專利名稱：無(wú)支架工程軟骨組織的構(gòu)建方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種工程組織的構(gòu)建方法，尤其涉及無(wú)支架工程軟骨組織的構(gòu)建方 法及其產(chǎn)品，屬于再生醫(yī)學(xué)及組織工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
軟骨損傷修復(fù)一直是關(guān)節(jié)外科研究的熱點(diǎn)。國(guó)外自體軟骨細(xì)胞移植(autologous chondrocyte implantation, ACI)已經(jīng)取得較好的臨床療效，但須二次手術(shù)，增加患者 的痛苦。目前，用于構(gòu)建工程軟骨組織的種子細(xì)胞可來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells, BMSCs )，但隨著年齡增長(zhǎng)干細(xì)胞數(shù)量和增殖能力顯著下降。 自體脂肪干細(xì)胞用于關(guān)節(jié)軟骨組織工程的構(gòu)建也有報(bào)道，但這些均存在需要患者進(jìn) 行二次手術(shù)的問(wèn)題。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)由于免疫表型發(fā)育不 完全，可用于異體移植，但面臨倫理、法律方面的問(wèn)題，也有移植后形成畸胎瘤的 報(bào)道，應(yīng)用受到限制。因此，尋找新的干細(xì)胞來(lái)源已越來(lái)越受到各國(guó)學(xué)者的關(guān)注。 近來(lái)有學(xué)者從分娩后的廢棄材料臍帶或胎盤中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞
(mesenchymal stem cells, MSCs ),并進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分化功能和表面標(biāo)志物等生物學(xué) 表型鑒定，為干細(xì)胞多向分化及MSCs在臨床的應(yīng)用提供了新的種子細(xì)胞來(lái)源和實(shí) 驗(yàn)基礎(chǔ)。
胎盤與臍帶屬于胚胎外組織，存在大量多向分化的干細(xì)胞。采用膠原酶消化法 可快速獲得大量成纖維細(xì)胞樣形態(tài)的干細(xì)胞。在揭:作過(guò)程中，小心分離臍帶血管組 織和臍帶外膜組織，即可獲得臍帶Wharton膠；由于臍帶僅含有3根血管，不含有 毛細(xì)血管，可獲得純度較高的間質(zhì)干細(xì)胞。臍帶Wharton膠間質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí) 間約為3 ~ 5天，而B(niǎo)MSCs原代培養(yǎng)時(shí)間約8 ~ 10天；臍帶Wharton膠間質(zhì)干細(xì)胞 培養(yǎng)過(guò)程中CFU-F頻率約為3:104,而B(niǎo)MSCs CFU-F頻率僅為1:104 ~ 105。流式細(xì) 胞儀檢測(cè)臍帶Wharton膠干細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD44、 CD105、 CD271,此為間充質(zhì)干細(xì) 胞的表面標(biāo)志；而不含表達(dá)CD34、 CD45造血干細(xì)胞標(biāo)志，這表明從臍帶間質(zhì) Wharton膠分離的干細(xì)胞均屬M(fèi)SCs,而不含造血干細(xì)胞，因此，從臍帶Wharton膠分離MSCs的純度高于BMSCs，方法更簡(jiǎn)便。
通過(guò)對(duì)人臍帶Wharton膠中的MSCs進(jìn)行組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn) Wharton膠MSCs與軟骨細(xì)胞具相似的細(xì)胞外基質(zhì)成分。文獻(xiàn)報(bào)道臍帶為富含膠 原和GAGs的組織，其中膠原占干重的50%,透明質(zhì)酸占GAGs的70%;軟骨組織 也富含膠原和GAG,膠原占干重的50%,其中II型膠原占總膠原的90% ~ 95% 。 本發(fā)明人在以往的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，臍帶MSC甲苯胺藍(lán)染色、番紅"O，，染色和II型膠原免 疫組織化學(xué)染色呈弱陽(yáng)性；軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)后，曱苯胺藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外 基質(zhì)富含軟骨糖蛋白、番紅"O"染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外富含增多的氨基多糖、免疫組織 化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)II型膠原增多。對(duì)臍帶MSC進(jìn)行RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，臍帶 MSC天然表達(dá)Sox-9和Col-2Al。 Sox-9基因位于人17號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，在胚胎性 別決定、調(diào)控軟骨分化發(fā)育起重要作用。Sox-9結(jié)合軟骨細(xì)胞特征分子II型膠原， aggrecan蛋白增強(qiáng)子元件，激活表達(dá)，從而調(diào)控軟骨分化。臍帶MSC天然陽(yáng)性表達(dá) Sox-9和Col-2Al,從分子水平揭示了臍帶MSC具有前軟骨細(xì)胞的特性；臍帶MSC 經(jīng)軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，II型膠原免疫組織化學(xué)染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，更接近于軟骨細(xì)胞，以 上均表明人Wharton膠分離出的干細(xì)胞具有自然向軟骨分化的特點(diǎn)。這也是它與成 人骨髓干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞不同之處。
