專利名稱：：頂果孢菌屬的新穎菌種,制備碘色菌素的方法和碘色菌素的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種能夠產(chǎn)生碘色菌素的頂果孢菌屬的新穎菌種，一種制備碘色菌素的方法和碘色菌素在誘發(fā)細(xì)胞中的細(xì)胞毒性與治療癌癥方面的用途。
背景技術(shù)：
：碘色菌素0，6-吩嗪二醇5，10-二氧化物)為紫色且散發(fā)紅色光澤的色素，最初是由分離自覆蓋于合適固體培養(yǎng)基上的碘色菌(C/jramo6a"e〃'M/n^W"Mm)菌落中發(fā)現(xiàn)。已發(fā)現(xiàn)其為吩嗪化合物中的一者且已知其是通過微生物所產(chǎn)生。因為碘色菌素可轉(zhuǎn)化為有醫(yī)藥學(xué)上價值的抗生素粘菌素(myxin)，故其在抗生素領(lǐng)域中廣受關(guān)注且已投入大量努力研發(fā)制備其的合適方法，例如美國專利第3,663,373號中所揭示的方法。除以上抗菌特性外，美國專利第3,764,679號揭露可使用碘色菌素作為抗高血壓劑以降低過敏患者的血壓。頂果孢菌屬(Acracarpo印ora)首先由田村等人(2000)揭示，且所述菌屬目前包含以下三種菌種多鈹頂果孢菌(A.cwTMgafwm)、巨頭頂果孢菌".macrace/7/mZfl)和多形頂果孢菌(A.pZ"omc^^a)。所述菌屬的成員為好氧性、革蘭氏陽性、不抗酸和非運動性且可形成分支基內(nèi)菌絲體的生物體。所述菌屬也可以非片狀基內(nèi)菌絲體的形式存在。氣生菌絲體尖上長有含巻曲孢子鏈的球狀和棒狀結(jié)構(gòu)。所述孢子是具有光滑表面和非運動性的橢圓形或短桿狀。生物體含有內(nèi)消旋二氨基庚二酸(A2pm),且在全細(xì)胞糖(B類)中檢測到北美放線菌粘糖(madurose)、葡萄糖、阿拉伯糖和鼠李糖(列契威尼樂&列契威尼樂(Lechevalier&Lechevalier)，1970)。主要細(xì)胞脂肪酸為異-C16:Q、C16:0、Cn:o和10-甲基-Cn:o，且磷脂酰乙醇胺為特征磷脂(diagnosticphospholipid)。主要甲基萘醌類為MK-9(H4)和MK-9(H2),且霉菌酸不存在于培養(yǎng)物中。所述菌屬的成員具有68-69mol呢的DNAG+C含量。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)一種能夠產(chǎn)生碘色菌素的頂果孢菌屬的新穎菌種。也發(fā)現(xiàn)從未報道過的碘色菌素在誘發(fā)哺乳動物細(xì)胞中的細(xì)胞毒性方面的新穎功能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一目的為提供一種能夠產(chǎn)生碘色菌素的新穎經(jīng)分離的頂果孢菌屬菌株。所述經(jīng)分離的頂果孢菌屬菌株優(yōu)選為以登錄號PTA-8410保藏于ATCC的04107M-2菌株，或其變異體或突變體。本發(fā)明的另一目的為提供一種制備碘色菌素的方法，其中所述碘色菌素是通過培養(yǎng)本發(fā)明經(jīng)分離的頂果孢菌屬菌株來制備。所制備出的碘色菌素可經(jīng)進(jìn)一步分離或純化。本發(fā)明的另一目的為提供一種用于誘發(fā)動物細(xì)胞中的細(xì)胞毒性的組合物，所述組合物包含有效量的碘色菌素。在一方面中，所述動物為哺乳動物且優(yōu)選為人類。在另一方面中，細(xì)胞為癌細(xì)胞或諸如AGS、HeLa、HepG2和MCF-7的細(xì)胞株。本發(fā)明的另一目的為提供一種碘色菌素的用途，其用于制備用以誘發(fā)動物細(xì)胞中的細(xì)胞毒性的藥物。在一方面中，所述動物為哺乳動物且優(yōu)選為人類。在另一方面中，細(xì)胞為癌細(xì)胞或諸如AGS、HeLa、HepG2和MCF-7的細(xì)胞株。本發(fā)明的另一目的為提供一種誘發(fā)動物細(xì)胞中的細(xì)胞毒性的方法，其包含使所述細(xì)胞與碘色菌素接觸。在一方面中，所述動物為哺乳動物且優(yōu)選為人類。在另一方面中，細(xì)胞為癌細(xì)胞或諸如AGS、HeLa、HepG2和MCF-7的細(xì)胞株。本發(fā)明的另一目的為提供一種用于治療動物癌癥的醫(yī)藥組合物，所述醫(yī)藥組合物包含有效量的碘色菌素。在一方面中，所述動物為哺乳動物且優(yōu)選為人類。本發(fā)明的另一目的為提供一種碘色菌素的用途，其用于制造用以治療癌癥的藥物。本發(fā)明的又一目的為提供一種治療動物癌癥的方法，其包含對需要所述治療的動物投予有效量的碘色菌素。在一方面中，所述動物為哺乳動物且優(yōu)選為人類。圖1顯示本發(fā)明的新穎04107M-2菌株在28。C下在HV瓊脂上生長14天后的掃描電子顯微照片。(線條表示1.5pm。)圖2顯示本發(fā)明的04107M-2菌株于燕麥瓊脂上的生長結(jié)果，可在其上觀察到具有金色光澤的微紅晶體。圖3顯示基于16SrDNA的近似全序列的鄰接樹。所述樹顯示04107M-2菌株在頂果孢菌屬菌種內(nèi)的種系發(fā)生位置。節(jié)點處的編號顯示1000次靴帶式重取樣的百分比。僅提供50%以上的值。(線條表示每核苷酸位置的0.01替代。)圖4顯示碘色菌素對各種腫瘤細(xì)胞生長的細(xì)胞毒性效應(yīng)。以2、5和10)ig/ml的碘色菌素處理細(xì)胞株72小時之后，從而MTT分析測定細(xì)胞生長抑制效應(yīng)。顯示四個獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。在活體外測試碘色菌素化合物對MRC-5、AGS、HeLa、HepG2和MCF-7細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性。