專利名稱：：同種異體脫鈣骨基質(zhì)材料納米dbm的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物材料
技術(shù)領(lǐng)域：
，是一種骨移植用同種異體脫鈣骨基質(zhì)材料納米DBM的制備方法。技術(shù)背景骨移植手術(shù)是臨床中僅次于輸血的常見組織移植術(shù)，各種原因造成的骨缺損的修復(fù)是骨科醫(yī)生所需要面對的一個難題。另外，隨著對疾病認(rèn)識程度的加深外科技術(shù)的發(fā)展，脊柱外科、神經(jīng)外科等對骨移植的需求也越來越大。近10年來，骨移植替代物的研究是脊柱外科領(lǐng)域的熱點之一。目前應(yīng)用的骨移植替代材料主要有自體骨、異體骨和合成材料三類。理想的骨移植物應(yīng)具備以下三個基本特點1、含有骨誘導(dǎo)因子，可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化；2、含有骨傳導(dǎo)基質(zhì)，有利于骨修復(fù)過程中血管的長入，提供三維的立體骨架可引導(dǎo)骨修復(fù)朝一定的方向進行；3、含有骨生成細(xì)胞，有利于骨生成。自體骨因同時具備上述特點而至今仍是植骨融合的金標(biāo)準(zhǔn)，但是存在供骨量有限、延長手術(shù)時間、增加患者創(chuàng)傷以及供骨區(qū)長期麻木、疼痛等缺陷。合成性材料主要為羥基磷灰石(HydroxyapatiteHA)、磷酸三鈣(TricalciumPhosphateTCP)、硫酸鈣(CalciumSulfateCS)、聚乳酸(PolylacticacidPLA)或這些材料的復(fù)合物。人工合成材料與自體骨、異體骨相比具有無毒、易于滅菌以及取用量無限制等優(yōu)勢，但其最大的缺陷是不具備骨誘導(dǎo)因子和骨生成細(xì)胞，僅具有骨傳導(dǎo)性，易碎、剪切力小、抗骨折性能差。異體骨移植的優(yōu)勢在于良好的骨傳導(dǎo)性，經(jīng)過特定方法處理還可以保留骨誘導(dǎo)性，但其免疫排斥反應(yīng)始終未得到根本解決，且可能導(dǎo)致細(xì)菌或病毒感染。有一種由同種異體骨經(jīng)特殊處理后制成的脫鈣骨基質(zhì)(DemineralizedBoneMatrix，DBM)，采用改良Urist法制備，步驟為1.取材將新鮮同種異體骨剔除骨膜和所有軟組織并劈成骨塊，刮除骨髓，用無菌凈化水沖洗干凈，置無水乙醇脫水、乙醚脫脂，通風(fēng)干燥后置-80'C冰箱凍干備用。2.脫脂將上述骨塊依次浸泡于無水乙醇、乙醚脫脂后，用蒸餾水反復(fù)沖洗去盡乙醚和溶解的油脂；3.脫鈣以0.6N鹽酸浸泡72小時，浸泡過程中不斷攪拌，每12小時更換鹽酸溶液一次，使所有的骨組織充分脫鈣；用蒸餾水沖洗并蒸餾水浸泡過夜；充分去除骨塊內(nèi)的鹽酸；將骨塊依次浸泡于無水乙醇、乙醚脫脂后，置通風(fēng)處自然揮發(fā)殘余乙醚；4.干燥、消毒將上述骨塊置37。C恒溫干燥箱內(nèi)干燥，三次稱量恒重后將其分裝密封；再用C(^照射消毒，照射劑量為20KGy。即為DBM骨塊。[詳見ReddiAH，HugginsC.Biochemicalsequencesinthetransformationofnormalfibroblastsinadolescentrats.ProcNatlAcadSciUSA,1972,69:1601-1605.]DBM同時具有骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)作用，且具有天然骨的組成成分，可以作為許多生長因子的天然載體，具有良好的生物學(xué)特性，因此在植骨融合術(shù)中的應(yīng)用得到深入研究。