專利名稱：復合生物材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生物醫(yī)學應用的人工骨、牙科材料和再生支架 (scaffold)領(lǐng)域，尤其涉及包含膠原蛋白、磷酸轉(zhuǎn)材料和一種或多種糖 胺聚糖的人工骨、牙科材料和再生支架及其前體。
背景技術(shù)：
天然骨是膠原蛋白、包括糖胺聚糖的非膠原蛋白有機相和磷酸鈣的 生物復合體。其復雜的層級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了出色的機械性能，包括高的硬度、 強度和斷裂韌度，從而使骨能夠承受日?；顒铀a(chǎn)生的生理應力。本領(lǐng) 域的研究人員面臨的挑戰(zhàn)是，如何使合成材料的組成和結(jié)構(gòu)允許天然骨 可以生長在人體或動物體中的合成材料里面和周圍。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，骨通過人體環(huán)境中形成的骨狀磷灰石層直接連接到人體 中的磷酸鈣上(稱為生物活性的性能)。另一方面，已知膠原蛋白和包含 膠原蛋白和例如糖胺聚糖等其它生物有機物質(zhì)的共聚物是多種細胞附著 和增殖的最佳基質(zhì)，所述細胞包括人體中負責骨的生成和修復的那些細 胞。
羥磷灰石是最通常用作骨替代材料的成分的磷酸鈣。但是，與例如 透轉(zhuǎn)磷石、磷酸三鈣和磷酸八鈣等其它形式的磷酸鈣材料相比，羥磷灰 石是較難溶的材料。由于該材料在人體中的再吸收速率特別低，所以當 制備生物材料時，磷灰石的較低的溶解度是不利的。
例如羥磷灰石等磷酸鈣是機械硬度高的材料。但是，與天然骨相比， 它們較脆。膠原蛋白是機械韌性高的材料，但是與天然骨相比，它具有 較低的硬度。包含膠原蛋白和糖胺聚糖的共聚物的材料比單獨的膠原蛋 白具有更高的韌性和硬度，但是，與天然骨相比，仍然具有較低的硬度。 在現(xiàn)有技術(shù)中，在制備機械韌性超過羥磷灰石且硬度超過膠原蛋白 和膠原蛋白與糖胺聚糖的共聚物的人工骨替代材料時，先前的嘗試包括 通過機械混合合并膠原蛋白和磷灰石。這樣的機械方法描述在
EP-A-0164484中。
該技術(shù)的最新進展包括，通過機械混合羥磷灰石、膠原蛋白和軟骨 素-4-硫酸酯來制備包含這些組分的骨替代材料。該技術(shù)描述在 EP-A-0214070中。該文獻還描述了軟骨素-4-硫酸酯與膠原蛋白的脫水熱 交聯(lián)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含磷灰石、膠原蛋白和軟骨素-4-硫酸酯的材料具有 良好的生物相容性。將磷灰石與膠原蛋白和需要時的軟骨素-4-硫酸酯機 械混合，實際上形成被膠原蛋白/軟骨素-4-硫酸酯包覆的磷灰石顆粒。已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)，盡管該材料是生物相容性的，但是在人體或動物體內(nèi)，天然骨 在內(nèi)部的生長極為有限，而且不能重新形成合成材料的磷酸鈣相。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在解決至少一部分與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問題。
第一方面，本發(fā)明提供一種制備包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或
多種糖胺聚糖的復合材料的方法，所述方法包括以下步驟
提供包含膠原蛋白、鈣源和磷源以及一種或多種糖胺聚糖的酸性水
溶液；和
從該水溶液中一起沉淀出膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚 糖以形成三元共沉淀物。
術(shù)語三元共沉淀物包涵三種化合物的沉淀物，其中，從相同溶液/分 散液中基本上同時沉淀出所述化合物。這應與機械混合這些組分形成的 材料不同，特別是與例如在不同溶液中單獨沉淀出的這些組分不同。共 沉淀物的微結(jié)構(gòu)基本上不同于機械混合其組分形成的材料。
在第一方面中，所述溶液優(yōu)選具有2.5 6.5的pH，更優(yōu)選2.5 5.5。 更優(yōu)選地，所述溶液具有3.0 4.5的pH。進而更優(yōu)選地，所述溶液具有
3.8 4.2的pH。最優(yōu)選地，所述溶液具有約為4的pH。
所述鈣源優(yōu)選選自硝酸鈣、醋酸鈣、氯化,弓、碳酸鈣、烷氧基轉(zhuǎn)、 氫氧化鈣、硅酸鈣、硫酸鈣、葡萄糖酸鈣和肝素的f丐鹽中的一種或多種。 肝素的鈣鹽可以得自豬的腸粘膜。合適的鈣鹽可購自Sigma-Aldrichlnc.。 所述磷源優(yōu)選選自磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、磷酸、二水合磷酸氫 二鈉(Na2HP04'2H20，有時稱為GPR Sorensen鹽)和磷酸三甲酯、磷酸 的堿金屬(例如Na或K)鹽、磷酸的堿土金屬(例如Mg或Ca)鹽中 的一種或多種。
糖胺聚糖是含有長的無支鏈多糖的大分子族，所述多糖含有重復的 二糖單元。優(yōu)選地，所述一種或多種糖胺聚糖選自硫酸軟骨素、硫酸皮 膚素(dermatin sulfate)、肝素、硫酸肝素、硫酸角質(zhì)素和透明質(zhì)酸。硫 酸軟骨素可以是軟骨素-4-硫酸酯或軟骨素-6-硫酸酯，它們都可以從 Sigma-Aldrich Inc.得到。軟骨素-6-硫酸酯可以得自鯊魚軟骨。透明質(zhì)酸 可以得自人的臍帶，肝素得自豬的腸粘膜。
優(yōu)選地，在三元共沉淀物的沉淀時，所述溶液具有4.0 5(TC的溫度。 更優(yōu)選地，所述溶液具有15 4(TC的溫度。所述溶液可以是室溫，即20 30°C，優(yōu)選20 27。C的溫度。最優(yōu)選地，該溫度為約25。C。
所述水溶液中鈣離子的濃度通常為0.00025 1摩爾/升，優(yōu)選0.001 1摩爾/升。當所述方法還包括過濾和/或低溫干燥的附加步驟時，所述水 溶液中鈣離子的濃度更優(yōu)選為0.05 0.5摩爾/升(例如0.08 0.25摩爾/ 升)，最優(yōu)選0.1 0.5摩爾/升。當所述方法還包括冷凍干燥和可選的注塑 成型的附加步驟時，所述水溶液中鈣離子的濃度更優(yōu)選為0.01 0.3摩爾 /升，最優(yōu)選0.05 0.18摩爾/升。
