專利名稱：：一種抗菌丹參酮提取物、其制備方法、用途及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的說涉及一種抗菌丹參酮提取物、其制備方法、用途及其產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
：唇形科鼠尾草屬藥材丹參(拉丁學(xué)名及a汲c5WvfaeMz加wr//zae，英文名Salviaroot)是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中應(yīng)用最早而且最廣泛的植物藥之一，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品。該藥具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效。主要用于治療月經(jīng)不調(diào)、徵瘕積聚、熱痹疼痛、瘡瘍腫痛、心煩不眠、肝脾腫大等。'《中國藥典》收錄的藥材來源為唇形科植物丹參(5Wv/am沿/wr/^aBge.)的干燥根及根莖。但在民間還有一些同屬植物也被作為丹參的替代藥材在使用，他們具有相似的化學(xué)成分和藥理作用。傳統(tǒng)上中醫(yī)的方劑通常是水煮提取，即將丹參與其他一些草藥混合煎煮。丹參的化學(xué)成分可以分為兩大類水溶性成分脂溶性成分對丹參'有效成分'的早期研究主要集中在脂溶性成分方面，迄今為止已得到40余種化合物。這些化合物又可以分為兩類即丹參酮類(鄰醌型)羅列酮類(鄰羥基對醌型)。多數(shù)丹參酮類化合物屬于二萜化合物，其中大部分是二萜醌類化合物。發(fā)現(xiàn)化合物種類已有40余種。如丹參酮、隱丹參酮、丹參酮IIA、丹參酮IIB、丹參酸甲酯、羥基丹參酮IIA、異丹參酮I、異丹參酮II、異隱丹參酮、丹參新酮、左旋二氫丹參酮I、丹參新醌甲、丹參新醌乙、丹參新醌丙和丹參酚等。下面所示這些化合物的結(jié)構(gòu)H3CCH31Dihydrotanshinone0CH,2CryptotanshinoneCH33TanshinoneI4TanshinoneIIAl.二氫丹參酮3.丹參酮I2.隱丹參酮4.丹參酮IIA最早認(rèn)識的丹參脂溶性化合物藥理作用主要是其抗菌作用，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所進(jìn)行了丹參抗細(xì)菌、真菌、結(jié)核桿菌的一系列研究。研究結(jié)果表明總丹參酮對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，當(dāng)用濾紙片法測定在總丹參酮最低濃度每片含6,25嗎時，對敏感菌株209P仍有抑菌圈。又測定了其對臨床分離的50株耐紅霉素的抗藥性金黃色葡萄球菌株也顯示活性。測定對IO種抗菌素及丹參酮的敏感度，發(fā)現(xiàn)金葡菌對多種抗菌素耐藥時對丹參酮仍敏感。由丹參酮分離出IO個單體，用濾紙片法發(fā)現(xiàn)，其中5個單體有抗金葡菌作用，分別為隱丹參酮、二氫丹參酮、羥基丹參酮、丹參酮IIB、丹參酸甲酯。丹參酮IIA、丹參酮I、丹參新醌甲、乙、丙未見抗菌作用。朱嘉蓉等[4]對丹參酮IIA的抑菌活性及選用溶劑的相關(guān)性進(jìn)行了研究，早年文獻(xiàn)報道，以氯仿溶解樣品對丹參酮進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，丹參酮IIA不顯任何抗菌活性，現(xiàn)將其改為二甲基甲酰胺(DMF)溶解后,再利用瓊脂擴(kuò)散法以觀察其抑菌的效果，結(jié)果丹參酮IIA和丹參酮IIB對大腸桿菌的最低抑菌濃度分別是50，25pg/ml，對金黃色葡萄球菌ATCC225923的最低抑菌濃度分別是100，50pg/ml，對綠膿桿菌ATCC227853的最低抑菌濃度分別是50，25pg/ml，對溶血性鏈球菌的最低抑菌濃度分別是1215，25pg/ml。羅厚蔚等[5]對丹參酮類及有關(guān)化合物42種對結(jié)核桿菌的抑菌作用及他們的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了研究，表明醌式基團(tuán)是抑菌的必須基團(tuán)，從丹參中分離得到的19個天然醌類化合物均具有很強(qiáng)的抑菌活性，MIC為0.31—5mg/L，且丹參中臨醌化合物的抑菌活性高于對醌化合物。A環(huán)的羥基化或環(huán)內(nèi)脫氫均可導(dǎo)致抑菌活性下降。丹參酮呋喃環(huán)的a-H的不同取代可明顯影響抑菌活性。李建晴等[6]研究了丹參酮IIA、隱丹參酮以及它們的鐵鋅配合物對大腸桿菌、金葡菌的抑菌活性，結(jié)果表明，隱丹參酮抑制大腸桿菌、金葡菌強(qiáng)于丹參酮IIA，且抑制金葡菌活性高于抑制大腸桿菌活性。隱丹參酮與金屬離子配合后抗菌活性有所增強(qiáng)，尤其與鋅配合后抑菌活性有較大幅度提高。羅永江等[7]對甘肅丹參提取研制的消炎醌及其主要成分隱丹參酮、丹參酮IIA等做了體外抑菌實(shí)驗(yàn)。采用丙酮作溶劑，小檗堿、土霉素作對照，分別對金葡菌、枯草桿菌、無乳鏈球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、停乳鏈球菌等進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果供試物對金葡菌、枯草桿菌、無乳鏈球菌的抑菌作用均強(qiáng)于小檗堿，兩單體化合物又以隱丹參酮最強(qiáng)，但較土霉素差，而對綠膿桿菌、大腸桿菌、停乳鏈球菌基本無作用。最近，微生物學(xué)雜志(2007年8月刊p350-357)報道，丹參對抗甲氧西林金黃色葡萄球菌顯示了抗微生物活性。對不同的提取法進(jìn)行研究，包括甲醇，正己烷，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇和水。發(fā)現(xiàn)最佳活性是正己烷和氯仿提取的部位。正己垸提取物抗甲氧西林金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度是128嗎/ml。