綜上所述，臍帶Wharton膠干細(xì)胞從形態(tài)學(xué)、增殖特性、細(xì)胞表面分子標(biāo)志和 免疫表型等方面均證實(shí)了具有MSCs的特點(diǎn),并證實(shí)了具有前軟骨細(xì)胞的特性，在一 定條件下可較好轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞。此外，臍帶的巨大優(yōu)勢(shì)還在于取材幾乎不受限 制；無(wú)倫理學(xué)限制；如能進(jìn)一步表明其免疫抑制特征或降低去除其抗原性，則可用 于異體移植，在同種異體關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)方面將有著廣闊應(yīng)用前景。
關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)是一臨床難題，種子細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的面臨的主 要問(wèn)題。目前國(guó)內(nèi)外組建軟骨組織工程的種子細(xì)胞均來(lái)源于自體，且體外構(gòu)建的方 式多為細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞支架。細(xì)胞與上述支架材料的復(fù)合較為繁瑣，細(xì)胞接種密度不 均，且存在細(xì)胞與支架生物相容性、支架體內(nèi)降解產(chǎn)物對(duì)人體安全性、支架臨床應(yīng) 用審批復(fù)雜等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種無(wú)支架的軟骨組 織的構(gòu)建方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種無(wú)支架工程軟骨組織的構(gòu)建方法，包括
(1) 將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs )誘導(dǎo)分化為軟骨
細(xì)胞；
(2) 將軟骨細(xì)胞接著進(jìn)行聚集誘導(dǎo)培養(yǎng)，使軟骨細(xì)胞向細(xì)胞外分泌基質(zhì)并結(jié) 成膜狀物，將膜狀物(該膜狀物由細(xì)胞外基質(zhì)及軟骨細(xì)胞組成)從培養(yǎng)瓶壁剝離后 在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，之后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移至離心管離心，在離心力的 作用下使細(xì)胞進(jìn)一步聚集，形成疏松的軟骨細(xì)胞團(tuán)塊；
(3) 將疏松的軟骨組織團(tuán)塊在旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到 致密的類軟骨組織。
步驟(1)中所述的誘導(dǎo)分化方式可采用單層誘導(dǎo)培養(yǎng)方式，可參考有關(guān)文獻(xiàn) 所公開(kāi)的方式進(jìn)行誘導(dǎo)分化(例如Wang HS， Hung SC， Peng ST, et al. Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord. Stem Cells, 2004, 22(7):1330);更優(yōu)選的，步驟(1 )中所述的誘導(dǎo)分化按照以下培養(yǎng)體系和培養(yǎng)條件 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)液為DMEM(20。/。FBS)加入10ng/mlhTGF-|31, 10ng/mlhFGF,體 積分?jǐn)?shù)為1%ITS和l.Oxl(T8 mol/L地塞米松；培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為37°C 、在5%C02 的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每3天換液一次。
步驟(2)中所述的聚集誘導(dǎo)培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件同步驟(1)所述的 誘導(dǎo)培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件，也可按照文獻(xiàn)所公開(kāi)的聚集誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件所進(jìn)行(B. Johnstone, T.M. Hering， A.I. Caplan， V.M. Goldberg, J.U. Yoo, In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells, Exp. Cell Res. 238 (1998) 265-272 )。
所述的離心管優(yōu)選是15毫升的尖底離心管；所述離心優(yōu)選在以下條件進(jìn)行離 心離心轉(zhuǎn)速為1000rpm-2000rpm,離心時(shí)間為10分鐘。