碘色菌素化合物可展現(xiàn)顯著的細(xì)胞毒性效應(yīng)，在10^g/ml的碘色菌素濃度下，MRC-5、AGS、HeLa、HepG2和MCF-7的細(xì)胞存活百分比分別為47%、8%、26%、40%和29%。具體實施方式定義除非本文另外界定，否則本發(fā)明所用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常所理解的含義。所述術(shù)語的含義和范疇?wèi)?yīng)為清晰的；然而，在任何潛在歧義的情況下，本文所提供的定義優(yōu)于任何辭典或外在定義。除非另外指出，否則本發(fā)明的方法和技術(shù)是根據(jù)在此項技術(shù)中熟知且如引用和論述于本發(fā)明整篇說明書中的各種通用和更特定參考文獻(xiàn)中所述的常規(guī)方法進(jìn)行。本發(fā)明所用的命名法和本發(fā)明的實驗步驟和技術(shù)和本文所述的藥物化學(xué)為此項技術(shù)中所熟知且通用者。術(shù)語"經(jīng)分離"或"分離"意謂使物質(zhì)自其原始環(huán)境(例如，若天然存在則為天然環(huán)境)中移出。術(shù)語"經(jīng)分離"并不一定反映物質(zhì)經(jīng)純化的程度。術(shù)語"突變體"或"變異體"意謂涵蓋全體細(xì)胞遺傳組成已通過如化學(xué)突變誘發(fā)、自發(fā)突變、遺傳工程、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染而改變，以致影響其物理或生物化學(xué)特性的任何微生物。然而，所述變異體或突變體應(yīng)具有以登錄號PTA-8410保藏于ATCC中的04107M-2菌株的所有識別特征。術(shù)語"全液培養(yǎng)物"是指含有細(xì)胞與培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)物。術(shù)語"治療"意謂預(yù)防或減輕嚴(yán)重癥狀或病理狀況的影響，包括延長預(yù)期壽命。在治療癌癥的情形下，治療可包括預(yù)防腫瘤生長，減小腫瘤尺寸，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡或增加腫瘤中的細(xì)胞凋亡。術(shù)語"有效量"意謂足以實現(xiàn)有益或所欲結(jié)果的量。術(shù)語"組合物"意謂活性劑和其它為惰性(例如，可檢測試劑或標(biāo)記或液體載劑)或活性(諸如佐劑)的化合物、載劑或組合物的組合。術(shù)語"細(xì)胞毒性"是指細(xì)胞死亡與導(dǎo)致細(xì)胞停滯(例如喪失生長的能力)的毒性以及細(xì)胞凋亡。術(shù)語"哺乳動物"意謂用以乳腺分泌的乳汁養(yǎng)育其幼崽的任何種類的高等脊椎動物，其包括(例如)人類、兔子和猴子。頂果孢菌屬菌株本發(fā)明的一目的為提供一種經(jīng)分離的頂果孢菌屬菌株。本發(fā)明的菌株可從天然來源(例如，從臺灣臺東縣收集的土壤樣品)分離。本發(fā)明的經(jīng)分離菌株能夠產(chǎn)生碘色菌素且具有下述特征。經(jīng)分離菌株顯示基內(nèi)菌絲體，且氣生菌絲體上生有孢囊。經(jīng)分離菌株在其肽聚糖中含有內(nèi)消旋二氨基庚二酸。葡萄糖、北美放線菌粘糖和鼠李糖為菌株的全細(xì)胞糖。唯一發(fā)現(xiàn)的磷脂為磷脂酰乙醇胺(PE)且主要甲基萘醍類為MK-9(H4)和MK-9(H2)。未檢測到霉菌酸。主要細(xì)胞脂肪酸為異-(:16:0(19.6%)、<:17:0(16.84%)和10-甲基-Cn:o(26.5P/c),且DNAG+C含量為72.40mol%。根據(jù)表型和基因型資料，建議應(yīng)將04107M-2菌株歸類為頂果孢菌屬的新穎菌種，亦即新穎石榴頂果孢菌種(^crocw770^om;n/m'casp.nov.)。也發(fā)現(xiàn)可自浸沈全液培養(yǎng)物的EtOAc萃取物獲得主要為紫色且散發(fā)紅色光澤的碘色菌素化合物，其提供一種制備碘色菌素的新穎方法。菌株石榴頂果孢菌04107M-2菌株(Jcracar/7o^ora/w"/ca)也涵蓋于本發(fā)明的范疇內(nèi)，其于2007年5月3日依據(jù)布達(dá)佩斯條約(BudapestTreaty)保藏于美國弗吉尼亞州馬納薩斯10801大學(xué)大道(10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209，U.S.A.)的美國菌種保存中心(AmericanTypeCultureCollection),且指定登錄號PTA-8410。其也于2007年1月15日保藏于臺灣食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存和研究中心(BioresourceCollectionandResearchCenter)(登錄號BCRC910341)。源自所保藏菌株的突變體或變異體(通過常規(guī)或重組方法獲得者)以及具有與所保藏菌株相同特征的任何石榴頂果孢菌菌株也在本發(fā)明的范疇內(nèi)。碘色菌素的制備可使用所有本發(fā)明的石榴頂果孢菌菌株(包括所保藏菌株和其突變體)以產(chǎn)生碘色菌素。根據(jù)本發(fā)明，碘色菌素可通過在合適條件下和合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的石榴頂果孢菌菌株以獲得含有碘色菌素的全液培養(yǎng)物來制備。本發(fā)明所用的培養(yǎng)基包括可用于培養(yǎng)頂果孢菌屬的任何培養(yǎng)基(諸如HV培養(yǎng)基)或可提供碳和氮來源和合成碘色菌素必需的任何組份的任何其它培養(yǎng)基。