專利名稱：：原核苯丙氨酸氨裂合酶的組合物及利用其組合物治療癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及原核苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)及其組合物，以及對這種組合物的優(yōu)化以增強原核PAL催化活性和/或穩(wěn)定性并降低原核PAL的免疫原性和/或蛋白水解敏感性。本發(fā)明還涉及原核PAL的這種最優(yōu)組合物用于治療癌癥的用途。
背景技術(shù)：
：PAL是一種在植物中廣泛分布的非哺乳動物酶(Koukol等，J.Biol.Chem.2362692-2698(1961)；Hanson等，TheEnzymes7:75-166(1972)；Poppe等，Curr.Org.Chem.71297-1315(2003))，somefungi(Rao等，Can.J.Biochem.45121863-1872(1967)；Abell等，MethodsEnzymol.142242-253(1987))andbacteria(Bezanson等，Can.J.Microbiol.16147-151(1970)；Xiang等，J.Biol.Chem.27732505-32509(2002)；Hill等，Chem.Commun.1358-1359(2003))，并且可以在大腸桿菌中重組產(chǎn)生。PAL的代表性名單包括Q9ATN7藿香；093967毒蠅傘(Flyagaric)；P35510,P45724,P45725,Q9SS45,Q8RWP4擬南芥(Mouse-arcress)；Q6ST23綠竹(斑竹)；Q42609Bromheadiafinlaysoniana(^^)；P45726Camelliasinensis(^)；Q9MAX1Catharanthusroseus()(Madagascarperiwinkle)；Q9SMK9Cicerarietinum(M^3.)；Q9XFX5,Q9XFX6CitrusClementinaxCitrusreticulate；Q42667Citruslimon(梓檬)；Q8H6V9,Q8H6W0Coffeacan印hora(粗壯咖啡)；Q852S1Daucuscarota(胡蘿卜)；023924Digitalislanata(^jftH)；023865Daucuscarota(古月胃卜)；P27991Glycinemax(大豆)；004058Helianthusannuus(普通向日葵)；P14166,Q42858Ipomoeabatatas(甘薯)；Q8GZR8,Q8W2E4Lactucasativa(萵苣)；049835，049836Lithospermumerythrorhizon；P35511,P26600Lycopersiconesculentum(番爺)；P35512Malusdomestica(蘋果)(Malussylvestris)；Q94C45,Q94F89Manihotesculenta(木薯屬)(木薯)；P27"0Medicagosativa(苜蓿)；P25872，P355l3，P45733Nicotianatabacum(普通煙草)；QOTIC9Quercussuber(栓皮櫟)；P147l7，P53443，Q7M1Q5，QS4VE0，Q84VE0Oryzasativa(M^)；P45727Perseaamericana(MM)；Q9AXI5Pharbitisnil(Violet)(日本牽?；?；P52777Pinustaeda(火炬松)；Q01861,Q04593Pisumsativum(faii)；P24481,P45728,P45729Petroselinumcrispum(l^jr)(Petroselinumhortense)；Q84LI2PhalaenopsisxDoritaenopsis雜5Cbh禾中；P07218,P19142,P19143Phaseolusvulgaris(菜豆)(Frenchbean)；Q7XJC3,Q7XJC4Pinuspinaster(海岸豐公)；Q6UD65Populusbalsamiferasubsp.trichocarpaxPopulusdeltoides；P45731,Q43052,024266Populuskitakamiensis(白楊)；Q8H6V5,Q8H6V6Populustremuloides(亶員楊)；P45730Populustrichocarpa(Westernbalsampoplar)；064963Prunusavium(櫻桃)；Q94EN0Rehmanniaglutinosa；PI1544圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)(酵母)(細(xì)紅酵母(Rhodotorulagracilis))；P10248深紅酵母(Rhodotorularubra)(酵母)(膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa))；Q9M568,Q9M567Rubusidaeus(懸鉤子)；P31425，P31426Solanumtuberosum(馬鈴薯)；Q6SPE8Stellarialongipes(Longstalkstarwort)；P45732Stylosantheshumilis(Townsvillestylo)；P45734Trifoliumsubterraneum(i也三卩十(Subterraneanclover))；Q43210,Q43664Triticumaestivum(小麥)；Q96V77Ustilagomaydis(黑粉菌)；P45735Vitisvinifera(葡萄)；和Q8VXG7Zeamays(玉蜀黍)。大量研究集中于使用酶苯丙氨酸氨裂合酶(PAL，EC4.3.1.5)用于苯丙酮尿癥(PKU)的酶替代治療(Hoskins等，Lancet1(8165)392-394(1980)；Gilbert等，Biochem.J.199(3)715-723(1981)；Hoskins,J.A.等，Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.35(2):275_282(1982)；Sarkissian等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(5)2339-2344(1999)；Liu等，Artif.CellsBloodSubstit.Immobil.Biotechnol.30(4)243-257(2002)；ffieder等，JBiol.Chem.254(24):12579_12587(1979)；Gamez等，Mol.Ther.11(6):986_989(2005)；Ambrus等，J.Pharmacol.Exp.Ther.224(3):598_602(1983)；Ambrus等，Science201(4358)837-839(1978)；Kalghatgi,Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.27(3):551_561(1980)；Ambrus,Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.37(1)105-111(1982)；Gilbert等，Biochem.Biophys.Res.Commun.131(2):557_563(1985)；Pedersen,Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.20(3):559_569(1978)；Marconi等，Biochimie62(8-9):575_580(1980)；Larue等，Dev.Pharmacol.Ther.9(2):73_81(1986)；Ambrus等，Ann.Intern.Med.106(4):531_537(1987)；Bourget等，APP1.Biochem.Biotechnol.10:57-59(1984)；Bourget等，F(xiàn)EBSLett.180(1):5_8(1985)；Bourget^f,Biochim.Biophys.Acta883(3)432-438(1986)；ChangArtif.CellsBloodSubstit.Immobil.Biotechnol.23(1)1-21(1995)；ChangMol.Biotechnol.17(3)249-260(2001)；美國專利號5，753，487)。PAL用于癌癥治療的用途已經(jīng)被提出，這是基于其限制向癌細(xì)胞的苯丙氨酸營養(yǎng)提供從而抑制腫瘤生長的能力(Fritz等，J.Biol.Chem.251(15)=4646-4650(1976)；Roberts等，CancerTreat.Rep.60(3)261-263(1976)；Shen等，CancerRes.37(4)1051-1056(1977)；Shen等，CancerTreat.Rep.63(6)1063-1068(1979)；ffieder等，J.Biol.Chem.254(24):12579-12587(1979))。此外，PAL介導(dǎo)的苯丙氨酸降低阻止了小鼠白血病和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的增殖。但是，在13次注射后靜脈注射的聚乙二醇化PAL被快速從循環(huán)血液中清除(Abell等，CancerRes.33:2529_2532(1973)；Roberts等，(1976)，同前；Shen等，(1977)，同前；(Shen等，J.ReticuloendothelialSoc.23167-175(1978))。一些腫瘤或癌細(xì)胞對于必需氨基酸諸如苯丙氨酸具有比正常細(xì)胞更高的代謝率和更大的需求。文獻(xiàn)中有證據(jù)表明，特異氨基酸(例如，苯丙氨酸)通過使用氨基酸降解酶(例如，PAL)的限制或減少，可以在人類癌癥患者和動物模型中減少某些腫瘤細(xì)胞的生長。例如，一些白血病細(xì)胞缺少酶天冬酰胺合成酶，其從谷氨酰胺合成非必需氨基酸天門冬酰胺，因此所述白血病細(xì)胞為了生存依賴于天門冬酰胺。Oncaspar(培門冬酶，EnzonPharmaceuticals,Inc.)，一種聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶，已經(jīng)被成功用于治療急性淋巴母細(xì)胞白血病(ALL)(Graham,Adv.DrugDel.Rev.55:1293-1302(2003))。癌癥療法中用于酶去除(enzymaticdepletion)潛在靶標(biāo)的氨基酸其他實例包括谷氨酰胺(谷氨酰胺脫氨酶，MedicalEnzymesAG)，精氨酸(精精氨酸脫亞氨酶，PhoenixPharmacologies,Inc.)和甲硫氨酸(甲硫氨酸酶，Anticancer,Inc.)(參見，例如，美國專利號6，312，939，6，737，259和5，690，929)。苯丙氨酸的飲食限制已經(jīng)顯示在動物模型中抑制高侵襲轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和不依賴雄激素的前列腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，在培養(yǎng)中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞而不是正常細(xì)胞的凋亡，增加荷瘤小鼠的存活率，使腫瘤細(xì)胞對化療劑敏感，和增強毒素的細(xì)胞毒性(Fu等.，Nutr.Cancer31:1_7(1998)；Fu等，CancerRes.59:758_765(1999)；Fu等，Nutr.Cancer4560-73(2003)；Fu等，J.Cell.Physiol.209:522_534(2006)；Meadows等，CancerRes.423056-3063(1982)；Elstad等，AnticancerRes.13:523_528(1993)；Elstad等，Nutr.Cancer25:47_60(1996)；Nunez等，CancerLett.236133-141(2006))。利用來自圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)(亦稱為粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis))的PAL酶(RtPAL)去除苯丙氨酸在體外培養(yǎng)中(Abell等，CancerRes.32:285_290(1972);Stith等，CancerRes.33966-971(1973))和小鼠體內(nèi)(Abell等，CancerRes.33:2529_2532(1973))抑制白血病淋巴細(xì)胞的生長。但是，在重復(fù)給小鼠注射后，RtPAL的血漿清除率大大加速，并且與非荷瘤小鼠相比，荷瘤小鼠中的清除率更快(Fritz等，J.Biol.Chem.251=4646-4650(1976)；Shen等，CancerRes.37:1051_1056(1977))。在多次施用后由于抗體滴度的增加，RtPAL的半衰期減少到約1小時，表明全身輻射可能是延緩清除率和延長半衰期必需的(Shen等，J.ReticuloendothelialSoc.23167-175(1978)。已經(jīng)將RtPAL聚乙二醇化以求減少酶的免疫原性和體內(nèi)的清除率(Wieder等，J.Biol.Chem.254:12579_12587(1979))。在給小鼠單次靜脈注射或多次靜脈注射后，聚乙二醇化RtPAL的血液半衰期長于未聚乙二醇化的RtPAL;但是，在第十三次靜脈注射后聚乙二醇化的RtPAL仍然被快速從血液清除。盡管PAL潛在地具有各種治療應(yīng)用，但PAL的使用受到降低的比活性和蛋白水解不穩(wěn)定性的限制。與其他治療蛋白類似，使用PAL作為酶療法伴隨有數(shù)個缺點，諸如免疫原性和蛋白水解敏感性(seeVellard,Curr.Opin.Biotechnol.14:1_7(2003))。到目前為止，改進(jìn)這些參數(shù)的共同努力還沒有實現(xiàn)，這歸因于對該蛋白結(jié)構(gòu)和生化知識的貧乏。因此，對于治療用途包括治療癌癥來說仍然存在對具有最優(yōu)動力學(xué)特性，包括有效的催化活性、更長的生物半衰期、更高的生化穩(wěn)定性、和/或減弱的免疫原性的PAL分子的需要。發(fā)明概述本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，原核或細(xì)菌PAL可以作為癌癥的有效治療。本發(fā)明涉及具有提高的特性，例如對于治療應(yīng)用來說更有效的催化活性，更高的生化穩(wěn)定性，減弱的免疫原性和/或更長的生物半衰期的原核PAL及其生物活性片段、突變體、變體或類似物。本發(fā)明提供藥物組合物和制劑，包括原核PAL及其生物活性片段、突變體、變體或類似物和藥學(xué)上可接受的載體，包括穩(wěn)定劑。本發(fā)明還提供原核PAL及其生物活性片段、突變體、變體或類似物的生產(chǎn)和純化方法，以及使用這種組合物用于治療目的的方法，包括腫瘤性疾病和癌癥的治療。如本文所用，“細(xì)菌PAL”和“原核PAL”可以互換使用，表示⑴來自原核生物的野生型PAL，包括但不限于來自Sti^ptomycesmaritimus(亦稱為EncP，SEQIDNO:5，圖4)、點形念珠藻(Nostocpunctiforme)(SEQIDNO:2，圖4)、多變魚腥藻(Anabaenavariabilis)(SEQIDNO:4，圖4)、組囊藻(Anacystisnidulans)(Lofflehardt,Z.Naturforsch.31(11-12):693-9(1976))、發(fā)光桿菌(Photorabdusluminescens)TTOl(Williams等，Microbiologyl51:2543_2550(2005))和輪枝鏈霉菌(Streptomycesverticillatus)(Bezanson等，Can.J.Microbiol.16(3):147_51(1970))的PAL;(2)這種野生型PAL酶的片段、突變體、變體或類似物，其保留對苯丙氨酸類似的(S卩，至少50%)的催化活性，并且優(yōu)選地顯示出增加的催化活性，更高的生化穩(wěn)定性，增加的半衰期，和/或降低的免疫原性，和(3)這種野生型PAL酶或其片段、突變體、變體或類似物的化學(xué)修飾形式，它們與其他化學(xué)基團(tuán)連接以提供其他有益的效果，諸如，例如但不限于，延長的半衰期和/或降低的免疫原性。例如，任一提及為了治療目的的制備或使用原核PAL及其片段、突變體、變體、類似物或化學(xué)修飾形式和這種酶的組合物的方法旨在表示制備、使用或配制所有這種野生型原核PAL或其片段、突變體、變體、類似物或化學(xué)修飾的方法。第一個方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包括細(xì)菌PAL及其生物活性片段、突變體、變體或類似物，和藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選的實施方案是來自點形念珠藻(Nostocpunctiforme)的細(xì)菌PAL(SEQIDNO2)或其生物活性片段、突變體、變體或類似物。另一優(yōu)選的實施方案是來自多變魚腥藻(Anabaenavariabilis)的細(xì)菌PAL(SEQIDNO4)或其生物活性片段、突變體、變體或類似物。本發(fā)明涉及與野生型PAL相比具有更高苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性的原核PAL變體。優(yōu)選地，原核PAL變體保留對應(yīng)于圓紅冬孢酵母PAL(RtPAL)的Ser210、Ala-Ser-Gly三聯(lián)體(211-213)、Asp214、Leu215、Asn270、Val269、Leu266、Leu134、His137,Lys468,Glu496,Gln500位的野生型活性位點殘基或這些活性位點殘基的保守替代，其中第211-213位的Ala-Ser-Gly三聯(lián)體被認(rèn)為是苯丙氨酸的結(jié)合位點。優(yōu)選的原核PAL變體可以包括其中一個或多個氨基酸殘基被另一氨基酸殘基替代以減少蛋白聚集的蛋白，所述蛋白聚集可能與降低的酶活性，增加的免疫原性，和/或其他不利影響例如體內(nèi)降低的生物利用率有關(guān)。本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其中原核PAL變體的一個或多個氨基酸殘基被另一氨基酸替代，其中與野生型PAL相比，所述替代增加苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低免疫原性。在一些實施方案中，原核PAL變體的一個或多個氨基酸殘基被另一氨基酸殘基替代。在一些實施方案中，原核PAL變體的一個或多個半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。在優(yōu)選的實施方案中，原核PAL變體是多變魚腥藻PAL(AvPAL)。在更優(yōu)選的實施方案中，AvPAL變體的一個或多個半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代，所述半胱氨酸殘基選自由第64、318、503和565位的半胱氨酸殘基組成的組。在更優(yōu)選的實施方案中，AvPAL變體第565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。在最優(yōu)選的實施方案中，AvPAL變體第503和565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。優(yōu)選的原核PAL變體可以包括融合蛋白，其中PAL酶與本領(lǐng)域已知能增加半衰期或被對癌癥的具體形式具有特異性的蛋白所識別的另一異源多肽融合，該另一異源多肽例如免疫球蛋白的天然或修飾恒定區(qū)或其保留有救濟(jì)表位(salvageepitope)片段。本發(fā)明還涉及這種原核PAL多肽的化學(xué)修飾形式，其與提供其他有益的作用的化學(xué)基團(tuán)連接。例如，本領(lǐng)域已知水溶性聚合物例如聚乙二醇與多肽的非特異性或位點特異性(例如，N端)鍵合能延長半衰期，化學(xué)基團(tuán)的鍵合還可以降低免疫原性和/或提高蛋白酶抗性。在一些實施方案中，原核PAL變體包括水溶性聚合物。在優(yōu)選的實施方案中，原核PAL變體包括聚乙二醇。在更優(yōu)選的實施方案中，原核PAL變體是多變魚腥藻PAL(AvPAL)，AvPAL和聚乙二醇的比例是約13(13AvPALPEG)。在最優(yōu)選的實施方案中，原核PAL變體是AvPAL變體，AvPAL變體和聚乙二醇的比例是約1:3(1:3AvPALrPEG)，AvPAL變體第503和565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。在一些實施方案中，原核PAL變體的一個或多個氨基酸殘基被賴氨酸殘基替代。原核PAL變體中添加的賴氨酸殘基的聚乙二醇化可以導(dǎo)致酶具有降低的免疫原性，增加的催化活性，和/或提高的生化穩(wěn)定性。不受具體理論束縛，假定位于/鄰近原核PAL活性位點(例如，AvPAL的第78位)的酪氨酸殘基可以是用于聚乙二醇化的位點，該聚乙二醇化降低酶活性。在優(yōu)選的實施方案中，位于/鄰近原核PAL變體活性位點的一個或多個氨基酸(不是酶活性所需要的)被賴氨酸殘基替代。不受具體理論束縛，假定位于/鄰近活性位點的替代賴氨酸殘基的聚乙二醇化在空間上阻止酪氨酸殘基(例如，AvPAL的第78位)被聚乙二醇化。這種原核PAL變體根據(jù)本發(fā)明的方法分離和純化，并因而以能夠在治療上利用原核PAL酶的量存在。在一些實施方案中，使用編碼完整或野生型原核PAL的cDNA。但是，在其他實施方案中，可以使用編碼其生物活性片段、突變體、變體或類似物的cDNA。此外，本發(fā)明提供通過基于結(jié)構(gòu)的分子工程方法獲得的優(yōu)化的原核PAL和/或化學(xué)修飾(例如，聚乙二醇化)形式的PAL的組合物。具體實施方案涉及適于治療用途的原核PAL的最優(yōu)組合物，其具有提高的比活性，增強的穩(wěn)定性，降低的免疫原性和/或蛋白水解敏感性。優(yōu)選的實施方案是點形念珠藻PAL的聚乙二醇化形式，其具有提高的比活性，增強的穩(wěn)定性，降低的免疫原性和/或蛋白水解敏感性。另一優(yōu)選的實施方案是多變魚腥藻PAL的聚乙二醇化形式，其具有提高的比活性，增強的穩(wěn)定性，降低的免疫原性和/或蛋白水解敏感性。在一些實施方案中，本發(fā)明的野生型原核PAL的生物活性位點可以按照需要進(jìn)行修飾以優(yōu)化PAL動力學(xué)特性。在優(yōu)選的實施方案中，利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，修飾的原核PAL具有足夠的活性以將接受治療的個體的血漿苯丙氨酸水平降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩。在其他優(yōu)選的實施方案中，生物活性改變的原核PAL具有的kcat為至少約0.Is-I,優(yōu)選的大于約0.5s-l，甚至更優(yōu)選的大于約l.Os-Ι。在其他優(yōu)選的實施方案中，生物活性改變的原核PAL具有的kcat為至少約0.4s-l，優(yōu)選的大于約2.Os-I，甚至更優(yōu)選的大于約4.Os-I。在其他優(yōu)選的實施方案中，生物活性改變的原核PAL具有的Km為約10微摩到約2000微摩。在更優(yōu)選的實施方案中，生物活性改變的原核PAL具有的Km為約10微摩到約1000微摩。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，生物活性改變的原核PAL具有的Km為約10微摩到約500微摩。在其他優(yōu)選的實施方案中，生物活性改變的原核PAL顯示的酶活性為野生型PAL的約至少50%到大于野生型PAL的約10倍。在其他優(yōu)選的實施方案中，生物活性改變的原核PAL顯示的酶活性為野生型PAL的約至少50%到比野生型PAL高約100%。這種生物學(xué)活性改變的原核PAL蛋白可以利用本領(lǐng)域公知的方法形成，例如通過定點誘變。在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明涉及代謝苯丙氨酸(即，將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為另一物質(zhì))的原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物在制備預(yù)防或治療個體的癌癥的藥物中的用途，所述個體優(yōu)選的為人類個體，以及用于預(yù)防或治療個體的癌癥的包含原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物的藥物組合物，所述個體優(yōu)選為人類個體。在一些實施方案中，所述藥物用于在人類個體中預(yù)防癌癥。在其他實施方案中，所述藥物用于在人類個體中治療癌癥。在優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物包含來自細(xì)菌的高度純化的PAL，或其生物活性片段、突變體、變體或其類似物，和藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選的制劑包含純度大于90%,95%,96%,97%,98%,99%,99.2%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%、或99.9%的原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物。本發(fā)明原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物的相對比活性優(yōu)選為野生型原核PAL比活性的至少約50%，更優(yōu)選大于約110%。第二個方面，本發(fā)明描述了利用原核PAL變體組合物用于治療目的的新方法。本發(fā)明涉及治療各種形式癌癥的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過給需要這種治療的個體施用治療有效量的藥物組合物來治療癌癥的方法，所述藥物組合物包含原核PAL變體和藥學(xué)上可接受的載體，其中與野生型PAL相比，所述原核PAL變體具有更高的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性，可以有效地將個體血液、血清或血漿(優(yōu)選的為血漿)中的苯丙氨酸濃度降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩。在一些實施方案中，原核PAL變體的一個或多個氨基酸殘基被另一氨基酸殘基替代，其中與野生型PAL相比，所述替代增加苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低免疫原性。在一些實施方案中，原核PAL變體的一個或多個半胱氨酸殘基被另一氨基酸殘基替代。在一些實施方案中，原核PAL變體的一個或多個半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。在優(yōu)選的實施方案中，原核PAL變體是多變魚腥藻PAL(AvPAL)變體。在特別優(yōu)選的實施方案中，AvPAL變體的選自第64、318、503和565位半胱氨酸殘基的一個或多個半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代，在第565位被絲氨酸殘基替代，或在第503和565位被絲氨酸殘基替代。在一些實施方案中，原核PAL變體包含水溶性聚合物。在一些實施方案中，所述水溶性聚合物是聚乙二醇。在優(yōu)選的實施方案中，原核PAL變體是多變魚腥藻PAL(AvPAL)變體，AvPAL變體和聚乙二醇的比例是約13(13AvPALPEG)。