專利名稱：一種體外制備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外制備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)移因子是從淋巴細胞中提取的一種低分子多肽與核酸復(fù)合物，能特異性或非特 異性地提高機體免疫功能，傳遞免疫信息，被譽為細胞免疫激活劑。它無種屬特異性，可在 種屬間傳遞，動物來源可用于人類。 轉(zhuǎn)移因子常規(guī)的制備方法是將動物新鮮或冷凍的脾臟及淋巴結(jié)在25t:左右去 除脂肪及結(jié)締組織，然后用純化水洗凈；將洗凈的組織切成小塊，加入適量水，用組織搗碎 機破碎細胞，制成勻漿，加適量純化水，混勻，置_201:反復(fù)凍融5 8次，融化溫度不得超
過37t:;將凍融的勻漿離心(離心溫度4t:)，去沉淀，留上清液備用；上清液裝透析袋，透
析24-48小時，半成品過濾除菌；成品的配置與檢驗。 轉(zhuǎn)移因子是經(jīng)誘導(dǎo)，由動物免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的可對抗外源性病原體的防御性肽 類活性物質(zhì)，分子量小、活性強，具有抗細菌、真菌、病毒和原蟲作用，甚至對癌細胞也具有 殺傷作用，應(yīng)用十分廣泛。轉(zhuǎn)移因子作為具有特異性與非特異性的免疫活性細胞調(diào)節(jié)因子， 廣泛應(yīng)用于治療任何動物病毒性疾病、真菌感染、細胞免疫減弱或缺陷病以及惡性腫瘤的 輔助治療，并有好的療效。但制備轉(zhuǎn)移因子的工藝繁瑣復(fù)雜、回收率低、無特異性。本發(fā)明 通過體外制備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子特異性強、產(chǎn)出率高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中制備的及轉(zhuǎn)移因子針對疾病沒有特異性，治療效 果不穩(wěn)定等缺點，提供一種體外免疫法生產(chǎn)特異性強、成本低、產(chǎn)出率高、效果更好的抗雞 傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案概述如下 —種體外制備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，由如下步驟 組成 (1)無菌采取實驗雞脾臟或抗凝血，用脾臟或外周血制備淋巴細胞單層； [ooog] (2)對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng)； (3)當(dāng)淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素和雞傳染性支氣管炎病毒誘導(dǎo)培 養(yǎng)，即獲得體外制備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。剌激雞脾細胞和雞血淋巴細胞增殖的植物血凝素劑的質(zhì)量濃度為50-100mg/L。
本發(fā)明的優(yōu)點 本發(fā)明以較少的雞脾臟或外周血為原料，制成淋巴細胞單層，在體外培養(yǎng)，然后用 植物血凝素和雞傳染性支氣管炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)誘導(dǎo)淋巴細胞單層即可體外生產(chǎn)出大量抗 雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的混合體，本發(fā)明的方法制備的抗雞傳染性支氣管
3炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子無需進一步的提純，直接將混合體用于禽類，即可起到抗雞傳染性 支氣管炎病毒及抗菌的作用，同時提高禽類的免疫力。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例1 : —種體外制備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，步驟
(1)無菌采取抗凝血，用外周血制備淋巴細胞單層，步驟為 無菌靜脈采取動物全血25毫升，加0. 8%肝素溶液0. 3ml抗凝，靜置45分鐘，用
帶膠球吸管吸取紅細胞層以上的所有血漿，特別是緊接紅細胞層上的白細胞層要盡量吸
取，分裝于消毒離心管內(nèi)，用PBS (pH為7. 2)液反復(fù)洗滌2 3次，離心速度800 1200轉(zhuǎn)
/分，然后用含30%犢牛血清水解乳蛋白40毫升進行白細胞培養(yǎng)，均勻混合后分裝于容量
100毫升培養(yǎng)方瓶或磚瓶中，塞緊瓶塞，置37t:恒溫箱中或磚瓶機中培養(yǎng)，經(jīng)2 3天，白細
