-末端核苷酸、ATTA。在第一輪PCR中，使用反向引物，RU6-sh260-l(ACCCCCATCTGTGGCTTCACAGGGTGCACGGGATCTACGAGACCTTCGCCGGTGTTTCGTCCTTTCC)(SEQIDNO:101)。在第二輪PCR中，使用反向引物RU6-sh260-2(GTCGACAAAAAAGCAGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCCCCATCTGTGGCTTCACAGG)(SEQIDNO:102)。對于miR260:在所有PCR步驟中使用與24_nt的U6啟動子5'端互補(bǔ)的正向引物，(ATTAGAATTCAAGGTCGGGCAGGAAGAG)(SEQIDNO:103)，和4個間隔子5'-末端核苷酸、ATTA。在第一輪PCR中，使用反向引物，RU6-miR31-260-1(GCTTCCCAGTTCAAGAGGTCTCGTAGACCGTGCACTCCTCTCCAGTTCCGAGTTACAGCGGTGTTTCGTCCTTTCC)(SEQIDNO:104)。在第二輪PCR中，使用反向引物，RU6_miR31-260-2(GTCGACAAAAAAGCTGCTGTCCAGACAGGAAAGATGTGCATGGTATACGAGACCAGCTTCCCAGTTCAAGAGGTCTC)(SEQIDNO:105)。第一次PCR反應(yīng)在50ii1終體積中含有pTz57-U6模板[1iU，100ng];FU6引物[lii16mM);反向引物[2ii16mM];dNTPs[lii1lOOmM];GoTaqPCR體系酶;和GoTaq⑧PCR體系10x緩沖液[5yl]。PCR反應(yīng)條件是94°C，2分鐘；94°C30秒，55°C1分鐘，72t:2.5分鐘，30個循環(huán)；72°C10分鐘。除了替換模板和反向引物之外，第二次PCR反應(yīng)含有與第一次相同的試劑。以l微升的第一次PCR反應(yīng)混合液作為模板采用相同的正向引物FU6和第二種反向引物在第二輪PCR進(jìn)行擴(kuò)增。通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)來自第二輪PCR的PCR產(chǎn)物長度并將其連接到pTz57R/T上。簡而言之，將第一和第二輪PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物[5iU]加入瓊脂糖凝膠上樣緩沖液[5iil，30^甘油v/v，0.25%w/v溴酚藍(lán)]中，并在TBE緩沖液[45mMTris，45mM硼酸鹽，ImMEDTA，pH8.3]中的含有溴化乙啶的瓊脂糖凝膠[50ml，0.8%w/v]中在100V下分辨2小時。分辨以Pstl消化的ADNA作為分子標(biāo)記。在UV射線下顯現(xiàn)分辨好的PCR產(chǎn)物。通過如實施例1所述的EcoRI限制性酶消化篩選推定pTz57R-sh260轉(zhuǎn)化物和推定pTz57R-miR260轉(zhuǎn)化物，并如前所述通過瓊脂糖凝膠電泳分辨消化片段。還采用FU6和RU6-sh260-2在如上所述擴(kuò)增條件下通過PCR乘PCR擴(kuò)增所提取的質(zhì)粒DNA確定推定pTz57R-sh260。采用QIAGENEndofree大量制備試劑盒按照供應(yīng)商說明制備純化的pTz57R-sh260和pTz57R_miR260。培養(yǎng)Huh-7細(xì)胞將人肝瘤細(xì)胞系Huh-7在增濕空氣中于37t:，5X0)2下維持在添加了10%胎牛血清(FCS)、青霉素(100UmL—0和鏈霉素(100UmL—0[完全培養(yǎng)基]的RPMI培養(yǎng)基中。通36常每2-3天將細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)并維持在6cm培養(yǎng)皿中。所有溶液在使用前預(yù)熱。在37t:下將細(xì)胞在lx胰蛋白酶/EDTA中胰蛋白酶作用3-5分鐘。通過加入等體積的含10%FCS的DMEM終止胰蛋白酶反應(yīng)，且在臺式離心機(jī)中以2000rmp離心2分鐘收集細(xì)胞。將細(xì)胞團(tuán)重懸在完全培養(yǎng)基[5ml]中，該懸浮液用于在6cm培養(yǎng)皿中種入[lml]新鮮完全培養(yǎng)基[15ml]。以pCineoUTRLUC、pCMV-Ren、pTz57R-sh260和pTz57R-miR260共轉(zhuǎn)染HuH-7細(xì)胞，并通過光度計測量分析HCV5'UTR下調(diào)采用陽離子脂質(zhì)體2000按照供應(yīng)商的說明在播種匯合率為60%的6孔培養(yǎng)板中以pCineoUTRLUC、pCMV-Ren禾PpTz57R-sh260或pCineoUTRLUC、pCMV-Ren和pTz57R-miR260，或pCineoUTRLUC、pCMV-Ren和pTz57R-miR118(以低效力表達(dá)耙向丙型肝炎病毒的miR31發(fā)夾的表達(dá)構(gòu)建體，而此處用作陰性對照)瞬時共轉(zhuǎn)染HuH-7細(xì)胞三份。