本發(fā)明的石榴頂果孢菌菌株可在約20至30'C，優(yōu)選約28'C的溫度下培養(yǎng)約l至3周，優(yōu)選約2周的時期。根據(jù)本發(fā)明，全液培養(yǎng)物中的碘色菌素可進(jìn)一歩分離或純化。分離或純化可通過任何此項技術(shù)中己知的技術(shù)來進(jìn)行。舉例而言，碘色菌素可通過諸如EtOAc、CH2Cl2或其混合物的溶劑來萃取。碘色菌素的用途將獲自本發(fā)明新穎菌株的碘色菌素進(jìn)行特性鑒別。結(jié)果驚人地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)行MTT測試時，碘色菌素展現(xiàn)對細(xì)胞株的細(xì)胞毒性效應(yīng)，而所述細(xì)胞株包括腫瘤細(xì)胞株，諸如AGS、HeLa、HepG2和MCF-7。換言之，碘色菌素能夠誘發(fā)細(xì)胞中的細(xì)胞毒性，且因此能夠殺死細(xì)胞，包括癌細(xì)胞。因為先前僅報道過碘色菌素的抗菌特性和其作為用以有效降低過敏患者血壓的抗高血壓劑的用途，故本發(fā)明提供一種碘色菌素在誘發(fā)動物細(xì)胞中的細(xì)胞毒性方面的新穎用途?；诘馍啬軌驓⑺腊┘?xì)胞的事實，本發(fā)明另外提供一種治療癌癥的方法，其包含對需要所述治療的動物投予有效量的碘色菌素以誘發(fā)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。所述動物優(yōu)選為哺乳動物且更佳為人類。在本發(fā)明中可治療的癌癥包括(但不限于)子宮頸癌、肝癌、胃癌和乳癌。用于本發(fā)明的碘色菌素可自任何常規(guī)來源獲得。常規(guī)來源的實例包括(但不限于)碘色菌、達(dá)松維爾擬諾卡氏菌(A^w^'o/^j和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(4c,WA"Zwc"/j^/erraonWfl";j)(塞斯考發(fā)(Ceskova)等人，2002)。根據(jù)本發(fā)明，碘色菌素也可自如上所述的本發(fā)明的制備方法獲得?？蓪⒌馍鼗衔镎{(diào)配為醫(yī)藥組合物，且以適合于所選投藥途徑的各種形式投予動物，包括人類患者。所述化合物優(yōu)選是與醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑合并投予，且可與特定傳遞劑組合或連接。化合物可通過已知技術(shù)，例如，經(jīng)口、不經(jīng)腸(包括皮下注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù))、通過吸入噴霧、局部、通過經(jīng)由粘膜或直腸吸收以含有一或多種常規(guī)無毒醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑、佐劑或媒劑的單位劑量調(diào)配物投予。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可為適于經(jīng)口投予的懸浮液或錠劑、鼻用噴霧、乳霜和無菌可注射制劑形式，諸如無菌可注射水性或油質(zhì)懸浮液或栓劑。對于以懸浮液形式經(jīng)口投藥而言，可根據(jù)醫(yī)藥調(diào)配技術(shù)中熟知的技術(shù)來制備組合物。組合物可含有微晶纖維素以賦予體積、褐藻酸或褐藻酸鈉作為懸浮劑、甲基纖維素作為粘度增強(qiáng)劑和甜味劑或調(diào)味劑。當(dāng)作為立即釋放錠劑時，組合物可含有微晶纖維素、淀粉、硬脂酸鎂和乳糖或此項技術(shù)中已知的其它賦形劑、粘合劑、增量劑、崩解劑、稀釋劑和潤滑劑。對于通過吸入劑或噴霧劑投藥而言，可根據(jù)醫(yī)藥調(diào)配技術(shù)中熟知的技術(shù)來制備組合物?？墒褂闷S醇或其它合適的防腐劑、可增強(qiáng)生物可用性的吸收促進(jìn)劑、碳氟化合物或此項技術(shù)中已知的其它增溶劑或分散劑將組合物制備為存于生理食鹽水中的溶液形式。對于以可注射溶液或懸浮液投藥而言，可根據(jù)此項技術(shù)中熟知的技術(shù)，使用合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑，諸如無菌油(包括合成甘油單酯或甘油二酯)和脂肪酸(包括油酸)調(diào)配組合物。對于以栓劑形式直腸投藥而言，可通過使其與合適無刺激性賦形劑(諸如可可脂、合成甘油酯或聚乙二醇(在周圍溫度下為固體，但在直腸腔中液化或溶解以釋放藥物))混合來制備組合物。優(yōu)選投藥途徑包括經(jīng)口和不經(jīng)腸，以及靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下途徑。更佳地，將化合物碘色菌素通過輸注或注射而以不經(jīng)腸(亦即靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi))方式投予。在本發(fā)明的一實施例中，可將化合物通過腫瘤注射直接投至腫瘤。在本發(fā)明的另一實施例中，可通過靜脈內(nèi)注射使用全身投遞方式投予化合物。所述化合物的溶液或懸浮液可于水或等張生理食鹽水(PBS)中制備，且視情況與無毒表面活性劑混合。分散液也可于甘油、液態(tài)聚乙烯、二醇、DNA、植物油、三乙酸甘油酯和其混合物中制備。在存儲和使用的一般條件下，所述制劑可含有防腐劑以防止微生物生長。適合于注射或輸注用途的醫(yī)藥劑型可包括包含活性成份的無菌水溶液、無菌水性分散液或無菌散劑，其適于即時制備無菌可注射或可輸注溶液或分散液。最終劑型在制備和存儲條件下應(yīng)為無菌、流體且穩(wěn)定。