優(yōu)選地，所述溶液包含磷酸根離子，溶液中磷酸根離子的濃度通常 為0，00025 1摩爾/升，優(yōu)選0.001 1摩爾/升。當所述方法還包括過濾 和/或低溫干燥的附加步驟時，溶液中磷酸根離子的濃度更優(yōu)選為0.05 0.5摩爾/升，進而更優(yōu)選0.1 0.5摩爾/升，例如0.1 0.35摩爾/升。當所 述方法還包括冷凍干燥和可選的注塑成型的附加步驟時，溶液中磷酸根 離子的濃度更優(yōu)選為0.01 0.3摩爾/升，進而更優(yōu)選0.05 0.18摩爾/升。
優(yōu)選地，在沉淀之前，溶液中膠原蛋白與一種或多種糖胺聚糖的總
量的重量比為8:1 30:1。更優(yōu)選地，膠原蛋白與一種或多種糖胺聚糖總 量的重量比為10:1 12:1，最優(yōu)選該比例為11:1 23:2。
優(yōu)選地，三元共沉淀物中膠原蛋白與透鈣磷石的重量比為10:1 1:100，更優(yōu)選5:1 1:20，進而更優(yōu)選3:2 1:10，最優(yōu)選3:2 1:4。
在沉淀之前，所述溶液中膠原蛋白的濃度通常為1 20g/L，更優(yōu)選 1 10g/L。當所述方法還包括過濾和/或低溫干燥的步驟時，所述溶液中 膠原蛋白的濃度更優(yōu)選為1 10 g/L，進而更優(yōu)選1.5 2.5 g/L，最優(yōu)選 1.5 2.0 g/L。當所述方法包括冷凍干燥和可選的注塑成型時，在沉淀之 前，所述溶液中膠原蛋白的濃度優(yōu)選為5 20g/L，更優(yōu)選5 12g/L，最 優(yōu)選9 10.5g/L。
在沉淀之前，所述溶液中一種或多種糖胺聚糖的總濃度通常為 0.01 1.5 g/L，更優(yōu)選0.01 1 g/L。當所述方法還包括過濾和/或低溫干 燥的附加步驟時，所述溶液中一種或多種糖胺聚糖的總濃度更優(yōu)選為 0.03 1.25 g/L，進而更優(yōu)選0.125 0.25 g/L，最優(yōu)選0.13 0.182 g/L。 當所述方法還包括冷凍干燥和可選的注塑成型的附加步驟時，所述溶液 中一種或多種糖胺聚糖的總濃度更優(yōu)選為0.15 1.5 g/L，進而更優(yōu)選 0.41 1.2g/L，最優(yōu)選0.78 0.96g/L。
優(yōu)選所述溶液包含鈣離子，膠原蛋白與鈣離子的重量比通常為 1:40 500:1。當所述方法還包括過濾和/或低溫干燥的附加步驟時，膠原 蛋白與鈣離子的比更優(yōu)選為1:40 250:1，進而更優(yōu)選1:13 5:4，最優(yōu)選 1:13 1:2。當所述方法還包括冷凍干燥和可選的注塑成型的附加步驟時， 膠原蛋白與鈣離子的比更優(yōu)選為1:8 500:1，進而更優(yōu)選5:12 30:1 ，最 優(yōu)選5:5 5:1。
沉淀可以通過下列方式實現(xiàn)在酸性水溶液中混合膠原蛋白、鈣源、 磷源和一種或多種糖胺聚糖；或使溶液靜止直到沉淀發(fā)生，攪動溶液， 使用例如氨水等堿性滴定劑滴定，加入例如預制透鈣磷石等成核劑；改 變鈣源的加入速率；或者采用這些方法的任意組合。
第二方面，本發(fā)明提供一種制備包含膠原蛋白、磷酸八鈣和一種或7
多種糖胺聚糖的復合生物材料的方法，所述方法包括以下步驟
提供包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復合材料，
禾口
通過水解將復合材料中的至少一部分透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣。 術(shù)語生物材料包涵與人體或動物體可生物相容的材料。 在第二方面中，所述復合材料優(yōu)選包含或基本上由以下物質(zhì)組成 含有膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述 三元共沉淀物可以用這里所述的與本發(fā)明第一方面有關(guān)的方法形成。
優(yōu)選地，透鈣磷石水解為磷酸八鈣的步驟包括使所述三元共沉淀 物與水溶液接觸，所述水溶液的pH等于或大于磷酸八鈣比透鈣磷石在熱
力學上更穩(wěn)定時的pH。優(yōu)選地，該水溶液具有6 8的pH。更優(yōu)選地， 該水溶液具有6.3 7的pH。最優(yōu)選地，該水溶液具有約6.65的pH。所 述水溶液可以包括，例如用滴定劑、緩沖液、被另一種含鈣化合物和/或 含磷化合物所飽和的溶液控制pH的去離子水。優(yōu)選的水溶液包含使用氨 水滴定到所需pH的醋酸。
優(yōu)選地，透鈣磷石水解為磷酸八鈣的步驟在20 5(TC的溫度下進行， 更優(yōu)選30 4(TC，進而更優(yōu)選36 38'C，最優(yōu)選約37'C。
優(yōu)選地，透鈣磷石水解為磷酸八鈣的步驟進行12 144小時，更優(yōu) 選18 72小時，最優(yōu)選24 48小時。
第三方面，本發(fā)明提供一種制備包含膠原蛋白、磷灰石和一種或多 種糖胺聚糖的復合生物材料的方法，所述方法包括以下步驟
提供包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復合材料，
和
通過水解將復合材料中的至少一部分透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷灰石。 磷灰石是一類包含鈣和磷酸根的礦物質(zhì)，它具有通式Ca5(P04)3(X)， 其中X可以是離子，通常為OH—、 F—和Cl—以及本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的 其它離子。磷灰石也包括取代的磷灰石，例如硅取代的磷灰石。磷灰石 包括羥磷灰石，羥磷灰石是磷灰石的具體例子。羥磷灰石也可以用硅取 代。
在第三方面中，復合材料優(yōu)選包含或基本由以下物質(zhì)組成包含膠 原蛋白、透鈣磷石和一種或一種糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述三元共 沉淀物可以按照這里所述的與本發(fā)明第一方面有關(guān)的方法形成。
優(yōu)選地，透鈣磷石水解為磷灰石的步驟包括使所述三元共沉淀物 與水溶液接觸，所述水溶液的pH等于或大于為磷灰石比透f丐磷石在熱力 學上更穩(wěn)定時的pH。優(yōu)選地，為了將透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷灰石，該水溶液