耐藥性是當(dāng)前急待解決的重大問題，有較強(qiáng)活性的抗菌藥物及產(chǎn)品具有很大的市場需求。根據(jù)以往研究及發(fā)明人對丹參中四個主要丹參酮類成分的抗耐藥菌的研究結(jié)果，丹參提取物中以隱丹參酮和二氫丹參酮兩種成分的抗菌活性最強(qiáng)，而丹參酮IIA和丹參酮I的活性較弱。目前在幾乎所有丹參植物原料及提取物中，丹參酮類成分以丹參酮IIA的含量最高，通?？梢哉嫉剿械⑼惓煞挚偭康?0%甚至更多。為了尋找一種更有效的丹參酮提取藥物，本發(fā)明特提供一種獨(dú)特的含有特定比例的丹參酮提取物，該提取物中以隱丹參酮含量最高，同時含有二氫丹參酮，多種有效成分發(fā)揮協(xié)同抗菌作用，增加療效，減少耐藥性產(chǎn)生的可能性。該提取物在較小的濃度下即對以下菌株顯示了很強(qiáng)的抗菌活性，比文獻(xiàn)報道的通常的丹參酮提取物活性更強(qiáng)，且耐藥性研究表明該特定比例的提取物不會產(chǎn)生耐藥性。甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌(MRSA)*甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)*凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)*鏈球菌，特別是肺炎鏈球菌。*痤痛桿菌CP.acwe勻同時，本發(fā)明并提供了適合工業(yè)生產(chǎn)的制備工藝，而不僅僅是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的樣品制備。該提取物可以用于制備治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染(MRSA)的藥物、消毒防護(hù)用品及治療痤瘡的美容護(hù)膚產(chǎn)品。本發(fā)明的目的是提供一種低劑量即可生效的抗甲氧西林金黃色葡萄球菌的有效藥物，且該藥物不易產(chǎn)生耐藥性，并提供了適合工業(yè)生產(chǎn)的制備工藝，而不僅僅是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的樣品制備。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一在于提供一種抗菌丹參酮提取物，該丹參酮提取物具有更合理的組分含量；本發(fā)明另一目的在于提供上述抗菌丹參酮提取物的制備方法，該方法簡便高效；本發(fā)明再一目的在于提供上述抗菌丹參酮提取物的用途；本發(fā)明最后一目的在于提供一種含有上述抗菌丹參酮提取物的制劑，該制劑可為藥用或其它用途。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案一種從Salviaspp.根中提取的抗菌丹參酮提取物，該提取物含有隱丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA，上述四種化合物的總重量含量大于等于該提取物總重量的15%，其中隱丹參酮重量含量大于等于四種化合物總重量的25%。所述Salviaspp.根為鼠尾草屬植物的根。本發(fā)明所述丹參酮提取物中主要成分為隱丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA，而其它成分則為丹參酮類衍生物，如丹參酮IIB、丹參酸甲酯等等，這都是為本領(lǐng)域技術(shù)人員都知曉的。以丹參酮提取物為主要成分的丹參酮膠囊已有多年臨床應(yīng)用，其安全性和有效性己經(jīng)得到很好的驗(yàn)證，本發(fā)明無需對其它成分再行贅述。根據(jù)所述的抗菌丹參酮提取物，所述四種化合物的總重量含量大于等于該提取物總重量的25%，其中隱丹參酮重量含量大于等于四種化合物總重量的30%。根據(jù)前面所述的抗菌丹參酮提取物，所述四種化合物的總重量含量大于等于該提取物總重量的35%，優(yōu)選為該提取物總重量的3599%;其中隱丹參酮重量含量大于等于四種化合物總重量的45%，優(yōu)選為提取物總重量的4595%。本發(fā)明經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)提高提取物中隱丹參酮含量，可以進(jìn)一步提高藥物治療效果。根據(jù)前面所述的抗菌丹參酮提取物，所述四種化合物的總重量含量大于等于該提取物總重量的45%，優(yōu)選為提取物總重量的4590%。其中隱丹參酮重量含量大于等于四種化合物總重量的55%，優(yōu)選為5585%。根據(jù)前面所述的抗菌丹參酮提取物，可進(jìn)一步優(yōu)選所述丹參酮IIA重量含量為四種化合物總重量的055%,優(yōu)選為050%，更優(yōu)選為040%，最優(yōu)選為020%。此外，根據(jù)前面所述的抗菌丹參酮提取物，還可再進(jìn)一步優(yōu)選二氫丹參酮含量為四種化合物總重量的540%，更優(yōu)選為535%，再優(yōu)選為530%，最優(yōu)選為1020%。本發(fā)明經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)丹參酮提取物中上述四種主要成分含量在特定范圍時，可以發(fā)揮很好的協(xié)同作用，進(jìn)一步提高療效，并減少耐藥性的產(chǎn)生。此外，人們通常認(rèn)為上述四種組分含量越高越好，而本發(fā)明卻發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)⑼狪IA含量較低時，反而更加利于藥效的發(fā)揮。譬如，可以優(yōu)選的是所述四種化合物的總重量含量為該提取物總重量的3599%，隱丹參酮重量含量為四種化合物總重量的4595%，丹參酮IIA重量含量為四種化合物總重量的050%，二氫丹參酮重量含量為四種化合物總重量的540%，其中二氫丹參酮重量含量還可優(yōu)選為四種化合物總重量的535%，更優(yōu)選為530%，其余為丹參酮I。