專利名稱：神經(jīng)毒性寡聚體的制作方法
神經(jīng)毒性寡聚體
本申請是申請日為2001年6月28日、發(fā)明名稱為"神經(jīng)毒性寡 聚體"的中國發(fā)明專利申請No. 01813312. 6的分案申請。 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及治療或減輕阿爾茨海默氏病和其它與異常蛋白聚集有 關(guān)的病癥的方法和組合物。具體地說，本發(fā)明涉及用于阿爾茨海默氏 病、帕金森病和內(nèi)障的免疫療法的方法和組合物。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏病(AD)特征性的淀粉樣病變主要由淀粉狀蛋白p (Ap)組成(Glenner & Wong， 1984 )，這是一種在生物液體中發(fā) 現(xiàn)的通?？扇艿暮?9-43個氨基酸的蛋白。淀粉狀蛋白形成與該疾病 的發(fā)病機(jī)理相關(guān)聯(lián)，因此鑒定導(dǎo)致Ap分解代謝受到抑制及其在新皮 質(zhì)中蓄積的神經(jīng)化學(xué)改變會對AD的發(fā)病機(jī)理提供重要的線索。
盡管與AD相關(guān)的基礎(chǔ)病理學(xué)、遺傳易感性和生物學(xué)正變得越來 越清楚，開發(fā)預(yù)防或治愈該疾病的有效藥物的合理的化學(xué)和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 仍難以捉摸。盡管AD的遺傳學(xué)表明Aj3的代謝與該疾病的發(fā)病機(jī)理密 切相關(guān)，如上所述，迄今為止治療AD的藥物集中在"認(rèn)知增強(qiáng) 劑，，，其并不針對潛在的疾病過程。這些藥物只獲得了有限的成功。
在AD中擾亂的神經(jīng)化學(xué)環(huán)境的性質(zhì)可從淀粉狀蛋白Ap的翻譯后 修飾部分地推斷出。從生物體系提取的A(3通常在十二烷基硫酸鈉-聚 丙烯酰胺凝膠電泳上作為表觀~ 4kD的單體遷移(SDS-PAGE; (Shoji等，1992 ));然而，從AD患者死后腦標(biāo)本中提取的Ap在 SDS-PAGE上作為SDS-、尿素-和甲酸-抗性寡聚體遷移(Masters 等，1985; Roher等，1996; Cherny等，1999 )。
對這些從神經(jīng)炎斑和血管淀粉狀蛋白提取的SDS-抗性寡聚體進(jìn)行 的矩陣協(xié)助的激光解吸離子化-質(zhì)鐠分析(MALDI-MS)表明存在共價 交聯(lián)的二聚和三聚Ap種類(Roher等，1996 )。
合成的A&一。和Apw通常在SDS-PAGE上作為表觀單體遷移，但經(jīng)溫育形成更高表觀分子量的種類(Burdick等，1992)。該過程通 過暴露于氧化體系而加速(Dyrks等，1992; At卿d等，1997)。
已提出賂氨酸交聯(lián)作為體內(nèi)A(3寡聚反應(yīng)的一種機(jī)制，因為在合成 的人Ap中的酪氨酸殘基可通過過氧化物酶催化的氧化體系而交聯(lián)
(Galeazzi等，1999 )。作為大鼠A卩，與人Ap不同，缺乏酪氨酸殘 基(Atwood等，1997 )，因此它對金屬催化的氧化寡聚反應(yīng)耐受， 而這可能解釋了在這些動物中淀粉狀蛋白沉積的罕見(Vaughan和 Peters， 1991 )。
蛋白中的酪氨酸交聯(lián)是氧化應(yīng)激的敏感標(biāo)志。在單一酪氨酰殘基 和/或二酪氨酰殘基之間形成共價碳-碳橋或碳-氧橋，產(chǎn)生多種穩(wěn)定 的發(fā)熒光的反應(yīng)產(chǎn)物(Gross和Sizer， 1959; Amado等，1984; Jacob等，1996 )。游離酪氨?；鶊F(tuán)的主要反應(yīng)產(chǎn)物是強(qiáng)熒光的氨基 酸3，3，_二酪氨酸(DT) 、 3，3，，3，-三酪氨酸(TT )和pulcherosine
(P),以及無熒光的異二酪氨酸(iso-DT) (Gross和Sizer, 1959; Amado等，1984; Jacob等，1996; Heinecke等，1993)。與 正常腦的相同區(qū)域相比，DT和3-硝基酪氨酸水平在AD患者腦的海馬 和新皮質(zhì)區(qū)域中升高，并且在AD患者的腦室腦脊液中也升高
(Hensley等，1998)。
酪氨酸交聯(lián)在其它神經(jīng)變性疾病如帕金森病和其它a-synuclein fibrils沉積的病癥中可能也是重要的。這些疾病和病癥包括帕金森 病本身、伴雷維小體形成的癡呆、多系統(tǒng)萎縮、哈-施病和彌漫性雷 維小體病。重組a-synuclein接觸硝化劑導(dǎo)致酪氨酸殘基的硝化以及 酪氨酸的氧化以形成DT;這導(dǎo)致a-synuclein的交聯(lián)以形成穩(wěn)、定的 聚集物(Souza等，2000)。同一作者還發(fā)現(xiàn)針對硝化的synuclein 產(chǎn)生的單克隆抗體特異性結(jié)合在多種synucleinopathies中的雷維小 體和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)含物(Duda等，關(guān)于制備參見Souza等， 2000)。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)源自人淀粉狀蛋白的Ap含有酪氨酸交聯(lián)，并同時包 括二酪氨酸和三酪氨酸交聯(lián)的種類。這些交聯(lián)可以在體外復(fù)制，例如通過將合成的人Ap與過氧化物酶和11202 —起溫育，或與&02在銅離子 的存在下一起溫育。這些修飾是耐受蛋白酶的，因而我們提出在AD 中由Ap與&02和過氧化物酶或銅離子的異常相互作用引起的酪氨酸 交聯(lián)促成神經(jīng)毒性A(5寡聚體的形成，以及Ap的沉積。因此可以使用 針對低分子量酪氨酸交聯(lián)的化合物而不是整個Ap的免疫來治療或預(yù) 防AD,而沒有引發(fā)自身免疫并發(fā)癥的風(fēng)險，后者可能由用完整A(i或 其大片段進(jìn)行免疫而誘導(dǎo)。通過將免疫療法的目標(biāo)靶限制到所述分子 的異常片段或部分，可以將對該分子的正常功能造成的不良干擾降至 最低，同時提供針對異常分子的積極治療。應(yīng)理解可以使用主動或被 動免疫。
引起蛋白通過酪氨酸發(fā)生共價交聯(lián)的氧化過程還與其它特征在于 特定蛋白病理性聚集和蓄積的病癥有關(guān)。因此認(rèn)為這些病癥也可用本 發(fā)明的方法預(yù)防或治療。
應(yīng)明確盡管在此參考了多篇現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)，這種引用并不表示承 認(rèn)這些文獻(xiàn)中的任何一篇構(gòu)成澳大利亞或任何其它國家中的部分公知 常識。
發(fā)明概述
