專利名稱：：一種藥物載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種藥物載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，每年世界有1000萬(wàn)人患上癌癥，約6萬(wàn)人死于癌癥，人數(shù)占全球死亡人數(shù)的12%。我國(guó)每年新增癌癥患者180萬(wàn)，死亡140萬(wàn)，平均每3分鐘就有1.3人死于癌癥，而且癌癥的發(fā)病率呈急劇上升到的趨勢(shì)。據(jù)《文匯報(bào)》報(bào)道，在過(guò)去不到20年的時(shí)間內(nèi)，我國(guó)癌癥發(fā)病率上升69%，死亡率增長(zhǎng)了29.4%，癌癥已經(jīng)嚴(yán)重危害了我國(guó)人民健康。傳統(tǒng)的放射療法和化療是目前常用的癌癥治療法，主要通過(guò)應(yīng)用有毒藥物來(lái)對(duì)付腫瘤組織，殺死癌細(xì)胞，但這同時(shí)也會(huì)對(duì)人體健康細(xì)胞造成很大的損害，因此發(fā)展一種毒副作用較小的基于納米技術(shù)和新型生物技術(shù)的特異性治療方法十分重要?；熓抢没瘜W(xué)藥物殺死腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化的一種治療方式，它是一種全身性治療手段，對(duì)原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶和亞臨床轉(zhuǎn)移灶均有治療作用。但是化學(xué)藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)影響機(jī)體的正常細(xì)胞，在取得治療效果的同時(shí)，常出現(xiàn)不同程度的毒副作用。化療過(guò)程中，身體衰弱、精神萎靡、出虛汗，白細(xì)胞和血小板、紅細(xì)胞、血色素下降接踵而來(lái)，甚至出現(xiàn)胸悶心悸、肝腎功能損害等，迫使患者停止治療。降低化療藥物的劑量可以有效減小或者消除毒副作用，但是對(duì)癌細(xì)胞的作用效果也大大降低了。紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，也是目前所了解的惟一一種可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物。同位素示蹤表明，紫杉醇只結(jié)合到聚合的微管上，不與未聚合的微管蛋白二聚體反應(yīng)。細(xì)胞接觸紫杉醇后會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積累大量的微管，這些微管的積累干擾了細(xì)胞的各種功能，特別是使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂的G2/M期，阻斷了細(xì)胞的正常分裂，還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)II-III期臨床研究，紫杉醇主要適用于乳腺癌和卵巢癌的治療，對(duì)肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。雖然紫杉醇的抗腫瘤作用早已被人們所認(rèn)識(shí)，但直到1988年才完成I期臨床試驗(yàn)，至1992年才被美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)用于治療卵巢癌。究其原因，除了紫杉醇本身來(lái)源困難外，其復(fù)雜的臨床毒副反應(yīng)也是限制其開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的重要原因。紫杉醇的臨床毒副作用主要表現(xiàn)在1)對(duì)造血系統(tǒng)產(chǎn)生影響；2)過(guò)敏反應(yīng)；3)神經(jīng)系統(tǒng)毒性；4)胃腸道粘膜炎；5)其他毒副作用。限制紫杉醇應(yīng)用的另外一個(gè)因素是紫杉醇是疏水性物質(zhì)，在水溶液中的溶解性非常差，其在臨床治療應(yīng)用時(shí)需使用一些增溶劑來(lái)溶解紫杉醇以達(dá)到治療的劑量要求。因此，開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)一種能夠包載紫杉醇以增加其水溶性的傳輸體系也就成為開(kāi)發(fā)紫杉醇藥物的一個(gè)關(guān)鍵因素。RNA干擾是一種由大約二十多個(gè)核苷酸組成的雙鏈小分子干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，它具有序列特異性而且發(fā)生在遺傳信息的轉(zhuǎn)錄之后。癌癥細(xì)胞對(duì)一些蛋白質(zhì)分子的特異性表達(dá)或過(guò)度表達(dá)逐漸成為癌癥治療在分子水平的新靶點(diǎn)，可以針對(duì)這些靶點(diǎn)發(fā)展新型RNAi干擾療法。比如可以使細(xì)胞周期停滯在G2期或者M(jìn)期的基因PLK1被3發(fā)現(xiàn)在人類各種腫瘤組織癌細(xì)胞中均高表達(dá)。研究表明，PLK1可在多種轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中表達(dá)，并見(jiàn)于所有人類最常見(jiàn)的腫瘤組織，包括肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌，胃癌組織也有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)。因此如果能用RNA干擾的辦法將PLK基因〃關(guān)閉〃，從而阻止癌細(xì)胞的自由分裂和復(fù)制，就有可能發(fā)展出治療癌癥的特異性新療法。然而，盡管目前在大多數(shù)研究中，siRNA顯示出抑制基因的良好潛質(zhì)，但是siRNA的合成費(fèi)用較高，只能瞬時(shí)沉默基因，并且在傳輸方面也面臨著巨大挑戰(zhàn)。由于siRNA分子本身穿透細(xì)胞膜的能力極差，而且極不穩(wěn)定，因此siRNA藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)重要關(guān)鍵是siRNA的傳輸體系。目前所采用的載體體系大多是陽(yáng)離子脂質(zhì)體或水溶性的陽(yáng)離子聚合物，將這些載體分子與siRNA溶液互混得到二者的復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)傳遞siRNA的目的，這類方法的不足就是不容易放大規(guī)模并且重復(fù)性較差。對(duì)一些癌細(xì)胞中存在的原癌基因表達(dá)的沉默，可以導(dǎo)致對(duì)一些化療藥物的敏感性增強(qiáng)。已經(jīng)有研究結(jié)果指出，將乳腺癌細(xì)胞中的PLK1表達(dá)水平下調(diào)，可以顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，從而可以用較低濃度的紫杉醇獲得很好的治療效果。因此發(fā)展能同時(shí)將RNAi藥物和化療藥物輸送到癌細(xì)胞、癌組織的載體有可能在沉默一些原癌基因表達(dá)的同時(shí)，用低劑量的化療藥物徹底殺死癌細(xì)胞。通過(guò)藥物可控釋放和靶向藥物輸送系統(tǒng)能夠減少藥物降解與損失，降低副作用，提高生物利用度和療效。如何使藥物能夠到達(dá)病灶部位，并在病灶部位和病灶細(xì)胞內(nèi)釋放藥物，是現(xiàn)今藥物制劑學(xué)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。聚合物納米顆粒載藥范圍廣、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、具有優(yōu)良的組織滲透性，體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)，能使藥物有效地到達(dá)靶點(diǎn)。它可以提高藥物穩(wěn)定性，延緩釋放，提高藥效，降低毒副作用。大量的研究證明，納米尺度的聚合物藥物載體可促進(jìn)藥物在腫瘤組織的富集，用納米藥物載體輸送藥物，在癌癥治療中顯示出良好的效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。由于腫瘤組織的微環(huán)境與正常組織存在顯著的差別，不利于小分子藥物通過(guò)血管輸送到腫瘤組織的深部及腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物作用的靶位。