專利名稱:靶向惡性腦瘤的功能化樹狀大分子基因載體系統(tǒng)的制作方法
靶向惡M瘤的功能化樹狀大M基因載體系統(tǒng)
fe^領(lǐng)域I本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及耙向惡'M瘤基因傳遞并對惡'M瘤進fi1 治療的功能化樹狀大^T基因載體系統(tǒng)。
背景獄惡SM瘤是極具危害的顱內(nèi)腫瘤,從肝生物學和細胞生物學的原理和角度,它是
一類以細胞惡性增殖為基本特征的疾病,往纟iS浸潤性生長,無明顯界限,手術(shù)船隹完全切除。 與全身各系鄉(xiāng)中瘤相比,惡ffiif瘤患者自出現(xiàn)癥輕死亡的平均期限不及半年,手術(shù)加放療的平 均存活期未逾~¥。采用手術(shù)、放療、化療綜合治療,惡1 ^腦生存率1年為45%、 2年20%。 腦臓瘤細胞動力學表明若手術(shù)切除99%的腫瘤,8周后腫瘤細胞則可恢復到原微目,為改善 惡幽中瘤的予販,迫ftX們探索新的治療途徑。
腫瘤的基因治療^ffl過向腫瘤細胞中引入功能性基因,調(diào)控細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導及蛋白表達,達 至柳帝鵬瘤細胞增殖的目的,這已成為當前腫瘤治療研究的熱點之一。在過去的十多年中,大量
試劑棚于體外細胞培養(yǎng)中,以增3SM粒DNA、反義核酸等遺4彌質(zhì)的轉(zhuǎn)染效率。這對式劑包括 陽離子脂復合物、多膚、表面活性劑、月旨質(zhì)體及其它試劑等。它們在許多方面優(yōu)于病毒載體,如 無免疫原性、無潛在的感染危險,以及妒方法簡單易行。但這些試劑的轉(zhuǎn)染效率通常不如腺病 ^^S組載體,因此明顯限制其i頓。
對于惡'M瘤的治療,基因治療還存在體內(nèi)傳遞的障礙,由于jfiLfi屏障的存在,常規(guī)的基因 載體體內(nèi)注射后難于傳避鵬內(nèi),因此開發(fā)功能化的基因載體,使基因被介導i!3llfiL腦屏障并耙
向于腫瘤,是腦瘤治療體內(nèi)基因傳遞的首要問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是樹共一種可以實現(xiàn)體內(nèi)腫瘤細胞的靶向和瘤細胞內(nèi)基因的高效轉(zhuǎn)染,
有J娜制腫瘤生長的靶向惡',瘤的功能化樹狀大肝基因載體系統(tǒng)。
本發(fā)明衝共的靶向惡m瘤的功能化樹狀大肝基因載體系統(tǒng)是以,蛋白、織蛋白單克
隆抗體或多克隆抗體、葉酸、表皮生長因子受,克隆抗體或多克隆抗體、RGD環(huán)肽中的一種或 多種的組合為靶向性功能因子,化學聯(lián)擬附狀大肝聚,-胺(PAMAM)載體上,再與治療 因子寡+維酸、siRNA肝頗粒DNA復合后制得,靜敗湖啦體定位注射后可以實現(xiàn)體內(nèi)腫
瘤細胞的耙向和瘤細胞內(nèi)基因的高效轉(zhuǎn)染,有 娜制腫瘤生長。
戶;M的聚itK-i^體是聚,安-胺樹狀^,其ftm為3 7代。
本發(fā)明戶腐的基因載體系^^3i以下步麟喊
第一、取1 100M份數(shù)的靶向性功能因子溶解于緩沖溶液中,fc甲基亞砜中,配^Si 濃度為0.01~90%的溶液,得溶液A;
第二取i ioo重量份數(shù)的聚ma安-胺溶解于去離子水,或緩沖溶液,或有機溶劑中,鵬重
量濃度為0.01~90%的溶液,得溶液B;.