在更優(yōu)選的實施方案中，原核PAL變體是多變魚腥藻PAL(AvPAL)變體，AvPAL變體和聚乙二醇的比例是約13(13AvPALPEG),并且AvPAL變體第503和565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。在更特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種治療癌癥的方法，包括給需要這種治療的個體施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含AvPAL變體和藥學(xué)上可接受的載體，其中AvPAL變體第503和565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代，所述AvPAL變體還包含聚乙二醇的水溶性聚合物，其中AvPAL變體和聚乙二醇的比例是約13，該AvPAL變體能夠有效地將個體血液、血清或血漿(優(yōu)選血漿)中的苯丙氨酸濃度降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩。在廣泛的實施方案中，癌癥是其中源自該癌癥的細(xì)胞的增殖和/或生存對苯丙氨酸限制或去除敏感的癌癥。在優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥是肺癌，腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌，結(jié)腸癌，前列腺癌，腎癌或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。在其他優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥是頭頸癌，卵巢癌，子宮癌，白血病(例如，急性髓性白血病或急性類淋巴母細(xì)胞白血病)或骨髓瘤。在其他優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥是兒童癌癥或耐藥性癌癥(即，已經(jīng)顯示對癌癥治療劑或靶向癌癥治療劑具有抗性)。本發(fā)明描述了治療個體癌癥的方法，包括給個體施用原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物，其中與不施用原核PAL的濃度相比，原核PAL的施用有效地降低了個體血液、血清或血漿(優(yōu)選血漿)中的苯丙氨酸(Phe)濃度。根據(jù)本發(fā)明方法挑選接受治療的個體可以具有任意血漿Phe濃度，例如，約40微摩到約2000微摩，或正常范圍的血漿Phe濃度，這種濃度范圍可以是約40微摩到約80微摩，更常見的范圍是約50微摩到約70微摩，大部分人類個體的范圍是約55微摩到約65微摩。利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，治療時個體的血漿Phe濃度被降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩。本發(fā)明還涉及治療癌癥的方法，通過給需要這種治療的個體施用治療有效量的藥物組合物和蛋白限制性(即，不含苯丙氨酸的)飲食，所述藥物組合物包含原核PAL變體和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述治療有效地降低了沒有聯(lián)合施用情況下的個體血漿Phe濃度。利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，治療時個體的血漿Phe濃度被降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩。在另一實施方案中，原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物可以與蛋白限制性飲食聯(lián)合施用。本文方法中采用的蛋白限制性飲食是一種苯丙氨酸限制性飲食，其中個體的總Phe攝入量被限制為少于600mg每天。在其他實施方案中，蛋白限制性飲食是苯丙氨酸限制性飲食，其中總Phe被限制為低于300mg每天。仍在其他實施方案中，蛋白限制性飲食添加了一種或多種氨基酸，例如，舉例而非限制地，酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和/或亮氨酸。還涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包含原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或其類似物，和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。所述藥物組合物還可以包含醫(yī)藥蛋白補充劑。仍在其他實施方案中，所述蛋白補充劑不含苯丙氨酸。所述蛋白補充劑優(yōu)選地是按照20mg/100g濃度添加的L-酪氨酸、L-谷氨酰胺、L-肉堿，按照40mg/100g濃度添加的L-牛磺酸，和硒加強。它還可以包含推薦的每日劑量的礦物質(zhì)，例如鈣、磷和鎂。補充劑還可以包含推薦的每日劑量的一種或多種氨基酸，該氨基酸選自L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-賴氨酸醋酸鹽、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-天冬酰胺一水合物、L-色氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-組氨酸、L-甲硫氨酸、L-谷氨酸、和L-天門冬氨酸。此外，所述補充劑還可以用推薦每日劑量的維生素A、D和E加強。補充劑優(yōu)選地包含提供所述補充劑至少40%能量的脂肪含量。這種補充劑可以以采用粉末補充劑形式或蛋白棒形式提供。本發(fā)明還涉及通過給需要這種治療的個體聯(lián)合施用治療有效量的藥物組合物和癌癥治療劑或靶向癌癥治療劑來治療癌癥的方法，所述藥物組合物包含原核PAL變體和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述治療有效地降低了沒有聯(lián)合施用情況下的個體血漿苯丙氨酸濃度。利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，治療后個體的血漿Phe濃度被降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩。優(yōu)選的實施方案包括優(yōu)化待治療的生物體所需的劑量以有效地預(yù)防或改善疾病癥狀，所述生物體優(yōu)選地是哺乳動物或人。原核PAL可以按照以下方式施用每日單次劑量，每日多次劑量，每周單次劑量，每周多次劑量，每月單次劑量或每月多次劑量。在一些實施方案中，PAL療法不是連續(xù)的，而是每天施用PAL直到個體的血漿Phe濃度利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法檢測降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩。優(yōu)選地，其中每天監(jiān)測個體的血漿Phe濃度，當(dāng)觀察到血漿Phe濃度增加10%-20%時施用PAL。在其他優(yōu)選的實施方案中，劑量每周遞送一次。本發(fā)明涉及至少0.001mg/kg、0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.05mg/kg的劑量，可以高達(dá)每周0.lmg/kg、0.5mg/kg、l.0mg/kg、5.Omg/kg、12mg/kg或更高。優(yōu)選的劑量是lmg/kg/周，更優(yōu)選的劑量是0.lmg/kg/周，甚至更優(yōu)選的劑量是0.01mg/kg/周。涉及遞送相當(dāng)劑量的各種腸胃外或非腸胃外施用途徑，包括口服、透皮、透粘膜、肺內(nèi)(包括霧化)、肌內(nèi)、皮下、或靜脈內(nèi)。還具體涉及通過直接推注或輸注入關(guān)節(jié)或CSF的施用，例如鞘內(nèi)、腦內(nèi)、心室內(nèi)，通過腰椎穿刺或通過小腦延髓池。優(yōu)選地通過皮下或口服遞送所述劑量。還涉及其他在人類個體中增加原核PAL活性的方式，包括基因治療。原核PAL基因的轉(zhuǎn)移可通過本領(lǐng)域已知的各種方式實現(xiàn)，包括病毒載體，同源重組或直接DNA注射。屬于這方面范圍的實施方案是編碼原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物全部或一部分的核酸序列，其可以在體內(nèi)施用給細(xì)胞，例如但不限于，被癌癥感染的細(xì)胞、位于癌癥附近或靠近癌癥的細(xì)胞、在血流中循環(huán)和/或遷移到癌癥部位的造血細(xì)胞。第三個方面，本發(fā)明提供原核PAL變體的藥物組合物或制劑，其包含細(xì)菌PAL及其生物活性片段、突變體、變體或其類似物，和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑。在一些實施方案中，所述穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸或其結(jié)構(gòu)類似物。在一些實施方案中，所述穩(wěn)定劑選自L-苯丙氨酸、反式肉桂酸和安息香酸。在一些實施方案中，所述穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸。在一些實施方式中，所述穩(wěn)定劑是反式肉桂酸。在一些實施方式中，所述穩(wěn)定劑是安息香酸。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了利用所述藥物組合物或制劑治療癌癥的方法。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物或制劑包含原核PAL變體和藥學(xué)上可接受的載體，其中原核PAL變體是AvPAL變體，AvPAL變體和聚乙二醇的比例是約13(13AvPALPEG)，并且AvPAL變體第503和565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代，所述藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑。在一些實施方案中，所述穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸或其結(jié)構(gòu)類似物。在一些實施方案中，所述穩(wěn)定劑選自L-苯丙氨酸、反式肉桂酸和安息香酸。在一些實施方案中，所述穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸。在一些實施方式中，所述穩(wěn)定劑是反式肉桂酸。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了利用所述藥物組合物或制劑治療癌癥的方法。第四個方面，本發(fā)明描述一種以能夠在治療上利用酶的量產(chǎn)生重組原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物的方法。本發(fā)明涉及源自細(xì)菌的PAL，所述細(xì)菌包括但不限于鏈霉菌屬(Str印tomyces)、堆囊粘細(xì)胞菌屬(Sorangium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和藍(lán)藻(cyanobacteria)如念珠藻和魚腥藻。在一些實施方案中，PAL源自細(xì)菌禾中屬Sti^ptomycesmaritimus,輪枝鏈霉菌，纖維堆囊菌(Soragiumcellulosum),點形念珠藻，Nostoctobacum，多變魚腥藻或惡臭假單胞菌。在優(yōu)選的實施方案中，PAL來源于藍(lán)藻種屬點形念珠藻或多變魚腥藻。在特別優(yōu)選的實施方案中，PAL來源于多變魚腥藻。在另一實施方案中，原核PAL酶活性利用cDNA或DNA序列產(chǎn)生，所述cDNA或DNA序列源自有時被描述為編碼HAL活性或具有PAL-HAL模體特征的序列，但它們具有不同于HAL的關(guān)鍵PAL殘基。在一個廣泛的實施方案中，所述方法包括將編碼原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物的全部或一部分的cDNA或DNA轉(zhuǎn)化適于表達(dá)其的細(xì)胞的步驟。在優(yōu)選的實施方案中，使用表達(dá)載體將DNA轉(zhuǎn)移入表達(dá)其的合適細(xì)胞或細(xì)胞系。在特別優(yōu)選的實施方案中，將cDNA或DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，重組細(xì)菌PAL被過表達(dá)，任選地作為融合蛋白表達(dá)。在進(jìn)一步的實施方案中，產(chǎn)生原核PAL的方法包括以下步驟(a)在合適的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)用編碼原核PAL的全部或其生物活性片段、突變體、變體或類似物的cDNA或DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞到合適的密度，以產(chǎn)生種子培養(yǎng)物，(b)將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞加入生物反應(yīng)器，(c)給生物反應(yīng)器提供合適的生長培養(yǎng)基，(d)將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞從包含酶的培養(yǎng)基分離。在優(yōu)選的實施方案中，在載體中有或沒有N端標(biāo)簽(例如，八組氨酰-標(biāo)簽)的重組原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物在大腸桿菌BLR(DE3)/PLysS(Novagen)或大腸桿菌BL21(DE3)/pLysS(Invitrogen)細(xì)胞中過表達(dá)，所述載體優(yōu)選是pIBXl(Su等，Appl.Environ.Microbiol.62:2723_2734(1996))或具有誘導(dǎo)型啟動子如IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的pET28a(Invitrogen)。在特別優(yōu)選的實施方案中，產(chǎn)生原核PAL的方法包括以下步驟(1)在搖瓶中為生物反應(yīng)器/發(fā)酵罐培養(yǎng)來自甘油儲液的種子培養(yǎng)物；(2)按照補料分批模式將所述種子培養(yǎng)物加入受控生物反應(yīng)器；(3)在添加葡萄糖的培養(yǎng)基(PH(7.8)，>20%溶解氧)中培養(yǎng)所述培養(yǎng)物，攪拌直至1200rpm，3(TC直至達(dá)到0D600為70-100的細(xì)胞密度(-22-25小時)；(4)利用0.4mMIPTG誘導(dǎo)所述培養(yǎng)物；(5)在22-26°C的降低溫度培養(yǎng)所述培養(yǎng)物，直至活性變化<0.lIU/mL(大約40-48小時，0D600通常為200)；和(5)通過連續(xù)離心收集細(xì)菌。在優(yōu)選的實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基被被定義并由酵母提取蛋白、蛋白胨-胰蛋白胨、葡萄糖、甘油、酪蛋白氨基酸、微量鹽和磷酸鹽緩沖鹽組成。第五個方面，本發(fā)明描述了一種純化原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物的方法。根據(jù)第一個實施方案，培養(yǎng)和裂解轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群，從而產(chǎn)生粗重組酶。通常將外源性材料與粗制物分離以免弄臟柱子。利用一種或數(shù)種層析樹脂進(jìn)行層析純化。隨后，用設(shè)計成能在較長時間提供穩(wěn)定活性的緩沖液配制純化的蛋白。在另一優(yōu)選的實施方案中，純化原核PAL的方法包括以下步驟(a)裂解包含重組PAL的細(xì)菌；(b)加熱處理裂解物以滅活病毒；(c)利用第二次連續(xù)離心步驟和/或深層過濾凈化該裂解物；(d)將凈化的裂解物通過木炭過濾步驟；(e)將(d)的濾液通過最終過濾步驟(例如用SartoriousSartopore0.2μm濾器)；(f)將最終濾液通過疏水性相互作用層析樹脂，如丁基疏水性相互作用層析；(g)將(f)的洗脫物通過陰離子層析樹脂，如Q離子交換柱；(h)利用切向流過濾通過緩沖液交換回收終產(chǎn)物；和(i)對終產(chǎn)物進(jìn)行滅菌。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)層析步驟中的一個或多個可以省略或替換，或?qū)游霾襟E的順序可以改變。最終，可以按照要求進(jìn)行合適的殺菌步驟。第六個方面，本發(fā)明涉及通過將所述原核PAL與培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞接觸鑒定能預(yù)防、改善或治療癌癥的原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物并確定該原核PAL能否降低腫瘤細(xì)胞增殖和/或生存的篩選分析。這種篩選分析還可以包括產(chǎn)生變體的步驟，所述變體包含活性位點，如Sti^ptomycesmaritimus的EncP中的Gly142、Thr-Ser-Gly三聯(lián)體(143-145)、Asp146，Leu147、Asn196、Ile195、Leu192、Leu76、Asn79、Met400、Thr428,Gln432處的保守或非保守替代，或其他原核PAL的它們的等同物，如點形念珠藻或多變魚腥藻，其等同于圓紅冬孢酵母的PAL(RtPAL)中的Ser210、Ala-Ser-Gly三聯(lián)體(211-213)、Asp214、Leu215、Asn270、Val269、Leu266、Leu134、His137、Lys468、Glu496、Gln500，在接近于活性位點的區(qū)域，或遍及整個多肽序列；然后檢測該變體的體外苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性。在某些實施方案中，所述方法是高通量分析法。在優(yōu)選的實施方案中，利用生物信息學(xué)方法對細(xì)菌種屬的完整基因組進(jìn)行測序，并篩選原核PAL同源物的存在。在另一優(yōu)選的實施方案中，這種同源物蛋白產(chǎn)物的PAL催化活性被證實，例如通過在體外檢測將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸鹽的能力來證實。第七個方面，本發(fā)明提供了用于診斷疾病的原核PAL組合物的使用方法，所述疾病包括但不限于癌癥。在一個實施方案中，使用原核PAL檢測血液、血漿或血清樣品中的Phe水平。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及一種包括原核PAL的診斷試劑盒，用于監(jiān)測患者血液、血漿或血清樣品的Phe水平。根據(jù)下面的詳細(xì)說明，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將非常清楚。但是應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)提及本發(fā)明的優(yōu)選實施方式時，給出詳細(xì)說明和特定實施例只是為了說明，因為根據(jù)該詳細(xì)說明，在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的不同改變和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。附圖的詳細(xì)說明圖1.圖IA點形念珠藻PAL的基因序列(SEQIDNO1)；圖IB點形念珠藻PAL的蛋白序列(SEQIDNO2)。圖2.圖2A多變魚腥藻PAL的基因序列(SEQIDNO3)；圖IB多變魚腥藻PAL的蛋白序列(SEQIDNO4)。圖3.來自原核生物和真核生物的芳香族氨基酸氨-裂合酶的親緣樹。序列獲自GenBank(括號內(nèi)給出登錄號)，并使用NeighborJoiningMethod通過ClustalX(1.83)進(jìn)行比對。圖4.點形念珠藻PAL(SEQIDNO2)和多變魚腥藻PAL(SEQIDNO4)與EncPPAL(SEQID.No.5)和惡臭假單胞菌HAL(SEQIDNO6)的藍(lán)藻蛋白序列的比對。高亮顯示對應(yīng)于PAL或HAL活性的活性位點殘基。圖5.圖5A多變魚腥藻苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)的蛋白序列，第64位具有半胱氨酸到絲氨酸的替代(AvPAL_C64S，SEQIDNO7)；圖5B多變魚腥藻PAL的蛋白序列，第318位具有半胱氨酸到絲氨酸的替代(AvPAL_C318S，SEQIDNO8)；圖5C多變魚腥藻PAL的蛋白序列，第503位具有半胱氨酸到絲氨酸的替代(AvPAL_C503S，SEQIDNO9)；圖5D:多變魚腥藻PAL的蛋白序列，第565位具有半胱氨酸到絲氨酸的替代(AvPAL_C565S，SEQIDNO10)；圖5E多變魚腥藻PAL的蛋白序列，第503和565位具有半胱氨酸到絲氨酸的替代(AvPAL_C565SC503S,SEQIDNO:11)。半胱氨酸到絲氨酸的替代用粗體下劃線表示。圖6.圖6A在37°C溫育不同時間段后，未聚乙二醇化AvPAL的第565位或第565和503位半胱氨酸到絲氨酸的替代對體外PAL特異酶活性的影響。圖6B在37°C溫育不同時間段后，聚乙二醇化AvPAL的第565位或第565和503位半胱氨酸到絲氨酸的替代對體外PAL特異酶活性的影響。圖7.圖7A在變性條件(左欄)或天然條件(右欄)下通過凝膠電泳分析AvPAL中半胱氨酸到絲氨酸的替代對溶液中蛋白聚集形成的影響。圖7B通過SEC-HPLC分析AvPAL中半胱氨酸到絲氨酸替代對溶液中蛋白聚集形成的影響。圖8.AvPAL中第565和503位(雙重突變)半胱氨酸到絲氨酸的替代對各種PEG濃度的位點特異性聚乙二醇化的影響。圖9.通過SEC-HPLC分析利用0.05%Tween80或IOmMEDTA處理AvPAL對溶液中蛋白聚集形成的影響。圖10.圖IOA通過SEC-HPLC分析通過二硫蘇糖醇(DTT)處理AvPAL對溶液中蛋白聚集形成的影響。圖IOB通過SEC-HPLC分析通過DTT和N-乙基馬來酰亞胺(NEM)處理AvPAL對溶液中蛋白聚集形成的影響。圖11.標(biāo)示的苯丙氨酸(Phe)和反式肉桂酸(t-CA)對4°C(頂欄)、25°C(中間欄)和37°C(底欄)保存不同時間(天數(shù))的聚乙二醇化AvPAL的酶活性的影響，所述AvPAL的第565和503位具有半胱氨酸到絲氨酸的替代(AvPAL_C565SC503S)(rAV-PAL-PEG)。圖12.標(biāo)示的1和5mM的酪氨酸(Tyr)對4°C(頂欄)、25°C(中間欄)和37°C(底欄)保存不同時間(天數(shù))的聚乙二醇化AvPAL的酶活性的影響，所述AvPAL的第565和503位具有半胱氨酸到絲氨酸的替代(AvPAL_C565SC503S)(rAV-PAL-PEG)。圖13.圖13A標(biāo)示的單獨或聯(lián)合的苯丙氨酸(Phe)、安息香酸和吡哆胺對4°C(頂欄)和37°C(底欄)保存不同時間(周)的聚乙二醇化AvPAL的酶活性的影響，所述AvPAL的第565和503位具有半胱氨酸到絲氨酸的替代(AvPAL_C565SC503S)(rAV-PAL-PEG)。圖13B顯示安息香酸(左)、苯丙氨酸(中)和反式肉桂酸(右)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖14.圖14A給短尾猴單次皮下注射4mg/kg(菱形)和12mg/kg(正方形)聚乙二醇化AvPAL對血漿AvPAL_C565SC503S水平隨時間(小時)的影響，所述AvPAL的第565和503位具有半胱氨酸到絲氨酸的替代(AvPAL_C565SC503S)。圖14B給短尾猴單次皮下注射4mg/kgAvPAL_C565SC503S對血漿AvPAL_C565SC503S(菱形)和苯丙氨酸(正方形)水平隨時間(小時)的影響。圖15.圖15A給大鼠單次靜脈注射lmg/kg(菱形)、5mg/kg(正方形)和25mg/kg(三角形)聚乙二醇化AvPAL對血漿AvPAL_C565SC503S水平隨時間(小時)的影響，所述AvPAL的第565和503位具有半胱氨酸到絲氨酸的替代(AvPAL_C565SC503S)。圖15A給大鼠單次皮下注射10mg/kg(菱形)、25mg/kg(正方形)和250mg/kg(三角形)AvPAL_C565SC503S對血漿AvPAL_C565SC503S水平隨時間(小時)的影響。圖16.圖16A標(biāo)示的0.01、0.1、1、10和100微克/mL聚乙二醇化AvPAL在體外對NOMOl急性髓性白血病(AML)增殖的影響(通過碘化吡啶染色檢測)，所述AvPAL的第565和503位具有半胱氨酸到絲氨酸的替代(AvPAL_C565SC503S)。圖16B標(biāo)示的0.1、1、10和100微克/mLAvPAL_C565SC503S在體外對IM9骨髓瘤細(xì)胞增殖的影響。圖17.圖17A標(biāo)示的0.01、0.1、1、10和100微克/mL聚乙二醇化AvPAL在體外對SF268(頂)和498L(底)腦/CNS腫瘤細(xì)胞增殖(通過碘化吡啶染色檢測)的影響，所述AvPAL的第565和503位具有半胱氨酸到絲氨酸的替代(AvPAL_C565SC503S)。圖17B標(biāo)示的0.01、0.1、1、10和100微克/mL4￥41^_0565305033在體外對耵29(頂)和!10116(底)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增殖的影響。圖17C標(biāo)示的0.01、0.1、1、10和100微克/mLAvPAL_C565SC503S在體外對H460(頂)、529L(中)和629L(底)肺腫瘤細(xì)胞增殖的影響。圖17C標(biāo)示的0.01、0.1、1、10和100微克/mLAvPAL_C565SC503S在體外對LNCAP(頂)、PC3M(中)和DU145(底)前列腺腫瘤細(xì)胞增殖的影響。圖18.B16黑色素瘤細(xì)胞系異種移植模型中，第565和503位具有半胱氨酸到絲氨酸的替代的聚乙二醇化AvPAL(AvPAL_C565SC503S)對腫瘤大小的影響。按照標(biāo)示通過皮下注射40、80或100mg/kg酶進(jìn)行預(yù)防性(頂部)或治療性(底部)施用。圖19:SNU398(頂部)和H印G2(底部)肝癌腫瘤細(xì)胞系異種移植模型中，第565和503位具有半胱氨酸到絲氨酸的替代的聚乙二醇化AvPAL(AvPAL_C565SC503S)對腫瘤大小的影響。按照標(biāo)示通過皮下注射60mg/kg酶進(jìn)行預(yù)防性施用。發(fā)明詳述已經(jīng)有數(shù)種細(xì)菌PAL被鑒定為HAL/PAL家族的一部分，包括但不限于來自Streptomycesmaritimus的PAL(亦稱為EncP，SEQIDNO:5，圖4)，來自點形念珠藻的PAL/HAL(來自點形念珠藻ATCC29133的登錄號ZP_00105927，2004年10月1日提交，NCBIMicrobialGenomesAnnotationProject)(SEQIDNO:2，4)，*自月星·(GeneID3679622，Ava_3988苯丙氨酸/組氨酸氨裂合酶，多變魚腥藻ATCC29413，2006年3月31日)(SEQIDNO:4，圖4)、光合原核生物組囊藻(Anacystisnidulans)(Lofflehardt,Z.Naturforsch.31(11-12):693_9(1976))、腸桿菌科家族的革蘭氏陰性菌、發(fā)光桿菌(Photorabdusluminescens)TTOl(Williams等，Microbiologyl51:2543_2550(2005))和輪生鏈霉菌(Streptomycesverticillatus)(Bezanson等.