步驟(3)中將疏松的軟骨組織團(tuán)塊在旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，所述 的誘導(dǎo)培養(yǎng)液同步驟(1 ),即DMEM力卩20%FBS,再加入10ng/ml hTGF陽(yáng)卩l(xiāng)、 10ng/ml hFGF、體積分?jǐn)?shù)為1%的ITS和1.Ox l(T8 mol/L地塞米松；培養(yǎng)條件如下培養(yǎng)溫度 為37。C;旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)速分步進(jìn)行調(diào)整，即(1 )將旋轉(zhuǎn)的起始速度控制 為12轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)30分鐘后，休息30分鐘，再重復(fù)上述操作2次之后將旋 轉(zhuǎn)速度改為16轉(zhuǎn)/分鐘，每持續(xù)旋轉(zhuǎn)三天換誘導(dǎo)培養(yǎng)液一次， 一般持續(xù)培養(yǎng)10-20 天，優(yōu)選為15天(本領(lǐng)域技術(shù)人員可視細(xì)胞的多少及所需形成的組織大小而適當(dāng) 改變或設(shè)定培養(yǎng)時(shí)間)。本發(fā)明首先將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞，將軟骨細(xì)胞進(jìn)行聚集 誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到大量的由細(xì)胞外基質(zhì)及軟骨細(xì)胞組成的膜狀物，將膜狀物剝離后放 入在離心管內(nèi)，在離心機(jī)的離心力的作用下，膜狀物堆積，取出堆積膜狀物，在細(xì) 胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)一周，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，繼續(xù)分泌的細(xì)胞外基質(zhì)將膜
狀物進(jìn)行整合，形成疏松的軟骨組織團(tuán)塊；最后將軟骨組織團(tuán)塊轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培 養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的作用下，疏松的軟骨組織團(tuán)塊在力 學(xué)的刺激下，細(xì)胞繼續(xù)增殖，并分泌基質(zhì)，形成更大的組織團(tuán)塊，組織變得致密、 光滑而具有光澤，使得誘導(dǎo)后的組織接近軟骨組織。
本發(fā)明由人臍帶MSCs經(jīng)過(guò)密集誘導(dǎo)培養(yǎng)后結(jié)成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，結(jié)合生物反應(yīng) 器技術(shù)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)后細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)具有類似軟骨細(xì)胞外 基質(zhì)的成分，是良好的軟骨細(xì)胞天然的支架，構(gòu)建得到無(wú)支架的工程軟骨組織。經(jīng) 細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)染色顯示，本發(fā)明所構(gòu)建的工程組織具有正常軟骨 細(xì)胞特點(diǎn)。
本發(fā)明在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中(細(xì)胞—細(xì)胞聚集成膜狀—疏松組織塊—致密組織塊 —類軟骨樣組織)不涉及細(xì)胞與外源性支架的復(fù)合問(wèn)題，細(xì)胞種植密度均勻，不存 在細(xì)胞與支架生物相容性的問(wèn)題，對(duì)人體安全，操作簡(jiǎn)單，臨床可應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨 缺損的治療或修復(fù)。


圖1 間充質(zhì)干細(xì)胞的表型。
圖2 本發(fā)明所構(gòu)建的無(wú)支架軟骨組織的外觀。
圖3 本發(fā)明所構(gòu)建的無(wú)支架軟骨組織的HE染色結(jié)果。
圖4 本發(fā)明所構(gòu)建的無(wú)支架軟骨組織的番紅花"O"染色結(jié)果。
圖5 本發(fā)明所構(gòu)建的無(wú)支架軟骨組織的曱苯胺藍(lán)染色結(jié)果。
圖6 本發(fā)明所構(gòu)建的無(wú)支架軟骨組織的n型膠原免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。
圖7 本發(fā)明所構(gòu)建的無(wú)支架軟骨組織的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果((Sox-9及Col-2Al 為陽(yáng)性)；1: Marker; 2、 7: (3-actin ; 3、 5: Sox-9; 4、 6: Col-2Al。 2、 3、 4為 誘導(dǎo)前的結(jié)果，5、 6、 7為誘導(dǎo)后的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方 案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
一、 材料與試劑
PE-CD44、 PE-HLA陽(yáng)ABC、 FITC墨HLA-DPDQDR、 FITC-CD34、 FITC-CD45及 FITC-IgGl和PE-IgGl抗體(BD公司，USA )， PE-CD105抗體(Sant Crus公司，USA), PE-CD271抗體(Miltenyi Biotec GmbH， Germany); DMEM培養(yǎng)基(dulbecco，s modified Eagle's medium, DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)、胰島素-轉(zhuǎn) 鐵蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium， ITS)、胰酶、地塞米松、II型膠原單克隆抗 體(Sigma公司，USA);青霉素、鏈霉素(華北制藥有限公司)；人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子卩l(xiāng) (human transforming growth factor|3-l, hTGF-pi， PeproTechEC公司，USA)、人成 纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(human fibroblast growth factor, hFGF, Pepro Tech EC公司， USA)。 Trizol Reagent (Invitrogen公司，USA)， RT陽(yáng)PCR試劑(QIAGEN公司， Germany),瓊脂糖(Promega公司，USA )。