然而，由于腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的不連續(xù)性，允許粒徑小于200nm的粒子通過(guò)血管壁進(jìn)入組織間隙，因此，將藥物裝載到納米粒中可通過(guò)滲透和滯留增強(qiáng)效應(yīng)(enhancedpermeabilityretention,EPR)在腫瘤組織中富集進(jìn)而實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向。聚合物納米顆?？捎脙捎H性嵌段共聚物在選擇性溶劑通過(guò)組裝形成。兩親性AB兩嵌段共聚物指的是這樣一種聚合物，它包括由化學(xué)鍵連接的兩種不同的聚合物鏈段，即A嵌段與B嵌段，典型的如聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物。兩親性ABA三嵌段共聚物指的是這樣一種聚合物，它包括第一聚合物的中心鏈段，稱作B嵌段，和第二聚合物作為兩端鏈段，稱為A嵌段。典型的實(shí)例如，聚(環(huán)氧乙烷)-聚(環(huán)氧丙烷)-聚(環(huán)氧乙烷)(PE0-PP0-PE0，PluronicTM)三嵌段共聚物。小分子藥物如化療藥物紫杉醇、阿霉素可以在兩親性嵌段共聚物組裝形成納米顆粒的過(guò)程中被包載到疏水性的內(nèi)核中。生物可降解高分子在藥物輸運(yùn)中具有更好的應(yīng)用前景，原因是生物可降解高分子可以在生物體內(nèi)降解，其降解產(chǎn)物或被排除體外，或參與生命體代謝，從而可以減少副作用。合成生物可降解高分子包括脂肪族聚酯、聚原酸酯、聚酸酐等在內(nèi)的大量可降解高分子，這些高分子在藥物輸運(yùn)、基因傳遞、細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程等生物醫(yī)用領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種藥物載體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的藥物載體，它的活性成分是聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物形成的帶正電荷的納米顆粒。所述納米顆?？蛇M(jìn)行化學(xué)修飾或配體修飾。所述藥物載體負(fù)載的藥物的活性成分可為化學(xué)物質(zhì)，如紫杉醇、siRNA等。所述siRNA是指針對(duì)不同靶點(diǎn)，可以抑制疾病相關(guān)基因表達(dá)的雙鏈小分子干擾RNA。所述三嵌段共聚物中，中間嵌段是所述聚己內(nèi)酯，一個(gè)末端嵌段是聚乙二醇單甲醚，另一個(gè)末端嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇嵌段的聚合度為45，對(duì)應(yīng)的數(shù)均分子量為2000g/mol;所述聚己內(nèi)酯嵌段的聚合度為45-100，對(duì)應(yīng)的數(shù)均分子量為5，130-ll，400g/mol;所述聚磷酸酯嵌段的聚合度為7-12，對(duì)應(yīng)的數(shù)均分子量為1，420-2，430g/mol。所述聚己內(nèi)酯為具體可為聚e-己內(nèi)酯。所述三嵌段共聚物具體可為mPEG45-PCL45-PPEEA7或mPEG^-PCL^-PPEEA^mPEG45-PCL，-PPEEA^的化學(xué)結(jié)構(gòu)如(I)所示OCI+H3N當(dāng)所述納米顆粒同時(shí)負(fù)載紫杉醇和siRNA時(shí)，所述納米顆粒與紫杉醇的質(zhì)量比為375000:1-3750:1;所述納米顆粒與siRNA的正負(fù)電荷比(N/P比)為50:1。本發(fā)明還保護(hù)一種治療癌癥的藥物，它的活性成分是由聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯負(fù)載抗癌藥物形成的納米顆粒。本發(fā)明還保護(hù)一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物，它的活性成分是由聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯負(fù)載抗癌藥物形成的納米顆粒。所述納米顆?？蛇M(jìn)行化學(xué)修飾或配體修飾。所述抗癌藥物可為化學(xué)物質(zhì)，如紫杉醇和/或siRNA。所述siRNA是指針對(duì)不同靶點(diǎn)，可以抑制疾病相關(guān)基因表達(dá)的雙鏈小分子干擾RNA。所述三嵌段共聚物中，中間嵌段是所述聚己內(nèi)酯，一個(gè)末端嵌段是聚乙二醇單甲醚，另一個(gè)末端嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇嵌段的聚合度為45，對(duì)應(yīng)的數(shù)均分子量為2000g/mol;所述聚己內(nèi)酯嵌段的聚合度為45-100，對(duì)應(yīng)的數(shù)均分子量為5，130-ll，400g/mol;所述聚磷酸酯嵌段的聚合度為7-12，對(duì)應(yīng)的數(shù)均分子量為1，420-2，430g/mol。所述聚己內(nèi)酯為具體可為聚e-己內(nèi)酯。所述三嵌段共聚物具體可為mPEG45-PCL45-PPEEA7或mPEG^-PCL^-PPEEA^mPEG45-PCL，-PPEEA^的化學(xué)結(jié)構(gòu)如(I)所示。5所述癌癥具體可為乳腺癌。所述腫瘤細(xì)胞具體可為乳腺癌細(xì)胞。當(dāng)所述癌癥為乳腺癌或所述腫瘤細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞時(shí)，所述siRNA可為針對(duì)PLK1基因的siRNA。當(dāng)所述納米顆粒同時(shí)負(fù)載紫杉醇和siRNA時(shí)，所述納米顆粒與紫杉醇的質(zhì)量比為375000:1-3750:1;所述納米顆粒與siRNA的正負(fù)電荷比(N/P比)為50:1。聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物是生物相容性的陽(yáng)離子型兩親性嵌段共聚物，在水溶液中自組裝形成具有疏水性核并帶有正電荷的納米顆粒，具有良好的穩(wěn)定性，制備方法簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高。共聚物在水溶液中形成膠束納米顆粒的同時(shí)，可將疏水性抗癌藥物包載進(jìn)其疏水性內(nèi)核中；利用納米顆粒聚磷酸酯殼層的正電荷，可以和帶負(fù)電的siRNA結(jié)合；從而形成可以同時(shí)輸運(yùn)抗癌藥物和siRNA的給藥體系。通過(guò)改變加入的疏水性藥物的量，可以改變納米顆粒的載藥率。通過(guò)改變納米顆粒和siRNA的N/P比，可以改變納米顆粒負(fù)載siRNA的量。PLKl在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)，將其表達(dá)水平下調(diào)后可以顯著提高細(xì)胞對(duì)紫杉醇的藥物敏感性，從而可以使用較低濃度的紫杉醇達(dá)到較好的治療效果。用聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物形成的納米顆粒負(fù)載紫杉醇和針對(duì)PLKl的siRNA(見(jiàn)圖9)，作為乳腺癌的治療藥物進(jìn)行給藥，實(shí)現(xiàn)了抗癌藥物與siRNA的協(xié)同作用，在較低藥物濃度條件下，可以有效地抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和乳腺癌腫瘤的生長(zhǎng)。本發(fā)明的藥物載體和本發(fā)明的藥物具有巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，也具有良好的應(yīng)用前景。圖1為mPEG-PCL-PPEEABoc的合成路線圖。圖2為EABoc和PEEABoc的核磁共振譜。圖3為mPEG-PCL大分子引發(fā)劑和mPEG-PCL-PPEEABoc的GPC譜。圖4為mPEG-PCL大分子引發(fā)劑的的^NMR譜。圖5為mPEG-PCL-PPEEABoc和mPEG-PCL-PPEEA的^NMR譜。圖6為芘在不同濃度mPEG-PCL-PPEEA聚合物溶液中的激發(fā)光譜。圖7為mPEG-PCL-PPEEA共聚物所形成的納米顆粒的表征。