具有6.65 9，更優(yōu)選7 8.5，進而更優(yōu)選7.2 8.5的pH。所述水溶液 可以包括，例如用滴定劑、緩沖液、被另一種含鈣化合物和/或含磷化合 物所飽和的溶液控制pH的去離子水。
優(yōu)選地，透l丐磷石水解為磷灰石的步驟在20 5(TC的溫度下進行， 更優(yōu)選30 4(TC，進而更優(yōu)選36 38"C，最優(yōu)選約37"C。
優(yōu)選地，透鈣磷石水解為磷灰石的步驟進行12 288小時，更優(yōu)選 18 72小時，最優(yōu)選24 48小時的時間。
增加透鈣磷石向磷酸八鈣和/或磷灰石轉(zhuǎn)化的速率的方法包括提高 (i)溫度，(ii)溶液中透鈣磷石的濃度和或(iii)攪拌速度。
需制備同時包含磷灰石和磷酸八鈣的本發(fā)明的生物材料?？梢酝瑫r 采用本發(fā)明第二和第三方面的方法，制備既包含磷酸八鈣又包含磷灰石 的材料。三元共沉淀物中的透鈣磷石可以先轉(zhuǎn)化為磷酸八H然后磷酸 八鈣可以部分地轉(zhuǎn)化為磷灰石。通常在8.0或8.0以上的pH下水解約12 小時，從而將透鈣磷石或磷酸八鈣全部或接近全部(即至少98%)轉(zhuǎn)化 為磷灰石。因此，材料中透鈣磷石和/或磷灰石的部分轉(zhuǎn)化可以通過水解 小于12小時的時間來實現(xiàn)。
優(yōu)選地，磷酸八韓水解為磷灰石的步驟在6.65 10，更優(yōu)選7.2 10， 進而更優(yōu)選8 9的pH下進行。
優(yōu)選地，磷酸八鈣水解為磷灰石的步驟在20 5(TC的溫度下進行， 更優(yōu)選30 4(TC，進而更優(yōu)選36 38'C，最優(yōu)選約37'C。
優(yōu)選地，磷酸八鈣水解為磷灰石的步驟進行2 144小時的時間，更 優(yōu)選12 96小時，最優(yōu)選24 72小時。
在本發(fā)明的第二和第三方面中，透鈣磷石向磷酸八鈣和/或磷灰石的
轉(zhuǎn)化優(yōu)選在30 4(TC的溫度下進行。更優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)化在36 38"C的溫 度下進行。最優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)化在約37。C的溫度下進行。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法還包括以下步驟使三元共沉淀物中的一種 或多種糖胺聚糖和膠原蛋白交聯(lián)。關(guān)于三元共沉淀物，它包括包含膠原 蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的三元共沉淀物和該共沉淀物的 衍生物。該衍生物包括至少一部分透鈣磷石已轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰 石的共沉淀物，和已經(jīng)定形或成型或進行了任何化學或機械處理的共沉 淀物。使用任何常規(guī)技術(shù)均可以實現(xiàn)交聯(lián)。
優(yōu)選地，至少一部分透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石，在透,丐 磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石之前使糖胺聚糖與膠原蛋白交聯(lián)。該交
聯(lián)可以通過下列方式實現(xiàn)對三元共沉淀物進行Y射線照射、紫外線照
射、脫水加熱處理、用例如葡萄糖、甘露糖、核糖等單糖和蔗糖進行非 酶糖基化、使該三元共沉淀物與戊二醛、乙基二甲氨基丙基碳二亞胺和/ 或去甲二氫愈創(chuàng)木酸中的一種或多種接觸，或上述方法的任意組合。在 本領(lǐng)域中這些都是常規(guī)方法。
優(yōu)選地，如果至少一部分透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石，則 在透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石之后使糖胺聚糖和膠原蛋白交 聯(lián)。透f丐磷石轉(zhuǎn)化為磷灰石和/或磷酸八鈣之后的交聯(lián)可以通過上述的一 種或多種方法，或通過脫水加熱處理，或這些方法的任意組合來實現(xiàn)。 脫水加熱處理包括使基材在升高的溫度下經(jīng)歷低壓環(huán)境。脫水加熱處理
的溫度可以為95 135°C。如果要使脫水加熱處理通常在18 36小時完 成，則該溫度優(yōu)選為100 110°C，最優(yōu)選105 110°C。如果要使脫水加 熱處理通常在4 8小時完成，則該溫度優(yōu)選為120°C 135°C，最優(yōu)選 125。C 135。C。
優(yōu)選地，在透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石之前和之后都使膠 原蛋白和糖胺聚糖交聯(lián)。
本發(fā)明的方法可以包括以下步驟使復合生物材料成形為適合用作 骨或牙科替代物的結(jié)構(gòu)?？梢栽谌渤恋砦镄纬芍螅窃谕糕}磷 石的任何轉(zhuǎn)化或膠原蛋白與糖胺聚糖交聯(lián)發(fā)生之前進行該步驟。
備選地，使生物材料成形的步驟可以在透f丐磷石轉(zhuǎn)化磷灰石和/或磷 酸八鈣或膠原蛋白與糖胺聚糖交聯(lián)之后進行。
優(yōu)選地，使用選自下列技術(shù)的技術(shù)使復合材料成形(i)過濾和/或 低溫干燥，(ii)冷凍干燥，(iii)注塑成型和(iv)冷壓。溫度為15 40
°C，最優(yōu)選35 4(TC的過濾和/或低溫干燥通常產(chǎn)生致密顆粒形式的材
料。冷凍干燥通常產(chǎn)生開孔形式。根據(jù)所用染料的形狀，注塑成型可以 產(chǎn)生多種形狀/形態(tài)的材料。冷壓通常產(chǎn)生致密丸狀形式。
本發(fā)明還提供一種適合轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣缮锊牧系那绑w材料，所述前體 材料包含復合材料，所述復合材料包含膠原蛋白、透f丐磷石和一種或多
種糖胺聚糖。優(yōu)選地，所述復合材料包含或基本上由以下物質(zhì)組成包
含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述三 元共沉淀物可以根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法制備。
