專利名稱：一種制備乳酸芽孢、丁酸芽孢桿菌活菌制品的新方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種乳酸芽孢、丁酸芽孢桿菌的活菌制劑的廉價(jià)制備方法。
背景技術(shù)：
乳酸芽孢桿菌、丁酸芽孢桿菌作為一類對(duì)人類、動(dòng)物有益的微生物，由于能形成芽孢，制成活菌制劑時(shí)，干燥相對(duì)簡(jiǎn)單，制品貯存活菌穩(wěn)定，通過胃酸時(shí)不易被殺死，比一般的微生物活菌制劑選用的菌株，如乳酸桿菌、雙歧桿菌、糞鏈球菌、酵母菌等飼用微生物菌株擁有明顯優(yōu)勢(shì)。美國專利US5.520936(1996)利用乳酸芽孢桿菌制備一種食品添加劑；日本專利JP11322622將乳酸芽孢桿菌用來治療皮膚病；US5.292523(1994)、US4.892731(1990)、JP63-146825(1986)、JP61-6625(1984)、JP06-166825(1994)、JP05-227898(1993)等專利涉及丁酸芽孢桿菌的特性及活菌制劑的制備和用途。但所有這些專利中，乳酸芽孢桿菌和丁酸芽孢桿菌發(fā)酵所用培養(yǎng)基的氮源都是牛肉膏、蛋白胨和酵母膏等生化培養(yǎng)基，因此價(jià)格昂貴。
發(fā)明目的針對(duì)培養(yǎng)基成本高的不足，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵原料成本降低而發(fā)酵液活菌數(shù)提高的制備乳酸芽孢、丁酸芽孢桿菌活菌制劑的新方法，技術(shù)方案本發(fā)明的一種制備乳酸芽孢、丁酸芽孢桿菌活菌制劑的方法，包括培養(yǎng)基的制備、發(fā)酵、離心、干燥，其特征在于利用酶生物技術(shù)處理植物蛋白原料制得基本培養(yǎng)基，再加入碳源和無機(jī)鹽，用于乳酸芽孢、丁酸芽孢桿菌單獨(dú)發(fā)酵培養(yǎng)，形成生物量大、芽孢形成率高的發(fā)酵物，再經(jīng)離心、賦形、干燥、制得乳酸芽孢、丁酸芽孢桿菌的干粉活菌制品。
現(xiàn)對(duì)乳酸芽孢、丁酸芽孢桿菌的干粉活菌制劑的制備過程進(jìn)行詳細(xì)敘述。
1、植物蛋白原料與水按1∶5-20的混合均勻，然后將該混懸液加熱至50-90℃保持10-30分鐘進(jìn)行預(yù)處理。植物蛋白原料包括大豆蛋白粉、玉米蛋白粉。
2、預(yù)處理好的混懸液調(diào)pH至6-9，加入水解酶，水解酶可以是堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸蛋白酶，但以堿性蛋白酶為佳；加酶量為100-600單位/克水解物，以200-300單位/克水解植物蛋白原料為佳。水解溫度為40-80℃，水解時(shí)間為20-40分鐘。
3、述水解液過濾得水解植物蛋白上清液，在上清液中加入無機(jī)鹽和糖，制得二個(gè)菌株單獨(dú)發(fā)酵液體培養(yǎng)基，其配方范圍為1-5％植物蛋白水解物(干物資含量)，0.1-0.5％無機(jī)鹽，0.1-0.5％糖，pH值為6.5-8.0，其余為水。無機(jī)鹽可以是氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉；糖可以是葡萄糖、蔗糖、乳糖。
5、將菌種種子液接種到上面得到的滅菌培養(yǎng)基中直接液體發(fā)酵或與載體混合固體發(fā)酵。發(fā)酵溫度以35-37℃為佳；發(fā)酵時(shí)間以24-48小時(shí)為佳，均發(fā)酵至芽孢形成率達(dá)95％以上停止培養(yǎng)。
5、于液體發(fā)酵物，先進(jìn)行高速離心收集菌體，再賦形、干燥；對(duì)于固體發(fā)酵物，直接賦形、干燥。干燥溫度為20-80℃，干燥至菌粉水含量小于5％。
有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比具有發(fā)酵活菌數(shù)量大、芽孢形成率高、生產(chǎn)成本低廉、產(chǎn)品活菌貯存穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步敘述。
實(shí)施例1稱取10Kg低溫脫脂豆粕，加入100L水，攪拌加熱至90℃；恒溫20分鐘，然后降溫至60℃進(jìn)行離心沉降，將取得上清液并將pH調(diào)至8.5，加20g活力為10萬單位/克的堿性蛋白酶于50℃酶水解30分鐘制得大豆蛋白水解液。將該水解液泵入1噸發(fā)酵罐中，加入1.2Kg氯化鈉、2.4Kg蔗糖，加水補(bǔ)充至600L，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.5后高壓滅菌得放大用液體培養(yǎng)基。
將乳酸芽孢桿菌從斜面接種到3升的MRS液體培養(yǎng)基中，36℃搖床培養(yǎng)16小時(shí)左右，達(dá)到活菌數(shù)5億/毫升后，接種到上述豆粕水解培養(yǎng)基中，36℃，通入300升/分鐘的無菌空氣，攪拌培養(yǎng).培養(yǎng)24小時(shí)左右取樣顯微鏡觀察，至95％以上的細(xì)菌從桿狀轉(zhuǎn)變?yōu)闄烟覡疃松挎吆螅瑝喝氲?5000rpm的高速管式離心機(jī)離心收集菌泥；將收集的菌泥與賦形劑混合干燥得菌粉24Kg，活菌數(shù)為220億/克。