此外，可以優(yōu)選的是所述四種化合物的總重量含量為該提取物總重量的3599%，隱丹參酮重量含量為四種化合物總重量的4595%，丹參酮IIA重量含量為四種化合物總重量的040%，二氫丹參酮重量含量為四種化合物總重量的540%，其中二氫丹參酮重量含量還可優(yōu)選為四種化合物總重量的535%，更優(yōu)選為530%，最優(yōu)選為1020%，其余為丹參酮I。此外，還可以優(yōu)選的是所述四種化合物的總重量含量為該提取物總重量的3599%，隱丹參酮重量含量為四種化合物總重量的4595%，丹參酮IIA重量含量為四種化合物總重量的020%，二氫丹參酮重量含量為四種化合物總重量的540%，其中二氫丹參酮重量含量還可優(yōu)選為四種化合物總重量的535%，更優(yōu)選為530%，最優(yōu)選為1020%，其余為丹參酮I。還譬如，可以優(yōu)選的是所述四種化合物的總重量含量為該提取物總重量的4590%，隱丹參酮重量含量為四種化合物總重量的5585%，丹參酮IIA重量含量為四種化合物總重量的040%，二氫丹參酮重量含量為四種化合物總重量的540%，其中優(yōu)選為535%，更優(yōu)選為530%，最優(yōu)選為1020%，其余為丹參酮I。另外還可以優(yōu)選的是所述四種化合物的總重量含量為該提取物總重量的4590%，隱丹參酮重量含量為四種化合物總重量的5585%，丹參酮IIA重量含量為四種化合物總重量的020%，二氫丹參酮重量含量為四種化合物總重量的540%，其中優(yōu)選為535%，更優(yōu)選為530%，最優(yōu)選為1020%，其余為丹參酮I。根據(jù)上面所述的抗菌丹參酮提取物，其中還可再進(jìn)一步優(yōu)選的是所述四種化合物的總重量含量為該提取物總重量的3599%，隱丹參酮重量含量為四種化合物總重量的4595%，二氫丹參酮重量含量為四種化合物總重量的530%，丹參酮IIA重量含量為四種化合物總重量的040%，其余為丹參酮I?；蛘哌M(jìn)一步優(yōu)選為所述四種化合物的總重量含量為該提取物總重量的4590%，隱丹參酮重量含量為四種化合物總重量的5585%，二氫丹參酮重量含量為四種化合物總重量的1020%，丹參酮IIA重量含量為四種化合物總重量的020X，其余為丹參酮I。根據(jù)前面所述的抗菌丹參酮提取物，可再進(jìn)一步優(yōu)選所述四種化合物的總重量含量為該提取物總重量的4099%，隱丹參酮重量含量為四種化合物總重量的5095%，二氫丹參酮重量含量為四種化合物總重量的530%，丹參酮I重量含量為四種化合物總重量的020%，丹參酮IIA重量含量為四種化合物總重量的040%。根據(jù)前面所述抗菌丹參酮提取物，所述提取物從丹參&J^a肌7"o/r力i^5"/7ge根中提取出來，但以下鼠尾草屬的植物亦可被使用g"i由-;iosa、5"aJw'agre収仏S"aJw'agiaranWca、SWva'a/J'sjM"J-ca、5"aJw'a一種制備前面所述丹參酮提取物產(chǎn)品的方法，所述制備方法包括滲漉提取和兩次純化步驟。所述滲漉方法一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉，即現(xiàn)有技術(shù)的任何滲漉方法均可用于制備本發(fā)明所述丹參酮提取物，但為了進(jìn)一步提高提取效果，本發(fā)明.所述滲漉提取優(yōu)選如下具體步驟(1)用高濃度乙醇充分浸泡原料；(2)用滲漉法提??；(3)真空濃縮，回收乙醇。采用本發(fā)明所述方案，能夠得到較高含量的隱丹參酮，而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，常規(guī)的溶劑回流提取往往由于收率過高而使隱丹參酮含量較低；超臨界萃取法往往得到較高含量的總丹參酮提取物但以丹參酮IIA為主要成分。根據(jù)前面所述的制備方法，所述滲漉提取還可進(jìn)一步再優(yōu)選為步驟(1)所述浸泡時間為1224小時，優(yōu)選為1520小時；步驟(2)所述滲漉法滲漉流速優(yōu)選為每小時藥材重量的1/31倍，滲漉收集液優(yōu)選為原料的518倍，更優(yōu)選712倍。根據(jù)前面所述的制備方法，所述第一次純化步驟優(yōu)選包括(1)用水或高濃度乙醇充分溶解提取物；(2)靜置沉淀；(3)分離沉淀和溶液，得到第一次純化物。步驟(1)中如果采用水溶解提取物，則步驟(3)中棄除水層，沉淀物為第一次純化物；但是如果步驟(1)采用了乙醇溶解，則步驟(3)中過濾掉沉淀物，乙醇溶液為第一次純化物，再將此乙醇溶液直接用于第二次純化。前面所述的制備方法，還可再優(yōu)選為步驟(a)所述水或高濃度乙醇用量為原料的520倍，更優(yōu)選為812倍。根據(jù)前面所述的制備方法，所述第二次純化過程使用吸附樹脂分離。所使用的吸附樹脂可以是各種型號的大孔吸附樹脂和各種系列的凝膠吸附樹脂。優(yōu)選用大孔吸附樹脂柱層析分離。大孔樹脂層析方法也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉，本領(lǐng)域技術(shù)人員在進(jìn)行本層析操作時無需再付出創(chuàng)造性勞動，但本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選所述用大孔吸附樹脂柱層析為采用弱極性或中等極性的大孔樹脂，更優(yōu)選采用AB-8或D101樹脂。且在樹脂使用過程中，通過細(xì)分不同濃度乙醇對不同丹參酮類成分洗脫能力的差異，達(dá)到對已知成分的分離和特定成分的富集。其分離步驟可以進(jìn)一步優(yōu)選為包括(1)用中等濃度的乙醇溶解第一次純化物；(2)上樹脂柱；(3)用中等濃度乙醇洗脫，并棄去洗脫液；(4)用較高濃度乙醇洗脫，獲得所述丹參酮提取物。其中步驟(3)所述中等濃度乙醇用量優(yōu)選為層析柱體積的25倍，更優(yōu)選3倍。此步驟中洗脫的為不需要的雜質(zhì)，因此本步驟洗脫液棄去不用；步驟(4)所述高濃度乙醇用量優(yōu)選為層析柱體積的520倍，更優(yōu)選812倍。本步驟(4)所述較高濃度洗脫液中才是最終的丹參酮提取物，收集此提取液，回收溶劑后減壓干燥既得提取物成品。