專利名稱：：木通皂苷d及其組合物在制備防治老年癡呆藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的涉及不同純度的木通皂苷D在制備預(yù)防和治療老年癡呆癥的組合物中用途。
背景技術(shù)：
：老年癡呆癥分為阿爾茨海默病(簡稱AD,全文同)、血管性癡呆(簡稱VD，全文同)和混合型癡呆(簡稱MD，全文同)等。AD患者大腦的改變以腦普遍萎縮，神經(jīng)元和神經(jīng)突觸丟失，神經(jīng)斑塊(老年斑SP)沉積和含有tau蛋白的神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)為特征。因此，能使神經(jīng)元再生(如海馬區(qū)神經(jīng)元再生)、阻止神經(jīng)遞質(zhì)(如乙酰膽堿)降低以及對抗e-淀粉樣蛋白造成的損傷(如以e-淀粉樣蛋白(Ae)沉積為核心的老年斑及e-淀粉樣蛋白在腦軟膜小血管壁上沉積)均有可能對AD的治療有一定的作用。AD患者大腦的神經(jīng)化學(xué)改變主要為膽堿能功能減退，皮質(zhì)和海馬廣泛區(qū)域乙酰膽堿活性降低，膽堿能神經(jīng)元及纖維變性、壞死和缺失。腦內(nèi)ChAT活性及Ach含量降低被公認(rèn)是AD的一個重要特征。膽堿的缺失是AD的特征，臨床曾嘗試采用多種藥物提高病人腦內(nèi)乙酰膽堿的水平以補償其膽堿能功能的缺失，來達到治療AD的目的。目前最為成熟和成功的治療AD的方法就是是采用AchE抑制劑，迄今為止，AchE抑制劑是唯一類通過美國FDA批準(zhǔn)用于治療AD的藥物。膽堿酯酶抑制劑通過減少突觸間隙處膽堿酯酶對突觸前神經(jīng)元釋放的乙酰膽堿的水解，增加了此處乙酰膽堿的含量，因此對AD有一定療效。但是膽堿酯酶抑制劑只能延緩患者癥狀(日常生活能力、冷漠、焦慮、抑郁和幻覺等精神癥狀)出現(xiàn)的時間，而不能逆轉(zhuǎn)疾病過程。膽堿酯酶抑制劑的主要副反應(yīng)是胃腸道反應(yīng)(惡心、嘔吐、腹瀉、食欲不振)，它與劑量有關(guān)，在大多數(shù)情況下緩慢增加劑量可緩解這一副反應(yīng)。對體重過輕的患者，胃腸道反應(yīng)可能會限制該類藥物的使用。心血管副反應(yīng)(心動過緩、暈厥)不常見，但有竇性心動過緩或其他室上性傳導(dǎo)阻滯的患者應(yīng)慎用；應(yīng)注意所有用膽堿酯酶抑制劑的患者都有可能發(fā)生暈厥，包括沒有心臟病史或心電圖異常的患者。膽堿能藥物都有刺激神經(jīng)肌肉接頭的作用，可導(dǎo)致肢體末端肌肉痙攣，這種痙攣通常與劑量有關(guān)，而且是一過性的。其它少見的副作用是失眠和抑郁加重，采用早上服藥可減輕失眠的副作用，用膽堿酯酶抑制劑前先治療抑郁可減輕抑郁加重的副作用。血管性癡呆是由于腦血管因素導(dǎo)致腦循環(huán)障礙、腦組織受損引起的一種記憶力衰退以及至少1項認(rèn)知功能(即語言、視空間、定向力或抽象思維)減退的疾病。VD多發(fā)生于高血壓、動脈硬化、糖尿病基礎(chǔ)之上。VD患者90%有腦內(nèi)多發(fā)、雙側(cè)分布的梗塞灶,以大腦皮質(zhì)下基底節(jié)區(qū)最易受累,梗塞灶小造成的神經(jīng)癥狀可輕微，但多發(fā)梗塞可使皮質(zhì)下白質(zhì)傳導(dǎo)纖維多處斷裂,部分神經(jīng)通路中斷。額葉皮質(zhì)血流顯著降低，可能就是由于深部白質(zhì)^變引起投射纖維功能聯(lián)絡(luò)中斷所致。有研究證明:微小梗塞灶除引起實際病灶區(qū)血流降低、功能低下外,還可以通過中斷神經(jīng)聯(lián)絡(luò)導(dǎo)致遠隔部位的血流降低、功能低下。由此可見VD是在廣泛動脈粥樣硬化基礎(chǔ)上,全腦血流下降、腦實質(zhì)多發(fā)小灶性缺血改變和特定皮質(zhì)神經(jīng)傳導(dǎo)功能缺失的結(jié)果。此外，VD組顳葉皮質(zhì)血流降低,與其臨床上表現(xiàn)嚴(yán)重記憶力減退一致,其原因可能是顳葉內(nèi)側(cè)部如海馬也存在梗塞病變。臨床上采取可以治療動脈粥樣硬化，改善血液循環(huán)的藥物進行治療VD。但該類西藥副作用明顯，會產(chǎn)生鼻塞、惡心和胃腸不適，且有心臟疾病的患者不能服用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是研究不同純度的木通皂苷D在制備預(yù)防和治療老年癡呆癥的組合物中用途。為解決上述問題，提供技術(shù)方案如下。不同純度的木通皂苷D在制備預(yù)防或治療老年癡呆組合物中的應(yīng)用。所述不同純度的木通皂苷D含量5-100%;優(yōu)選純度的木通皂苷D含量80~100%。所述老年癡呆包括阿爾茨海默病、血管性癡呆和混合型癡呆。所述組合物包括不同純度的木通皂苷D與藥學(xué)上可接受的載體或者常規(guī)食用輔料。本發(fā)明還包括不同純度的木通皂苷D與其它具有活血化瘀或改善記憶或提高免疫力的藥物混合在制備預(yù)防或治療老年癡呆組合物中的應(yīng)用。所述具有活血化瘀或改善記憶或提高免疫力的藥物選自以下物質(zhì)中的一種或多種丹參酮、葛根素、槲皮素、華中五味子酮、靈芝多糖、三七總皂苷、石杉堿甲、白藜蘆醇、紅景天素、蛇床子素、川芎嗪。