一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或減輕病癥的方法，其中所述 病癥特征在于與氧化損傷相關(guān)的特定蛋白的病理性聚集和蓄積以及形 成酪氨酸交聯(lián)，所述方法包括以下步驟用免疫有效劑量的一種或多 種選自以下的化合物二酪氨酸、三酪氨酸、四酪氨酸(也稱為 pulcherosine)、氧化的酪氨酸正源物如鄰-酪氨酸和間-酪氨酸、硝 基酪氨酸和含有酪氨酸交聯(lián)的肽，任選還包含與所述化合物絡(luò)合的銅 離子，對需要治療的對象進(jìn)行免疫。這些化合物在此統(tǒng)稱為膝氨酸 交聯(lián)的化合物"。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會認(rèn)可所述化合物的免疫有效劑量是會引發(fā) 產(chǎn)生能與酪氨酸交聯(lián)的化合物結(jié)合的抗體的劑量。該技術(shù)人員也能確 定特定的酪氨酸交聯(lián)的化合物是否引起抗體產(chǎn)生。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，病理性聚集形式的特定蛋白包含酪氨酸交聯(lián)的部分。在特別優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述酪氨酸交聯(lián)的化合物是一 種肽，它是病理性聚集形式的特定蛋白的免疫原性部分，所述肽包含 與交聯(lián)的酪氨酸的上游和下游殘基相連接的交聯(lián)的酪氨酸部分。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述酪氨酸交聯(lián)的化合物是二酪氨酸交聯(lián) 的化合物。
每當(dāng)量二酪氨酸可以使用多至3當(dāng)量的銅，條件是施用的每一劑 含不超過1 ^M的銅。
用于免疫的化合物任選與載體蛋白偶聯(lián)，所述栽體蛋白本身具有 免疫原性，如破傷風(fēng)類毒素、匙孔血藍(lán)蛋白或白蛋白。還任選所述化 合物可以與佐劑一起施用，如明礬、單磷酰脂、胞壁酰肽、諸如 QS21的iscom之類。本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚知道合適的載體和佐 劑。
使用含有酪氨酸交聯(lián)的肽時，優(yōu)選與病癥相關(guān)的特定蛋白的最小 的且具有免疫原性的部分，其由與交聯(lián)的酪氨酸的上游和下游殘基相 連的二酪氨酸部分構(gòu)成。當(dāng)所迷病癥是阿爾茨海默氏病時，優(yōu)選所迷
包含酪氨酸交聯(lián)的肽來源于在人A(5h。或A(5H2的氨基酸序列中酪氨酸 IO周圍的序列。
在本發(fā)明的所有方面，當(dāng)使用含有酪氨酸交聯(lián)的肽時，優(yōu)選所述 酪氨酸交聯(lián)可通過在銅離子存在下的氧化而得到。
更優(yōu)逸所述肽還包含與二酪氨酸絡(luò)合的銅離子。
可以通過任何便利的途徑進(jìn)行免疫，包括皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注 射，涂敷至粘膜表面，或局部應(yīng)用，例如藥膏。
所述化合物的給藥劑量會取決于以下因素而不同個體化合物的 性質(zhì)、患者的體重、年齡和一般健康狀況以及是否使用佐劑。預(yù)計劑 量將在0. 1 pg至200 mgDT的范圍內(nèi)，更優(yōu)選1_50 mg,最優(yōu)選10-20 mg。盡管可以給予單次免疫，優(yōu)選進(jìn)行多次免疫，例如一周一次 進(jìn)行1-12個月，更優(yōu)選進(jìn)行4個月。在6-12個月之后可以給予加強(qiáng) 系列。通過測定DT抗體監(jiān)測免疫應(yīng)答；可以采用任何便利的測定體 系，如ELISA。在任選的技術(shù)方案中，所述方法還包括以下的額外步驟鑒定在
病理性聚集的特定蛋白中酪氨酸交聯(lián)的占優(yōu)勢形式；并合成一種或多
種包含一種或多種占優(yōu)勢形式的酪氨酸交聯(lián)的酪氨酸交聯(lián)的化合物。
在本發(fā)明的這一方面的或選形式中，免疫可以是被動的。因而本 發(fā)明提供了預(yù)防、治療或減輕病癥的方法，其中所述病癥特征在于與 氧化性損傷相關(guān)的特定蛋白的病理性聚集和蓄積，并且其中所述病理 性聚集形式的特定蛋白包含輅氨酸交聯(lián)，所述方法包括向需要這種治 療的對象施用有效量的抗體或抗體片段的步驟，
所述抗體或抗體片段是針對酪氨酸交聯(lián)的化合物產(chǎn)生的， 所述化合物是病理性聚集形式的特定蛋白的免疫原性部分并且包 含酪氨酸交聯(lián)，
并且所述抗體或抗體片段能特異性結(jié)合該病理性聚集形式的特定 蛋白。
所述抗體可以是多克隆或單克隆的。當(dāng)抗體是多克隆抗體時，優(yōu) 選其來源于人，并可以例如來源于正常健康個體的混合人血清?；蛘?可以使用來自對駱氨酸交聯(lián)的化合物進(jìn)行過超免疫的個體的血清。超 免疫方案在本領(lǐng)域中是已知的。所述抗體可以通過任何便利的方法從
血清中分離；在本領(lǐng)域中已知多種合適的方法。當(dāng)所述抗體是單克隆 抗體時，優(yōu)選將其人源化。很好理解抗體的抗原結(jié)合片段，如
F(ab，)、 F(ab，)2、 Fv或單克隆scFv在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。產(chǎn)生和純 化多克隆抗體和單克隆抗體的方法以及重組產(chǎn)生人源化單克隆抗體或 scFv片段的方法，在本領(lǐng)域中廣為人知。參見例如Harlow和Lane (1988); W090/07861;和W092/01047。人源化單克隆抗體也可以 在轉(zhuǎn)基因哺乳動物中產(chǎn)生；參見例如W091/10741和W093/12227。
優(yōu)選所述抗體特異性地與病理性聚集形式的特定蛋白發(fā)生反應(yīng)， 而不與未聚集形式的該蛋白發(fā)生顯著的反應(yīng)。
在主動或被動免疫之后，監(jiān)測患者的臨床改善情況，這可以在短 至1周之內(nèi)開始，但更通常可以在6周時觀察到，并可長達(dá)12個 月。采用在監(jiān)測患有相關(guān)病癥患者中所用的常規(guī)臨床指征。參與的臨床醫(yī)生會知道最適合采用的測試。
當(dāng)治療是預(yù)防性的時，監(jiān)測患者發(fā)生病癥的征象?；颊呖梢允怯?于遺傳連鎖而具有患病危險，例如在家族性阿爾茨海默氏病或亨廷頓 舞蹈病中。
因此，本發(fā)明在第二方面提供了用于本發(fā)明方法中的預(yù)防性或治 療性組合物，其包含酪氨酸交聯(lián)的化合物，以及可藥用栽體，并任選 還包含佐劑，和/或與所述化合物絡(luò)合的銅離子。
在第二方面的或選方案中，本發(fā)明提供了用于本發(fā)明的被動免疫
方法中的預(yù)防性或治療性組合物，其包含針對如上所定義的酪氨酸交 聯(lián)的化合物的抗體或其片段，所述抗體能結(jié)合酪氨酸交聯(lián)的化合物， 以及可藥用栽體。
在第三方面，本發(fā)明提供了診斷病癥的方法，其中所述病癥特征 在于與氧化性損傷相關(guān)的特定蛋白的病理性聚集和蓄積以及形成酪氨
酸交聯(lián)，所述方法包括以下步驟測定來自懷疑患有所述病癥的對象 的生物液體樣本中是否存在選自以下組的化合物二酪氨酸、三酪氨 酸、四酪氨酸、氧化的酪氨酸正源物如鄰-酪氨酸和間-酪氨酸、硝基 酪氨酸和含有酪氨酸交聯(lián)的肽。
