專利名稱：可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽單鏈抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能對(duì)抗可卡因等 精神活性物質(zhì)引起精神依賴(復(fù)吸)的抗體的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
:
精神活性物質(zhì)依賴(吸毒)和復(fù)吸是當(dāng)今社會(huì)嚴(yán)重的問題，目前， 尚無較理想的方法來防治脫毒后的復(fù)吸。近年來科學(xué)界對(duì)可卡因一苯丙
胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(CART)研究不斷深入，可卡因一苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽 (CART)是一類與藥物的成癮和依賴效應(yīng)相關(guān)的肽類物質(zhì)，可卡因和苯 丙胺等精神活性物質(zhì)可導(dǎo)致可卡因一苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽明顯表達(dá)，但其 受體目前尚未克隆成功。增加與藥物成癮密切相關(guān)腦區(qū)中腦腹側(cè)背蓋區(qū) (VTA) CART的水平可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生可卡因樣行為，誘導(dǎo)條件性位置 偏愛的形成(Kimmel HL,et.al.， ( 2000). I他aventral tegmental area injection of rat cocaine and amphetamineregulated transcript peptide 55—102 induces locomotor activity and promotes conditioned place preference. J Pharmacol Exp Ther 294:784-792)。尸檢發(fā)現(xiàn)，可卡因成癮患者的CART的表達(dá)也 顯著增力口(Kuhar MJ, Dall Vechia S. (1999) CART peptides: novel addiction-and feeding-related neuropeptides. Trends Neurosci 22:316—20.)，表明精神 活性物質(zhì)誘導(dǎo)的中樞CART水平的增加可能是導(dǎo)致復(fù)吸的重要原因之 一。提示減少可卡因一苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽的表達(dá)就可削弱機(jī)體對(duì)可卡因 和可苯丙胺等精神活性長(zhǎng)期使用而引起的精神依賴(林琴，可卡因一苯 丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽抗體抑制嗎啡誘導(dǎo)的小鼠條件性位置偏愛的形成和重 建，2006，第二軍醫(yī)大學(xué)碩士論文)。
1974年，Bonese等人第一次提出用免疫療法來治療藥物依賴(Bonese， K. F.et.al.， (1974). Changes in heroin self-administration by a rhesus monkey after morphine immunization. Nature 252， 708—710.) ， 1986年，Owens禾口 Mayersohn首次提出了被動(dòng)免疫療法應(yīng)用于治療藥物依賴的概念(Owens,S. M., & Mayersohn, M. (1986). Phencyclidine-specific Fab fragments alter phencyclidine disposition in dogs. Drug Metab Dispos 14, 52— 58.)。九十年
代初期單克隆抗體應(yīng)用于藥物依賴這一治療概念的提出(McClurkan, M. B et.al.,(1993) Disposition of a monoclonal anti-phencyclidine Fab fragment in rats.J Pharmacol Exp Ther 266, 1439— 1445. Valentine, J. L.， et.al., (1994) Anti-phencyclidine monoclonal Fab fragments dramatically alter phencyclidine pharmacokinetics in rats. J Pharmacol Exp Ther 269， 1079— 1085. Valentine, J. L.， & Owens, S. M. (1996). Antiphencyclidine monoclonal antibody therapy significantly changes phencyclidine concentrations in brain and other tissues in rats. J Pharmacol Exp Ther 278, 717—724.)，單克隆抗體 具有可重復(fù)、純度高、特異性強(qiáng)及可大量制備等的優(yōu)點(diǎn)，而且單克隆抗 體可以對(duì)藥物過量及自身給藥產(chǎn)生即時(shí)和長(zhǎng)期的作用。
抗體作為一種新的診斷和治療手段有巨大的潛力，大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明，抗體可以用于人類，有治療疾病的作用?；蚬こ炭贵w很多，其 中單鏈抗體(single chain antibody )是一個(gè)重要的基因工程抗體，是利用基 因工程方法使抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段約5-25個(gè) 氨基酸的連接肽，首尾拼接而成的重組蛋白。它能較好地保持抗原親和 活性，并具有分子量小、免疫原性低、組織穿透力強(qiáng)、體內(nèi)清除快、易 于進(jìn)行基因工程改進(jìn)和大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，且易與效應(yīng)分子相連 構(gòu)建多種新功能的抗體分子。噬菌體表面展示文庫(kù)技術(shù)是獲得基因工程 抗體的關(guān)鍵技術(shù)，其要點(diǎn)是:從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中分離抗體可變 區(qū)基因；PCR擴(kuò)增抗體全套基因片段(如VH. VL)，將體外擴(kuò)增的VH. VL 基因片段隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體，形成組合文庫(kù)；將基因組合文庫(kù)插入噬 菌體編碼膜蛋白的基因m(g3)或基因VI(g8)的先導(dǎo)系列的下游，使外源 基因表達(dá)的多肽以融合蛋白的形式展示在外殼蛋白gpIII或gpWI的N端。 研究發(fā)現(xiàn)這樣展示的多肽能保持其活性，據(jù)此可用固相化抗原經(jīng)"親和 結(jié)合-洗脫-擴(kuò)增"數(shù)個(gè)循環(huán)，直接、方便、簡(jiǎn)捷、高效地篩選出表達(dá)特 異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫(kù)。