本發(fā)明還提供一種包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖 的復合生物材料，該生物材料可以用這里描述的本發(fā)明的方法得到。
本發(fā)明還提供一種包含膠原蛋白、磷酸八鈣和一種或多種糖胺聚糖 的復合生物材料，該生物材料可以用本發(fā)明第二方面的方法得到。
本發(fā)明還提供一種包含膠原蛋白、磷灰石和一種或多種糖胺聚糖的 復合生物材料，該生物材料可以用本發(fā)明第三方面的方法得到。
本發(fā)明還提供一種包含膠原蛋白、糖胺聚糖和透鈣磷石的三元共沉 淀物的復合生物材料。
本發(fā)明還提供一種包含一種和多種磷酸鈣材料的顆粒、膠原蛋白和 一種或多種糖胺聚糖的生物材料，其中所述膠原蛋白和所述一種或多種 糖胺聚糖交聯(lián)并形成母體，所述磷酸鈣材料的顆粒分散在所述母體中， 所述磷酸鈣材料選自透鈣磷石、磷酸八鈣和/或磷灰石中的一種或多種。
如果沒有其他說明，下面的描述與本發(fā)明的復合生物材料的所有方 面都相關(guān)。
優(yōu)選使膠原蛋白和一種或多種糖胺聚糖交聯(lián)。
膠原蛋白優(yōu)選以5(干)重量％ 90(干)重量％的量存在在所述材料 中，更優(yōu)選15重量％ 60(干)重量％，更優(yōu)選20(干)重量％ 40(干)重量
優(yōu)選地， 一種或多種糖胺聚糖以0.01(干)重量％ 12(干)重量％的量
存在在所述材料中，更優(yōu)選1(干)重量％ 5.5(干)重量％，最優(yōu)選1.8(干) 重量％ 2.3(干)重量％。
優(yōu)選地，如果所述材料包含透轉(zhuǎn)磷石，則膠原蛋白與透轉(zhuǎn)磷石的重 量(干)比為10:1 1:100，更優(yōu)選5:1 1:20，最優(yōu)選3:2 1:10，例如3:2 1:4。
優(yōu)選地，如果所述材料包含磷酸八鈣，則膠原蛋白與磷酸八f丐的重 量(干)比為10:1 1:100，更優(yōu)選5:1 1:20，最優(yōu)選3:2 1:10。
優(yōu)選地，膠原蛋白與一種或多種糖胺聚糖的總量的重量(干)比為 8:1 30:1，更優(yōu)選10:1 30:1 ，進而更優(yōu)選10:1 12:1 ，最優(yōu)選11:1 23:2。
本發(fā)明的復合生物材料可以用作骨或牙科的替代材料。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的復合生物材料的人工骨材料、骨移植 物、骨嫁接物、骨替代物、骨支架、填充物、涂料或粘固劑。術(shù)語涂料 包括任何包含本發(fā)明的生物材料或前體的涂料。涂料可以施用于修復件、 骨或任何欲用在人體或動物體中的基材的外表面或內(nèi)表面上，該涂料中 包含顆粒材料。本發(fā)明的復合物可以用于礦化生物材料的體內(nèi)和體外修 復，包括但不局限于骨和牙科材料。本發(fā)明的生物材料可以用于同種異 體移植物和自身移植物的生長。
本發(fā)明的包含磷酸八鈣的生物材料可以不含有或基本不含有任意前 體透l丐磷石相。在該生物材料的磷酸鈣材料的總量中，該生物材料可以 包含小于2重量％的透鈣磷石。
磷酸鈣材料可以包含或基本上由相純(phase pure)的磷酸八鈣或磷 灰石組成。相純是指優(yōu)選含有至少98%，更優(yōu)選至少99%和最優(yōu)選至少 99.5%的所需要的相(用X射線衍射測定)。備選地，根據(jù)生物材料所需 要的性能，該生物材料可以包含磷酸八鈣和磷灰石的混合物。
本發(fā)明的包含透鈣磷石的材料可以用作制備生物材料的前體材料， 或本身適合用作生物材料。
本發(fā)明的方法可以使用遵從下列順序的方法來進行，可以整體地或
部分地應用該方法來制備膠原蛋白、 一種或多種糖胺聚糖和一種或多種 磷酸鈣組分的生物復合物。下列說明是以舉例的方式提供，適用于本發(fā) 明的方法的任何方面。
I:在酸性PH下膠原蛋白、糖胺聚糖(GAG)和磷酸鈣透轉(zhuǎn)磷石的三元共
沉淀
進行該步驟，以通過溶液沉淀同時形成復合物的三種(或三種以上)
組分，和控制三種(或三種以上)各個相的比例。通過改變pH、溫度、 老化時間、鈣離子濃度、磷離子濃度、膠原蛋白濃度和糖胺聚糖濃度中 的一個或一個以上來實現(xiàn)對復合物的組成性能(具體是膠原蛋白糖胺 聚糖CaP (磷酸鈣)的比例)的控制。pH可以維持恒定(例如使用緩 沖液、pH電位滴定或其它方法)或使其變化?？赡艿拇渭?污染物)相 包括其它酸性磷酸鈣(例如三斜磷鈣石、磷酸氫鈣)和包括滴定的副產(chǎn) 物和其它反應物(例如磷酸銨、硝酸銨)的混合物。在該步驟中也可以 加入輔助交聯(lián)(例如葡萄糖、核糖)或增加體內(nèi)響應(例如生長因子、 基因轉(zhuǎn)錄因子、硅、促尿鈉排泄肽)的添加劑。
II:凈形狀的形成
進行該步驟以制備最終復合物形式的所需構(gòu)造，特別強調(diào)對孔結(jié)構(gòu) 的控制。該技術(shù)的例子包括過濾和低溫干燥(產(chǎn)生致密顆粒形式)、冷凍 干燥(產(chǎn)生開孔形式)、注塑成型(根據(jù)染料類型產(chǎn)生多種形狀)和冷壓 (產(chǎn)生致密的丸狀形式)。
III:初級交聯(lián)
進行該步驟優(yōu)選可以確保當放在pH升高的溶液中時，復合物的糖
胺聚糖含量不會迅速流失，而且可以提高復合物的機械和降解性能。該 技術(shù)的例子包括低溫物理技術(shù)(例如Y射線照射、紫外線照射、脫水加 熱處理)、化學技術(shù)(例如用單糖的非酶糖基化、戊二醛、乙基二甲氨基 丙基碳二亞胺、去甲二氫愈創(chuàng)木酸)或組合方法(例如同時非酶糖基化
和Y射線照射)。在需要轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣時(即步驟IV中)，在低于約37 'C的溫度下有利地進行初級交聯(lián)，以防止透鈣磷石相轉(zhuǎn)化為其脫水形式 三斜磷鈣石，三斜磷鈣石是不易水解為磷酸八鈣的磷酸鈣。
IV:水解
可以進行該步驟，以便從透鈣磷石將CaP相(在生理pH下具有高 溶解度的相)部分地或完全地水解為磷酸八鈣和/或磷灰石(在生理pH 下具有較低溶解度的相)和基本上除去任何可溶性污染相(例如硝酸銨、 磷酸氫鈣)。在水解為磷酸八鈣(OCP)的t青況中，在約6.65和約37°C 溫度下將選定的pH有利地維持恒定約24 48小時(使用緩沖液、pH電 位滴定或其它方法)。如步驟I的情況，在水解步驟(步驟IV)中也可以 加入輔助交聯(lián)(例如葡萄糖、核糖)或增加體內(nèi)響應(例如生長因子、 基因轉(zhuǎn)錄因子、硅、促尿鈉排泄肽)的添加劑。