圖8為mPEG-PCL-PPEEA共聚物所形成的納米顆粒的細(xì)胞毒性。圖9為負(fù)載紫杉醇和siRNA的納米顆粒的示意圖。圖10為負(fù)載siRNA的納米顆粒對(duì)細(xì)胞中PLK1蛋白表達(dá)量的影響。圖11為負(fù)載紫杉醇和siRNA的納米顆粒對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響。圖12為負(fù)載紫杉醇和siRNA的納米顆粒對(duì)裸鼠乳腺癌腫瘤的生長(zhǎng)抑制效果。圖13為不同處理后的裸鼠的腫瘤切片TURNEL染色的照片。圖14為不同處理后的裸鼠的腫瘤切片H&E染色的照片。圖15為不同處理后的裸鼠的器臟與體重相比的結(jié)果。圖16為不同處理后的裸鼠的血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平的檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。N/P指的是納米顆粒的胺基正電荷與siRNA磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷的比值。實(shí)施例中所用原料來(lái)源及處理方法PLK1siRNA的序列如下正義序列5，-UgAAgAAgAUCACCCUCCUUAdTdT-3，反義序列5，-UAAggAgggUgAUCUUCUUCAdTdT-3，N.C.siRNA的序列如下正義序列5，-UUCUCCgAACgUgUCACgUdTdT-3，反義序列5，-ACgUgACACgUUCggAgAAdTdT-3'e-己內(nèi)酯(CL，Acros)，純度^99X，在N2氣氛下用CaH2回流24h，使用前減壓蒸出。聚乙二醇單甲醚(Mn二2000g/mol，mPEG45)，購(gòu)于Aldrich公司，純度^99.5%，使用前用甲苯共沸除水。異辛酸亞錫(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，先用對(duì)二甲苯共沸兩次，然后再減壓蒸餾，收集152t:(2040Pa)的餾分用于聚合反應(yīng)。三氯化磷、乙二醇，使用前重蒸。二氯甲烷，用五氧化二磷回流24h，使用前蒸出。三乙胺，先后用鄰苯二甲酸酐，NaOH和CaH2分別回流24h，使用前蒸出。四氫呋喃，用鈉鉀合金回流，使用前蒸出。乙醚、甲苯用鈉砂回流干燥，均在使用前蒸出。未經(jīng)說(shuō)明的其他試劑直接使用。實(shí)施例1、mPEG-PCL-PPEEA的合成和表征—、2-(N-叔丁氧羰基胺基)乙氧基-2-氧-l，3，2-二氧磷雜環(huán)戊烷(PEEABoc)環(huán)狀磷酸酯單體的合成與表征(—)2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷雜環(huán)戊烷(COP)的合成COP合成路線如圖1(A)所示。合成COP的具體步驟為在300mL3.26mol/L三氯化磷的二氯甲烷溶液中，緩慢加入301mL3.25mol/L乙二醇的二氯甲烷溶液。待滴完后，繼續(xù)反應(yīng)0.5小時(shí)，減壓蒸去溶劑。再連續(xù)兩次減壓蒸出產(chǎn)物后，溶解在苯中，通3天02直到反應(yīng)完全，減壓蒸餾(20Pa)，收集72t:的餾分，得到C0P。(二)N-叔丁氧羰基胺基乙醇(EABoc)的合成和表征合成路線如圖1(B)所示。合成EABoc的具體步驟為在250毫升三口瓶中依次加入6.1克(0.lOmol)乙醇胺、100mL四氫呋喃、100mL超純水，攪拌待其完全溶解后，連續(xù)加入8.4g(0.lmol)碳酸氫鈉和21.8g(0.lmol)二碳酸二叔丁酯。在(TC下反應(yīng)30分鐘后，自然升至室溫反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)液用100mL乙醚萃取2次，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥。減壓下除去溶劑，得到EABoc，產(chǎn)率為95%。對(duì)EABoc進(jìn)行核磁共振氫譜CHNMR)分析，^NMR譜見(jiàn)圖2(A)。由圖2(A)可見(jiàn)，各種質(zhì)子均得到相應(yīng)歸屬，積分比例吻合。(三)2-(N-叔丁氧羰基胺基)乙氧基-2-氧-l，3，2-二氧磷雜環(huán)戊烷(PEEABoc)的合成和表征合成路線如圖1(C)所示。合成PEEABoc的具體步驟為在_5°C的低溫反應(yīng)浴下，將制得的C0P(14.25g，0.lmol)的四氫呋喃(30ml)溶液滴加到EABoc(16.lOg，O.lmol)和三乙胺(10.12g，0.lmol)的四氫呋喃(120ml)溶液中，反應(yīng)過(guò)夜。然后在^保護(hù)下，過(guò)濾以上溶液，將濾液濃縮后，用400mL干燥的冷乙醚沉淀，移去上清液，沉淀物用油泵抽干，即為PEEABoc。對(duì)PEEABoc進(jìn)行核磁共振氫譜CHNMR)和核磁共振碳譜(13C_NMR)分析？HNMR譜見(jiàn)圖2(B)，13C-NMR譜見(jiàn)圖2(C)。從圖2(B)可以觀察到，1.43卯m的單峰為叔丁基的9個(gè)氫核，3.36ppm和4.12ppm的三重峰分別為-0CH2CH2NH-和-0CH2CH2NH-片段上的2個(gè)氫核，4.36卯m的多重峰為磷酸酯環(huán)-0(^2(^20-上的4個(gè)氫核。在圖2(C)中，各種碳的化學(xué)位移已在圖中標(biāo)明。以上的核磁共振譜證明了單體的結(jié)構(gòu)。二、聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物(mPEG-PCL-PPEEA)的合成和表征(—)聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯(mPEG-PCL)大分子引發(fā)劑的合成和表征各種分子量的端羥基聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯大分子引發(fā)劑是以聚乙二醇單甲醚為引發(fā)劑，在本體條件下引發(fā)己內(nèi)酯單體聚合而成。通過(guò)調(diào)節(jié)聚乙二醇單甲醚的分子量以及己內(nèi)酯與聚乙二醇單甲醚的投料比，可以得到不同分子量的聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯聚合物。異辛酸亞錫因其高催化效率及無(wú)毒性，是被最廣泛應(yīng)用的內(nèi)酯及交酯環(huán)狀單體開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)的催化劑，已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)作為食品添加劑。以mPEG45為引發(fā)劑，異辛酸亞錫(Sn(0ct)2)為催化劑制備聚合物，聚合反應(yīng)在手套箱中進(jìn)行，mPEG-PCL合成的具體實(shí)驗(yàn)步驟如下1)將進(jìn)行反應(yīng)的圓底燒瓶經(jīng)多次的抽真空火焰干燥和充氮?dú)獾奶幚砗?，放入手套箱?)按表1的配比進(jìn)行投料向燒瓶中加入mPEG化、CL單體和Sn(0cth，在12(TC攪拌下反應(yīng)。3)反應(yīng)24小時(shí)后，將產(chǎn)物移出手套箱，用少量的CH2C12溶解，將溶液沉淀到冷的乙醚中，反復(fù)兩次，收集沉淀物，用油泵抽干至恒重為止，即得產(chǎn)物。不同投料比可得到不同的產(chǎn)物，如此得到了一系列mPEG-PCL共聚物，見(jiàn)表1。表1不同投料比(摩爾比)合成mPEG-PCL<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>a聚合物右下角的數(shù)字代表聚合物根據(jù)^NMR得到的聚合度對(duì)上述mPEG-PCL共聚物進(jìn)行核磁共振氫譜CHNMR)分析，測(cè)定其聚合度和數(shù)均分子量。用凝膠滲透色譜(GPC〕法以聚苯乙烯為標(biāo)準(zhǔn)分析mPEG-PCL共聚物的數(shù)均分子量和分子量分布PDI(分子量分布寬度指數(shù))。聚合度、數(shù)均分子量和分子量分布PDI見(jiàn)表2。GPC譜見(jiàn)圖3(A)和圖3(B)。丄HNMR譜見(jiàn)圖4。表2mPEG-PCL聚合物的表征<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>aGPC測(cè)定；blHNMR測(cè)定。