可選擇地，所述方法包括以下步驟測定來自懷疑患有所述病癥 的對象的生物液體中是否存在針對酪氨酸交聯(lián)的化合物的抗體。
優(yōu)選所述生物液體選自血液、血漿、血清、腦脊液、尿和唾液。 優(yōu)選所述化合物是二酪氨酸。
所述測定可以通過任何合適的方式進(jìn)行，但最為方便地通過 ELISA測定進(jìn)行，使用針對酪氨酸交聯(lián)的化合物的抗體。這種測定可 以反過來用于檢測針對酪氨酸交聯(lián)的化合物的抗體。優(yōu)選所迷抗體是 單克隆抗體，或單克隆抗體的混合物?；蛘咚鰷y定可以通過在325 nm的激發(fā)波長和350-500 nm的發(fā)射波長下測定熒光來進(jìn)行。
在本發(fā)明的所有這三方面，優(yōu)選所述病癥選自阿爾茨海默氏病、 肌萎縮性側(cè)索硬化、運動神經(jīng)元病、內(nèi)障、帕金森病、克羅伊茨費爾 特-雅各布病、亨廷頓舞蹈病、伴有雷維小體形成的癡呆、多系統(tǒng)萎縮、哈-施病和彌漫性雷維小體病或內(nèi)障。
更優(yōu)選所迷病癥是阿爾茨海默氏病或帕金森病。
為了本說明書的目的，應(yīng)清楚理解詞語 免括"指"包括但不
FH于"，詞語包含"具有相應(yīng)的含義。 附圖簡要說明
圖1顯示了人A(3,而不是大鼠Ap,在過氧化物酶催化的氧化之 后發(fā)生熒光和SDS-抗性'將人Ap卜4。、人42或大鼠4。 ( 50 nM) 置于50 mM硼酸(pH 9.5) ± H202 ( 1 mM )和過氧化物酶(7.5 pg/ml)中37X:溫育1天。
(A) 焚光光# (X激發(fā)325,入發(fā)射350-500);
(B) 在SDS-PAGE上的遷移(通過使用4G8的蛋白質(zhì)印跡)；
(C )將APh2 ( 10 nM )與H202 ( 1 nM )和過氧化物酶(7. 5 pg/ml)在磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.4)中37t:溫育5天。通過SDS PAGE和蛋白質(zhì)印跡(4G8)將產(chǎn)物(泳道2)與在相同條件下但缺乏 &02/過氧化物酶情況下溫育的肽(泳道1)相比較。
圖2顯示了源于人淀粉狀蛋白的AP含有酪氨酸交聯(lián)的寡聚體。將 源于人淀粉狀蛋白的Ap (20 [iM) (Roher等，1996 )用熒光光譜分 析，與純DT標(biāo)準(zhǔn)相比(入激發(fā)325，人發(fā)射350—500) (A)，以及蛋白 質(zhì)印跡(4G8)分析(B)。
圖3顯示了二酪氨酸和三酪氨酸交聯(lián)存在于源自人淀粉狀蛋白的 A(3中，并且它們結(jié)合銅。
(A)和(B)將人淀粉狀蛋白純化、水解并在層析分離之后測定 質(zhì)譜。顯示了反映對在不同層析保留時間(RT)洗脫的相同樣本的分 析的兩次獨立的掃描。
(C) 在增加濃度的CuS04或NaCl存在下，純化的DT在280 nm 和315 nm處的吸光度。
圖4顯示了可溶性AP高親和力地結(jié)合銅。
(A)粗可溶性提取物(1)和來自銅螯合Sepharose柱的pH 1 洗脫物(2)的銀染。(B)用W02、 G211和G210探測的pH 1洗脫物的蛋白質(zhì)印跡。 圖5顯示了 LC-MS分析的結(jié)果，證實了人A(i結(jié)合銅。 粗制可溶性提取物(5A)和IMAC純化的可溶性提取物(5B)的 LC-MS分析。
APw2的質(zhì)譜(5C)和(5E),和結(jié)合兩個銅原子的4。的質(zhì)譜 (5D )和(5F )。
IMAC和LC-MS數(shù)據(jù)證實源自腦的AJi可結(jié)合銅。
圖6顯示在蛋白質(zhì)印跡中檢測交聯(lián)的A(iw。和aph2中的二酪氨酸。
還比較了創(chuàng)建二酪氨酸鍵合的兩種技術(shù)。
上面的蛋白質(zhì)印跡(A)使用W02抗體證實AP的存在。下面的印 跡(B)證實了由單克隆抗體IC3識別的二酪氨酸鍵合的存在。該抗 體是針對用硼酸/ &02/辣根過氧化物酵制備的 一種形式的二酪氨酸而 產(chǎn)生的。
泳道l APho-硼酸交蘇
泳道2 APH廣硼酸交聯(lián)
泳道3 Ap卜40-銅交聯(lián)
泳道4 APh2-銅交聯(lián)
泳道5 APh。 -未處理
泳道6 A卩卜42-未處理
泳道7綴合至KLH的二酪氨酸
圖7顯示作為潛在的免疫原產(chǎn)生的酪氨酸交聯(lián)形式的實例。這些 結(jié)構(gòu)含有酪氨酸交聯(lián)并且羧基和氨基末端乙酰化以模擬額外氨基酸殘 基的存在，所述額外氨基酸殘基正常情況下會存在于酪氨酸交聯(lián)的肽 中酪氨酸交聯(lián)的部分的任一側(cè)。設(shè)計多拷貝二輅氨酸抗原的呈遞以提 高所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。
7A酪氨酸
7B 二酪氨酸
7C Atee7D DiAtee 7E IsoDiAtee 7F TriAtee 7G TetraAtee
7H含一個異鍵的TriAtee的或選形式
圖8顯示在蛋白質(zhì)印跡中檢測多種酪氨酸交聯(lián)的種類中的二酪氨 酸鍵。含DT的種類包括連接至BSA的二酪氨酸交聯(lián)的Ap^6二聚體或 三聚體，和連接至BSA或KLH載體蛋白的多種聚-DT種類。上面的蛋 白質(zhì)印跡(A)證實了樣本結(jié)合針對DT產(chǎn)生的多克隆兔抗血清的能 力，其中DT是使用硼酸/ &02/過氧化物酶技術(shù)制備的并使用戊二醛 連接至KLH (在實施例7中討論)。下面的蛋白質(zhì)印跡(B)證實由 單克隆抗體IC3識別的二酪氨酸鍵合的存在。該抗體是針對也是用硼 酸/ &02/過氧化物酶技術(shù)制備的一種形式的二酪氨酸而產(chǎn)生的。
泳道l Ap9—16 DT二聚體-BSA
泳道2 Ap9_16 DT三聚體-BSA
泳道3粗ATEE - BSA
泳道4聚酪氨酸-BSA
泳道5 BSA
泳道6 A(3三聚體-KLH
泳道7粗ATEE - KLH
泳道8聚酪氨酸_ KLH
泳道9 KLH
發(fā)明詳述
本發(fā)明現(xiàn)在將通過僅參照以下非限定性實施例和附圖的方式進(jìn)行詳細(xì)描述。
在此使用的縮寫如下:
AD 阿爾茨海默氏病
DT 3， 3，-二酪氨酸
TT 3， 3，3，-三酪氨酸
P pulcherosine
iso-DT 異二酪氨酸
試驗程序 試劑和Ap肽制備
如先前所述從患AD的人腦的淀粉樣斑中提取寡聚AP ( Roher 等，1996)。將純化的淀粉狀蛋白AP溶于甲酸，然后在使用之前立 即用更換5次的100 mM的碳酸氫銨(pH 7, 5)透析。
由W. M. KeckFoundationBiotechnology Resource Laboratory (Yale University, New Haven， CT )進(jìn)行人 Ap卜4。、 A卩h2和大鼠APh。的合成、純化并通過HPLC分析、氨基酸分析和質(zhì) 譜對其進(jìn)行表征，使用由Quality Control Biochemicals， Inc. (Hopkinton， MA )合成的肽進(jìn)行確證研究。