V:次級交聯(lián)
進行該步驟以進一步調(diào)整復合物的機械和降解性能?？梢允褂蒙鲜?步驟III中列出的任何或全部交聯(lián)程序以實現(xiàn)次級交聯(lián)。
提供下列實施例和附圖以幫助進一步理解本發(fā)明。不應認為實施例 和附圖限定了本發(fā)明的范圍。實施例或附圖中描述的任何特征適用于以 上說明的任何方面。


圖1是共沉淀后的復合物的X射線衍射譜圖(Cu-Ka照射)； 圖2是三元共沉淀物的掃描電子顯微鏡(SEM)顯微照片； 圖3是三元共沉淀物的透射電子顯微鏡(TEM)顯微照片； 圖4表示在105。C和50毫托脫水加熱處理48小時后的復合物的X 射線衍射譜圖，表明透鈣磷石相轉(zhuǎn)化為其脫水形式三斜磷鈣石；
圖5是設定離子濃度和硝酸鈣氫氧化鈣的比的組合，以維持pH
=4.0;
圖6表示確定含有磷酸鈣與膠原蛋白+糖胺聚糖的質(zhì)量比為1:1的三 元共沉淀物漿體的pH 4.0下的合成條件；
圖7是除去游離水后的膠原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀物
的X射線衍射譜圖(CU-K(X照射)；
圖8是CaP :膠原蛋白+糖胺聚糖二l:l的三元共沉淀物表面的二次 電子(SE)和反向散射電子(BSE)照片；
圖9表示EDAC交聯(lián)后的膠原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀 物的X射線衍射譜圖(Cu-Ka照射)；
圖10表示EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/糖胺聚糖/CaP三元共沉淀物在37 。C和pH 6.67下向磷酸八鈣轉(zhuǎn)化72小時后，形成膠原蛋白/糖胺聚糖/磷酸 八鈣生物復合物后的X射線衍射譜圖(Cu-Ka照射)；
圖11是設定離子濃度和硝酸鈣氫氧化鈣的比的組合，以維持pH =4.5;
圖12表示確定含有磷酸鈣與膠原蛋白+糖胺聚糖的質(zhì)量比為3:1的 三元共沉淀物槳體的pH4.5下的合成條件；
圖13表示除去游離水后的膠原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀 物的X射線衍射譜圖(Cu-Kot照射)；
圖14表示EDAC交聯(lián)后的膠原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀 物的X射線衍射譜圖(Cu-Ka照射)；
圖15表示EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/糖胺聚糖/CaP三元共沉淀物在37 'C和8.50的pH下向磷灰石轉(zhuǎn)化72小時后，形成膠原蛋白/糖胺聚糖/磷 灰石生物復合物的X射線衍射譜圖(Cu-Ka照射)；
圖16表示經(jīng)Y射線照射次級交聯(lián)后的EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/糖胺 聚糖/Ap三元共沉淀物的X射線衍射譜圖17表示剛剛進行三元共沉淀和干燥(步驟I和II)后的復合物的 X射線衍射譜圖18表示初級交聯(lián)(步驟III)后的共沉淀物顆粒的結(jié)構(gòu)的SEM顯 微照片；
圖19表示水解為磷酸八鈣的過程(步驟IV)的XRD譜圖；禾口
圖20表示復合物的TEM圖。
具體實施方式
實施例1
實施例1是上述合成方法的例子，僅僅進行步驟I III。在室溫(20 25°C)和約3.2的pH (用氨水滴定來維持)下進行三元共沉淀。在本實 施例中，共沉淀物在37。C下干燥，通過脫水加熱處理進行交聯(lián)。在本實 施例中既不進行CaP的水解轉(zhuǎn)化，也不進行次級交聯(lián)。
材料
膠原蛋白復原(reconstituted)的提取了胃蛋白酶的豬皮膠原蛋白(端 膠原(atelocollagen)); 85%1型，15%111型；Japan Meat Packers (日本
大阪)。
糖胺聚糖來自鯊魚軟骨的軟骨素-6-硫酸酯；鈉鹽；Sigma-Aldrich Inc
(美國密蘇里州圣路易斯) 鈣源(i)氫氧化鈣Ca(OH)2; Sigma-Aldrich Inc (美國密蘇里州圣路易 斯)；(ii)硝酸f丐；Ca(N03)2'4H20; Sigma-Aldrich Inc (美國密蘇里州圣 路易斯)；
磷源磷酸H3P04; BDHLaboratory Supplies (英國普爾(Poole)) 滴定劑氨水；NH3; BDH Laboratory Supplies (英國普爾)
程序
步驟I
溶液A:
一在室溫下將Ca(OH)2溶解在0.48摩爾/升的H3P04中至0.12摩爾/升的
濃度，使用氨水將得到的溶液滴定至p1^3.2。
懸浮液B:
一將軟骨素-6-硫酸酯溶解在去離子水中至3.2 g/L的濃度。然后在恒定
攪拌下，以1.5的硝酸根:氫氧根的摩爾比將Ca(N03)"H20和Ca(OH)2
加到軟骨素硫酸酯溶液中，制備出總鈣濃度為2.4摩爾/升的懸浮液。
_將0.144 g的膠原蛋白加到20 ml的溶液A中，使用均質(zhì)器混合至溶
解。然后在恒定攪拌下將4 ml的懸浮液B加到溶液A中。
一持續(xù)攪拌60分鐘，監(jiān)測pH以確保pH維持在3.15 <pH< 3.30的范圍
中。然后使得到的漿體在室溫下老化24小時。
步驟II
_使所述漿體在37。C下風干5天，用去離子水洗滌剩余的三元共沉淀物， 接著在37r下再干燥24小時。
—所得到的三元共沉淀物的X射線衍射譜圖表示在圖1 (Cu-K(oc)照射) 中，SEM照片表示在圖2中。
步驟III
在105r和50毫托的真空下脫水加熱處理(DHT) 48小時使三元共 沉淀物交聯(lián)。脫水加熱處理后的三元共沉淀物的TEM照片表示在圖3中。 圖4表示脫水加熱處理后的三元共沉淀物的X射線衍射譜圖，表明透鈣 磷石相轉(zhuǎn)化為其脫水形式三斜磷鈣石。
實施例2