所述具有活血化瘀或改善記憶或提高免疫力的藥物選自以下物質(zhì)中的一種或多種銀杏葉、楮實、遠志、紫河車、紅花、桃仁、石蒼蒲及它們提取物。本發(fā)明用對神經(jīng)元的再生、乙酰膽堿酯酶的抑制以及對AP25-35所致的細胞損傷的保護作用等方法，篩選出不同純度的木通皂苷D用于制備預(yù)防或治療AD組合物，該組合物對血管性癡呆(VD)和混合型癡呆(MD)也有一定預(yù)防和治療作用。本發(fā)明包括用不同純度的木通皂苷D與藥學(xué)上可接受載體混合。藥學(xué)上可接受的載體包括口服制劑輔料或胃腸外途徑給藥的輔料。給藥途徑可以是口服、注射、局部給藥等。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，該組合物可以是口服制劑或注射用制劑，其中口服制劑包括膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、口服液、片劑、滴丸等。所用輔料包括淀粉、蔗糖、乳糖、糖粉、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、異丙醇、吐溫-80、甘油、丙二醇、微晶纖維素鈉、糊精、環(huán)糊精、氯化鈉、維生素C、半胱氨酸、檸檬酸、硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉、硬脂酸鹽和明膠等常規(guī)輔料，制劑的后期制備工藝及設(shè)備均屬制藥領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明對此不作限定，故在此不予詳述。本發(fā)明組合物口服給藥的劑量為2-3次/天，0.150.45g/次。本發(fā)明還包括不同純度的木通皂苷D與其它具有活血化瘀或改善記憶或提高免疫力的藥物混合，制備預(yù)防或治療老年癡呆的藥物。例如將不同純度的木通皂苷D與選自銀杏葉、楮實、遠志或紫河車及它們提取物中的一種或多種進行組配，用本領(lǐng)域常規(guī)方法，制備預(yù)防或治療老年癡呆的組合物，可以加入常規(guī)載體，制成各種制劑。再如將不同純度的木通皂苷D與選自丹參酮、葛根素、槲皮素、華中五味子酮、靈芝多糖、三七總皂苷三七總皂苷、石杉堿甲、白藜蘆醇、紅景天素、.蛇床子素中的一種或多種進行組配，用本領(lǐng)域常規(guī)方法，制備預(yù)防或治療老年癡呆的組合物，可以加入常規(guī)載體，制成各種制劑。本發(fā)明不同純度的木通皂苷D提取物是從天然的中藥續(xù)斷中提取得到的,續(xù)斷是常用的中草藥,具有補肝腎的作用，有長期的中醫(yī)用藥經(jīng)驗，該藥使用安全性高，上無毒性作用記載。不同純度的木通皂苷D有抗老年癡呆活性，都有促進神經(jīng)元的再生、抑制乙酰膽堿酯酶以及對AP25-35所致的細胞損傷的保護作用，這些藥理作用協(xié)調(diào)產(chǎn)生顯著的預(yù)防或治療抗老年癡呆藥效。實施例一不同純度的木通皂苷D的制備不同純度的木通皂苷D的提取、分離取lkg續(xù)斷藥材，粉碎成米粒大小，用95%的乙醇水浴回流提取3次，每次分別為2、1.5、1小時，每次加入乙醇的量分別為10、9、8倍量(藥材乙醇W:V)。取第2次提取液1000ml，水浴減壓回收乙醇至小體積，直接干燥，得第6份含木通皂苷D的樣品，其木通皂苷D純度為5%(含量測定方法見下)。提取液過濾，合并，水浴減壓回收乙醇至小體積(每1公斤藥材約得濃縮液750ml)，得濃縮液。濃縮液取出50ml，直接干燥，得第5份含木通皂苷D的樣品，即純度為22%的木通皂苷D(含量測定方法見下)。濃縮液用石油醚萃取脫脂，直至石油醚無色。脫脂后的濃縮液取出50ml，直接干燥，得第4份含木通皂苷D的樣品，即純度為44%的木通皂苷D(含量測定方法見下)。脫脂后的濃縮液用稀鹽酸(IN)調(diào)pH3-4，每1公斤藥材的酸化濃縮液用IOL氯仿分次萃取，合并萃取液，用稀氫氧化鈉液(1N)中和氯仿萃取液至pH7。水浴減壓回收氯仿近干，得第3份含木通皂苷D的樣品，即純度為62%的木通皂苷D(含量測定方法見下)。將第3份含木通皂苷D的樣品約5g，拌入1.5g硅膠，上樣到200g的100-200目的硅膠柱上，用不同比例的氯仿-甲醇系統(tǒng)洗脫，約在氯仿-甲醇=8:2處，得第2份含木通皂苷D的樣品，即純度為8"/。木通皂苷D(含量測定方法見下)。將第2份含木通皂苷D的樣品，經(jīng)ODS柱分離，用甲醇-水系統(tǒng)洗脫，約在甲醇-水=6:4處，得第l份樣品，即純度為卯。/。的木通皂苷D。含量測定方法見下。純度為100%的木通皂苷D的樣品，為中檢所提供的標(biāo)準(zhǔn)品。附不同純度的木通皂苷D的含量測定儀器型號采用Anglientll00S高效液相色譜儀。按照《中國藥典》九五年版一部WD項下規(guī)定進行高效液相色譜法測定。色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗色譜柱為AichromBond-lC18;流動相為0.1%TFAH2O:0.1%TFACH3CN=71:29;流速為0.8ml/min;柱溫30。