專利名稱：：一種治療骨科疾病的原料藥及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種治療骨科疾病的原料藥，同時本發(fā)明還涉及一種治療骨科疾病的原料藥的制備方法。
背景技術(shù)：
：續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dz;p犯citfoyj^wYfe.Y.ChengetT.M.Ai的干燥根。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，記載其"味苦，微溫，主傷寒，補不足，金瘡，癰瘍，折跌，續(xù)筋骨，婦人乳難。久服，益氣力。一名龍豆，一名屬折。"李時珍謂"續(xù)斷、屬折、接骨，皆以功命名也。"從其命名可見續(xù)斷自古就為骨傷科要藥。今藥典記載"味苦、辛，微溫。歸肝、腎經(jīng)。補肝腎，強筋骨，續(xù)折傷，止崩漏。用于腰膝酸軟，風濕痹痛，崩漏，胎漏，跌撲損傷。酒續(xù)斷多用于風濕痹痛，跌撲損傷"。足見續(xù)斷自古為骨科疾病的有效治療藥物。近代研究表明續(xù)斷中主要化學成分有皂苷類、環(huán)烯醚萜類、生物堿、揮發(fā)油等成分。本發(fā)明人對湖北或四川產(chǎn)的多批續(xù)斷進量總皂苷的測定含量可達10.0%~16.0%，其中以川續(xù)斷皂苷VI含量為主，2005年版中國藥典規(guī)定川續(xù)斷藥材中川續(xù)斷皂苷VI含量不少于2.0%。川續(xù)斷皂苷VI又稱木通皂苷D，不僅存在于續(xù)斷藥材中，木通、預(yù)知子、山銀花中也存在，其中木通中含量也較高。至今雖從續(xù)斷藥材中分得20多種皂苷成分，但未見適用于工業(yè)化生產(chǎn)的高純度川續(xù)斷皂苷VI的制備方法報道，也未有人對高純度川續(xù)斷皂苷VI在骨科疾病應(yīng)用方面報道。續(xù)斷藥材在傳統(tǒng)醫(yī)學中常用于腰膝酸痛、風濕痹痛、跌打損傷及安胎，現(xiàn)代藥理學研究表明續(xù)斷有促進骨損傷愈合、抗骨質(zhì)疏松、抗衰老、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用。川續(xù)斷皂苷VI作為續(xù)斷藥才中有效成分的代表成分之一，通過適宜的工藝制備高純度的川續(xù)斷皂苷VI，達至國際一類新藥的要求，將有望成為一個國內(nèi)外創(chuàng)新藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種治療骨科疾病的原料藥一一川續(xù)斷皂苷VI。本發(fā)明的另一目的是提供一種環(huán)保安全、提取率高、可用于工業(yè)化生產(chǎn)的川續(xù)斷皂苷VI的制備方法。治療骨科疾病的原料藥川續(xù)斷皂苷VI是由續(xù)斷或其它含川續(xù)斷皂苷VI的藥材提取制備而得，其的重量百分數(shù)占提取物總量的95.0%99.9%。本發(fā)明提供了一種治療骨科疾病的原料藥，該原料藥為川續(xù)斷皂苷VI，由含川續(xù)斷皂苷VI的中藥材提取制備而得，川續(xù)斷皂苷VI的重量百分數(shù)含量占川續(xù)斷皂苷VI提取物總量的95.099.9%，其化學名稱為3-0-a-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元-28-0-P-D-吡喃葡萄糖(1-6)-P-D-吡喃葡萄糖苷，化學結(jié)構(gòu)式為本發(fā)明所述的骨科疾病是指骨質(zhì)疏松、骨折、骨性關(guān)節(jié)炎或骨質(zhì)增生。本發(fā)明所述的含川續(xù)斷皂苷VI的中藥材是指續(xù)斷、木通或預(yù)知子。本發(fā)明所述的原料藥可與藥學上可接受的輔料混合制成固體制劑或液體制劑，其中所述的固體制劑為片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸、貼劑或注射用凍干粉，所述的液體制劑為口服液、軟膠囊、膏劑或注射液。本發(fā)明還提供了一種從中藥材中提取川續(xù)斷皂苷VI的有效方法，提取所得樣品中川續(xù)斷皂苷VI重量百分含量高達95.099.9%，本純度在本
技術(shù)領(lǐng)域：
屬很高范圍。該提取方法包括下列步驟1)提取、濃縮取含川續(xù)斷皂苷VI的中藥材，用低級醇或含水的低級醇提取，濾過，得提取液A;將所得提取液A減壓回收醇，濃縮至相對密度為1.201.40，得濃縮液B;2)濃縮液處理將濃縮液B加水稀釋成每毫升含0.31.5g生藥材的溶液，加堿調(diào)節(jié)pH值到7.010.0，靜置436小時，濾過或離心，分取上清液，得溶液C;3)分離總皂苷將溶液C上樣于裝有大孔樹脂的層析柱上，循環(huán)吸附23次，用23倍量柱體積的0.55.0%的堿液洗脫后用水洗至近中性，再用24倍量柱體積的1040%乙醇洗脫，棄去洗脫液;最后用48倍量柱體積的50-95%乙醇洗脫，收集洗脫液，得總皂苷提取液D;4)脫色將總皂提取液D過氧化鋁或脫色樹脂柱或采用活性碳進行脫色；將脫色后的總皂苷提取液減壓回收醇，濃縮，干燥，得川續(xù)斷皂苷VI粗品；5)純化、精制川續(xù)斷皂苷VI:將川續(xù)斷皂苷VI粗品用水或含水的低級醇制成溶液，進一步采用柱層析分離純化或采用不同極性溶劑分級萃取純化精制即得川續(xù)斷皂苷VI。