由表2可見(jiàn)，根據(jù)^NMR計(jì)算結(jié)果，mPEG化-PCL站的數(shù)均分子量為7130g/mol，對(duì)應(yīng)的嵌段PCL4s的數(shù)均分子量為5130g/mol^PEG^-PCL,的數(shù)均分子量為13400g/mol，對(duì)應(yīng)的嵌段PCL，的數(shù)均分子量為11400g/mol。圖3(A)對(duì)應(yīng)mPEG45-PCL45;圖3(B)對(duì)應(yīng)mPEG^-PCL^o從圖中可以看到兩種聚合物呈現(xiàn)的都是規(guī)整的單峰，并具有相對(duì)較窄的分子量分布。圖4(A)對(duì)應(yīng)mPEG45-PCL45;圖4(B)對(duì)應(yīng)mPEG^-PCL^o經(jīng)過(guò)對(duì)比可以看到mPEG45-PCL45和mPEG45-PCL咖具有相似的譜，分析如下字母a到f標(biāo)記了歸屬mPEG-PCL的所有質(zhì)子信號(hào)，聚e-己內(nèi)酯的聚合度通過(guò)4.02卯m的三重峰(歸屬于聚己內(nèi)酯的-C(O)0CH2)與3.63卯m的單峰(歸屬于聚乙二醇單甲醚的_CH2CH2_)的積分面積比計(jì)算得到。(二)聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物(mPEG-PCL-PPEEA)的合成和表征以mPEG-PCL為引發(fā)劑，異辛酸亞錫(Sn(0ct)2)為催化劑制備聚合物，聚合反應(yīng)在手套箱中進(jìn)行。在反應(yīng)前，mPEG-PCL大分子引發(fā)劑用干燥的甲苯共沸兩次，減壓抽干。合成路線如圖1(D)。合成mPEG-b-PCL-b-PPEEABoc的具體步驟如下1)將進(jìn)行反應(yīng)的圓底燒瓶經(jīng)多次的抽真空火焰干燥和充氮?dú)獾奶幚砗螅湃胧痔紫洹?)按表2的比例進(jìn)行投料往25mL燒瓶中加入mPEG-PCL、PEEABoc和THF，保證PEEABoc的起始濃度為lmol/L。在30。C下攪拌30分鐘后，加入Sn(0ct)2。3)反應(yīng)3小時(shí)后，將反應(yīng)液濃縮，在ot:下沉淀到io:i(v/v)的乙醚/甲醇混合溶劑中，過(guò)濾，將固體抽干，即得到mPEG-b-PCL-b-PPEEABoc。4)取lg上述聚合物溶于10mL無(wú)水THF，加入20mL的6MHC1/THF溶液使得HC1最終的濃度為4M。在(TC下攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，將反應(yīng)液濃縮，用冷的乙醚沉淀，過(guò)濾，抽干固體，即得到mPEG-b-PCL-b-PPEEA聚合物。表3不同投料比(摩爾比)合成mPEG-PCL-PPEEABoc聚合物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>a聚合物右下角的數(shù)字代表聚合物根據(jù)^NMR得到的聚合度用凝膠滲透色譜(GPC〕法以聚苯乙烯為標(biāo)準(zhǔn)分析mPEG-PCL-PPEEABoc共聚物的數(shù)均分子量和分子量分布PDI(分子量分布寬度指數(shù))。需要指出，由于脫保護(hù)后的mPEG-PCL-PPEEA很難用GPC表征，所以所列的分子量及分子量分布都是指脫保護(hù)前的mPEG-PCL-PPEEABoc。對(duì)mPEG-PCL-PPEEABoc和mPEG-PCL-PPEEA進(jìn)行核磁共振氫譜CHNMR)分析，測(cè)定其聚合度和數(shù)均分子量。mPEG-PCL-PPEEABoc的聚合度、數(shù)均分子量和分子量分布PDI見(jiàn)表4。mPEG-PCL-PPEEABoc的GPC譜見(jiàn)圖3(C)和圖3(D)。mPEG45-b-PCL-b-PPEEABoc和mPEG45-b-PCL-b_PPEEA的^NMR譜見(jiàn)圖5。表4聚合物的表征<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>aGPC測(cè)定;blHNMR測(cè)定。由表4可見(jiàn)，根據(jù)^NMR計(jì)算結(jié)果，mPEG45-PCL45-PPEEABoc7的數(shù)均分子量為9000g/mol，對(duì)應(yīng)的嵌段PPEEABoc,的數(shù)均分子量為1870g/mol;脫保護(hù)后對(duì)應(yīng)的mPEG45-PCL45-PPEEA7的數(shù)均分子量為6550g/mol，對(duì)應(yīng)的嵌段PPEEA7的數(shù)均分子量為1，420g/mol;mPEG45-PCL，-PPEEABoc^的數(shù)均分子量為16600g/mol，對(duì)應(yīng)的嵌段PPEEABoc12的數(shù)均分子量為3200g/mol;脫保護(hù)后對(duì)應(yīng)的mPEG45-PCL，-PPEEA^的數(shù)均分子量為15840g/mol，對(duì)應(yīng)的嵌段PPEEA12的數(shù)均分子量為2430g/mol。圖3(C)對(duì)應(yīng)mPEG45-b-PCL45-b-PPEEABoc7;圖3(D)對(duì)應(yīng)mPE^-b-PCL，-PPEEABoc『從圖中可以看到聚合物呈現(xiàn)的都是規(guī)整的單峰，并具有相對(duì)較窄的分子量分布。與mPEG-PCL大分子引發(fā)劑(圖3(A)和圖3(B))比較可以看到mPEG-PCL-PPEEABoc聚合物的分子量向高分子量方向移動(dòng)。圖5(A)對(duì)應(yīng)脫保護(hù)前的mPEG45-b-PCL45-b-PPEEABoc7;圖5(B)對(duì)應(yīng)脫保護(hù)后的mPEG45-b-PCL45-b-PPEEA7;圖5(C)對(duì)應(yīng)脫保護(hù)前的mPEGM-b-PCL^-b-PPEEABoc^;圖5(D)對(duì)應(yīng)脫保護(hù)后的mPEG45-b-PCL咖-b-PPEEA『與圖4(A)相比較，圖5(A)和圖5(C)出現(xiàn)了幾個(gè)新的信號(hào)，如在1.401.48卯m處的多峰對(duì)應(yīng)的除PCL鏈段上的e處的亞甲基的質(zhì)子信號(hào)外，明顯多出了聚磷酸酯側(cè)基Boc保護(hù)基團(tuán)上甲基的9個(gè)氫核(j)的質(zhì)子信號(hào)，在4.35ppm處出現(xiàn)的信號(hào)對(duì)應(yīng)于聚磷酸酯主鏈段上_0-CH2-CH2-0-的4個(gè)氫核(g)的峰，在4.20卯m和3.41卯m出現(xiàn)的質(zhì)子峰則歸屬于聚磷酸酯鏈段側(cè)基上的-0_CH2(h)-CH2(i)-NH-的信號(hào)。聚磷酸酯鏈段的聚合度是根據(jù)HNMR圖中在4.35卯m處的聚磷酸酯主鏈上的質(zhì)子(g)積分面積與在3.63ppm處的聚乙二醇主鏈上的質(zhì)子(b)積分面積之比計(jì)算的。這些聚磷酸酯鏈段上特征信號(hào)峰的出現(xiàn)證明了嵌段聚合物的生成。將mPEG^-PCL^-PPEEABoc^三嵌段聚合物在無(wú)水的HC1/THF溶液中反應(yīng)脫去Boc的保護(hù)基團(tuán)，圖5(B)和圖5(D)給出了脫保護(hù)后力-NMR譜圖的變化。從中可以發(fā)現(xiàn)，Boc基團(tuán)上的1.48ppm處的強(qiáng)峰消失，而在8.42ppm處出現(xiàn)了一個(gè)鈍峰，對(duì)應(yīng)于側(cè)鏈胺基的活潑氫，從而證明了脫保護(hù)的成功進(jìn)行，并且從圖中相應(yīng)峰的積分面積計(jì)算己內(nèi)酯和磷酸酯鏈段保持完整，沒(méi)有發(fā)生降解等副反應(yīng)，相應(yīng)鏈段的聚合物均沒(méi)有變化。實(shí)施例2、用mPEG-PCL-PPEEA共聚物制備納米顆粒用實(shí)施例1制備的兩種mPEG-PCL-PPEEA共聚物制備納米顆粒?！⒓{米顆粒的制備兩親性嵌段共聚物在水溶液中存在疏水嵌段的疏水相互作用，只要共聚物濃度高于臨界聚集濃度即可形成納米顆粒。制備納米顆粒的方法有多種，最簡(jiǎn)單常見(jiàn)的就是溶劑揮發(fā)法，具體方法為將10mgmPEG-PCL-PPEEA三嵌段共聚物溶于lmL四氫呋喃中，室溫下攪拌1小時(shí)，然后在攪拌下以60mL/h的速度滴入lOmL超純水，再攪拌兩小時(shí)后，于減壓下抽掉有機(jī)溶劑，定容到10mL，得到lmg/mL的納米顆粒溶液。通過(guò)上述方法分別制備lmg/mL的mPEG45-PCL45_PPEEA7納米顆粒溶液和lmg/mL的mPEG45-PCL1Q。-PPEEA12納米顆粒溶液。二、臨界聚集濃度(CAC)的測(cè)定以芘為熒光探針表征兩親性聚合物的聚集體的臨界聚集濃度是最為常見(jiàn)和有效的方法。