但DBM作為骨移植替代物還存在如下不足l.分批處理時存在骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)性能差異；2.雖然DBM的抗原性較弱，但在少數(shù)受體內(nèi)會表現(xiàn)出嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)而最終導(dǎo)致骨移植的失??；3.生物力學(xué)性能較差，不適合用于需要承受重力和其他應(yīng)力的部位。這使得DBM的使用范圍大大減小。近年來納米技術(shù)的突破性進展，對生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了巨大影響。納米技術(shù)可大大改善生物材料的表面特性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，使生物材料的生物學(xué)性能大大提高，將納米技術(shù)應(yīng)用于骨移植材料的研究已成為這一領(lǐng)域的研究熱點。但至今未見運用納米技術(shù)制成同種異體納米脫鈣骨基質(zhì)材料(簡稱納米DBM)成功用于骨移植的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種成骨誘導(dǎo)性及傳導(dǎo)性好、抗原性低、可隨意塑形的同種異體骨移植替代材料納米DBM的制備方法。本發(fā)明納米DBM的制備方法，是在改良Urist法制備同種異體DBM骨塊的基礎(chǔ)上，進一步在液氮內(nèi)超細(xì)研磨。步驟如下1)制備DBM骨塊采用改良Urist法按常規(guī)制備同種異體DBM骨塊；2)制備DBM粉末將上述DBM骨塊置于液氮冷凍粉碎機，在液氮的液面保持在稍高于研磨球的情況下進行預(yù)粉碎，得DBM粉末；3)制備納米DBM:將上述DBM粉末置于超細(xì)研磨粉碎機內(nèi)，力卩入適量蒸餾水，在17。C25t:下進行研磨，轉(zhuǎn)速由800r/min升至1200r/min，充分研磨后將勻漿進行高速離心，棄上清液，得納米DBM。本發(fā)明方法制得的納米DBM呈灰白色，經(jīng)電鏡檢測，粒徑為50100nm，表面稍粗糙，有不規(guī)則納米溝槽。納米DBM質(zhì)地均勻、堅韌，有一定延展性，可任意塑形。將其塑形為所需形狀和大小的骨移植物后置37t:恒溫干燥，密封包裝，用Cc^照射消毒后備用。動物實驗表明，鑒于納米材料的特性，本發(fā)明制備方法制得的納米DBM具有良好的生物相容性和植骨融合效果，是一種良好的骨移植替代材料。采用本發(fā)明制備的納米DBM在以下方面顯著改善了DBM性能1)納米DBM可按需要隨意塑形，塑形干燥后所得任意形狀的納米DBM能滿足臨床上不同部位特殊形狀的植骨需求；2)應(yīng)用納米技術(shù)構(gòu)建DBM，可大大減少因DBM自身脫鈣所帶來的生物力學(xué)下降的后果，更能滿足臨床上植骨的力學(xué)要求；3)納米DBM表面的不規(guī)則的納米溝槽，對成骨細(xì)胞在其表面黏附生長及基質(zhì)分泌有更顯著的促進作用，4)納米DBM有更良好的生物相容性，無毒、無刺激，不引起免疫排斥反應(yīng)。本發(fā)明制備方法簡便，以同種異體骨為原料，取材容易，可滿足臨床需要；所制得的納米DBM可隨意塑形，其作為骨移植替代材料使用方便；具有納米結(jié)構(gòu)的DBM材料，生物相容性好，不引起免疫排斥反應(yīng)，從而解決了臨床骨移植替代材料骨融合效果不佳的難題；其可作為如骨形態(tài)發(fā)生蛋白等外源性促進骨再生生長因子的良好載體，具有良好的促進骨再生能力。