胞均勻貼壁，即制成淋巴細胞單層。 (3)對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng)； 在作傳代細胞培養(yǎng)前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，以確定細胞已長成單層， 即可進行細胞的傳代培養(yǎng)。 (4)當(dāng)淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素(終濃度為100mg/L)和雞傳染性 支氣管炎病毒(終濃度為1280血凝單位/ml)誘導(dǎo)培養(yǎng)。 (5)經(jīng)培養(yǎng)2 3天，離心細胞培養(yǎng)液，收集上清，上清液在4t:下磁力攪拌透析， 超濾除菌，即制成特異型轉(zhuǎn)移因子。 轉(zhuǎn)移因子濃度的測定、抑菌實驗的方法、半成品和成品的檢驗項目均同實施例1。 本方法生產(chǎn)的的轉(zhuǎn)移因子為黃色澄明液體，多肽含量0. 43g/L，核糖含量0. 35g/L。
實施例2 —種體外制備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，步驟
(1)無菌采取實驗雞脾臟，用脾臟制備淋巴細胞單層，步驟為
A、處理雞脾臟 取新鮮雞脾臟置于無菌玻璃容器中，加入PBS(pH為7. 2)溶液浸泡半小時或浸于 質(zhì)量百分濃度為1 %的新潔爾滅溶液中，取出以酒精消毒脾臟表面，用解剖剪及鑷子去除脾 臟脂肪及包膜，用PBS(pH為7. 2)液洗滌一次，再將脾臟剪成小段移入平皿中，最后用眼科 剪將脾臟剪成lmm3小塊，再用PBS (pH為7. 2)液洗滌2_3次，以去除血細胞、色素物質(zhì)及剪 碎過程中機械損傷的細胞；
B、消化及分散組織塊 將上步清洗過的PBS(pH7. 2)液吸掉、將剪碎的組織塊移入錐形瓶中，按組織塊體 積的5倍量加入0. 25%胰蛋白酶液(pH為7. 6 7. 8)，置37"水浴中消化20 40分鐘。 每隔10分鐘搖動一次錐形瓶，以便組織塊散開，以利繼續(xù)消化，直到組織變成松散、表面發(fā) 毛時為止，這時從水浴中取出錐形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用PBS(pH為7. 2)液洗滌2 3 次，用0. 5%水解乳蛋白-Hanks液洗，用口徑稍大的細管吹打數(shù)次，用四層紗布濾過；
C、細胞計數(shù)
采用血球計數(shù)板進行計數(shù)，計數(shù)方法與白細胞計數(shù)相同；
D、細胞懸液的分裝和培養(yǎng) 按細胞計數(shù)結(jié)果，將細胞懸液用DMEM營養(yǎng)液調(diào)整至60萬/毫升細胞懸液。將細 胞懸液分裝入細胞培養(yǎng)瓶(100ml)和細胞轉(zhuǎn)瓶，分裝量為該瓶容量的1/5，蓋上蓋，做好標(biāo) 識，然后將細胞培養(yǎng)瓶和轉(zhuǎn)瓶分別放在二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機上培養(yǎng)；
E、觀察 置于37t:培養(yǎng)的細胞，需逐日進行觀察。若細胞已生長，則要觀察細胞的形態(tài)特征
并判斷其所處的生長階段直至形成淋巴細胞單層。
(3)對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng) 在作傳代細胞培養(yǎng)前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下現(xiàn)察，以確定細胞已長成單層， 即可進行細胞的傳代培養(yǎng)。
(4)當(dāng)淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素和雞傳染性支氣管炎病毒誘導(dǎo)培
養(yǎng) 當(dāng)脾淋巴傳代細胞長成單層后，更換維持液同時加入植物血凝素(終濃度為
75mg/L)和雞傳染性支氣管炎病毒(終濃度為640血凝單位/ml)誘導(dǎo)培養(yǎng)。 (5)誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時后，將細胞培養(yǎng)物經(jīng)超聲破碎后取樣，并檢測轉(zhuǎn)移因子的濃度。
轉(zhuǎn)移因子濃度的測定對轉(zhuǎn)移因子的定量多以多肽含量定量用Folin-酚法或分 光光度法測定多肽含量，以多肽含量lmg為一個轉(zhuǎn)移因子單位。本方法生產(chǎn)的的轉(zhuǎn)移因子 為黃色澄明液體，多肽含量0. 38g/L，核糖含量0. 28g/L。
半成品和成品的檢驗 半成品檢定半成品進行細菌內(nèi)毒素、無菌檢查、pH值等項檢測。
成品檢定成品分別作轉(zhuǎn)移因子和的鑒別試驗、外觀檢測、pH值、多肽含量、特異
活性試驗、蛋白質(zhì)反應(yīng)、無菌檢查、細菌內(nèi)毒素、異常毒性等項檢驗。 實施例3 —種體外制備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，步驟
(1)取新鮮雞脾臟置于無菌玻璃容器中，加入PBS(pH為7. 2)溶液浸泡半小時或浸 于質(zhì)量百分濃度為1 %的新潔爾滅溶液中，取出以酒精消毒脾臟表面，用解剖剪及鑷子去除 脾臟脂肪及包膜，用PBS (pH為7. 2)液洗滌一次，再將脾臟剪成小段移入平皿中，最后用眼 科剪將脾臟剪成lmm3小塊，再用PBS (pH為7. 2)液洗滌2-3次； (2)將上步清洗過的PBS(pH7. 2)液吸掉、將剪碎的組織塊移入錐形瓶中，按組織 塊體積的5倍量加入0. 25%胰蛋白酶液(pH為7. 6 7. 8)，置37。C水浴中消化20 40 分鐘。每隔10分鐘搖動一次錐形瓶，以便組織塊散開，以利繼續(xù)消化，直到組織變成松散、 表面發(fā)毛時為止，這時從水浴中取出錐形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用PBS(pH為7. 2)液洗滌 2 3次，用0. 5%水解乳蛋白-Hanks液洗，用口徑稍大的細管吹打數(shù)次，用四層紗布濾過；