將上述配制的lmg/mL的納米顆粒溶液稀釋成一系列濃度，同時(shí)保證每一濃度下芘的濃度保持6X10—^Ql/L不變。固定最大發(fā)射波長(zhǎng)在390nm，掃描芘的激發(fā)光譜。見(jiàn)圖6(A)禾P(B)。圖6為芘在不同濃度mPEG-PCL-PPEEA聚合物溶液中的激發(fā)光譜。圖6(A)為mPEG45-PCL45-PPEEABoc7;圖6(B)為mPEG^-PCL^-PPEEABoc^由圖可見(jiàn)，兩圖的變化趨勢(shì)一致。隨著聚合物濃度的增加，芘探針的熒光光譜發(fā)生了顯著的變化，首先是峰的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，其次是其(O，O)吸收譜帶從336nm紅移到339nm，這些變化是由于芘由水環(huán)境轉(zhuǎn)移至疏水環(huán)境，意味著核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒的形成。結(jié)合上述的激發(fā)光譜，計(jì)算每個(gè)聚合物濃度下339nm和336nm時(shí)峰的強(qiáng)度比，即1339/1336，將一系列的I339/I336對(duì)相應(yīng)的濃度的對(duì)數(shù)作圖，見(jiàn)圖6(C)，圖中的Log特指Logl。。由圖6(C)可見(jiàn)，兩條曲線均呈S型，在低濃度下，聚合物的熒光強(qiáng)度基本穩(wěn)定，當(dāng)達(dá)到一定濃度后，其比值開(kāi)始迅速增大，表明芘選擇性的由水環(huán)境進(jìn)入疏水核中，此時(shí)納米顆粒形成。繼續(xù)增大聚合物濃度時(shí)，熒光強(qiáng)度到達(dá)一個(gè)平臺(tái)，不再增大，這表明共聚物在水中已完全自組裝形成了以聚己內(nèi)酯為疏水核的納米顆粒。CAC值可由水平線與斜線切線的交點(diǎn)確定。利用上述方法求得mPEG45-PCL45-PPEEA7和mPEGM-PCL^-PPEEA^的CAC值分別為3.57X10—3和2.68X10—3mg/mL?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著疏水鏈段聚己內(nèi)酯的增加，聚合物的CMC值減小，表明隨疏水相互作用的增強(qiáng)，聚合物膠束更易形成。CAC的大小直接反應(yīng)了聚合物顆粒在水溶液中的穩(wěn)定性，其值愈小表明組裝顆粒的穩(wěn)定性愈高。本發(fā)明中的聚合物的CAC值與一般的小分子表面活性劑相比，低了近兩個(gè)數(shù)量級(jí)，表明此聚合物較好的穩(wěn)定性。三、納米顆粒的形態(tài)利用透射電子顯微鏡觀察mPEG-PCL-PPEEA共聚物所形成的納米顆粒的形態(tài)。如圖7(A)和圖7(B)所示，圖7(A)對(duì)應(yīng)mPEG45-PCL45-PPEEA7;圖7(B)對(duì)應(yīng)mPEG45-PCL，-PPEEA『由圖可見(jiàn)，兩種mPEG-PCL-PPEEA共聚物所形成的納米顆粒都呈現(xiàn)規(guī)整的球形結(jié)構(gòu)，粒徑約為20nm和60nm且大小分布均一。四、納米顆粒的粒徑和zeta電勢(shì)通過(guò)型號(hào)為MalvernZetasizerNanaoZS90的動(dòng)態(tài)光散射儀檢測(cè)濃度為0.lmg/mL的mPEG-PCL-PPEEA納米顆粒的粒徑與粒徑分布。圖7(C)和圖7(D)分別是聚11合物mPE^-PCl^-PPEE^的粒徑和zeta電勢(shì)的結(jié)果，圖7(E)和圖7(F)分別是聚合物mPEG45-PCL10。-PPEEA12的粒徑和zeta電勢(shì)的結(jié)果。mPEG45-PCL45-PPEEA7納米顆粒的平均直徑為27.7nm，粒徑分散度(PDI)為0.20，zeta電勢(shì)為32.3mV。mPEGM-PCL^-PPEEA^顆粒的平均直徑在121nm，粒徑分散度(PDI)為0.09，zeta電勢(shì)為45mV。需要指明的是，利用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量的粒徑比透射電子顯微鏡的結(jié)果偏大，這主要是因?yàn)閯?dòng)態(tài)光散射測(cè)量的是納米顆粒在水溶液中的流體動(dòng)力學(xué)半徑，而透射電鏡測(cè)量的是納米顆粒在脫水狀態(tài)的粒徑。但是不管哪種測(cè)量方法均顯示上述三嵌段聚合物的納米顆粒都具有均勻的粒徑分布。這些正電荷除了可以穩(wěn)定納米顆粒外，更主要的作用是可以結(jié)合siRNA，起到傳輸siRNA的作用。五、mPEG-PCL-PPEEA納米顆粒的生物相容性將上述配制的lmg/mL的納米顆粒溶液稀釋為1.95-500yg/mL。通過(guò)MTT方法測(cè)定不同濃度mPEG-PCL-PPEEA共聚物納米顆粒的細(xì)胞毒性。具體試驗(yàn)為將不同濃度的mPEG45-PCL45-PEEP7納米顆粒溶液和不同濃度的mPEG^-PCL^-PEEP^納米顆粒溶液分別與HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后，分別測(cè)細(xì)胞存活率，以PEI作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。不同處理下細(xì)胞的存活率見(jiàn)圖8。由圖可見(jiàn)，當(dāng)聚合物濃度從1.95iig/mL增大到500yg/mL，兩種納米顆粒對(duì)細(xì)胞活力都沒(méi)有明顯的影響，細(xì)胞活力一直維持在100%左右，表明上述納米顆粒具有良好的生物相容性。實(shí)施例3、mPEG45-PCL咖-PPEEAu納米顆粒作為siRNA載體的應(yīng)用負(fù)載siRNA藥物的納米顆粒的制備方法如下用實(shí)施例1制備的mPEG45-PCL，-PPEEA^共聚物制備納米顆粒溶液，方法同實(shí)施例2。將一定量的siRNA溶液加入50iiLOpti-MEM中，得到siRNA溶液。將納米顆粒溶液與siRNA溶液混合，室溫靜置20分鐘，得到負(fù)載siRNA藥物的納米顆粒。負(fù)載siRNA藥物的Lipofectamine2000的制備方法如下將一定量的siRNA溶液力口入50iiLOpti—MEM中，得至ljsiRNA溶液。將一定量的Lipofectamine2000加入到適量Opti-MEM中，混勻。將Lipofectamine2000溶液與siRNA溶液混合，室溫靜置20分鐘，得到負(fù)載siRNA藥物的Lipofectamine2000?！?、對(duì)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的作用將MDA-MB-435s細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，TCHu35)以5X105的密度接種于六孔板中24小時(shí)后，分別進(jìn)行如下處理，每個(gè)處理設(shè)置三次重復(fù)處理一用負(fù)載PLKlsiRNA藥物的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，PLKlsiRNA的終濃度為12.5nM，固定N/P為50。處理二用負(fù)載PLKlsiRNA藥物的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，PLKlsiRNA的終濃度為25nM，固定N/P為50。處理三用負(fù)載PLKlsiRNA藥物的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，PLKlsiRNA的終濃度為62.5nM，固定N/P為50。處理四用負(fù)載PLKlsiRNA藥物的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，PLKlsiRNA的終濃度為125nM，固定N/P為50。對(duì)照一用負(fù)載PLK1siRNA藥物的Lipofectamine2000溶液處理細(xì)胞，PLK112siRNA的終濃度為50nM，Lipofectamine2000與PLK1siRNA的質(zhì)量比為3.75。對(duì)照二用PLKlsiRNA溶液處理細(xì)胞，PLK1siRNA的終濃度為125nM。對(duì)照三用N.C.siRNA溶液處理細(xì)胞，N.C.siRNA的終濃度為125nM。對(duì)照四用負(fù)載N.C.siRNA的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，N.C.siRNA的終濃度為125nM，固定N/P為50。