各肽由HPLC鑒定為單一峰。將合成的AP肽溶于雙重去離子水 中，濃度為0.5-1.0 mg/ml，進(jìn)行超聲處理3分鐘，然后于10 000 g離心20分鐘，在試驗當(dāng)天使用上清(Ap原液)。如前所述 (Atwood等，1998 )通過在214 nm分光光度分析吸光度或通過 Micro BCA蛋白測定(Pierce, Rockford, IL )確定Ap狀原液的濃 度。
使用之前，將所有的緩沖液和金屬離子的原液通過0.22 nm濾器 (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)過濾以除去顆粒物質(zhì)。所有 其它的試劑均為分析級或更純。辣根過氧化物酶購自Sigma Chemical Co. (St. Louis, M0)。
二酪氨酸和酪氨酸交聯(lián)的AP的制備和焚光分析通過將溶于硼酸緩沖液(50 mM， pH 9. 5 )中的L-酪氨酸(1 mg/ml)與H202 ( 5 mM)和辣根過氧化物酶(7.5 pg/ml)在37匸溫 育1天而產(chǎn)生DT標(biāo)準(zhǔn)(Amado等，1984)。
通過將在硼酸鹽緩沖液(50 mM， pH 9. 5 )中的Ap ( 50 nM)與 H202 ( 1 mM)和過氧化物酶(7. 5 pg/ml )在37X3溫育5天而產(chǎn)生交 聯(lián)的Ap。在接近生理條件下研究該反應(yīng)的一項單獨的試驗中，將Ap, 42在磷酸緩沖鹽水(PBS， pH 7.4)中稀釋至10 nM，并與1 pM H202 和過氧化物酶(7. 5 ng/ml )在371:溫育5天。溫育之后，將樣本凍 干以使肽的濃度范圍可通過蛋白質(zhì)印跡檢測(見下)。
反應(yīng)產(chǎn)物通過快速相液相層析(FPLC)分離。在層析之前先通過 在0'C離心而將過量的硼酸從樣本中沉淀出來。然后通過加入0.25% TFA將樣本酸化，并通過過濾(0.22 nm孔徑)除去剩余的不溶物 質(zhì)。將樣本裝填至ij 3 ml Resource RPC柱(Pharmacia, Uppsala, Sweden)上，并用含0. 1%TFA的水洗柱。將結(jié)合的種類用0-100%線 性梯度的含0. 1%TFA的乙腈以1 ml/min在45分鐘內(nèi)洗脫，并以O(shè). 5 ml餾分收集。將餾分干燥、重組于水中并通過熒光(激發(fā)330 nm; 發(fā)射400 nm)和UV吸光度(284 nm )測定二酪氨酸。峰餾分進(jìn)一步 通過質(zhì)譜分析表征，并使用消光系數(shù)對二酪氨酸進(jìn)行定量(E315 nm=8380 M、m l; Malencik等，1996 )。
使用Hitachi F-4500分光熒光計分析溶液中熒光化合物的存 在。DT、 TT和P具有特征性的發(fā)射光譜(人激發(fā)325，人發(fā)射350-500)，這與酪氨酸和色氨酸完全不同，酪氨酸和色氨酸在這些波長 不發(fā)出熒光。在該發(fā)射范圍內(nèi)隨二酪氨酸濃度在0-50 nM增加，熒光 呈線性增加。
MALDI-TOF質(zhì)譜分析
將SDS抗性的、寡聚的、源自人淀粉狀蛋白的Ap的樣本用6N HCl在105X:真空下水解48小時。此后，在Harvard University Mass Spectrometry Facility通過液相色語MALDI-T0F質(zhì)譜(IX-MS )分析樣本。使用LCT質(zhì)譜儀(Micromass Inc， Beverly MA)與連到C18反 相柱(2.1 mm x250 mm)的HP1100液相色譜相連接而得到質(zhì)譜。使 用緩沖液A (水-0. 1%甲酸(FA))和緩沖液B (乙腈-O. 1%FA)的梯 度進(jìn)行LC-MS。所述梯度從2%B (0-2分鐘)到100%B ( 20-23分 鐘)。
蛋白質(zhì)印跡分析
將等份的各反應(yīng)(2 ng肽)收集到15 pi樣本緩沖液(含4% SDS， 5% p-巰基乙醇)中并加熱至95°C (5分鐘)。將樣本在PAGE
(Tricine膠，10-20%; Novex， San Diego, CA)上電泳，轉(zhuǎn)移至 PVDF薄膜(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA )， 用戊二醛
(1%， v/v)固定，用乳(10%, w/v)封閉，然后用抗-AP單克隆抗 體4G8 (Senetek， Maryland Heights, MI)在4"探測過夜。在一 項試驗中使用單克隆抗體W02 (表位殘基5-8) 、 G211 (表位殘 基35-42)或G210 (表位殘基33-40 )。然后將印跡與抗小鼠辣根 過氧化物酶(HRP)綴合物(Pierce, Rockford， IL)于室溫溫育2 小時，并用 ECL試劑(Amersham， Little Chalf ont, UK)或 Supersignal Ultra (Pierce, Rockford, )顯象。使用Fluoro-S ■Image Analysis System ( Bio-Rad， Hercules, CA )捕獲化學(xué)發(fā)光 信號，并用Multi-Analyst Software ( Bio-Rad, Hercules, CA)分 析電子圖象。分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物購自Amersham ( Arlington Heights, IL)。
實施例1:過氧化物酶催化的A|3聚合伴隨著酪氨酸交聯(lián)的形成 我們最初測試了過氧化物酶催化的氧化條件是否可以促進(jìn)Ap聚 合，通過測定與或不與^02和過氧化物酶溫育1天的人A(5h。、人Ap卜 42和大鼠APh。 (50 nM)的熒光。對這些樣本的熒光計分析指示在含 ApH。和APH2的樣本中熒光顯著增加，如圖1A所示。這些結(jié)果與先 前關(guān)于合成的人Ap所報道的結(jié)果類似，后者在高得多的肽濃度1.25 mM下實現(xiàn)(Galeazzi等，1999)。與人序列Ap肽的行為相比，與 &02和過氧化物酶溫育后沒有觀察到大鼠APH。熒光信號的增加，亦如圖1A所示。這提示熒光信號是對AP的酪氨酸氧化產(chǎn)物特異性的，因 為大鼠AP缺乏酪氨酸(Shivers等，1988)。
為了證實這些反應(yīng)導(dǎo)致AP聚合，將如上所述處理的Apt 4。和APh2 在SDS-PAGE上進(jìn)行電泳，并通過蛋白質(zhì)印跡分析。與未經(jīng)處理的Ap 相比，與&02和過氧化物酶一起溫育的人合成APh。和A(3卜42均顯示出 表》見SDS抗性聚合物的顯著增加，如圖1B所示。當(dāng)Afi與單獨&02或 過氧化物酶溫育時，既沒有觀察到聚合也沒有觀察到熒光增加。
實施例2:聚合在生理條件下發(fā)生
為了確定&02/過氧化物酶誘導(dǎo)的合成A(3的聚合是否在接近生理 的條件下發(fā)生，我們還將10 nM的A(3h2與1 nM H202和過氧化物酶 (7.5 pg/ml)在PBS (pH 7. 4)中溫育。我們觀察到肽的SDS抗性 被再次誘導(dǎo)，如圖1C所示；然而，產(chǎn)生的寡聚體的表觀分子量比通 過使用更高濃度底物所產(chǎn)生的要低，如圖1B所示。在這些條件下表 觀A(3聚合物在SDS-PAGE上的遷移提示形成了二聚體(8 kD )、三聚 體(13 kD )和四聚體(17 kD )。