C，測定波長為215nm;理論板數(shù)按木通皂甙D計算不低于3000。對照品溶液的制備精密稱取105'C干燥至恒重的木通皂甙D對照品適量，加甲醇溶液制成每lml中含200pg的溶液，即得。供試品溶液的制備取本品內(nèi)容物20mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加甲醇溶液30ml，置8(TC水浴中加熱30分鐘，趁熱超聲20分鐘，取出，冷卻至室溫，用甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45um濾膜濾過，即得。測定分別精密量取25pl的對照品(木通皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品購于北京藥品生物制品檢定所)和樣品液，分別注入液相色譜柱，測定峰面積，計算含量，即得。精密度實驗、重現(xiàn)性實驗、加樣回收率實驗結(jié)果均符合要求。含量測定結(jié)果:第1份樣品木通皂苷D含量為100%;第2份樣品木通皂苷D含量為81%;第3份樣品木通皂苷D含量為62%;第4份樣品木通皂苷D含量為44%;第5份樣品木通皂苷D含量為22W;第6份樣品木通皂苷D含量為5。/。。實施例二不同純度的木通皂苷D對膽堿酯酶抑制作用膽堿(ChE)的缺失是AD的特征之一。抑制膽堿酯酶的活性可以減少膽堿的缺失，從而減輕或者緩解AD的癥狀。乙酰膽堿酯酶(AchE)分布于神經(jīng)細胞、紅細胞和血清等組織中；乙酰膽堿酯酶(BuChE)主要分布于神經(jīng)組織、血漿等中。因此采用人血來篩選膽堿酯酶抑制劑，可以為臨床提供更有效的制劑。1、儀器與材料CP225D型天平(德國Sartorius公司)，HP8453紫外一可見分光光度6計(美國惠普公司)，LG10-2.4A離心機(北京醫(yī)用離心機廠)，恒溫水浴(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。磷酸二氫鉀(廣州化學(xué)試劑二廠)，磷酸氫二鈉，(廣州化學(xué)試劑二廠)，0.9%Sodiumchlorideinjection(廣東利泰藥業(yè)有限公司)，Acelythiocholineiodide(>98%)(SIGMA公司)，S-Butyrlthiocholineiodide(>98%)(SIGMA公司)，DTNB[5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoicacid)即5，5'—二硫代雙2-硝基苯甲酸](SIGMA公司)，全血、血清(自身采血)。膽堿酯酶DTNB比色法測定。膽堿酯酶水解乙酰硫代膽堿生成硫代膽堿和乙酸。硫代膽堿和巰基顯色劑5,5'—二硫代雙2-硝基苯甲酸反應(yīng)，生成黃色化合物5-巰基一2-硝基苯甲酸(TNBA)，在412nm波長下比色定量。2、試劑配帝U:67mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBSPH7.40)配制稱取無水磷酸二氫鉀(KH2P04)9.07g，用去離子水溶解并稀釋至1L(甲液)；稱取磷酸氫二鈉(Na2HP04*12H20)23.87g，用去離子水溶解并稀釋至1L(乙液)。取甲液19.2ml與乙液80.8ml混和即得。25mol/L碘化乙酰膽堿(ASch)溶液配制稱取ASch(生物試劑)72.3mg,置于10ml容量瓶中，加入145mol/L氯化鈉溶液溶解并稀釋至刻度。3%SDS溶液的配制取3.0g十二垸基硫酸鈉，置于100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度。5mmol/LDTNB溶液培植稱取5,5'—二硫代雙2-硝基苯甲酸19.8g，力卩67mmol/L(PH7.40)PBS約2ml使完全溶解，再用145mol/L氯化鈉溶液稀釋至10ml，置冰箱中保存。臨用時，用145mol/L氯化鈉溶液稀釋10倍。供試藥物樣品液的配制稱取不同純度的木通皂苷D(純度分別為100%、81%、62%、44%、22%和5%)，以及陽性對照銀杏葉提取物(純度55%),分別置于容量瓶中，用含0.1%二甲基亞砜雙蒸水溶解并定容至刻度，得lxl0Qmg/ml、lxl0"mg/ml、lxl(T2mg/ml的供試藥物樣品液，0.2pm濾膜過濾除菌，并于4X:保存，備用。使用時預(yù)先除菌的無血清MEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)不同純度的木通皂苷D都有促進神經(jīng)元再生、抑制乙酰膽堿酯酶生成以及對八025.35所致的細胞損傷的保護作用，具有較強抗AD活性，本發(fā)明并不僅限于上述六份樣品。本發(fā)明實施例二、三、四中，僅列出從六個純度的木通皂苷D樣品，是為了說明不同純度的木通皂苷D都有抗AD活性，只要木通皂苷D的純度在5^以上，都有促進神經(jīng)元的再生、抑制乙酰膽堿酯酶以及對Ae25-35所致的細胞損傷的保護作用，都可用于制備抗AD藥物，但最優(yōu)純度為100%。紅細胞的制備取血5ml置于含有EDTA的抗凝管中，在2000r/min下離心20min后吸取出血漿和淡黃色層，紅細胞沉淀加10倍體積的生理鹽水充分洗滌后以3000r/min離心20min，棄上清液，重復(fù)洗滌3次后，紅細胞沉淀加等量的生理鹽水混勻，使成約50%混懸液，備用。