專利名稱：含有納米相鈣磷鹽、膠原和海藻酸鹽的骨材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有納米相鈣磷鹽、膠原和海藻酸鹽的骨材料的制備方法，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
骨修復的研制開發(fā)一直是生物醫(yī)學工程領(lǐng)域科學工作者努力的方向。現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了包括金屬、陶瓷、高分子以及其復合材料制成的多種骨修復材料，但是由于力學性能，生物相容性以及降解性等方面的不足，手術(shù)中實際使用的骨修復材料效果最好的還是自體骨和異體骨。但是自體骨和異體骨有分別有數(shù)量有限和存在免疫排斥，感染疾病的危險的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種含有納米相鈣磷鹽、膠原和海藻酸鹽的骨材料的制備方法，該材料以仿生合成的鈣磷鹽、蛋白質(zhì)和多糖為原料，使其微觀結(jié)構(gòu)具有仿骨特性，因而具有很好的生物相容性和生物活性。
本發(fā)明提出的含有納米相鈣磷鹽、膠原和海藻酸鹽的骨材料的制備方法，包括下列各步驟(1)在酸溶的膠原溶液中緩慢滴加含有鈣離子的溶液，加入鈣離子的量為每克膠原滴加鈣離子0.01～0.16mol，滴加的同時攪拌，其中，用以溶解膠原的酸為鹽酸、硝酸或乙酸，膠原溶液的濃度為5.0×10-5～5.0×10-3g/ml。
(2)在上述第1步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加含磷酸根離子的水溶液，加入的磷酸根離子的量與第1步中加入的鈣離子的量的摩爾比為Ca∶P＝1～2∶1。
(3)在上述第2步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加NaOH溶液至pH值為6～8，PH值用試紙或pH計測定，在pH值為5～6時開始出現(xiàn)沉淀，pH值為7時出現(xiàn)白色懸濁液。
(4)將溶液靜置1～5天，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復清洗三次后，放入凍干機內(nèi)冰凍干燥，隨后研磨制得干粉備用。
(5)將上述第4步制得的干粉與海藻酸鈉以質(zhì)量比為10～1∶1的比例混合后，加少量水充分調(diào)和，固體粉末與水的質(zhì)量比為1∶3～0.5，生長因子如重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(以下簡稱BMP)可以在此步以水溶液的形式加入，加入量為每克固體粉末中加入1～10毫克。
(6)將充分調(diào)和后的產(chǎn)物填入外表面帶微孔的模具中，置于重量百分比濃度為0.5～10％的氯化鈣溶液中浸泡8小時以上，至材料成型以后脫模。
(7)將脫模后的材料在蒸餾水中浸泡12～48小時，在30～50℃烘干，或在-5～-20℃冷凍后放入冰凍干燥機中除去水分，前一種方法將得到比較致密高強度的骨材料。而后一種方法將得到帶有孔洞結(jié)構(gòu)的骨框架材料。