具體實施方式現(xiàn)結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述。實施例1:制備兔納米DBM1、采用改良Urist法制備兔DBM骨塊，步驟如下1)取材新西蘭家兔1只(第二軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供，下同)，按常規(guī)取新鮮兔骨100g，剔除骨膜和所有軟組織并劈成骨塊，刮除骨髓后用無菌凈化水反復(fù)沖洗，置無水乙醇脫水2h，乙醚脫脂lh，通風(fēng)處過夜干燥后，將骨塊置-8(TC冰箱凍干備用；2)制備DBM骨塊(1)脫脂依次將上述骨塊浸泡于100ml無水乙醇2小時，去乙醇；加乙醚100ml浸泡12小時，去乙醚；用蒸餾水沖洗3次，去盡乙醚和溶解的油脂；(2)脫鈣將脫脂后的骨塊以0.6N鹽酸100ml浸泡72小時，浸泡過程中不斷攪拌，每12小時更換鹽酸溶液一次，以保證所有的骨組織充分脫鈣；將骨塊取出后用蒸餾水沖洗5次，再用蒸餾水浸泡過夜，以充分去除^^塊內(nèi)的鹽酸；(3)脫水、干燥、消毒將上述骨塊依次置于無水乙醇100ml浸泡2小時，去除乙醇，置于乙醚100ml浸泡1小時，去乙醚，將其置于通風(fēng)處自然揮發(fā)殘余乙醚;再將其置37。C恒溫干燥箱內(nèi)干燥，三次稱量恒重，得DBM骨塊24g，將其分裝密封，再按常規(guī)用Cc^照射消毒后備用。3)制備DBM粉末將上述DBM骨塊與進口鋼質(zhì)研磨球一同放入液氮冷凍球磨粉碎機的容器內(nèi)。將液氮充入容器內(nèi)直至液面稍高于研磨球，以800RPM進行研磨2小時，同時保持液氮液面始終稍高于研磨球，得DBM粉末備用。2、制備納米DBM:將上述DBM粉末置于超細(xì)研磨粉碎機(MICROS)內(nèi)，加入適量蒸餾水進一步研磨粉碎，轉(zhuǎn)速和研磨時間依次為①800r/min，5min;②1000r/min，10min;③1200r/min,10min;1200r/min,15minX10次；MICROS初始研磨溫度為17t:，工作中最高溫度為25。C，研磨時由循環(huán)水進行冷卻降溫。研磨結(jié)束后將勻漿進行高速離心(7500r/min)，取得納米DBM沉淀，電鏡掃描放大100020000倍，可見納米DBM直徑為50100nm，表面略粗糙，有不規(guī)則納米溝槽。將沉淀塑形成長條形后置于37t:恒溫干燥箱進行干燥，使甩(:06()照射消毒備用。實施例2:制備小鼠納米DBM小鼠20只(第二軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供，下同)，雌雄不限，體重2530g。按常規(guī)取骨50g，采用改良Urist法制備同種異體DBM骨塊并制成納米DBM，方法同實施例l，得納米DBM12g。納米DBM生物相容性實驗l.急性毒性實驗1)制備小鼠納米DBM浸提液將實施例2制備的條狀納米DBM放入無菌生理鹽水中，在37'C恒溫水浴箱中持續(xù)浸泡120h(材料重量與浸提介質(zhì)容量的比例為0.1g/ml)，得浸提液。2)動物實驗取健康成年小鼠10只，雌雄不限，體重2530g，隨機分為實驗組和對照組，每組5只，實驗組腹腔內(nèi)注射浸提液(50ml/kg體重)，對照組腹腔內(nèi)注射生理鹽水(50ml/kg)。實驗前后均用市售飼料飼養(yǎng)，觀察注射后24、48、72h小鼠的精神狀態(tài)、反應(yīng)靈敏度、活動量、進食量、體重變化。結(jié)果見表l。表4納米DBM急性毒性實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表1可見，實驗組5只小鼠，均未死亡，無癱瘓、呼吸抑制等反應(yīng)，進食、活動、反應(yīng)等一般情況良好，體重?zé)o明顯變化，與對照組相比無明顯差異，說明納米DBM無毒。