上述制備方法中，所述的步驟l)和步驟5)中低級醇的碳數(shù)為C1C5，濃度為X,0%<X5100%，本發(fā)明優(yōu)選乙醇和正丁醇；所述的步驟1)中的提取方法為煎煮法、加熱回流法、浸出法或滲漉法；所述的步驟2)和步驟3)中的堿液是NaOH、KOH、Ca(OH)2、K2C03、Na2C03、NaHC03、氨水和三乙胺中的一種或幾種的混合物；所述的步驟3)中分離總皂苷所用的大孔樹脂是SA-1、SA-2、ADS-5、ADS-7、ADS-8、AB-8和D201中的一種或兩種，本發(fā)明優(yōu)選SA-2、SA-2和ADS-5;所述的步驟5)中的純化精制方法可采用下列方法之一或混合使用1)將川續(xù)斷皂苷VI粗品用洗脫液溶解，離心或微濾后上樣于葡聚糖凝膠柱層析分離，洗脫液為5~80%醇，采用部分收集器收集，將主含川續(xù)斷皂苷VI流分收集，合并，減壓回收醇，濃縮干燥，即得精制川續(xù)斷皂苷VI;2)將川續(xù)斷皂苷VI粗品用洗脫液溶解，離心或微濾后上樣于反相柱層析分離，洗脫液為20~90%醇，采用部分收集器收集，將主含川續(xù)斷皂苷VI流分收集，合并，減壓回收醇，濃縮干燥，即得精制川續(xù)斷皂苷VI;3)將川續(xù)斷皂苷Vl粗品用水制成每毫升含50300mg粗品的溶液，用堿調(diào)PH值至8.011.0，先用含醇的乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲垸萃取數(shù)次；再用正丁醇或水飽合正丁醇萃取數(shù)次，合并正丁醇萃取液；再用水反洗正丁醇萃取液24次；減壓回收正丁醇至原體積的1/51/3后放置1248小時，去除沉淀，繼續(xù)濃度縮，干燥，即得川續(xù)斷皂苷VI，如純度低于95%,采用含水的碳數(shù)為C1C4的低級醇或混合有機溶劑進行重結(jié)晶，即得精制川續(xù)斷皂苷VI。本發(fā)明研究得出總皂苷的制備過程中的步聚1)采用正丁醇或水飽合正丁醇提取，采用水或正丁醇飽合水反洗正醇提取液，濃縮正丁醇提取液至近干，加水溶解制成每毫升相當于0.31.5g的藥材溶液，去除不溶tf，再上樣于SA-l或ADS-2大孔樹脂，進行總皂苷分離，所得總皂苷中川續(xù)斷皂苷VI含量可達85.0%95%。由于從中藥或天然藥物中提取單一有效成分目前技術(shù)難度尚很大，故《藥品注冊管理辦法》規(guī)定從中藥或天然藥物中提取單一成分純度大于90%即可申報中藥一類新藥。本發(fā)明的制備方法在第四步就可達到一類藥的要求，但為提高藥品質(zhì)量控制，保持臨床用藥的安全性和有效性，非常有必要進一步提高原料藥的純度，故本發(fā)明的制備方法增加步聚5)純化精制川續(xù)斷皂苷VI，目的是獲得純度達98%以上的川續(xù)斷皂苷VI。本發(fā)明采用質(zhì)譜技術(shù)和核磁共振技術(shù)，對所得原料藥川續(xù)斷皂苷VI進行結(jié)構(gòu)確證，結(jié)果表明本品為白色粉末,ESIMSm/z927.5[M-H]—.!H-NMR(C5D5N)S:6.25(1H,d,J=8.2Hz,Glcl-H),5.42(1H，brs,H-12)，5.03(1H,d,J=7.7Hz,Glc2-H),4.97(1H，d,J=7.2Hz,Ara-H),3.18(1H,dd,J=4.0,13.8Hz,H-3),U7(3H,s,CH3),1.12(3H,s,CH3),0.98(3H,s,CH3),0.93(3H,s,CH3),0.87(3H,s,CH3),0.86(3H,s,CH3)。13C-NMR(CsD5N)見下表I。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的AsperosaponinVI(川續(xù)斷皂苷VI)圖譜數(shù)據(jù)一致(馬雙成，陳德昌，趙海杰.蕷知子化學成分研究(III)，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1998，10(3):49-51)。表IAsperosaponinVI和文獻報道的13C-NMR數(shù)據(jù)(C5D5N，S)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>ASP-VI對大鼠慢性增生性炎癥明顯有抑制作用，作用強于陽性對照藥。(3)采用大鼠去除卵巢復(fù)制雌激素缺乏型骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨節(jié)模型，經(jīng)8周的治療后ASP-VI270mg/kg和XDS300mg/kg組可明顯改善卵巢摘除大鼠的全身骨密度和股骨硬度，表明ASP-VI和XDS對雌激素缺乏型骨質(zhì)疏松有明顯治療作用。骨質(zhì)疏松大鼠右側(cè)股骨骨折模型組大鼠的骨密度較未骨折骨質(zhì)疏松模型組大鼠的股骨骨密度均明顯要低，經(jīng)治療8周后治療組骨質(zhì)疏松骨折大鼠股骨骨密度均有增加，其中ASP-VI270mg/kg、90mg/kg劑量組和XDS300mg/kg組骨折骨股骨密度明顯高于模型組。骨質(zhì)疏松骨折大鼠的進行測定，結(jié)果表明骨折大鼠骨痂鈣、磷含量均明顯低于假手術(shù)組，經(jīng)8周治療后，ASP-VI270mg/kg、90mg/kg劑量組，XDS目300mg/kg、100mg/kg劑量組骨痂鈣明顯增加；ASP-VI和XDS高劑量組骨痂磷含量均顯著升高，但ASP-VI作用強于XDS。