pCMV-Ren用于表達(dá)Renilla熒光素酶作為內(nèi)效率的轉(zhuǎn)染對照。每次轉(zhuǎn)染都含有pCineoUTRLUC[100ng]、pCMV-Ren[50ng]和pTz57R構(gòu)建體[1Pg]。質(zhì)粒DNA:每次反應(yīng)按如下制備陽離子脂質(zhì)體2000復(fù)合溶液將預(yù)溫的陽離子脂質(zhì)體2000[每次反應(yīng)4i！1]加入到OptiMEM[每次反應(yīng)150ii1]，并使其在室溫下溫育15分鐘。將質(zhì)粒DNA[每次反應(yīng)1.06iil總DNA]加到OptiMEM[每次反應(yīng)150y1]，并使其在室溫下溫育15分鐘。然后將陽離子脂質(zhì)體2000和質(zhì)粒DNA溶液組合，通過吸液溫和地混合并使其在室溫下復(fù)合15分鐘以發(fā)生轉(zhuǎn)染反應(yīng)。將種入?yún)R合率為60%的12孔培養(yǎng)皿以PBS進(jìn)行洗滌。然后將每個分離的轉(zhuǎn)染反應(yīng)液加至孔內(nèi)并在增濕空氣，37t:和5%C02中溫育2小時。然后移除轉(zhuǎn)染反應(yīng)液，添加完全培養(yǎng)基[2ml]，將培養(yǎng)皿在增濕空氣，37t:和5%C02中溫育48小時。為評估HCV5'UTR下調(diào)，采用二元GloTM熒光素酶試驗系統(tǒng)評估了熒光素酶的表達(dá)。溫育48小時之后，以PBS將轉(zhuǎn)染細(xì)胞洗滌三次之后，在細(xì)胞中直接添加lxPLB緩沖液[100ia]，接著在室溫下溫和振蕩30分鐘。然后將細(xì)胞裂解物[20iU]從每個轉(zhuǎn)染孔分散至白色不透明的光度計微孔板上。采用Veritas微孔板光度計進(jìn)行光度測量。P和M進(jìn)樣器分別注入熒光素酶試驗試劑II(LARII)和終止和Glo試劑。微孔板置于光度計上，并在每孔中進(jìn)樣LARII[100yl]之后以2秒預(yù)測量延遲和10秒整合讀取光度值以檢測螢火蟲熒光素酶。用M進(jìn)樣器中往每孔中進(jìn)樣終止和Glo試劑[100iU]，并以2秒預(yù)測量延遲和10秒整合讀取光度值以檢測renilla熒光素酶。重復(fù)實驗。通過計算螢火蟲/renilla光度比并標(biāo)準(zhǔn)化由pTz57R-sh260和pTz57R-miR260轉(zhuǎn)染獲得的與pTz57R-miR118轉(zhuǎn)染獲得的比值以分析讀數(shù)。采用StudentsT-檢驗計算統(tǒng)計差異。結(jié)果和討論克隆HCV5，UTR耙表達(dá)構(gòu)建體(pCineoUTRLUC)HCV5'UTR和螢火蟲熒光素酶PCR擴(kuò)增成功地產(chǎn)生了346bp禾P1653bpDNA產(chǎn)物(圖29A，第2和3道)。PCR產(chǎn)物被成功地連接到如通過限制性內(nèi)切核酸酶消化所示的pGEM-T上(圖29B和29C)。以EcoRI限制pGEM+UTR和pGEM+LUC分別產(chǎn)生了3015bp和346bp(圖29B，第3-12道)，3015bp和1653bp(圖29C，第4、5、7_9和11道)的預(yù)期片段。為pGEM-T-UTR選擇克隆2并為pGEM-T-LUC選擇克隆3以進(jìn)一步克隆。HCV5'UTR和螢火蟲熒光素酶DNA被成功地亞克隆到pCineo以產(chǎn)生pCineoUTRLUC(圖30)。由克隆l-5、8-12、17-19、21和22中提取的質(zhì)粒DNA的Sphl-限制性酶切產(chǎn)生了4593bp、2026bp和779bp的預(yù)期片段(圖30，，第3-7、10-14、19-21和23-24道)。選擇克隆1。sh260和miR31_260的設(shè)計和pTz57R_sh260和pTz57R-miR31260的克隆通過在線軟件程序mF0LD[49]預(yù)測，miR_30[41](圖25)的預(yù)測結(jié)構(gòu)未展現(xiàn)出類似于sh260(圖27，SEQIDNO:36)的預(yù)測結(jié)構(gòu)。但是，miR_31(圖26)的預(yù)測結(jié)構(gòu)展現(xiàn)出類似于所設(shè)計的miR260(圖28，SEQIDNO:4)的結(jié)構(gòu)，這顯示了miR260具有典型的miR31二級結(jié)構(gòu)。sh260和miR260表達(dá)構(gòu)建體的克隆(pTz57R-sh260和pTz57R_miR260)pTz57R-sh260:通過瓊脂糖凝膠電泳確定了兩步PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物長度，第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物是大約347bp(圖31A，第2道)而第二輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物是大約486bp(圖31A，第3道)。