實施例2是上述合成方法的例子，僅僅進行步驟1 IV。在室溫和 pH 4.0下進行三元共沉淀。在本實施例中，通過仔細控制氫氧化鈣和硝 酸鈣的濃度實現(xiàn)pH的控制，該方法也能控制三元共沉淀物中透鈣磷石與 膠原蛋白+糖胺聚糖的質(zhì)量比。然后將得到的三元共沉淀物冷凍至-20。C， 放置在真空下，然后加熱使游離水(即冰)升華。使用l-乙基3-(3-二甲 氨基丙基)碳二亞胺處理進行初級交聯(lián)。然后通過在約37"C和6.67的pH 下水解將得到的干燥的三元共沉淀物轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣。在本實施例中， 不進行次級交聯(lián)。
MM
I型由牛腱溶解的酸，Integra Life Sciences Plainsboro,美國新澤西州 糖胺聚糖來自鯊魚軟骨的軟骨素-6-硫酸酯；鈉鹽；Sigma-Aldrich Inc
(美國密蘇里州圣路易斯) 鈣源(0氫氧化鈣Ca(OH)2; Sigma-Aldrich Inc (美國密蘇里州圣路易 斯)；(ii)硝酸轉(zhuǎn)；Ca(N03)2.4H20; Sigma-Aldrich Inc (美國密蘇里州圣 路易斯)；
磷源磷酸H3P04; BDH Laboratory Supplies (英國普爾)
滴定劑無
交聯(lián)劑(i)l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺^EDAC); Sigma-Aldrich Inc (美國密蘇里州圣路易斯)；(ii) N-羥基琥珀酰亞胺(=NHS); Sigma-Aldrich Inc (美國密蘇里州圣路易斯)
程序 步驟I
—選擇透鈣磷石與膠原蛋白+糖胺聚糖的目標質(zhì)量比為1:1。
一在200 ml的總反應體積中，膠原蛋白+糖胺聚糖的濃度設定為21
mg/ml 。
_使用pH變量的經(jīng)驗三維圖(在恒定的[C^+]與[P]反應物離子比為1.0 下制作)，改變(i)離子濃度,Ca2+] = [H3P04])和(ii)硝酸鈣:氫 氧化鈣的比，確認pH恒定為4.0的點的軌跡。這表示在圖5中(設定離 子濃度和硝酸鈣氫氧化鈣的比的組合，以維持pH二4.0)。 —將該點的軌跡疊加在具有相同的坐標軸的透鈣磷石質(zhì)量產(chǎn)率的圖上， 確認它與21 mg/ml的曲線的交點，使得可以設定反應物濃度，在該反應 物濃度下，在pH為4.0 ( [Ca2+] = [H3P04] =0.1383摩爾/升； Ca(N03)2'4H20 :Ca(OH)2 =0.1356)時，可以制備含有磷酸鈣(21 mg/ml)與膠原蛋白+糖胺聚糖(21 mg/ml)的質(zhì)量比為1:1的三元共沉淀 物漿體。見圖6:確定含有磷酸鈣與膠原蛋白+糖胺聚糖的質(zhì)量比為1:1 的三元共沉淀物漿體的pH 4.0下的合成條件。 —將3.8644 g的膠原蛋白分散在冰浴中冷卻的171.4 ml的0.1383摩爾/ 升的H3P04中，使用配備直徑19 mm的定子的均質(zhì)器在15000轉(zhuǎn)/分鐘下 混合90分鐘，制備高粘度的膠原蛋白分散液。
一通過周期地振蕩來分散溶解糖胺聚糖，使0.3436 g軟骨素-6-硫酸酯溶 解在室溫下的14.3 ml的0.1383摩爾/升的磷酸中，制備糖胺聚糖溶液。 一 90分鐘后，在15,000轉(zhuǎn)/分鐘的連續(xù)均質(zhì)下，將14.3ml糖胺聚糖溶液 以約0.5 ml/分鐘的速率加到攪拌中的膠原蛋白分散液中，所得到的高粘 度膠原蛋白/糖胺聚糖分散液總共混合90分鐘。
_在混合90分鐘后，在15,000轉(zhuǎn)/分鐘的恒定攪拌下，用30分鐘將1.804
g的Ca(OH)2和0.780 g的Ca(N03)2'4H20加到高粘度膠原蛋白/糖胺聚糖
分散液中，制備膠原蛋白/糖胺聚糖/CaP三元共沉淀物漿體，此后再向漿
體中混入14.3 ml的0.1383摩爾/升的磷酸。
_三元共沉淀物漿體的pH約為4.0。
_使三元共沉淀物漿體在25。C下停留48小時。
步驟II
—將三元共沉淀物漿體放在-2(TC的冷凍機中，使其固化過夜。
一然后從冷凍機中取出冷凍的漿體，放在約80毫托的真空中，使溫度
升至室溫，這樣使冰從漿體中升華，使其進行48小時。
_除去游離水后的膠原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線
衍射譜圖(Cu-K(oi)照射)表示在圖7中，共沉淀物表面的SEM照片表
示在圖8中(CaP:膠原蛋白+糖胺聚糖=1:1的三元共沉淀物表面的二次
電子(SE)和反向散射電子(BSE)照片)。
步驟III
一在完全除去游離水之后，使得到的1.25 g的干三元共沉淀物在40 ml 的去離子水中水合20分鐘。
—將20 ml的0.035摩爾/升的EDAC和0.014摩爾/升的NHS的溶液加 到含有三元共沉淀物和去離子水的容器中，在緩和攪拌和室溫下使三元 共沉淀物交聯(lián)2小時。
_除去EDAC溶液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三元共沉淀物，在溫 和攪拌下在新鮮的PBS中，在37。C下培養(yǎng)2小時。 一在PBS中2小時后，用去離子水洗滌三元共沉淀物，在溫和攪拌下在 37。C下培養(yǎng)兩個10分鐘的間隔。
_然后將三元共沉淀物在37。C下干燥72小時。圖9表示EDAC交聯(lián)后 的膠原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射譜圖(Cu-K(a) 照射)。
步驟IV
_將交聯(lián)的三元共沉淀物顆粒放在50ml37X:的去離子水中，使用氨水 將溶液的pH調(diào)節(jié)為6.67。
_溫度和pH維持恒定48小時，此后過濾出共沉淀物，在去離子水中洗 滌，在37。C下風干。
—轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣后的共沉淀物的X射線衍射譜圖表示在圖10中 (EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/糖胺聚糖/CaP三元共沉淀物在37。C和pH 6.67 下向磷酸八鈣轉(zhuǎn)化72小時后，形成膠原蛋白/糖胺聚糖/磷酸八鈣生物復 合物，Cu-K(a)照射)。
實施例3
實施例3是上述合成方法的例子，進行步驟1 V。在室溫和約4.5 的pH下進行三元共沉淀。如在實施例2中，通過仔細控制氫氧化鈣和硝 酸鈣濃度實現(xiàn)pH控制，不使用滴定劑。然后將得到的三元共沉淀物冷凍 至-2(TC，放置在真空下，然后加熱使游離水(即冰)升華。使用l-乙基 3-(3_二甲氨基丙基)碳二亞胺處理進行初級交聯(lián)。然后將得到的干燥的共