上述產(chǎn)品用環(huán)氧乙烷蒸氣消毒2～4小時，或用Co60照射消毒后保存?zhèn)溆谩?br> 發(fā)明中以生物自組裝的方法合成了納米晶磷酸鈣膠原基復合材料，該材料由納米相的鈣磷鹽和膠原分子自組裝而成。它在納米尺度上具有重復片層結(jié)構(gòu)，周期為10-15nm，由膠原層和鈣磷鹽層交替排列而成，由于其從成分和結(jié)構(gòu)上仿天然骨，因此具有很好的生物相容性和很高的生物活性。發(fā)明中的另一種原料海藻酸鈉是目前在組織工程中用作細胞支架的生物材料主要是一種天然高分子材料。它具有無毒、親水、生物相容性及細胞親和性好的特點。發(fā)明中制備的材料的強度主要由鈣化的海藻酸鹽提供，其強度值和降解性能都和海藻酸鈉的加入量及鈣化程度有關(guān)。這就可以在一定程度上調(diào)整材料的降解速度。通過把這種生物相容性好，降解速度可控，易于成型的天然高分子材料和納米晶磷酸鈣膠原基復合材料整合為高孔隙率的框架材料，得到了有著優(yōu)異生物相容性和生物活性的可降解骨替代材料，可以作為可降解骨替代材料在醫(yī)療方面得到廣泛應用。樣品制備過程中還可以加入適量的生長因子，最大限度的提高材料的生物活性。材料在微觀結(jié)構(gòu)上仿骨和采用天然原料是本發(fā)明的兩大特點，材料也因此具有優(yōu)異的生物性能。
根據(jù)本發(fā)明的方法制備的骨材料，具有優(yōu)異的生物相容性，而且結(jié)構(gòu)上也具有仿骨性。其鈣磷鹽晶體尺寸在納米量級，與有機成分膠原的結(jié)合緊密，排列有一定規(guī)律。由于采用的是天然原料此材料的生物相容性也很好。且此材料強度和孔隙率合理，可以作為植入型可降解骨材料得到應用。
具體實施例方式本發(fā)明所用的膠原為益而康公司的I型膠原凝膠(濃度固含量1％，所含膠原為純化的牛皮膠原)，CELLON公司購買的液態(tài)I型膠原(濃度0.3％溶液PH值由HCl調(diào)整所含膠原為純化的牛皮膠原)，天津第二附屬醫(yī)院的I型膠原凝膠(濃度固含量1％，所含膠原為純化的牛跟腱膠原)；所用的含PO43-的溶液為Na2HPO4，H3PO4，(NH4)2HPO4的水溶液；所用的含鈣離子的溶液為CaCl2·6H2O，Ca(NO3)2，CaCl2·2H2O的水溶液。使用的海藻酸鈉來自Acros Co.、青島膠南明月海藻工業(yè)、北京西四化工原料等公司。
實施例1所用材料為從益而康公司購買的I型膠原凝膠(濃度固含量1％，所含膠原為純化的牛皮膠原)、分析純CaCl2·6H2O、分析純Na2HPO4、海藻酸鈉來自Acros Co.。
(1)將20g膠原凝膠溶于300ml 0.5M乙酸溶液中，緩慢滴加18.3ml 1mol/l CaCl2和11ml 1mol/l Na2HPO4，滴加的同時用磁力攪拌器攪拌；(2)繼續(xù)攪拌，同時緩慢滴加0.5mol/l的NaOH溶液至PH值為7；
(3)靜置溶液1天，除去上清，離心分離出沉淀用去離子水反復清洗三次后放入凍干機內(nèi)進行冰凍干燥，研磨后制得干粉備用；(4)將2.4克第(3)步制得的干粉與0.6克海藻酸鈉混和后加5毫升蒸餾水充分調(diào)和。
(5)將調(diào)和后的產(chǎn)物填入外表面帶微孔的模具中，微孔直徑為0.45微米，于5％(w％)的氯化鈣溶液中浸泡12小時后脫模。
(6)脫模后的材料在蒸餾水中浸泡12小時后于-20℃冷凍，隨后放入冰凍干燥機中32小時除去水分。
(7)將第(6)步的產(chǎn)品用環(huán)氧乙烷蒸氣消毒2小時后保存。
實施例2所用材料為天津第二附屬醫(yī)院的I型膠原凝膠(濃度固含量1％，所含膠原為純化的牛跟腱膠原)、分析純CaCl2·2H2O、分析純(NH4)2HPO4、海藻酸鈉來自北京西四化工原料公司。
(1)20g膠原凝膠溶于300ml 0.1M HNO3溶液中，緩慢滴加10ml 1mol/l CaCl2和10ml 1mol/l (NH4)2HPO4，滴加的同時用磁力攪拌器攪拌；(2)繼續(xù)攪拌，同時緩慢滴加0.5mol/l的NaOH溶液至PH值為7；(3)靜置溶液4天，除去上清，離心分離出沉淀用去離子水反復清洗三次后放入凍干機內(nèi)進行冰凍干燥，研磨后制得干粉備用；(4)將1.8克第(3)步制得的干粉與0.6克海藻酸鈉混和后用3毫升重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 BMP的懸浮液充分調(diào)和，BMP的含量為16.8毫克。