而如何回收溶劑并減壓干燥，也為現(xiàn)有通常采用的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員無需再付出創(chuàng)造性勞動。根據(jù)前面所述的制備方法，所述中等濃度的乙醇優(yōu)選為60%乙醇，所述較高濃度的乙醇優(yōu)選為7095%乙醇，更優(yōu)選7590%的乙醇，最優(yōu)選7584%的乙醇。不同濃度乙醇洗脫樹脂柱對隱丹參酮含量影響非常大，在不同洗脫階段選用何種濃度的乙醇需進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)勞動。經(jīng)過多次嘗試，發(fā)現(xiàn)使用7095%的乙醇對有效成分進(jìn)行洗脫可以得到較高含量的目標(biāo)產(chǎn)物，而選擇7590%時可進(jìn)一步提高隱丹參酮含量。我們同時發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)降低乙醇濃度反而更加利于提取物純度的提高，譬如釆用7584%的乙醇可以將上述四種化合物及隱丹參酮含量達(dá)到最佳值。經(jīng)過上述方法純化，可進(jìn)一步提高隱丹參酮、二氫丹參酮的含量。并且本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，上述提取物再經(jīng)合適溶劑重結(jié)晶，還可進(jìn)一步提高隱丹參酮、二氫丹參酮的含量。在選擇結(jié)晶法提高上述成分含量的同時，丹參酮IIA的含量不但沒有提高，反而有所降低。因此能夠得到更高質(zhì)量的上述丹參酮提取物產(chǎn)品。根據(jù)前面所述的丹參酮提取物可用于制備抗菌藥物或其它產(chǎn)品，其中優(yōu)選用于制備治療痤瘡的藥物或其它產(chǎn)品。還可以優(yōu)選用于制備抗耐藥菌的藥物或其它產(chǎn)品，其中更優(yōu)選用于制備抗耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌藥物或其它產(chǎn)品。所述其它產(chǎn)品可以為化妝品、護(hù)膚品以及消毒劑等等。通過上述制備方法制得的本發(fā)明藥物活性組分，可作為藥物或化妝品配方中的活性成分與生理學(xué)上可接受的載體結(jié)合，制成制劑，以便能夠通過任何一種方便的途徑給與宿主。優(yōu)選外用或口服制劑。該提取物可用于制造抗菌藥，尤其適用于制備抗耐藥菌的藥物。它可用于抗以下菌株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)、凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)，以及鏈球菌，特別是肺炎鏈球菌。該提取物也可用于治療痤瘡美容護(hù)膚。痤瘡是痤瘡丙酸桿菌引起的皮膚疾病。一種含有前面所述丹參酮提取物的制劑產(chǎn)品，其特征在于，所述制劑產(chǎn)品以前面所述丹參酮提取物為活性成分，并加入一種或多種其它的適合輔料，所述制劑可供外用或內(nèi)服。這種制劑產(chǎn)品可以為藥用制劑產(chǎn)品，或者為前面所述的化妝品或護(hù)膚品制劑產(chǎn)品。在上述制劑產(chǎn)品中，所述丹參酮提取物有效濃度可小于64pg/ml或低于32pg/ml，可低至16pg/ml，甚至更低。在低濃度下仍能表現(xiàn)出顯著的活性。然而，上述制劑產(chǎn)品中其它輔料和制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉，譬如專利申請03144300，即公開了這樣一種含有丹參酮提取物的中藥組合物，其中還含有三七、冰片等其它成分。本發(fā)明所述丹參酮提取物同現(xiàn)有技術(shù)丹參酮提取物各個有效成分比例、含量不同，但依然能夠按照現(xiàn)有技術(shù)的方案進(jìn)行制劑制備。所述制劑制備完全不需要本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行創(chuàng)造性勞動，僅僅需要將現(xiàn)有技術(shù)的丹參酮提取物替換成本發(fā)明的丹參酮提取物即可，其它所添加的輔料和制備方法無需任何變動，或者稍做適應(yīng)性調(diào)整。而這種適應(yīng)性調(diào)整，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其自身掌握的技術(shù)知識是完全能夠?qū)崿F(xiàn)的。本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明得到的丹參酮提取物純度高；(2)本發(fā)明得到的丹參酮提取物中隱丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA比例更加合理，能夠發(fā)揮更好的臨床效果。(3)本發(fā)明所述的丹參酮提取方法簡單易行，效率高，可以得到成分更加合理的丹參酮提取物。圖1標(biāo)準(zhǔn)對照品的HPLC色譜圖，圖2乙酸乙酯提取物(實(shí)施例l)的HPLC色譜圖，圖3超臨界萃取提取物(實(shí)施例2)的HPLC色譜圖，圖4乙醇滲濾提取物(實(shí)施例3)的HPLC色譜圖，圖5實(shí)施例中本發(fā)明提取物(實(shí)施例5)的HPLC色譜圖，圖6實(shí)施例中本發(fā)明提取物的TLC薄層色譜指紋圖譜，圖6中薄層板上左列點(diǎn)為對照品；右列點(diǎn)為混合對照品(由下至上依次為二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA)具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:丹參藥材50g，粉碎后用4倍量95%乙醇回流提取3次，每次1小時。合并提取液。濃縮，回收乙醇。藥渣用4倍量的水提取2次，每次1小時。提取物用15ml水溶解，用石油醚萃取3次，每次15ml。水部分用乙酸乙酯萃取3次，每次15ml。合并乙酸乙酯萃取液，濃縮，干燥得乙酸乙酯萃取物2.45g。