液態(tài)載劑或媒劑可為溶劑或液態(tài)分散介質(zhì)，包含(例如)水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇或液態(tài)聚乙二醇和其類似物)、植物油、無毒甘油酯和其合適混合物?？?例如)通過形成脂質(zhì)體、通過維持所需粒徑(在分散液的情況下)或通過使用無毒表面活性劑來維持適當(dāng)流動性。可通過各種抗菌劑和抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞和其類似物)實現(xiàn)防止微生物的作用。在多數(shù)情況下，需包括等張試劑，例如糖、緩沖液或氯化鈉?？赏ㄟ^在組合物中包含延遲吸收的試劑(諸如單硬脂酸鋁水凝膠和明膠)來實現(xiàn)可注射組合物的延長吸收。無菌可注射溶液是通過使適當(dāng)溶劑中的所需量的連接物與如上所列舉的各種其它成份混合，且需要時隨后進(jìn)行過濾滅菌來制備。在用于制備無菌可注射溶液的無菌散劑的情況下，優(yōu)選制備方法為真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其獲得活性成份加上存在于先前的無菌過濾溶液中的任何其它所欲成份的散劑。當(dāng)于活體內(nèi)使用以殺死癌細(xì)胞時，投予劑量為可產(chǎn)生所欲效果的量，諸如足以減少或消除腫瘤的量。適當(dāng)量可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員使用已知方法和關(guān)系自以下實例中所提供的活體外數(shù)據(jù)來決定。投予的有效劑量會隨各患者所特有的病狀而改變。一般而言，諸如疾病負(fù)擔(dān)、腫瘤位置(暴露的或遠(yuǎn)程的)、宿主年齡、代謝、疾病、先前所接觸藥物和其類似因素皆會影響藥物的預(yù)期效用。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用標(biāo)準(zhǔn)步驟和患者分析以下述實例中所提供的數(shù)據(jù)計算推斷適當(dāng)?shù)膭┝俊４送?，本發(fā)明的組合物可與其它抗腫瘤治療合并投予。本文所述的所有公開案、專利和專利文獻(xiàn)均以全文引用的方式并入本文中?？尚薷谋疚乃龅谋景l(fā)明以包括替代實施例。如以下所申請的所有所述明顯替代實施例均在本發(fā)明的范疇內(nèi)。實例提供以下實例以輔助所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員實施本發(fā)明。即使如此，不應(yīng)將所述實例視為本發(fā)明的限制，因為在不悖離本發(fā)明的精神或范疇的情況下，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可對本文所述實施例進(jìn)行修改和變化。A.頂果孢菌屬菌株的分離，04107TM-2菌株04107M-2菌株是從臺灣臺東縣所收集的土壤樣品中通過HV瓊脂(早川&野野村(Hayakawa&Nonomura)，1987)于28。C下培養(yǎng)4周分離獲得。將菌株維持于燕麥片瓊脂上，且將菌株的孢子或菌絲體碎片懸浮于含有20%(體積/體積)甘油的培養(yǎng)液并存儲于-20。C。B.04107TM-2菌株的特征(1)形態(tài)特征在28'C將04107M-2菌株在HV瓊脂上培養(yǎng)14天，通過4%四氧化鋨溶液固定，且隨后以乙醇和丙酮連續(xù)脫水且經(jīng)臨界點干燥之后，通過掃描電子顯微鏡(東京日立(Hitachi,Tokyo)S-450)觀察所述菌株的形態(tài)特征。發(fā)現(xiàn)04107M-2菌株會產(chǎn)生分支和非片段基內(nèi)菌絲體，且氣生菌絲體尖上生有棒狀結(jié)構(gòu)。如圖1所示，孢子為非運動性、桿狀且表面平滑。(2)生理特征在28。C下進(jìn)行所有生理測試。通過戈登(Gordon)等人(1974)所述的方法和步驟檢測生長溫度，七葉苷、酪蛋白、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤和L-酪氨酸的水解，以及淀粉酶、硝酸還原酶和尿素酶的產(chǎn)生。菌株在各種培養(yǎng)基上的生長皆不良，且如圖2所示，在燕麥片瓊脂上觀察到具有金色光澤的微紅晶體。在所有測試的培養(yǎng)基中皆未發(fā)現(xiàn)可溶性色素的產(chǎn)生。生理測試的結(jié)果顯示于表1。表1.04107TM-2菌株的生理特征<table>Complextableseetheoriginaldocumentpagex</column></row><table>腺嘌呤-七葉苷+酪蛋白+次黃嘌呤-L-酪氨酸-黃嘌呤-以下各物的產(chǎn)生淀粉酶-黑色素-硝酸還原酶-尿素酶+*+:陽性反應(yīng)，-:陰性反應(yīng)，+/-:可疑反應(yīng)(3)生物化學(xué)特征使菌株在具有YS培養(yǎng)液(于pH值為7.0的l.OL蒸餾水中含有10.0g酵母萃取液和10.0g淀粉)的燒瓶(125rpm/min)中，在28°C下震蕩生長14天之后進(jìn)行生物質(zhì)量化學(xué)分類研究(biomassforchemotaxonomicstudies)。通過長谷川(Hasegawa)等人(1983)所述的方法測定全細(xì)胞水解產(chǎn)物中的二氨基庚二酸的異構(gòu)體和糖。通過遵循明尼金(Minnikin)等人(1975)所揭示的方法，經(jīng)由薄層層析法(TLC)來檢驗霉菌酸的存在，且通過遵循明尼金(Minnikin)等人(1984)所揭示的方法，萃取且鑒別磷脂。通過柯林斯(Collins)等人(1977)所揭示的方法，萃取甲基萘醌類，且隨后通過具有Nova-PakC18管柱的HPLC(600型號，沃特斯公司(Waters))分析純化甲基萘醌類。