，Can.J.Microbiol.16(3)147-51(1970))的PAL/HAL。此外，還檢測了Sti^ptomycesmaritimus中的PAL活性(Xiang等.，J.Biol.Chem.277=32505-32509(2002))已經(jīng)對藍(lán)藻如魚腥藻和念珠藻進(jìn)行了關(guān)于生物活性天然產(chǎn)物產(chǎn)生的研究，所述天然產(chǎn)物通過混合的多聚乙酰肽生物合成途徑產(chǎn)生(Moore，Nat.Prod.Rep.22(5):580_593(2005)；Becker等·，Gene325:35_42(2004)；Hoffman等.，Gene311171-180(2003))。盡管PAL是普遍存在的高等植物酶，其在向苯丙素代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵步驟中催化苯丙氨酸非氧化性脫氨成肉桂酸(Hahlbrock等.，Annu.Rev.PlantPhys.PlantMol.Biol.40347-369(1989)),只有少量細(xì)菌中存在PAL，其中在“S.maritimus”(Xiang,etai,J.Biol.Chem.27732505-32509(2002))和纖維堆囊菌(Sorangiumcellulosum)(Hill等，Chem.Commun.1358-1359(2003))中其參與苯甲?；o酶A生物合成，在輪生鏈霉菌中參與肉桂酰胺的生物合成(Bezanson等，Can.J.Microbiol.16147-151(1970))。抑菌劑腸道菌素是海洋細(xì)菌“Str印tomycesmaritimus"的天然產(chǎn)物，其生物合成涉及大量不尋常的特性(Hertweck等，Chem.Biol.11461-468(2004)；Piel等，Chem.Biol.7943-955(2000)；Piel等，J.Am.Chem.Soc.122:5415_5416(2000)；Xiang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA10115609-15614(2004))其中之一是罕見多聚乙酰合酶(PKS)起始單位苯甲?；o酶A(CoA)的形成(Moore等，Nat.Prod.Rep.19:70_99(2002))。起始生化反應(yīng)包括通過新的細(xì)菌苯丙氨酸氨裂合酶(PAL，EC4.3.1.5)EncP將氨基酸L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸(Xiang等，J.Biol.Chem.277=32505-32509(2002))肉桂酸活化為其輔酶A硫酯，繼之以單——輪beta氧化得到苯甲?；o酶AOfertweck等，Chem.Bio.Chem.2784-786(2001)；Hertweck等，Tetrahedron569115-9120(2000)；Xiang等，J.Bacteriol.185399-404(2003))，其起始腸道菌素II型PKS利用丙二?；o酶A的7個分子進(jìn)行鏈延伸。第一種原核PAL-編碼基因(encP)(SEQIDNO:5)被表征，其在“S.maritimus”中新形成肉桂酸和腸道菌素合成中的作用已被鑒定(Kalaitzis等，J.Am.Chem.Soc.1259290-9291(2003)；Xiang等，J.Biol.Chem.277:32505_32509(2002))。encP基因編碼522個氨基酸的蛋白，即明顯比真核PALs少幾乎200個氨基酸殘基。盡管序列與植物PALs諸如來自Petroselinumcrispurn的同源(Rijther等，Eur.J.Biochem.2693065-3075(2002))(CAA57056，30%相同和48%類似)，它與諸如來自惡臭假單胞菌(Schwede等，Biochemistry27:5355_5361(1999))(A35251，36%相同和54%類似，SEQIDNO:6，圖4)的細(xì)菌組氨酸氨裂合酶(HALs，EC4.3.1.3)和來自莢膜紅細(xì)菌(Rhodobactercapsulatus)的酪氨酸氨裂合酶(TAL)(Kyndt等，F(xiàn)EBSLett.512240-244(2002))(圖3)具有更高的同源性。同源性包括氨裂合酶的苯丙氨酸/組氨酸/酪氨酸家族143位的保守活性位點絲氨酸殘基，其是4-methy1ideneimidazo1e_5_酮(MI0)輔基中修飾脫氫丙氨酸殘基的可能前體(Langer等，Adv.Prot.Chem.58175-188(2001)；Poppe,Curr.Opin.Chem.Biol.5512-524(2001)；Schwede等，Biochemistry27:5355-5361(1999))。EncP與AdmH(AA039102，63%相同和76%類似)具有最高的序列同源性，AdmH是一種假定的苯丙氨酸氨基變位酶，參與成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)的andrimid生物合成，與球孢鏈霉菌(Str印tomycesglobisporus)的酪氨酸氨基變位酶Sgc4有關(guān)(Christenson等，J.Am.Chem.Soc.125:6062_6063(2003)；Christenson等，Biochemistry4212708-12718(2003))ο對于分別從組氨酸和苯丙氨酸化學(xué)上困難的清除氨來說，HAL和PAL顯示通常共享同一機制。利用這兩種酶，超親電子的輔基5亞甲基-3，5-二氫咪唑并-4-酮(MIO)通過對芳香環(huán)Friedel-Crafts-型攻擊活化它們相應(yīng)底物的非酸beta氫原子。通過阻止任意堿基通向酶的結(jié)合口袋，產(chǎn)生的sigma復(fù)合物阻止從環(huán)提取質(zhì)子。環(huán)外雙鍵的形成是氨清除、脫芳和斷裂的關(guān)鍵。修復(fù)性MIO基團(tuán)被再生，形成產(chǎn)物尿刊酸酯或肉桂酸鹽(Poppe等，Angew.Chem.Int.Ed.44:3668_3688(2005))。因為HAL和PAL的高同源性，HAL和PAL的保守區(qū)HAL/PAL保守區(qū)。這種高同源性可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)庫像NCBI關(guān)于“PAL-HAL”蛋白可能酶活性的一些混淆，導(dǎo)致錯誤標(biāo)示，諸如NCBI數(shù)據(jù)庫中對于點形念珠藻和多變魚腥藻所列的蛋白序列。因此一些PAL酶可能會被誤標(biāo)為HAL酶。盡管PALs和HALs活性位點非常類似，但預(yù)測在一些關(guān)鍵殘基上是不同的(Calabrese等.，Biochemistry43(36):11403_11416(2004)；Xiangetal.，(2002)，同前；Williamsetal，(2005)，同前)。尤其在HAL中，惡臭假單胞菌的甲硫氨酸382和谷氨酰胺414(SEQIDNO6)在所有HALs中都是高度保守的，但在迄今為止的描述中(真核生物或原核生物)，在所有PALs中總是分別被賴氨酸和谷氨酰胺替換(圖4)。所以可以說具有“PAL-HAL”區(qū)域并具有賴氨酸382和谷氨酰胺414同系物的所有蛋白都具有包含PAL活性的蛋白的序列標(biāo)記物。這些相對較新描述的PAL標(biāo)記物(Williams等，(2005)，同前)允許正確標(biāo)記一些酶以區(qū)分HAL和PAL，可以從已經(jīng)公開的基因和蛋白數(shù)據(jù)庫中鑒定一些新的PAL酶。本發(fā)明涉及這種原核PAL及其生物活性片段、突變體、變體或類似物的組合物，以及它們用于治療目的，包括治療癌癥的用途。A.定義除非另有說明，本申請中使用的下列術(shù)語，包括說明書和權(quán)利要求，具有下面給出的定義。必須注意到，在本說明書和所附權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”包括數(shù)含義，除非上下文明確另外規(guī)定。標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)術(shù)語的定義可參見工具書，包括CareyandSundberg，AdvancedOrganicChemistry,3rdEdition，Vols.AandB(PlenumPress,NewYork1992)。本發(fā)明的實施將使用，除非另外指出，有機化學(xué)合成的常規(guī)方法、質(zhì)譜分析、層析的制備型和分析型方法、蛋白化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)和藥理學(xué)均屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。參見，例如，Τ.E.Creighton，ProteinsStructuresandMolecularProperties(W.H.FreemanandCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(WorthPublishers，Inc.，第4片反，2004)；Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2片反，1989)；MethodsInEnzymology(S.ColowickandN.Kaplan編，AcademicPress，Inc.)；Remington'sPharmaceuticalSciences，18thEdition(Easton,Pennsylvania:MackPublishingCompany,1990)。所有本文引用的出版物、專利和專利申請均在此通過引用全文并入本文，無論是在上文或下文。下列氨基酸縮寫在全文貫穿使用丙氨酸=Ala(A)精氨酸Arg(R)天門冬酰胺Asn(N)天門冬氨酸Asp(D)半胱氨酸Cys(C)谷氨酰胺Gln(Q)谷氨酸=Glu(E)甘氨酸Gly(G)組氨酸His(H)異亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L)賴氨酸Lys(K)甲硫氨酸Met(M)苯丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P)絲氨酸Ser(S)蘇氨酸Thr(T)色氨酸Trp(W)酪氨酸Tyr(Y)纈氨酸Val(V)“多核苷酸”是指由核苷酸單位組成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，如脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)以及核酸類似物。核酸類似物包括那些包含非天然存在堿基，利用除了天然存在的磷酸二酯鍵以外的鍵與其他核苷酸鍵合的核苷酸，或包括磷酸二酯鍵以外的鍵連接的堿基。因此，核苷酸類似物的實例包括，例如但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、boranophosphates、甲基膦酸酯、手性膦酸甲酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等等。這種多核苷酸可以是合成的，例如，利用自動化DNA合成儀。術(shù)語“核酸”通常是指大的多核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸”通常是指短的多核苷酸，通常不大于約50個核苷酸。應(yīng)理解當(dāng)核苷酸序列用DNA序列(即A、T、G、C)表示時，其還包括RNA序列(即A、U、G、C)，其中〃U"替換〃T"。"cDNA"是指與mRNA互補或相同的DNA，采用單鏈或雙鏈形式。本文使用常規(guī)標(biāo)志來描述多核苷酸序列單鏈多核苷酸序列的左側(cè)末端是5'端；雙鏈多核苷酸序列的左側(cè)方向是5'方向。向新生RNA轉(zhuǎn)錄物添加核苷酸的5'到3'方向被稱作轉(zhuǎn)錄方向。與mRNA具有相同序列的DNA鏈被稱作“編碼鏈”；與該DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA具有相同序列的DNA鏈上的序列(位于5'到RNA轉(zhuǎn)錄物的5'端)被稱作“上游序列”；與RNA具有相同序列的DNA鏈上的序列(位于3'到編碼RNA轉(zhuǎn)錄物的3'端)被稱作“下游序列”?！盎パa”是指兩多核苷酸相互作用表面的拓?fù)湎嗳莼蚺鋵?。因此，兩個分子可以被稱作互補的，此外，接觸面特征是彼此互補的。如果第一多核苷酸的核苷酸序列與第二多核苷酸的多核苷酸結(jié)合伴侶的核苷酸序列相同，則第一多核苷酸與第二多核苷酸互補。因此，序列為5'-TATAC-3'的多核苷酸與序列為5'-GTATA-3'的多核苷酸互補。如果與所述核苷酸序列互補的序列與參照核苷酸序列基本上相同，則核苷酸序列與參照核苷酸序列“基本上互補”，?！熬幋a”是指多核苷酸(如基因，cDNA或mRNA)中的具體核苷酸序列的固有性質(zhì)，它們在生物進(jìn)程中作為合成其他聚合物和大分子的模板，具有確定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或由此而來的確定氨基酸序列和生物學(xué)特性。因此，如果基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄和mRNA翻譯在細(xì)胞或其他生物系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白，則該基因編碼蛋白。編碼鏈(其核苷酸序列與mRNA序列相同，通常以序列表形式提供)和非編碼鏈(用作基因或cDNA轉(zhuǎn)錄的模板)可以被稱作編碼該基因或cDNA的蛋白或其他產(chǎn)物。除非另作說明，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括編碼相同氨基酸序列的相互簡并形式的所有核苷酸序列。編碼蛋白和RNA的核苷酸序列可以包括內(nèi)含子?！爸亟M多核苷酸”是指具有自然界未連接在一起的序列的多核苷酸。擴增或組裝的重組多核苷酸可以包括在合適的載體中，所述載體可用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。包括重組多核苷酸的宿主細(xì)胞被稱作“重組宿主細(xì)胞”?；蛉缓笤谥亟M宿主細(xì)胞中表達(dá)以產(chǎn)生，例如，“重組多肽”。重組多核苷酸還可以發(fā)揮非編碼功能(例如啟動子、復(fù)制起點、核糖體結(jié)合位點等等)?！氨磉_(dá)控制序列”是指多核苷酸中的核苷酸序列，它調(diào)節(jié)與其可操作連結(jié)的核苷酸序列的表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)?！翱刹僮鞯剡B接”是指兩部分的功能關(guān)系，其中一部分的活性(例如，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力)導(dǎo)致對其他部分的作用(例如，序列的轉(zhuǎn)錄)。表達(dá)控制序列可以包括例如但不限于以下序列啟動子(例如，誘導(dǎo)型或組成型)、增強子、轉(zhuǎn)錄終止子、起始密碼子(即ATG)、內(nèi)含子的剪接信號和終止密碼子?！氨磉_(dá)載體”是指包含重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸包含與待表達(dá)的核苷酸序列可操作地連接的表達(dá)控制序列。表達(dá)載體包括足夠的用于表達(dá)的順式作用元件；其他表達(dá)元件可以用宿主細(xì)胞或體外表達(dá)系統(tǒng)提供。表達(dá)載體包括所有本領(lǐng)域已知的那些，諸如整合了重組多核苷酸的粘粒、質(zhì)粒(例如，裸質(zhì)?；虬谥|(zhì)體的質(zhì)粒)和病毒?！皵U增”是指使多核苷酸序列復(fù)制從而增加到更多數(shù)目多核苷酸分子的任意方法，例如通過逆轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)復(fù)制?！耙铩笔侵改軌蚺c指定的多核苷酸模板特異性雜交并提供合成互補多核苷酸的起始點的多核苷酸。當(dāng)多核苷酸引物置于誘導(dǎo)合成的條件下，即在核苷酸、互補多核苷酸模板和聚合試劑如DNA聚合酶存在的條件下，這種合成發(fā)生。引物通常是單鏈的，但也可以是雙鏈的。引物通常是脫氧核糖核酸，但各種合成和天然存在的引物具有很多應(yīng)用。引物與模板互補，其被設(shè)計成與模板雜交作為合成啟始的位點，但無需反映模板的確切序列。在這種情況下，引物與模板的特異性雜交取決于雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性。引物可以用例如生色團(tuán)、放射性基團(tuán)或熒光基團(tuán)標(biāo)記，用作可檢測基團(tuán)?！岸嚯摹笔侵赣砂被釟埢⑾嚓P(guān)的天然存在的結(jié)構(gòu)變體及其合成的非天然存在的類似物通過肽鍵連結(jié)組成的聚合物，相關(guān)的天然存在的結(jié)構(gòu)變體，以及其合成的非天然存在的類似物。合成多肽可以是合成的，例如，利用自動化多肽合成儀合成。術(shù)語“蛋白”通常是指大的多肽。術(shù)語“肽”通常是指短的多肽。本文使用常規(guī)標(biāo)志來描述多肽序列多肽序列的左側(cè)末端是氨基端；多肽序列的右側(cè)末端是羧基端。“保守替代”是指在多肽中的氨基酸用功能類似的氨基酸替代。下列6組各包含互為保守替代的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸⑶、谷氨酸(E)；3)天門冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸⑴、亮氨酸、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)。氨基酸還可以按如下分組(1)疏水性的Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中度親水性的:Cys、Ser、Thr；(3)酸性的Asp、Glu；(4)堿性的Asn、Gln、His、Lys、Arg；(5)影響鏈方向的殘基Gly、Pro；和(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。在兩種或更多種多核苷酸或多肽序列的上下文中，術(shù)語“一致”或百分比“一致性”是指，利用序列比較算法(描述于2005年9月19日提交的先前共同待決的美國專利申請?zhí)?1/230，374，其在此通過引用全文并入本文)或通過目測檢測，當(dāng)比較和比對最大對應(yīng)性時，兩種或更多種序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸殘基。在兩種核酸或多肽的上下文中，短語“基本上同源”或“基本上一致”一般是指，利用下列序列比對算法之一或目測檢測，當(dāng)比較和比對最大對應(yīng)性時，兩種或更多種序列或子序列具有至少40%、60%、80%、90%、95%、98%核苷酸或氨基酸殘基一致性。優(yōu)選地，長度至少約50個殘基的序列區(qū)域，更優(yōu)選至少約100個殘基的區(qū)域基本上一致，最優(yōu)選所述序列至少約150個殘基基本上一致。在最優(yōu)選的實施方案中，所述序列在兩個比較生物高聚物中的任一或兩者的全長上基本上一致?！盎旧霞兊摹被颉胺蛛x的”表示目標(biāo)種類是存在的優(yōu)勢種類(即在組合物中比任意其他個體大分子種類更多摩爾量)，基本上純化的組分是一種組合物，其中目標(biāo)種類包含所有存在的大分子種類的至少約50%(基于摩爾量)。通常，基本上純的組合物是指該組合物中存在的大分子種類的約80%到90%或更多是純化的目標(biāo)種類。如果組合物基本上由單一大分子種類組成，則該目標(biāo)種類被純化到基本上同質(zhì)(通過常規(guī)檢測方法無法檢測到該組合物中的污染種類)。對于該定義來說，溶劑種類，小分子(<500Daltons)，穩(wěn)定劑(例如，BSA)和基本離子種類不被認(rèn)為是大分子種類。在一些實施方案中，本發(fā)明的原核PAL變體組合物是基本上純的或分離的。在一些實施方案中，本發(fā)明的原核PAL變體組合物是相對于它們的合成中所使用的大分子起始原料來說基本上純的或分離的。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑混合的基本上純化或分離的原核PAL變體。當(dāng)“天然存在的”用于一個客體時，是指該客體可在自然界發(fā)現(xiàn)的事實。例如，存在于生物體(包括病毒)的多肽或多核苷酸序列是天然存在的，它們可以從自然界的來源分離，并且沒有由人類在實驗室中有意改變?！耙吧汀?wt)是涉及生物體天然遺傳形式的術(shù)語。野生型不同于突變形式(具有遺傳突變的生物體)。術(shù)語“多肽”和“蛋白”是指氨基酸殘基的聚合物，不限于產(chǎn)物的最小長度。因此，肽、寡肽、二聚體、多聚體等均包括在該定義內(nèi)。全長蛋白及其片段均被該定義包括。該術(shù)語還包括多肽的表達(dá)后修飾，例如，糖基化、乙?；⒘姿峄鹊?。此外，根據(jù)本發(fā)明的目的，“多肽”是指蛋白，其包括對天然序列的修飾，諸如缺失、添加和替代(通常實際上是保守的)，只要蛋白維持所需活性。在本文中這種多肽可以稱為“突變體”。這些修飾可以是有意的，如通過定點誘變，或可以是偶然的，如由產(chǎn)生蛋白的宿主造成的突變或歸因于PCR擴增的錯誤。如本文使用的，“變體”、“類似物”或“衍生物”是一種化合物，例如肽，其與指定化合物例如肽具有超過約70%的但低于100%的序列相似性。這種變體、類似物或衍生物可以由非天然存在的氨基酸殘基組成，舉例來說包括而不限于高精氨酸、鳥氨酸、青霉胺和正纈氨酸，以及天然存在的氨基酸殘基。這種變體、類似物或衍生物還可以由一種或多種D-氨基酸殘基組成，且在兩個或更多個氨基酸殘基之間包含非肽鍵。如本文使用的，PAL多肽(例如，AvPAL)與水溶性聚合物(例如聚乙二醇或PEG)的“比例”是指PAL多肽和水溶性聚合物的反應(yīng)條件摩爾比。例如，AvPAL和聚乙二醇13的比例(13AvPALPEG)表示在約ImolAvPAL每3mol聚乙二醇的反應(yīng)條件下產(chǎn)生化學(xué)修飾的PAL。在實施例6描述的反應(yīng)條件下，見下文，約13AvPALPEG的比例產(chǎn)生約10-12molPEG每moIAvPAL單體。本文使用的“治療”是指預(yù)防性治療或治療性治療或診斷性治療?！邦A(yù)防性”治療是給不顯示疾病或病理癥狀(即，癌癥)或只顯示早期癥狀的個體施用的治療，目的是減少患病風(fēng)險。可以給予發(fā)明的原核PAL組合物作為預(yù)防性治療以降低發(fā)生疾病(即，癌癥)的可能性，或如果已經(jīng)發(fā)生的話，把疾病的嚴(yán)重性降到最低?！爸委熜浴敝委熓墙o顯示疾病征兆或癥狀(即，癌癥)的個體施用的治療，目的是減少或消除所述征兆或癥狀。所述征兆或癥狀可以是生化的，細(xì)胞的，組織學(xué)的，功能性的，主觀或客觀的?？梢越o予本發(fā)明的原核PAL組合物作為治療性治療或為了診斷?！霸\斷”表示鑒定病理性疾病(即，癌癥)的存在或性質(zhì)。診斷方法在它們的特異性和選擇性方面不同。當(dāng)特定診斷方法不能提供疾病的確切診斷時，如果該方法提供有助于診斷的陽性指示就足夠了?！八幬锝M合物”是指適于受試動物(包括人和哺乳動物)藥物使用的組合物。藥物組合物包含藥理學(xué)有效量的原核PAL多肽，還包含藥學(xué)上可接受的載體。藥物組合物包括包含活性成分，和惰性成份(組成載體)以及所述成分的任意兩種或更多種結(jié)合、絡(luò)合或聚集，或從所述成分的一種或者多種解離，或與所述成分的一種或多種的其他類型反應(yīng)或相互作用所直接或間接產(chǎn)生的任意產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的藥物組合物包含通過混合本發(fā)明的原核PAL多肽與藥學(xué)上可接受的載體制備的任意組合物?！八帉W(xué)上可接受的載體”是指任一標(biāo)準(zhǔn)藥物賦形劑、運載體、稀釋劑、穩(wěn)定劑、防腐齊、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體，如但不限于磷酸緩沖鹽溶液、葡萄糖的5%水溶液、和乳液如油/水或水/油乳化液，和各種類型的濕潤劑和/或佐劑。合適的藥物載體和制劑描述于Remington'sPharmaceuticalSciences，第19片反(MackPublishingCo.,Easton,1995)。優(yōu)選的藥物載體取決于施用活性劑的預(yù)期方式。典型的施用方式包括腸的(例如，口服)或腸胃外的(例如，皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射；或局部、透皮、或透粘膜施用)。“藥學(xué)上可接受的鹽”是可以配制原核PAL變體組合物用于藥物用途的鹽，包括例如金屬鹽(鈉、鉀、鎂、鈣等等)以及氨或有機胺的鹽。“藥學(xué)上可接受的，，或“藥理學(xué)上可接受的，，表示不是生物學(xué)上或其他方面不希望的材料，即該材料可以給個體施用，而不引起任何不良的生物學(xué)效應(yīng)或以有害方式與組合物包含的任一組分相互作用。本文使用的術(shù)語“單位劑型”是指適用于人和動物個體的單位劑量的物理分散單位，每個單位包含預(yù)定量的本發(fā)明原核PAL變體以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形齊U，經(jīng)計算該量足以產(chǎn)生預(yù)期效果。本發(fā)明新的單位劑型的規(guī)格取決于使用的具體原核PAL變體和待實現(xiàn)的效果，以及與宿主中各原核PAL變體有關(guān)的藥效學(xué)?！吧韕H”或“生理范圍的pH”表示包括大約7.2到8.0范圍的pH，更常見的包括大約7.2到7.6的范圍。本文使用的術(shù)語“個體”包括哺乳動物和非哺乳動物。哺乳動物的實例包括但不限于哺乳綱的任意成員人，非人靈長類動物諸如黑猩猩，以及其他猿和猴物種；農(nóng)畜如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家畜諸如兔、狗和貓；實驗動物包括嚙齒類動物，如大鼠、小鼠和豚鼠等等。非哺乳動物的實例包括但不限于鳥類、魚等等。該術(shù)語不指定具體的年齡或性別。B.原核PAL變體對于具體大分子可靠三維結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)模型的闡述使合理設(shè)計成為優(yōu)化所述大分子具體結(jié)構(gòu)和/或功能的有效方法。使用三維結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)模型優(yōu)化PAL酶的方法描述于2005年9月19日提交的先前共同待決的美國專利申請?zhí)?1/230，374中，其在此通過引用全文并入本文。原核PAL的高分辨率三維蛋白晶體結(jié)構(gòu)可用于涉及蛋白工程的方法，以提高原核PAL的生化和生物物理學(xué)特性，并增加原核PAL的體內(nèi)療效。本發(fā)明涉及與野生型原核PAL相比，具有更大苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性的原核PAL變體。本發(fā)明還涉及與野生型原核PAL相比，具有更大生化穩(wěn)定性和/或生化半衰期的原核PAL變體。具有增強催化活性的原核PAL變體本發(fā)明的野生型原核PAL的生物活性位點可以按照需要改變以優(yōu)化PAL動力學(xué)特性。