沉淀物在pH 8.50和37'C下轉(zhuǎn)化為磷灰石。使用Y射線照射進行次級交 聯(lián)。
材料
I型由牛腱溶解的酸，Integra Life Sciences Plainsboro，美國新澤西州
糖胺聚糖來自鯊魚軟骨的軟骨素-6-硫酸酯；鈉鹽；Sigma-Aldrich Inc
(美國密蘇里州圣路易斯) 鈣源(i)氫氧化鈣Ca(OH)2; Sigma-Aldrich Inc (美國密蘇里州圣路易 斯)；(ii)硝酸鈣；Ca(N03)2.4H20; Sigma-Aldrich Inc (美國密蘇里州圣 路易斯)；
磷源磷酸H3P04; BDH Laboratory Supplies (英國普爾) 滴定劑無
交聯(lián)劑(i)l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺^EDAC); Sigma-Aldrich Inc (美國密蘇里州圣路易斯)；(ii) N-羥基琥珀酰亞胺(=NHS); Sigma-Aldrich Inc (美國密蘇里州圣路易斯)
程序 步驟I
一選擇透鈣磷石與膠原蛋白+糖胺聚糖的目標質(zhì)量比為3:1。 一在200ml的總反應體積中，使膠原蛋白+糖胺聚糖的濃度為10mg/ml。 —使用pH變量的經(jīng)驗三維圖(在恒定的[C^+]與[P]反應物離子比為1.0 下)，改變(i)離子濃度^P[Ca2+] = [H3P04])和(ii)硝酸鈣氫氧化 鈣的比，確認pH恒定為4.5的點的軌跡。這表示在圖11中(設定離子 濃度和硝酸鈣氫氧化鈣的比的組合，以維持pH二4.5)。 一將該點的軌跡疊加在透鈣磷石質(zhì)量產(chǎn)率的圖上(具有相同的坐標軸)， 確認它與30mg/ml(即3倍于膠原蛋白+糖胺聚糖的濃度)的曲線的交點， 使得可以設定反應物濃度，在該反應物濃度下，在pH為4.5 ([Ca2+]= [H3P04] =0.1768摩爾/升；Ca(N03)2'4H20 : Ca(OH)2 =0.049)下，可 以制備含有磷酸鈣(30mg/ml)與膠原蛋白+糖胺聚糖(lOmg/ml)的質(zhì) 量比為3:1的三元共沉淀物漿體。這表示在圖12中確定含有磷酸鈣與 膠原蛋白+糖胺聚糖的質(zhì)量比為3:l的三元共沉淀物漿體的pH4.5下的合 成條件。
一將1.837 g的膠原蛋白分散在冰浴中冷卻的171.4 ml的0.1768摩爾/ 升的H3P04中，使用配備直徑19 mm的定子的均質(zhì)器在15000轉(zhuǎn)/分鐘下
混合90分鐘，制備膠原蛋白分散液。
_通過周期地振蕩分散溶解糖胺聚糖，使0.163 g軟骨素-6-硫酸酯在室 溫下溶解在14.3 ml的0.1768摩爾/升的磷酸中，制備糖胺聚糖溶液。 一 90分鐘后，在15,000轉(zhuǎn)/分鐘的連續(xù)均質(zhì)下，將14.3ml糖胺聚糖溶液 以約0.5 ml/分鐘的速率加到混合的膠原蛋白分散液中，所得到的膠原蛋 白/糖胺聚糖分散液總共混合90分鐘。
一在90分鐘的混合后，在15,000轉(zhuǎn)/分鐘的恒定攪拌下，用30分鐘將
2.498 g的Ca(OH)2和0.380 g的Ca(N03)2.4H20加到膠原蛋白/糖胺聚糖分
散液中，制備膠原蛋白/糖胺聚糖/CaP三元共沉淀物漿體，此后再向混合
漿體中加入14.3 ml的0.1768摩爾/升的磷酸。
_三元共沉淀物漿體的pH約為4.5。
一使三元共沉淀物漿體在25T:下停留48小時。
步驟II
一將三元共沉淀物漿體放在-20。C的冷凍機中，使其冷凍過夜。 _然后從冷凍機取出冷凍的漿體，放在約80毫托的真空中，使溫度升 至室溫，這樣使冰從漿體中升華，使其進行48小時。除去游離水后的膠 原蛋白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射譜圖(Cu-K(a)照 射)表示在圖13中。
步驟III
一在完全除去游離水之后，使得到的1.25 g的干三元共沉淀物在40 ml 的去離子水中水合20分鐘。
一將20 ml的0.018摩爾/升EDAC和0.007摩爾/升NHS的溶液加到含 有三元共沉淀物和去離子水的容器中，在緩和攪拌和室溫下使三元共沉 淀物交聯(lián)2小時。
一除去EDAC溶液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三元共沉淀物，在溫 和攪拌下在新鮮的PBS中，在37℃下培養(yǎng)2小時。
一在PBS中2小時后，用去離子水洗滌三元共沉淀物，在溫和攪拌和
37"C下培養(yǎng)兩個10分鐘的間隔。
一然后將三元共沉淀物在37。C下干燥72小時。EDAC交聯(lián)后的膠原蛋 白/糖胺聚糖/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射譜圖(Cu-K(a)照射) 表示在圖14中。
步驟IV
一將交聯(lián)的三元共沉淀物顆粒放在37°C的50 ml的預先用透f丐磷石飽和 的去離子水中，使用氨水將溶液的pH調(diào)節(jié)為8.50。 一維持溫度和pH恒定72小時，此后過濾出共沉淀物，在去離子水中洗 滌，在37"C下風干。轉(zhuǎn)化為磷灰石后的共沉淀物的X射線衍射譜圖表示 在圖15中(EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/糖胺聚糖/CaP三元共沉淀物在37°C 和8.50的pH下向磷灰石轉(zhuǎn)化72小時后，形成膠原蛋白/糖胺聚糖/磷灰 石生物復合物，Cu-K(oO照射)。
步驟V
一將干燥的膠原蛋白/糖胺聚糖/Ap三元共沉淀物進行32.1 kGy劑量的y 射線照射。圖16表示y射線照射后的X射線衍射譜圖(經(jīng)y射線照射的 次級交聯(lián)后的EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/糖胺聚糖/Ap三元共沉淀物)。
實施例4 材料
膠原蛋白復原的提取了胃蛋白酶的豬皮膠原蛋白(端膠原)；85%1型， 15%111型；Japan Meat Packers (日本大阪)。
糖胺聚糖來自鯊魚軟骨的軟骨素-6-硫酸酯；鈉鹽；Sigma-Aldrich Inc
(美國密蘇里州圣路易斯) 鈣源(i)氫氧化鈣Ca(OH)" Sigma-Aldrich Inc (美國密蘇里州圣路易 斯)；(ii)硝酸鈣；Ca(N03)2'4H20; Sigma-Aldrich Inc (美國密蘇里州圣 路易斯)；