上述實驗結(jié)果充分顯示本發(fā)明藥物對骨質(zhì)疏松、骨折均有明顯治療作用，對骨科疾病中骨折、骨性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生等引起的疼痛、炎癥臨床癥狀有明顯治療作用。實驗結(jié)果提示ASP-VI不但可提高骨質(zhì)松大鼠的全身骨密度，對骨折處的骨密度和骨痂鈣、磷含量均有提高作用，且ASP-VI作用明顯強于XDS，提示APS-VI是續(xù)斷皂苷的主要有效成分，純度增加療效也增加。可見本發(fā)明原料藥可應(yīng)用于制備骨質(zhì)疏松、骨性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生和骨折性疾病的治療藥物。圖1為AsperosaponinVIESI(Neg)質(zhì)譜圖2為AsperosaponinVI1H-NMR譜圖3為AsperosaponinVI1H-NMR譜(放大譜)圖4為AsperosaponinVI1H-NMR譜(放大譜)圖5為AsperosaponinVI13C-NMR譜圖6為AsperosaponinVI13C-NMR譜(放大譜)圖7為AsperosaponinVI13C-NMR譜(放大譜)圖8為AsperosaponinVIDEPT譜圖9為AsperosaponinVIDEPT譜(放大譜)圖IO為純化后樣品純度檢測液相圖譜具體實施方式以下列舉具體實施例及藥效學試驗對本發(fā)明進行說明。實施例只用于對本發(fā)明作進一步說明，不代表本發(fā)明的保護范圍，其他人根據(jù)本發(fā)明做出的非本質(zhì)的修改和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例1取續(xù)斷1公斤，用8L70%乙醇提取2次，每次回流2小時，合并提取液，減壓濃縮，回收乙醇至無醇味，加水稀釋成每毫升含1.0g藥材液體，用5%氫氧化鈣混懸液調(diào)pH至89，靜置12小時，取上清液，過濾，得濾液。將濾液加入l.OkgSA-2大孔樹脂的層析柱上，循環(huán)吸附2次后，用3L的1.0。/。KOH洗脫，再用水沖洗至近中性后改用3130%乙醇洗脫，棄去前兩次洗脫液;最后用7L60%乙醇沖洗，收集洗脫液，用0.5%活性碳脫色，過濾，減壓回收乙醇，濃縮、干燥，得淺黃色川續(xù)斷皂苷VI粗品80.9克。將川續(xù)斷皂苷VI粗品加水配制成800ml的溶液，用5%KOH調(diào)pH值至9.010.0，先用等體積含5%乙醇的乙酸乙酯萃取3次；再用等體積水飽合正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取液。再用正丁醇飽合水反洗正丁醇萃取液3次后，加0.5。/。活性碳6(TC保溫4小時脫色，過濾，濾液減壓回收正丁醇到2400ml，靜置過夜，取上清液繼續(xù)濃縮，干燥，即得川續(xù)斷皂苷￥128.38，純度96.8%。實施例2取續(xù)斷1公斤，粉碎，用6L水飽合正丁醇浸泡過夜后開始滲漉，收集正丁醇，用等體積正丁醇飽水萃取3次，減壓回收正丁醇至近干，加水稀釋成每毫升含0.8g藥材液體，靜置12小時，過濾，取濾液，將濾液加入1.5kgADS-5大孔樹脂的層析柱上，循環(huán)吸附3次后，用3L的0.5。/。NaOH洗脫，再用水沖洗至近中性后改用3L30。/。乙醇洗脫，棄去前兩次洗脫液，最后用5L70。/。乙醇沖洗，收集70%乙醇洗脫液，過D208脫色樹脂進行脫色后，減壓回收乙醇，濃縮、干燥，得淡黃色川續(xù)斷皂苷VI粗品52.6克。將200g反相柱ODS柱填料(Grace,50nm)用甲醇浸泡過夜后，裝柱(5.0cm(i.d.)x80cm)，待柱床穩(wěn)定后，將柱內(nèi)的溶劑系統(tǒng)換成50%甲醇，再將溶劑放干至填料層，備用。稱取川續(xù)斷皂苷VI粗品5g溶于約20ml的50M甲醇中，用吸管將樣品液沿柱壁緩緩加于填料層之上，打開柱塞，待樣品液滲入柱床后，依次用2000ml50。/o甲醇，2000ml70yo甲醇洗脫，每100ml為一餾分，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收至干后，再用甲醇溶解轉(zhuǎn)移出來。用TLC檢測樣品純度，并進行合并，共得到HPLC檢測純度為99.2%的樣品川續(xù)斷皂苷VI2.4725g。實施例3取續(xù)斷1公斤，粉碎，用1倍量80%乙醇潤濕，用6L80。/。乙醇浸泡15小時后開始滲漉，5ml/min，收集滲漉液，減壓濃縮，回收乙醇至無醇味后，加水到3000ml，靜置4小時，過濾，取濾液，將濾液加入L2kgADS-8大孔樹脂的層析柱上，循環(huán)吸附3次后，用4L的水洗脫，再用4L30。/。乙醇洗脫，棄去洗脫液，棄去前兩次洗脫液，再用4L90%乙醇沖洗，收集90%乙醇洗脫液，90%乙醇洗脫液過酸性氧化鋁柱脫色(6.0cmX8.0cm)，減壓回收乙醇，濃縮、真空干燥，得微黃色川續(xù)斷皂苷VI粗品51.3克。取上述所得川續(xù)斷皂苷VI粗品8g用60ml65。/。乙醇溶解，過0.45ixm的微孔濾膜，上樣于葡聚糖凝膠LH-20柱(直徑8cm,長120cm)層析分離。洗脫液為65%乙醇，流速0.5cm/h，采用部分收集器收集，將含川續(xù)斷皂苷VI流分收集。