血漿的制備同上法制備。各種實驗樣品液對乙酰膽堿酯酶抑制率的測定分別取備用的紅細胞混懸液或血漿0.2ml，加入67mmol/LPBS150ml制成每1.5ml中含有2pl紅細胞PBS溶液備用。取1.5ml上述紅細胞或血漿PBS溶液，加入適量供試藥物樣品液，使之含藥濃度為10—、1(^和l(T3mg/ml，混勻，置于37t:水浴上孵育5min后，依次加入預(yù)溫的DTNB溶液和ASch溶液各0.5ml，對照管中以等量的生理鹽水代替ASch。立即渦旋混勻后，置于37'C水浴中準(zhǔn)確孵育6min，立即放入冰浴中終止反應(yīng)。放入4000rpm的離心機中離心15分鐘，以蒸餾水為空白，取上清液在412nm處測定OD值。各藥物對乙酰膽堿酯酶抑制率計算公式以酶抑制率為指標(biāo)評價各組分對酶的抑制情況，酶的抑制率可用下列公式計算/0/0=0￡>脂—叫(其中OD^。為不加藥的吸光度，o",為加藥后的吸光度，OZ^為空白對照的吸光度。3.乙酰膽堿酯酶抑制實驗3.1不同純度的木通皂苷D紅細胞膜上乙酰膽堿酯酶的抑制作用詳見表1。表l、不同純度的木通皂苷D對紅細胞膜上AChE抑制率(I土SD，n=3)樣品樣品濃度mg/ml1X10"1X10-21X10-3空閂組2.12±0.03銀杏葉提取物34.72±0.9269.01±0.8339.24±0.63含100%木通皂苷0樣品63.60±0.%85.40±0.9354.90±3.18含81先木通皂苷D樣品45.93±5.4185.18±0.9450.84±6.73含62%木通皂苷0樣品40.65±1.5080.30±1.0547.46±3.49含44%木通皂苷D樣品34.36±5.3173.44±0.7243.55±10.75含22%木通皂苷D樣品26，27±4.8262.02±1.1832.56±7.34含5%木通皂苷0樣品25,08±2.8453.34±2.7821息6.59由表1可知，不同純度的木通皂苷D樣品給藥濃度在1Xl(T、lX10—s時，對紅細胞膜上乙酰膽堿酯酶均有抑制作用。但是樣品液對乙酰膽堿酯酶抑制的最佳濃度為1X10一2。3.2不同純度的木通皂苷D對血漿中乙酰膽堿酯酶的抑制作用，詳見表2。表2、不同純度的木通皂苷D對血漿中AchE的抑制率8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表2可知，不同純度的木通皂苷D樣品給藥濃度在1X10—LlX10—3時，對血漿中乙酰膽堿酯酶均有抑制作用。但是各組樣品液對血漿中乙酰膽堿酯酶抑制的最佳濃度為ixio一不同純度的木通皂苷D樣品對紅細胞膜上乙酰膽堿酯酶、對血漿中乙酰膽堿酯酶均有抑制作用，可以對腦癡呆(AD)產(chǎn)生治療作用。實施例三不同純度的木通皂苷D樣品對Ap25-35誘導(dǎo)的Pd2細胞損傷的保護作用e-淀粉樣蛋白(Ae)在腦組織及血管周圍異常沉積形成老年斑是AD的一個重要的病理學(xué)特征，A3是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。PCu細胞是腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系，具有神經(jīng)元細胞的諸多特征，成為研究神經(jīng)元細胞常用的細胞模型，是研究AD發(fā)病機制的較為理想的細胞模型，該模型也可以用來進行治療VD藥物的藥效學(xué)考察。因此我們采用P-淀粉樣蛋白對PC12細胞造模來考察各種藥物對A卩25.35誘導(dǎo)的PC^細胞損傷的保護作用。MTT(3-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,四甲基偶氮唑鹽)比色微量分析是一種檢測細胞生長和存活的靈敏方法,重復(fù)性好?；罴毎€粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶(LDH)可將黃色的MTT還原為藍紫色結(jié)晶物,而死亡細胞則無此功能。通過測定光密度即可反映細胞活性。細胞膜通透性的改變是細胞損傷的一個共同的特征，神經(jīng)細胞損傷程度與LDH釋放量成正比,故測定培養(yǎng)液中LDH活性可作為反映細胞損傷的一種敏感且較為簡便的指標(biāo)。儀器與材料Ap25.35(Sigma-AWrich公司，純度大于99%)，PC^細胞(武漢大學(xué)細胞說庫)，MTT(sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基(高糖)(Hyclone產(chǎn)品)，20%小牛血清(杭州四季青公司)，青霉素、硫酸鏈霉素(石家莊石藥集團產(chǎn)品)，20。/。牛血清白蛋白(BSA)(上海伯奧生物科技有限公司)。