為定量分析細(xì)胞脂肪酸含量，使用TSB培養(yǎng)基在28'C下于125r.p.m.的震蕩恒溫箱中培養(yǎng)04107M-2菌株7天。根據(jù)制造商(美國微生物ID有限公司(MicrobialIDInc.,U.S.A.))所提供的方法制備甲基化脂肪酸的萃取液。發(fā)現(xiàn)04107M-2菌株的全細(xì)胞水解產(chǎn)物中含有內(nèi)消旋A2pm、北美放線菌粘糖、鼠李糖和葡萄糖。主要甲基萘醌類為MK-9(H4)和MK-9(H2)，且未檢測到霉菌酸。然而，檢測到磷脂酰乙醇胺(PE)。主要脂肪酸甲酯為異《16:0(19.6%)、Cn:o(16.8樣)和10-甲基-C17:。(26.51%)，且DNA的G+C含量為72.40mol%。(4)種系發(fā)生特征為獲得用以對16SrRNA基因定序的DNA,將04107M-2菌株在28。C下的YS培養(yǎng)液中生長14天。使用吸管尖將細(xì)胞自培養(yǎng)液中取出且使用QIAGENGenimicDNA試劑盒萃取全部DNA。通過玉岡(Tamaoka)&駒形(Komagata)(1984)所揭示的HPLC方法測定DNA的G+C含量。使用由中島(Nakajima)等人(1999)所提供的方法PCR擴(kuò)增16SrRNA基因，且直接在BigDyeTerminator3.1版試劑盒(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(A卯liedBiosystems))的ABI3730型自動DNA定序儀上定序。在使用CLUSTALX(湯普森(Thompson)等人，1997)進(jìn)行多次數(shù)據(jù)比對之后，使用軟件包PHYUP和MEGA(分子進(jìn)化遺傳分析，MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis)2.1版(庫馬(Kumar)等人，2001)進(jìn)行種系發(fā)生分析。計算進(jìn)化距離(根據(jù)木村(Kimura)雙參數(shù)模型的距離選項；木村，1980)且用斎藤(Saitou)&寧(Nei),1987所述的鄰接方法(neighbor-joiningmethod)使序列分群。通過IOOO次重取樣進(jìn)行靴帶式分析(Bootstrapanalysis)以評估鄰接數(shù)據(jù)的樹狀拓樸。根據(jù)江崎(Ezaki)等人(1989)所揭示的方法進(jìn)行DNA-DNA雜交。在上述方法之后，可確定04107M-2菌株的16SrRNA基因的近似完整序列(1511nt)。所述序列與美國基因數(shù)據(jù)庫(GenBank)數(shù)據(jù)庫的初步比對顯示其與頂果孢菌屬的某些成員具高序列相似性。圖3顯示基于04107M-2菌株、其它確實公開的頂果孢菌屬菌種和相關(guān)菌種的16SrRNA基因的序列獲得的種系發(fā)生樹。二元相似值(binarysimilarity)介于96.5%(多形頂果孢菌IFO162667)與98.27。(皺紋頂果孢菌(A.coTMgato)NBRC13972T)的范圍內(nèi)。新穎04107M-2分離菌與其最接近類型的菌株，皺紋頂果孢菌BCRC16357T、巨頭頂果孢菌和多形頂果孢菌的DNA-DNA雜交率分別為2.9%、0.4%和1.0%(參見表2)。表2.頂果孢菌屬的菌種間的DNA雜交率<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>種為不同菌種(韋恩(Wayne)等人，1987)。與最接近的種系發(fā)生鄰近者(phylogeneticneighbours)相比，分離物的差別性也是源于表型證據(jù)(參見表2)?；诒硇秃突蛐吞卣鳎苊黠@應(yīng)將分離物歸類為具有04107M-2菌株類型的頂果孢菌屬的新穎菌種，即為新穎石榴頂果孢菌種。C.碘色菌素的化合物鑒別以EtOAc萃取全液培養(yǎng)物(IOL)，且在減壓下濃縮以得到EtOAc-(部份A，5g)可溶部分。將所述EtOAc(5g)可溶部分于Si凝膠(0.25kg)管柱上層析，用正己烷洗提且用EtOAc增濃以得到15個部份(部份Al部份A15)。使部份A3(1.56g)進(jìn)行Si凝膠(30g)管柱層析，用正己烷洗提且用EtOAc增濃以得到11個部份(部份A3-l-部份A3-11)。將部份A3-ll(21.0mg)通過制備型TLC(正己烷-EtOAc，5:1)純化以得到碘色菌素。經(jīng)上述方法處理后，可獲得主要為紫色且發(fā)紅色的化合物(吩嗪類)碘色菌素，且其物理化學(xué)特征提供如下紫色針狀物(苯)；熔點235~236°C;IR(KBr)vmax3500(OH)cm";^NMR(CDC13，400MHz)S7,15(2H，dd，/=7,8,0.9Hz)，7.71(2H，dd,/=7.8,9.3Hz)，8.02(2H,dd,/=9.3，0.9Hz)，14.70(2H,s);EIMSm々244[M]+(90)。分子式C12H8N204。D.碘色菌素的細(xì)胞毒性效應(yīng)通過如下所述的MTT分析測定碘色菌素的細(xì)胞毒性MRC-5(胚胎肺，正常，人類，BCRC60023)、AGS(人類胃腺癌，BCRC60102)、HeLa(人類子宮頸上皮樣癌瘤，BCRC60005)、HepG2(人類肝胚細(xì)胞瘤，BCRC60177)和MCF7(人類乳腺癌，BCRC60436)是購自食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存和研究中心。在經(jīng)10%胎牛血清(FBS，GIBCO)和1%盤尼西林(penicillin)/鏈霉素(GIBCO)補(bǔ)充的最小必需培養(yǎng)基(MEM，GIBCO)中培養(yǎng)MRC-5、HeLa和HepG2細(xì)胞。