其中，總丹參酮的含量為18.38，隱丹參酮的含量為3.74，丹參酮IIA的含量為8.56%，丹參酮I含量4.64%，二氫丹參酮含量1.44%。實(shí)施例2:將粉碎后的丹參藥材裝入萃取釜，設(shè)定壓力為20MPa和溫度為45'C。將95%乙醇溶液流量為1.Oral/min，與C02混合后循環(huán)動態(tài)萃取60min。萃取液經(jīng)分離得到超臨界萃取提取物。其中，總丹參酮的含量為48.45，隱丹參酮的含量為5.26，丹參酮IIA的含量為39.40y。，丹參酮1含量2.75%，二氫丹參酮含量1.04%。實(shí)施例3:取丹參藥材1000g,用適量95%乙醇浸漬24h,均勻裝入滲漉筒中，滲漉提取，收集滲漉液量為藥材的12倍，滲漉速度為每小時900ml。將滲漉提取液減壓濃縮回收乙醇，制得丹參提取物56g。其中，總丹參酮含量為14.0%，隱丹參酮的含量為3.56%,丹參酮IIA的含量為5.92%，丹參酮I含量2.79%，二氫丹參酮含量1.74%。上述三個實(shí)施例中，實(shí)施例l采用了乙醇回流提取的方法，實(shí)施例2采用了二氧化碳超臨界萃取的方法，實(shí)施例3雖然進(jìn)行了滲漉提取，但沒有重結(jié)晶，得到的提取物含量均不能符合要求。而下面實(shí)施例中采用了本發(fā)明所述的技術(shù)方案進(jìn)行提取，各組分含量均優(yōu)于上述方法。實(shí)施例4:將實(shí)施例3中的50g丹參乙醇滲漉提取物以10倍量的水充分溶解，棄去水部分，得到水沉淀部分。水沉淀部分再以60%乙醇溶解，上2000mlD101型大孔樹脂進(jìn)行純化，并以60%乙醇洗脫雜質(zhì)后，用80-90%乙醇梯度洗脫，得到丹參酮大孔樹脂純化物10g。其中，總丹參酮含量42.9%，隱丹參酮的含量為19.0%，丹參酮IIA的含量為16.5%，丹參酮I含量3.82%，二氫丹參酮含量3.65%。實(shí)施例5:取丹參藥材50kg，用適量95%乙醇浸漬12h，均勻裝入滲漉筒中，滲漉提取，收集滲漉液量為藥材的9倍，滲漉速度為每小時25L。將滲漉液在60'C以下減壓濃縮，得到滲漉濃縮液。將此濃縮液加入適量95%乙醇充分溶解后，濾除沉淀，溶液再加入適量水調(diào)節(jié)乙醇濃度至60%，此藥液通過1800mlAB-8型大孔吸附樹脂柱，60%乙醇洗脫3倍樹脂體積后，80%乙醇洗脫12倍樹脂體積，收集80%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，得到總丹參酮提取物40g。其中，總丹參酮含量49.1%,隱丹參酮的含量為30.2%，丹參酮IIA的含量為8.6%，丹參酮I含量5.34%，二氫丹參酮含量4.96%。實(shí)施例6:取另一批號丹參藥材1000g，粉碎成粗粉，以適量95%乙醇浸漬12h，均勻裝入滲漉筒中，滲漉提取，乙醇用量為9倍，滲漉以每小時流量為每小時500ml。將滲漉液在60°C以下減壓濃縮得到滲漉濃縮液。將此濃縮液加入適量95%乙醇充分溶解后，濾除沉淀，溶液再加入適量水調(diào)節(jié)乙醇濃度至60%。此藥液通過1800mlAB-8型大孔吸附樹脂柱，以60%乙醇洗脫后，用80%乙醇洗脫6倍柱體積、用95%乙醇洗脫8倍柱體積，合并80%和95%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，得到總丹參酮提取物12.2g。其中，總丹參酮含量32.0%,隱丹參酮的含量為9.05%,丹參酮IIA的含量為14.62%，丹參酮I含量5.36%，二氫丹參酮含量3.92%。實(shí)施例7:將實(shí)施例3中50g丹參乙醇滲漉提取物以10倍量的水充分溶解，棄去水部分，得到水沉淀部分。水沉淀部分再以60%乙醇溶解，上2000mlD101型大孔樹脂進(jìn)行純化，并以60%乙醇洗脫雜質(zhì)后，用75%乙醇洗脫15倍柱體積，合并洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，得到總丹參酮提取物1.2g。其中，總丹參酮含量40.33%，隱丹參酮的含量為33.11%，丹參酮IIA的含量為0.29%，丹參酮I含量0.21%，二氫丹參酮含量6.72%。實(shí)施例8:取另一批號丹參藥材1000g，粉碎成粗粉，以適量95X乙醇浸漬12h，均勻裝入滲漉筒中，滲漉提取，乙醇用量為9倍，滲漉以每小時流量為每小時500ml。將滲漉液在60°C以下減壓濃縮得到滲漉濃縮液。取50g滲漉提取物以10倍量的水充分溶解，棄去水部分，得到水沉淀部分。水沉淀部分再以1000ml60。/。乙醇溶解，濾除不溶物，上2000mlD101型大孔樹脂進(jìn)行純化，并以60%乙醇洗脫雜質(zhì)后，用70%乙醇洗脫10倍柱體積，再用75%乙醇洗脫5倍柱體積，合并75%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，得到總丹參酮提取物0.6g。其中，總丹參酮含量72.6%,隱丹參酮的含量為59.6%，丹參酮IIA的含量為0.3%，丹參酮1含量0.4%，二氫丹參酮含量12.3%。實(shí)施例9:將實(shí)施例8中得到的丹參酮提取物0.5g以適量95%乙醇溶解，放置15小時，結(jié)晶，過濾，以少量乙醇洗滌，干燥，得到結(jié)晶0.35g。其中，總丹參酮含量90.6%,隱丹參酮的含量為74.2%，丹參酮IIA的含量為0.1%，丹參酮I含量0.2%，二氫丹參酮含量16.1%。實(shí)施例10:取另一批號丹參藥材1000g，粉碎成粗粉，以適量95%乙醇浸漬10h，均勻裝入滲漉筒中，滲漉提取，乙醇用量為10倍，滲漉以每小時流量為每小時1000ml。將滲漉液在60°C以下減壓濃縮得到滲漉濃縮液。取50g滲漉提取物以10倍量的水充分溶解，棄去水部分，得到水沉淀部分。水沉淀部分再以1000ml60。/。乙醇溶解，濾除不溶物，上2000mlD101型大孔樹脂進(jìn)行純化，并以65%乙醇洗脫雜質(zhì)后，用75%乙醇洗脫10倍柱體積，再用85%乙醇洗脫5倍柱體積，收集84%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，得到總丹參酮提取物0.6g。