專利名稱：信筒子醌在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中草藥單體信筒子醌(Embdin)的新用途，具體涉及信筒 子醌在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管新生是在已有血管基礎(chǔ)上產(chǎn)生新血管的過程，包括五個基本過程①血 管基底膜降解；②內(nèi)皮細(xì)胞穿過基底膜遷移到血管周圍基質(zhì)；③內(nèi)皮細(xì)胞增殖、 相互黏附并連接； 形成管腔樣結(jié)構(gòu)；⑤基質(zhì)重塑和平滑肌細(xì)胞的包繞及血管 的相互吻合形成血管網(wǎng)。
血管新生在生理和病理?xiàng)l件下都有發(fā)生，生理性血管新生主要發(fā)生在胚胎發(fā) 育和女性生理周期，對于正常的發(fā)育非常關(guān)鍵；病理性血管新生是許多疾病發(fā)生 的重要原因，包括腫瘤、心血管疾病、糖尿病等，其中腫瘤一直對人類健康造成 極大威脅，腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移都依賴于新生血管為其提供養(yǎng)分；沒有新生血管的 生成，腫瘤一般只能長至2 3立方毫米，因此通過抑制血管新生來抑制腫瘤以及 其他相關(guān)疾病具有廣闊的應(yīng)用前景。
與傳統(tǒng)腫瘤治療方式(如化療、放療等)相比，抗血管新生療法耙向于腫瘤 灶的血管內(nèi)皮細(xì)胞而不是腫瘤細(xì)胞本身，具有療效明顯、毒副作用小等諸多優(yōu)點(diǎn)。 它可以直接通過阻止血管新生相關(guān)蛋白的產(chǎn)生，也可以通過抑制它們的作用而起 效，特效的抗血管新生藥物已然成為治療癌癥和其他血管新生依賴性疾病的有效 治療方法。2004年美國FDA批準(zhǔn)了第一個血管新生抑制劑用于治療結(jié)腸癌，現(xiàn) 有多種類似制劑在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，一些中草藥單體也已被發(fā)現(xiàn)具有抗血管新生的 作用。
信筒子醌(Embelin)是白花酸藤果中提純出的一種苯醌類化合物，雖然己 有文獻(xiàn)報(bào)道信筒子醌可以通過直接作用于腫瘤細(xì)胞而具有抗腫瘤的作用，還有抗 菌、抗炎、抗生育等作用，但是尚沒有信筒子醌可以抑制血管新生的報(bào)道，或通 過抑制血管新生來抑制腫瘤，也沒有信筒子醌作為抑制血管新生藥物的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)信筒子醌作為一種新的血管生成抑制劑的藥理用途。
本發(fā)明在于信筒子醌在制備血管新生抑制藥物中的應(yīng)用，尤其是信筒子醌在 制備抑制乳腺癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤、急性骨髓性白血病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮 癬、糖尿病綜合癥、血管瘤等血管新生依賴性疾病中的相關(guān)應(yīng)用。
具體而言，本發(fā)明提供信筒子醌在制備抑制腫瘤血管新生的藥物中的應(yīng)用。 在制備抑制血管新生藥物為抑制關(guān)節(jié)炎病變組織的血管新生的藥物中的應(yīng)用，所 述的關(guān)節(jié)炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或者炎性關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明還提供信筒子醌在制備抑制新生血管性眼病的藥物種的應(yīng)用。具體包 括新生血管性角膜疾??；或者新生血管性視網(wǎng)膜疾??；或者抑制血管新生性虹膜 疾??；或者制新生血管性青光眼；或者新生血管性脈絡(luò)膜疾??；或者新生血管性 結(jié)膜眼?。换蛘呱裳苄桶變?nèi)障；或者新生血管性玻璃體眼?。换蛘咝律?性視神經(jīng)疾病。其中，所述的新生血管性視網(wǎng)膜疾病為糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視 網(wǎng)膜靜脈閉塞、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變或者視網(wǎng)膜動脈閉塞。所述的新生血管性脈絡(luò) 膜疾病為濕性老年黃斑病變。
本發(fā)明還提供了信筒子醌在制備抑制血管瘤病變組織血管新生的藥物中的 應(yīng)用，以及在制備抑制銀屑病病變組織血管新生的藥物中的應(yīng)用，以及在制備抑 制實(shí)體瘤病變組織血管新生的藥物中的應(yīng)用，其中實(shí)體瘤為原發(fā)性或者繼發(fā)性的 實(shí)體瘤。
本發(fā)明還提供信筒子醌在制備抑制血管瘤的藥物中的應(yīng)用，其中血管瘤包括 多發(fā)性血管瘤或者血管母細(xì)胞瘤。還提供信筒子醌在制備抑制Kaposi's肉瘤病變 組織血管新生的藥物、以及抑制白血病、淋巴瘤或者骨髓瘤血液癌癥的藥物、以 及抑制Paget's疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供信筒子醌在制備血管新生抑 制劑組合物上的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明可以將治療有效量的信筒子醌和藥學(xué)上允許的任意一種輔料制 成藥物組合物，也可以添加其他與信筒子醌沒有拮抗作用的抗血管新生藥物。其 制劑可以是藥學(xué)上的任意一種劑型，包括但不限于片劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、 口服液、注射劑、脂質(zhì)體等。