第三、取0.05-500重量份數(shù)的EDC[l-[3-(dimethylamino) propyl]-3"ethylcarbodiimide HC1溶于 緩沖溶液中,Sfii^i濃度為0.01~90%的溶液,得溶液C;
第四、在-2(TC 8(TC^f牛下,將溶液A與溶液B混合均勻,逐步滴加溶液C,反應0.5~72
小時;
第五、將上步反應^對7K5t析后冷凍千燥,得到靶向惡鵬瘤的功能化樹狀大肝基因載
體;
第六、取1-100重量份數(shù)的第五頻幌的耙向惡'M瘤的功能化樹狀大^基因載,解于 緩沖溶液中,加入1~64重量份數(shù)的治療因子,渦流震蕩1~1200粥中,得到耙向惡,瘤的功能 化樹狀大好基因載體系統(tǒng)。
臓的緩沖溶液為生 7尺、磷酸陽磷鵬緩沖溶液、氯化鈉-鹽酸緩沖溶液、Tris緩沖溶液或 碳,-碳隨鈉緩沖溶fc
用于聚醐安-胺溶解的有機蹄偽甲醇、乙醇或丙酮。
所述的靶向性功能因子是,蛋白、,蛋白單克隆抗體或多克隆抗體、葉酸、表皮生長因 子受,克隆抗體或多克隆抗體、RGD環(huán)肽中的一種或兩種以上的組合;所丞的聚 -胺載體是 聚翻安-胺樹狀分子,其代數(shù)為3 7代;所述的治療因子是治療性鎌苷酸、質(zhì)粒DNA或siRNA 分子。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極鄉(xiāng)
本發(fā)明掛共的靶向惡fete瘤的功能化樹狀大好基因載體系統(tǒng),艦埋植、立體定位注射、 靜詠注射和頸動脈注射,可以體內(nèi)靶向于惡ttfi瘤細胞,并實現(xiàn)基因在瘤細胞中的高效轉(zhuǎn)染,達 到良好的治療效果。
與商業(yè)化的基因載體Oligofectamin和未纟Slf,的PAMAM相比,F(xiàn)A-PAMAM在體內(nèi)夕卜均 倉腿著的提高基因的靶向性鵬能力。
圖1是不同功能化載粘寡蹄酸復合后的謝電子顯微境照片;圖中,入未改性的PAMAM 為密實的實心球體,粒子分布均勻,粒徑大小經(jīng)過透射電鏡標準尺寸測雖得出其值在50nm 左右;B,葉酸修飾后并不改變PAMAM的基本形繊征和粒子大小,粒子仍實心球體,分布 較均勻,粒徑大小經(jīng)過透射尺寸標準(表2-l)測量換算后得出其值也在50nm左右;C,在 N/P比為32:1時,與單純的載體粒子相比,復,粒子的形繊征仍未勝改變,粒子分布 均勻,粒徑大小在60-80nm,此時的照片襯度很高,粒子呈密實的小球狀;D,在N/P比為32:1 時,復合物粒子的形態(tài)特征與N/P比為16:1時相同,不同的艦時照片的襯度很低;E在N/P 比為64:1時,復合物粒子的形態(tài)呈現(xiàn)出各種的自聚集結(jié)構(gòu),在我們拍擬啲圖中,64:l的FA-PAMAM/ODN 復,呈現(xiàn)為簇狀束, 64:l的PAMAM/ODN復合物分子則為扇形組裝結(jié)構(gòu); 圖2影就細胞儀檢測不同載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效萄ODN由FITC標記),圖中,A為空白鎌 苷酸,B為寡聚脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染寡核苷酸,C為樹狀大分子聚酰胺-胺轉(zhuǎn)染寡核苷酸,D為葉酸-樹 狀大肝聚酰胺-胺轉(zhuǎn)染寡核苷酸; 圖3是荷瘤鼠生,分析;
圖4是MRI動態(tài)檢測動物模型的生長狀況(上對照組大鼠顱內(nèi)腫瘤強化MRI, A為一周后,