超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)，NU2600E型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Precision公司)，TGL-166A型高速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，LD5-2A型臺式高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)，勻漿器(上海實驗儀器廠)，MODELS960型酶標(biāo)儀(MetertechInc公司)，XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)，酶標(biāo)儀(Bio-RadModel550MicroplateReaderJapan)。A卩誘導(dǎo)PCi2細胞大鼠嗜鉻細胞瘤株P(guān)C,2細胞，用含5%牛血清及5%馬血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素鈉200ku七'1，鏈霉素100mg丄"，PH7.4)調(diào)整細胞密度為2"06，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100pl，并分成空白組、模型組和藥物組，每組6孔。放置于C02孵箱中，在37'C，5。/。C02條件下用DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，待其長滿后即可用于實驗。吸去細胞液，然后向模型組和藥物治療組加入老化的A(325-35造模，換上含有相應(yīng)濃度O.lmmol七"的無血清DMEM(正常組不含任何藥物)。37°C，5%C02條件下培養(yǎng)48小時，吸去培養(yǎng)液，每孔加入含0.5g丄"MTT1(^1的無血清DMEM，培養(yǎng)4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔加入10。/。的二甲基亞砜(DMSO)約15(Hil，待藍色顆粒完全溶解，用酶標(biāo)儀檢測。供試藥物的配制稱取不同純度的木通皂苷D(純度分別為90%、81%、62%、44%、22%和5%)，陽性對照銀杏葉提取物(純度55%)分別置于容量瓶中，用含0.1。/。二甲基亞砜雙蒸水溶解并定容至刻度，得lxl()Gmg/ml、lxlO"mg/ml、lxl(^mg/ml的供試藥物樣品液，0.2(jm濾膜過濾除菌，并于4'C保存，備用。使用時預(yù)先除菌的無血清MEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以S士sd表示，使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P《0.05認(rèn)為有顯著性差異。3.實驗結(jié)果3.1不同濃度八(325.35對？(:12細胞的毒性作用表3、不同濃度Ap25-35對PC!2細胞毒性作用(n=6)A卩25-35—組別OD±SD(pmol/L)正常對照0.854±0.236模型300.149±0.065*250.209±0.061*200.328±0.119*100.612±0.15950.836±0.354*與正常組比較，從表3可以看出，隨著八(325.35濃度增大，OD值減小，說明OD值與AP25.35濃度呈依賴關(guān)系。并且通過統(tǒng)計學(xué)分析，當(dāng)AP25.35濃度大于20umol/L時，其OD值低于正常對照組，差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(尸<0.01)，表明細胞受到損傷或部分細胞巳死亡，說明在給予AP25-35>20umOl/L時造模成功。結(jié)論造模時采用A(325.35的濃度應(yīng)大于30umol/L。3.2不同純度的木通皂苷D樣品對Ap25-35誘導(dǎo)的PQ2細胞損傷的保護作用由表4可見，與正常組比較，模型組(PO.01)的OD值顯著的降低，說明給予30umol/L的八|325.35誘導(dǎo)的PC,2細胞AD模型建立成功。與模型組比較，純度為100%、81%、62%和44%的木通皂苷D樣品組(PO.01)均能極顯著提高OD值，說明上述4組藥物在濃度IXlO—Vg/ml時具有對抗八(325.35對Pd2毒性的極顯著性作用(P<0.01)。純度為22°/。和5%的木通皂苷D樣品組(PO.05)均能顯著提高OD值，說明上述2組藥物在濃度1X10—^g/ml時具有對抗八&25.35對？<:12毒性的顯著性作用(P<0.05)。表4、不同純度的木通皂苷D對AP25—35誘導(dǎo)的PQ2細胞損傷的保護作用(n=6)組別藥物濃度mg/mlA卩25-35(f_imol/L)①空白對照組——--0.553±0.069②模型組300.250±0.038AA③銀杏葉提取物300.424±0.035*含9fm木通皂苷D樣品1X10-2300.548±0.031**含81%木通皂苷D的樣品1X10-2300.537±0.049**含62%木通皂苷0的樣品1X10-2300.528±0.039**⑦含44%木通皂苷D的樣品1X10-2300.515±0.038**⑧含22%木通皂苷D的樣品1Xl(T'300.436±0.041*⑨含5呢木通皂苷D的樣品300.402±0.034*注與正常組比較，^表示代0.01:與模型組比較，*表示代0.05,**表示代0.01。