在經(jīng)10呢FBS禾n1%盤尼西林/鏈霉素補(bǔ)充的Ham'sF-12培養(yǎng)基(F-12，GIBCO)中培養(yǎng)AGS細(xì)胞。在經(jīng)10呢FBS、1%盤尼西林/鏈霉素和10jag/m人類重組胰島素(GIBCO)補(bǔ)充的MEM中培養(yǎng)MCF7細(xì)胞。在37'C下的含有5%C02的濕潤空氣的恒溫箱中維持所有細(xì)胞株。通過改良的MTT[溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎗](默克公司(Merck))比色法測定化合物碘色菌素對所有細(xì)胞株的細(xì)胞毒性。對于MRC-5、AGS、HeLa、HepG2和MCF7細(xì)胞而言，在96孔組織培養(yǎng)盤(Falcon)中分別加入180pl細(xì)胞培養(yǎng)物起始濃度為5000、3000、1500、3000和3000個細(xì)胞/孔。將化合物碘色菌素以三種濃度(5pM、2)iM和lnM)—式四份分配到建立的培養(yǎng)物中。培養(yǎng)3天之后，通過以下MTT分析測定每一細(xì)胞株的細(xì)胞數(shù)目將20nl1mg/ml的MTT添加至盤的各孔中，且隨后在37。C下將盤培養(yǎng)5小時。將甲臜晶體于100filDMSO(默克公司(Merck))中震蕩IO分鐘使其再溶解，且立即在540nm的波長(Mosmann，1983)下于ELISA讀取器(Bio-Tek)上讀取盤。圖4所示結(jié)果顯示化合物碘色菌素能夠在所有測試細(xì)胞株中誘發(fā)顯著細(xì)胞毒性效應(yīng)。參考文獻(xiàn)布什(Bush)，J.A.，朗(Long)，B.H.，卡堤諾(Catino)，J.J.，布拉德爾(Braduer)，W.T.和富田(Tomita)，K.(1987).蝶霉素(rebeccamycin)-—種新穎抗腫瘤劑的制造禾口生物活性(Productionandbiologicalactivityofrebeccamycin，anovelantitumoragent).抗菌素雜志(J.Antibiot.)40:668-678?？铝炙?Collins)，M.D.，卑路斯(Pirouz)，T.，古德菲勒(GoodfeHow)，M.和明尼金(Minnikin)，D.E.(1977).放線菌和棒狀桿菌中甲基萘醌的分布(Distributionofmenaquinonesinactinomycetesandcorynebacteria).普通微生物學(xué)雜志(/GenA/7craWoZ)100，221-230。江崎(Ezaki),T.，橋本(Hashimoto)，Y.和藪內(nèi)(Yab匿hi)，E.(1989).微量稀釋孔中的熒光脫氧核糖核酸-脫氧核糖核酸雜交作為使用放射性同位素測定菌株中的遺傳關(guān)聯(lián)性的薄膜濾器雜交的替代(Fluorometricdeoxyribonucleicacid-deoxyribonucleicacidhybridizationinmicrodilutionwellsasanalternativetomembranefilterhybridizationinwhichradioisotopesareusedtodeterminegeneticrelatednessamongbacterialstrains).國際細(xì)菌分類學(xué)雜志(/"f/SyWfiacfen'o/)39,224-229。戈登(Gordon)，R.E.，巴內(nèi)特(Barnett)，D.A"翰德翰(Handerhan)，J.E.和潘德(Pand)，C.H.-N.(1974).空腔諾卡氏菌、自養(yǎng)諾卡氏菌和諾卡氏菌株(iVocflWacoe""ca，WocaWflawfo加p/u'ca:，andthenocardinstrain).國際細(xì)菌分類學(xué)雜志(/"f/SywSacfen'oZ)24,54-63。長谷川(Hasegawa)，T.,滝沢(Takizawa)，M.和谷田(Tanida)，S.(1983).化學(xué)群需氧放線菌的快速分析(Arapidanalysisforchemicalgroupingofaerobicactinomycetes).生物技術(shù)和應(yīng)用微生物學(xué)(/Ge"A一Af!'c油'。Z)29,319-322。早川(Hayakawa)，M,和野野村(Nonomura)，H.(1987).腐殖酸-維他命糖，一種選擇性分離土壤放線菌的新穎培養(yǎng)基(Humicacid-vitaminagar,anewmediumfortheselectiveisolationofsoilactinomycetes).發(fā)酵工程雜志(/Ferme"frec/moZ)65，501-509。五十嵐(Igarashi)，M.，陳(Chen)，W.，Tsucluda，T.，梅北(Umekita)，M.，沢(Sawa)，T.,長繩(Naganawa)，H"浜田(Hamada)，M.和竹內(nèi)(Takeuchi)，T.(1995).4，-脫乙?；?(-)-griseusinsA和B，來自放線菌的新穎萘醌抗生素(4'-Deacetyl-(-)匿griseusinsAandB,newnaphthoquinoneantibioticsfromanactinomycete).抗菌素雜志(J.Antibiot.)48:1502-1505。木村(Kimura)，M.(1980).—種通過比較研究核苷酸序列估計堿基置換進(jìn)化速率的簡單方法(Asimplemethodforestimatingevolutionaryratesofbasesubstitutionsthroughcomparativestudiesofnucleotidesequence.)