目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道通過噬菌體展示技術(shù)篩選出用于治療由于可卡因 等精神活性物質(zhì)(包括阿片類、可卡因、苯丙胺和氯胺酮等)導(dǎo)致的成 癮行為的抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選出用于治療由于可卡因等精神活性物質(zhì)導(dǎo)致的 成癮行為的抗體基因，表達(dá)和純化該抗體以及該抗體的應(yīng)用。
本發(fā)明是基于可卡因一苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(CART)而研發(fā)出的一種 可以對(duì)抗可卡因一苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽的單鏈抗體。
本發(fā)明以GST-CART融合蛋白(氨基酸序列見本申請(qǐng)人的中國(guó)專利 申請(qǐng)200510025292.5 ，發(fā)明名稱為"可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽基因疫苗 及其制備與應(yīng)用"中公開的序列)作為抗原免疫小鼠，獲得cDNA文庫(kù)， 應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選出可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽單鏈抗體基因，將 該基因克隆到原核表達(dá)載體pET28a上，運(yùn)用原核表達(dá)系統(tǒng)，誘導(dǎo)表達(dá)并 純化可卡因一苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽單鏈抗體，直接注射到動(dòng)物體內(nèi)從而減 少了機(jī)體對(duì)可卡因和苯丙胺等精神藥物長(zhǎng)期使用而引起的精神依賴。
本發(fā)明提供一類可卡因一苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽單鏈抗體，共6種，分 別命名為AH1， AH4B， AH6， AH19,AH33B， AH36，單鏈抗體的蛋白 結(jié)構(gòu)N端和C端序列具有小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈特征，本單鏈抗體 的特征性序列位于NC端之間，被柔性短肽GGGGSGGGGSGGGGS相連， 柔性短肽NC端包含與CART特異性結(jié)合的序列，其分子量為29.9 33.4Kd，等電點(diǎn)為5.22 6.61之間。
AH1具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列；
AH4B具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列；
AH6具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列；
AH19具有SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列；
AH33B具有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列；
AH36具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了上述抗體在制備治療由于可卡因等精神活性物質(zhì)導(dǎo) 致的成癮行為中的應(yīng)用。
本發(fā)明的抗體，體外可有效識(shí)別合成的CART活性片段CART55-102; 腹腔注射抗體后，可顯著抑制可卡因誘導(dǎo)的小鼠自發(fā)活動(dòng)增強(qiáng)，大劑量 (lmg/kg)可完全逆轉(zhuǎn)可卡因誘導(dǎo)的行為敏化；對(duì)正常小鼠的自發(fā)活動(dòng)，在觀察的劑量(0.04 lmg/kg)下無明顯影響。


圖1. GST-CART融合蛋白考馬斯亮藍(lán)染色圖
其中第1泳道為純化的GST-CART55.h)2融合蛋白，第2泳道為純化的
GST蛋白。M為蛋白質(zhì)MARKER，自上而下分別為116KDa， 66KDa， 45KDa， 35KDa， 25KDa。
圖2. Western blotting驗(yàn)證GST-CART特異性圖
其中第1泳道為純化的GST-CART (55-102)融合蛋白，第2泳道為純
化的GST蛋白， 一抗為CART單抗(1:1000)， 二抗為goat anti mouse
IgG-HRP(l:lOOOO),作為免疫原的融合蛋白特異性良好。
圖3. pET28a-CARTscFv模式圖和cDNA及蛋白序列(AH36)
圖4.純化后pET28a-CARTscFv抗體(AH36)考馬斯亮藍(lán)染色圖
其中M為蛋白質(zhì)Maker,自上而下分別為116KDa， 66KDa， 45KDa，
35KDa， 25KDa，第1泳道為純化后單鏈抗體蛋白(AH36)。
圖5.ELISA檢驗(yàn)pET28a-CARTscFv(AH36)抗體滴度
其中橫坐標(biāo)為抗體稀釋度，縱坐標(biāo)為450nm波長(zhǎng)OD值，抗體原液濃
度為200ug/ml。
圖6. pET28a-CARTscFv抗體(AH36)對(duì)正常動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)的影響 其中橫坐標(biāo)為實(shí)驗(yàn)組，分別是完全對(duì)照組，生理鹽水組，0.04mg/kgCART 抗體組和lmg/kgCART抗體組。縱坐標(biāo)為水平運(yùn)動(dòng)距離(mm)， *表示 OD值大于陰性對(duì)照組2.1倍。
圖7.單次給予CART單鏈抗體(AH36)對(duì)可卡因誘導(dǎo)的動(dòng)物行為敏化表達(dá) 的影響
其中縱坐標(biāo)為水平運(yùn)動(dòng)距離(mm)，橫坐標(biāo)為實(shí)驗(yàn)組，分別生理鹽水， 0.04mg/kg抗體，0.2mg/kg抗體，lmg/kg抗體組。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。 實(shí)施例l:
pGEX-4T3—CART55.1Q2 (林琴，可卡因一苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽抗體抑制嗎啡誘導(dǎo)的小鼠條件性位置偏愛的形成和重建，2006，第二軍醫(yī)大學(xué) 碩士論文，pGEX—4T3購(gòu)自amersham phaemacia公司)表達(dá)甘油菌30^1 轉(zhuǎn)接于3ml包含lOO^g/ml的LB培養(yǎng)基中，37"C搖床培養(yǎng)過夜；轉(zhuǎn)接菌 液lml于100ml包含100(ig/ml Amp的LB培養(yǎng)基中，37"搖床培養(yǎng)至 OD600值為0.4時(shí)，加入1M IPTG 400^1使其終濃度為0.4mM， 37°C ， 230r.p.m.搖床誘導(dǎo)表達(dá)5h后，4""C低溫離心機(jī)12， OOOr.p.m.離心20min 收集菌體，以10ml/濕重(g)加入PBS懸浮菌體。將細(xì)菌懸夜置于冰浴 中，IOOW超聲1秒，間歇1秒，超聲20min。4t:低溫離心機(jī)12， OOOr.p.m. 離心20min， GST-CART55.1()2存在于上清中，小心移取上清至一干凈離心 管中備用。徹底懸浮Glutathione-Sepharose 4B beads,移取適量至層析柱 中，先用2倍體積的去離子水洗，再用三倍體積的lxPBS洗。加入含目 的蛋白的上清溶液，并將流速控制在2-10倍柱體積/小時(shí)。當(dāng)含有目的蛋 白質(zhì)的溶液不再流出時(shí)，加入PBS洗滌樹脂，將流速控制于10-20倍柱 體積/小時(shí)，當(dāng)流出液的280nm值接近洗滌液值時(shí)，洗滌完成。加入3-10 倍柱體積的50mMGSH洗脫液洗脫目的蛋白，將流速控制于2-10倍柱體 積/小時(shí)，分步收集流出液，并測(cè)定出目的蛋白所在的收集管。將洗脫下 來的含目的蛋白的溶液在PBS中4"C透析過夜。
純度及特異性良好的GST-CART蛋白(見說明書附圖l， 2)免疫動(dòng) 物，取脾臟細(xì)胞，按O'Brien PM and Aitken R編著《抗體噬菌體展示方 法與操作指南》構(gòu)建建cDNA文庫(kù)，用PCR擴(kuò)增出帶酶切位點(diǎn)的抗體 VH-linker-VL片段，Sfil酶和Notl酶雙酶切PCR產(chǎn)物，膠回收片段，Sfil 酶和Notl酶雙酶切pCANTAB5E (購(gòu)自amersham phaemacia公司)噬菌 體載體，膠回收載體。將膠回收后的抗體片段和pCANTAB5E載體進(jìn)行 粘端連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1型菌株，通過篩選富集，挑取陽(yáng)性克隆 菌株，表達(dá)分泌性抗體，ELISA及Western bloting檢驗(yàn)抗體特異性，識(shí) 別CART，抽提質(zhì)粒，委托生工生物技術(shù)公司測(cè)序。PCR擴(kuò)增加入酶切位 點(diǎn)的抗體基因，Xhol酶和Ncol酶雙酶切PCR產(chǎn)物，XhoI酶和NcoI酶 雙酶切pET28a載體，將膠回收后的抗體片段和pET28a載體進(jìn)行粘端連 接，測(cè)序(見說明書附圖3，為AH36克隆到pET—28aNcoI禾卩Xho I中 的序列)。驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株內(nèi)，運(yùn)用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)單鏈抗體，親和層析柱純化抗體(見說明書附圖4)， ELISA檢驗(yàn)單鏈抗體特異性及 滴度(見說明書附圖5)。
實(shí)施例2: CART單鏈抗體(AH36)對(duì)可卡因引起的藥物依賴的影響
將抗體用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證實(shí)可卡因一苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽抗體減少了機(jī) 體對(duì)可卡因等精神藥物使用而引起的藥物依賴。結(jié)果如下
(一)行為敏化模型
1. 自發(fā)活動(dòng)記錄設(shè)備
本實(shí)驗(yàn)采用的條件位置偏愛穿梭箱黑箱作為自發(fā)活動(dòng)記錄設(shè)備。黑箱 放置于100x100x100的隔音箱內(nèi)，內(nèi)徑為15xl5x35cm，箱底上方5cm處 分別安置有光滑鐵絲網(wǎng)一塊；穿梭門關(guān)閉。觀察箱具有隔光、隔音的效 果，聲強(qiáng)衰減為20-25dB。在箱子的頂部，安裝有白光照明燈和紅外LED， 并有通風(fēng)通道和小風(fēng)扇；裝有1個(gè)微攝像頭，并有DC 12V電源線和A/V 視頻線的接頭；箱底部墊有一塊墊板，可有效防止光線的反射，使成像 清晰。
2. 動(dòng)物模型構(gòu)建
將實(shí)驗(yàn)用小鼠按體重以隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分組。第1到7天上午10: 00-12: OO之間持續(xù)給予可卡因20mg/kg，非飼養(yǎng)環(huán)境中l(wèi)h后放回詞養(yǎng)籠 中，第8到14天撤藥，第15天給予可卡因20mg/kg誘導(dǎo)動(dòng)物行為敏化 的表達(dá)，觀測(cè)其在給可卡因后30分鐘之內(nèi)的水平運(yùn)動(dòng)距離。
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
(1 ) pET28a-CARTscFv抗體(AH36)對(duì)正常動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)無影響。
小鼠腹腔注射pET28A-CARTscFv抗體0.04mg/kg， lmg/kg， 2h后觀. 測(cè)其30分鐘之內(nèi)的水平運(yùn)動(dòng)距離。0.04mg/kg， lmg/kg與生理鹽水對(duì)照 組相比較，小鼠水平活動(dòng)距離沒有明顯差異(P>0.05 )，表明 pET28A-CARTscFv抗體本身沒有影響動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)(見說明書附圖6)。
(2)單次給予pET28a-CARTscFv抗體(AH36)抑制可卡因誘導(dǎo)的動(dòng)物行 為敏化的表達(dá)。
在第15天給予可卡因誘導(dǎo)行為敏化表達(dá)之前2h分別給小鼠腹腔注 射生理鹽水、0.04mg/kgpET28A-CARTscFv抗體、 0.2mg/kgpET28A-CARTscFv抗體、lmg/kgpET28A-CARTscFv抗體。生理鹽水組為連續(xù)7天給小鼠皮下注射可卡因20mg/kg，第15天給 予可卡因20mg/kg誘導(dǎo)前2h給小鼠腹腔注射生理鹽水10ml/kg， 0.04mg/kg 抗體組為連續(xù)7天給小鼠皮下注射可卡因20mg/kg,第15天給予可卡因 20mg/kg誘導(dǎo)前2h給小鼠腹腔注射PET28A-CARTSCFV抗體0.04mg/kg， 0.2mg/kg抗體組為連續(xù)7天給小鼠皮下注射可卡因20mg/kg，第15天給 予可卡因20mg/kg誘導(dǎo)前2h給小鼠腹腔注射pET28a-CARTscFv抗體 0.2mg/kg， lmg/kg抗體組為連續(xù)7天給小鼠皮下注射可卡因20mg/kg， 第15天給予可卡因20mg/kg誘導(dǎo)前2h給小鼠腹腔注射pET28a-CARTscFv 抗體lmg/kg。 *P<0.05 ， **P<0.01與生理鹽水組比較有顯著性差異。
結(jié)果表明三個(gè)劑量的pET28A-CARTscFv抗體均能抑制可卡因引起 的行為敏化的表達(dá)(見說明書附圖7)。
AH1， AH4B， AH6， AH19,AH33B與AH36—樣可有效與CART55—SEQUENCE LISTING
〈110〉中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