其中，總丹參酮含量76.8%,隱丹參酮的含量為42.2%,丹參酮IIA的含量為9.1%，丹參酮I含量0.9%，二氫丹參酮含量24.6%。實(shí)施例11:稱取50mg實(shí)施例5中的丹參酮提取物，溶于適量注射用油中，再稱取適量表面活性劑(如3g普羅尼克和甘油等)溶于適量的注射用水中，電磁攪拌下將前者緩慢滴加入后者，攪拌，將溶液在超聲，加水加至全量。微乳用濾膜過濾，用超級納米機(jī)勻化，制得含有0.5%本發(fā)明提取物的微乳制劑。實(shí)施例12:稱取適量凝膠基質(zhì)(如0.6g卡波姆)分散水中，放置過夜，加入3g丙二醇和6g潤濕劑(如甘油)攪拌均勻；另取一燒杯用適量溶劑(如3g丙二醇)超聲溶解O.12g實(shí)施例4中的丹參酮提取物；將上述二種溶液混和，攪拌均勻，向上述混和液中加入PH調(diào)節(jié)劑(如三乙醇胺)，邊加邊攪拌，再加入少量抗氧化劑(如尼泊金乙酯)，充分?jǐn)嚢?，制得含有約1%本發(fā)明提取物的凝膠制劑。實(shí)施例13:稱取5g實(shí)施例7中的丹參酮提取物，加入適量填充劑(如lg微晶纖維素)和崩解劑(如0.2g交聯(lián)PVP、CMS-Na)混勻，再加入少量潤滑劑(如硬脂酸鎂)，壓成1000片，制得本發(fā)名提取物的片劑。實(shí)施例14:稱取5g實(shí)施例7中的丹參酮提取物，用適量95%乙醇溶解后，加入注射用水和抗氧化劑，制得含有O.1%本發(fā)明提取物的消毒劑。試驗(yàn)例l:實(shí)施例1及實(shí)施例2中制備的樣品的抗菌活性研究研究單位國家細(xì)菌耐藥性監(jiān)測中心中國藥品生物制品檢定所抗生素室研究樣品實(shí)施例1及實(shí)施例2中制備的提取物研究結(jié)果1.初期預(yù)試驗(yàn)中實(shí)施例2中的超臨界萃取提取物的抗菌活性明顯弱于實(shí)施例1中的乙酸乙酯提取物。2.使用乙酸乙酯提取物對401個菌株進(jìn)行了抗菌活性測試；95%以上為臨床分離耐藥菌，其中有41株MRSA和17株MRCNS。3.預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，該樣品對革蘭氏陽性菌的活性好，對革蘭氏陰性菌的活性低，其抗菌譜具有較強(qiáng)的選擇性。4.對臨床分離的MRSA和MRCNS具有很強(qiáng)的抗菌活性。表1乙酸乙酯提取物抗菌活性測定結(jié)果代碼細(xì)菌名稱數(shù)平均MIC5(糞球菌Enterococcusfaecalis72〉512腸球菌Enterococcussp.5〉512大腸埃希菌Escherichiacoli4>512金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus12024表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidis12022肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae4347肺炎桿菌Klebsiellapneumoniaess.116->512綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa1>512馬鏈球菌Streptococcusequi1〉512馬腸疫鏈球菌Streptococcusequinus1128類馬鏈球菌Streptococcus,isimilis1〉512草綠色鏈球菌Streptococcusiridans，alpha-hem.564A群beta溶血鏈球菌Streptococcus,beta-haem.GroupA164B群beta溶血鏈球菌Streptococcus,beta—haem.GroupB2256,64C群beta溶血鏈球菌Streptococcus,beta-haem.GroupC264beta溶血鏈球菌Streptococcus,beta-haemolytic1532-〉512鏈球菌Streptococcus,sp.6256鏈球菌Streptococcus,sp.1256試驗(yàn)例2:本發(fā)明提取物的抗菌實(shí)驗(yàn)研究研究單位國家細(xì)菌耐藥性監(jiān)測中心中國藥品生物制品檢定所抗生素室。研究樣品實(shí)施例4制備提取物菌株來源國家細(xì)菌耐藥性監(jiān)測中心收集保存菌株107株。菌株經(jīng)Phoenix100System細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定。試驗(yàn)用菌株包括(1).金黃色葡萄球菌87株(MRSA52株、MSSA35株)；(2).凝固酶陰性葡萄球菌23株(MRCNS4株、MSCNS19株)；(3).鏈球菌7株(其中肺炎鏈球菌5株)。藥敏試驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法測定分離菌株對氟氯西林/氨芐西林的最低抑菌濃度(MIC)，實(shí)驗(yàn)方法按照美國CLSI/NCCLS2006年版規(guī)定進(jìn)行。M-H肉湯培養(yǎng)基為英國0xoid公司產(chǎn)品。質(zhì)量控制菌株包括金黃色葡萄球菌ATCC29213和肺炎鏈球菌ATCC49619。數(shù)據(jù)分析用世界衛(wèi)生組織提供的WH0NET-5.3軟件分析。研究結(jié)果1.質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213和肺炎鏈球菌ATCC49619對青霉素的MIC結(jié)果符合CLSI/NCCLS2006年版判定的范圍。2.實(shí)施例4中樣品對葡萄球菌，包括甲氧西林敏感、耐藥的葡萄球菌和鏈球菌、肺炎鏈球菌有較好的抗菌活性。樣品對各菌株的MIC值的結(jié)果見表2-6。表2實(shí)施例4樣品對葡萄球菌和鏈球菌臨床分離株的MlC(叫/ml)菌種檢測菌株數(shù)MIC5。