每100ml為一餾分，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收至干后，再用乙醇溶解轉(zhuǎn)移出來，用TLC檢測樣品純度，并進行合并，減壓回收乙醇，濃縮，低溫干燥，即得5.2177§白色川續(xù)斷皂苷VI粉未，純度98.7%。實施例4取木通1公斤，加10L乙醇浸泡12小時后開始滲漉，收集滲漉液，減壓濃縮，回收乙醇至無醇味，加水稀釋成每毫升含1.0g藥材液體，靜置24小時，過濾，將濾液加入1.2kgAB-8大孔樹脂的層析柱上，循環(huán)吸附3次后，用4L的5.(P/。Na2C03洗脫，再用純化水沖洗至中性再用3L20。/。乙醇沖洗，棄去洗脫液，再用4L卯％乙醇沖洗，收集90%乙醇洗脫液，加0.3%活性碳6(TC保溫30min脫色，過濾，減壓回收乙醇，濃縮、干燥，得川續(xù)斷皂苷VI粗品69.4克。取上述所得川續(xù)斷皂苷VI粗品10g用50ml50%乙醇溶解成每毫升含皂苷200mg,離心或微濾后上樣于葡聚糖凝膠LH-20柱(直徑8cm,長120cm)層析分離。洗脫液為50%乙醇，流速0.6cm/h,采用部分收集器收集，將主含川續(xù)斷皂苷VI流分收集。每100ml為一餾分，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收至干后，再用乙醇溶解轉(zhuǎn)移出來，用TLC檢測樣品純度，并進行合并，減壓回收乙醇，濃縮，低溫干燥，即得6.7716g木通皂苷D(川續(xù)斷皂苷VI)，純度98.7%。實施例5取預(yù)知子l公斤，粉碎，用水2倍量水潤濕，用6L水飽合正丁醇浸泡過液后開始滲漉，減壓濃縮，回收正丁醇至相對密度為1.20(5(TC)，加水稀釋成每毫升含l.Og藥材液體，用5%Ca(OH)2調(diào)pH值到8.0~9.0，靜置6小時，過濾，取濾液，將濾液加入1.0kgASD-5大孔樹脂的層析柱上，循環(huán)吸附3次后，用2L0.8%KaOH洗脫，再用水洗脫至近中性，改用4L30%乙醇洗脫，棄去洗脫液，最后用6L80。/。乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液，過酸性氧化鋁柱脫色后，減壓回收乙醇，濃縮、干燥，得川續(xù)斷皂苷VI粗品56.3克。將200g反相柱ODS柱填料(Grace,5(Vm)用甲醇浸泡過夜后，裝柱(5.0cm(i.d.)x80cm)，待柱床穩(wěn)定后，將柱內(nèi)的溶劑系統(tǒng)換成60%甲醇，再將溶劑放干至填料層，備用。稱取川續(xù)斷皂苷VI粗品5g溶于約20ml的60n/。甲醇中，用吸'管將樣品液沿柱壁緩緩加于填料層之上，打開柱塞，待樣品液滲入柱床后，依次用2000ml60。/。甲醇，2000ml75。/o甲醇洗脫，每100ml為一餾分，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收至干后，再用甲醇溶解轉(zhuǎn)移出來。用TLC檢測樣品純度，并進行合并，得川續(xù)斷皂苷VI1.6987g，純度為97.4%。實施例6按1000個制劑單位投料計,取續(xù)斷皂苷VI100g，葡萄糖120g，甘露醇220g，亞硫酸氫鈉10g，共制成1000瓶注射用凍干粉，規(guī)格:每瓶含續(xù)斷皂苷VI100mg。稱取處方量的續(xù)斷總皂苷、葡萄糖、甘露醇、亞硫酸氫鈉，加注射用水5000ml，5(TC攪拌溶解；加入0.2%注射用活性碳，5(TC保溫攪拌約30分鐘；砂芯漏斗過濾；加注射用水至6000ml;以0.22um濾膜過濾；測定中間體含量、灌裝；冷凍干燥；蓋膠塞、軋蓋，得注射用續(xù)斷總皂苷凍干粉926瓶，每瓶含皂苷VI98.2mg。實施例7按1000個制劑單位投料計，取續(xù)斷皂苷VI250g，羥丙甲基纖維素100g，微晶纖維素30g，乳糖60g，微粉硅膠5g，共制成1000片，規(guī)格每片含續(xù)斷皂苷VI250mg。上述原輔料分別事先過100目篩，按處方量稱取續(xù)斷總皂苷、羥丙甲基纖維素、微晶纖維素、乳糖，混合均勻，用80%藥用乙醇制軟材，過24目篩制粒，6(TC條件下干燥4小時，20目篩整粒，加入微粉硅膠，壓片，即得。實施例8按1000個制劑單位投料計，取續(xù)斷皂苷VI300g,淀粉80g，羧甲基淀粉鈉8g，硬脂酸鎂5g，共制成1000粒膠囊，規(guī)格每粒含續(xù)斷皂苷VI300mg。上述原輔料分別事先過80目篩，按處方量稱取續(xù)斷皂苷VI、淀粉，羧甲基淀粉鈉，混合均勻，用60%藥用乙醇制軟材，過24目篩制粒，6(TC條件下干燥4小時，20目篩整粒，加入硬脂酸鎂，填充膠囊，得續(xù)斷皂苷VI膠囊952粒。實施例9按1000個制劑單位投料計，取續(xù)斷皂苷VI50g，聚乙二醇4000100g，聚乙二醇600030g，共制成1000粒滴丸，規(guī)格每粒含續(xù)斷皂苷VI50mg。稱取處方量續(xù)斷皂苷VI加入60ml80%乙醇，在60。C水浴中攪拌至融溶狀態(tài)，另取處方量的聚乙二醇4000和聚乙二醇6000在水浴中溶融，分次加入續(xù)斷皂苷VI乙醇液，混勻，溶融后，快速移至預(yù)熱至恒溫滴丸設(shè)備貯液瓶中，滴制，得續(xù)斷皂苷VI滴丸910粒。川續(xù)斷皂苷VI化學結(jié)構(gòu)式確證白色粉末，ESIMSm/z927.5[M-H]-.