分別如圖2A和圖2B所示，對從患AD的死后腦組織純化的AP的 熒光分析顯示了酪氨酸交聯(lián)的種類的特征性分光熒光譜模式；該純化 的蛋白在SDS-PAGE上作為表觀的寡聚體遷移，如先前所述(Roher 等，1996)。
實施例3:寡聚體的酪氨酸交聯(lián)
為了證實表觀寡聚的源自人淀粉狀蛋白的AP是駱氨酸交聯(lián)的，將 樣本進(jìn)行水解，然后通過MALDITOF-MS分析。該分析，如圖3A所 示，指示相當(dāng)于361 Da (m/z 361，代表M + H)的峰，從而證實了 樣本中DT或iso-DT的存在。還檢測到相當(dāng)于540 Da的較小峰，與 TT或P的存在一致。其它顯著的峰在247、 263、 307、 309和538 Da 檢測到；這些可能代表對Ap氨基酸的其它修飾，如羰基化 (Atwood， 1999)和其它氨基酸交聯(lián)。
在423和425 Da (比值3: 2)還檢測到水解人Ap所得到的更大 量片段，提示Cu結(jié)合到DT或iso-DT ( Cu質(zhì)量=63 & 65 Da， 》 2:1天然同位素豐度)。
實施例4: 二酪氨酸對銅的結(jié)合
為了測試在423和425的峰是否會是由于DT結(jié)合Cu所致，我們 通過光譜分析檢查了 Cu"與DT的相互作用。將二酪氨酸(50 pM)溶 于磷酸緩沖液(50 mM， pH 7. 4 )中，并在SPECTRAmax Plus (Molecular Devices)上測量吸收光譜(200 — 1000 nm )。波谷 (280 nm)和波峰(315 nm )明顯。然后將二駱氨酸與遞增濃度的 C載(0-200 [iM)或NaCl ( 0-200 pM) —起溫育，并監(jiān)測在280 nm 和315 nm處吸光度的變化。
我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)DT與遞增濃度的Cu2+—起溫育時，它在315 nm處的 特征性吸收峰消失，而在280 nm出現(xiàn)一個新的吸收峰?；瘜W(xué)計量比 在1: 1 - 2: 1 (Cu: DT)之間時光譜變化達(dá)到平臺，然后在3: 1 飽和，提示DT可結(jié)合多至3當(dāng)量的Cu。 二氯化物結(jié)合也會產(chǎn)生類似 的P + 2質(zhì)量單位增加(CI質(zhì)量=35和37 Da， 《 3: 1天然同位素 豐度)，但將DT與NaCl共溫育不誘導(dǎo)光譜吸收改變。這些結(jié)果如圖 3C所示..
實施例5: Ap的二酪氨酸化增加其銅結(jié)合能力
我們預(yù)測一部分在人腦可溶性級分中發(fā)現(xiàn)的AP由于二酪氨酸化會 顯示出增強(qiáng)的銅結(jié)合性能。為了測試這是否是真實的情況，我們將患 AD腦的一部分可溶性提取物通過帶有銅的螯合Sepharose柱。將來 自冷凍AD腦和對照腦(AC )的0. 5 g大腦皮層灰質(zhì)在3 ml冰冷的磷 酸緩沖鹽水(PBS)中勻裝化。將樣本于175 000 g離心1小時，并 保留上清用于分析Ap含量。將10 ml上清裝填到帶有1 mg/ml硫酸 銅的螯合S印harose柱上 使用含0. 5 M NaCl的0.05 M乙酸鈉緩 沖液(pH 8)洗出未結(jié)合的蛋白。以分步梯度的增加酸度洗脫結(jié)合的 物質(zhì)，使用pH 5.5、 3和1的連續(xù)步驟，然后用50 mM EDTA洗以解 吸柱。使用2 kDa的大小截斷值將洗脫物進(jìn)行徹底透析以除去游離的 銅和鹽，凍干并進(jìn)行SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡和LC-MS分析。在 Quatro II triple quadrupole (Micromass)上獲得ESL質(zhì)譜(+ve離子)。以連續(xù)模式每8秒從650-1650 m/z收集質(zhì)譜。將樣本引入在 5 mM乙酸銨緩沖液中的離子源。狹線印跡分析顯示在pH 3洗脫物中 無W02免疫反應(yīng)性，并在pH 1再進(jìn)行一次洗脫。在該pH檢測到強(qiáng)的 免疫反應(yīng)性，并且經(jīng)透析的樣本呈藍(lán)色。
蛋白質(zhì)印跡分析顯示在pH 1和EDTA餾分中存在Ap;這提示與銅 的非常高親和力的結(jié)合，因為pH 3通常足以從這種柱上洗脫大多數(shù) 的銅結(jié)合蛋白。在這些餾分中的物質(zhì)顯示出高度富含寡聚A|3。這些 結(jié)果如圖4所示。
銀染(圖4A)證實了實質(zhì)性的基于金屬親和力的純化(泳道1 vs. 2)，而蛋白質(zhì)印跡分析展示了似乎相當(dāng)于多個單體A(i的免疫反 應(yīng)性條帶(圖4B)。圖5顯示來自AD腦組織的粗制的和IMAC-純化 的上清提取物的LC (上)和MS (下)曲線。值得注意的是IMAC純化 的樣本的LC和MS譜實質(zhì)上更為清楚。對IMAC純化的樣本的LC-MS 分析產(chǎn)生相當(dāng)于A(3種類的信號，包括帶有2個銅原子的APh。，如在 銅存在或缺失情況下對合成肽的LC-MS分析所證實的。在代表性質(zhì)譜 上突出的峰群表明質(zhì)量/電荷比與母離子一致，其質(zhì)量為4515.1 (Ap卜42 )和4457. 9 ( Ap140 +2 Cu )。
為了證實該強(qiáng)結(jié)合銅的A(J餾分是否含有DT，我們采用了針對使 用^02和辣根過氧化物酶的方法產(chǎn)生的DT所產(chǎn)生的單克隆抗體IC3 (Kato 等， (1998 ); 這是Himeji Institute of Technology, Himeji, Japan的Dr. Yoji Kato贈送的4L物)。我們發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì) 印跡上觀察到的更高分子量的AP寡聚體與對DT的正染色定位在共同 區(qū)域。
含AP的餾分還展示出存在二酪氨酸部分特征性的熒光發(fā)射光譜。 該發(fā)射通過加入銅而終止，其方式是對由于該修飾引起銅結(jié)合增強(qiáng)所 預(yù)測到的。
實施例6:對二酪氨酸化的AP的進(jìn)一步表征
將富含DT的AP從人腦的可溶性級分中分離出來，其量足以進(jìn)行 進(jìn)一步表征。這些研究包括在組織培養(yǎng)中的毒性研究、氨基酸測序、金屬結(jié)合研究和測定富含DT的Ap是否具有增強(qiáng)的電化學(xué)活性的試 驗，所述電化學(xué)活性例如誘導(dǎo)過氧化氫形成和銅還原。 實施例7:針對二酪氨酸的免疫的效果
我們嘗試在野生型小鼠中產(chǎn)生對DT的免疫應(yīng)答。在該試驗中， 通過以下步驟制備DT:將在硼酸緩沖液中的貉氨酸與&02混合，并 將該混合物與辣根過氧化物酶一起溫育，如在試驗程序中所述。
使用戊二醛并按照標(biāo)準(zhǔn)方案將DT綴合至載體蛋白匙孔血藍(lán)蛋白 (KLH)。在弗氏完全佐劑中制備DT- KLH、單獨KLH或未經(jīng)處理的 酪氨酸每一種的乳液，對每兩只動物各用含100 mg DT- KLH或者未 經(jīng)處理的酪氨酸或單獨KLH的接種物進(jìn)行腹膜內(nèi)接種。在此時取免疫 前血清。在免疫接種之后10天收集第一免疫血清。在此后以兩周的 間隔給予兩次加強(qiáng)免疫。在每次接種時和在最后的強(qiáng)化后一周時取血 樣。