B為兩周后;下治療組大鼠顱內(nèi)腫瘤強化MRI, C為一周后,D為兩周后,E為三周后);
圖5是FA-PAMAM/ODN、 PAMAM/ODN、 Oligofectamin/ODN和裸ODN靜脈注射24小時 后體內(nèi)組織,官分布。
本發(fā)明提供的具有體內(nèi)靶向BW瘤的功能化樹狀大分子基因載體系統(tǒng)包括
(一) 、靶向惡性瘤的功能化樹狀大分子基因載體的制備
(二) 、基因載粘治療因子(治療性基因)復合,制錢因載體系統(tǒng)
(三) 、惡腿瘤基因治療駄
技術(shù)方案l:以荷C6膠質(zhì)瘤大鼠為動辦莫型,按功能化載體所載基因重量與動物重量比1:
IO(MOOOO稱取功能化載體與治療性基因復^j,頸動E^lt洽療惡'M瘤。
技術(shù)方案2:以荷C6皿瘤大鼠為動辦IM,按功能化載體所,因《與動 *比1:
10(M國稱取功能化載體與治療性基因復,,靜脈激治療惡'W瘤。
技術(shù)方案3:以荷C6,瘤大鼠為動辦難,按功能化載體所,因M與動tM比l-
IO(MOOOO稱取功能化載體與治療性基因復^/, ^^瘤瘤腔內(nèi)立體定位注射治療惡I4H瘤。
實施例l
(1) lmg葉酸溶于lmL二甲基亞砜中,得溶液A。 (2) 10mg聚醐安-胺5代樹狀大肝溶 于lmL去離子水中,得溶液B。 (3) 3mgEDC溶解于lmL碳M-碳WL鈉緩沖溶液中,得溶液C。 室溫下將溶液A與溶液B混合均勻,逐步滴加溶液C,反應4小時。將i^反lS^tl對7Kii析后 冷凍千燥,得葉酸改性的聚醐安-胺基因載體。其鄉(xiāng)電子顯微鏡照片如圖la。 (4)將葉酸改性的 聚醐安-胺與l,25mg寡核苷酸,渦^M蕩10併中,得到含有耙向惡鵬瘤的功能化樹狀大肝基 因載體系統(tǒng)的溶液D。 (5)將溶液0過0.22膜,尾靜脈ait至C6荷瘤鼠,24小時后體內(nèi)分布如 圖5。 (6)將溶液0過0.22膜,瘤腔內(nèi)定位艦,荷瘤鼠生存期如圖3,其MRI動態(tài)檢測動物腫 瘤生長狀況如圖4。 實施例2
所用聚鵬-胺為3代樹狀大肝,其它同M例1 實施例3
所用聚翻安-胺為7f^狀大M,其它同實施例l 實施例4
(1) O.lmgRGD環(huán)肽溶于lmL二甲基亞砜中,得溶m。 (2) lmg聚mS安-胺5ftW狀大肝溶 于lmL去離子水中,得溶細。(3)0.3mgEDC溶解于lmL碳,^a戯鈉緩沖溶液中,得溶液C。 室溫下將溶a與溶自混合均勻,逐步滴加溶液C,反應4小時。將J^反應^對zK3t析后冷凍 千燥,得RGD改性的聚鵬-胺基因載體。(4)將RGD改性的聚itl^胺與0.125mg寡核苷酸,渦流 震蕩10分鐘,得到含有耙向惡'm瘤的功能化樹狀大W基因載體系統(tǒng)的溶^D。 (5)將溶 過
0.22膜,尾靜除,至C6荷瘤鼠,或瘤腔內(nèi)定位Slt,荷瘤鼠生^^有 iM著延長。 實施例5
(1) 0.06mgRGD環(huán)肽和0.04g葉麟溶于lmL二甲基亞砜中,得溶船。(2) lmg聚,-胺5 代樹駄肝溶于lmL去離子水中,得溶細。(3) 0.3mg EDC溶解于lmL碳,-碳隨鈉緩沖溶 液中,得溶液C。室溫下將溶m與溶細混合均勻,逐步滴加溶液C, ^Z4小時。將戰(zhàn)鵬產(chǎn) 物對7X3S析后冷凍千燥,得RGD和葉酸雙功能改性的聚自-ra因載體。(4)將RGD和葉酸雙功 能改性的聚醐安-胺與0.125mg siRNA,渦流震蕩10射中,得到含鞭向惡鵬瘤的功能化樹狀大 M基因載體系統(tǒng)的溶^D。 (5)將溶船過0.22膜,尾靜詠皿至C疏瘤鼠,或瘤腔內(nèi)定位,, 荷瘤鼠生存期有艦著延長。 實施例6