二、 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
C02培養(yǎng)箱(Hereus B5060型，Germany);倒置相差光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng) (OLYMPUS, 1X70， Japan )及光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)(OLYMPUS, BX51， Japan); 流式細(xì)胞儀(BD公司，USA);凝膠分析系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)有限公司，Champgel 2000型)；旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(SYNTHECON公司，USA)。
三、 D-hank，s平衡液的配制
取8.0gNaCl、 0.4gKCl、 0.06g Na2HP04.H20、 0.06gKH2PO4，加水200ml溶解， 加入酚紅母液lml，定容至1000 ml,分裝到250ml瓶中，高壓蒸汽消毒，用時(shí)用 NaHC03調(diào)整pH值到7.2左右。
實(shí)施例1 無(wú)支架組織工程軟骨組織的構(gòu)建及鑒定 1 、人臍帶Wharton膠干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
從手術(shù)臺(tái)取足月正常產(chǎn)健康產(chǎn)婦臍帶組織，D-Hank平衡液充分洗滌殘留的血 液，去除臍靜脈、動(dòng)脈及臍帶外膜，剝離Wharton膠，剪碎后用I型膠原酶37。C磁 力攪拌器作用下消化。將消化后的含細(xì)胞消化液用D-Hank平衡液清洗、1500轉(zhuǎn)/ 分鐘離心10min，離心3遍后，將收集的細(xì)胞種植于含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的DMEM培養(yǎng)瓶中，37°C、 5%0)2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以倒置相差顯微鏡觀察。
2、 人臍帶Wharton膠干細(xì)胞表面分子標(biāo)志檢測(cè)與鑒定
收集第二代人臍帶Wharton膠干細(xì)胞，分別加入造血干細(xì)胞標(biāo)志抗體 FITC-CD34和FITC-CD45， MSCs標(biāo)志抗體PE-CD44、 PE-CD105和PE-CD271,主 要組織相容性抗原復(fù)合物(major histocompability complex, MHC )標(biāo)志抗體 PE-HLA-ABC和FITC-HLA-DPDQDR,觀察人臍帶干細(xì)胞造血標(biāo)志、MSCs標(biāo)志和 MHC表達(dá)情況，同時(shí)采用PE-IgGl和FITC-IgGl作為同行對(duì)照。人臍帶干細(xì)胞與 相應(yīng)抗體在4。C冰箱中孵育30min， PBS洗滌并調(diào)整細(xì)胞濃度為lxl06/ml,流式細(xì) 胞儀檢測(cè)。結(jié)果PE-CD44、 PE-CD105和PE-CD271陽(yáng)性，F(xiàn)ITC-CD34和FITC-CD45 陰性；HLA-ABC陽(yáng)性，HLA-DPDQDR陰性(圖1 )。
3、 軟骨組織的構(gòu)建(聚集誘導(dǎo)培養(yǎng)+旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)誘導(dǎo)培養(yǎng))
(1 )取高密度的第二代人臍帶Wharton膠MSCs置于向軟骨分化的誘導(dǎo)培養(yǎng) 液中(DMEM(20。/oFBS)加入10ng/mlhTGF-(31, 10ng/mlhFGF,體積分?jǐn)?shù)為1%ITS 和l.Oxl(T8 mol/L地塞米松)；培養(yǎng)條件37°C 、 5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每3 天換液，可見(jiàn)誘導(dǎo)后人臍帶Wharton膠MSCs迅速結(jié)成膜狀；
(2)隨著聚集誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)成的膜狀物隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，膜的邊緣掀起， 將細(xì)胞膜小心吹打，移至15ml尖底的離心管內(nèi)在轉(zhuǎn)速為1000-2000rpm的條件下離 心lOmin,細(xì)胞進(jìn)一步聚集，使膜狀物堆積于尖底的離心管底部，離心管內(nèi)的誘導(dǎo) 培養(yǎng)液同步驟(l);然后取出膜狀物，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)l周后， 用吸管小心的將基于細(xì)胞膜的松散的團(tuán)塊樣組織移至旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)繼續(xù)進(jìn) 行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液同步驟(1)，培養(yǎng)溫度為37。C, 旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)速分步進(jìn)行調(diào)整，即(l)起始速度為12轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)培 養(yǎng)30分鐘后停止旋轉(zhuǎn)(休息)30分鐘，(2)將步驟(1 )再重復(fù)2次，之后旋轉(zhuǎn) 速度改為16轉(zhuǎn)/分鐘，每持續(xù)旋轉(zhuǎn)三天換誘導(dǎo)培養(yǎng)液一次，持續(xù)培養(yǎng)15天左右， 即得。