(3)將細胞懸液用DMEM營養(yǎng)液調(diào)整至60萬/毫升細胞懸液，然后分裝入細胞培養(yǎng) 瓶和細胞轉(zhuǎn)瓶，分別放在二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機上培養(yǎng)； (4)經(jīng)2 3天，白細胞均勻貼壁，即制成淋巴細胞單層，可進行細胞的傳代培養(yǎng)。 當(dāng)長成單層后，更換維持液同時用植物血凝素(終濃度為70mg/L)和雞傳染性支氣管炎病
5毒(終濃度為640血凝單位/ml)誘導(dǎo)培養(yǎng)。 (5)經(jīng)培養(yǎng)1 2天，離心細胞培養(yǎng)液，收集上清，上清液透析，超濾除菌，上清液即
為特異型轉(zhuǎn)移因子。 應(yīng)用實例 100只15日齡肉雞(經(jīng)過健康檢查無菌)分為A、B、C、D、E共5組，B、C、D、E組經(jīng)過人工感染0. 5ml雞傳染性支氣管炎病毒強毒攻毒后作實驗。A組為健康組，不感染病毒，不給藥；B組陰性對照組，感染病毒，不給藥；C組為本發(fā)明藥物低劑量組，按禽0. 5ml/只雞/天肌肉注射；D組為本發(fā)明藥物高劑量組，按禽1. 0ml/只雞/天注射飼喂；E組為黃芪多糖組(天津生機集團股份生物有限公司)，按禽0.5g/只雞/天注射注射。結(jié)果表明，采用本發(fā)明藥物治療雞傳染性傳染性支氣管炎病毒病有著明顯的療效。
本發(fā)明特異性轉(zhuǎn)移因子實驗結(jié)果如下
編號組另IJ_死亡率％ '治愈率％_有效率％
~~健康組 5 100.0(20/20) 100.0(20/20)
B 陰性對照組 95.0(19/20) 0(0/20) 20.0(4/20) 本次試驗結(jié)果表明，該藥物低、高劑量治療組與對照組差異非常顯著(P < 0. 01)，說明本發(fā)明藥物對病毒引起的雞傳染性支氣管炎病毒病具有顯著的治療作用。且與"黃芪多糖"組療效相當(dāng)(P>0.01)。 上述參照實施例對抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法進行的
詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不
脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
C 低劑量治療組 25.0(50/20) 30.0(6/20) 75 (15/20)
D 高劑量治療組 15.0(3/20) 75.0(15/20) 75.0(17/20)E "黃芪多糖"組25.0(5/20) 20.0(4/20)_65.0(13/20)
權(quán)利要求
一種體外制備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征是由如下步驟組成(1)無菌采取雞脾臟或雞血，用脾臟或外周血制備淋巴細胞單層；(2)對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng)；(3)當(dāng)淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素和雞傳染性支氣管炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)，即獲得體外制備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求書1中體外制備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制 備方法，其特征是剌激雞脾細胞和雞血淋巴細胞增殖的植物血凝素劑的質(zhì)量濃度為 50-100mg/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種體外制備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法。本發(fā)明雞脾臟或外周血為原料，制成淋巴細胞單層，然后用植物血凝素和雞傳染性支氣管炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)淋巴細胞，體外生產(chǎn)出大量抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。本發(fā)明的方法體外制備的抗特異性轉(zhuǎn)移因子用于治療雞傳染性傳染性支氣管炎病，同時提高禽類的免疫力。
文檔編號A61K35/14GK101757027SQ20081015241
公開日2010年6月30日 申請日期2008年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者王連民, 田杏芳 申請人:天津生機集團股份有限公司