實驗結(jié)果表明，純度為100%、81%、62%和44%的木通皂苷D樣品組藥物1X10—2mg/ml濃度和純度為22%和5%木通皂苷D樣品組藥物1X10"mg/ml濃度時能顯著對抗八卩25.35對PC12的毒性作用。實施例四木通皂苷D與其他化合物的組合物樣品對Ap25-35誘導(dǎo)的PC12細胞損傷的保護作用實驗原理、儀器與材料、A卩誘導(dǎo)PC12細胞的方法、統(tǒng)計分析等同實施例三。供試藥物的配制稱取木通皂苷D(純度90%)、分別與丹參酮、葛根素、槲皮素、五味子酮、靈芝多糖、三七總皂苷、石杉堿甲、白藜蘆醇、紅景天素、蛇床子素、川芎嗪(購買自植物提取物制造商)或銀杏葉、楮實、遠志、紫河車、紅花、桃仁、石蒼蒲提取物提取物(實驗室自制)組成l:1的混合物共18份，分別置于容量瓶中，用含0.1%二甲基亞砜雙蒸水溶解并定容至刻度，得lxl00mg/ml、lxlO-lmg/ml、lxl0-2mg/ml的供試藥物樣品液，0.2pm濾膜過濾除菌，并于4'C保存，備用。使用時預(yù)先除菌的無血清MEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。表5、木通皂苷0及其組合物對八|325.35誘導(dǎo)的？(:12細胞損傷的保護作用(n=6)組別藥物濃度mg/mlA卩25-35((jmol/L)±SD(1〉空白對照組----0.553±0.069(2)模型組300.250±0.038AA(3)銀杏葉提取物1Xl(T2300.498±0.031**(4)木通皂苷D+丹參酮1X10-2300,513土0.028林(5)木通皂苷D+葛根素1X10-2300.516±0.034**(6)木通皂苷D+槲皮素1Xio-2300.527±0.037**(7)木通皂苷D+白藜蘆醇1X10—1300.425±0.043*(8)木通皂苷D+蛇床子素1X10-1300.413±0.033*(9)木通皂苷D+石杉堿甲1X10-1300.517±0.028林鵬木通皂苷D+紅景天素1xio-1300.531±0.032**(ll)木通皂苷D+三七總皂苷1X10-1300.421±0.023*似木通皂苷D+川芎嗪1xio-1300.518±0.031**微木通皂苷D+銀杏葉提取物1Xl(T1300.426±0.034*(14)木通皂苷D+遠志提取物1X10-1300.412±0.029*(15)木通皂苷D+紅花提取物300.519±0.027**(抑木通皂苷D+桃仁提取物1xio-1300.415±0.013*(1T)木通皂苷D+石菖蒲提取物1xio-1300.431±0.038*(18)木通皂苷D+紫河車提取物1X1(T1300.419±0.023*鵬木通皂苷D+靈芝多糖1xio-1300.520±0.017**(加木通皂苷D+五味子酮300.421±0.032*較，*表示尺0.05，**表示代0.01。實施例五不同純度的木通皂苷D樣品對Ap25.35誘導(dǎo)原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護作用儀器與材料DMSO(Sigma-Aldrich公司)，MTT(Sigma-Aldrich公司)，|3淀粉樣肽25.35[(卩Amyloidpeptidefragment25-35,A|325.35)Sigma-Aldrich公司]，小牛血清(杭州四季青生物工程公司，020615)，DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBCO公司)，多聚賴氨酸(第一軍醫(yī)大學(xué)試劑中心)，青霉素(河南新鄉(xiāng)華星藥廠，020410C),鏈霉素(大連美羅大藥廠生產(chǎn)(20010324)，胰酶(上海生工進口分裝，1299A77),LDH試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)。出生3日以內(nèi)的SD大鼠(清潔級，合格證號2000A020,由南通醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)。25cm2培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)，96孔板(美國Corning公司)，5410水套式C02培養(yǎng)箱(美國NAPCO公司)，MODEL2960型酶標(biāo)儀(MeterechInc生產(chǎn))，XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)，電子分析天平(德國DennerInc)。原代大鼠皮層神經(jīng)元的分離(采用差速貼壁法分離原代神經(jīng)元)取新生3天以內(nèi)的SD大鼠，碘酒涂布皮膚消毒，再浸入75%的酒精中脫碘約1分鐘，將消毒好的動物放入超凈臺，以剪刀剪掉頭部，用無齒鑷小心分離頭皮、顱骨，取出大腦，剝離出皮層。將取出的皮層轉(zhuǎn)移到平皿內(nèi)，用吸管吸取一定的PBS液沖洗掉附著在皮層上的血跡，再將干凈的皮層組織移至另一平皿中，加入少量PBS液，以眼科剪充分剪碎組織約20分鐘。