Km，得到最大活性一半的底物濃度，與維持Phe水平在可接受范圍內(nèi)的PAL治療效果密切相關(guān)，該可接受范圍利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法檢測為低于約20微摩到60微摩的檢測水平，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩。Km是酶對底物的親和力。通過控制親和力，可以限制或控制任意酶對不同濃度底物的效果。例如，如果Km是1000微摩(例如，圓紅冬孢酵母的PAL)，在240微摩的血液Phe水平酶活性將降低到約12.5%，在60微摩的血液Phe水平酶活性將降低到約3%。如果Km是240微摩，在240微摩的血液Phe水平酶活性將降低到約50%，在60微摩的血液Phe水平酶活性將降低到約12%。優(yōu)選的治療目標(biāo)是治療時原核PAL酶具有足夠活性以降低Phe水平并將其維持在從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩，這可利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法檢測。當(dāng)Phe水平跌至正常范圍內(nèi)(大約55-60微摩，參見Kaufmann，Proc.Natl.Acad.SciUSA963160-3164(1999))時，Km為約1000微摩的酶將快速喪失活性，仍需要不切實際地施用高濃度或大體積劑量。治療時具有更低Km的酶可以快速去除Phe并將Phe維持在從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩，這可用于控制癌癥。在優(yōu)選的實施方案中，生物活性原核PAL變體的kcat為至少約0.ls_l，優(yōu)選的大于約0.5s-l，甚至更優(yōu)選的大于約l.Os-Ι。在最優(yōu)選的實施方案中，生物活性原核PAL變體的kcat為至少約0.4s-l，優(yōu)選的大于約2.Os-Ι，甚至更優(yōu)選的大于約4.0s_l。在其他優(yōu)選的實施方案中，生物活性原核PAL變體的Km為約10微摩到約2000微摩。在更優(yōu)選的實施方案中，生物活性原核PAL變體的Km為約10微摩到約1000微摩。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，生物活性原核PAL變體的Km為約10微摩到約500微摩。在其他優(yōu)選的實施方案中，生物活性原核PAL變體顯示的酶活性為野生型PAL的約50%到比野生型PAL高約10倍。在其他優(yōu)選的實施方案中，生物活性原核PAL顯示的酶活性為野生型PAL的約至少50%到比野生型PAL高約100%。這種生物活性原核PAL變體可以利用本領(lǐng)域公知的方法形成，如通過定點誘變形成。具有降低免疫原性的原核PAL變體目前大量策略被用于降低蛋白免疫原性。優(yōu)選地，被引入以最小化免疫應(yīng)答的改變不破壞大分子的結(jié)構(gòu)、功能或穩(wěn)定性。使用的有效策略包括增加人序列含量(嵌合體和/或其他“人源化”方法)，改進(jìn)溶液性質(zhì)，去除抗體表位，引入化學(xué)衍生化(諸如聚乙二醇化)，和/或鑒定并去除MHC抗原識別位。對于注射治療，通過進(jìn)行表位作圖繼之以合理誘變以改變和/或另外突變免疫原性的這些位點，單獨地和結(jié)合位點特異性聚乙二醇化(Hershfield等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7185_7189(1991)；Leong等，Cytokine16(3)106-119(2001)；Lee等，Pharm.Res.20(5):818_825(2003))或其他化學(xué)衍生化方法來降低蛋白免疫反應(yīng)性到可接受的程度，從而可以解決體內(nèi)免疫反應(yīng)性。抗原表面蛋白區(qū)域的改變降低免疫原性(Chirino等.，DrugDiscov.Today9(2):82_90(2004))。一種改進(jìn)方法包括構(gòu)建保留催化活性的尺寸更小的蛋白(例如，使用吸光度分析進(jìn)行活性測量)。還可以使用蛋白工程結(jié)合ELISA篩選來鑒定免疫反應(yīng)性降低的突變體。另一種方法是引入點突變以增加用于聚乙二醇衍生化的表面Lys位點，這種方法顯示降低對試驗酶嘌呤核苷磷酸化酶的免疫原性(Hershfield等(1991)，同前)。一種可選途徑使用位于蛋白表位區(qū)的殘基突變來去除免疫原性位點(Yeung等，J.Immunol.172(11):6658_6665(2004))。在類似于抗體人源化的方法中，用來自人抗體的同源環(huán)區(qū)和/或殘基替代同源蛋白的相應(yīng)環(huán)區(qū)。改進(jìn)蛋白的溶液特性可以增加特異性酶活性和/或降低免疫原性。細(xì)菌表達(dá)的重組蛋白的一種典型溶液特性是蛋白聚集體的形成，這歸因于，例如，鏈內(nèi)二硫鍵形成、疏水性相互作用和/或二價陽離子(Chi等，Pharm.Res.20(9)=1325-1336(2003))0重組表達(dá)蛋白的聚集能夠增強免疫應(yīng)答(Hermeling等，Pharm.Res.21(6)=897-903(2994)；Schellekens,Nephrol.Dial.Transplant.20(suppl6):vi3_9(2005))。一種改進(jìn)方法包括用其他氨基酸殘基(例如，絲氨酸)替代表面半胱氨酸殘基，以將形成鏈內(nèi)二硫鍵的可能性降到最低。例如，用絲氨酸殘基替代兩個表面半胱氨酸殘基減少分支酸裂合酶的聚集，而對酶活性影響較小(Holden等·，Biochim.Biophys.Acta1594(1)160-167(2002))。本發(fā)明涉及一個或多個半胱氨酸殘基被另一氨基酸殘基(優(yōu)選的絲氨酸殘基)替代的原核PAL變體。在一些實施方案中，原核PAL的一個或多個半胱氨酸殘基被另一氨基酸殘基替代。在優(yōu)選的實施方案中，原核PAL是AvPAL。在更優(yōu)選的實施方案中，AvPAL的一個或多個半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。C.化學(xué)修飾的原核PAL變體大分子化學(xué)修飾可以采用以下方式進(jìn)行非特異性方式(導(dǎo)致衍生種類的混合物)或位點特異性方式(基于野生型大分子反應(yīng)性定向的衍生，和/或定點誘變和化學(xué)修飾聯(lián)用的位點選擇性修飾)，或任選地利用表達(dá)蛋白的結(jié)扎法(ligationmethods)(Hofmann等，Curr.Opin.Biotechnol.13(4)297-303(2002))。優(yōu)選地，使用化學(xué)修飾降低免疫原性。聚乙二醇化是一種得到確認(rèn)的降低蛋白免疫原性的方法(Bhadra等，Pharmazie57(1)5-29(2002))，但糖基化和其他化學(xué)衍生步驟，利用磷酸化、酰胺化、羧化、乙?；?、甲基化的修飾，酸加成鹽、酰胺、酯和N-?；苌锏男纬梢彩强尚械?Davis，Science303480-482(2004))。用于聚乙二醇化PAL蛋白和確定聚乙二醇化最適程度的方法描述于2005年9月19日提交的之前共同待決的美國專利申請?zhí)?1/230，374，其在此通過引用全文并入本文。本發(fā)明涉及包含水溶性聚合物(即聚乙二醇或PEG)的原核PAL變體。本發(fā)明涉及在原核PAL變體的活性位點/其附近引入一個或多個賴氨酸殘基以增強催化活性、降低免疫原性和/或提高生化穩(wěn)定性，部分通過阻斷酶活性位點/其附近的其他氨基酸殘基(例如，酪氨酸)的潛在聚乙二醇化或阻斷對于酶活性重要的賴氨酸殘基的潛在聚乙二醇化來實現(xiàn)。不受具體理論的約束，假定原核PAL活性位點/其附近的酪氨酸殘基(S卩，AvPAL中第78或314位)可能是聚乙二醇化位點，這會降低酶活性。在一些實施方案中，原核PAL活性位點/其附近的一個或多個氨基酸殘基(不是酶活性需要的)被賴氨酸殘基替代。在優(yōu)選的實施方案中，原核PAL是AvPAL。在更優(yōu)選的實施方案中，第78或314位的AvPAL酪氨酸殘基不易被聚乙二醇化。再一次不受具體理論約束，假定原核PAL的賴氨酸殘基(即，AvPAL中第419位)可以是會降低底物結(jié)合和/或催化活性的聚乙二醇化位點，其由于相鄰賴氨酸殘基PAL(即，AvPAL中第413位)的聚乙二醇化而通常被阻斷進(jìn)行聚乙二醇化。在一些實施方案中，原核PAL的一個或多個氨基酸殘基被賴氨酸殘基替代，從而使對于酶的底物結(jié)合和/或催化活性非常重要的賴氨酸殘基不易被聚乙二醇化。在優(yōu)選的實施方案中，原核PAL是AvPAL。在更優(yōu)選的實施方案中，第419位的AvPAL賴氨酸殘基不易被聚乙二醇化。聚乙二醇化的原核PAL變體2006年6月12日提交的先前共同待決的美國專利申請?zhí)?1/451，999(其在此通過引用全文并入本文)的實施例7到9描述了下列PAL的聚乙二醇和非聚乙二醇形式對ENU2或BTBRenu2小鼠中苯丙氨酸(Phe)水平的影響圓紅冬孢酵母的賴氨酸突變體R91KPAL(RtPAL)、藍(lán)藻點形念珠藻產(chǎn)生的PAL(NpPAL)、和cyanobacterium多變魚腥藻產(chǎn)生的PAL(AvPAL)0該動物模型是苯丙氨酸羥化酶基因(PAH)基因座處純合的突變體，導(dǎo)致動物患嚴(yán)重高苯丙氨酸血癥。高血漿Phe水平使該動物成為評價PAL降低血漿Phe能力的合適模型。與未聚乙二醇化的NpPAL和AvPAL相比，分別施用聚乙二醇化形式的NpPAL和AvPAL在ENU2小鼠中分別導(dǎo)致Phe的更大降低。對于NpPAL來說，通過每周注射可以維持這種作用超過十周。這些結(jié)果表明對來自藍(lán)藻、點形念珠藻和多變魚腥藻的PAL的聚乙二醇化對于降低患PKU小鼠的Phe水平非常重要。2006年6月12日提交的先前共同待決的美國專利申請?zhí)?1/451，999(其在此通過引用全文并入本文)的實施例14描述了AvPAL多肽中半胱氨酸殘基(例如，第503和565位)的絲氨酸替代對ENU2小鼠Phe水平的影響。與利用聚乙二醇化野生型AvPAL得到的血漿Phe相比，聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的施用導(dǎo)致血漿Phe的降低。此外，與聚乙二醇化的野生型AvPAL相比，注射聚乙二醇化AvPAL變體的動物中抗PAL抗體滴度更低。這些結(jié)果顯示聚乙二醇化的AvPAL變體具有(1)與聚乙二醇化的野生型AvPAL相當(dāng)?shù)捏w內(nèi)PAL酶活性，和⑵具有比聚乙二醇化的野生型AvPAL降低的免疫原性。D.原核PAL變體的治療用途和施用1.癌癥的各種形式本發(fā)明涉及利用包括使用原核PAL組合物的方法治療癌癥，單獨施用或與其他治療，例如但不限于癌癥治療劑或靶向癌癥治療劑聯(lián)用。具體來說，本發(fā)明涉及，原核PAL組合物可用于治療任意水平(例如，從約40微摩到2000微摩)血液、血清或血漿苯丙氨酸(Phe)濃度的患者群體，其中人血漿中的正常范圍是約55微摩到60微摩(Kaufman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:3160_3164(1999))。本文使用的“癌癥治療劑”是指任意化合物，例如，小分子或肽/多肽，其已經(jīng)被證明對癌細(xì)胞發(fā)揮治療功效(即，增殖和/或生存的抑制)。通常，癌癥治療劑是細(xì)胞毒劑或細(xì)胞生長抑制劑。本文使用的“靶向癌癥治療齊『是指任意化合物，例如，小分子或肽/多肽，或多肽或偶聯(lián)的多肽，其已經(jīng)被證明對特定癌細(xì)胞或組織發(fā)揮治療功效(即，增殖和/或生存的抑制)。通常，靶向癌癥治療劑是抗體，具有抗體樣結(jié)構(gòu)域的多肽，或其他多肽，例如酶、激素、生長因子、細(xì)胞因子等等，它們選擇性結(jié)合靶細(xì)胞的表面。抗體、具有抗體樣結(jié)構(gòu)域的多肽或其他多肽可以是不偶聯(lián)的，或可以偶聯(lián)到癌癥治療劑。靶向癌癥治療劑可以是對特定癌細(xì)胞或組織發(fā)揮治療功效的化合物。本發(fā)明的原核PAL組合物可用于治療任意Phe限制或去除抑制其增殖和/或生存的癌癥。對本發(fā)明的原核PAL組合物治療有效的癌癥的鑒定可以基于體外培養(yǎng)實驗(參見實施例14)或小鼠中的體內(nèi)人腫瘤異種移植研究(參見實施例15)使用例如腫瘤活檢標(biāo)本或與在人類癌癥的動物模型中已知的或得到證實的對Phe限制或去除敏感的腫瘤類型進(jìn)行比較來進(jìn)行。在優(yōu)選的實施方案中，癌癥是肺癌、腦癌或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。在其他優(yōu)選的實施方案中，癌癥是頭頸癌、子宮癌、白血病(例如急性髓性白血病或急性淋巴母細(xì)胞白血病)或骨髓瘤。在其他優(yōu)選的實施方案中，癌癥是兒童癌癥或耐藥性癌癥(即，已經(jīng)被證實對癌癥治療劑或靶向癌癥治療劑有抗性的癌癥)。本發(fā)明的一些實施方案涉及通過給個體聯(lián)合施用組合物和蛋白限制性(即不含苯丙氨酸)飲食來治療癌癥，所述組合物包含原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物，其中與不存在所述聯(lián)合施用的濃度相比，原核PAL和蛋白限制性飲食的聯(lián)合施用有效地降低了所述個體血液、血漿或血清中的Phe濃度。預(yù)期本發(fā)明的方法需要監(jiān)測接受原核PAL組合物治療的個體的血漿Phe濃度?；颊呷缓笸ㄟ^單獨施用原核PAL組合物，或聯(lián)合施用其他治療如癌癥治療劑或靶向癌癥治療齊U，或聯(lián)合施用原核PAL和蛋白限制型(即不含苯丙氨酸)飲食來進(jìn)行治療，從而使患者血液、血漿或血清Phe濃度至少降低10%。優(yōu)選地，所述方法使血液、血漿或血清Phe濃度至少降低25%，更優(yōu)選地至少降低50%。更優(yōu)選地，所述方法使個體血液、血清或血漿Phe濃度至少降低50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多(例如當(dāng)血漿Phe濃度為60微摩的患者接受治療時，Phe濃度降低50%、70%或90%將分別產(chǎn)生30微摩、18微摩或6微摩的血漿Phe濃度)。顯然，應(yīng)理解本發(fā)明的治療方法會努力將治療后的患者的血液、血清或血漿Phe濃度降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩，這可以利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法檢測。腸胃外、口服或其他標(biāo)準(zhǔn)施用途徑和劑量可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法實現(xiàn)。2.用于治療的組合物本發(fā)明涉及癌癥的治療性介入。這種介入最初基于原核PAL組合物、藥物組合物和制劑的使用，它們可以單獨使用或與其他治療如癌癥治療劑或靶向癌癥治療劑聯(lián)合使用，或?qū)⒌偷鞍罪嬍?即低苯丙氨酸)和原核PAL聯(lián)合施用，或上述兩者。此外，原核PAL和/或限制性飲食還可以與其他治療組合物聯(lián)合，所述組合物設(shè)計成用于例如對抗低苯丙氨酸水平現(xiàn)象，例如例如但不限于酪氨酸補充法。該部分提供了關(guān)于可用于本文預(yù)期治療的組合物、藥物組合物和制劑的討論。原核PAL組合物、藥物組合物和制劑通常，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包括治療有效量的本發(fā)明的原核PAL組合物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、運載體、稀釋劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。這種藥物組合物包含各種緩沖液內(nèi)容物(例如Tris-HCl、磷酸鹽)、pH和離子強度的稀釋劑；添加劑如去污劑和增溶劑(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)，抗氧化劑(例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)，防腐劑(例如Thimerosol、苯甲醇)和填充物(例如乳糖、甘露醇)；參見，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版(1990，MackPublishingCo.，Easton，Pa.)第1435:1712頁，其在此通過引用并入本文?；钚猿煞值挠行Я渴侵委?、預(yù)防或診斷有效量，其由本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮這類因素如體重、年齡和治療目標(biāo)后可以很容易地確定。本發(fā)明的原核PAL藥物組合物可以包括緩沖劑以維持溶液pH在所需范圍內(nèi)。優(yōu)選的緩沖劑包括Tris-HCl、醋酸鈉、磷酸鈉、和檸檬酸鈉。還可以使用這些緩沖劑的混合物。組合物中有效的緩沖劑量主要取決于使用的具體緩沖液和溶液PH。例如，醋酸鹽在pH5是比在PH6更有效的緩沖液，所以在pH5可以使用比在pH6更少的醋酸鹽。更優(yōu)選的緩沖劑是Tris-HCl。用于本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)選pH范圍是約pH6.0-8.5。用于本發(fā)明藥物組合物的更優(yōu)選PH范圍是約pH7.0-8.0。用于本發(fā)明藥物組合物的最優(yōu)選pH范圍是約pH7.0-7.6。本發(fā)明的藥物組合物還可以包括等滲調(diào)節(jié)劑，以使溶液等滲并且更適合于注射。優(yōu)選的試劑是在50-200mM濃度范圍內(nèi)的氯化鈉。更優(yōu)選的試劑是在100_150mM濃度范圍內(nèi)的氯化鈉。最優(yōu)選的試劑是在130-150mM濃度范圍內(nèi)的氯化鈉。藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑可以包括穩(wěn)定劑，其是穩(wěn)定本發(fā)明原核PAL組合物的分子。本文使用的術(shù)語“穩(wěn)定”，旨在包括，例如但不限于，增加原核PAL酶的保存期限、保護(hù)原核PAL酶免受蛋白水解消化、維持原核PAL酶的活性構(gòu)象、以及在高溫保存時保留原核PAL酶活性。本發(fā)明的穩(wěn)定劑包括L-苯丙氨酸(Phe)及其結(jié)構(gòu)類似物，如反式桂皮酸(t-CA)、安息香酸、酪氨酸(Tyr)等。在親和純化除去其底物L(fēng)-苯丙氨酸后，來自菜豆(Phaseolusvulgaris)的植物PAL(PvPAL)顯示活性喪失(DaCunha,Eur.J.Biochem.178243-248(1988))，并且已經(jīng)表明酪氨酸保護(hù)來自圓紅冬孢酵母的酵母PAL(RtPAL)免遭蛋白酶滅活(Wang等.，Mol.Genet.Metab.86134-140(2005)；Pilbak等，F(xiàn)EBSJ.2731004-1019(2006))。如下文所示，Phe及其結(jié)構(gòu)類似物中的一些具有穩(wěn)定多變魚腥藻原核PAL(AvPAL)的PEGPAL偶聯(lián)物的能力(參見實施例11)。不受具體理論的約束，假定原核PAL酶作為酶-底物復(fù)合物更穩(wěn)定，其中結(jié)合的底物Phe被轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物t-CA或t-CA的過渡態(tài)類似物。t-CA保持與其他高反應(yīng)性活性位點中心(ΜΙ0基團(tuán))的結(jié)合，從而穩(wěn)定PAL酶。因此，PAL酶底物、Phe、產(chǎn)物、t-CA或其結(jié)構(gòu)類似物是本發(fā)明的穩(wěn)定劑。本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含原核PAL變體和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑。所述穩(wěn)定劑是Phe或其結(jié)構(gòu)類似物。所述穩(wěn)定劑選自L-苯丙氨酸、反式肉桂酸和安息香酸。本發(fā)明穩(wěn)定劑的優(yōu)選范圍是每摩爾原核PAL活性位點約0.1到20摩爾穩(wěn)定劑。本發(fā)明穩(wěn)定劑的更優(yōu)選的范圍是每摩爾原核PAL活性位點約0.5到10摩爾穩(wěn)定劑。本發(fā)明穩(wěn)定劑的最優(yōu)選的范圍是每摩爾原核PAL活性位點約1到10摩爾穩(wěn)定劑。在一些實施方案中，藥物組合物包含原核PAL變體和藥學(xué)上可接受的載體，其中與野生型PAL相比，所述原核PAL變體具有更高的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性，能夠有效地將個體血液、血清或血漿中的Phe濃度降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑。在一些實施方案中，所述穩(wěn)定劑是Phe或其結(jié)構(gòu)類似物。在一些實施方案中，所述穩(wěn)定劑選自L-苯丙氨酸、反式肉桂酸和安息香酸。在優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物包含原核PAL變體和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述原核PAL變體是多變魚腥藻PAL(AvPAL)變體，其中AvPAL變體第503和565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代，所述AvPAL變體還包括聚乙二醇的水溶性聚合物，其中AvPAL變體和聚乙二醇的比例是約13，所述AvPAL變體能夠有效地將個體血液、血清或血漿中的苯丙氨酸濃度降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑。在一些實施方案中，所述穩(wěn)定劑是Phe或其結(jié)構(gòu)類似物。在優(yōu)選的實施方案中，所述穩(wěn)定劑選自L-苯丙氨酸、反式肉桂酸和安息香酸。如本文使用的，當(dāng)涉及原核PAL變體組合物時，術(shù)語“治療有效量”是指能夠有效產(chǎn)生對癌癥患者健康狀況的預(yù)期有益效果的量。在一些實施方案中，原核PAL變體的治療有效量導(dǎo)致血液、血漿或血清(優(yōu)選的血漿)L-苯丙氨酸水平的降低，這有利于患者。該量對于不同個體間是不同的，取決于大量因素，包括患者的總體身體健康狀況、飲食和疾病狀態(tài)。用于治療的原核PAL的量導(dǎo)致血液、血漿或血清(優(yōu)選的血漿)L-苯丙氨酸水平的可接受的降低，并在PAL治療期間將該值維持在有益水平(通常范圍是低于血液、血漿或血清(優(yōu)選的血漿)L-苯丙氨酸正常范圍的約5%到約35%和100%之間，優(yōu)選的范圍是低于約5%到約35%，甚至更優(yōu)選的范圍是低于約5%到約15%)。在一些實施方案中，與未接受治療的患者相比，原核PAL變體的治療有效量在接受治療的患者中減少腫瘤生長、腫瘤大小或腫瘤負(fù)荷大于約10%、30%、50%、70%、90%、95%、98%或99%。在一些實施方案中，與未接受治療的患者相比，原核PAL變體的治療有效量在接受治療的患者中將腫瘤維持在穩(wěn)定狀態(tài)。在一些實施方案中，與末接受治療的患者相比，原核PAL變體的治療有效量在接受治療的患者中增加存活時間或無病時間至少約10%、20%、50%、100%、2倍、5倍或10倍的更長時間。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用公開提供的材料和步驟可以輕易地確定本發(fā)明原核PAL變體組合物的治療有效量。本發(fā)明提供比天然PAL施用頻率更低的原核PAL變體施用。給藥頻率將根據(jù)接受治療的疾病而改變，但通常是約每周一次。應(yīng)理解實際使用的給藥頻率可以稍微不同于本文公開的頻率，這歸因于不同個體對原核PAL變體應(yīng)答的差異；術(shù)語“約”旨在反映這種差異。預(yù)期施用原核PAL變體約每周兩次，約每周一次，約每兩周一次，約每月一次，或比約每月一次更長。因此本發(fā)明可用于降低血液、血漿或血清L-苯丙氨酸水平。許多癌癥相關(guān)疾病，其中血液、血漿或血清L-苯丙氨酸水平的去除是有益的，都可以用本發(fā)明的原核PAL變體藥物組合物進(jìn)行治療。根據(jù)本發(fā)明制備的原核PAL藥物組合物優(yōu)選地通過腸胃外注射、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、動脈內(nèi)或鞘內(nèi)施用。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚其他遞送途徑也可有效用于本發(fā)明的藥物組合物。本文描述的方法使用原核PAL藥物組合物，其包含如上所述的分子，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、運載體、稀釋劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體，和任選的其他治療和/或預(yù)防成分。這類賦形劑包括液體諸如水、鹽水、甘油、聚乙二醇、透明質(zhì)酸、乙醇、環(huán)糊精、修飾的環(huán)糊精(即磺丁基乙醚環(huán)糊精)等等。用于非液體制劑的合適賦形劑還可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些。藥學(xué)上可接受的鹽可用于本發(fā)明的組合物，包括例如無機酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等等；和有機酸鹽如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等等。關(guān)于藥學(xué)上可接受賦形劑和鹽的深入討論可以獲自Remington'sPharmaceuticalSciences，第18片反(Easton,Pennsylvania:MackPublishingCompany，1990)。此外，這類運載體中還可以存在輔助物，如濕潤劑或乳化劑、生物緩沖劑、表面活性劑等等。生物緩沖劑實際上可以是任意溶液，其是藥理學(xué)上可接受的，并為制劑提供所需pH，即生理可接受范圍內(nèi)的pH。緩沖液的實例包括鹽水、磷酸緩沖鹽溶液、Tris緩沖鹽溶液、Hank's緩沖鹽溶液等等。取決于預(yù)期施用方式，藥物組合物可以采用固體形式、半固體或液體劑型，例如片齊、栓劑、丸劑、膠囊、粉劑、液體、懸浮劑、乳劑、軟膏、洗劑等等，優(yōu)選地采用適于精確劑量單次施用的單位劑型。所述組合物將包括治療有效量的原核PAL以及藥學(xué)上可接受的載體，此外，可以包括其他藥劑、佐劑、稀釋劑、緩沖液等等。通常，本發(fā)明的原核PAL藥物組合物將作為藥物制劑施用，如那些適于口服(包括口腔和舌下)、直腸、鼻、局部、肺部、陰道或腸胃外(包括肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))施用或采用適于通過吸入或吹入施用的制劑。優(yōu)選的施用方式是利用方便的每日靜脈內(nèi)給藥方案，其可以根據(jù)患病程度進(jìn)行調(diào)整。對于固體組合物來說，常規(guī)的無毒固體載體包括例如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等等。藥學(xué)上可施用的液體組合物可以例如通過將本文描述的原核PAL變體組合物和可選的藥物佐劑在賦形劑(如水、鹽水、水性葡萄糖、甘油、乙醇等等)中溶解、分散等等，從而形成溶液或懸液來制備。