對(duì)照五用負(fù)載N.C.siRNA的Lipofectamine2000溶液處理細(xì)胞，N.C.siRNA的終濃度為50nM，Lipofectamine2000與N.C.siRNA的質(zhì)量比為3.75。對(duì)照六用無(wú)菌水處理細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48小時(shí)后，用RNAsimple總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取細(xì)胞中的總RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA樣品的濃度，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，結(jié)果表明對(duì)照六的細(xì)胞內(nèi)的PLK1mRNA表達(dá)量很高；對(duì)照一的細(xì)胞內(nèi)PLK1mRNA表達(dá)量有所降低；四個(gè)處理組中，細(xì)胞中的PLK1mRNA表達(dá)量與對(duì)照六相比有明顯的降低，并且隨著siRNA的用量增加而減少。二、對(duì)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的作用將MDA-MB-435s細(xì)胞以5X105的密度接種于六孔板中24小時(shí)后，分別進(jìn)行如下處理，每個(gè)處理設(shè)置三次重復(fù)處理一用負(fù)載PLKlsiRNA藥物的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，PLKlsiRNA的終濃度為25nM，固定N/P為50。處理二用負(fù)載PLKlsiRNA藥物的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，PLKlsiRNA的終濃度為62.5nM，固定N/P為50。處理三用負(fù)載PLKlsiRNA藥物的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，PLKlsiRNA的終濃度為125nM，固定N/P為50。對(duì)照一用負(fù)載PLKlsiRNA藥物的Lipofectamine2000溶液處理細(xì)胞，PLK1siRNA的終濃度為50nM，Lipofectamine2000與PLK1siRNA的質(zhì)量比為3.75。對(duì)照二用無(wú)菌水處理細(xì)胞。細(xì)胞處理48小時(shí)后，用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液收集后用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定各樣品的蛋白濃度。每個(gè)樣品取50g蛋白，進(jìn)行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDSPAGE)電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白封閉PVDF膜2小時(shí)后，用膜清洗液(溶解0.05%Tween20的PBS)清洗膜兩次，然后用P-actin(Santacruz，Cat:sc-47778)的一抗或者PLK1的一抗(Santacruz，Cat:sc_17783)孵育PVDF膜2小時(shí)，然后用膜清洗液清洗膜兩次后用帶有HRP標(biāo)記的二抗(Santacruz，Cat:SC_2031)孵育膜l小時(shí)。通過(guò)ECL顯色反應(yīng)將蛋白條帶曝光在底片上。結(jié)果見(jiàn)圖10。圖10中，1:對(duì)照二；2:對(duì)照一；3:處理一；4:處理二；5:處理三。結(jié)果顯示對(duì)照二的細(xì)胞中的PLK1蛋白表達(dá)量最高；對(duì)照一的細(xì)胞中的PLK1蛋白表達(dá)量有明顯的下降；處理一、處理二和處理三中的細(xì)胞中的PLK1蛋白表達(dá)量有明顯的下降，并且能夠隨著siRNA的劑量的增加，細(xì)胞中PLK1蛋白的表達(dá)量降低。mPEG45-PCL45-PPEEABoc7作為siRNA載體具有與mPEGM-PCL^-PPEEA^相同的效果。實(shí)施例4、mPEG45-PCL1Q。-PPEEA12納米顆粒作為紫杉醇載體的應(yīng)用—、負(fù)載紫杉醇的納米顆粒的制備紫杉醇通過(guò)溶劑揮發(fā)法包載進(jìn)膠束納米顆粒中，具體操作為將10mg實(shí)施例1制備的mPEG^-PCL，-PPEEA^共聚物溶解在1.0mL四氫呋喃中，然后再向其中加入一定體積的事先溶解于四氫呋喃的紫杉醇溶液(聚合物質(zhì)量紫杉醇質(zhì)量=501000)。將10mL超純水逐滴加入上述溶液中，在室溫下攪拌1小時(shí)后用真空泵將四氫呋喃除掉并且抽去一部分水，當(dāng)剩余2mL液體時(shí)停止抽真空。取出膠束納米顆粒溶液，然后以5000rpm離心除去游離的紫杉醇。二、載藥量和包封率的測(cè)定將包載有紫杉醇的納米顆粒取lmL凍干后用乙腈水=50:50(體積比)的混合溶劑溶解，紫杉醇的包載量通過(guò)HPLC測(cè)定。紫杉醇的載藥量(DLC)和包封率(DLE)由以下公式計(jì)算包載入膠束中的紫杉醇質(zhì)量包封率(DLE)=形成膠束的過(guò)程中加入紫衫醇的質(zhì)量載藥量(DLC)=包載入膠宋中的紫杉醇質(zhì)量X100%包載紫杉醇的膠束質(zhì)量試驗(yàn)設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果為平均值。結(jié)果見(jiàn)表5。當(dāng)嵌段共聚物與紫杉醇的投料質(zhì)量比在50比1與1000比1之間，紫杉醇幾乎沒(méi)有沉淀，包封率(DLE)基本上都在90%以上，如表5所示。在聚合物與紫杉醇的投料比是50:1時(shí)，包封率(DLE)是92.5%，載藥量(DLC)是1.85%;當(dāng)投料比降低到200:1時(shí)，包封率(DLE)提高到94.2%，但載藥量(DLC)下降到0.47%。進(jìn)一步提高投料比到1000:l，包封率(DLE)達(dá)到了95.1%，而載藥量(DLC)只有0.059%。表5負(fù)載紫杉醇的納米顆粒的載藥量和包封率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量以上負(fù)載紫杉醇的納米顆粒的粒徑。通過(guò)Zeta電勢(shì)測(cè)量以上負(fù)載紫杉醇的納米顆粒的表面的電勢(shì)。試驗(yàn)設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果見(jiàn)表6。當(dāng)只有聚合物形成膠束納米顆粒時(shí)，其粒徑在75nm左右，表面電位為51mV左右，當(dāng)聚合物與紫杉醇按照投料比是50:l或者更低時(shí)，所形成的納米顆粒的粒徑為6070nm之間；表面電位在4250mV之間。這說(shuō)明這種嵌段共聚物在包載疏水性藥物時(shí)，對(duì)膠束納米顆粒的粒徑和表面電位性質(zhì)基本上沒(méi)有影響。表6負(fù)載紫杉醇的納米顆粒的粒徑和表面電勢(shì)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>mPEG45-PCL45-PPEEABoc7作為紫杉醇載體具有與mPEG^-PCL^-PPEEA^相同的效果。實(shí)施例5、mPE^-PCL，-PPEEA^納米顆粒作為紫杉醇和siRNA載體的應(yīng)用—、負(fù)載紫杉醇和siRNA的納米顆粒的制備1、納米顆粒的制備用實(shí)施例1制備的mPEG45-PCL咖-PPEEA^共聚物制備納米顆粒溶液，方法同實(shí)施例2。2、負(fù)載紫杉醇的納米顆粒的制備紫杉醇通過(guò)溶劑揮發(fā)法包載進(jìn)膠束納米顆粒中，具體操作為將10mg實(shí)施例1制備的mPEG^-PCL，-PPEEA^共聚物溶解在1.0mL四氫呋喃中，然后再向其中加入一定體積的事先溶解于四氫呋喃的紫杉醇溶液。將lOmL超純水逐滴加入上述溶液中，在室溫下攪拌1小時(shí)后用真空泵將四氫呋喃除掉并且抽去一部分水，當(dāng)剩余2mL液體時(shí)停止抽真空。取出膠束納米顆粒溶液，然后以5000rpm離心除去游離的紫杉醇。3、負(fù)載紫杉醇和siRNA的納米顆粒的制備將一定量的siRNA溶液加入50iiLOpti-MEM中，得到siRNA溶液。將步驟1制備的負(fù)載紫杉醇的納米顆粒溶液與siRNA溶液混合，室溫靜置20分鐘，得到負(fù)載紫杉醇和siRNA的納米顆粒。