^-NMR(C5D5N)S:6.25(1H,d,J=8.2Hz,Glcl-H),5.42(1H，brs,H-12),5.03(1H，d,J=7.7Hz,Glc2-H),4.97(1H，d,J=7.2Hz,Ara-H),3.18(1H，dd,J=4.0,13.8Hz,H-3),L17(3H，s,CH3),L12(3H,s,CH3)，0.98(3H,s,CH3),0.93(3H,s,CH3),0.87(3H,s,CH3),O.即H,s,CH3)。13C-NMR(C5D5N)見下表n。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的AsperosaponinVI圖譜數(shù)據(jù)一致(馬雙成，陳德昌，趙海杰.蕷知子化學成分研究(III)，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1998，10(3):49-51)。各圖譜見附圖110。其化學結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>AsperosaponinVI(C47H76018,MW=928)表IIAsperosaponinVI和文獻報道的13C-NMR數(shù)據(jù)(C5DsN，S)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>藥效學試驗一、試驗材料1、受試藥與對照藥川續(xù)斷皂苷VI(AsperosaponinVI，ASP-VI)，由自制,批號071012，純度99.2%，續(xù)斷總皂苷(XDS)，批號070821，總皂苷含量84.5%(其中含ASP-VI67.6%)。對乙酰氨基酚，廣東環(huán)球制藥有限公司生產(chǎn)，批號080102;仙靈骨保膠囊，貴州同濟堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號070306。用前以純化水配成所需濃度的溶液或混懸液。3、試劑與儀器甲醛溶液，廣州化學試劑廠生產(chǎn)，批號20060704-11;丙酮，洛陽市化學試劑廠，批號060413;鹽酸，廣州東紅化工廠，批號070703913;氫氧化鈉，天津大茂化學試劑廠，批號20070822。RB100熱板儀，成都泰盟儀器科技有限公司生產(chǎn)；BS-124S電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司生產(chǎn)；DPX-L型雙能X線骨密度檢定儀，LunarCo.U.S.A;INSTRON-1122型萬能材料試驗機，英國；游標卡尺(中國金華)；80-1型離心沉淀機(中國上海)；UV1201紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)。3、動物昆明小鼠，合格證(粵監(jiān)證字)第2006A063號；SD大白鼠，合格證(粵監(jiān)證字)第2006A064號均由中山大學實驗動物中心提供。二、統(tǒng)計處理采用SPSS統(tǒng)計軟件進行組間方差分析或給藥前后自身比較的t檢驗。三、試驗方法及結(jié)果1、ASP-VI抗炎鎮(zhèn)痛作用研究1.1ASP-VI對熱致痛的影響采用熱板法試驗，以小鼠舔后足作為疼痛表現(xiàn)，預(yù)先測定痛閾，取痛閾為1030s的小鼠參加實驗。取合格雌性昆明小鼠50只，隨機分為5組，每組IO只。分別為陰性對照組(給等容積純化水)、300mg/kg對乙酰氨基酚組，ASP-VI75mg/kg、150mg/kg、300mg/kg三個劑量組。各組皆灌胃給藥1次，0.2ml/10g。給藥前及給藥后l小時分別測定小鼠痛閾，如痛閾大于60s，以60s計算。結(jié)果見表1。表lASP-VI對小鼠痛閾的影響(I土s,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注與陰對照組比較，*P<0.05，**P<0.01由表l可見，ASP-VI可不同程度提高小鼠痛閾，中、高劑量組有顯著性差異(PO.01或P0.05)，提示ASP-VI對小鼠熱剌激引起的疼痛有鎮(zhèn)痛作用。其鎮(zhèn)痛作用同陽性對照藥對乙酰氨基酚無明顯差異，且呈劑量相關(guān)性。1.2對福爾馬林至痛和炎癥的影響將60只雄性小鼠隨機分為五組，即陰性對照組(給等容積純化水)、對乙酰氨基酚組、XDS組、ASP-VI低、中、高劑量組。正常飼養(yǎng)一天后禁食給水12h后每組灌胃給藥0.2ml/10g。給藥lh后，于小鼠左后肢足跖部皮下注射1%福爾馬林溶液20ul，并計時，立即置于直徑20cm的玻璃容器中，分別記錄注射甲醛溶液后0~5min(I相)和2030min(II相)內(nèi)小鼠疼痛反應(yīng)的累計時間，進行評分。評分方法舔、咬或抖足3分，提足2分，跛行1分，走動自如0分。分別得出各組大鼠I相和II相的累計分值。累積分值二(0tl+lt2+2t3+3t4)/(tl+t2+t3+t4)[tl、t2、t3、t4分別為0、1、2、3分的持續(xù)時間(s)]。結(jié)果見表2。表2ASP-VI對小鼠福爾馬林致痛的影響(I土s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注與陰對照組比較，*P<0.05，**P<0.01由表2可見數(shù)據(jù)可以看出，ASP-VI的高、中、低劑量對降低II相反應(yīng)疼痛積分有一定的作用，其中與對照組相比均有顯著差異，作用效果強于陽性對照藥。陽性藥物與ASP-VI對I相反應(yīng)均無明顯作用。