然后收集組織糜液至一青霉素藥瓶中，加入適量胰酶，37'C消化組織約30分鐘后，加入DMEM高糖培養(yǎng)液(內(nèi)含10%小牛血清、青霉素及鏈霉素各100000U/L)以終止胰酶的消化作用，200目篩網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)800rpmX5min離心，棄上清液，加入DMEM培養(yǎng)液至5ml體積，移入到經(jīng)多聚賴氨酸處理過的25cW培養(yǎng)瓶里，37'C約30分鐘，以使纖維細胞先行貼擘。30分鐘后將液體轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)液體體積并進行細胞計數(shù)為8X105個/ml，再將細胞接種于多聚賴氨酸處理過的96孔板內(nèi)，定時換液。AP25.35的"老化"處理將一定量的無菌雙蒸水注入到凍干Ap25.35中，配制成200nmmol/L的儲備液，置于37卩下至少7天，臨用前用DMEM稀釋，加入培養(yǎng)孔中，終濃度為30nmmol/L。供試藥物的配制不同純度的木通皂苷D(純度分別為100%、81%、62%、44%、22%和5%),陽性對照為銀杏葉提取物(純度55%)，分別置于容量瓶中，用含0.1%二甲基亞砜雙蒸水溶解并定容至刻度，得lxl0Vg/ml、lxlO"mg/ml、lxl(^mg/ml的供試藥物樣品液，0.2pm濾膜過濾除菌，并于4'C保存，備用。使用時預(yù)先除菌的無血清MEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。AD細胞模型的建立及藥物處理SD大鼠原代皮層神經(jīng)元接種于96孔板，以含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液、5。/。C02培養(yǎng)箱、37。C培養(yǎng)7天，將細胞分成以藥物溶液換液。然后向模型組及藥物治療組加入終濃度為20nmol/L的"老化"的A(325-35造模，24小時后以藥物溶液為藥物組換液，繼續(xù)加入Ap25-35，維持48小時后開始測試。該模型同樣適用于治療VD藥物的篩選。MTT比色每孔加入0.5%的MTT10nl繼續(xù)培養(yǎng)4小時，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲亞砜(DMSO)200nl/L，待顆粒溶解后置于酶標(biāo)儀上，在570nm的波長下檢測各孔的吸光度。與正常組比較，模型組(P<0.01)的OD值顯著的降低，說明給予30umol/L的Ap25.35造成的原代大鼠皮層神經(jīng)元的損傷(PO.01)AD模型建立成功。與模型組比較，純度為100%、81%、62M和44義的木通皂苷D樣品組藥物(P0.01)均能極顯著提高OD值，說明上述4組藥物在濃度lXl(^mg/ml時具有對抗A(325-35造成的原代大鼠皮層神經(jīng)元的損傷(P<0.01)的極顯著性作用(PO.Ol)。純度為22%和5%的木通皂苷D樣品組藥物(PO.05)均能顯著提高OD值，說明上述2組藥物在濃度1X10"mg/ml時具有對抗A(325-35造成的原代大鼠皮層神經(jīng)元損傷的顯著性作用(P<0.05)。表6、各藥物組對AP25-35誘導(dǎo)原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護作用結(jié)果(n=6)組別藥物濃度mg/mlAP25—M(umol/L)±SD①空白對照組--0.723±0.089②模型組300.312±0.022AA③含10(W木通皂苷D樣品1X1(T2300.578±0.036**④含8W木通皂苷D的樣品1X1(T2300.565±0.025林⑤含62%木通皂苷D的樣品1X10-2300.548±0.038**⑥含44%木通皂苷D的樣品IXl(T2300,527±0.031林⑦含22%木通皂苷D的樣品1X10"300.465±0.036*⑧含5%木通皂苷D的樣品1X10-1300.433±0.024*⑨銀杏葉提取物1X1(T1300.454±0.031*注與正常組比較，^表示代0.01;與模型組比較，*表示代0.05，**表示/><0.01。實驗結(jié)果表明，純度為100%、81%、62%和44%的木通皂苷D樣品組藥物在1Xl(T2mg/ml的濃度時、純度為22%和5%木通皂苷D樣品組藥物在1X10"mg/ml的濃度時，對AP25-35誘導(dǎo)原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護作用具有顯著性(分別為代0.05)。實施例六14木通皂苷D對血管性癡呆大鼠血液流變學(xué)的影響1.1材料1.1.1動物SD健康大白鼠50只，雌雄兼半,體質(zhì)量200250g,實驗條件下自然飲食，適應(yīng)環(huán)境1周后進行實驗。1.1.2藥物木通皂苷D(純度為90%)樣品按照實施例1進行制備;陽性對照喜德鎮(zhèn)(天津華津制藥廠與北京諾華制藥有限公司合作生產(chǎn),批號070371)。1.1.3試劑水合氯醛、肝素。