(1) 10§織蛋白溶刊.51111磷酸-磷離緩沖溶液(PBS)中,得溶船。 (2) 0.5mg聚Sti安 -胺樹狀大肝溶于lmLPBS緩沖溶液中,得溶細。(3)0.5mg EDC溶解于0,5mL去離子水中,得溶 液C。室溫下將溶a與溶細混合均勻,逐步滴加溶液C,反應4小時。將Jb^反j^物aSephdex50 柱后冷凍千燥,得繊蛋白改性的聚鵬-胺基因載體。其翻電子顯微^ 、片如圖lb。 (4)將織 蛋白改性的聚mK-胺與O.lmg寡核苷酸,渦流震蕩10射中,得含WIE向惡M瘤的功能化樹狀大分 子基因載體系統(tǒng)的溶娜。(5)將溶艦過0.22膜,尾靜脈注射至C6荷瘤鼠,熒腿微^M察發(fā)現(xiàn) 腫瘤內(nèi)有明顯寡核苷酸存在。(6)將溶 過0.22膜,瘤腔內(nèi)定位注射,荷瘤鼠平均生存期延長至 27±3.2天,與對照組相比生#^顯著延長。 實施例7
所用的功能化耙向因子為,蛋白單克隆抗體, 步驟如 例6,尾靜敗a^f至C6荷瘤鼠, 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)有明顯寡核苷酸存在;瘤腔內(nèi)定位注射,荷瘤鼠平均生存期延長至 24±2.5天,與對照組相比生存期顯著延長。 實施例8
所用的功能化耙向因子為微蛋白多克隆抗體.,鄉(xiāng)步驟如實施例6,尾靜詠注射至C満瘤鼠,
熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)有明顯寡核苷酸存在;瘤腔內(nèi)定位注射,荷瘤鼠平均生存期延長至 27±2.7天,與對照組相比生糊顯著延長。 實施例9
所用的功能化耙向因子為表皮生長因子受體單克隆抗體,實施步驟如實施例6,尾靜脈注射至
C6荷瘤鼠,熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)有明顯寡核苷酸存在;瘤腔內(nèi)定位注射,荷瘤鼠平均生存 期延長敦7士3.4天,與對照組相比生存期顯著延長。' 實施例10
所用的功能化耙向因子為表皮生長因子受體多克隆抗體,實施步驟如實施例6,尾靜脈注射至 C6荷瘤鼠,熒光顯微鏡觀察發(fā)測中瘤內(nèi)有明顯寡核苷酸存在;瘤腔內(nèi)定位注射,荷瘤鼠平均生存 期延長至30±2.7天,與對照組相比生存期顯著延長。
權(quán)利要求
1、一種靶向惡性腦瘤的功能化樹狀大分子基因載體系統(tǒng),其特征在于該基因載體系統(tǒng)是以聚酰胺-胺為載體,與靶向性功能因子化學偶聯(lián)后,與治療因子物理結(jié)合制成。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1臓的靶向惡鵬瘤的功能化樹狀大好基因載體系統(tǒng),辦征在于所 述的靶向性功能因子是,蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白單克隆抗體或多克隆抗體、葉酸、表皮生長因子受體 單克隆抗體或多克隆抗體、RGD環(huán)肽中的一種或兩種以上的組合。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向惡行腦瘤的功能化樹狀大肝基因載體系統(tǒng),其特征在于所 述的聚,-胺載體是聚酰胺-胺樹狀分子,其代數(shù)為3~7代。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向惡性腦瘤的功能化樹狀大好基因載體系統(tǒng),其特征在于所 述的治療因子是治療性寡核苷酸、質(zhì)粒DNA或siRNA。