(叫/ml)MlU(嗎/ml)MlC&g/ml)范圍<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3beisanmrsa16429zjmrsa709037〉84beisanmrsa21830zjmrsa61104585rarsal5831mrsa4045246832gxmrsa749787mu50433zjmrsal6057848mrsa420834zjmrsa60702249mrsal3835zjmrsa608007>810mrsal9836gxmrsa7402811mrsa2437mrsa516484412511400438mrsa516467813虹sa3409839mrsa516390414mrsa3479840gxmrsa3536815zjrarsa619057>841gxmrsa4221816mrsa5002842gxmrsa5450817gdmrsa69443z加rsa809078〉818mrsa5120844gxmrsa7345>819mrsa60578845mrsal27007820wuhao846gdmrsal2821tnrsa5153847zjmrsa731066822z加rsa614036848zjmrsa723053823z加rsa614036849z加rsa723017>824zjmrsa613066>850zjmrsa711067825zjmrsa612011〉851zjmrsa710008826z加rsa708015〉852gxmrsa63728注*為萬古霉素中介的金黃色葡萄球菌。表523株凝固酶陰性葡萄球菌的MIC值序號菌種編號MIC(叫/ml)序號菌種編號MIC(|ig/ml)1s印207481813105510>82sep786814sepl5483s印20735781553724484who681621222925s印99981721215826sep339418SEP154-287209166>8191559>88s印207518820Zhongshsnyitt〉89sep474821mrse511453tt810s印207742>822mrse36915#811s印212419223msse79647tt8121040234注#為甲氧西林耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌表67株鏈球菌的MIC值序號菌種編號MIC(叫/ml)序號菌種編號MIC(—1)1spyl9615165*spnl6732162承spnA534166*hb733-15163承spn724167sagl3813164*spn630516注*為肺炎鏈球菌。試驗(yàn)例3:本發(fā)明提取物對Propionibacteriumacnes(P.acnes)的活性研究單位MDSPha皿Service研究樣品實(shí)施例5中樣品研究方法將精制丹參酮提取物加入含有痤瘡桿菌P.acnes(ATCC6919;1x104to5x105CFU/mL)的培養(yǎng)皿，在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)(增強(qiáng)的梭狀芽孢桿菌培養(yǎng)基，37°C)。最終接種物濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)光密度曲線進(jìn)行調(diào)整。在37。C培養(yǎng)48小時后，進(jìn)行檢測。分別以(+)和(-)表示抑制和不抑制。測試了從0.03iig/mL-100ug/mL八個不同的濃度，Ampicillin0.1ug/mL作為陽性對照。計算MIC和MBC。研究結(jié)果該提取物具有抑制痤瘡桿菌P.acnes的活性，其MIC為10ug/mL，MBC是30ug/mL。表7本發(fā)明提取物對P.acnes的抑制活性(-=不抑制；+=抑制).0.03ug/mL_^_^_0.1ug/mL一一0.3Pg/mL一—1Pg/mL一-3yg/mL——10yg/mL+—30ug/mL++100ug/mL++試驗(yàn)例4:本發(fā)明提取物產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性的研究研究單位SchoolofHealthandBioscience,UniversityofEastLondon研究樣品實(shí)施例5中樣品使用菌株OxfordStaphylococcusaureus(NCTC6571)和3個臨床分離服SA菌株T3，102andMRSA99研究方法將高濃度的細(xì)菌(107cfu/ml-l)在本發(fā)明提取物的不同抑菌濃度下進(jìn)行培養(yǎng)。分別在第4天和第7天將其加入到含有不同濃度的本發(fā)明提取物的培養(yǎng)基中，每周一次按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定MIC值。研究結(jié)果在為期三周的培養(yǎng)中，本發(fā)明藥物的樣品的MIC值沒有發(fā)生改變。而對照藥物ciprofloxacin兩周后在以上4個菌株中其MIC值均發(fā)生改變，表明耐藥性的產(chǎn)生而本發(fā)明藥物則未產(chǎn)生耐藥性。試驗(yàn)例5色譜條件圖3和圖5色譜條件色譜柱AtlantisdC18(5um，250X4.6腿)。檢測波長255nm。柱溫25°C。流速lml/min流動相以甲醇(A)-水(B)進(jìn)行梯度洗脫。時間(分鐘)流動相A(y。)流動相B(y。)03575^354570—10030—045501000圖1，2和4色譜條件色譜柱AtlantisdC18(5線250X4.6誦)。檢測波長255nm。柱溫25°C。流速lml/min流動相以甲醇(A)-水(B)進(jìn)行梯度洗脫。時間(分鐘)流動相A(8/。)流動相B(呢)055ii^557563—7037—30759570—9030—10圖6色譜條件使用硅膠G薄層板，以石油醚一四氫呋喃一甲醇(10:2:1)為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視。權(quán)利要求1、一種從Salviaspp.