1.L4儀器手術(shù)剪(直、彎)、微動脈夾、顯微手術(shù)鑷、尼龍線、手術(shù)縫線、縫合針、靜脈采血針、孔巾、手術(shù)固定板、肝素鈉抗凝管、采血針、美國LBY-N6A旋轉(zhuǎn)式黏度劑。1.2方法1.2.1VD動物模型的建立根據(jù)改良線栓法制成MCA0模型，大鼠10%水合氯醛腹腔注射(0.35mL/100g)麻醉后,將其仰臥固定，以絡(luò)合碘消毒頸部皮膚，行頸部右側(cè)切口，于胸骨舌骨肌與胸骨甲狀肌分離出右頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)及頸外動脈(ECA)并掛線備用，結(jié)扎ECA與CCA,用微動脈夾夾閉ICA遠心端后，迅速于ECA與ICA分叉處作一切口，從切口處插入一端加熱成光滑球形尼龍線(直徑為0.25咖,距球端2cm處作標(biāo)記)。線插入ICA后，于入口處稍稍結(jié)扎尼龍線與入口處ICA段,然后松開夾閉ICA的動脈夾,繼續(xù)插入尼龍線至稍有阻力后略回撤,至線插入深度為1822,左右,造成大腦中動脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。再次結(jié)扎入口處尼龍線外留約3cm，縫合皮膚。2h后輕輕提拉所留線頭至有阻力，實現(xiàn)大腦中動脈再灌，則造模完成。正常組大鼠不作任何處理。1.2.2動物分組取造模成功的大鼠隨機分為模型組、木通皂苷D組和喜德鎮(zhèn)組各10只，假手術(shù)組只結(jié)扎ECA與ICA，另設(shè)正常組。木通皂苷D組給藥按40mg/(kgd)灌胃；喜德鎮(zhèn)組給予喜德鎮(zhèn)灌胃0.625mg/(kgd);正常組、假手術(shù)組、模型組均給予蒸餾水1mL/d體重灌胃；術(shù)后第1天即用藥,每曰灌胃1次。連續(xù)給藥28d后，進行心臟采血測定相應(yīng)指標(biāo)。1.2.3血液流變學(xué)指標(biāo)水合氯醛(0.35mL/100g)麻醉，將大鼠固定于手術(shù)板上，觸及心臟搏動最強處，于一次性靜脈釆血針插入心臟,接肝素抗凝管,送入實驗室,4h內(nèi)實驗完畢，所用儀器為LBY-N6A自清洗旋轉(zhuǎn)式黏度計,將數(shù)據(jù)輸入計算機記錄。2.結(jié)果木通皂苷D組、喜德鎮(zhèn)組全血黏度高切、中切、低切及血漿黏度均較模型組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.01)。木通皂苷D組全血黏度高切、中切、低切及血漿黏度均比喜德鎮(zhèn)組低,且中切黏度、低切黏度及血漿黏度喜德鎮(zhèn)組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.05)。結(jié)果見表7。表7、木通皂苷D對大鼠全血黏度及血漿黏度的影響(mPa.s,n-lO,I±SD)組別全血粘度血漿粘度高切中切低切正常組4.80±0.575.59±0.539.72±0.681.13±0.09假手術(shù)組5.53±0,62"5.97±0.56"13.11±1.30"1.25±0.16模型組8.86±0.64*10.60±0.8316.65±0.99A1.64±0.92喜得鎮(zhèn)組5.87±0.68"6.97±0.43"12.86±0.94"1.26±0.11，木通皂苷D組(90W5.61±0.49"5.71±0.48*11.63±0.71"1.12±0.11*注與模型組比較女P〈0.01;與正常組比較AP〈0.05由表7可知，木通皂苷D可以降低VD模型大鼠的全血和血漿黏度，對血管性癡呆有一定的治療作用。權(quán)利要求1、木通皂苷D在制備預(yù)防或治療老年癡呆組合物中的應(yīng)用。2、權(quán)利要求1的應(yīng)用，所述木通皂苷D的純度為5%—100%。3、權(quán)利要求1的應(yīng)用，所述木通皂苷D的純度為80%—100%。4、權(quán)利要求l的應(yīng)用，所述老年癡呆包括阿爾茨海默病、血管性癡呆和混合型癡呆。5、權(quán)利要求l的應(yīng)用，所述組合物包括不同純度的木通皂苷D與藥學(xué)上可接受的載體或者常規(guī)食用輔料。6、不同純度的木通皂苷D與其它具有活血化瘀或改善記憶或提高免疫力的藥物混合在制備預(yù)防或治療老年癡呆組合物中的應(yīng)用。7、權(quán)利要求6的應(yīng)用，所述具有活血化瘀或改善記憶或提高免疫力的藥物選自以下物質(zhì)中的一種或多種丹參酮、葛根素、槲皮素、華中五味子酮、靈芝多糖、三七總皂苷、石杉堿甲、白藜蘆醇、紅景天素、蛇床子素、川芎嗪。8、權(quán)利要求6的應(yīng)用，所述具有活血化瘀或改善記憶或提高免疫力的藥物選自以下物質(zhì)中的一種或多種銀杏葉、楮實、遠志、紫河車、紅花、桃仁、石蒼蒲及它們提取物。全文摘要不同純度的木通皂苷D用于制備預(yù)防或治療老年癡呆的組合物，可與藥學(xué)上可接受載體混合。文檔編號A61P25/28GK101669960SQ20081019603公開日2010年3月17日申請日期2008年9月11日優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日發(fā)明者楊中林申請人:中國藥科大學(xué)