為實(shí)施本發(fā)明的方法，信筒子醌可通過口服、腸胃外、吸入式噴霧或通過植 入式貯存器給藥。"腸胃外"包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈 內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)及顱內(nèi)注射或輸入技術(shù)。
口服可用固體或液體狀的劑量單位，如末劑、散劑、片劑、糖衣劑、膠囊劑、 顆粒劑、懸浮劑、溶液劑、糖漿劑、滴劑、舌下含片等劑型進(jìn)行給藥。
末劑是將本發(fā)明化合物磨成適當(dāng)?shù)募?xì)度而制成。散劑是將本發(fā)明化合物磨成 適當(dāng)?shù)募?xì)度，然后與同樣細(xì)度的醫(yī)藥用載體(如載體、甘露糖醇之類可食性碳水化合物等)混合制成。根據(jù)需要，也可混入矯味劑、防腐劑、分散劑、著色劑、
香料等物質(zhì)。
膠囊劑是將如上所述制成粉末狀的末劑和散劑或入片劑部分所述的顆粒化的 物質(zhì)填充到如明膠膠囊外殼中而制成。也可將潤滑劑和助流劑等混合到粉末狀物 質(zhì)中，然后在膠囊中進(jìn)行填充操作。若添加助溶劑和崩解劑等，如聚乙二醇，碳 酸鈉，可改善膠囊攝取時的藥效。
本發(fā)明公開了信筒子醌在制備血管新生藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明，信筒子醌 在人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)的增殖實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞成管 實(shí)驗(yàn)、雞胚尿囊膜血管新生等均有明顯的抑制作用，可用于制備抑制血管新生的 藥物。


圖l:信筒子醌抑制HMEC-1細(xì)胞的增殖
圖2:信筒子醌抑制HMEC-1細(xì)胞的體外劃痕遷移照片
其中A.對照；B.10"M信筒子醌
圖3:信筒子醌抑制HMEC-1細(xì)胞的修飾的Boyden小室遷移照片
其中A.對照；B. 1UM信筒子醌
圖4:信筒子醌抑制HMEC-1細(xì)胞的成管照片
其中A.對照；B. 101XM信筒子醌 圖5:信筒子醌抑制雞胚尿囊膜新生血管形成的照片 其中A.對照;B. l嗎/disc信筒子醌
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)例l:信筒子醌抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)細(xì)胞增殖
目的和原理細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用MTS assay。 MTS assay是一種在活細(xì)胞中 運(yùn)用比色法確定細(xì)胞增殖數(shù)量的測定方法。NADPH脫氫酶將MTS四唑鹽化合 物轉(zhuǎn)變成一種溶于組織培養(yǎng)液的一種有色物質(zhì)，其顏色深淺與細(xì)胞株的活細(xì)胞數(shù) 目在一定范圍內(nèi)高度相關(guān)。通過該模型可評價(jià)藥物對細(xì)胞增殖能力的影響。
方法將HMEC-1細(xì)胞懸液接種于96孔板中(每孔5000個細(xì)胞)，分別加 入含有不同濃度信筒子醌的培養(yǎng)基作用48 72小時,然后每孔加入20nl顯色劑， 孵育1 4小時，再用酶標(biāo)儀在4卯nm處讀出每個孔中的光吸收值。
結(jié)果與評價(jià)與對照組相比，加入信筒子醌后，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力受到抑 制，說明信筒子醌可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
實(shí)施實(shí)例2:信筒子醌抑制HMEC-1細(xì)胞體外劃痕遷移實(shí)驗(yàn)
目的和原理細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)又叫體外劃痕實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通過在培養(yǎng)板中長滿的單層內(nèi)皮細(xì)胞上制造劃痕，在顯微鏡下觀察'并記錄下劃痕邊緣細(xì)胞朝劃痕部 位遷移的情況，來評價(jià)藥物對內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響。
方法將8×104個/ml細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長至90%以上，用微 量移液器的lml的吸頭在每孔中劃一條線。用PBS將細(xì)胞碎片洗凈，再加入含 有VEGF165以及含有不同藥物濃度的培養(yǎng)基，于5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)約24 小時左右，直至VEGF165組長滿。