如果需要，待施用的藥物組合物還可以包含微量的無毒輔助物如濕潤劑或乳化劑、PH緩沖劑、增強劑(tonicifyingagents)等等，例如醋酸鈉、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺醋酸鈉、油酸三乙醇胺酯等等。制備這類劑型的實際方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，或?qū)λ麄儊碚f是顯而易見的；例如,參見Remington'sPharmaceuticalSciences，如上文的參考。對于口服給藥來說，組合物通常采用片劑、膠囊或軟膠囊的形式，或可以是水性或非水性溶液、懸液或糖漿。片劑和膠囊是優(yōu)選的口服給藥形式。用于口服使用的片劑和膠囊通常包括一種或多種常用的載體諸如乳糖和玉米淀粉。通常還添加潤滑劑，諸如硬脂酸鎂。當(dāng)使用液體懸液時，活性劑可以與乳化劑和懸浮劑組合。如果需要，還可以添加調(diào)味劑、著色劑和/或甜味劑。用于摻入本文口服制劑的其他可選組分包括，但不限于防腐劑、懸浮齊U、增稠劑等等。腸胃外制劑可以制備為常規(guī)形式，作為液體溶液或懸液，適于重建的固體或凍干形式，注射前在液體中溶解或懸浮，或作為乳液。優(yōu)選的，利用合適的載體、分散劑或濕潤劑和懸浮劑，根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)配制注射用無菌懸液。注射用無菌制劑還可以是溶于無毒腸胃外可接受稀釋劑或溶劑的注射用無菌溶液或懸液。屬于可使用的可接受賦形劑和溶劑的是水、Ringer's溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌、非揮發(fā)油、脂肪酯或多元醇通常被用做溶劑或懸浮介質(zhì)。此外，腸胃外給藥可以包括使用緩釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)，這樣的話可以維持劑量的恒定水平?？梢越o患者施用治療有效劑量的本文描述的本發(fā)明的原核PAL組合物以治療癌癥。在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏型ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法可以測定這種原核PAL組合物的毒性和治療效果，例如通過測定LD5tl(50%群體的致死劑量)和ED5tl(50%群體的治療有效劑量)。毒性和治療效果的劑量比例是療效指數(shù)，其可以表示為LD5tZED5tl的比例。顯示高療效指數(shù)的原核PAL組合物通常是優(yōu)選的。從細(xì)胞培養(yǎng)物分析和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制給人使用的劑量范圍。劑量優(yōu)選的處于循環(huán)濃度范圍內(nèi)，其包括具有最低或者最小毒性的ED5tlt5該范圍內(nèi)的劑量可以變化，這取決于使用的劑型和使用的施用途徑?？梢詮募?xì)胞培養(yǎng)物分析和動物模型確定治療有效的劑量或量。飲食蛋白除了給癌癥患者施用原核PAL組合物外，還預(yù)期可以限制或改變患者的飲食蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚用于治療PKU的各種商品化供應(yīng)的蛋白配制品。這類配制品包括MAXIMAID、PHENEX1、PHENEX2(RossLaboratories,Liverpool,UK),LOFENALAC,PHENYL-FREE(Mead-Johnson)等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用參考蛋白配制品，其通常不含Phe濃度。該蛋白配制品中經(jīng)常添加PKU患者缺乏的氨基酸。這種氨基酸包括例如L-酪氨酸和L-谷氨酰胺。此外，除了蛋白限制外，眾所周知還應(yīng)提供L-肉堿和牛磺酸(通常發(fā)現(xiàn)于人乳和動物來源的其他食品)。在一些實施方案中，L-肉堿可以作為20mg/100g的蛋白補充劑提供，牛磺酸可以作為40mg/100g的蛋白補充劑提供，以幫助提供這些因子通常存在于人乳和動物來源食品中的量。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以查閱2000國家科學(xué)院-國家研究委員會飲食參考攝取量(2000NationalAcademyofSciences-NationalResearchCouncilDietaryReferenceIntakes)關(guān)于其他組分的進(jìn)一步列表，如必需維生素和礦物，這些應(yīng)提供給患者以確保除了飲食蛋白限制外其他補充劑被提供。根據(jù)上文關(guān)于總蛋白量和優(yōu)選血漿Phe濃度的討論，本領(lǐng)域?qū)⒛艽_定要求的飲食蛋白限制的量，進(jìn)而調(diào)節(jié)患者的飲食。當(dāng)給該個體施用原核PAL時，確定本發(fā)明方法是否有效需要定期地檢測患者的血漿Phe濃度以確保血漿Phe濃度維持在從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩。檢測這種濃度的試驗在下文描述。優(yōu)選地，實現(xiàn)低于約20微摩到60微摩的檢測水平的濃度，更優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種治療癌癥的方法，包括給需要這種治療的個體施用治療有效量的藥物組合物，還包括給個體施用蛋白限制性(即，不含苯丙氨酸)飲食，所述藥物組合物包含原核苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)變體和藥學(xué)上可接受的載體，其中與野生型PAL相比，所述PAL變體具有更高的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性，能夠有效將個體血液、血清或血漿中的苯丙氨酸濃度降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩。本發(fā)明的一些方法包括原核PAL與飲食蛋白限制的聯(lián)合使用，以影響患有各種形式癌癥的患者的治療效果。為了在本文涉及的聯(lián)合療法中實現(xiàn)合適的治療效果，優(yōu)選地通常給個體施用原核PAL組合物和飲食限制的組合有效量以產(chǎn)生所需治療結(jié)果(即，利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法檢測，血漿Phe濃度降低到低于最佳約20微摩到60微摩的檢測水平的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩)。該步驟可以包括施用原核PAL組合物并同時施用飲食蛋白治療組合物。這可以通過施用單一組合物或藥理學(xué)蛋白制劑來實現(xiàn)，該組合物或藥理學(xué)蛋白制劑包含所有飲食蛋白需要，還包括原核PAL?？蛇x地，飲食蛋白(補充劑或正常蛋白粉)與原核PAL的藥理學(xué)制劑(片劑，注射劑或飲料)在大約同一時間攝取。還可以將原核PAL配制入適于攝入的蛋白棒或其他食品如核仁巧克力餅、薄烤餅、蛋糕中。因為施用原核PAL不會產(chǎn)生酪氨酸(與PAH的施用不同)，因此這種治療仍然會使酪氨酸成為這類患者的必需氨基酸。因此，對于只接受原核PAL聯(lián)合飲食蛋白療法的患者來說，含有酪氨酸的飲食補充法是合乎需要的。在其他選擇中，原核PAL治療可以在飲食蛋白療法前或后進(jìn)行，間隔范圍從數(shù)分鐘到數(shù)小時。在蛋白和原核PAL組合物分開施用的實施方案中，通常要確保每次遞送時間之間的重要時間段不會過期，從而使PAL仍能夠發(fā)揮對患者的有利作用。在這種情況下，預(yù)期在飲食蛋白攝入約2-6小時內(nèi)(之前或之后)施用PAL，只有約1小時的延時是最優(yōu)選的。在一些實施方案中，預(yù)期當(dāng)PAL的每日劑量給患者長時間施用時，PAL療法將是連續(xù)的療法。3.聯(lián)合療法此外，除了僅僅基于原核PAL遞送和飲食蛋白調(diào)節(jié)的療法之外，本發(fā)明的方法還涉及與特異性靶向一種或多種癌癥癥狀的組合物一起的聯(lián)合療法。這類組合物包含例如但不限于癌癥治療劑和靶向癌癥治療劑。癌癥治療劑根據(jù)本文描述的方法，任意對癌細(xì)胞具有治療作用(即，抑制增殖和/或生存)的藥劑都可以用作與本發(fā)明原核PAL組合物聯(lián)合的癌癥治療劑。通常，癌癥治療劑是細(xì)胞毒劑或細(xì)胞生長抑制劑。癌癥治療劑可以與本發(fā)明的原核PAL組合物一起作為癌癥協(xié)同療法施用。本文使用的“癌癥協(xié)同療法”是指癌癥治療劑和原核PAL組合物同時或連續(xù)施用，所述癌癥治療劑在原核PAL組合物之后施用，或反過來。細(xì)胞毒劑的有用類型包括例如抗微管蛋白劑、auristatins,DNA小溝結(jié)合劑、DNA復(fù)制抑制劑、烷化劑(例如，鉬復(fù)合物如順鉬、單鉬、雙鉬和三核鉬復(fù)合物和卡鉬)、蒽環(huán)類、抗生素、抗葉酸物、抗代謝物、化療敏化劑、多卡米星、鬼白亞乙苷、氟化嘧啶、離子載體、lexitropsins、亞硝基脲、順鉬、預(yù)形成化合物、嘌呤抗代謝物、嘌呤霉素、輻射敏化劑、類固醇、紫杉烷類、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、長春花生物堿等等。個體細(xì)胞毒劑包括例如雄激素、氨茴霉素(AMC)、天冬酰胺酶、5-氮胞苷、咪唑硫嘌呤、博來霉素、白消安、丁硫氨酸硫酸亞胺、喜樹堿、卡鉬、亞硝脲氮芥(BSNU)、CC-1065、苯丁酸氮芥、順鉬、秋水仙堿、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、胞苷阿糖胞苷、細(xì)胞松弛素B、氮烯唑胺、更生霉素(原先的放線菌素)、道諾紅菌素、氨烯咪胺、紫杉萜、多柔比星、雌激素、5-氟脫氧尿苷、5_氟尿嘧啶、短桿菌肽D、羥基脲、伊達(dá)比星、異磷酰胺、依立替康、環(huán)己亞硝脲(CCNU)、氮芥、苯丙氨酸氮芥、6_巰基嘌呤、氨甲蝶呤、光輝霉素、絲裂霉素C、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、普卡霉素、丙卡巴胼、鏈脲霉素、替尼泊甙、6_硫代鳥嘌呤、噻替派、托泊替康、長春堿、長春新堿、長春瑞濱、VP-16和VM-26。在一些實施方案中，癌癥治療劑是細(xì)胞毒劑。合適的細(xì)胞毒劑包括例如多拉司他汀Gfi^nauristatinE、AFP、MMAF、MMAE)、DNA小溝結(jié)合劑(例如烯二炔和lexitropsins)、多卡米星、紫杉烷類(例如紫杉醇和紫杉萜)、嘌呤霉素、長春花生物堿、CC-1065、SN-38、托泊替康、嗎啉代_多柔比星、根霉素、氰基嗎啉_多柔比星、棘霉素、考布他汀、紡錘菌素、埃博霉素A和B、雌氮芥、cryptophysins、西馬多丁、美登素類、discodermolide、eleutherobin、禾口米托惠酉昆。在一些實施方案中，細(xì)胞毒劑是常規(guī)化療劑例如多柔比星、紫杉醇、苯丙氨酸氮芥、長春花生物堿、氨甲蝶呤、絲裂霉素C或鬼白亞乙苷。此外，可以使用有效藥劑諸如CC-1065類似物、加利車霉素、美登素、多拉司他汀10類似物、根霉素、和海葵毒素。在一些實施方案中，細(xì)胞毒劑是DNA小溝結(jié)合劑，例如CBI化合物或烯二炔類(例如，加利車霉素)。在一些實施方案中，癌癥治療劑是抗微管蛋白劑?？刮⒐艿鞍讋┑膶嵗ㄗ仙纪轭?例如TAXOL(紫杉醇)、TAX0TERE(紫杉萜))、T67(Tularik)、長春花生物堿(例如長春新堿、長春堿、長春地辛和長春瑞濱)、和多拉司他汀(例如auristatinE、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)。其他抗微管蛋白劑包括例如漿果赤霉素衍生物、紫杉烷類似物(例如埃博霉素A和B)、噻氨酯噠唑、秋水仙堿和秋水酰胺、雌氮芥、cryptophysins、西馬多丁、美登素類、考布他汀、discodermolide、禾Peleutherobin。在一些實施方案中，細(xì)胞毒劑是美登素類，另一類抗微管蛋白劑，例如美登素或DM-I。在一些實施方案中，癌癥治療劑是放射性同位素。在一些實施方案中，癌癥治療劑不是放射性同位素。在一些實施方案中，細(xì)胞毒劑是抗代謝物。抗代謝物可以是例如嘌呤拮抗劑(例如，硫唑嘌呤或霉酚酸酯)、二氫葉酸還原酶抑制劑(例如，氨甲蝶呤)、無環(huán)鳥苷、更昔洛韋、疊氮胸苷、阿糖腺苷、利巴韋林、疊氮胸腺嘧啶、胞苷阿糖胞苷、氨基三環(huán)癸烷、雙脫氧尿苷、碘苷、poscarnet、或曲氟尿苷。在其他實施方案中，細(xì)胞毒劑是他克莫司、環(huán)孢菌素或雷帕霉素。在其他實施方案中，細(xì)胞毒劑是阿地白介素、阿侖珠單抗、阿利維A酸、別嘌呤醇、六甲密胺、氨磷汀、阿那曲唑、三氧化二砷、貝沙羅汀、貝沙羅汀、二甲睪酮、卡培他濱、塞來昔布、克拉屈濱、Darbepoetinalfa、Denileukindiftitox、右雷佐生、屈他雄酮丙酸鹽、表柔比星、Epoetinalfa、雌氮芥、依西美坦、非格司亭、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、氟維司群、吉西他濱、吉妥珠單抗、奧佐米星、戈舍瑞林、伊達(dá)比星、異磷酰胺、伊馬替尼、去鐵胺、干擾素alfa_2a、依立替康、來曲唑、甲酰四氫葉酸、左旋四咪唑、meclorethamine或氮芥、甲地孕酮、美司鈉、氨甲蝶呤、甲氧沙林、絲裂霉素C、米托坦、苯丙酸諾龍、奧普瑞白介素、奧沙利鉬、氨羥二磷酸二鈉、培加酶、培門冬酶、培非司亭、噴司他丁、雙溴丙基哌嗪、普卡霉素、嚇菲爾鈉、甲基芐胼、阿的平、拉布立酶、利妥昔單抗、沙莫司亭、鏈脲霉素、三苯氧胺、替莫唑胺、鬼臼噻吩甙、睪內(nèi)酯、硫鳥嘌呤、托瑞米芬、托西莫單抗、曲妥單抗、維甲酸、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、長春堿、長春新堿、長春瑞濱和唑來膦酸。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療癌癥的方法，包括給需要這種治療的個體施用治療有效量的藥物組合物，還包括施用治療有效量的包括癌癥治療劑的藥物組合物，所述藥物組合物包含原核Phe氨裂合酶(PAL)變體和藥學(xué)上可接受的載體，其中與野生型PAL相比，所述PAL變體具有更大的Phe轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性，能夠有效將個體血液、血清或血漿中的Phe濃度降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩。靶向癌癥治療劑根據(jù)本文描述的方法，任意對特定癌細(xì)胞具有治療作用(即，抑制增殖和/或生存)的藥劑都可以用作與本發(fā)明的原核PAL組合物聯(lián)合的靶向癌癥治療劑。通常，靶向癌癥治療劑是選擇性結(jié)合特定類型的腫瘤細(xì)胞或組織的抗體或酶或蛋白，例如但不限于，借助于具有抗體樣的靶向結(jié)構(gòu)域或通過受體介導(dǎo)的結(jié)合。抗體、具有抗體樣靶向結(jié)構(gòu)域的多肽、酶或蛋白可以被放射標(biāo)記，或與對靶細(xì)胞或組織具有細(xì)胞毒或抑制細(xì)胞效應(yīng)的毒素或其他藥劑偶聯(lián)?？蛇x地，靶向癌癥治療劑可以是通過抑制或活化蛋白，例如但不限于，酶或受體(其優(yōu)選地在特定類型的腫瘤細(xì)胞或組織中表達(dá)或顯示活性)而對特定癌細(xì)胞或組織發(fā)揮治療作用(即，抑制增殖和/或生存)的藥劑。靶向癌癥治療劑可以與本發(fā)明的原核PAL組合物一起作為靶向癌癥協(xié)同療法施用。本文使用的“靶向癌癥協(xié)同療法”是指靶向癌癥治療劑和原核PAL組合物同時或連續(xù)施用，所述靶向癌癥治療劑在原核PAL組合物之后施用，或反過來。在一些實施方案中，靶向癌癥治療劑是人源化的抗HER2單克隆抗體，RITUXAN(利妥昔單抗；Genentech；嵌合抗CD20單克隆抗體)；OVAREX(AltaRexCorporation,ΜΑ)；PANOREX(GlaxoWellcome,NC；小鼠IgG2a抗體)；CetuximabErbitux(ImcloneSystemsInc.,NY；EGFR；Vitaxin(Medlmmune,Inc.,MD；CampathI/H(Leukosite,MA；人源化IgGl抗體)；SmartMI95(ProteinDesignLabs，Inc.，CA；人源化抗CD33IgG抗#)；LymphoCide(Immunomedics,Inc.,NJ-,AMittrLCD22IgG)；SmartIDlO(ProteinDesignLabs,Inc.，CA-,AMittrLHLA-DR#)；Oncolym(Techniclone,Inc.,CA；M射標(biāo)記的小鼠抗HLA-DrlO抗體)；Allomune(BioTransplant,CA；人源化抗CD2mAb)；Avastin(Genentech,Inc.,CA；抗VEGF人源化抗體)；Epratuzamab(Immunomedics,Inc.,NJandAmgen,CA；抗CD22抗體)；和CEAcide(Immunomedics,NJ；人源化抗CEA抗體)。其他合適的抗體包括但不限于抗下列抗原的抗體CA125、CA15-3,CA19-9、L6、LewisY、LewisX、甲胎蛋白、CA242、胎盤堿性磷酸酶、前列腺特異性抗原、前列腺酸性磷酸酶、表皮生長因子、MAGE-UMAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、p97、MUC1-KLH、CEA、gpl00、MARTl、前列腺特異性抗原、IL-2受體、CD20、CD52、CD33、CD22、人絨毛膜促性腺激素、CD38、CD40、粘蛋白、P21、MPGJPNeu癌基因產(chǎn)物。在一些實施方案中，靶向癌癥治療劑是具有抗體樣靶向結(jié)構(gòu)域或具有選擇性結(jié)合特定細(xì)胞或組織的能力(例如，通過配體受體結(jié)合)的酶或其他蛋白。通常，具有抗體樣靶向結(jié)構(gòu)域的蛋白、酶或其他蛋白與癌癥治療劑例如化合物或肽/多肽，例如毒素如蓖麻毒、白喉毒素、假單胞菌內(nèi)毒素等等(Kreitman，AAPSJ.8(3):E532_E551(2006))或?qū)Π屑?xì)胞或組織具有細(xì)胞毒或抑制細(xì)胞效應(yīng)的其他藥劑偶聯(lián)。在一些實施方案中，靶向癌癥治療劑是對特定癌細(xì)胞或組織具有治療作用的化合物(例如，小分子或肽/多肽)，例如絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、核受體激動劑、核受體拮抗劑等等。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種治療癌癥的方法，包括給需要這種治療的個體施用治療有效量的藥物組合物，還包括施用治療有效量的包括靶向癌癥治療劑的藥物組合物，所述藥物組合物包含原核Phe氨裂合酶(PAL)變體和藥學(xué)上可接受的載體，其中與野生型PAL相比，所述PAL變體具有更大的Phe轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性，能夠有效將個體血液、血清或血漿中的Phe濃度降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩。4.鑒定和監(jiān)測患者群體如本文自始至終所討論的，在本發(fā)明的各種實施方案中需要檢測指定癌癥患者是否對原核PAL療法產(chǎn)生應(yīng)答，并檢測開始和治療方案進(jìn)行期間患者的苯丙氨酸(Phe)濃度，以根據(jù)血漿Phe濃度的降低監(jiān)測所述方案的效果。示例性的這類方法在下文描述。鑒定患者對原核PAL療法的應(yīng)答對本發(fā)明原核PAL組合物治療有效的患者的鑒定可以基于體外培養(yǎng)實驗或小鼠中的體內(nèi)人腫瘤異種移植研究來進(jìn)行，或與已知的或得到證實的其生長依賴Phe的并且在人類癌癥的動物模型中對Phe限制或去除敏感的腫瘤類型進(jìn)行比較來進(jìn)行?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的方案進(jìn)行體外培養(yǎng)實驗，其中腫瘤細(xì)胞(例如，來自腫瘤活檢或臨床吸出物)在存在或沒有原核PAL組合物或存在或沒有缺乏苯丙氨酸的培養(yǎng)基的條件下生長(參見，例如，Abell等，CancerRes.32=285-290(1972)；Stith等，CancerRes.33:966_971(1973)；Fu等，CancerRes.59:758_765(1999)；Fu等，J.Cell.Physiol.209:522-534(2006)；Elstad等，Nutr.Cancer25:47-60(1996)；Nunez等，CancerLett.236133-141(2006))。還可參見實施例14?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的方案在小鼠中進(jìn)行體內(nèi)人腫瘤異種移植研究，其中將腫瘤細(xì)胞(例如，來自腫瘤活檢或臨床吸出物)注射入裸鼠或SCID小鼠，然后在存在或沒有原核PAL組合物或存在或沒有缺乏苯丙氨酸的飲食的條件下移植入新生裸鼠或SCID小鼠(參見，例如，Abell等，CancerRes.33:2529_2532(1973)；Shen等，CancerRes.371051-105(1977)；Fu等，Nutr.Cancer31:1_7(1998)；Fu等，Nutr.Cancer4560-73(2003)；Meadows等，CancerRes.42:3056_3063，1982；Elstad等，AnticancerRes.13523-528,(1993))。還可參見實施例15。已知或得到證實的其生長依賴于Phe并且在人類癌癥的動物模型中對Phe限制或去除敏感的腫瘤類型包括例如白血病、轉(zhuǎn)移性骨髓瘤和不依賴雄激素的前列腺癌(Abell等，(1973)，同前；Shen等，(1977)，同前；Fu等，(1998)，同前；Fu等，(2003)，同前；Meadows等，(1982)，同前；Elstad等，(1993)，同前)。實施例14顯示源自以下癌癥的腫瘤細(xì)胞的增殖和/或生存在與本發(fā)明原核PAL組合物溫育時對Phe限制敏感肺癌、腦癌或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、頭頸癌、子宮癌、白血病(例如急性髓性白血病或急性類淋巴母細(xì)胞白血病)和骨髓瘤。苯丙氨酸濃度的檢測檢測血液、血清或血漿中苯丙氨酸(Phe)濃度的方法是本領(lǐng)域已知的，其中一些描述于2005年9月19日提交的先前共同待決的美國專利申請?zhí)?1/230，374，其在此通過引用全文并入本文。預(yù)期在治療方案的整個過程都按照適當(dāng)間隔(例如每天、每隔一天或每周)監(jiān)測患者的血漿Phe水平。通過這種規(guī)律性的監(jiān)測血漿Phe水平，臨床醫(yī)生將能夠評價治療效果并據(jù)此調(diào)整原核PAL和/或飲食蛋白需要量。E.原核PAL的產(chǎn)生本發(fā)明的另一方面是一種產(chǎn)生原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物的方法。在優(yōu)選的實施方案中，在載體中有或沒有N端標(biāo)簽(例如，八組氨酰-標(biāo)簽)的重組原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物在大腸桿菌BLR(DE3)/PLysS(Novagen)或大腸桿菌BL21(DE3)/pLysS(Invitrogen)細(xì)胞中過表達(dá)，所述載體優(yōu)選是pIBXl(Su等，Appl.Environ.Microbiol.62:2723_2734(1996))或具有誘導(dǎo)型啟動子諸如IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的pET28a(Invitrogen)。用于生物反應(yīng)器/發(fā)酵罐的種子培養(yǎng)物在搖瓶的甘油儲液中生長。然后將所述種子培養(yǎng)物按照補料分批方式加入受控生物反應(yīng)器。然后補充葡萄糖，并用堿(NH40H)調(diào)控pH，攪拌直至1200rpm。添加O2保持大于20%的溶解氧。細(xì)胞在37°C的溫度生長，直至達(dá)到0D_為70-100(22-25小時)，然后用0.4mMIPTG誘導(dǎo)。溫度降低到30°C，培養(yǎng)直至活性變化<0.lIU/mL(大約40-48小時，0D_通常為200)。細(xì)胞培養(yǎng)基通常被定義并由酵母提取蛋白、蛋白胨-胰蛋白胨、葡萄糖、甘油、酪蛋白氨基酸、微量鹽和磷酸鹽緩沖鹽組成。重組原核PAL產(chǎn)物或其生物活性片段、突變體、變體或類似物在胞內(nèi)產(chǎn)生，不分泌。通過連續(xù)離心(Alfa-Laval，Carr，Ceba,或等同物)收集細(xì)菌。F.原核PAL的純化本發(fā)明的另一方面描述一種純化原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物的方法。根據(jù)第一個實施方案，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群被培養(yǎng)和裂解，產(chǎn)生粗重組酶。通常將外源性材料與粗制物分離以免弄臟柱子。利用一種或數(shù)種層析樹脂進(jìn)行層析純化。隨后，用設(shè)計成能在較長時間提供穩(wěn)定活性的緩沖液配制純化的蛋白。在另一優(yōu)選的實施方案中，純化原核PAL或其生物活性片段、突變體變體或類似物的方法包括以下步驟(a)利用壓力勻漿器裂解包含重組PAL或其生物活性片段、突變體變體或類似物的細(xì)菌(但還可以通過其他物理方式如玻璃珠裂解)；(b)熱處理；(c)利用第二次連續(xù)離心步驟和/或深層過濾凈化該裂解物(例如用CuonoZetaPlus或Maximizer，PallFiltron，或MilliporeMillistak或Opticao濾器)；(d)通過木炭過濾步驟(例如用MilliporeMillistak40AC)；(e)通過最終過濾步驟(例如用SartoriousSartopore0.2μm濾器)；(f)通過疏水性相互作用層析(例如用TosohBiosciences的ToyopearlButyl650M)；(g)通過Q離子交換柱(例如用BioRad的Macropr印HighQ)；和(h)利用切向流過濾通過緩沖液交換回收終產(chǎn)物(例如用SartoriousHydrosart或PESIOOkDa膜)。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)層析步驟中的一個或多個可以省略或替換，或?qū)游霾襟E的順序可以改變。最終，可以按照要求進(jìn)行合適的殺菌步驟?，F(xiàn)在已經(jīng)大致描述了本發(fā)明，通過參考下列實施例將更容易理解相同內(nèi)容。提供實施例只是為了說明目的，無論如何不是用于限制本發(fā)明的范圍。已經(jīng)盡力確保使用的數(shù)字(例如量、溫度等等)的準(zhǔn)確性，但顯然應(yīng)允許一些實驗誤差和偏差。實施例實施例1點形念珠藻和多變魚腥藻PAL的克隆DNA操作點形念珠藻基因組DNA購自ATCC(29133D)，并利用引物5‘-CACTGTCATATGAATATAACATCTCTACAACAGAACAT-3'(SEQIDNO12)和5'-GACAGTGGCGGCCGCTCACGTTGACTTTAAGCTCGAAAAAATATG-3(SEQIDNO13)PCR擴增PAL基因(ZP_00105927)。用NdeI禾口NotI消化所獲PCR產(chǎn)物，將1.7kb片段分別連入有N-His標(biāo)簽和沒有標(biāo)簽的pET_28a(+)和pET-30a(+)(Novagen)。