其中MRS液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨 1.0％ 酵母膏 0.5％乙酸鈉 0.5％ 檸檬酸三銨 0.2％葡萄糖 1.0％ 土溫-80 0.1％硫酸鎂 0.02％ 硫酸錳 0.005％pH調(diào)至7.2 補(bǔ)充水至100％實(shí)施例2稱取10Kg含70％蛋白質(zhì)的玉米蛋白粉，加100L水，攪拌均勻加熱至90℃，攪拌維持20分鐘后降溫至70℃，調(diào)pH至7.0，加10g 14萬單位/克的木瓜蛋白酶于70℃酶水解30分鐘。往該水解液加水補(bǔ)充至200L，加入0.6Kg葡萄糖，0.4Kg氯化鈉和0.4Kg磷酸氫二鈉，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.5后高壓滅菌得放大用水解玉米蛋白水解液體培養(yǎng)基。
將丁酸芽孢桿菌從斜面接種到2升的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12時(shí)，達(dá)到活菌數(shù)10億/毫升后，接種到上述玉米蛋白水解培養(yǎng)基中；然后將該接種液體營(yíng)養(yǎng)液與250Kg固體載體碳酸鈣混合均勻后，于37℃通氮厭氧固體培養(yǎng)48小時(shí)。取樣顯微鏡觀察99％以上的細(xì)菌從桿狀轉(zhuǎn)變?yōu)樗鬆羁昭挎撸瑢⒃摴腆w培養(yǎng)物，加入賦形劑混合搓顆粒，置于50℃真空干燥4小時(shí)，得干燥菌粉310Kg，活菌數(shù)為12億/克。
實(shí)施例3
用實(shí)施例1和實(shí)施例2方法獲得的乳酸芽孢桿菌粉(2.2×1010個(gè)/克)和丁酸芽孢桿菌粉(1.2×109個(gè)/克)，進(jìn)行了穩(wěn)定性試驗(yàn).將兩種樣品用鋁塑復(fù)合袋密封分裝，保存在25℃的恒溫箱中，定期測(cè)定活菌數(shù)，.活菌數(shù)的測(cè)定方法，將等測(cè)試樣用0.9％滅菌生理鹽水以10倍稀釋法稀釋，將0.1毫升涂布在培養(yǎng)皿內(nèi)的MRS瓊脂平板上，用37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)后，數(shù)瓊脂上的菌落，乘以稀釋倍數(shù)，得出活菌數(shù).菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果見表1。
表1活靈活現(xiàn)數(shù)結(jié)果

結(jié)果表明，本發(fā)明制備的乳酸芽孢桿菌體和丁酸芽孢桿菌體能在室溫下穩(wěn)定生存24個(gè)月。
實(shí)施例4利用MRS培養(yǎng)基和利用植物蛋白水解液作培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸芽孢桿菌和丁酸芽孢桿菌的發(fā)酵物活菌數(shù)、芽孢形成率、發(fā)酵原料成本(換算成活菌數(shù)10×108個(gè)/克)對(duì)照結(jié)果見表2.
表2發(fā)酵液活菌數(shù)、芽孢形成率、發(fā)酵原料成本對(duì)照

從表2可以看出，植物蛋白水解液培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基相比，發(fā)酵液活菌數(shù)提高50％以上、芽孢形成率均有明顯提高，而發(fā)酵原料成本降低70％以上，經(jīng)濟(jì)效益非常顯著。
權(quán)利要求
1.一種制備乳酸芽孢、丁酸芽孢桿菌活菌制劑的方法，包括培養(yǎng)基的制備、發(fā)酵、離心、干燥，其特征在于培養(yǎng)基利用酶生物技術(shù)處理植物蛋白原料制得，所述的酶生物技術(shù)包括(1)、植物蛋白原料與水按1∶5-20的混合均勻，然后將該混懸液加熱至50-90℃保持10-30分鐘進(jìn)行預(yù)處理；(2)、預(yù)處理好的混懸液調(diào)pH至6-9，加入水解酶，加酶量為100-600單位/克水解物，水解溫度為40-80℃，水解時(shí)間為20-40分鐘；(3)、上述水解液過濾得水解植物蛋白上清液，在上清液中加入無機(jī)鹽和糖，制得二個(gè)菌株單獨(dú)發(fā)酵液體培養(yǎng)基，其配方范圍為1-5％植物蛋白水解物(干物資含量)，0.1-0.5％無機(jī)鹽，0.1-0.5％糖，pH值為6.5-8.0，其余為水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于植物蛋白原料是大豆蛋白、玉米蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于水解酶是堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸蛋白酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于無機(jī)鹽是氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉；糖是葡萄糖、蔗糖、乳糖。
全文摘要
一種制備乳酸芽孢、丁酸芽孢桿菌活菌制劑的新方法，利用酶生物技術(shù)處理植物蛋白原料制得培養(yǎng)基，用于乳酸芽孢、丁酸芽孢桿菌單獨(dú)發(fā)酵培養(yǎng)，形成生物量大、芽孢形成率高的發(fā)酵物，再經(jīng)離心、賦形、常溫以上溫度干燥、制得乳酸芽孢、丁酸芽孢桿菌的干粉活菌制劑。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)成本低廉，產(chǎn)品活菌穩(wěn)定，效果優(yōu)良。
文檔編號(hào)A61K35/66GK1403567SQ0114204
公開日2003年3月19日 申請(qǐng)日期2001年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月7日
發(fā)明者溫朗聰, 董永軍, 張賓紅, 王曉曦, 趙汝鳴 申請(qǐng)人:大連化工研究設(shè)計(jì)院