(5)將調(diào)和后的產(chǎn)物填入外表面帶微孔的模具中，微孔直徑為0.45微米，于5％(w％)的氯化鈣溶液中浸泡24小時后脫模。
(6)脫模后的材料在蒸餾水中浸泡48小時后于30℃烘干24小時。
(7)將第(6)步的產(chǎn)品用環(huán)氧乙烷蒸氣消毒4小時后保存。
實施例3所用材料為CELLON公司購買的液態(tài)I型膠原(濃度0.3％溶液PH值由HCl調(diào)整所含膠原為純化的牛皮膠原)、分析純的CaCl2·6H2O、分析純H3PO4(含量＞＝85％密度1.689g/ml)，海藻酸鈉來自Acros Co.。
(1)100ml膠原溶液中滴加溶于10ml去離子水中的1.125ml H3PO4，滴加的同時用磁力攪拌器攪拌；(2)稱取結(jié)晶良好的6.01g CaCl26H2O溶于20ml去離子水，使其完全溶解，將其滴加入上一步制得的溶液中后，繼續(xù)攪拌1小時；(3)繼續(xù)攪拌，同時緩慢滴加0.75mol/1的NaOH溶液至PH值為7；(4)靜置溶液1天，除去上清，離心分離出沉淀用去離子水反復清洗三次后放入凍干機內(nèi)進行冰凍干燥，研磨后制得干粉備用；(5)將2.1克第(4)步制得的干粉與0.3克海藻酸鈉混和后用5毫升重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP)的懸浮液充分調(diào)和，BMP的含量為7.2毫克。
(6)將調(diào)和后的產(chǎn)物填入外表面帶微孔的模具中，微孔直徑為0.45微米，于3％(w％)的氯化鈣溶液中浸泡32小時后脫模。
(7)脫模后的材料在蒸餾水中浸泡1小時后于-10℃冷凍，隨后放入冰凍干燥機中32小時除去水分。
(8)將第(7)步的產(chǎn)品用環(huán)氧乙烷蒸氣消毒2小時后保存。
實施例4所用材料為益而康公司購買的I型膠原凝膠(濃度固含量1％，所含膠原為純化的牛皮膠原)、分析純Ca(NO3)2、分析純Na2HPO4，海藻酸鈉來自Acros Co.。
(1)20g膠原凝膠溶于300ml 0.5M乙酸溶液中，緩慢滴加16.5ml 1mol/lCa(NO3)2和11ml 1mol/l H3PO4，滴加的同時用磁力攪拌器攪拌；(2)繼續(xù)攪拌，同時緩慢滴加0.5mol/l的NaOH溶液至PH值為7；(3)靜置溶液1天，除去上清，離心分離出沉淀用去離子水反復清洗三次后放入凍干機內(nèi)進行冰凍干燥，研磨后制得干粉備用；(4)將2克第(3)步制得的干粉與1.5克海藻酸鈉混和后直接填入外表面帶微孔的模具中，微孔直徑為0.6微米，于8％(w％)的氯化鈣溶液中浸泡12小時后脫模。
(5)將脫模后的材料在蒸餾水中浸泡24小時，隨后在45℃下烘干24小時(6)參照國標用Co60照射消毒后保存。
實施例5所用材料為益而康公司購買的I型膠原凝膠(濃度固含量1％，所含膠原為純化的牛皮膠原)、分析純CaCl2·6H2O、分析純Na2HPO4，海藻酸鈉來自青島膠南明月海藻工業(yè)。
(1)30g膠原凝膠溶于300ml 0.5M乙酸溶液中，緩慢滴加18.3ml 1mol/l CaCl2和11ml 1mol/l Na2HPO4，滴加的同時用磁力攪拌器攪拌；(2)繼續(xù)攪拌，同時緩慢滴加0.5mol/l的NaOH溶液至PH值為7；(3)靜置溶液5天，除去上清，離心分離出沉淀用去離子水反復清洗三次后放入凍干機內(nèi)進行冰凍干燥，研磨后制得干粉備用；(4)將1.8克第(3)步制得的干粉與0.6克海藻酸鈉混和加2毫升蒸餾水充分調(diào)和。