采用ELISA測定對DT的免疫應(yīng)答。我們發(fā)現(xiàn)用DT- KLH或未處 理的酪氨酸免疫的小鼠對DT的免疫應(yīng)答從未超過用單獨KLH免疫的 小鼠的應(yīng)答。用獲自Dr. Kato的DT單克隆抗體IC3作為陽性對照， 在該測定中產(chǎn)生了針對DT的適度的陽性反應(yīng)。
在第二項試驗中，用DT- KLH以上述方式免疫兩只兔。對這些動 物所產(chǎn)生的血清的ELISA結(jié)果證實產(chǎn)生了針對DT的適中的免疫應(yīng) 答。
我們還嘗試證實在來自4名通過死后的組織病理學(xué)檢查被診斷患 有阿爾茨海默氏病的患者的個體血清中是否存在針對DT的內(nèi)源抗 體。通過ELISA或通過蛋白質(zhì)印跡在這些血清中沒有觀察到針對DT 的免疫反應(yīng)性。
在進(jìn)一步的試驗重復(fù)中，我們檢查了上述針對DT- KLH產(chǎn)生的小 鼠或兔抗血清是否識別從人腦提取的AP二聚體或更高級別寡聚體中 的DT部分。令人驚奇地是，上述血清均未顯示針對人腦AP中的DT 部分的活性。陽性對照抗體IC3在該測定中也呈陰性。
實施例8:制備二酪氨酸部分的方法對免疫原性和抗體反應(yīng)性的影響
我們懷疑免疫應(yīng)答的意外缺乏可能是由于二酪氨酸部分的抗原性
差所致。
為了調(diào)查研究這一假設(shè)，我們用兩種不同的方法制備了酪氨酸交
聯(lián)的合成APh。和APh2。第一種方法包括將在硼酸緩沖液中的Ap肽與 辣根過氧化物酶和&02—起溫育，如在上面試驗程序中所描述的。
在第二種方法中，在含30 nM CuCl2和200 nM ^02的雙重去離子 水中制備2.5pM A(3溶液，并于室溫溫育1-5天。
將交聯(lián)的AP的各變種的樣本進(jìn)行PAGE，并使用Ap特異性抗體 W02或陽性對照抗DT抗體IC3進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。這些印跡的結(jié)果如 圖6所示。
在ELISA和蛋白質(zhì)印跡分析中IC3抗體在交聯(lián)的A(3中均檢測到 DT。此外，在蛋白質(zhì)印跡中所述抗體識別實施例7中制備的DT- KLH 中二酪氨酸的存在。從這些結(jié)果似乎由硼酸或銅方法APh2比APh。更 有效地交聯(lián)。另外，當(dāng)用涉及銅的方法交聯(lián)時，APH。喪失對W02的 免疫反應(yīng)性。這可能是由于該肽對自由基損傷或交聯(lián)之后抗體結(jié)合部 位的修飾、掩蔽或阻礙更為敏感。
令人驚奇的是，從用IC3的鑒別染色很明顯Ap通過二酪氨酸交聯(lián) 的模式取決于產(chǎn)生交聯(lián)所用的不同反應(yīng)。IC3單克隆抗體檢測不出由 硼酸方法制備的DT，但確實檢測出由銅方法制備的DT。
同樣令人驚奇的是，IC3抗體在APh。中檢測DT交聯(lián)優(yōu)先于在 APh2中。這一模式與用抗AP抗體W02所觀察到的情況相反。
這些結(jié)果證實誘導(dǎo)DT交聯(lián)的方法和被交聯(lián)的多肽的結(jié)構(gòu)在抗體 對DT的識別中是關(guān)鍵的變量。在這種情況中，向二酪氨酸連接的 ApH。添加2個氨基酸殘基導(dǎo)致抗二酪氨酸抗體結(jié)合的能力大大降 低。這一結(jié)果可以推至體內(nèi)情形，提示對抗原的選擇對引發(fā)生理學(xué)相 關(guān)的免疫應(yīng)答是至關(guān)重要的。
實施例9:酪氨酸交聯(lián)的形式對抗體識別的影響
預(yù)計DT接種物必須綴合至大的載體蛋白以引起免疫應(yīng)答。而且，所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的質(zhì)量在部分程度上也會取決于對適合載體的
選擇。為了檢查這一點，我們?yōu)楦鱀T種類選擇了兩種可供選擇的載 體，牛血清白蛋白(BSA)和匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。
另外，為了調(diào)查二酪氨酸的不同形式在免疫識別中的作用，我們 制備了含有多種形式DT的粗混合物，包括多種寡聚體和分支形式的 DT。在該粗混合物中的酪氨酸交聯(lián)是用如上所述的硼酸/&02/過氧化 物酶方法創(chuàng)建的。所得的DT混合物含有在酪氨酸分子的環(huán)和骨架上 的多個位點鍵合的分子。所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)的實例如圖7所示。
然后通過反相HPLC將粗混合物分離成主要含單-二酪氨酸、二酪 氨酸、三酪氨酸和聚酪氨酸的餾分。
寡聚結(jié)構(gòu)的兩個重要特征是它們可以呈遞多個拷貝的目標(biāo)抗原以 提高免疫原性并增強(qiáng)免疫應(yīng)答，以及它們可以呈現(xiàn)酪氨酸殘基之間化 學(xué)鍵的或選形式。
為了研究在AD中構(gòu)成在體內(nèi)對Ap氧化^修飾的酪氨酸交聯(lián)的性 質(zhì)，我們還制備了酪氨酸交聯(lián)的Ap片段。使用相同的技術(shù)，我們制 備了由兩條或更多條厶|3916肽鏈組成通過二酪氨酸交聯(lián)的分子(結(jié)構(gòu) 未顯示)。所得到的交聯(lián)最可能代表多種形式酪氨酸交聯(lián)的外消旋混 合物。
上述的多種新結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)印跡中得到表征，使用抗-DT單克隆 IC3或來自用DT- KLH免疫的兔的免疫血清(如實施例7中所述)。 這些結(jié)果如圖8所示。
結(jié)果證實與BSA相連的Ap9-16的二聚體而不是三聚體對兔免疫血 清和單克隆抗體IC3均具有免疫反應(yīng)性。
在印跡中KLH的存在被兔免疫血清識別，無論其是否綴合至另外 的酪氨酸交聯(lián)抗原。聚酪氨酸-BSA和聚路氨酸-KLH被IC3識別，但 兔免疫血清不能區(qū)分單獨KLH和聚酪氨酸-KLH。
從這些結(jié)果清楚可見對兔的免疫產(chǎn)生了對某些形式的二酪氨酸具 有反應(yīng)性但對其它形式無反應(yīng)性的抗體，正如從圖6中的數(shù)據(jù)所預(yù)測 的。實施例10:在轉(zhuǎn)基因動物中用二酪氨酸免疫對AP沉積的作用 可以得到多種神經(jīng)疾病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，包括阿爾茨海默氏病
(Games等，1995; Hsiao等，1996 );帕金森病(Masliah等， 2000 );家族性肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS) (Gurney等，1994);亨 廷頓舞蹈病(Reddy等，1998 );和克羅伊茨費爾特-雅各布病
(CJD) (Telling等，1994)。
我們已發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默氏病的轉(zhuǎn)基因模型之一 APP2576 tg小鼠