結(jié)果與評價(jià)在顯微鏡下觀察并拍照，結(jié)果為其中A為對照組，B為10 uM信筒子醌；與對照組相比，給予信筒子醌后，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移受到抑制， 說明信筒子醌可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移運(yùn)動。
實(shí)施實(shí)例3:信筒子醌抑制HMEC-1細(xì)胞修飾的Boyden小室遷移實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮韮?nèi)皮細(xì)胞修飾的Boyden小室遷移實(shí)驗(yàn)采用Millicell (Millopore) 小室，這是一類可插入細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)皿，底層有孔徑為8Mffl的多聚碳酸鹽濾 膜，在生長因子的誘導(dǎo)下細(xì)胞可以透過膜的一側(cè)粘附于含有高濃度生長因子的另 一側(cè)，此實(shí)驗(yàn)可以檢測藥物對內(nèi)皮細(xì)胞有阻力遷移能力的影響。
方法向24孔板中加入1%的明膠于37℃孵育30分鐘，棄去明膠，用PBS 洗三遍。小室外24孔板中加入600ul含有VEGF服的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。小室中 接入2萬個細(xì)胞，之后再加入50uL不同濃度的信筒子醌藥物，于37°C 5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育四小時。
結(jié)果與評價(jià)四小時后，將小室內(nèi)外的細(xì)胞培養(yǎng)液吸去，下層細(xì)胞遷移的細(xì) 胞用4%多聚甲醛固定20分鐘，用PBS洗三遍并吸干，之后用蘇木精伊紅染色 20分鐘，再用PBS將背景多余染料洗去，室溫晾干。OLYMPUS顯微鏡下拍照計(jì)數(shù) 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。結(jié)果為其中A為對照組，B為luM信筒子醌組；與對照組比，給予 信筒子醌后，內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力受到影響，說明信筒子醌可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞有阻 力的遷移的能力。實(shí)施實(shí)例4:信筒子醌抑制HMEC-1細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)
目的和原理Matrigel (基質(zhì)膠)是從EHS (Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性的基底膜抽提物。此種肉瘤富含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其主 要成份是層粘連蛋白，還有膠原IV、內(nèi)功素、硫酸肝素糖蛋白，它還含有TGF-卩、 纖維母細(xì)胞生長因子、組織纖溶酶原激活物(tPA)和其他的一些生長因子。在 室溫下，此Matrigel可聚合成一種具有生物活性的基質(zhì)材料，作用與哺乳動物細(xì) 胞基底膜類似，對于細(xì)胞的粘附和分化有效應(yīng)作用。內(nèi)皮細(xì)胞可以在Matrigel 上融合形成微管，可以利用內(nèi)皮細(xì)胞的這種特性來研究藥物對血管形成的影響。 方法將Matrigel鋪到48孔板上，于37℃、 5% CO2培養(yǎng)箱放置30min待其 凝固后，每孔加入60000個細(xì)胞，再加入500W含有不同濃度信筒子醌的培養(yǎng) 基，混勻。于37℃ 5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18小時后在顯微鏡下觀察微管形成情況，每孔選擇上下左右及中間共五個不同部位，計(jì)算微管形成數(shù)量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析。
結(jié)果與評價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel中生長16-18h后，細(xì)胞由原來的多角形 變成長梭形，在Matrigel中延伸生長，單個細(xì)胞巻成管狀并相互連接，形成三
維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果為其中A:對照組，B: 10幽信筒子醌；與對照組相比，給
予信筒子醌之后，內(nèi)皮成管過程受到影響，三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞，說明信筒子 醌可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞微管形成。
實(shí)施實(shí)例5:信筒子醌抑制雞胚尿囊膜血管新生
目的和原理在雞胚生長早期，其機(jī)體免疫系統(tǒng)尚未完全建立，處于對各種 外來抗原免疫耐受階段，對所加的測試藥物不會產(chǎn)生排斥反應(yīng)。將含藥物的載體 置于其表面，可觀察到藥物對雞胚尿囊膜新生血管的影響。目前是一種較為理想 的研究血管生成的活體模型。