對于克隆1-4和6，推定pTz57R-sh260的PCR篩選成功地產(chǎn)生了486bp的PCR產(chǎn)物(圖31B，第2-5和7道)。以SalI從克隆3中消化推定pTz57R-sh260產(chǎn)生了2S86bp和386bp的預(yù)期片段(圖31C，第2道)。因此選擇克隆3。pTz57R-miR260:通過瓊脂糖凝膠電泳確定了兩步PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物長度，第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物是大約323bp(圖32A，第8道)而第二輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物是大約377bp(圖32B，第8道)。以SalI從克隆1中消化推定pTz57R-miR260產(chǎn)生了2886bp和377bp的預(yù)期片段(圖32C，第1道)。因此選擇克隆l。miR260表達(dá)比sh260產(chǎn)生了更好的HCV5'UTR下調(diào)為測定sh260和miR260是否下調(diào)HCV5'UTR區(qū)的表達(dá)，我們將5'UTR融合到螢火蟲熒光素酶指示基因中。當(dāng)與陰性對照的miR118相比時，sh260(p=0.000562004)和miR260(p=9.96473E-05)都可以明顯地下調(diào)指示基因的表達(dá)(圖33)，但是相對sh260(26%)，miR260實現(xiàn)了更強(qiáng)的下調(diào)(50%)。因此發(fā)現(xiàn)基于miR-31設(shè)計的miR260在耙向HCV5'UTR轉(zhuǎn)錄物中比sh260更有效。當(dāng)參照特定其實施方式具體描述本發(fā)明時，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到對本發(fā)明所作的各種變更，修改和其他變化都未偏離本發(fā)明的實質(zhì)和范圍。因此權(quán)利要求覆蓋或包含了所有這些修改，變更和/或變化。參考文獻(xiàn)1.MWassenegger，TPelissier(1998):AmodelforRNA-mediatedgenesilencinginhigherplants.PlantMolBiol37:349.2.HNgo，CTschudi，KGull，EUllu(1998):Double-strandedRNAinducesmRNAdegradationinTrypanosomabrucei.ProcNatlAcadSciUSA95:14687.3丄Misquitta，BMPaterson(1999)-TargeteddisruptionofgenefunctioninDrosophilabyRNAinterference(RNA-i):arolefornautilusinembryonicsomaticmuscleformation.ProcNatlAcadSciUSA96:1451.4.NJCaplen，JFleenor，AFire，RAMorgan(2000):dsRNA-mediatedgenesilencinginculturedDrosophilacells:atissueculturemodelfortheanalysisofRNAinterference.Gene252:95.5.YXLi，MJFarrell，RLiu，NMohanty，MLKirby(2000):Double-strandedRNAinjectionproduces皿llphenotypesinzebrafish.DevBiol217:394.386.HAkashi，MMiyagishi，TYokota，TWatanabe，THino，KNishina，MKohara，TK.(2005):EscapefromtheinterferonresponseassociatedwithRNAinterferenceusingvectorsthatencodelongmodifiedhairpin—RNA.MolecularBioSystems1:382.7.EMMaine(2000):Aconservedmechanismforpost-transcriptionalgenesilencingGenomeBioll:1018.8.GJHarmon(2002)長interference.Nature418:244.9.GHutvagner，PDZamore(2002):AmicroRNAinamultiple-turnoverRNAienzymecomplex.Science297:2056.10.SMElbashir，WLendeckel，TTuschl(2001):RNAinterferenceismediatedby21-and22-nucleotideRNAs.GenesDev15:188.11.MJiang，JMilner(2002)-SelectivesilencingofviralgeneexpressioninHPV_positivehumancervicalcarcinomacellstreatedwithsiRNA，aprimerofRNAinterference.Oncogene21:6041.12.XZou，DRay，AAziyu，KChristov，ADBoiko，AVGudkov，HKiyokawa(2002):Cdk4disruptionrendersprimarymousecellsresistanttooncogenictransformation,leadingtoArf/p53_independentsenescence.GenesDev16:2923.13.AJHamilton,DCBaulcombe(1999):AspeciesofsmallantisenseRNAinposttranscriptionalgenesilencinginplants.Science286:950.14.EBernstein,AACaudy，SMHammond,GJHarmon(2001):RoleforabidentateribonucleaseintheinitiationstepofRNAinterference.Nature409:363.15.SMElbashir，JHarborth，WLendeckel，AYalcin，KWeber，TTuschl(2001):Duplexesof21—nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature411:494.16.TDalmay，RHorsefield，THBraunstein，DCBaulcombe(2001):SDE3encodesanRNAhelicaserequiredforpost—transcriptionalgenesilencinginArabidopsis.EmboJ20:2069.17.ANykanen，BHaley，PDZamore(2001):ATPrequirementsandsmallinterferingRNAstructureintheRNAinterferencepathway.Cell107:309.18.ASmardon，JMSpoerke，SCStacey，MEKlein，NMackin，EMMaine(2000):EG0—1isrelatedtoRNA—directedRNApolymeraseandfunctionsingerm_linedevelopmentandRNAinterferenceinC.elegans.CurrBiol10:169.19.AFire，SXu，MKMontgomery,SAKostas，SEDriver,CCMello(1998):Potentandspecificgeneticinterferencebydouble—strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature391:806.20.HKawasaki,KTaira(2004)-InductionofDNAmethylationandgenesilencingbyshortinterferingRNAsinhumancells.Nature.21.JGil，MEsteban，DRoth(2000):InvivoregulationofthedsRNA-dependentproteinkinasePKRbythecellularglycoproteinp67.Biochemistry39:16016.22.MRPlayer,PFTorrence(1998):The2-5Asystem:modulationofviralandcellularprocessesthroughaccelerationofRNAdegradation.PharmacolTher78:55.23.MKumar，GGCarmichael(1998):AntisenseRNA:functionandfateofduplexRNAincellsofhighereukaryotes.MicrobiolMolBiolRev62:1415.24.SAgrawal，QZhao(1998):Antisensetherapeutics.Curr0pinChemBiol2:519.25.MMiyagishi，KTaira(2002):U6promoter-drivensiRNAswithfoururidine3'overhangsefficientlysuppresstargetedgeneexpressioninmammaliancells.NatBiotechno120:497.26.NSLee，TDohjima，GBauer，HLi，MJLi，AEhsani，PSalvaterra，JRossi(2002)-ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-lrevtranscriptsinhumancells.NatBiotechno120:500.27.TRBrummelkamp，RBernards,RAgami(2002):AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancells.Science296:550.28.PJPaddison，AACaudy，EBernstein,GJHa翻n，DSConklin(2002):ShorthairpinRNAs(shRNAs)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells.GenesDev16:948.29.GSui，CSoohoo，BAffarel，F(xiàn)Gay，YShi，WCForrester(2002):ADNAvector—basedRNAitechnologytosuppressgeneexpressioni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所述人工pri-miR序列是SEQIDN0:136或與其具有至少90%序列同一性的序列，且編碼所述人工pri-miR序列的DNA序列是SEQIDNO:4。17.根據(jù)權(quán)利要求l-9任意一項所述的表達(dá)盒，其中所述人工pri-miR序列是SEQIDN0:137或與其具有至少90%序列同一性的序列，且編碼所述人工pri-miR序列的DNA序列是SEQIDNO:7。18.根據(jù)權(quán)利要求l-9任意一項所述的表達(dá)盒，其中所述人工pri-miR序列是SEQIDNO:138或與其具有至少90%序列同一性的序列，且編碼所述人工pri-miR序列的DNA序列是SEQIDNO:8。19.根據(jù)權(quán)利要求l-9任意一項所述的表達(dá)盒，其中所述人工pri-miR序列是SEQIDNO:139或與其具有至少90%序列同一性的序列，且編碼所述人工pri-miR序列的DNA序列是SEQIDNO:9。20.根據(jù)權(quán)利要求l-9任意一項所述的表達(dá)盒，其中所述人工pri-miR序列是SEQIDNO:140或與其具有至少90%序列同一性的序列，且編碼所述人工pri-miR序列的DNA序列是SEQIDN0:10。21.根據(jù)權(quán)利要求l-9任意一項所述的表達(dá)盒，其中所述人工pri-miR序列是SEQIDNO:165或與其具有至少90%序列同一性的序列，且編碼所述人工pri-miR序列的DNA序列是SEQIDNO:36。22.根據(jù)權(quán)利要求1-9任意一項所述的表達(dá)盒，其中所述人工pri-miR序列是SEQIDNO:166或與其具有至少90%序列同一性的序列，且編碼所述人工pri-miR序列的DNA序列是SEQIDNO:37。23.根據(jù)權(quán)利要求1-22任意一項所述的表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括啟動子/轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。24.根據(jù)權(quán)利要求l-23任意一項所述的表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括終止信號。25.根據(jù)權(quán)利要求l-24任意一項所述的表達(dá)盒，該表達(dá)盒是包含兩個或多個權(quán)利要求1(i)部分所述人工pri-miR序列的二聚體或多聚體表達(dá)盒。26.根據(jù)權(quán)利要求1-25任意一項所述的表達(dá)盒，當(dāng)其在體外或體內(nèi)表達(dá)時能夠抑制或沉默肝炎病毒基因的表達(dá)。27.—種載體，該載體包含根據(jù)權(quán)利要求1-26任意一項所述的表達(dá)盒。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的載體，該載體是病毒或非病毒載體。29.—種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含根據(jù)權(quán)利要求l-28任意一項所述的表達(dá)盒或載體。30.—種治療或預(yù)防肝炎的組合物，該組合物包括根據(jù)權(quán)利要求l-26任意一項所述的表達(dá)盒或根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的載體和藥學(xué)可接受佐劑和/或載體。