2.熱原實驗1)制備兔納米DBM浸提液用實施例1制備的條狀兔納米DBM制備浸提液，方法同急性毒性實驗。2)動物實驗取新西蘭家兔3只，雌雄不限，體重2.32.7kg，測納米DBM浸提液注射前后體溫。注射前體溫測試用電子體溫計測家兔肛溫，每小時檢測1次，連續(xù)4次，體溫在38.6。C39.rC，且最大溫差《0.4。C，符合要求，正常飼養(yǎng)至第7天，再次測肛溫2次，兩次的間隔時間為l小時，取6次體溫的平均值為正常體溫。注射后體溫測試:第7天測體溫后，分別從家兔耳緣靜脈推注預(yù)熱至37°C的DBM浸提液，注射劑量為每公斤體重10ml(10ml/kg)，飼養(yǎng)條件同前，于注射后前3小時內(nèi)每小時測肛溫1次，共3次，以3次中最高的一次體溫減去正常體溫，為該家兔的體溫升高度數(shù)。結(jié)果見表2。表5納米DBM熱原實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表2可見，家兔體溫升高在0.210.35t:，根據(jù)中國衛(wèi)生部"生物材料和醫(yī)療器材生物學(xué)評價技術(shù)要求"，符合熱原檢測規(guī)定，說明納米DBM無致熱作用。3.溶血試驗O制備稀釋兔血靜脈抽取新西蘭家兔血5ml，加2%草酸鉀0.25ml抗凝，吸出4ml加至0.9%生理鹽水5ml中進行稀釋，即為稀釋兔血；2)溶血實驗實驗組取條狀納米DBM材料1份約5g，浸泡于含有10ml生理鹽水的試管內(nèi)，37。C水溫中維持30min，然后加入0.2ml稀釋兔血，緩慢混合，置37。C水浴60min;陰性對照組取3只試管，每只試管中加10ml生理鹽水，再加入0.2ml稀釋兔血，置37。C水浴60mim陽性對照組取3只試管，每只試管中加10ml蒸餾水，再加0.2ml稀釋兔血，輕輕振動，使之完全溶血，置37。C水浴60min;將上述各組的試管分別以2000r/min離心5分鐘，取上清，再用分光光度計于波長545nm測吸光度，陰性和陽性對照組各取3只試管測得的平均值。溶血程度按以下公式計算溶血程度=(實驗組吸光度-陰性對照組吸光度)/(陽性對照組吸光度-陰性對照組吸光度)X100。/。。結(jié)果見表3。表6納米DBM體外溶血試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表3可見，納米DBM浸提液對體外新鮮兔血溶血率為3.76%，在允許范圍內(nèi)(3%5%)，說明納米DBM無溶血作用。納米DBM的植骨融合效果實驗l.模型制作取新西蘭家兔18只，雌雄不限，體重2.53.0kg，隨機分成納米DBM組、DBM組、自體骨組3組，每組6只。麻醉前家兔禁食、禁水12小時，所有動物手術(shù)操作過程相同。用氯胺酮肌肉注射麻醉，劑量為每公斤體重50mg(以下用50mg/kg表示)。將家兔俯臥位固定于兔板上，術(shù)區(qū)常規(guī)剃毛、消毒鋪無菌單，肌肉注射160萬單位青霉素。按常規(guī)腰椎后正中縱向依次切開皮膚、皮下組織，沿棘突骨膜下向兩側(cè)剝離椎旁肌，顯露雙側(cè)椎板和關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)。將椎板、小關(guān)節(jié)和橫突表面去皮質(zhì)準(zhǔn)備植骨床，三組分別植入納米DBMlg、DBMlg、自體骨lg，逐層縫合切口。傷口不包扎。術(shù)后肌肉注射青霉素80萬單位/日，連續(xù)3天。手術(shù)前后所有家兔均單獨分籠，允許自由活動，市售兔飼料喂養(yǎng)。2.影像學(xué)觀察術(shù)后2周、4周、8周、12周分別按常規(guī)拍攝腰椎正、側(cè)位X片及腰椎CT平掃。