1.3對大鼠慢性炎癥的影響大鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只。分別為陰性對照組(給等容積純化水)、對乙酰氨基酚180mg/kg組，ASP-VI45mg/kg、90mg/kg、180mg/kg三個劑量組。在乙醚淺麻下，剪毛消毒，于下腹部正中切開皮膚，將重50mg的滅菌棉球植入兩側(cè)腹股溝皮下，然后縫合皮膚，消毒，整個過程為無菌操作。從手術(shù)前3天開始灌胃給藥，1.0ml/100g，每天1次，連續(xù)10天。第11天處死大鼠，小心剝離取出棉球及包裹的肉芽組織，6(TC干燥12小時后稱重，減去原棉球重量即為肉芽組織重量,結(jié)果以每100g體重所含肉芽組織重量(雙側(cè))表示。結(jié)果見表3。表3ASP-VI對大鼠慢性增生性炎癥的影響(7±s,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注與陰對照組比較，*P<0.05，**P<0.01由表3可見，ASP-VI抑制棉球刺激的大鼠肉芽組織增生，與陰性對照組比較，ASP-VI高、中劑量組與陽性對照組均有顯著性差異(P<0.01)，提示ASP-VI對大鼠慢性增生性炎癥明顯有抑制作用，作用強于陽性對照藥。2ASP-VI對骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合的影響2.1實驗方法模型復(fù)制實驗動物選用3月齡SD雌性大鼠60只，骨質(zhì)疏松模型復(fù)制參照文獻法(趙詠芳，沈培芝，徐宇等.仙靈骨葆膠囊對去卵巢致骨質(zhì)疏松骨量的影響，中醫(yī)正骨，2000;12(5):1112。陳奇主編.中藥藥效研究思路與方法.北京人民衛(wèi)生出版社，2005:957)，3%戊巴比妥腹腔麻醉，無菌條件下取腰椎兩旁切口進入腹腔背側(cè)，完整摘除雙側(cè)卵巢，止血縫合。另取10只大鼠設(shè)為假手術(shù)組，除不摘除卵巢外，同法操作。縫合后，正常飼養(yǎng)。3個月后，骨質(zhì)疏松大鼠用氯氨酮麻醉，參考文獻資料復(fù)制右側(cè)股骨骨折模型(李曉林,羅新樂，余楠生等.畦魚降鈣素對骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合的影響.中國骨質(zhì)疏松雜志，2003，59(2):111-113;卿茂盛，凍小磚，鄒志鵬.續(xù)斷對大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合影響的生物力學實驗研究，中國醫(yī)學物理雜志，2002，19(3):159-161)。給藥與飼養(yǎng)將造模大鼠隨機分為6組，分別為骨質(zhì)疏松模型組(OPS)，骨質(zhì)疏松骨折模型組(OPF)，骨質(zhì)疏松骨折+仙靈骨保600mg/kg組(OPFG)，骨質(zhì)疏松骨折+ASP-VI270mg/kg組(OPFA-H)、骨質(zhì)疏松骨折+ASP-VI90mg/kg組(OPFA-L)，骨質(zhì)疏松骨折+XDS450mg/kg組(OPFX-H)、骨質(zhì)疏松骨折十XDS150mg/kg組(OPFX-L)。各組均在造模后當天給藥，假手術(shù)組(SHAM)、OP組和OPF組大鼠灌胃法給服純化水，1.0ml/100g體重，每天1次，藥物組，按規(guī)定劑量配制相應(yīng)濃度，按1.0ml/100g體重，每天灌胃l次，連續(xù)用藥8周。各組大鼠分籠詞養(yǎng)，自由攝取標準大鼠飼料，自由飲用蒸餾水。觀察指標及測定方法各組動物均在8周處死，進行下列指標觀察。(1)骨密度(MBD)和骨抗彎強度(FBS)的測定處死前，大鼠腹腔注射5%氯氨酮注射液10mg/100g，當大鼠呈現(xiàn)穩(wěn)定的昏睡狀態(tài)持續(xù)10min以上時，置于DPX-L型雙能X線骨密度儀(LunarCo.U.S.A)的探頭下，應(yīng)用骨密度測定軟件進行全身和骨折處掃描，測定全身骨密度和骨折股骨的骨密度。測骨密度后大鼠處死，取下左、右兩側(cè)股骨，分別先用游標卡尺測定股骨中段的寬度并計算截面積，后將股骨放在萬能材料試驗機的支架上(跨距^25mm)，以5mm/min的速度下壓股骨中段，記錄最大的壓力載荷，最后計算抗彎強度(單位截面面積上最大的壓力載荷)。(2)骨痂鈣、磷含量的測定將測定FBS的骨折的右則股骨用丙酮震蕩脫水12小時，真空干燥(105°C，24h)后稱重，將標本研碎成細顆粒狀，再置于6N鹽酸中105i:水解12h，標本冷卻后用NaOH調(diào)至pH值到6.0。用甲基百里香酚藍比色法測定骨痂總鈣量(Ca);用孔雀綠直接顯色法測定骨痂磷含量；計算公式Ca(樣本濃度咖ol/L)=AbsX2.5X100/0.3087P(樣本濃度mmol/L)=AbsX1.29X200/0.18882.2結(jié)果2.2.l藥物對大鼠骨密度(MBD)和骨抗彎強度(FBS)的影響由下表4可見經(jīng)治療8周后，骨質(zhì)疏松大鼠全身骨密度均有不同程度提高，ASP-VI高劑量組、陽性藥物組和XDS高劑量組的GMBD明顯高于骨質(zhì)疏松模型組，但較假手術(shù)組水平還較遠，可能同用藥時間較短有關(guān)。