磷源磷酸H3P04; BDH Laboratory Supplies (英國普爾)
滴定劑氨水；NH3; BDH Laboratory Supplies (英國普爾)
程序 步驟I
_在室溫下將Ca(OH)2溶解在0.48摩爾/升的H3P04中至0.12摩爾/升的
濃度，制備出溶液A，將所得到的溶液滴定至pH為3.2。
一將軟骨素-6-硫酸酯溶解在去離子水中至3.2 g/L的濃度，制備出懸浮
液B。在恒定攪拌下，以1.5的硝酸根:氫氧根的摩爾比將Ca(N03)2.4H20
和Ca(OH)2加到軟骨素硫酸酯溶液中，制備總鈣濃度為2.4摩爾/升的懸浮液。
—將0.144 g的膠原蛋白加到20 ml的溶液A中，使用均質(zhì)器混合至溶 解。然后在恒定攪拌下將4 ml的懸浮液B加到溶液A中。持續(xù)攪拌60 分鐘，監(jiān)測pH以確保pH維持在3.15〈pH〈3.30的范圍中。然后使所得 到的漿體在室溫下老化24小時。
步驟II
_使所述漿體在37。C下風干5天，用去離子水洗滌剩余的三元共沉淀物， 接著在37'C下再干燥24小時。
步驟III
_將共沉淀物放在稀醋酸(pH=3.2)中，用30 kGy的Y射線照射劑量 照射。然后從溶液中除去交聯(lián)的沉淀物，洗滌，在37"C下風干。
步驟IV
一將交聯(lián)的共沉淀物顆粒放在37"C的50ml去離子水中，使用氨水將溶 液的pH調(diào)節(jié)為6.65。維持恒定溫度和pH 48小時，此后過濾出共沉淀物， 在去離子水中洗滌，在37"C下風干。
步驟V
2_將交聯(lián)的水解的共沉淀物顆粒放在室溫的真空箱中，施加50毫托的
真空度，然后將溫度升高至105°C。 24小時后，將溫度降至室溫，釋放真空。
圖17表示剛剛進行三元共沉淀和干燥(步驟I和II)后的復合物的 X射線衍射譜圖。該譜圖證實主要存在的相是透鈣磷石。
圖18表示初級交聯(lián)(步驟in)后的共沉淀物顆粒的結(jié)構(gòu)的SEM顯 微照片。值得注意的是顆粒在微觀結(jié)構(gòu)的均一性質(zhì)。
水解為磷酸八鈣的過程(步驟IV)表示在圖19的XRD譜圖中。在 12.5。透鈣磷石峰強度逐漸減弱，在4.5。磷酸八鈣(OCP)的主峰增強， 這表明無機相用48小時轉(zhuǎn)化為OCP。
復合物的TEM圖表示在圖20中?？梢钥闯?，分散在膠原蛋白/糖胺 聚糖母體中的10 20nm的低縱橫比的磷酸鈣晶體呈無規(guī)分布。
本發(fā)明的復合生物材料可以用作可生物吸收的材料?？梢灶A期，移 植后，由該材料制備的構(gòu)件將完全吸收，僅僅留下健康的再生的組織， 絲毫不留下移植物本身。
權(quán)利要求
1. 一種材料，所述材料包含三元共沉淀物，所述三元共沉淀物包含膠原蛋白、磷酸鈣材料和一種或多種糖胺聚糖。
2. 如權(quán)利要求l所述的材料，其中所述磷酸鈣材料選自透轉(zhuǎn)磷石、磷酸八鈣和/或磷灰石中的一種或多種。
3. 如權(quán)利要求2所述的材料，其中所述磷酸鈣材料選自透鈣磷石和磷酸八鈣的組合；透鈣磷石和磷灰石的組合；或磷酸八f丐磷灰石的組 合。
4. 如權(quán)利要求1所述的材料，其中所述材料適合轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣缮锊牧稀?br> 5. 如權(quán)利要求l所述的材料，其中所述三元共沉淀物由膠原蛋白、 透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖組成。
6. 如權(quán)利要求l所述的材料，其中所述材料是復合生物材料。
7. 如權(quán)利要求6所述的材料，所述復合生物材料用作骨或牙科替代 材料。
8. 如權(quán)利要求1 7中任一項所述的材料，其中所述膠原蛋白與所 述一種或多種糖胺聚糖已被交聯(lián)。
9. 如權(quán)利要求1 7中任一項所述的材料，其中所述膠原蛋白以5 重量％ 90重量％的量存在在所述材料中。
10. 如權(quán)利要求9所述的材料，其中所述膠原蛋白以15重量％ 60 重量％的量存在在所述材料中。
11. 如權(quán)利要求1 7中任一項所述的材料，其中所述一種或多種糖 胺聚糖以0.01重量％ 12重量。％的量存在在所述材料中。
12. 如權(quán)利要求ll所述的材料，其中所述一種或多種糖胺聚糖以1 重量％ 5.5重量％的量存在在所述材料中。
13. 如權(quán)利要求1 7中任一項所述的材料，其中，所述材料包含透 鈣磷石時，膠原蛋白與透鈣磷石的重量比為10:1 1:100。
14. 如權(quán)利要求13所述的材料，其中所述膠原蛋白與透鈣磷石的重量比為5:1 1:20。
15. 如權(quán)利要求1 7中任一項所述的材料，其中，所述材料包含磷 酸八鈣時，膠原蛋白與磷酸八鈣的重量比為10:1 1:100。
16. 如權(quán)利要求15所述的材料，其中所述膠原蛋白與磷酸八鈣的重 量比為5:1 1:20。
17. 如權(quán)利要求1 7中任一項所述的材料，其中膠原蛋白與一種或 多種糖胺聚糖總量的重量比為8:1 30:1。
18. 如權(quán)利要求1所述的材料，所述材料包含一種或多種磷酸鈣材 料的顆粒、膠原蛋白和一種或多種糖胺聚糖，其中所述膠原蛋白和所述 一種或多種糖胺聚糖交聯(lián)形成母體，所述磷酸鈣材料的顆粒分散在所述母體中，和所述磷酸鈣材料選自透鈣磷石、磷酸八鈣和/或磷灰石中的一種或多種。
19. 一種包含權(quán)利要求1 7或18中任一項所述材料的人工骨材料、 骨移植物、骨嫁接物、骨替代物、骨支架、填充物、涂料或粘固劑。
全文摘要
一種制備包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復合材料的方法，所述方法包括以下步驟提供包含膠原蛋白、鈣源和磷源以及一種或多種糖胺聚糖的酸性水溶液；和從所述水溶液中一起沉淀出膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖以形成三元共沉淀物。
文檔編號A61L27/28GK101391117SQ20081016901
公開日2009年3月25日 申請日期2004年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月28日
發(fā)明者塞麗娜·貝斯特, 威廉·邦菲爾德, 安德魯·林恩, 魯思·卡梅倫 申請人:劍橋企業(yè)有限公司