4、 鑒定
形成的組織具有類軟骨特點(diǎn)，外觀組織具有光澤和彈性，直徑為5mm(圖2 ) 組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定軟骨細(xì)胞圓形，位于陷窩中，番紅"O"、甲苯 胺藍(lán)染色，II型膠原染色細(xì)胞內(nèi)外均陽(yáng)性(圖3，圖4,圖5,圖6 )。 DNA鑒定RT-PCR檢測(cè)，Sox-9及Col-2Al為陽(yáng)性(圖7 )。
權(quán)利要求
1、一種無(wú)支架工程軟骨組織的構(gòu)建方法，包括(1)將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells)誘導(dǎo)培養(yǎng)分化為軟骨細(xì)胞；(2)將軟骨細(xì)胞進(jìn)行聚集誘導(dǎo)培養(yǎng)，使軟骨細(xì)胞向細(xì)胞外分泌基質(zhì)并結(jié)成膜狀物，將膜狀物在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，之后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)離心，在離心力的作用下，使細(xì)胞進(jìn)一步團(tuán)聚，形成疏松的軟骨細(xì)胞團(tuán)塊；(3)將疏松的軟骨細(xì)胞團(tuán)塊在旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到致密的類軟骨組織。
2、 按照權(quán)利要求1的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(2)中所述的離心管是15 毫升的尖底離心管。
3、 按照權(quán)利要求1的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(2)中所述離心的轉(zhuǎn)速為 1000rpm-2000rpm，離心時(shí)間為10min。
4、 按照權(quán)利要求1的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(3)中所述的旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速按 照以下步驟進(jìn)行調(diào)控(1 )將起始旋轉(zhuǎn)速度控制為12轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)30分鐘再停止 旋轉(zhuǎn)30分鐘；(2 )將步驟(1 )重復(fù)2次以后將旋轉(zhuǎn)速度控制為16轉(zhuǎn)/分鐘，進(jìn)行 持續(xù)旋轉(zhuǎn)。
5、 按照權(quán)利要求4的構(gòu)建方法，其特征在于所述的持續(xù)旋轉(zhuǎn)的時(shí)間為10-20天。
6、 按照權(quán)利要求5的構(gòu)建方法，其特征在于所述的持續(xù)旋轉(zhuǎn)的時(shí)間為15天。
7、 權(quán)利要求l-6任何一項(xiàng)構(gòu)建方法所得到的無(wú)支架工程軟骨組織。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種無(wú)支架工程軟骨組織的構(gòu)建方法及由該方法所得到的產(chǎn)品。本發(fā)明的構(gòu)建方法包括將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞，再接著進(jìn)行聚集誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其向細(xì)胞外分泌基質(zhì)并結(jié)成膜狀物；將膜狀物在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)誘導(dǎo)培養(yǎng)，形成疏松的軟骨組織團(tuán)塊；在旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器內(nèi)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到致密的類軟骨組織。經(jīng)細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)或免疫組織化學(xué)染色顯示，本發(fā)明所構(gòu)建的工程組織具有正常軟骨細(xì)胞表型。本發(fā)明所構(gòu)建的無(wú)支架工程軟骨組織不涉及細(xì)胞與外源性支架的復(fù)合問(wèn)題，不存在細(xì)胞與支架生物相容性的問(wèn)題，對(duì)人體安全，細(xì)胞種植密度均勻，臨床應(yīng)用操作簡(jiǎn)單，可應(yīng)用于軟骨缺損的治療或修復(fù)。
文檔編號(hào)A61F2/28GK101543644SQ20081010284
公開(kāi)日2009年9月30日 申請(qǐng)日期2008年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月27日
發(fā)明者侯克東, 盧世璧, 莉 張, 江 彭, 玥 田, 玫 袁, 許文靜, 郭金義 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院