右側(cè)股骨骨折模型組大鼠的骨密度較未骨折的假手術(shù)大鼠或骨質(zhì)疏松模組大鼠的股骨骨密度均明顯要低，經(jīng)治療8周后治療藥骨質(zhì)疏松骨折大鼠股骨骨密度均有增加，其中ASP-VI高、低劑量組、XDS高劑量組和陽性藥物組右側(cè)骨股骨密度明顯高于骨質(zhì)疏松骨折模型組。提示ASP-VI不但可提高骨質(zhì)松大鼠的全身骨密度，對骨折處的骨密度也有提高作用，且作用強于XDS和陽性藥物。表4各組大鼠全身骨密度和右側(cè)股骨骨密度測定結(jié)果(:？土s，n=8~10)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注與骨質(zhì)疏松假手術(shù)組(SHAM)比較，"P〈0.01;與骨質(zhì)疏松骨折假手術(shù)組(OPS)比較；**P<0.01;與OPS組比較，*P<0.05，**P<0.01;與OPF組比較，AP<0,05，AAP<0.01;2.2.2藥物對大鼠骨痂鈣、磷含量的影響由下表6可見骨質(zhì)疏松骨折大鼠骨痂鈣、磷含量均明顯低于未骨折假手術(shù)組。經(jīng)8周治療后，ASP-VI高、低劑量組，XDS高、低劑量組及陽性藥物組骨痂鈣明顯增加；ASP-VI高劑量組、XDS高劑量組和仙靈骨葆膠囊組骨痂磷含量均顯著升高。提示ASP-VI和XDS對骨質(zhì)疏松骨折大鼠的明顯治療作用，且APS-VI作用明顯強于XDS。表6骨痂鈣和磷含量的變化(i±s,n=8~10)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注與骨質(zhì)疏松骨折假手術(shù)組(OPS)比較；**P<0.01;與OPF組比較，*P<0.05，**P<0.01四、結(jié)論試驗采用本發(fā)明提取所得川續(xù)斷皂苷VI(APS-VI)進行骨科疾病方面的藥理作用研究，觀察APS-VI的藥理活性，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。試驗結(jié)果表明(1)ASP-VI可不同程度提高小鼠痛閾，150mg/kg、300mg/kg組對小鼠熱刺激引起的疼痛有明顯鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用同陽性對照藥對乙酰氨基酚相近，且呈劑量相關(guān)性。福爾馬林致痛試驗結(jié)果表明ASP-VI的75mg/kg、150mg/kg、300mg/kg三個劑量對降低II相反應(yīng)疼痛積分均有降低，與對照組相比均有顯著差異，作用效果與及陽性對照藥相當，陽性藥物與ASP-VI對I相反應(yīng)均無明顯作用。(2)慢性炎癥試驗結(jié)果表明ASP-VI可抑制棉球刺激的大鼠肉芽組織增生，與陰性對照組比較，ASP-VI90mg/kg、180mg/kg與陽性對照組均有顯著性差異(PO.Ol)，提示ASP-VI對大鼠慢性增生性炎癥明顯有抑制作用，作用強于陽性對照藥。G)采用大鼠去除卵巢復(fù)制雌激素缺乏型骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折模型，經(jīng)8周的治療后ASP-VI270mg/kg和XDS300mg/kg組可明顯改善卵巢摘除大鼠的全身骨密度和股骨硬度，表明ASP-VI和XDS對雌激素缺乏型骨質(zhì)疏松有明顯治療作用。骨質(zhì)疏松大鼠右側(cè)股骨骨折模型組大鼠的骨密度較未骨折骨質(zhì)疏松模型組大鼠的股骨骨密度均明顯要低，經(jīng)治療8周后治療藥骨質(zhì)疏松骨折大鼠股骨骨密度均有增加，其中ASP-VI270mg/kg、卯mg/kg劑量組和XDS450mg/kg組骨折骨股骨密度明顯高于模型組。對骨質(zhì)疏松骨折大鼠骨痂鈣、磷進行測定，結(jié)果表明骨折大鼠骨痂鈣、磷含量均明顯低于假手術(shù)組，經(jīng)8周治療后，ASP-VI270mg/kg、90mg/kg劑量組，XDS450mg/kg、150mg/kg劑量組骨痂鈣明顯增加；ASP-VI、XDS高劑量組和仙靈骨葆膠囊組骨痂磷含量均顯著升高。本試驗結(jié)果提示ASP-VI不但可提高骨質(zhì)松大鼠的全身骨密度，對骨折處的骨密度和骨痂鈣、磷含量均有提高作用，但ASP-VI作用明顯強于XDS,提示APS-VI是續(xù)斷皂苷的主要有效成分，純度增加療效也增加。上述實驗結(jié)果充分顯示本發(fā)明藥物ASP-VI對骨質(zhì)疏松、骨折有明顯治作用，且對骨科疾病中骨性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生、骨折等疼痛或炎癥臨床癥狀有明顯治療作用。權(quán)利要求1.一種治療骨科疾病的原料藥，其特征在于，該原料藥為川續(xù)斷皂苷VI，由含川續(xù)斷皂苷VI的中藥材提取制備而得，川續(xù)斷皂苷VI的重量百分數(shù)含量占川續(xù)斷皂苷VI提取物總量的95.0～99.9％，其化學名稱為3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，化學結(jié)構(gòu)式為2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療骨科疾病的原料藥，其特征在于，所述的骨科疾病是指骨質(zhì)疏松、骨折、骨性關(guān)節(jié)炎或骨質(zhì)增生。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療骨科疾病的原料藥，其特征在于，所述的含川續(xù)斷皂苷VI的中藥材是指續(xù)斷、木通或預(yù)知子。