〈120〉可卡因一苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽單鏈抗體及其應(yīng)用
<130〉說明書，權(quán)利要求書
〈160〉 6
〈170> Patentln version 3.1
〈210> 1
<211〉 311
<212> PRT
〈213〉人工序列
〈400〉 1
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 15 10 15
Ala Gin Pro Ala Met Ala Met Ala Glu Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly 20 25 30
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 35 40 45
Thr Gly Asn Ser lie Thr Ser Asp Tyr Ala Trp His Trp lie Arg Gin 50 55 60
Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr lie Thr Tyr Asp Gly 65 70 75 80
Ser Asn Lys Ser His Pro Ser Leu Lys Asn Arg lie Ser lie Thr Arg 85 90 95
Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr 100 105 110,
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Gly Arg Ala lie 115 120 125Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Val Leu 145 150 155 160
Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr 165 170 175
lie Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr 180 185 190
Met His Trp Tyr His Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie 195 200 205
Tyr Leu Ala Ser Asp Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 210 215 220
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu 225 230 235 240
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Ser Cys Gin His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr 245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Ala Ala Ala Gly Ala 260 265 270
Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu Glu lie 275 280 285
Lys Arg Ala Ser Gin Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Val 290 295 300
Glu His His His His His His 305 310〈210> 2 〈211〉 293 <212> PRT <213>人工序列 〈400〉 2
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 15 10 15
Ala Gin Pro Ala Met Ala Met Ala Glu Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly 20 25 30
Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala 35 40 45
Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg 50 55 60
Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Met lie Asp Pro Ala Asn Asp 65 70 75 80
Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gin Gly Lys Ala Thr lie Thr Ala 85 90 95
Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Phe Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser 100 105 110
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg Phe Leu Arg Tyr Gly 115 120 125
Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 145 150 155 160lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin 165 170 175
Arg Ala Thr lie Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly 180 185 190
Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys 195 200 205
Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg 210 215 220
Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asp Pro 225 230 235 240
Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His lie Arg Glu 245 250 255
Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Asp Trp Lys Leu Glu lie Lys Arg 260 265 270
Ala Ser Gin Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Val Glu His 275 280 285
His His His His His 290
〈210〉 3 〈211〉 312 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400〉 3
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 15 10 15Ala Gin Pro Ala Met Ala Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu 20 25 30