二、對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響采用3H標(biāo)記的胸腺嘧啶檢測(cè)細(xì)胞增殖。將MDA-MB-435s細(xì)胞以5X105的密度接種于六孔板中24小時(shí)后，分別進(jìn)行如下處理，每個(gè)處理組設(shè)置三個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值處理一用負(fù)載紫杉醇和PLK1siRNA的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，紫杉醇的終濃度為0.1iig/mL，PLKlsiRNA的終濃度為125nM，固定N/P為50(即納米顆粒的濃度為375yg/mL)。處理二用負(fù)載紫杉醇和PLK1siRNA的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，紫杉醇的終濃度為0.Oliig/mL，PLK1siRNA的終濃度為125nM，固定N/P為50(即納米顆粒的濃度為375ug/mL)。處理三用負(fù)載紫杉醇和PLK1siRNA的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，紫杉醇的終濃度為0.005iig/mL，PLK1siRNA的終濃度為125nM，固定N/P為50(即納米顆粒的濃度為375ug/mL)。處理四用負(fù)載紫杉醇和PLK1siRNA的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，紫杉醇的終濃度為0.001iig/mL，PLK1siRNA的終濃度為125nM，固定N/P為50(即納米顆粒的濃度為375ug/mL)。對(duì)照一用負(fù)載紫杉醇的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，紫杉醇的終濃度為0.1g/mL，納米顆粒溶液的終濃度為375iig/mL。對(duì)照二用負(fù)載紫杉醇的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，紫杉醇的終濃度為0.01iig/mL，納米顆粒溶液的終濃度為375g/mL。對(duì)照三用負(fù)載紫杉醇的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，紫杉醇的終濃度為0.005g/mL，納米顆粒溶液的終濃度為375g/mL。對(duì)照四用負(fù)載紫杉醇的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，紫杉醇的終濃度為0.001g/mL，納米顆粒溶液的終濃度為375g/mL。。對(duì)照五用匿SO溶解的紫杉醇處理細(xì)胞，紫杉醇的終濃度為0.1iig/mL。對(duì)照六用匿SO溶解的紫杉醇處理細(xì)胞，紫杉醇的終濃度為0.01iig/mL。對(duì)照七用匿SO溶解的紫杉醇處理細(xì)胞，紫杉醇的終濃度為0.005iig/mL。對(duì)照八用匿SO溶解的紫杉醇處理細(xì)胞，紫杉醇的終濃度為0.001iig/mL。對(duì)照九用納米顆粒溶液處理細(xì)胞，納米顆粒溶液的終濃度為375g/mL。對(duì)照十用負(fù)載PLKlsiRNA的納米顆粒溶液處理細(xì)胞，PLK1siRNA終濃度為125nM。對(duì)照^^一用負(fù)載PLKlsiRNA的Lipofectamine2000溶液處理細(xì)胞，PLK1siRNA終濃度為50nM，Lipofectamine2000與N.C.siRNA的質(zhì)量比為3.75。對(duì)照十二用負(fù)載N.C.siRNA的Lipofectamine2000溶液處理細(xì)胞，N.C.siRNA終濃度為50nM，Lipofectamine2000與N.C.siRNA的質(zhì)量比為3.75。對(duì)照十三用無(wú)菌水處理細(xì)胞。經(jīng)上述處理的MDA-MB-435s細(xì)胞在37°C5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42小時(shí)，然后每孔中加入20iiL含有0.5iiCi3H-TdR(GEHealthcare,Cat:25007364)的PBS，再繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后，用多頭細(xì)胞收集器將每孔培養(yǎng)物分別吸收于直徑24mm的玻璃纖維濾紙上，抽氣過(guò)濾并用蒸餾水充分洗滌。將濾紙片放在8(TC烘干約lh，然后將濾紙片浸于加了10ml脂溶性閃爍液(5.Og2，5-二苯基惡唑(PPO)，O.3g1，4-雙-2-15-苯基惡唑苯(POPOP)溶解于200mL無(wú)水乙醇和800mL甲苯中)的閃爍杯中，置于P-液體閃爍計(jì)數(shù)器中測(cè)定每個(gè)樣品的每分鐘脈沖數(shù)(cpm值)。將各組數(shù)據(jù)取平均值，然后以對(duì)照十三的數(shù)值為100%，其他各組對(duì)其做歸一化處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖ll所示?？梢钥闯鲇肔ipofectamine2000輸運(yùn)PLK1siRNA能夠顯著降低MDA-MB-435s細(xì)胞的增殖能力，而用Lipofectamine2000輸運(yùn)N.C.siRNA對(duì)細(xì)胞的增殖能力沒(méi)有影響。用膠束納米顆粒輸運(yùn)PLK1siRNA能夠抑制MDA-MB-435s細(xì)胞的增殖能力，而膠束納米顆粒對(duì)細(xì)胞的增殖能力沒(méi)有影響。當(dāng)膠束納米顆粒共輸運(yùn)紫杉醇和PLK1siRNA與膠束納米顆粒輸運(yùn)紫杉醇和單獨(dú)的紫杉醇相比，能夠非常顯著的降低MDA-MB-435s細(xì)胞的增殖能力。三、對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制1、原位乳腺癌小鼠腫瘤模型建立16大量培養(yǎng)MDA-MB-435s細(xì)胞，在準(zhǔn)備注射細(xì)胞前用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)細(xì)胞6小時(shí)，然后用胰酶消化，經(jīng)過(guò)1000rpm離心收集細(xì)胞，用PBS重懸細(xì)胞使密度達(dá)到2.5X107cells/mL，然后將200i!L細(xì)胞懸液注射在裸鼠右側(cè)第二個(gè)乳腺中。原位注射乳腺癌細(xì)胞的裸鼠在SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)約IO天左右可以形成可見(jiàn)腫瘤。腫瘤的體積按照公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>計(jì)算，其中a是指腫瘤較長(zhǎng)的直徑，b是指腫瘤較短的直徑。2、載藥納米顆粒對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)的抑制作用研究在裸鼠的腫瘤體積達(dá)到50mm3左右開(kāi)始進(jìn)行治療，將接種了MDA_MB_435s腫瘤的裸鼠按照下述處理方式分為8組，每組6只裸鼠。處理一注射45iiLPBS。處理二注射45iiL溶解60iig泰素《的PBS溶液，作為對(duì)照。處理三注射45iiL納米顆粒的PBS溶液，納米顆粒的濃度為5mg/mL。處理四注射45iiL負(fù)載PLK1siRNA的納米顆粒的PBS溶液，PLK1siRNA的量為80pmol，納米顆粒溶液的濃度為5mg/mL(即N/P為50)。處理五注射45iiL結(jié)合N.C.siRNA的納米顆粒的PBS溶液，N.C.siRNA的量為80pmol，納米顆粒溶液的濃度為5mg/mL(即N/P為50)。處理六注射45iiL溶解3.2ng紫杉醇的PBS溶液。處理七注射45iiL包載紫杉醇的納米顆粒的PBS溶液，紫杉醇的濃度為0.0667iig/mL，納米顆粒溶液的濃度為5mg/mL。處理八注射45iiL負(fù)載紫杉醇和PLKlsiRNA的納米顆粒的PBS溶液，PLKlsiRNA的量為80pmol，紫杉醇的濃度為0.067iig/mL，納米顆粒溶液的濃度為5mg/mL。自裸鼠分組當(dāng)天起，開(kāi)始對(duì)裸鼠進(jìn)行治療，各組溶液注射在腫瘤內(nèi)部。每4天為一個(gè)治療周期，其中前3天進(jìn)行各組注射治療，總共進(jìn)行7個(gè)治療周期。在治療開(kāi)始后，每隔一天對(duì)腫瘤體積測(cè)量一次。圖12顯示了腫瘤體積的變化，圖中的縱坐標(biāo)為測(cè)量得到的腫瘤體積與治療前模型的平均腫瘤體積的比值。