多變魚腥藻細(xì)胞購自ATCC(29413)。提取基因組DNA(Qiagen)，并利用SOE-PCR擴增PAL基因(YP_324488)以去除NheI位點。引物1(5‘-CACTGTGCTAGCATGAAGACACTATCTCAAGCACMAG-3)(SEQIDNO:14)和引物2(5'-GGAMTTTCCTCCATGATAGCTGGCTTGGTTATCMCATCAATTAGTGG-3')(SEQIDNO:15)用于擴增核苷酸1-1190，引物3(5'-CCACTAATTGATGTTGATAACCAAGCCAGCTATCATGGAGGAAATTTCC-3)(SEQIDNO:16)和引物4(5'-CACTGTGCGGCCGCTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3)(SEQIDNO:17)用于擴增核苷酸1142-1771。利用引物1和4將這兩種PCR產(chǎn)物結(jié)合以擴增全長基因。所獲PCR產(chǎn)物用NheI消化，Klenow(NEB)鈍化，然后用NotI消化。將1.7kb片段連入pET_28a(+)和pET_30a(+)(Novagen)。該質(zhì)粒被命名為3p86-23。還將多變魚腥藻PAL(AvPAL)基因克隆入pIBX7(Tkalec等，Appl.Environ.Microbiol.66:29_35(2000))，該載體來源于pIBXl(Su等，Appl.Environ.Microbiol.622723-2734(1996))(參見實施例7)。菌株和培養(yǎng)條件對于點形念珠藻PAL(NpPAL)，利用pGro7(TaKaRa)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞(Stratagene)，感受態(tài)BL21(DE3)pGro7細(xì)胞用Inoue方法制備(SambrookandRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，2001))。這些細(xì)胞用pET_28_NpPAL轉(zhuǎn)化，并在含50mg/L卡那霉素和20mg/L氯霉素的25mLLB中37°C培養(yǎng)過夜。將20毫升該培養(yǎng)物種入IL含卡那霉素、氯霉素和500mg/LL-阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基中，并在37°C培養(yǎng)。當(dāng)0D_為0.6時，將培養(yǎng)物在冰上冷卻。5分鐘后，培養(yǎng)物用0.3mMIPTG誘導(dǎo)，并在20°C生長16小時。通過離心收集細(xì)胞。BL21(DE3)pLysS細(xì)胞(Stratagene)用AvPAL轉(zhuǎn)化，并進(jìn)行和NpPAL相同的培養(yǎng)，但無阿拉伯糖誘導(dǎo)。通過轉(zhuǎn)化將克隆入pIBX7載體的AvPAL(參見實施例7)導(dǎo)入BLR(DE3)/pLysS(Novagen)細(xì)胞，并在含50mg/L卡那霉素的25mLLB中37°C培養(yǎng)過夜。將20毫升該培養(yǎng)物種入IL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，并在37°C培養(yǎng)。當(dāng)0D_為0.6時，將培養(yǎng)物在冰上冷卻。5分鐘后，培養(yǎng)物用0.3mMIPTG誘導(dǎo)，并在30°C生長16小時。通過離心收集細(xì)胞。實施例2NpPAL禾口AvPAL的純化在臺式離心機上5，OOOg離心培養(yǎng)物20分鐘，棄去上清。在進(jìn)一步處理前細(xì)胞沉淀通常凍存于-70°C。解凍時，將細(xì)胞沉淀用TBS(25mMTris,150mMNaCl,ρΗ7.8)懸浮到大約80個光密度單位(600nm)。利用兩次通過12-14，OOOpsi的APV壓力勻漿器裂解細(xì)胞。然后在55°C熱處理粗裂解物2小時。在10，OOOg離心裂解物30分鐘，保留上清，并用0.2μm真空濾器(Corning)過濾。利用連續(xù)通過丁基650M柱(TosohBiosciences)和MacroPr印HighQ柱(BioRad)，從凈化的裂解物純化PAL。在SDSPAGE和反相HPLC中洗脫產(chǎn)物均顯示高的純度水平。實施例3聚乙二醇化PAL變體的產(chǎn)生聚乙二醇化圓紅冬孢酵母PAL(RtPAL)的方法在下文描述。用于聚乙二醇化原核PAL(例如，點形念珠藻(NpPAL)或多變魚腥藻(AvPAL))的類似方法描述于實施例6。蛋白聚乙二醇化聚乙二醇化利用文獻(xiàn)方法的改進(jìn)(Hershfield等.，(1991)，同前；美國專利號6，057，292;Lu等，Biochemistry40(44)13288-13301(2001)；NektarTherapeutics,2003目錄)?；罨腜EG包括線性PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯(mPEG-SPA，MW5kDa或MW20kDa)和分枝PEG羥基丁二酰亞胺(mPEG2-NHS酯，MWlOkDa或MW40kDa)，它們兩者在一端都覆蓋甲氧基，并可獲自NektarTherapeutics；通常需要實驗確定最適聚乙二醇化蛋白(Veronese等，J.BioactiveCompatiblePolymers12:196-207(1997))。利用不同比例的PALPEG(考慮蛋白的摩爾比以及每蛋白單體的賴氨酸數(shù)目)、不同的pH、不同的緩沖液、各種溫度和孵育時間來確定最適聚乙二醇化條件。高的PAL蛋白PEG衍生物比例是必需的，因為天然PAL具有大量賴氨酸(每個圓紅冬孢酵母(Rt)單體29個)，且因為在小鼠中重復(fù)注射時未修飾的PAL顯示免疫反應(yīng)性，還因為裸(野生型)PAL在暴露于蛋白酶時很快滅活。在-20°C冷凍終止聚乙二醇化反應(yīng)，并通過SDS-PAGE，MALDI-T0F質(zhì)譜分析，活性評價，蛋白水解敏感性和免疫反應(yīng)性來分析樣品。在活性、蛋白水解和免疫評價前，為了除去過量的未反應(yīng)PEG，將反應(yīng)物用pH8.5,0.05M磷酸鉀緩沖液在4°C透析過夜，利用Tube-O-Dialyzers(GenoTechnology)攪拌。在利用NI蛋白分析試劑盒(GenoTechnology)測定蛋白濃度后，利用先前描述的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件對未衍生化和PEG衍生化的PAL樣品進(jìn)行PAL活性測量。在體外表征后，利用PKU小鼠模型對最有希望的聚乙二醇化治療候選物進(jìn)行體內(nèi)試驗。表征利用280nm處的PAL消光系數(shù)(對于RtPAL和AvPAL來說分別是0.5和0.75mgml^cnT1)測定非修飾蛋白樣品和聚乙二醇化蛋白樣品的蛋白濃度，利用NIProteinAssay(GenoTechnology)計算濃度，包括采樣處理以去除可能干擾精確蛋白濃度測定的非蛋白污染物。PEG-PAL產(chǎn)物通過下列方法表征肽作圖技術(shù)以確定位點特異性聚乙二醇化(LC/ESI-MSD)和三硝基苯磺酸(TNBS)以檢測聚乙二醇化前后的游離胺滴度。肽作圖確定大多數(shù)胰蛋白酶肽(終止于賴氨酸)的聚乙二醇化相對占有率，但是，由于大小以及多個相鄰賴氨酸胰蛋白酶肽，利用該技術(shù)無法檢測到所有位點。TNBS分析更準(zhǔn)確的確定每mol酶的平均PEG分子數(shù)，但無法給出哪些位點被聚乙二醇化的信息。因此，這兩種分析法都被使用，以便彼此互補。通過SDS-PAGE和天然凝膠分析可以粗略估計PAL產(chǎn)物被PEG衍生化的百分比。使用酶分析評價聚乙二醇化前后的比活性，并提供不存在四聚體PAL結(jié)構(gòu)損失的證據(jù)。PAL活性分析利用CaryUV分光光度計(Cary50)按動力學(xué)方式進(jìn)行PAL活性分析。在室溫下(25°C)通過290nm處吸光度的增加來監(jiān)測反式肉桂酸鹽的產(chǎn)生，從而分析PAL對L-苯丙氨酸底物的活性(Hodgins，(1968)，同前)。290nm處反式肉桂酸的摩爾消光系數(shù)是10，238升]TiQiT1。反應(yīng)混合物包含溶于lOOmMTris-HCl緩沖液，pH8.5的22.5mM苯丙氨酸。對于標(biāo)準(zhǔn)測量來說，最終酶濃度是0.0035mg/mL，但對于動力學(xué)研究來說，分析中的酶濃度被調(diào)整以使290nm處的每分鐘斜率在0.005到0.02范圍內(nèi)?；钚詳?shù)據(jù)可以表示為比活性(微摩Xmir^mg—1)。PAL的一個單位被定義為室溫下每分鐘產(chǎn)生1微摩反式肉桂酸的酶量。實施例4體外半衰期和免疫原性試驗在生化表征后，利用3種不同和互補的技術(shù)(Western印跡、ELISA和免疫沉淀(IP))，針對抗抗體的免疫反應(yīng)性(通過給PKU小鼠注射天然PAL(非聚乙二醇化)激發(fā))對最有希望的PEG-PAL候選物進(jìn)行篩選。對于Western印跡分析，使用110，000稀釋度的PAL抗血清(來自注射了PAL的小鼠)。作為陰性對照，來自緩沖液處理小鼠的血清也使用相同稀釋度。將二抗、堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(Promega)稀釋到15，000，并利用AP底物WesternBlue(Promega)顯色。使用lmg/mL溶于PBS的PAL并用PBS并用0.05%Tween-20，2%BSA封閉，在Nunc/ImmunoMaxisorp板(NalgeNuncInternational)中按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行ELISA檢測。將小鼠抗血清(來自天然PAL暴露小鼠)用EB封閉液(PBS，0.05%Tween-20,2%BSA)稀釋到110，000，使用服-山羊抗小鼠化6作為二抗，11用于450歷處的檢測。使用免疫沉淀檢測PAL抗體結(jié)合。蛋白樣品(PAL或聚乙二醇化PAL)在TTBS緩沖液(含0.Tween的Tris緩沖液鹽水)中溫育，在添加抗體樣品前檢測PAL活性。每個樣品與8倍過量的陽性對照抗PAL血清溫育，并利用未免疫小鼠血清進(jìn)行雙份陰性對照反應(yīng)。溫育后，根據(jù)珠子的小鼠IgG結(jié)合能力，添加過量的蛋白GSepharose4(50%,v/v),在轉(zhuǎn)動條件下將樣品再在4°C溫育過夜。通過離心回收上清，分析上清中各樣品的PAL活性。不丟棄珠子沉淀物，這樣的話可以通過Western印跡進(jìn)行進(jìn)一步的分析。為了證實抗體_珠子結(jié)合的存在，使用Western印跡檢測珠子上的PAL抗原。PAL結(jié)合步驟后通過離心回收的珠子用TTBS和TBS緩沖液清洗若干次。在這些清洗后，向珠子中添加SDS-PAGE上樣緩沖液，在95°C加熱樣品5分鐘。然后利用PAL抗血清通過Western印跡分析樣品。通過Western印跡檢測，與顯示高抗體結(jié)合的天然未修飾PAL相比，顯示較差抗體結(jié)合的酶變體在沉淀的珠子組分中具有相應(yīng)較少的PAL，但在上清中顯示保留更高的活性。實施例5蛋白酶敏感性的檢測對天然圓紅冬孢酵母PAL的蛋白酶作圖研究顯示蛋白水解敏感性的主要位點。去除這類位點可以降低或消除蛋白水解敏感性，并有助于開發(fā)出有效的PKU酶替代物。但是，清除蛋白水解敏感性的這類位點可能導(dǎo)致酶活性的降低或損失。在蛋白工程化產(chǎn)生保留活性的改進(jìn)PAL(和PEG-PAL)突變體后，與胰蛋白酶/糜蛋白酶的蛋白酶混合物一起溫育篩選蛋白酶抗性，然后檢測活性保留(通過0D290測量值)和減少的蛋白裂解(通過PAGE凝膠分析)，這能夠鑒定出將用于體內(nèi)試驗的具有合適體外特性的突變體。與蛋白酶混合物一起溫育評價蛋白水解穩(wěn)定性，所述蛋白酶混合物近似于腸環(huán)境并包含2.3mM胰蛋白酶、3.5mM糜蛋白酶、3.05mM羧肽酶A和3.65mM羧肽酶B。蛋白水解試驗包括酶溫育，向PAL溶液中添加蛋白酶，以確定待測不同蛋白變體(進(jìn)行或未進(jìn)行聚乙二醇化或其他化學(xué)修飾的天然或突變蛋白)的蛋白酶敏感程度，包括蛋白酶暴露后的活性保持和穩(wěn)定性保持時長。使用SDS-PAGE和MALDI-T0F質(zhì)譜作圖實驗確定任意蛋白酶敏感位38點的位置(Kriwacki，R.W.等，J.Biomol.Tech.9(3):5_15(1980))。這些作圖結(jié)果對于確定蛋白酶易感性的主要位點(諸如已經(jīng)鑒定的兩個主要位點)非常重要，從而使全部主要敏感位點可以利用聚乙二醇化保護(hù)和/或突變來去除，以去除和/或保護(hù)PAL結(jié)構(gòu)的敏感區(qū)。實施例6聚乙二醇化NpPAL和AvPAL的產(chǎn)生通常，NpPAL和AvPAL的聚乙二醇化包括將蛋白與SUNBRIGHTME-200HS20kDaNHS-活化的PEG(NOF)混合。聚乙二醇化方案，利用NHS-活化的20kDa線性PEG的標(biāo)準(zhǔn)“HC”方法1)評價蛋白中內(nèi)毒素的存在。將蛋白溶液(0.lmL)稀釋于0.9mL新鮮MQ水中，利用手持式CharlesRiver裝置(EndoPTS)在0.5EU/ml靈敏度檢測內(nèi)毒素。如果內(nèi)毒素大于0.5EU/mL，則先通過MustangE過濾，然后是SterogeneEtox樹脂來減少內(nèi)毒素，不太優(yōu)選通過進(jìn)一步層析純化來減少內(nèi)毒素。通過pH7.8&DEAEFF(Amersham)的減少是有限的，但足夠有效。2)蛋白的濃縮和緩沖液交換。將蛋白濃縮到大于25mg/mL但小于或等于75mg/mL，緩沖液交換為50mMKP04,pH8.5。如果使用旋轉(zhuǎn)濾器制備該濃縮物，則首先如下檢測濾器的內(nèi)毒素只與緩沖液在降低的速度下旋轉(zhuǎn)減少的時間(3000rpm，3分鐘)，然后按照和步驟1相同的方法檢測殘留緩沖液中的內(nèi)毒素。50mMKP04,pH8.5的緩沖液批次記錄/配方包含水(QS到1L)、磷酸氫二鉀(8.4913g/L，48.75mM)和磷酸二氫鉀(0.17011g/L,1.25mM)。溶液經(jīng)過0.2ym濾器過濾，并保存在室溫。濃縮產(chǎn)物緩慢通過MustangE濾器acrodisc過濾(l_2mL/分鐘)。在A280處檢測稀釋的樣品和無菌TBS，pH7.5的空白對照測定蛋白濃度。NpPAL的消光系數(shù)是0.83，AvPAL的消光系數(shù)是0.75。3)NPPAL和AvPAL的聚乙二醇化。將通常保存于_80°C的PEG加熱到室溫。向PEG中添加KPO4進(jìn)行混懸，以最大速度渦旋，并在手中劇烈搖動管子以確保所有大團(tuán)塊被混懸。在PEG第一次變濕1分鐘內(nèi)將蛋白添加到充分混懸的PEG溶液中，并通過非常輕柔的倒置進(jìn)行混合。將用鋁箔包好的管子放置于振蕩器的軸上，在室溫下非常溫和地振蕩3小時。將所述管中充滿TBS(pH7.5)并進(jìn)行無菌過濾。立即配制懸液或在4°C保存直至準(zhǔn)備好配制。4)配制。配制緩沖液配方/批次記錄包含水(QS到1L)、Tris-Base(3.2mM)、Tris-HCl(16.8mM)和氯化鈉；緩沖液經(jīng)過0.2um濾器過濾，室溫下保存。利用Vivaflow50(小批量)或Vivafiow200(更大批量)通過100MWC0再生纖維素膜對緩沖液進(jìn)行切向流動過濾。溶液再用MQ水、0.INNaOH和200mL水沖洗。用50mL/分鐘橫流的TBS，pH7.5平衡溶液。確定滲透物的PH以確保pH為7.5。通過首先用TBS稀釋大約3倍然后恢復(fù)到初始體積至少4次，對溶液進(jìn)行緩沖液交換。對于Vivaflow50和200來說橫流通常是180_200mL/分鐘。終產(chǎn)物經(jīng)過MustangE過濾。在將0.lmL用1.9mL無菌新鮮水稀釋后，評價內(nèi)毒素的存在。如果內(nèi)毒素大于lEU/mL，利用SterogeneEtox凝膠減少內(nèi)毒素。將配制好的無菌聚乙二醇化NpPAL或AvPAL密封在小瓶中，放置于-70°C直至準(zhǔn)備好用于體內(nèi)研究。實施例7AvPAL變體(半胱氨酸突變體)的產(chǎn)生在AvPAL多肽中進(jìn)行氨基酸替代以減少細(xì)菌表達(dá)的重組蛋白中存在的聚集。蛋白聚集可能降低酶活性和/或在體內(nèi)增加免疫原性。一種這類形式的聚集是作為鏈內(nèi)二硫鍵形成的結(jié)果發(fā)生的。為了將這種可能性降到最低，各個AvPAL半胱氨酸殘基，單獨地或一起，被絲氨酸殘基替代。AvPAL多肽具有6個半胱氨酸殘基，位于第64、235、318、424、503和565位(SEQIDN0:4)。產(chǎn)生下列AvPAL單半胱氨酸突變體AvPAL_C64S(SEQIDNO:7)、AvPAL_C318S(SEQIDNO:8)、AvPAL_C503S(SEQIDNO9)和AvPAL_C565S(SEQIDNO:10)。還產(chǎn)生AvPAL半胱氨酸雙突變體，AvPAL_S565SC503S(SEQIDNO:11)。圖5A-5E顯示這些AvPAL半胱氨酸突變體的氨基酸序列?？寺±谜蛞顰varPALfor(5‘-CACTGTCATATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3‘)(SEQIDNO:18)和反向引物AvarPALrev(5'-CACTGTCTCGAGATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3)(SEQIDNO:19)從多變魚腥藻基因組DNA(ATCC29413-U，QiagenDneasy試劑盒)擴增AvPAL基因。所獲PCR產(chǎn)物用Taq處理，然后連接入pCR2.1T0P0TA(Invitrogen)。所獲質(zhì)粒被命名為lp40。通過S0E-PCR添加5‘Nhel位點并去除內(nèi)部NheI位點。利用正向引物N-Nhe_AvPAL(5'-CACTGTGCTAGCATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3')(SEQIDNO:20)和反向引物Nhe-AvPALrev(5'-GGAAATTTCCTCCATGATAGCTGGCTTGGTTATCAACATCAATTAGTGG-3')(SEQIDNO21)從lp40擴增上游AvPAL片段，利用正向引物Nhe-AvPALfor(5'-CCACTAATTGATGTTGATAACCAAGCCAGCTATCATGGAGGAAATTTCC-3)(SEQIDNO22)和反向引物AvPALrev-r(5'-ACAGTGGCGGCCGCTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3)(SEQIDNO23)從lp40擴增下游AvPAL片段。在單個PCR反應(yīng)中，將上述兩種PCR產(chǎn)物退火，并用DNA聚合酶延伸得到全長AvPAL基因，然后用引物N-Nhe-AvPAL和AvPALrev-r進(jìn)行擴增。所獲PCR產(chǎn)物用Nhel消化、K1enow鈍化、NotI消化，并連接入pET28a+載體(通過Ndel消化、Klenow鈍化和NotI消化來制備)。所獲質(zhì)粒被命名為3p86-23。通過PCR添加新的限制酶切位點。利用正向引物AvEcoRIfor(5'-CACTGTGAATTCATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3‘)(SEQIDN0:24)和反向引物AvSmalrev(5'-CACTGTCCCGGGTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCT-3')(SEQIDNO25)從質(zhì)粒3p86_23擴增AvPAL。所獲PCR產(chǎn)物用EcoRI和Smal消化，并連接入EcoRI-和Smal-消化的pIBX7載體。所獲質(zhì)粒被命名為7p56Av3。半胱氨酸突變體通過定點誘變(QuickChangeXLII，Stratagene)，將AvPAL基因中的兩個半胱氨酸密碼子(對應(yīng)于AvPAL多肽的第503和565位)用絲氨酸密碼子替代。通過利用正向弓丨物Av_C503S(5‘-GTCATTACGATGCACGCGCCT€TCTATCACCTGCAACTGAG-3)(SEQIDNO26)和反向引物Av_C503Srev(5‘-CTCAGTTGCAGGTGATAGAGAGGCGCGTGCATCGTAATGAC-3)(SEQIDNO27)的PCR，將質(zhì)粒7p56Av3中將第503位的半胱氨酸密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸密碼子。絲氨酸密碼子用下劃線表示，編碼鏈中的G到C突變(非編碼鏈中的C到G突變)用粗體表示。所獲質(zhì)粒被命名為j282。利用正向引物Av_C565S(5'-CAGTTCAAGATATCTTACCCTCCTTGCATTAACCCGGGCTGC-3‘)(SEQIDN0:28)和反向引物Av_C565Srev(5'-GCAGCCCGGGTTAATGCAAGGAGGGTAAGATATCTTGAACTG-3)(SEQIDNO29)將質(zhì)粒j282中將第565位的密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸密碼子。絲氨酸密碼子用下劃線表示，編碼鏈中的G到C突變(非編碼鏈中的C到G突變)用粗體表示。所獲質(zhì)粒被命名為j282a。AvPAL基因中對應(yīng)于AvPAL多肽第64、318和565位的半胱氨酸密碼子被類似地用絲氨酸密碼子替代，使用下列引物對C64S，正向引物Av_C64S(5‘-GCAGGGTATTCAGGCATCT1CTGATTACATTAATAATGCTGTTG-3)(SEQIDNO30)和反向引物Av_C64Srev(5‘-CAACAGCATTATTAATGTAATCAGAAGATGCCTGAATACCCTGC-3‘)(SEQIDNO31)；C318S,正向弓丨物Av_C318S(5‘-CAAGATCGTTACTCACTCCGA1CCCTTCCCCAGTATTTGGGGC-3)(SEQIDNO:32)和反向引物Av_C318Srev(5'-GCCCCAMTACTGGGGAAGGGATCGGAGTGAGTAACGATCTTG-3)(SEQIDNO33)；和C565S，正向引物Av_C565S(SEQIDNO28)和反向引物Av_C565Srev(SEQIDNO:29)。絲氨酸密碼子用下劃線表示，編碼鏈中的G到C突變和非編碼鏈中的C到G突變用粗體表示。實施例8AvPAL變體(半胱氨酸突變體)的體外酶活性該研究的目的是確定AvPAL多肽中各種半胱氨酸殘基的絲氨酸替代對體外苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)的酶活性的影響。按照實施例7的描述克隆AvPAL變體(即，半胱氨酸突變體)。將AvPAL半胱氨酸突變體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌，按照實施例1的描述表達(dá)AvPAL半胱氨酸突變多肽，并按照實施例2的描述進(jìn)行純化。按照實施例3的描述檢測野生型(WT)AvPAL和AvPAL半胱氨酸突變體的體外PAL酶活性。表1顯示與未聚乙二醇化的WTAvPAL相比，純化的未聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸突變蛋白的體外PAL比活性被第64位半胱氨酸殘基的絲氨酸替代(AvPAL_C64S)降低，但第503或565中任一個或第503和565位半胱氨酸殘基的絲氨酸替代(分別為AvPAL_C503S,AvPAL_C565S和AvPAL_C565SC503S)對其不產(chǎn)生不利影響。表1:AvPAL半胱氨酸突變體的比活性<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>為了確定絲氨酸殘基的引入對聚乙二醇化AvPAL蛋白的酶活性是否有影響，按照實施例6的描述將WTAvPAL和半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S聚乙二醇化。表1顯示第503和565位半胱氨酸殘基的絲氨酸替代對聚乙二醇化AvPAL蛋白的體外PAL比活性沒有不利影響。實施例9AvPAL變體(半胱氨酸突變體)的體外生化表征該研究的目的是確定AvPAL多肽中各種半胱氨酸殘基的絲氨酸替代對⑴加速的穩(wěn)定性；(2)聚集體形成；和(3)位點特異性聚乙二醇化的影響。加速的穩(wěn)定性AvPAL中半胱氨酸殘基的絲氨酸替代對體外穩(wěn)定性的影響通過以下方法確定將純化的AvPAL半胱氨酸突變體(聚乙二醇化或未聚乙二醇化的)在37°C保存不同時段，然后按照實施例3的描述檢測這些蛋白的體外PAL比活性。按照實施例8的描述制備野生型AvPAL和AvPAL半胱氨酸突變體(未聚乙二醇化或聚乙二醇化的)。如圖6A所示，未聚乙二醇化AvPAL蛋白的比活性在37°C至少穩(wěn)定5天，并且第565位，或第503和565位半胱氨酸殘基的絲氨酸替代對其沒有不利影響。類似地，如圖6B所示，聚乙二醇化AvPAL蛋白的比活性在37°C至少穩(wěn)定6天。在37°C6天后，與野生型AvPAL和半胱氨酸AvPAL雙突變體AvPAL_C565SC503S相比，半胱氨酸AvPAL單突變體AvPAL_C565S顯示稍微降低的穩(wěn)定性。聚集體形成AvPAL中半胱氨酸殘基的絲氨酸替代對溶液中蛋白聚集體形成的影響通過以下方法確定通過變性和天然凝膠電泳或SEC-HPLC來分離純化的、未聚乙二醇化野生型AvPAL和AvPAL半胱氨酸突變體。在變性條件(4-12%NuPAGEBis-Tris)或天然條件(8%Tris_Gly，pH8.3)下通過凝膠電泳分離純化的AvPAL制品。利用CoomassieBlue染色分離的AvPAL蛋白。通過SEC-HPLC分離純化的AvPAL制品。將AvPAL蛋白上樣到含20mM磷酸鈉、300mMNaCl、pH6.9^TSKMl^ft(G3000Sffxl,7.8mmX30cm,5um(TosohBioscience，LLC))，并采用0.5mL/分鐘的流速進(jìn)行洗脫。在Agilent系列1100分光計上分析分離的AvPAL蛋白。根據(jù)凝膠電泳(圖7A)或SEC-HPLC(圖7B)判斷，野生型AvPAL制品以及AvPAL_C503S和AvPAL_C64S制品中存在聚集體，但AvPAL_C565S和AvPAL_C565SC503S制品中不存在。位點特異性聚乙二醇化AvPAL中半胱氨酸殘基的絲氨酸替代對位點特異性聚乙二醇化的影響通過以下方法確定按照實施例6的描述聚乙二醇化野生型AvPAL和半胱氨酸雙突變體AvPAL_C503SC565S，然后比較下列AvPAL賴氨酸殘基的相對聚乙二醇化K2、K10、K32、K115、K145、Κ195、Κ301、Κ335、Κ413、Κ419、Κ493、Κ494和Κ522。用8Μ尿素變性大約100微克(10μLX10微克/μL)未聚乙二醇化或聚乙二醇化的AvPAL蛋白。變性蛋白然后在IOOyL的反應(yīng)體積(含0.8Μ尿素，ρΗ8.2)中用胰蛋白酶在37°C消化過夜(約20小時)。在37°C用1μLIMDTT還原胰蛋白酶消化的蛋白1小時，然后用3yL15%TFA終止反應(yīng)。在C18反相柱上分離消化的蛋白。通過減去對應(yīng)未聚乙二醇化肽的肽圖計算每個聚乙二醇化AvPAL肽的聚乙二醇化百分比。如圖8所示，當(dāng)AvPAL蛋白PEG的比例為13時，可能除了K419之外，任意賴氨酸(K)殘基的聚乙二醇化百分比不存在顯著差異，其中半胱氨酸雙突變體C565SC503S的聚乙二醇化百分比低于野生型AvPAL。但是，利用AvPAL蛋白PEG比例增加的半胱氨酸雙突變體獲得的結(jié)果(其中沒有觀察到劑量反應(yīng)關(guān)系)，結(jié)合相對較小的聚乙二醇化百分比，表明K1419處觀察到的差異不可能是有意義的。因此，第503和565位半胱氨酸殘基的絲氨酸替代看起來不影響AvPAL的位點特異性聚乙二醇化。