5、 一種權(quán)利要求1所述的靶向惡性腦瘤的功能化樹狀大分子基因載體系統(tǒng)的制備方法,其 特征在預方法紐以下步驟制成第一、取l 100重量份數(shù)的耙向性功能因子溶解于緩沖溶液中,或二甲基亞砜中, 濃度為0.01~90%的溶液,得溶液A;第二取1 100重量份數(shù)的聚酰胺溶解于去離子7K,緩沖溶液,或二甲基亞砜中,配成重量濃度為0.01 90%的溶液,分離液B;第三、取0.05~500重量份數(shù)的EDC[l-[3-(dimethylamino) propyl]-3ethylcarbodiimide HC1溶于 緩沖溶液中,配 量濃度為0.01~90%的溶液,得溶液C;第四、在-20。C 80C條件下,將溶液A與溶液B混合均勻,逐步滴加溶液C,反應0.5 72小時;第五、將上步反應,詠爐析后冷凍千燥,得到耙向惡,瘤的功能化樹狀大肝基因載體;第六、取1 100重量份數(shù)的第五頻幌的靶向惡,瘤的功能化樹狀大肝基因載鵬解于 緩沖溶液中,加入1~64 重量份數(shù)的治療因子,渦流震蕩1~1200併中,得到靶向惡,瘤的功能 化樹狀大肝基因載體系統(tǒng)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法,期寺征在于各種過程中所用的緩沖溶液為生SSfe水、 磷酸-磷離緩沖溶液、氯化鈉隱鹽酸緩沖溶液、Tris緩沖溶液碳,-碳縫鈉緩沖溶液。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5臓的制備方法,辦征在于用于聚ma安-胺溶解的有機翻偽甲醇、乙醇或丙酮。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5、 6或7所述的制備方法,其特征在于所述的靶向性功能因子是轉(zhuǎn)鐵蛋白、 ,蛋白單克隆抗體或多克隆抗體、葉酸、表^長因子受,克隆抗體或多克隆抗體、RGD環(huán) 肽中的一種或兩種以上的組合;所述的聚酰胺-胺載體是聚酰胺-胺樹狀肝,其代數(shù)為3 7代;所 述的治療因子是治療性寡核苷酸、質(zhì)粒DNA或siRNA分子。
全文摘要
一種靶向惡性腦瘤的功能化樹狀大分子基因載體系統(tǒng)。本發(fā)明提供的靶向惡性腦瘤的功能化樹狀大分子基因載體系統(tǒng)是以轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白單克隆抗體或多克隆抗體、葉酸(FA)、表皮生長因子受體單克隆抗體或多克隆抗體、RGD環(huán)肽中的一種或多種的組合為靶向性功能因子,化學聯(lián)接到樹狀大分子聚酰胺-胺(PAMAM)載體上,再與治療因子寡核苷酸、siRNA分子或質(zhì)粒DNA復合后制得,通過瘤腔內(nèi)定位注射、頸動脈注射或尾靜脈注射,可提高基因在惡性腦瘤內(nèi)的分布,并可高效表達,對腫瘤實現(xiàn)有效抑制。與商業(yè)化的基因載體Oligofectamin和未經(jīng)過修飾的PAMAM相比,F(xiàn)A-PAMAM在體內(nèi)外均能顯著的提高基因的靶向性投遞能力。
文檔編號A61P35/00GK101337076SQ200810145690
公開日2009年1月7日 申請日期2008年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月4日
發(fā)明者原續(xù)波, 康春生, 菲 李, 浦佩玉, 躍 鐘 申請人:天津醫(yī)科大學總醫(yī)院