從圖中可以看出，PBS、納米顆粒的PBS溶液和結(jié)合N.C.siRNA的納米顆粒PBS溶液對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用。泰素4乍為現(xiàn)在應(yīng)用廣泛的癌癥化療藥物有非常明顯的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用。納米顆粒輸送PLK1siRNA也能比較有效的抑制腫瘤生長(zhǎng)。溶解紫杉醇的PBS溶液和包載紫杉醇的納米顆粒溶液對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用相當(dāng)，但都沒(méi)有PLK1siRNA作用明顯。抑制腫瘤生長(zhǎng)作用最明顯的是同時(shí)輸送紫杉醇和PLK1siRNA的納米顆粒。這證明這種共輸送的體系能夠在很低的化療藥物濃度和siRNA濃度的情況下很好的抑制腫瘤的生長(zhǎng)。完成4個(gè)治療周期的治療后，將裸鼠處死，首先取裸鼠的血以進(jìn)行谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測(cè)量；然后每組中取一只裸鼠進(jìn)行拍照；將腫瘤從裸鼠體內(nèi)取出后先進(jìn)行拍照然后用4%多聚甲醛對(duì)組織進(jìn)行固定，切片后用H&E染色和TUNEL染色。測(cè)量裸鼠體內(nèi)各個(gè)器臟重量和裸鼠重量。從裸鼠腫瘤大小可以明顯地看出經(jīng)納米顆粒同時(shí)輸送紫杉醇和PLK1siRNA的治療組的腫瘤體積明顯小于其他處理組的腫瘤體積。圖13表示各處理組腫瘤組織切片經(jīng)TUNEL染色的結(jié)果。圖13中，A為處理一；B為處理六；C為處理七；D為處理八?？梢郧宄目闯鼋?jīng)PBS處理的腫瘤組織中癌細(xì)胞生長(zhǎng)正常沒(méi)有出現(xiàn)凋亡的癌細(xì)胞，而經(jīng)紫杉醇、納米顆粒輸送的紫杉醇和納米顆粒共同輸送紫杉醇和PLK1siRNA處理的腫瘤組織中都出現(xiàn)了明確的凋亡的癌細(xì)胞區(qū)域，并且經(jīng)納米顆粒共輸運(yùn)紫杉醇和PLKlsiRNA處理的腫瘤組織中凋亡癌細(xì)胞面積最大，治療效果最好。圖14表示各處理組腫瘤組織切片經(jīng)H&E染色的結(jié)果。圖14中，A為處理一；B為處理二；C為處理三；D為處理四；E為處理六；F為處理七；G為處理八?？梢院芮宄目闯鼋?jīng)PBS處理的腫瘤組織中癌細(xì)胞生長(zhǎng)正常，經(jīng)泰素處理的腫瘤組織中癌細(xì)胞已經(jīng)消失，經(jīng)納米顆粒處理的腫瘤組織中癌細(xì)胞生長(zhǎng)也正常，但是其余各處理組的腫瘤組織中均出現(xiàn)不同于正常癌細(xì)胞組織的區(qū)域，為凋亡的癌細(xì)胞區(qū)域，并且經(jīng)納米顆粒共輸運(yùn)紫杉醇和PLKlsiRNA處理的腫瘤組織中凋亡癌細(xì)胞面積最大，說(shuō)明治療效果最好。圖15表示各種處理組的裸鼠的體內(nèi)器臟重量與裸鼠體重的比值，可以看出各種條件的處理對(duì)裸鼠的重要器官?zèng)]有影響。圖16表示各種處理組的裸鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶的濃度變化，經(jīng)過(guò)納米顆粒共同輸送紫杉醇和PLK1siRNA處理的裸鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度與PBS處理組相比，沒(méi)有明顯的升高，在正常的范圍內(nèi)。以上實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明中的共同給藥體系具有很好的腫瘤治療效果，并且沒(méi)有顯示出動(dòng)物體內(nèi)的毒副作用，具有很好的生物相容性和生物安全性。mPEG45-PCL45-PPEEABoc7作為紫杉醇和siRNA載體具有與mPEG45-PCl^。。-PPEEA^相同的效果。18權(quán)利要求一種藥物載體，它的活性成分是聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物形成的帶正電荷的納米顆粒。2.如權(quán)利要求1所述的藥物載體，其特征為所述藥物的活性成分為化學(xué)物質(zhì)。3.如權(quán)利要求2所述的藥物載體，其特征在于所述化學(xué)物質(zhì)包括紫杉醇。4.如權(quán)利要求3所述的藥物載體，其特征在于所述化學(xué)物質(zhì)還包括siRNA。5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的藥物載體，其特征在于所述三嵌段共聚物中，中間嵌段是所述聚己內(nèi)酯，一個(gè)末端嵌段是聚乙二醇單甲醚，另一個(gè)末端嵌段是所述聚磷酸酯;所述聚乙二醇嵌段的聚合度為45，對(duì)應(yīng)的數(shù)均分子量為2000g/mol;所述聚己內(nèi)酯嵌段的聚合度為45-100，對(duì)應(yīng)的數(shù)均分子量為5，130-11，400g/mol;所述聚磷酸酯嵌段的聚合度為7-12，對(duì)應(yīng)的數(shù)均分子量為1，420-2，430g/mol。6.如權(quán)利要求5所述的藥物載體，其特征為所述三嵌段共聚物為mPEG45-PCL45-PPEEA7或mPEG45-PCLi。。-PPEEA『7.—種治療癌癥的藥物，它的活性成分是由聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯負(fù)載抗癌藥物形成的納米顆粒。8.如權(quán)利要求7所述的藥物，其特征在于所述抗癌藥物為化學(xué)物質(zhì)；所述化學(xué)物質(zhì)包括紫杉醇和/或siRNA。9.如權(quán)利要求7或8所述的藥物，其特征在于所述三嵌段共聚物中，中間嵌段是所述聚己內(nèi)酯，一個(gè)末端嵌段是聚乙二醇單甲醚，另一個(gè)末端嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇嵌段的聚合度為45，對(duì)應(yīng)的數(shù)均分子量為2000g/mo1;所述聚己內(nèi)酯嵌段的聚合度為45-100，對(duì)應(yīng)的數(shù)均分子量為5，130-11，400g/mol;所述聚磷酸酯嵌段的聚合度為7_12，對(duì)應(yīng)的數(shù)均分子量為1，420-2，430g/mol。10.如權(quán)利要求9所述的藥物，其特征為所述三嵌段共聚物為mPEG^-PCl^-PPEEA7或mPEG45-PCL，-PPEEA^;所述癌癥為乳腺癌。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種藥物載體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的藥物載體，活性成分是聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物形成的帶正電荷的納米顆粒。本發(fā)明還提供了治療癌癥的藥物，它的活性成分是由聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯負(fù)載抗癌藥物形成的納米顆粒。聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物是生物相容性的陽(yáng)離子型兩親性嵌段共聚物，在水溶液中自組裝形成具有疏水性核并帶有正電荷的納米顆粒，具有良好的穩(wěn)定性，制備方法簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，可將疏水性抗癌藥物包載進(jìn)其疏水性內(nèi)核中，可和帶負(fù)電的siRNA結(jié)合；從而形成同時(shí)輸運(yùn)抗癌藥物和siRNA的給藥體系。本發(fā)明的藥物載體和本發(fā)明的藥物具有巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，也具有良好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A61P35/00GK101766817SQ200810246720公開(kāi)日2010年7月7日申請(qǐng)日期2008年12月26日優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日發(fā)明者孫天盟,杜金志,王均申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)