根中提取的抗菌丹參酮提取物，該提取物含有隱丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA，其特征在于，上述四種化合物的總重量含量大于等于該提取物總重量的15％，其中隱丹參酮重量含量大于等于四種化合物總重量的25％。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌丹參酮提取物，其特征在于，所述四種化合物的總重量含量大于等于該提取物總重量的25%，其中隱丹參酮重量含量大于等于四種化合物總重量的30%。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗菌丹參酮提取物，其特征在于，所述四種化合物的總重量含量大于等于該提取物總重量的35%，其中隱丹參酮重量含量大于等于四種化合物總重量的45%。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗菌丹參酮提取物，其特征在于，所述四種化合物的總重量含量大于等于該提取物總重量的45%，其中隱丹參酮重量含量大于等于四種化合物總重量的55%。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗菌丹參酮提取物，其特征在于所述四種化合物的總重量含量為該提取物總重量的3599%，隱丹參酮重量含量為四種化合物總重量的4595%。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗菌丹參酮提取物，其特征在于所述四種化合物的總重量含量為該提取物總重量的4590%，隱丹參酮重量含量為四種化合物總重量的5585%。7、根據(jù)權(quán)利要求16任意一項(xiàng)所述的抗菌丹參酮提取物，其特征在于，所述丹參酮IIA重量含量為四種化合物總重量的055%，優(yōu)選為050%，更優(yōu)選為040%，最優(yōu)選為020%。8、根據(jù)權(quán)利要求16任意一項(xiàng)所述的抗菌丹參酮提取物，其特征在于，所述二氫丹參酮重量含量為四種化合物總重量的540%，優(yōu)選為535%，更優(yōu)選為530%，最優(yōu)選為1020%。9、根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗菌丹參酮提取物，其特征在于所述四種化合物的總重量含量為該提取物總重量的4099%，隱丹參酮重量含量為四種化合物總重量的5095%，二氫丹參酮重量含量為四種化合物總重量的530%，丹參酮I重量含量為四種化合物總重量的020%，丹參酮IIA重量含量為四種化合物總重量的040%。10、根據(jù)權(quán)利要求19任意一項(xiàng)所述抗菌丹參酮提取物，其特征在于，所述提取物從丹參SalviamiltiorrhizaBunge根中提取出來。11、一種制備權(quán)利要求110任意一項(xiàng)所述丹參酮提取物產(chǎn)品的方法，其特征在于，所述制備方法包括滲漉提取和兩次純化步驟。12、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的制備方法，其特征在于，所述滲漉提取具體步驟包括(1)用高濃度乙醇充分浸泡原料；(2)用滲漉法提??；(3)真空濃縮，回收乙醇。13、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的制備方法，其特征在于，所述第一次純化步驟包括(1)用水或高濃度乙醇充分溶解提取物；(2)靜置沉淀；(3)分離沉淀和溶液，得第一次純化物。14、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的制備方法，其特征在于，所述第二次純化過程為用樹脂柱層析分離，所述樹脂柱優(yōu)選大孔吸附樹脂柱。15、根據(jù)權(quán)利要求14所述的制備方法，其特征在于，其分離步驟包括(1)用中等濃度的乙醇溶解所述第一次純化物；(2)上樹脂柱；(3)用中等濃度乙醇洗脫，并去洗脫液；(4)用較高濃度乙醇洗脫，獲得所述丹參酮提取物。16、根據(jù)權(quán)利要求12、13或15任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述中等濃度的乙醇是指60%乙醇，所述較高濃度的乙醇是指7095%乙醇。17、根據(jù)權(quán)利要求110任意一項(xiàng)所述的丹參酮提取物產(chǎn)品可用于制備抗菌藥物或其它產(chǎn)品，其中優(yōu)選用于制備治療痤瘡的藥物或其它產(chǎn)品，或者優(yōu)選用于制備抗耐藥菌的藥物或其它產(chǎn)品，更優(yōu)選用于制備抗耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌藥物或其它產(chǎn)品。18、一種含有權(quán)利要求110任意一項(xiàng)所述丹參酮提取物的制劑產(chǎn)品，其特征在于，所述制劑產(chǎn)品以權(quán)利要求110任意一項(xiàng)所述丹參酮提取物為活性成分，并加入一種或多種其它的適合輔料，所述制劑可供外用或內(nèi)服。全文摘要本發(fā)明涉及一種從Salviaspp.根中提取的抗菌丹參酮提取物、其制備方法、用途及其產(chǎn)品。該提取物含有隱丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA，所述四種化合物的總重量含量為該提取物總重量的40～99％，隱丹參酮重量含量為四種化合物總重量的50～95％，二氫丹參酮重量含量為四種化合物總重量的5～30％，丹參酮I重量含量為四種化合物總重量的0～20％，丹參酮IIA重量含量為四種化合物總重量的0～40％。所述制備方法包括滲漉提取和兩次純化步驟。所述提取物用于制備抗菌藥物或其它產(chǎn)品。本發(fā)明得到的丹參酮提取物純度高，各成分比例更加合理，能夠發(fā)揮更好的臨床效果。文檔編號A61P31/00GK101411745SQ20081016722公開日2009年4月22日申請日期2008年10月15日優(yōu)先權(quán)日2007年10月15日發(fā)明者忠鐘申請人:博仲盛景醫(yī)藥技術(shù)(北京)有限公司