實施例10AvPAL蛋白聚集的機制進(jìn)行研究以探索細(xì)菌表達(dá)的AvPAL蛋白的聚集機制。濃縮純化的AvPAL制品，并在37°C溫育濃縮的蛋白溶液2小時，以加速溶液中純化AvPAL蛋白的聚集。通過SEC-HPLC分離AvPAL蛋白來檢測聚集。為了確定是否由二硫鍵交聯(lián)造成聚集，向濃縮蛋白液中添加50mM二硫蘇糖醇(DTT)，然后在37°C溫育2小時。按照實施例2的描述純化細(xì)菌中表達(dá)的AvPAL蛋白，并利用旋轉(zhuǎn)濾器(MilliporeBiomax-IOKNMWL)進(jìn)行濃縮。在EppendorfCentrifuge5415C中大約15，OOOg旋轉(zhuǎn)蛋白數(shù)分鐘。對于傾向聚集的半胱氨酸突變體(例如，AvPAL_C503S和AvPAL_C64S)，將蛋白濃縮到約20mg/mL并在37°C溫育2小時。對于抗聚集的半胱氨酸突變體(例如，AvPAL_C565S和AvPAL_C565SC503S)，將蛋白濃縮到約40mg/mL并在37°C溫育2小時。如表2所示，在37°C溫育2小時后，純化AvPAL半胱氨酸突變體AvPAL_C64S和AvPAL_C503S的制品形成聚集體。與預(yù)期一致，在37°C溫育2小時前將AvPAL蛋白濃縮將導(dǎo)致該聚集現(xiàn)象加劇。通過將濃縮蛋白暴露于DTT可以阻斷聚集，這表明該聚集是因為二硫鍵交聯(lián)。與此相反，在37°C溫育2小時后純化AvPAL半胱氨酸突變體AvPAL_C565S和AvPAL_C565SC503S的制品不形成聚集體，這表明第565位的半胱氨酸殘基通過二硫鍵交聯(lián)參與AvPAL聚集。表2二硫鍵交聯(lián)相關(guān)的AvPAL半胱氨酸突變體聚集<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>為了確定哪些半胱氨酸殘基作為游離巰基存在，純化的AvPAL制品在8M尿素存在條件下被變性，用碘乙酰胺烷基化，胰蛋白酶消化，并通過LC/MS進(jìn)行分析。所有AvPAL半胱氨酸殘基都被碘乙酰胺標(biāo)記，提示細(xì)菌表達(dá)的AvPAL的所有半胱氨酸殘基都作為游離巰基存在(數(shù)據(jù)未顯示)。為了確定哪些半胱氨酸殘基存在于天然蛋白的表面，純化的AvPAL制品首先用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)處理，然后在8M尿素存在條件下被變性，用碘乙酰胺烷基化，胰蛋白酶消化，并通過LC/MS進(jìn)行分析。第235和424位的半胱氨酸殘基不被NEM烷基化，第318位的半胱氨酸殘基只被NEM部分烷基化，提示第64、503和565位的半胱氨酸殘基位于天然AvPAL的表面，第318位的半胱氨酸殘基部分暴露于天然AvPAL的表面(數(shù)據(jù)未顯示)。為了確定哪些半胱氨酸殘基參與鏈內(nèi)二硫鍵交聯(lián)，在37°C將67μL0.7mg/mL純化的未聚乙二醇化野生型AvPAL制品溶液在包含20mM碘乙酰胺的8M尿素中變性和烷基化1小時，然后在25°C含胰蛋白酶的100μL反應(yīng)體積pH8.2中消化過夜(約17.5小時)。分離胰蛋白酶消化的蛋白并通過質(zhì)譜法進(jìn)行分析，其中鑒定對應(yīng)于預(yù)測的二硫鍵配對的肽并定量為總離子計數(shù)(TIC)。表3顯示檢測到C503-C503、C503-C565、C565-C318和C565-C565的二硫鍵配對。在純化的AvPAL制品的二硫鍵配對中發(fā)現(xiàn)第565位的半胱氨酸殘基，并較低程度地發(fā)現(xiàn)第503位的半胱氨酸殘基。表3聚集體二硫鍵配對<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>#未檢測到進(jìn)行研究以確定除了二硫鍵交聯(lián)外的其他機制是否參與AvPAL蛋白聚集。將純化的AvPAL制品與0.05%Tween或IOmMEDTA溫育，然后按照實施例9的描述通過SEC-HPLC分離。Tween因為疏水性相互作用減少蛋白聚集，而EDTA由于二價陽離子的存在減少蛋白聚集。如圖9所示，暴露于0.05%Tween或IOmMEDTA對AvPAL蛋白聚集沒有影響。IOmMEDTA處理的AvPAL中第10分鐘的附加峰是由于EDTA在210nm處的吸收。為了進(jìn)一步研究二硫鍵交聯(lián)在AvPAL蛋白聚集中的作用，在通過SEC-HPLC分離前，純化的AvPAL先通過DTT處理進(jìn)行還原，然后脫鹽。如圖IOA所示，通過DTT處理AvPAL蛋白聚集被降到最低，但在37°C溫育18小時后聚集體再次形成。與此相反，如圖IOB所示，在DTT暴露后以及脫鹽和37°C溫育18小時前一旦AvPAL表面半胱氨酸通過N-乙基馬來酰亞胺(NEM)處理被修飾(即烷基化)，則聚集體不再形成?；谝陨纤?，細(xì)菌表達(dá)的AvPAL的聚集看起來僅僅歸因于鏈內(nèi)二硫鍵的形成，而不是因為疏水作用或二價陽離子的存在。第565和503位的半胱氨酸殘基參與AvPAL制品中鏈內(nèi)二硫鍵的形成。實施例11AvPAL變體(半胱氨酸突變體)聚乙二醇化形式的液體制劑進(jìn)行研究以調(diào)查各種賦形劑(例如，穩(wěn)定劑)對本發(fā)明制劑中AvPAL多肽變體(例如，第503和565位半胱氨酸殘基的絲氨酸替代)的聚乙二醇化形式的加速穩(wěn)定性的影響。按照實施例7的描述制備聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。利用體外活性分析，比色杯分析或板分析，檢測聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S不同制劑的加速穩(wěn)定性。對于比色杯分析來說，純化的聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S用TBS稀釋緩沖液稀釋，然后添加到含22.5mM苯丙氨酸(Phe)UOOmMTris-HCl,pH8.5的分析緩沖液中。在30°C溫育2分鐘后，通過290nm處的吸光度測量釋放的反式肉桂酸(t_CA)量。對于板分析來說，純化的聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S用TBS稀釋緩沖液加BSA/Phe/Brij稀釋，然后添加到含22.5mMPheUOOmMTris-HCl，pH8.5的分析緩沖液中。在30°C溫育10-20分鐘后，通過290nm處的吸光度測量釋放的反式肉桂酸(t_CA)量。一IU的PAL活性等于1微摩TCA/分鐘。在第一個加速穩(wěn)定性研究中，評價pH對聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPALAvPAL_C565SC503S穩(wěn)定性的影響。將純化的聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S在從4到9的各個pH的IOmM緩沖液和HOmMNaCl中預(yù)先配制。測試的緩沖液檸檬酸鹽(pH4)、醋酸鹽(pH5)、組氨酸(pH6)、磷酸鹽(pH7)、Tris(pH7.5、pH8)和精氨酸(pH9)。在4°C、25°C或37°C保存酶制劑直至30天后，檢測體外活性。在pH4觀察到PAL酶活性的全部喪失。選擇7到8的pH范圍作進(jìn)一步鑒定。在第二個加速穩(wěn)定性研究中，評價pH和各種賦形劑對聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPALAvPAL_C565SC503S穩(wěn)定性的影響。在存在或沒有0.5%EDTA.0.5%EDTA加0.5%抗壞血酸或0.5%EDTA加5mM甲硫氨酸(Met)的條件下，將純化的聚乙二醇化在pH7,7.5或8.0的IOmMTris和140mMNaCl中預(yù)先配制。在4°C、25°C或37°C保存酶制劑直至60天后，檢測體外活性。pH7.0和7.5在維持酶活性方面看起來是相當(dāng)?shù)模珽DTA對酶活性幾乎沒有影響，抗氧化劑抗壞血酸和甲硫氨酸對酶活性有負(fù)面影響。在相同的加速穩(wěn)定性研究中，評價AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的聚乙二醇化的影響。未聚乙二醇化和聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S之間酶活性的損失率是相似的。在第三個加速穩(wěn)定性研究中，評價酶底物和產(chǎn)物作為賦形劑對聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPALAvPAL_C565SC503S穩(wěn)定性的影響。在存在或沒有ImMPhe(底物，5摩爾每摩爾活性位點)、2mMTCA(產(chǎn)物，10摩爾每摩爾活性位點)或0.05%Tween80(表面活性劑)的條件下，將大約12mg/mL(0.2mM)純化的聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S在pH7.5的IOmMTris和140mMNaCl中預(yù)先配制。在4°C、25°C或37°C保存酶制劑不同時間后，每周檢測體外活性。Phe和t-CA均顯著增加酶的穩(wěn)定性，而Tween對酶穩(wěn)定性沒有影響。加速穩(wěn)定性研究1、2和3的概述顯示于圖11。在第四個加速穩(wěn)定性研究中，評價低濃度的Phe和t-Ca在低濃度作為賦形劑對聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S穩(wěn)定性的影響。在存在或沒有0.4mMPhe(底物，2摩爾每摩爾活性位點)或0.4mMTCA(產(chǎn)物，2摩爾每摩爾活性位點)的條件下，將大約12mg/mL(0.2mM)純化的聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S在pH7.5的IOmMTris和140mMNaCl中預(yù)先配制。在4°C、25°C或37°C保存酶制劑不同時間后，每周檢測體外活性。低濃度的Phe和t-CA均能有效的穩(wěn)定酶活性。在第五個加速穩(wěn)定性研究中，評價弱的酶底物酪氨酸(Tyr)作為賦形劑對聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S穩(wěn)定性的影響。在存在或沒有1或5mMTyr(底物，分別為5或25摩爾每摩爾活性位點)的條件下，將大約12mg/mL(0.2mM)純化的聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S在pH7.5的IOmMTris和140mMNaCl中預(yù)先配制。在4°C、25°C或37°C保存酶制劑不同時間后，每周檢測體外活性。Tyr對酶活性具有極小的、非劑量依賴性穩(wěn)定作用(圖12)。在第六個加速穩(wěn)定性研究中，評價親核凈化劑作為賦形劑對聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S穩(wěn)定性的影響。在存在或沒有IPhe(底物，3摩爾每摩爾活性位點)、2mM親核凈化劑(安息香酸或吡哆胺，6摩爾每摩爾活性位點)或ImMPhe和2mM親核凈化劑的條件下，將大約20mg/mL(0.33mM)純化的聚乙二醇化AvPAL_C363SC303S在pH7.5的IOmMTris和140mMNaCl中預(yù)先配制。在4°C或37°C保存酶制劑不同時間后，每周檢測體外活性。安息香酸而不是吡哆胺能夠有效穩(wěn)定酶活性(圖13A)。Phe和安息香酸沒有疊加作用，表明是類似的穩(wěn)定機制。安息香酸和t-CA的穩(wěn)定效應(yīng)表明它們起Phe結(jié)構(gòu)類似物的作用(參見圖13B)。將6個加速穩(wěn)定性研究的數(shù)據(jù)合并以預(yù)測各種制劑中聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的有效保存期限。保存期限如下確定(1)確定活性衰變的的速率(kde。ay)，其遵循針對每種制劑條件的一級動力學(xué)；(2)繪制ln(kde。ay)υ.1/溫度(°K)的曲線；(3)檢測指定制劑條件的活性衰變需要的Ea(AGdeeay)；(4)利用計算的Ea和指定溫度觀察到的kdecay推斷4°C的kde。ay;和(5)確定保存期限(T9tl)，其是4°C酶比活性下降>10%的時間。表4顯示Phe和t-CA均大大增強聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的預(yù)期保存期限。表4利用各種賦形劑的聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的預(yù)測保存期限T9tl(單位為周)<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>*數(shù)字是基于6個不同實驗的數(shù)據(jù)估算的?？傊鲜鎏幏角把芯刻崾揪垡叶蓟疉vPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_〇565305033的最優(yōu)？!1是7到7.5。抗氧化劑的存在導(dǎo)致酶活性的顯著損失。在加速條件(25°C和37°C)下，苯丙氨酸(Phe)和反式肉桂酸(t_CA)使rAvPAL-PEG的穩(wěn)定性增加50%或更高。每個rAvPAL-PEG活性位點2倍過量的Phe或t_CA足以穩(wěn)定活性，更高濃度看起來沒有額外益處。較弱的PAL底物(Tyr)看起來不能穩(wěn)定酶活性，而安息香酸穩(wěn)定rAvPAL-PEG活性的程度類似于其結(jié)構(gòu)類似物Phe。當(dāng)與Phe聯(lián)用時，沒有觀察到與安息香酸的增加活性穩(wěn)定作用，表明活性穩(wěn)定的通用機制。實施例12AvPAL變體(半胱氨酸突變體)聚乙二醇化形式的凍干制劑進(jìn)行研究以探索各種固體(例如，凍干)制劑對本發(fā)明AvPAL多肽變體(例如，第503和565位半胱氨酸殘基的絲氨酸替代)的聚乙二醇化形式的活性的影響。按照實施例7的描述制備聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。如下配制聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S(Fl)IOmg/mLAvPAL_C565SC503S,IOmMTris,ρΗ7·5；(F2)10mg/mLAvPAL_C565SC503S,IOmMTris,pH7.5，25mg/mL甘露醇；或(F3)10mg/mLAvPAL_C565SC503S,IOmMTris,pH7.5，20mg/mL甘露醇，5mg/mL蔗糖。配制后，每種中的PAL酶活性為1.7到1.8U/mg。凍干后，將制劑在4°C保存直至使用，然后用新鮮無菌過濾的MilliQ水重懸。按照實施例11的描述檢測PAL酶活性。表5顯示，在AvPAL_C565SC503S制劑的凍干、保存或重懸時看起來不存在活性損失。表5凍干配制(LF)時聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的比活性<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>實施例13短尾猴和大鼠中AvPAL變體(半胱氨酸突變體)聚乙二醇化形式的毒性/藥代動力學(xué)研究在短尾猴和大鼠中進(jìn)行毒性/藥代動力學(xué)研究以確定施用單劑量AvPAL多肽變體(例如，第503和565位半胱氨酸殘基的絲氨酸替代)的聚乙二醇化形式的影響。按照實施例7的描述制備聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。短尾猴毒性/藥代動力學(xué)研究該研究使用四(4)組猴子，每組含3只雄性和3只雌性。組1接受安慰劑(mL/kg)；組2、3和4分別接受單次皮下注射溶液形式的4、12和60mg/kg聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。在給藥前和給藥后的不同時間(從3到504小時)采集猴的血漿樣品。發(fā)現(xiàn)60mg/kg劑量對猴來說是有毒性的，所以終止該研究的組4部分。圖14A顯示在單次皮下注射4和12mg/kg后不同時間血漿中聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的濃度。數(shù)據(jù)顯示聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的單相清除。具有一級吸收的單室模型看起來描述了單次皮下注射后聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的血漿模式。圖14B顯示在單次皮下注射4mg/kg后不同時間血漿中苯丙氨酸(Phe)和聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的濃度。在該劑量，血漿Phe濃度在24小時內(nèi)降低到低于GC/MS分析的定量下限，并且血漿Phe的下降維持超過10天。大鼠毒性/藥代動力學(xué)研究該研究使用八(8)組大鼠，安慰劑組含3只雄性和3只雌性，檢測組含6只雄性和6只雌性。組1和5接受安慰劑的單次靜脈內(nèi)和皮下注射。組2、3和4分別接受1、5和25mg/kg聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的單次靜脈內(nèi)注射。組6、7和8分別接受10、25和250mg/kg聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的單次皮下注射。在給藥前和給藥后的不同時間(從1到360小時)采集大鼠的血液樣品。在每次采集時間，采集每組3只大鼠的血液。在該研究中沒有觀察到大鼠中的毒性。圖15A顯示在單次靜脈內(nèi)注射1、5和25mg/kg后不同時間血漿中聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的濃度。數(shù)據(jù)顯示單次靜脈注射后聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S從血漿的單相清除。圖15B顯示在單次皮下注射10、25和250mg/kg后不同時間血漿中聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的濃度。具有一級吸收的單室模型看起來描述了單次皮下注射后聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的血漿模式。表6顯示單次靜脈內(nèi)或皮下注射后聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的藥代動力學(xué)參數(shù)。表6單次靜脈內(nèi)或皮下給藥后聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的藥代動力學(xué)參數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>*對于皮下施用途徑，最終t1/2長于靜脈內(nèi)；這可能歸因于與清除率相比皮下組織的吸收率更慢(這樣的話觀察到的t1/2實際上是吸收)。#利用25mg/kg靜脈AUC數(shù)據(jù)的生物利用度是21.5%。在該藥代動力學(xué)研究中看起來不存在性別差異。對于靜脈內(nèi)和皮下施用途徑來說AUCinf和Cmax與劑量大致成正比。大鼠和短尾猴中的多次給藥毒性研究在大鼠和短尾猴的重復(fù)給藥毒性研究中評價聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的安全性。給大鼠每周兩次皮下施用直至25mg/kg的聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S，超過28天沒有顯示毒性。給短尾猴猴每周兩次皮下施用高達(dá)lmg/kg劑量的聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S，超過28天沒有顯示顯著毒性。在第一次給藥后觀察到血漿Phe水平的劑量依賴性降低；在第一次給藥后，所有劑量組中血漿Phe水平都回到基線，這表明對于所施用酶的可能的抗體應(yīng)答。第28天在大多數(shù)lmg/kg治療的動物中觀察到最低的抗AvPAL_C565SC503SIgG滴度。該研究第28天在任意動物中都未觀察到IgM滴度。實施例14AvPAL變體(半胱氨酸突變體)對培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的影響進(jìn)行研究以探索AvPAL多肽變體(例如，第503和565位半胱氨酸殘基的絲氨酸替代)的聚乙二醇化形式對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞增殖的影響。按照實施例7的描述制備聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。腫瘤細(xì)胞的體外增殖利用碘化吡啶熒光分析法檢測，如Dengler等，Anti-CancerDrugs6:522-532(1995)所述。血液腫瘤針對聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S對細(xì)胞體外增殖的影響，評價一組二十四(24)種血液腫瘤細(xì)胞系，包括14例白血病，5例淋巴瘤和5例骨髓瘤。第0天按照5，000細(xì)胞/孔將血液腫瘤細(xì)胞系種入培養(yǎng)板。第1天，向培養(yǎng)物中添加各種濃度(從0.01到100微克/mL)的聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。第5天，收集細(xì)胞，通過碘化吡啶染色檢測DNA含量。確定IC5(1、IC7(^niC9(1。這些實驗對每種血液腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行兩次或三次。表7顯示通過碘化吡啶染色檢測，聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S有效抑制數(shù)種血液腫瘤細(xì)胞系的體外增殖。表7聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S在體外對血液腫瘤系碘化吡啶染色的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>在兩種敏感型血液腫瘤細(xì)胞N0M01和IM9中，聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S對細(xì)胞增殖的劑量依賴性抑制(由碘化吡啶染色的減弱可以確定)分別顯示于圖14A和21B。這些腫瘤細(xì)胞系分別具有低于1.0和10.0微克/ml的IC50和IC70。為了比較，人白血病細(xì)胞系中天冬酰胺酶具有1-10微克/mL的IC5(1。但是，通常，通過ICTO值判斷，血液腫瘤細(xì)胞系比實體瘤系更具抗性(見下文)。實體瘤針對聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S對體外細(xì)胞增殖的影響，評價一組三十六(36)種實體瘤細(xì)胞系，包括源自膀胱、腦、結(jié)腸、胃、頭和頸、肺、乳腺、卵巢、胰腺、前列腺、腎和子宮的腫瘤。第0天按照5，000細(xì)胞/孔將實體瘤細(xì)胞系種入培養(yǎng)板。第1天，向培養(yǎng)物中添加各種濃度(從0.01到100微克/mL)的聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。第5天，通過碘化吡啶染色檢測DNA含量。確定IC5(1、IC7(1和IC9(|。表8顯示通過碘化吡啶染色檢測，聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S有效抑制數(shù)種實體瘤細(xì)胞系的體外增殖。表8聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S在體外對實體瘤系碘化吡啶染色的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>在源自腦/CNS癌、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌的腫瘤細(xì)胞系中，聚乙二醇化半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S對細(xì)胞增殖的劑量依賴性抑制(由碘化吡啶染色的減弱可以確定)分別顯示于圖17A-D。在實體瘤細(xì)胞系的這種寬泛組中AvPAL_C565SC503S顯示選擇性的抗增殖活性，在來自肺、腦/CNS、結(jié)腸、前列腺和腎的腫瘤細(xì)胞系中尤其有效(即，IC5(I在0.2和0.7微克/mL之間)。至少源自膀胱、頭和頸、乳腺、卵巢及子宮的腫瘤細(xì)胞系對AvPAL_C565SC503S的細(xì)胞殺傷也是敏感的。數(shù)種黑色素瘤對AvPAL_C565SC503S的細(xì)胞殺傷也是敏感的。實施例15AvPAL變體(半胱氨酸突變體)在裸鼠中的抗癌活性進(jìn)行研究以調(diào)查AvPAL多肽變體(例如，第503和565位半胱氨酸殘基的絲氨酸替代)的聚乙二醇化形式對裸鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。按照實施例7的描述制備聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。免疫缺陷裸鼠或SCID小鼠中人類腫瘤細(xì)胞的皮下異種移植物已經(jīng)成功地被用作人類癌癥模型，以檢測癌癥治療劑以及靶向癌癥治療劑(諸如抗體和毒素偶聯(lián)物)的體內(nèi)功效(綜述參見Kerbel，CancerBiol.Ther.2(4):Suppl.1:S134_S139(2003))。利用裸鼠中人類腫瘤細(xì)胞的異種移植物，可以單獨檢測，或與癌癥治療劑或靶向癌癥治療劑聯(lián)合檢測，或與苯丙氨酸限制飲食聯(lián)合檢測聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的體內(nèi)抗癌活性。為了建立人類腫瘤異種移植物，給裸鼠皮下注射溶于0.2mLPBS的約5X106個人類腫瘤細(xì)胞。平均腫瘤大小隨時間增加。從荷瘤裸鼠切除人類異種移植腫瘤，制備大約30mm3的腫瘤組織塊。給用于評價聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的體內(nèi)抗癌活性的新生裸鼠每只皮下植入一個腫瘤組織塊。在腫瘤開始前或一組裸鼠中的平均腫瘤大小為大約100-150mm3時起始治療性治療(預(yù)防模型)，和/或建立腫瘤后當(dāng)一組裸鼠中的平均腫瘤大小超過500mm3時起始治療性治療(治療模型)。第一步，確定將血漿苯丙氨酸(Phe)水平降低到接近于零的聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的劑量。按照如2006年6月12日提交的先前共同待決的美國專利申請?zhí)?1/451，999的實施例7到9和14的描述進(jìn)行實驗，除了使用的是裸鼠而不是ENU2小鼠。在這起始步驟中確定PAL酶劑量和施用頻率。第二步，在源自患者的各種人類腫瘤異種移植物或細(xì)胞系中評價聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的抗腫瘤活性。腫瘤模型包括不同的癌癥類型，例如但不限于，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和腎癌?？梢詼y試的腫瘤和腫瘤細(xì)胞系的非綜合提供于表7(血液腫瘤)和8(實體瘤)。