(Hsiao等，L996 )還具有高的內(nèi)障發(fā)生率。這些動物模型適于測試 本發(fā)明的方法。
使用APP2576品系的轉(zhuǎn)基因小鼠(Hsiao等，1996)。選擇8-9 月齡的雌性小鼠并分組進(jìn)行治療。
使用多種技術(shù)制備酪氨酸交聯(lián)的抗原以產(chǎn)生不同形式的酪氨酸交 聯(lián)。所用的抗原包括
抗原載體蛋白
Ap9—16二聚體BSA
AP9-w三聚體BSA
(粗)ATEEBSA
聚酪氨酸BSA
AP三聚體KLH
(粗)ATEE腦
聚酪氨酸固
每次免疫包含在弗氏完全佐劑中的25 jig抗原，總體積為0.5 ml,皮下給予。
對照動物接受不含酪氨酸交聯(lián)的抗原的載體蛋白。 以14天間隔取血清樣本，在28天給予加強(qiáng)免疫。測定血清樣本 中是否存在抗-DT抗體，例如使用Kato等的ELISA方法 預(yù)期在最 后的強(qiáng)化注射后大約5周內(nèi)獲得高抗體效價。還測定了血中AP的水 平。
一旦出現(xiàn)高效價抗體，每隔一段時間處死動物，并檢查它們的腦以確定所述免疫接種是否減少了腦淀粉狀蛋白形成，并鑒定最有效的 免疫方案。使用校準(zhǔn)蛋白質(zhì)印跡測定在腦和血清中的可溶性和不溶性
AP的水平。用免疫組化方法檢查腦中的A(5斑負(fù)荷。
在長達(dá)8個月的時間內(nèi)測試各組中其它小鼠的認(rèn)知表現(xiàn)，根據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)方法使用Morris水迷宮。每天還由不知情的操作者測定動物的總 體健康狀況，使用的5分整數(shù)等級主觀地評價包括運動活性、警覺和 一般健康指征在內(nèi)的特征組合。
實施例11:用針對二酪氨酸的抗體治療的效果
通過本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)操作用一種或多種實施例7中描述的免疫 原對正常小鼠進(jìn)行超免疫。每隔一段時間對小鼠進(jìn)行放血并如上所述 測定其血清中的抗-DT。檢測到高效價抗體時，收獲血清并用本領(lǐng)域 常用方法分離和/或富集抗體成分。
將這些抗體靜脈內(nèi)注射或直接注射入APP2576轉(zhuǎn)基因小鼠的CSF 中，在數(shù)天或數(shù)周內(nèi)以單劑或重復(fù)多劑給予。
在用抗二酪氨酸抗體治療后每隔一段時間處死轉(zhuǎn)基因小鼠，并檢 查它們的腦以確定抗體治療是否減少了腦淀粉狀蛋白形成。
實施例12:診斷與酪氨酸交聯(lián)相關(guān)的病癥
對來自證實患有AD的患者和來自年齡相匹配的對照的血清和腦 脊液(CSF)樣本使用如上所迷的熒光分析測定其中酪氨酸交聯(lián)的化 合物的存在。在一組樣本中，首先使樣本通過偶聯(lián)至次氮基三乙酸的 固相支持體而富集樣本中的酪氨酸交聯(lián)的化合物，如美國專利No. 5972674中所述
使用來自患有ALS、帕金森病和CJD的患者的樣本進(jìn)行類似的測定。
可能患者還具有針對酪氨酸交聯(lián)的化合物的循環(huán)抗體，因此在可 供選擇的測定中，用ELISA測定利用針對DT的單克隆抗體檢測血清 或CSF中的這種抗體(Kato等，1998)。
實施例13:鑒定存在于經(jīng)氧化修飾的Ap中的二酪氨酸的形式 為了鑒定存在于經(jīng)氧化修飾的Ap中的DT的主要形式，產(chǎn)生銅催化的Ap寡聚體的酶促消化片段，并通過質(zhì)譜分析所述片段。該技術(shù) 近來被應(yīng)用于分析對朊病毒蛋白的銅催化氧化修飾(Requena, J.
R.，等，2001 PNAS 98: 7170-7175 )。
這使得對抗原的鑒定最可能有效產(chǎn)生適用于被動免疫的單克隆抗 體，如實施例11中所述。產(chǎn)生針對任何特定抗原的高度特異性單克 隆抗體的方法在本領(lǐng)域中是廣為人知的， 一旦選出了抗原，則使用已 知的方法進(jìn)行對最有效抗原呈遞方式的系統(tǒng)性分析。
討論
在AD中的神經(jīng)元損傷與可溶性Ap相關(guān)，而不與固定在神經(jīng)炎斑 中的不溶性AP相關(guān)(McLean等，1999)?，F(xiàn)在我們首次顯示了從罹 患AD的腦中提取的神經(jīng)毒性AP寡聚體含有酪氨酸交聯(lián)，其可以是 DT、 iso-DT、 TT和/或P。這些修飾通過將AP與過氧化物酶和HA — 起溫育，或通過在銅離子存在下氧化AP而在體外得到模仿。這些修 飾可干擾AP的代謝，可促成在AD中看到的神經(jīng)毒性，并且指示在所 述疾病中的神經(jīng)化學(xué)紊亂。
DT、 T和P之間碳-碳橋的形成被認(rèn)為是不可逆的；DT交聯(lián)對6N HC1在llOt!水解切割24小時和蛋白酶消化非常耐受(Smail等， 1995)。在病理學(xué)上，蛋白的DT修飾對分解代謝的抗性可以解釋酪 氨酸聚合物對脂褐質(zhì)形成所起的作用(Kato等，1998 ),和對熒光 內(nèi)障形成中a-晶體蛋白的交聯(lián)所起的作用(Kikugawa等，1991)。 顯然，預(yù)期AP的酪氨酸交聯(lián)會抑制其分解代謝，并因此在AD中淀粉 樣蛋白斑沉積的發(fā)展中可能是重要的步驟。
酪氨酸交聯(lián)的形成必需要使含有酪氨酰殘基的分子進(jìn)行接觸。我 們的結(jié)果提示AP的酪氨酸殘基必須對于過氧化物酶是可接近的，并 且淀粉狀蛋白的Ap亞基之間的酪氨酰殘基必須在某些階段并置。
由于DT形成需要H202，檢測在來自AD的腦AP中的DT修飾暗示 在AD中腦中的仏02升高。不希望受到任何已提出的機(jī)制的約束，我 們認(rèn)為在腦實質(zhì)中的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬活化，與AD中的淀粉狀 蛋白形成密切相關(guān)(Sheng等，1997)，可能提供過氧化物酶活性和H202以引起Ap的酪氨酸交聯(lián)。已觀察到活化的大鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 的過氧化物酶水平增加(Lindenau等，1998)，并且體外試驗已證 實了 AP引發(fā)和/或觸發(fā)培養(yǎng)的大鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和人吞噬細(xì)胞的呼 吸爆發(fā)的能力(Van Muiswinkel等，1996 )。活化的吞噬細(xì)胞釋放 髓過氧化物酶(Pember等，1983),并在呼吸爆發(fā)過程中產(chǎn)生活性 氧種類。這一反應(yīng)被設(shè)計用來殺死入侵的病原體或腫瘤細(xì)胞；但是， 也顯示該環(huán)境促進(jìn)周圍蛋白和脂類的氧化(Byun等，1999 )。在活 化的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞鄰近可以產(chǎn)生類似的微環(huán)境。在體外，髓過氧化 物酶-^02體系促進(jìn)酪氨酸交聯(lián)的種類如DT、 TT、 P和isoDT的合成