方法對種蛋外殼進(jìn)行消毒，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中孵育5天后，在超凈工 作臺中，用酒精棉擦拭其表面，在蛋殼氣室端開一個直徑約l厘米的小口，通過 小孔觀察胚胎所在的位置，剝除部分外殼，露出尿囊膜。之前準(zhǔn)備好加入不同濃 度信筒子醌，直徑為5毫米滅菌圓形濾紙，將濾紙加在尿囊膜上無血管區(qū)，用滅 菌透明膠帶封口。
(A:對照組，不加信筒子醌,B: Wg/disC信筒子醌)
結(jié)果與評價(jià)放入濾紙的雞胚放入孵育箱中繼續(xù)孵育兩天之后,揭去透明膠 帶，剝殼將尿囊膜盡量暴露，在體視顯微鏡下拍照，結(jié)果見圖5。與對照組比較， 給予信筒子醌之后，新的微血管生成受到抑制，說明信筒子醌可以抑制雞胚尿囊 膜新血管的生成。
權(quán)利要求
1. 信筒子醌在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制腫瘤血管新生的藥物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制關(guān)節(jié) 炎病變組織的血管新生的藥物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于關(guān)節(jié)炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或者 炎性關(guān)節(jié)炎。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制新生 血管性眼病的藥物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于眼病為新生血管性角膜疾??； 或者新生血管性視網(wǎng)膜疾病；或者抑制血管新生性虹膜疾?。换蛘咧菩律苄?青光眼；或者新生血管性脈絡(luò)膜疾??；或者新生血管性結(jié)膜眼??；或者生成血管 型白內(nèi)障；或者新生血管性玻璃體眼??；或者新生血管性視神經(jīng)疾病。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于新生血管性視網(wǎng)膜疾病為糖尿 病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變或者視網(wǎng)膜動脈閉塞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于新生血管性脈絡(luò)膜疾病為濕性 老年黃斑病變。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制血管 瘤病變組織血管新生的藥物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制銀屑 病病變組織血管新生的藥物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制實(shí)體 瘤病變組織血管新生的藥物。 '
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于實(shí)體瘤為原發(fā)性或者繼發(fā)性 的實(shí)體瘤。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生的藥物為抑制血 管瘤的藥物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于血管瘤包括多發(fā)性血管瘤或 者血管母細(xì)胞瘤。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制 Kaposi's肉瘤病變組織血管新生的藥物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制白血 病、淋巴瘤或者骨髓瘤血液癌癥的藥物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為抑制 Paget's疾病的藥物。
18. 根據(jù)權(quán)利要求l-17所述的應(yīng)用，其特征在于信筒子醌在在制備血管新生 抑制劑組合物上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中草藥單體信筒子醌(Embelin)的新用途，具體涉及信筒子醌在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。信筒子醌在制備抑制乳腺癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤、急性骨髓性白血病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、糖尿病綜合癥、血管瘤等血管新生依賴性疾病中的相關(guān)應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明，信筒子醌在人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)的增殖實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)、雞胚尿囊膜血管新生等均有明顯的抑制作用，可用于制備抑制血管新生的藥物。
文檔編號A61P35/02GK101278925SQ20081003810
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者劉明耀, 盧彬彬, 京 張, 張曉麗, 易庭芳, 易正芳, 李雙喜, 力 賴 申請人:華東師范大學(xué)