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly 35 40 45
Phe Asn lie Lys Asp Thr Tyr lie His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu 50 55 60
Gin Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met lie Asp Pro Thr Asp Gly His Thr 65 70 75 80
Lys Ser Asp Pro Lys Phe Gin Gly Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr 85 90 95
Ser Ser Asn Asn Ala Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 100 105 110
Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gly Asp Arg Tyr Gly Tyr Gly 115 120 125
Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Val 145 150 155 160
Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala 165 170 175
Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser 180 185 190
Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu 195 200 205lie Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His Pro Val Glu 225 230 235 240
Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Arg Glu Leu Pro 245 250 255
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Ala Ala Ala Gly 260 265 270
Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu Glu 275 280 285
lie Lys Arg Ala Ser Gin Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 290 295 300
Val Glu His His His His His His 305 310
〈210〉 4
〈211〉 277
〈212〉 PRT 〈213〉人工序列
<400> 4
Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 1 5 10 15
Pro Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys 20 25 30
Ser Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Asp Pro Phe Asn Gly Gly Thr Arg 35 40 45Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser 50 55 60
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 65 70 75 80
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asn Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 85 90 95
Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Val Met Thr Gin 115 120 125
Ser Leu Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser 130 135 140
Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 145 150 155 160
Trp Asn Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Leu 165 170 175
Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 180 185 190
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu Glu Asp 195 200 205
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Trp Glu lie Pro Tyr Thr Phe 210 215 220
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val 225 230 235 240Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu Glu lie Lys Arg 245 250 255
Ala Ser Gin Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Val Glu His 260 265 270
His His His His His 275
〈210〉 5 〈211〉 310 〈212〉 PRT 〈213>人工序列 〈400> 5
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 15 10 15
Ala Gin Pro Ala Met Ala Met Ala Glu Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly 20 25 30
Thr Val Leu Thr Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala 35 40 45
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Leu Met Asn Trp Val Lys Gin Arg 50 55 60
Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Arg lie Asp Pro Ala Asn Gly 65 70 75 80
Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gin Gly Lys Ala Thr lie Thr Ala 85 90 95
Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser 100 105 110Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Arg Gly 115 120 125
Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160
Gin lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Leu Gly 165 170 175
Glu Glu lie Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu 180 185 190
His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Glu Ser Ser Pro Lys Pro Trp lie Tyr 195 200 205
Ala Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 210 215 220
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Met Glu Gly Glu 225 230 235 240
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Phe Thr Thr Ser Pro Tyr Thr 245 250 255
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys Ala Ala Ala Gly Ala Pro 260 265 270
Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu Glu lie Lys 275 280 285
Arg Ala Ser Gin Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Val Glu 290 295 300His His His His His His 305 310
〈210> 6 <211〉 308 <212> PRT 〈213〉 人工序列 〈400〉 6
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 15 10 15
Ala Gin Pro Ala Met Ala Met Ala Glu Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly 20 25 30
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val 35 40 45
Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin 50 55 60
Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr lie Ser Tyr Asp Gly 65 70 75 80
Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg lie Ser lie Thr Arg 85 90 95
Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr 100 105 110
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Leu Thr Gly Tyr Trp Tyr 115 120 125
Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 130 135 140Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Val 145 150 155 160
Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val 165 170 175
Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Gly Ser Ser Leu Asn Trp 180 185 190
Leu Gin Gin Glu Pro Asp Gly Thr lie Lys Arg Leu lie Tyr Ala Thr 195 200 205
Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser 210 215 220
Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe 225 230 235 240
Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr Thr Phe Gly 245 250 255
Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro 260 265 270
Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu Glu lie Lys Arg Ala 275 280 285
Ser Gin Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Val Glu His His 290 295 300
His His His His 30權(quán)利要求
1. 一類可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽單鏈抗體，具有SEQ ID NO1-6所示的任一氨基酸序列。
2、權(quán)利要求1所述的抗體在制備治療由于精神活性物質(zhì)導(dǎo)致的成癮行為 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一類新型的抗體，用于治療由于可卡因等精神活性物質(zhì)(包括阿片類、可卡因、苯丙胺和氯胺酮等)導(dǎo)致的成癮行為。通過噬菌體展示技術(shù)篩選可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽抗體基因，然后將可卡因—苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(CART)單鏈抗體序列與原核表達(dá)載體相連，誘導(dǎo)表達(dá)及純化獲得針對(duì)CART抗體的單鏈抗體，命名為CARTscFv(AH1，AH4B，AH6，AH19，AH33B，AH36)。小鼠腹腔注射CARTscFv后，其中和外周循環(huán)系統(tǒng)中CART，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)CART降低。可卡因誘導(dǎo)的行為敏化動(dòng)物模型證實(shí)，本發(fā)明的CART單鏈抗體可以抑制可卡因誘導(dǎo)的小鼠行為敏化的表達(dá)。表明CART單鏈抗體具有治療精神活性物質(zhì)所引起成癮、特別是復(fù)吸的巨大潛力。
文檔編號(hào)A61P25/30GK101280016SQ200810038100
公開日2008年10月8日 申請(qǐng)日期2008年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者柴景蕊, 由振東, 路長(zhǎng)林 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)