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療骨科疾病的原料藥，其特征在于，該原料藥與藥學上可接受的輔料混合制成固體制劑或液體制劑，其中所述的固體制劑為片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸、貼劑或注射用凍干粉，所述的液體制劑為口服液、軟膠囊、膏劑或注射液。5、權(quán)利要求1所述的治療骨科疾病的原料藥的制備方法，其特征在于，包括下列步驟1)提取、濃縮取含川續(xù)斷皂苷VI的中藥材，用低級醇或含水的低級醇提取，濾過，得提取液A;將所得提取液A減壓回收醇，濃縮至相對密度為1.201.40，得濃縮液B;2)濃縮液處理將濃縮液B加水稀釋成每毫升含0.31.5g生藥材的溶液，加堿調(diào)節(jié)pH值到7.010.0，靜置436小時，濾過或離心，分取上清液，得溶液C;3)分離總皂苷將溶液C上樣于裝有大孔樹脂的層析柱上，循環(huán)吸附23次，用23倍量柱體積的0.55.0%的堿液洗脫后用水洗至近中性，再用24倍量柱體積的1040%乙醇洗脫,棄去洗脫液;最后用48倍量柱體積的50-95%乙醇洗脫，收集洗脫液，得總皂苷提取液D;4)脫色將總皂提取液D過氧化鋁或脫色樹脂柱或采用活性碳進行脫色；將脫色后的總皂苷提取液減壓回收醇，濃縮，干燥，得川續(xù)斷皂苷VI粗品；5)純化、精制川續(xù)斷皂苷VI:將川續(xù)斷皂苷VI粗品用水或含水的低級醇制成溶液，進一步采用柱層析分離純化或采用不同極性溶劑分級萃取純化精制即得川續(xù)斷皂苷VI。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療骨科疾病的原料藥的制備方法，其特征在于，所述的步驟1)和步驟5)中低級醇的碳數(shù)為C1C5，濃度為X，0%<XS100%。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療骨科疾病的原料藥的制備方法，其特征在于，所述的步驟l)中的提取方法為煎煮法、加熱回流法、浸出法或滲漉法。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療骨科疾病的原料藥的制備方法，其特征在于，所述的步驟2)和步驟3)中的堿液是NaOH、KOH、Ca(OH)2、K2C03、Na2C03、NaHC03、氨水和三乙胺中的一種或幾種的混合物。9、根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療骨科疾病的原料藥的制備方法，其特征在于，所述的步驟3)中分離總皂苷所用的大孔樹脂是SA-1、SA-2、ADS-5、ADS-7、ADS-8、AB-8和D201中的一種或兩種。10、根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療骨科疾病的原料藥的制備方法，其特征在于，所述的步驟5)中的純化精制方法采用下列方法之一或混合使用1)將川續(xù)斷皂苷VI粗品用洗脫液溶解，離心或微濾后上樣于葡聚糖凝膠柱層析分離，洗脫液為5~80%醇，采用部分收集器收集，將主含川續(xù)斷皂苷VI流分收集，合并，減壓回收醇，濃縮干燥，即得精制川續(xù)斷皂苷VI;2)將川續(xù)斷皂苷VI粗品用洗脫液溶解，離心或微濾后上樣于反相柱層析分離，洗脫液為20~90%醇，采用部分收集器收集，將主含川續(xù)斷皂苷VI流分收集，合并，減壓回收醇，濃縮干燥，即得精制川續(xù)斷皂苷VI;3)將川續(xù)斷皂苷Vl粗品用水制成每毫升含50300mg粗品的溶液，用堿調(diào)PH值至8.011.0，先用含醇的乙酸乙酯、二氯甲垸或三氯甲烷萃取數(shù)次；再用正丁醇或水飽合正丁醇萃取數(shù)次，合并正丁醇萃取液；再用水反洗正丁醇萃取液24次；減壓回收正丁醇至原體積的1/51/3后放置1248小時，去除沉淀，繼續(xù)濃度縮，干燥，即得川續(xù)斷皂苷VI，如純度低于95%，采用含水的碳數(shù)為C1C4的低級醇或混合有機溶劑進行重結(jié)晶，即得精制川續(xù)斷皂苷VI。全文摘要本發(fā)明公開了一種治療骨科疾病的原料藥，該原料藥為川續(xù)斷皂苷VI，由含川續(xù)斷皂苷VI的中藥材提取制備而得，川續(xù)斷皂苷VI的重量百分數(shù)含量占川續(xù)斷皂苷VI提取物總量的95.0％～99.9％，其化學名稱為3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。本發(fā)明還公開了川續(xù)斷皂苷VI原料藥的制備方法，該方法分為提取、濃縮、分離總皂苷、脫色、純化精制幾個步聚，該制備方法的優(yōu)點是本制備方法提取率高、成本低、安全環(huán)保，適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。本發(fā)明還提出了該原料藥在制備防治骨質(zhì)疏松、骨折、骨性關(guān)節(jié)炎的骨科疾病治療藥物方面的應(yīng)用。文檔編號A61K36/185GK101366721SQ200810030360公開日2009年2月18日申請日期2008年8月25日優(yōu)先權(quán)日2008年8月25日發(fā)明者濤翟,馬仁強申請人:馬仁強