為了評價聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的抗癌活性，將皮下載有不同人類腫瘤異種移植物的裸鼠通過皮下給予3種不同劑量水平(約5到500mg/kg)的AvPAL_C565SC503S進(jìn)行治療。該劑量可以導(dǎo)致約0.1到10mg/kg的人類劑量。通過腫瘤體積抑制和/或絕對生長延緩來分析抗癌活性。還通過致死率和/或體重改變來評價AvPAL_C565SC503S的耐受性。每個體內(nèi)抗癌研究由至少四個組組成，一個運載體對照組和至少三個原核PAL酶治療組。組大小至少是8只小鼠，導(dǎo)致總共32只小鼠接受皮下腫瘤移植。具有相似大小腫瘤(100-150mm3)的小鼠被隨機分組(第0天)。就抗癌效果來說，在原核PAL酶治療結(jié)束后可以再監(jiān)測小鼠2周，以檢測腫瘤生長的可能重新開始。根據(jù)動物試驗規(guī)程，如果腫瘤直徑超過1.6cm，處死小鼠。每周兩次檢測腫瘤直徑以及體重。根據(jù)公式a*b2/2(其中'a'是腫瘤的最大直徑，‘b'是垂直軸)計算腫瘤體積。基于第0天(給藥第一天)計算每個個體腫瘤的相對腫瘤體積和體重。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到大約100-150mm3時開始治療。根據(jù)動物研究規(guī)程，如果腫瘤體積超過1600mm3，處死小鼠。在裸鼠連續(xù)傳代中建立的患者來源的腫瘤也可以用作試驗?zāi)[瘤。通常，這些腫瘤保留原始患者腫瘤的重要特征，包括組織學(xué)和藥物敏感性。對于某些腫瘤，例如，一種CNS和兩種前列腺癌，使用癌細(xì)胞系來源的腫瘤。實施例16示例性原核PAL制劑下列實施例提供用于配制組合物的參數(shù)的指導(dǎo)，所述組合物包含原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物，其可用于治療腫瘤病和癌癥。用于配制本發(fā)明原核PAL組合物的參數(shù)包括但不限于維持pH的緩沖劑，等滲調(diào)節(jié)劑，穩(wěn)定劑的缺失或存在，以及其他賦形劑、運載體、稀釋劑的缺失或存在等。在實施例11中，將聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S配制為約12-20mg/mL(about0.2-0.33mM)的濃度。優(yōu)選的原核PAL變體被配制為約1到50mg/mL(約0.016到0.8mM)的濃度范圍，優(yōu)選地為約5到20mg/mL(約0.08到0.33mM)，和更優(yōu)選地為約5到15mg/mL(約0.08到0.25mM)。本發(fā)明原核PAL組合物最優(yōu)選的制劑具有約10+/-5mg/mL(約0.16+/-0.08mM)的PAL酶濃度。在實施例11中，聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S用pH7.0、7.5和8.0的10mMTris-HCl,140mMNaCl配制。優(yōu)選的緩沖劑是Tris-HCl，或其等同物，濃度范圍為5到50mM，優(yōu)選為5到20mM，和更優(yōu)選為5到15mM。本發(fā)明原核PAL組合物最優(yōu)選的制劑具有濃度為約10+/-5mM的Tris-HCl。藥物組合物優(yōu)選的pH是約pH6.0-8.5，優(yōu)選約pH7.0-8.0，更優(yōu)選約pH7.0-7.6。本發(fā)明原核PAL組合物最優(yōu)選的制劑具有約pH7.3+/-0.3的pH。優(yōu)選的等滲調(diào)節(jié)劑是NaCl或其等同物，濃度范圍為約100到200mM，優(yōu)選為約130到170mM，和更優(yōu)選為約130到150mM。本發(fā)明原核PAL組合物最優(yōu)選的制劑具有濃度為約140+/"10mM的NaCl。如實施例11所示，在苯丙氨酸(Phe)和某些其結(jié)構(gòu)類似物(包括，例如，反式肉桂酸(t-CA)和安息香酸)存在的條件下聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S是穩(wěn)定的；酪氨酸(Tyr)對PAL酶的穩(wěn)定效應(yīng)最小。優(yōu)選的穩(wěn)定劑是Phe或其結(jié)構(gòu)類似物，穩(wěn)定劑的范圍為約0.1到20摩爾穩(wěn)定劑每摩爾原核PAL活性位點，優(yōu)選為約0.5到10摩爾穩(wěn)定劑每摩爾原核PAL活性位點，更優(yōu)選為約1到10摩爾穩(wěn)定劑每摩爾原核PAL活性位點。本發(fā)明原核PAL組合物最優(yōu)選的制劑具有的穩(wěn)定劑濃度為約5+/-4摩爾穩(wěn)定劑每摩爾原核PAL活性位點。在pH<7或pH>7.6，或EDTA、氨基胍或Tween80存在的條件下，聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S不是顯著穩(wěn)定的；而抗氧化劑抗壞血酸和甲硫氨酸使PAL酶不穩(wěn)定(實施例11，數(shù)據(jù)未顯示)。優(yōu)選地將本發(fā)明的原核PAL組合物制備為液體制劑，但也可以制備為固體(例如，凍干)制劑。在這種情況下，可以添加賦形劑，例如填充劑如甘露醇和/或蔗糖。在實施例12中，在沒有甘露醇或蔗糖，存在25mg/mL甘露醇，或存在20mg/mL甘露醇加5mg/mL蔗糖的條件下，用pH7.5的10mMTris-HCl，140mMNaCl配制聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S，并將其凍干。優(yōu)選的凍干制劑包括濃度為約1到5%(w/v)或10到50mg/mL的甘露醇，優(yōu)選的為約2到4%，更優(yōu)選的為約2到3%。另一優(yōu)選的凍干制劑包括甘露醇和蔗糖，其中甘露醇的濃度為約1到5%(w/v)或10到50mg/mL，優(yōu)選的為約1到3%，更優(yōu)選的為約1.5到2.5%，蔗糖的濃度為約0.1到2%(w/v)或0.1到2mg/mL，優(yōu)選的為約0.2%到1%，更優(yōu)選的為約0.3%到0.7%。本發(fā)明原核PAL組合物最優(yōu)選的凍干制劑具有的甘露醇濃度為約2.5+/-0.5%甘露醇或2.0+/-0.5%甘露醇加0.5+/-0.2%蔗糖。因此，本發(fā)明的原核PAL組合物的優(yōu)選制劑顯示于表9。表9原核PAL變體的示例性制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>*用于凍干的原核PAL制劑實施例17原核PAL組合物用于癌癥治療的臨床評價下列實施例提供了用于臨床評價本發(fā)明的治療方法中的組合物的有關(guān)參數(shù)的指導(dǎo)，所述組合物包含原核PAL或其生物活性片段、突變體、變體或類似物。如本文自始至終所述，原核PAL組合物將用于癌癥的治療。進(jìn)行臨床試驗，其將提供關(guān)于原核PAL的口服或皮下給藥的安全性、藥代動力學(xué)的評價，以及替代物和指定的臨床終點的初始應(yīng)答。該試驗將進(jìn)行至少而不是必須限于24周，以收集100位可評價患者的足夠安全性信息。該試驗的初始劑量將在約0.001到約1.Omg/kg/周之間變化。如果該劑量不導(dǎo)致患者血漿苯丙氨酸(Phe)水平的降低，例如從約50微摩到約70微摩的正常范圍降低到從低于檢測水平到低于約30微摩的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩，則根據(jù)需要應(yīng)當(dāng)增加劑量，并維持額外的最短時間，但不必限于24周，以確定安全性并評價進(jìn)一步的效果。安全性的檢測將包括不良事件、變態(tài)反應(yīng)、完整的臨床化學(xué)組(腎和肝功能)、尿分析和差別CBC。此外，還將監(jiān)測其他參數(shù)，包括血液Phe水平的降低、神經(jīng)心理學(xué)和認(rèn)知試驗，并還監(jiān)測全球性評價。本實施例還涉及檢測藥物在循環(huán)中的藥代動力學(xué)參數(shù)，以及血液中PAL的一般分配和半衰期?？梢灶A(yù)期這些檢測將有助于將劑量與臨床反應(yīng)聯(lián)系起來。方法無癌對照患者和已經(jīng)診斷患有某種形式癌癥的患者將經(jīng)歷基準(zhǔn)醫(yī)療史和身體檢查，神經(jīng)心理學(xué)和認(rèn)知測驗，一套標(biāo)準(zhǔn)的臨床實驗室試驗(CBC，Panel20，CH50,UA)，尿蝶呤水平、二氫蝶啶還原酶(DHPR)水平和禁食血液(血漿)組的血清氨基酸檢測。將檢測基準(zhǔn)血液、血清或血漿Phe水平。患者將到診所進(jìn)行密切的每周隨訪。在完成治療周期一周后患者將回到診所進(jìn)行全面評價。如果需要升高劑量，則患者將遵循上面所列的相同方案。在該試驗自始至終都將監(jiān)測安全性。診斷和包括/排除標(biāo)準(zhǔn)患者可以是男性或女性，具有某種形式癌癥的記載的診斷書。該研究將包括先前接受過手術(shù)、化療、放療和/或其他抗癌療法并且處于癥狀緩解期(例如，無病至少5年)的癌癥患者。如果患者已經(jīng)診斷出患某種形式的癌癥，但還未接受某些形式的抗癌療法，則該患者將被排除出該初步研究。原核PAL安全性如果在研究過程中不存在顯著的急性或慢性藥物反應(yīng)，則可以確定原核PAL療法是安全的。如果在臨床檢查、臨床試驗或其他相應(yīng)研究中未觀察到顯著異常，則可以確定藥物的更長時間施用是安全的。原核PAL功效一旦確定原核PAL療法是安全的并且能夠有效降低患者的血漿苯丙氨酸(Phe)水平，例如，從約50微摩到約70微摩的正常范圍降低到從低于檢測水平到低于約30微摩的范圍，優(yōu)選地低于約20微摩，甚至更優(yōu)選地低于約10微摩，本發(fā)明的原核PAL組合物可以在下列癌癥患者中進(jìn)行檢測先前接受過手術(shù)、化療、放療和/或其他抗癌療法并處于癥狀緩解期(例如，無病至少5年)的癌癥患者，以及已經(jīng)診斷出患有某種形式的癌癥但至今還未接受任意形式抗癌療法的患者。對于癥狀緩解期的癌癥患者，單獨施用原核PAL，或與特定形式癌癥的標(biāo)準(zhǔn)癌癥療法聯(lián)合施用，以確定接受PAL療法的患者是否比未接受本發(fā)明原核PAL組合物的患者在癥狀緩解期(即，無病)維持更長時間。對于患有活性形式癌癥的癌癥患者，單獨施用原核PAL，或與特定形式癌癥的標(biāo)準(zhǔn)癌癥療法聯(lián)合施用，以確定接受PAL療法的患者是否比未接受本發(fā)明原核PAL組合物的患者對所述癌癥療法具有更好的響應(yīng)(例如，保持無病狀態(tài)更長時間，具有更長的生存時間，或具有更低的腫瘤生長、腫瘤大小或腫瘤負(fù)荷)。原核PAL療法可以單獨施用，或與癌癥治療劑或靶向癌癥治療劑聯(lián)合施用，或與蛋白限制性飲食(即，不含苯丙氨酸)聯(lián)合施用，或上述兩者。實施例18AvPAL變體(半胱氨酸突變體)在B166黑色素瘤細(xì)胞系異種移植模型中的抗癌活性在B16黑色素瘤細(xì)胞系異種移植模型中評價聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的預(yù)防性或治療性給藥的抗腫瘤效果，所述AvPAL_C565SC503S按照實施例7的描述制備，并用10mMTris-HCl，140mMNaCl,ImM反式肉桂酸(t_CA)，pH7.5配制為2.86和7.14mg/mL。預(yù)防性治療表示給未顯示病征的個體施用的治療，而治療性治療表示給顯示病征的個體施用的治療。利用聚乙二醇化AvPAL變體的預(yù)防性或治療性治療的抗腫瘤效果通過B16黑色素瘤異種移植物生長的延緩和小鼠存活時間的增加來檢測。為了建立腫瘤異種移植物，給96只6周齡雌性B6J小鼠在后腰窩處皮下注射約1X106個B16黑色素瘤細(xì)胞。將注射的小鼠隨機分為兩組，代表預(yù)防性治療和治療性治療群體。分配到預(yù)防組的小鼠被進(jìn)一步分成四組，每組接受每周兩次皮下注射運載體(10mMTris-HCl,140mMNaCl，ImM反式肉桂酸(t_CA)，pH7.5)或不同劑量水平(40、80或100mg/kg)的聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。預(yù)防組的第1天表示將B16黑色素瘤細(xì)胞注射到小鼠的那一天，如圖18(頂部)所示。但是，在治療組中，第1天表示注射到小鼠的B16黑色素瘤體積達(dá)到200-300mm3的那一天，如圖18(底部)所示。當(dāng)分到治療組的小鼠的腫瘤體積達(dá)到200-300mm3時，這些小鼠被進(jìn)一步分成四組，每組接受每周兩次在腫瘤相反一側(cè)腰窩皮下注射運載體(10mMTris-HCl,140mMNaCl，ImM反式肉桂酸(t_CA)，pH7.5)或不同劑量水平(40、80或100mg/kg)的聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。每天觸診所有小鼠，直至腫瘤可以測量。通過數(shù)字式測徑器測量每周檢測腫瘤體積三次，利用公式(1Xw2)/2，其中w是腫瘤2條垂直軸的最短值。每周檢測體重三次，每天進(jìn)行臨床觀察(死亡、異常、以及疼痛或痛苦的癥狀)。在給藥施用前(每周的第1天)、給藥后48小時(每周的第3天)和結(jié)束時通過眼球后竇道采集每周進(jìn)行血液采集。在第36天或個別地在腫瘤體積達(dá)到1500mm3時殺死小鼠，無論哪一種情況首先發(fā)生。在結(jié)束時采集腫瘤，并用福爾馬林固定用于組織學(xué)檢查。到第16天預(yù)防組的一些小鼠具有1500mm3的腫瘤體積(參見圖18(頂部))。到第10天治療組的一些小鼠具有1500mm3的腫瘤體積(底部))。圖18顯示當(dāng)預(yù)防性(頂部)或治療性(底部)施用酶時，聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S能夠以劑量依賴性方式延緩B16黑色素瘤細(xì)胞系異種移植物的生長。表10顯示當(dāng)預(yù)防性或治療性施用酶時，聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S能夠增加存活率(通過腫瘤體積小于1500mm3的小鼠的百分比來確定)。表10:B16黑色素瘤異種移植模型中rAVPAL-PEG_C565SC503S對存活率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>*至少50%治療組中的小鼠具有大于1500mm3的腫瘤體積的那一天該研究顯示，當(dāng)在黑色素瘤小鼠模型中預(yù)防性或治療性施用時，聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S發(fā)揮抗腫瘤作用。實施例19AvPAL變體(半胱氨酸突變體)在肝癌腫瘤細(xì)胞系異種移植模型中的抗癌活性在兩種肝癌腫瘤細(xì)胞系異種移植模型中評價聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的預(yù)防性給藥的抗腫瘤效果，所述AvPAL_C565SC503S按照實施例7的描述制備，并用10mMTris-HCl,140mMNaCl，ImM反式肉桂酸(t_CA)，pH7.5配制為9.lmg/mL。預(yù)防性治療表示給未顯示病征的個體施用的治療。利用聚乙二醇化AvPAL變體的預(yù)防性治療的抗腫瘤效果通過肝癌異種移植物生長的延緩和小鼠存活時間的增加來檢測。為了建立腫瘤異種移植物，給20只6周齡雌性B6J小鼠在后腰窩處皮下注射約1X107個SNU398肝癌腫瘤細(xì)胞或約5X106個IfepG2肝癌腫瘤細(xì)胞。將注射SNU398和注射HepG2的小鼠分成兩組，每組接受每周三次皮下注射運載體(10mMTris-HCl,140mMNaCl,ImM反式肉桂酸(t_CA)，pH7.5)或60mg/kg聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。第1天表示SNU398細(xì)胞或H印G2細(xì)胞注射到小鼠的那天，如圖19所示。每天觸診所有小鼠，直至腫瘤可以測量。通過數(shù)字式測徑器測量每周檢測腫瘤體積三次，利用公式(1Xw2)/2，其中w是腫瘤2條垂直軸的最短值。每周檢測體重三次，每天進(jìn)行臨床觀察(死亡、異常、以及疼痛或痛苦的癥狀)。在研究前、第7次給藥后48小時和結(jié)束時進(jìn)行通過眼球后竇道采集的血液采集。在第60天或個別地在腫瘤體積達(dá)到1500mm3時殺死小鼠，無論哪一種情況首先發(fā)生。在結(jié)束時采集腫瘤，并用福爾馬林固定用于組織學(xué)檢查。圖19顯示聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的預(yù)防性施用能夠延緩SNU398(頂部)和HepG2(底部)肝癌細(xì)胞系異種移植物的生長。表11顯示聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的預(yù)防性施用能夠增加存活率，通過SNU398和H印G2肝癌細(xì)胞系異種移植物腫瘤體積小于1500mm3的的小鼠的百分比確定。表11兩種肝癌腫瘤異種移植模型中rAVPAL-PEG_C565SC503S對存活率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>*至少50%治療組中的小鼠具有大于1500mm3的腫瘤體積的那一天這些研究顯示，當(dāng)在兩種肝癌小鼠模型中預(yù)防性施用時，聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S發(fā)揮抗腫瘤作用。對在上述說明性實施例中闡述的本發(fā)明的多種修改和變化預(yù)期會被本領(lǐng)域技術(shù)人員想到。因此本發(fā)明只受所附權(quán)利要求書的限制。權(quán)利要求藥物組合物，其包含原核苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)變體和藥學(xué)上可接受的載體，其中與野生型PAL相比，所述PAL變體具有更高的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑。2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述PAL變體的一個或多個氨基酸殘基被另一氨基酸殘基替代，其中與野生型PAL相比，所述替代增加所述活性和/或降低所述免疫原性。3.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述PAL變體的一個或多個半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。4.權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述PAL變體是多變魚腥藻PAL(AvPAL)變體。5.權(quán)利要求4的藥物組合物，其中所述AvPAL變體第64、318、503和565位的一個或多個半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述AvPAL變體第565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。7.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述AvPAL變體第503和565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。8.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述PAL變體還包含水溶性聚合物。9.權(quán)利要求8的藥物組合物，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇。10.權(quán)利要求9的藥物組合物，其中所述PAL變體是AvPAL變體，且其中所述AvPAL變體與聚乙二醇的比例為約13(13AvPALPEG)。11.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中所述AvPAL變體第503和565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。12.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑。13.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸或其結(jié)構(gòu)類似物。14.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸。15.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑是反式肉桂酸。16.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑是安息香酸。17.藥物組合物，其包含AvPAL變體和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述AvPAL變體第503和565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代(SEQIDN0:11)，且所述AvPAL變體還包含聚乙二醇的水溶性聚合物，其中AvPAL變體與聚乙二醇的比例為約13，且其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑。18.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸或其結(jié)構(gòu)類似物。19.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑選自L-苯丙氨酸、反式肉桂酸和安息香酸。20.權(quán)利要求19的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸。21.權(quán)利要求19的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑是反式肉桂酸。22.權(quán)利要求19的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑是安息香酸。23.治療癌癥的方法，包括給患者施用治療有效量的包含PAL變體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中所述PAL變體a)與野生型PAL相比，具有更高的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性；和b)能有效地將患者血液、血清或血漿中的苯丙氨酸濃度降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述PAL變體的一個或多個氨基酸殘基被另一氨基酸殘基替代，其中與野生型PAL相比，所述替代增加所述活性和/或降低所述免疫原性。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述PAL變體的一個或多個半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述PAL變體是AvPAL變體。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述AvPAL變體第64、318、503和565位的一個或多個半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述AvPAL變體第565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。29.權(quán)利要求27的方法，其中所述AvPAL變體第503和565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。30.權(quán)利要求23的方法，其中所述PAL變體還包含水溶性聚合物。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述PAL變體是AvPAL變體，且其中所述AvPAL變體與聚乙二醇的比例為約13(13AvPALPEG)。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述AvPAL變體第503和565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代。34.治療癌癥的方法，包括給患者施用治療有效量的包含AvPAL變體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中a)所述AvPAL變體第503和565位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代(SEQIDNO11)；和b)所述AvPAL變體還包含聚乙二醇的水溶性聚合物，其中AvPAL變體與聚乙二醇的比例為約13；且其中所述AvPAL變體能有效地將患者血液、血清或血漿中的苯丙氨酸濃度降低到從低于檢測水平到約20微摩和60微摩之間的范圍。35.權(quán)利要求23或34的方法，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸或其結(jié)構(gòu)類似物。37.權(quán)利要求35的方法，其中所述穩(wěn)定劑選自L-苯丙氨酸、反式肉桂酸和安息香酸。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸。39.權(quán)利要求37的方法，其中所述穩(wěn)定劑是反式肉桂酸。40.權(quán)利要求37的方法，其中所述穩(wěn)定劑是安息香酸。41.權(quán)利要求23或34的方法，其中所述癌癥選自肺癌、腦癌或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、頭頸癌、卵巢癌、子宮癌、急性髓性白血病、急性淋巴母細(xì)胞白血病、骨髓瘤、兒童癌癥和耐藥性癌癥。42.權(quán)利要求23或34的方法，其中源自所述癌癥的細(xì)胞的增殖和/或生存對苯丙氨酸限制或去除敏感。43.權(quán)利要求23或34的方法，還包括施用治療有效量的包含癌癥治療劑或靶向癌癥治療劑的藥物組合物。44.權(quán)利要求23或34的方法，還包括給患者施用蛋白限制性飲食。45.權(quán)利要求23或34的方法，其中所述患者的血液、血清或血漿中的所述苯丙氨酸濃度被降低到從低于檢測水平到低于約20微摩的范圍。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述患者的血液、血清或血漿中的所述苯丙氨酸濃度被降低到從低于檢測水平到低于約10微摩的范圍。47.權(quán)利要求23或34的方法，其中所述患者是人。全文摘要本發(fā)明涉及由原核生物產(chǎn)生的苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)變體，其中與野生型PAL相比，所述原核PAL變體具有更高的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性。本發(fā)明提供了原核PAL及其生物活性片段、突變體、變體或類似物的組合物，以及為了治療目的產(chǎn)生、純化和使用所述組合物的方法，所述治療目的包括癌癥的治療。文檔編號A61P35/00GK101803492SQ200880016488公開日2010年8月11日申請日期2008年8月15日優(yōu)先權(quán)日2007年8月17日發(fā)明者E·D·卡基斯,P·A·菲茨帕特里克,丹尼爾·J·溫特,奧古斯塔斯·O·奧克哈瑪菲,穆巴拉克·穆塔利夫,米歇爾·C·維拉德,肖恩·M·貝爾申請人:生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