分子進(jìn)化雜志(/AfoZEVoZ)16,111-120。庫馬(Kumar)，S.，田村(Tamura)，K.，雅科布森(Jakobsen)，I.B.和寧(Nei)，M.(2001).MEGA2:分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析軟件(MEGA2:MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysissoftware).生物信息學(xué)雜志(&'w'"/omum'")17,1244-1245。列契威尼樂(Lechevalier)，M.P.和列契威尼樂(Lechevalier)，H.A.(1970).化學(xué)組成作為需氧放線菌分類中的標(biāo)準(zhǔn)(Chemicalcompositionasacriterionintheclassificationofaerobicactinomycetes),國際細(xì)菌分類學(xué)雜志(/"f./.51，Bacfer!'W).20:435-443。中島(Makajima)，Y"Kitpreechavanich，V"鈴木(Suzuki)，K.和工藤(Kudo)，T.(1999).新穎珊瑚色小雙孢菌屬(M!'cra&!'印oracorallina),從泰國土壤分離的小雙孢菌(Af!'craW印ora)屬的親j禾中(Mf'cra&!、poracorallinasp.nov,anewspeciesofthegenusM!'croRyporaisolatedfromThaisoil).國際細(xì)菌分類學(xué)雜志(/"f./.S;yW.Sa"er!'oZ).49:1761-1767。明尼金(Minnikin)，D.E.，阿爾西馬尼(Alshamaony)，L.和古德菲勒(Goodfellow)，M.(1975).通過薄層色譜分析全細(xì)胞甲醇分解產(chǎn)物區(qū)別分枝桿菌、諾卡氏菌和相關(guān)分類群(Differentiationof腳co6a"m'鵬，iVocani!'a,andrelatedtaxabythinlayerchromatographicanalysisofwhole-cellmethanolysates).普通微生物學(xué)雜志(/Ge/iM/c油'o/)88,200-204。斎藤(Ssitou)，N.和寧(Nei)，M.(1987).鄰接法一種重構(gòu)種系發(fā)生樹的新穎方法(Theneighbor-joiningmethod:anewmethodforreconstructingphylogenetictrees).分子生物進(jìn)化雜志(MW歷W5w/)4,406-425。蒙塔內(nèi)(Montaner)，B.和佩雷斯-托馬斯(Perez-Tomas)，R.(2003).靈菌紅素一種新穎家方夷的抗癌藥物(Theprodigiosins:anewfamilyofanticancerdrugs).癌癥藥靶研究最新進(jìn)展(Curr.CancerDrugTargets).3:57-65。長澤(Nagasawa)，T.，深尾(Fukao)，H.，入江(Irie)，H.和山田(Yamada)，H.(1984).左金霉素A、B、C和D:由諾卡氏菌株所制得的新穎醌類型的抗生素(SakyomicinsA,B，CandD:newquinone-typeantibioticsproducedbyastrainofNocardia).分類、制造、分離禾口生物學(xué)性質(zhì)(Taxonomy,production,isolationandbiologicalproperties).抗菌素雜志(J.Antibiot.)37:693-699。1摩斯曼(Mosmann)，T.(1983).細(xì)胞生長和存活的快速比色測定關(guān)于增殖和細(xì)胞毒性分析的應(yīng)用(Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:Applicationtoproliferationandcytotoxicityassays).免疫方法雜志(/mmtmoZ.臉/ZioA)65,55-63。P.塞斯考發(fā)(Ceskova)，Z.扎克(Zak)，D.B.約翰遜(Johnson)，O.Janiczek和M.曼迪(Mandi)(2002).通過生長于元素硫上的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌株形成碘色菌素(FormationofiodininbyastrainofAcidithiobacillusferrooxidansgrownonelementalsulfur).生物技術(shù)和應(yīng)用微生物學(xué)(FoliaMicrobiol)(布拉格(Praha)).47(1):78-80。玉岡Tamaoka，J.和駒形(Komagata)，K.(1984).通過反相高效液相色譜確定DNA堿基組成(DeterminationofDNAbasecompositionbyreversed-phasehigh-performanceliquidchromatography).歐洲微生物學(xué)會聯(lián)合微生物學(xué)快報(F￡MS!'craWo/Le")25，125-128。田村(Tamura)，T.，鈴木(Suzuki)，S.和波多野(Hatano)，K.(2000).新穎頂果孢菌屬一禾中放線菌目新種(Acrocarposporagen.Nov.,anewgenusoftheorderActinomycetales).國際細(xì)菌分類學(xué)雜志(/"fJSy"5acfen'oZ)50，1163-1171。1湯普遜(Thompson)，J,D.