結(jié)果如下術(shù)后2周，納米DBM、DBM、自體骨三組X片均見植骨區(qū)高密度影，CT掃描見植骨區(qū)高信號影，成骨量少，植骨塊與椎板有明顯間隙，尚未融合。三組無明顯差異。術(shù)后4周，X片顯示納米DBM、DBM和自體骨3組植骨區(qū)密度均較2周時增高，CT掃描見植骨區(qū)有部分成骨，植骨塊與椎板間隙較模糊，但納米DBM組較DBM組及自體骨組成骨量稍多。術(shù)后12周，X片可見納米DBM、DBM及自體骨三組均取得骨性融合，但納米DBM組與其它兩組相比，融合骨塊大、質(zhì)地均勻、密度高。說明納米DBM融合效果更好。3.組織學(xué)觀察術(shù)后4周、12周時，每組各隨機抽取3只家兔，心臟內(nèi)空氣注射處死，切取椎板、關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)、橫突和新形成的骨塊制作標(biāo)本，脫鈣切片后進行HE染色。顯微鏡下觀察結(jié)果表明，術(shù)后4周時，納米DBM組和自體骨組可見新生骨和纖維骨痂形成，DBM組僅見纖維骨痂形成。12周時三組均達到骨性連接，但納米DBM組新生骨中較其他兩組具有更多的骨細(xì)胞。結(jié)果表明，本發(fā)明制備的納米DBM材料有良好的生物相容性和植骨融合效果，是一種更理想的骨移植替代材料。權(quán)利要求1.一種同種異體脫鈣骨基質(zhì)材料納米DBM的制備方法，步驟如下1)采用改良Urist法按常規(guī)將新鮮同種異體骨制成DBM骨塊；2)將DBM骨塊置于液氮冷凍粉碎機預(yù)粉碎，得DBM粉末；3)制備納米DBM將DBM粉末置于超細(xì)研磨粉碎機內(nèi)，加入適量蒸餾水，溫度保持在17℃～25℃，轉(zhuǎn)速由800r/min升至1200r/min，充分研磨后將勻漿進行高速離心，棄上清液，得納米DBM，干燥、分裝、密封、消毒即可。2.按權(quán)利要求1所述的脫鈣骨基質(zhì)材料納米DBM的制備方法，其特征在于用超細(xì)研磨粉碎機研磨時，轉(zhuǎn)速和研磨時間依次為①800r/min，5min;②1000r/min，10min;③1200r/min，10min;④1200r/min，15minX10次。3.權(quán)利要求1或2所述方法制得的納米DBM在制備骨移植替代物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及生物材料
技術(shù)領(lǐng)域：
，是一種骨移植用同種異體脫鈣骨基質(zhì)材料納米DBM的制備方法。其步驟為1)采用改良Urist法按常規(guī)將新鮮同種異體骨制成DBM骨塊；2)將DBM骨塊置于液氮冷凍粉碎機預(yù)粉碎，得DBM粉末；3)制備納米DBM將DBM粉末置于超細(xì)研磨粉碎機內(nèi)，加入適量蒸餾水，在17℃～25℃下進行充分研磨，將研磨后所得的勻漿進行高速離心，棄上清，得納米DBM，塑形、干燥后消毒備用。本發(fā)明制備方法簡便，以同種異體骨為原料，取材容易；因為本方法制得的DBM為納米結(jié)構(gòu)，其作為骨移植替代材料，生物相容性好，可作為如骨形態(tài)發(fā)生蛋白等外源性促進骨再生生長因子的良好載體，具有良好的促進骨再生能力。文檔編號A61L27/00GK101401974SQ20081020252公開日2009年4月8日申請日期2008年11月11日優(yōu)先權(quán)日2008年11月11日發(fā)明者嚴(yán)望軍,雷房,巍朱,賈連順,將邵,列錢,陳雄生,凱黃申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)