(5)將調(diào)和后的產(chǎn)物填入外表面帶微孔的模具中，微孔直徑為0.6微米，于10％(w％)的氯化鈣溶液中浸泡8小時后脫模。
(6)脫模后的材料在蒸餾水中浸泡30分鐘后于-20℃冷凍，隨后放入冰凍干燥機中24小時除去水分。
(7)將第(6)步的產(chǎn)品用環(huán)氧乙烷蒸氣消毒4小時后保存。
權(quán)利要求
1.一種含有納米相鈣磷鹽、膠原和海藻酸鹽的骨材料的制備方法，其特征在于該方法包括下列各步驟(1)溶的膠原溶液中緩慢滴加含有鈣離子的溶液，加入鈣離子的量為每克膠原滴加鈣離子0.01～0.16mol，滴加的同時攪拌，其中，用以溶解膠原的酸為鹽酸、硝酸或乙酸，膠原溶液的濃度為5.0×10-5～5.0×10-3g/ml；(2)在上述第1步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加含磷酸根離子的水溶液，加入的磷酸根離子的量與第1步中加入的鈣離子的量的摩爾比為Ca∶P＝1～2∶1；(3)在上述第2步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加NaOH溶液至pH值為6～8，PH值用試紙或pH計測定，在pH值為5～6時開始出現(xiàn)沉淀，pH值為7時出現(xiàn)白色懸濁液；(4)將溶液靜置1～5天，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復清洗三次后，放入凍干機內(nèi)冰凍干燥，隨后研磨制得干粉備用；(5)上述第4步制得的干粉與海藻酸鈉以質(zhì)量比為10～1∶1的比例混合后，加少量水充分調(diào)和，固體粉末與水的質(zhì)量比為1∶3～0.5；(6)充分調(diào)和后的產(chǎn)物填入外表面帶微孔的模具中，置于重量百分比濃度為0.5～10％的氯化鈣溶液中浸泡8小時以上，至材料成型以后脫模；(7)將脫模后的材料在蒸餾水中浸泡12～48小時，在30～50℃烘干，或在-5～-20℃冷凍后放入冰凍干燥機中除去水分，得到骨框架材料。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在上述第5步中以水溶液的形式加入生長因子重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2，加入量為每克固體粉末中加入1～10毫克。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有納米相鈣磷鹽、膠原和海藻酸鹽的骨材料的制備方法,首先在酸溶的膠原溶液中緩慢滴加含有鈣離子的溶液,然后在該溶液中邊攪拌邊緩慢滴加含磷酸根離子的水溶液,再邊攪拌邊緩慢滴加堿液調(diào)pH值,將溶液靜置,除去上清,離心分離出沉淀,研磨制得干粉,將干粉與海藻酸鈉混合,加水調(diào)和,調(diào)和后的產(chǎn)物填入模具中,成型、脫模、并在蒸餾水中浸泡,干燥后得到骨材料。本發(fā)明的方法制備的骨材料,具有優(yōu)異的生物相容性,結(jié)構(gòu)上也具有仿骨性。其鈣磷鹽晶體尺寸在納米量級,與有機成分膠原的結(jié)合緊密,排列有一定規(guī)律。由于采用的是天然原料此材料的生物相容性也很好。此材料強度和孔隙率合理,可以作為植入型可降解骨材料得到應用。
文檔編號A61L27/24GK1337271SQ0114190
公開日2002年2月27日 申請日期2001年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月21日
發(fā)明者崔福齋, 張曙明, 廖素三, 馮慶玲 申請人:清華大學