31.根據(jù)權(quán)利要求1-26任意一項所述的表達(dá)盒或根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的載體在制備用于治療或預(yù)防肝炎方法的藥物的方法中的應(yīng)用。32.—種抑制或沉默肝炎病毒基因表達(dá)的方法，該方法包括將有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求1-26任意一項所述的表達(dá)盒或根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的載體給藥至患者。33.—種抑制或沉默肝炎病毒基因表達(dá)的方法，該方法包括以下步驟(i)將根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物體中；禾口(ii)表達(dá)包含在根據(jù)權(quán)利要求1-26任意一項所述的表達(dá)盒內(nèi)的人工pri-miR。34.—種編碼模擬天然存在miR序列的人工pri-miR序列的DNA序列，其中所述人工pri-miR序列不同于所述天然存在pri-miR序列在于所述天然存在pri-miR序列的指導(dǎo)序列和指導(dǎo)的互補(bǔ)序列被靶向肝炎病毒的序列所置換，且當(dāng)其被PolII啟動子所轉(zhuǎn)錄時會造成肝炎病毒基因表達(dá)的沉默或抑制。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的DNA序列，其中所述肝炎病毒是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。36.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的DNA序列，其中所述天然存在miR序列選自miR_30、miR-31和miR-122。37.根據(jù)權(quán)利要求34-36任意一項所述的DNA序列，其中所述肝炎靶序列選自以下SEQIDNOs中的任意一序列11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、38、39和106;與其具有至少90%的序列同一性的序列；與任意一項上述序列互補(bǔ)的核酸序列；與任意一項上述序列特異性雜交的核酸序列；或嗜肝DNA病毒的同源序列。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的DNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDNO:11或SEQIDNO:109，或與其具有至少90%序列同一性的序列。39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的DNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDNO:12或SEQIDNO:110，或與其具有至少90%序列同一性的序列。40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的DNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDNO:13或SEQIDNO:lll，或與其具有至少90%序列同一性的序列。41.根據(jù)權(quán)利要求37所述的DNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDNO:14或SEQIDNO:112，或與其具有至少90%序列同一性的序列。42.根據(jù)權(quán)利要求37所述的DNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDNO:106或SEQIDNO:171，或與其具有至少90%序列同一性的序列。43.根據(jù)權(quán)利要求34-37任意一項所述的DNA序列，其是SEQID冊3或與其90%相同的序列。44.根據(jù)權(quán)利要求34-37任意一項所述的DNA序列，其是SEQID冊4或與其90%相同的序列。45.根據(jù)權(quán)利要求34-37任意一項所述的DNA序列，其是SEQID冊7或與其90%相同的序列。46.根據(jù)權(quán)利要求34-37任意一項所述的DNA序列，其是SEQIDNO:8或與其90%相同的序列。47.根據(jù)權(quán)利要求34-37任意一項所述的DNA序列，其是SEQIDNO:9或與其90%相同的序列。48.根據(jù)權(quán)利要求34-37任意一項所述的DNA序列，其是SEQID冊10或與其90%相同的序列。49.根據(jù)權(quán)利要求34-37任意一項所述的DNA序列，其是SEQIDNO:36或與其90%相同的序列。50.