(Jacob等，1996)。
因此，對AP蓄積作出反應(yīng)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化可促進(jìn)Ap的 酪氨酸交聯(lián)，抑制其清除并導(dǎo)致惡性循環(huán)。AP本身可能產(chǎn)生用于形 成DT的最近&02源，促成這一可能的惡性循環(huán)，因為Ap與02反應(yīng) 通過還原亞化學(xué)計算量的012+或Fe"而形成HA(Huang， Atwood 等，1999; Huang， Cuajungco等，1999 )。所以，非常重要的是從 人淀粉狀蛋白中純化完整的結(jié)合有銅的AP (圖3A)。合成的Ap卜42以 阿托摩爾(attomolar)親和力結(jié)合012+，并且由于在AD淀粉狀蛋白 中富集銅(Lovell等，1998)，我們曽懷疑AP可能在體內(nèi)結(jié)合銅。 源自淀粉狀蛋白的AP含有銅這一發(fā)現(xiàn)也與AD的病理生理學(xué)相關(guān)，因 為012+沉淀Ap (Atwood等，1998)，并且012+加強(qiáng)所述肽的毒性
(Huang等，1999)。
令人產(chǎn)生興趣的是，在用酸水解源自人淀粉狀蛋白的AP之后， 以及在質(zhì)譜分析的酸性條件下，Cu"仍保持與DT結(jié)合(圖3A)。對 Cu"的這一不同尋常的親和力可能是由DT修飾在Ap上形成外加的高 親和力Cu2+結(jié)合部位的結(jié)果。由于該增加的對Cu2+的親和力，DT-修飾 的Ap的神經(jīng)毒性或其電化學(xué)活性與未修飾的Ap相比可增高。由DT #~飾引起的外加的Cu"結(jié)合還可增加Ap沉淀為淀粉狀蛋白，這可以 解釋為什么用螯合劑在pH 7.4處理促進(jìn)二聚體Ap從死后AD腦組織 中釋放的程度高于單體Ap (通過蛋白質(zhì)印跡測定)(Cherny等，1999)。對蛋白水解抗性增加和外加金屬結(jié)合的組合可能是促成AD 病理的AP的酪氨酸交聯(lián)的特別有害的后果。
PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠過量產(chǎn)生人形式的A(3w2并隨著老化顯示出廣泛 的腦淀粉樣蛋白斑沉積，以及行為和認(rèn)知缺陷(Games等，1995; WO96/40896)。用合成的A(3卜42免疫成熟PDAPP小鼠導(dǎo)致淀粉樣蛋白 斑在數(shù)量和強(qiáng)度上的驚人減低，而用該抗原免疫的PDAPP小鼠不產(chǎn)生 淀粉樣蛋白斑(Schenk等，1999和W099/27944 )?？磥硪颜T導(dǎo)了對 A|3142的成功的免疫應(yīng)答，證據(jù)是在緊靠殘余淀粉樣蛋白斑附近的清 除性小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，以及在血中存在針對Apw2的抗體。作者建議 用Ap免疫可用于預(yù)防或治療AD。然而，廣泛認(rèn)為對AD進(jìn)行免疫療 法似乎并不切實可行，因為由于免疫耐受人受體對自身蛋白不能產(chǎn)生 有意義的免疫應(yīng)答。Schenk等得到的結(jié)果提示，給予適宜的刺激， 腦可能具有再吸收或清除頑固的淀粉狀蛋白沉積的能力。但是，用 AP本身進(jìn)行免疫并不理想，因為可能誘導(dǎo)有害的自身免疫應(yīng)答，和/ 或誘導(dǎo)不充分的、不能清除斑的應(yīng)答。通過用根據(jù)本發(fā)明的非天然二 酪氨酸或含有二酪氨酸的化合物進(jìn)行免疫，可以避免這一問題。
對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說很明顯，盡管出于清楚和理解的目的詳 細(xì)描述了本發(fā)明的某些細(xì)節(jié)，可以對在此描述的技術(shù)方案和方法作出 多種修改和變化，而不偏離本說明書中所公開的發(fā)明概念的范圍。
在此引用的參考文獻(xiàn)列于以下數(shù)頁，并在此引入作為參考。參考文獻(xiàn)
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1. 選自各自包含酪氨酸交聯(lián)鍵的Aβ1-42、Aβ1-4。和Aβ9-16的寡聚體的化合物用于制備誘導(dǎo)對含有酪氨酸交聯(lián)鍵的Aβ寡聚體特異性的抗體應(yīng)答以治療或預(yù)防阿爾茨海默氏病的藥物的用途。
2. 權(quán)利要求1的用途，其中所述化合物與本身具有免疫原性的載 體蛋白偶聯(lián)。
3. 權(quán)利要求2的用途，其中所述載體蛋白選自破傷風(fēng)類毒素、匙 孔血藍(lán)蛋白和白蛋白。
4. 權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中所迷化合物與佐劑一起施用。
5. 權(quán)利要求1-4任一項的用途，其中所述化合物是來源于在人 AJ3卜"或A(3h。或APw6的^酸序列中酪氨酸10周圍的序列的酪氨酸交 聯(lián)的肽。
6. 特異性針對來源于在人APw或APh?；駻Ph6的M酸序列中酪 氨酸10周圍的序列的酪氨酸交聯(lián)的肽的抗體或抗體片段在制備用于治 療阿爾茨海默氏病的藥物中的用途。
7. 權(quán)利要求6的用途，其中所述抗體或抗體片段特異性針對選自 APh2、 A卩h。和APw的Ap寡聚體。
8. 權(quán)利要求6或7的用途，其中所述抗體是多克隆的。
9. 權(quán)利要求6或7的用途，其中所述抗體來源于人。
10. 權(quán)利要求6或7的用途，其中所述抗體是單克隆的。
11. 用作藥物的預(yù)防性或治療性組合物，其包含權(quán)利要求1中所定 義的酪氨酸交聯(lián)的化合物或權(quán)利要求6或7中所定義的抗體或抗體片 段，以及可藥用載體。
12. 權(quán)利要求11的預(yù)防性或治療性組合物，還包含佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療或減輕阿爾茨海默氏病和其它與異常蛋白聚集有關(guān)的病癥的方法和組合物。具體地說，本發(fā)明涉及用于阿爾茨海默氏病、帕金森病和內(nèi)障的免疫療法的方法和組合物。一方面本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或減輕病癥的方法，所述病癥特征在于與氧化性損傷有關(guān)的特定蛋白的病理性聚集和蓄積以及形成酪氨酸交聯(lián)，該方法包括以下步驟用免疫有效劑量的一種或多種酪氨酸交聯(lián)的化合物，任選還包含與所述化合物絡(luò)合的銅離子，對需要這種治療的對象進(jìn)行免疫?；蛘呖梢圆捎冕槍野彼峤宦?lián)的化合物的被動免疫。還公開并要求保護(hù)預(yù)防性或治療性組合物和診斷方法。
文檔編號A61K39/385GK101411876SQ20081012989
公開日2009年4月22日 申請日期2001年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月28日
發(fā)明者A·布什, R·E·坦茲, R·徹尼 申請人:普拉納生物技術(shù)有限公司;綜合醫(yī)院有限公司