，吉布森(Gibson)，T.J"普魯尼?？?Plewniak)，F(xiàn)"吉安摩金(Jeanmougin)，F(xiàn).和希金斯(Higgins)，D.G.(1997).ClustalXwindows界面由質(zhì)量分析工具輔助的多序列比對的靈活策略(TheClustalXwindowsinterface:flexiblestrategiesformultiplesequencealignmentaidedbyqualityanalysistools).核酸石開究(iV油/Ci4c^尺e廳rcZi)24,4876-4882。韋恩(Wayne)，L.G"伯倫納(Brenner)，D.J.,科爾威爾(Colwell)，R.R.和其它9位作者(1987)，細(xì)菌分類學(xué)國際委員會(InternationalCommitteeonSystematicBacteriology).adnoc委員會關(guān)于調(diào)整細(xì)菌分類方法的報告(Reportoftheadnoccommitteeonreconciliationofapproachestobacterialsystematics).國際細(xì)菌分類學(xué)雜志((/"f./.5fl"e〃'oZ.)37:463-464。權(quán)利要求1.一種能夠產(chǎn)生碘色菌素的頂果孢菌(Acrocarpospora)的經(jīng)分離菌株，所述菌株具有當(dāng)在固體培養(yǎng)基上生長時產(chǎn)生具有金色光澤的微紅晶體的特征。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的經(jīng)分離菌株，其具有以下特征-具有基內(nèi)菌絲體；氣生菌絲體上生有孢子囊；肽聚糖中含有內(nèi)消旋二氨基庚二酸；葡萄糖、北美放線菌粘糖和鼠李糖為全細(xì)胞糖；磷脂酰乙醇胺(PE)為僅有磷脂；MK-9(H4)和MK-9(H2)為主要甲基萘醌；未檢測到霉菌酸；異-<:16:0(19.6%)、(:17:0(16.84%)和10-甲基-(:17:0(26.51%)為主要細(xì)胞脂肪酸；和DNAG+C含量為72.40mol%。3.—種石榴頂果孢菌Acrocarposporapunica)的經(jīng)分離菌株，其命名為石榴頂果孢菌04107M-2，且以登錄號PTA-8410保藏于ATCC，或其具有實質(zhì)上與石榴頂果孢菌04107M-2相同特征的變異體或突變體。4.一種制備碘色菌素的方法，其包含培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的經(jīng)分離菌株。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述碘色菌素經(jīng)進(jìn)一步分離或純化。6.—種在活體外誘發(fā)動物細(xì)胞中細(xì)胞毒性的方法，其包含使所述細(xì)胞與碘色菌素接觸。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述碘色菌素是由根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的經(jīng)分離菌株產(chǎn)生。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述細(xì)胞為癌細(xì)胞。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述癌細(xì)胞來自以下癌細(xì)胞株中的一種AGS、HeLa、HepG2和MCF-7。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述動物為哺乳動物。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述哺乳動物為人類。12.—種碘色菌素的用途，其用于制備用以治療動物癌癥的藥物。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中所述碘色菌素是由根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的經(jīng)分離菌株產(chǎn)生。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中所述動物為哺乳動物。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述哺乳動物為人類。16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中所述癌癥是通過誘發(fā)所述動物癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性來治療。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的用途，其中所述癌癥選自子宮頸癌、肝癌、胃癌和乳癌。全文摘要本發(fā)明提供一種能夠產(chǎn)生碘色菌素的頂果孢菌屬(Acrocarposporagen.)的新穎菌種。本發(fā)明也提供一種制備碘色菌素的方法和碘色菌素在誘發(fā)細(xì)胞毒性與治療癌癥方面的用途。文檔編號A61K31/495GK101343615SQ20081012686公開日2009年1月14日申請日期2008年7月10日優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日發(fā)明者余立文,吳文蓉,敏曾,楊淑鳳,袁國芳,鄭銘仁申請人:財團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所