根據(jù)權(quán)利要求34-37任意一項所述的DNA序列，其是SEQID冊37或與其90%相同的序列。51.—種模擬天然存在miR序列的人工pri-miR序列，其中所述人工pri-miR序列不同于所述天然存在pri-miR序列在于所述天然存在pri-miR序列的指導(dǎo)序列和指導(dǎo)的互補(bǔ)序列被靶向肝炎病毒的序列所置換，且當(dāng)其被PolII啟動子所轉(zhuǎn)錄時會造成肝炎病毒基因表達(dá)的沉默或抑制。52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的RNA序列，其中所述肝炎病毒是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。53.根據(jù)權(quán)利要求51或52所述的RNA序列，其中所述天然存在miR序列選自miR-30、miR-31和miR-122。54.根據(jù)權(quán)利要求51-53任意一項所述的RNA序列，其中所述肝炎靶序列選自以下SEQIDN0s中的任意一序列141、142、143、144、145、146、146、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、167、169和172的任意一項；與其具有至少90%的序列同一性的序列；與任意一項上述序列互補(bǔ)的核酸序列；與任意一項上述序列特異性雜交的核酸序列；或嗜肝DNA病毒的同源序列。55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的RNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDN0:141，或與其具有至少90%序列同一性的序列。56.根據(jù)權(quán)利要求54所述的RNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDN0:142，或與其具有至少90%序列同一性的序列。57.根據(jù)權(quán)利要求54所述的RNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDNO:143，或與其具有至少90%序列同一性的序列。58.根據(jù)權(quán)利要求54所述的RNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDN0:144，或與其具有至少90%序列同一性的序列。59.根據(jù)權(quán)利要求54所述的RNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDNO:172，或與其具有至少90%序列同一性的序列。60.根據(jù)權(quán)利要求51-54任意一項所述的RNA序列，其是SEQID冊135或與其90%相同的序列。61.根據(jù)權(quán)利要求51-54任意一項所述的RNA序列，其是SEQID冊136或與其90%相同的序列。62.根據(jù)權(quán)利要求51-54任意一項所述的RNA序列，其是SEQID冊137或與其90%相同的序列。63.根據(jù)權(quán)利要求51-54任意一項所述的RNA序列，其是SEQID冊138或與其90%相同的序列。64.根據(jù)權(quán)利要求51-54任意一項所述的RNA序列，其是SEQIDNO:139或與其90%相同的序列。65.根據(jù)權(quán)利要求51-54任意一項所述的RNA序列，其是SEQIDNO:140或與其90%相同的序列。66.根據(jù)權(quán)利要求51-54任意一項所述的RNA序列，其是SEQIDNO:165或與其90%相同的序列。67.根據(jù)權(quán)利要求51-54任意一項所述的RNA序列，其是SEQIDNO:166或與其90%相同的序列。全文摘要本發(fā)明涉及肝炎基因表達(dá)的抑制。具體而言，本發(fā)明涉及采用RNA序列抑制乙型和丙型肝炎病毒復(fù)制的方法。含有來自于內(nèi)源微RNAs(miRs)的DNA序列的表達(dá)盒被用于所述方法，其通過PolII啟動子轉(zhuǎn)錄，然后被加工成產(chǎn)生靶肝炎病毒序列(RNAi效應(yīng)子序列)特異性的序列。RNAi效應(yīng)子序列可靶向所選肝炎病毒序列造成肝炎病毒基因的基因沉默或轉(zhuǎn)錄抑制。在體外或體內(nèi)可將表達(dá)盒遞送至宿主細(xì)胞。本發(fā)明還要求保護(hù)含有所述表達(dá)盒的藥物組合物。文檔編號A61K31/713GK101755049SQ200880025425公開日2010年6月23日申請日期2008年5月29日優(yōu)先權(quán)日2007年5月29日發(fā)明者塔努沙·奈杜,維多利亞·瑪麗·朗肖,阿卜杜拉·伊利,阿巴思諾特·帕特里克,馬克·索爾·溫伯格申請人:約翰內(nèi)斯堡威特沃特斯蘭德大學(xué)