專利名稱：從連翹中分離抗腫瘤的三萜類化合物的提取方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從常用中藥連翹(Forsythia suspensa的干燥果實)中分離出三 辟類化合物的提取方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性肺瘤已成為常見且嚴重威脅人類生命和生活質(zhì)量的主要疾病之一。目 前，化療是現(xiàn)階段治療惡性腫瘤的重要手段之一，它作為一種全身性的治療方法， 有可能最大限度地殺滅患者體內(nèi)的腫瘤細胞。但是目前已有的化療藥物在取得一 定治療效果的同時也存在不容忽視的缺陷，如仍然缺乏對占惡性腫瘤90 %以上 的實體瘤治療有效的藥物，藥物無選擇性從而導(dǎo)致全身毒副反應(yīng)嚴重，腫瘤的耐 藥性也越來越強。而臨床上所使用的抗腫瘤化療藥物多為國外進口藥物，其價格 昂貴，給社會和患者家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。近年來，植物來源的抗腫瘤藥已逐漸引起人們重視。具有微觀蛋白抑制作用 的紫杉醇、拓樸異構(gòu)酶抑制劑喜樹堿等都取得了良好的治療效果。植物來源的抗 腫瘤藥物不僅在發(fā)現(xiàn)新藥方面有巨大潛力，其作用原理的深入研究可為抗腫瘤新 藥的研制與開發(fā)提供新的動力。中草藥在我國的應(yīng)用歷史悠久，臨床也已積累了 許多治療癌癥的寶貴經(jīng)驗，因此從中草藥中尋找與開發(fā)自主創(chuàng)新和源頭創(chuàng)新的藥 物具有重要的戰(zhàn)略意義。連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl的干燥果實， 為中醫(yī)常用的清熱解毒藥，歷來被視為瘡家要藥。其味苦，無毒，性微寒，具有 清熱解毒、散結(jié)消腫等功效，主治溫?zé)?、丹毒、斑疹、癰殤腫毒、瘰癘等癥。連 翹的主要成分為木脂素類、黃酮類、三萜類、苯乙醇及其苷類等。在本發(fā)明之前，對連翹生物學(xué)活性的研究主要集中在抗菌、抗病毒、抗炎、 解熱、保肝等方面。常見的以連翹為原料的中成藥制劑有4艮翹解毒片、雙黃連注 射液、抗病毒口服液等。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述缺陷，從中藥連翹中提取得到三薛類化合物，并 將其作為抗腫瘤藥物應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是 從連翹中分離抗腫瘤的三萜類化合物的提取方法，其主要技術(shù)步驟在于 (1)將干燥的連翹果實粉碎；(2 )將粉碎的連翹放入95 %乙醇中浸泡；(3) 待乙醇揮干后，得浸膏；(4) 將浸膏用乙酸乙酯萃取后，硅膠拌樣； (5 )將硅膠拌樣進行硅膠柱層析；(6) 然后用石油醚、乙酸乙酯混合溶液分次洗脫；(7) 將分次洗脫的溶液點板合并，靜置；(8) 靜置后析出結(jié)晶；(9) 經(jīng)重結(jié)晶，得三碎類化合物，即五環(huán)三薛類化合物安博立酸和四環(huán)三碎類 化合物。本發(fā)明的另一技術(shù)方案是安博立酸作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用，其主要技術(shù)特征在于將安博立酸制備成粉 劑、針劑、口服膠囊。本發(fā)明的又一技術(shù)方案是達瑪烷化合物作為抗肺瘤藥物的應(yīng)用，其主要技術(shù)特征在于將達瑪烷化合物制備成粉劑、針劑、口服膠囊。本發(fā)明的優(yōu)點和效果在于從連翹果實中利用適當(dāng)?shù)娜躨某，高效率的提取具有 抗腫瘤作用而副作用較小的化合物的方法。克服了連翹只在抗菌、抗病毒、抗炎、 解熱、保肝等方面的應(yīng)用局限。本發(fā)明中使用的連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl 的干燥果實，利用乙醇等溶媒提取，減壓濃縮除去提取液的溶媒，再將浸膏用別 的溶媒提取。用這樣的提取方法成功地得到了具有抗腫瘤作用的連翹中的三薛類 化合物，完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了 一種新方法從從連翹中分離抗腫瘤的三萜類化合物，即五環(huán)三 碎類化合物安博立酸和四環(huán)三碎類化合物達瑪烷化合物；四環(huán)三碎類化合物達瑪 烷化合物，即達瑪-24-烯-3p-乙酰氧基-20s-醇。本發(fā)明又將上述二種三薛類化 合物作為抗腫瘤藥物予以新的應(yīng)用。


圖1——本發(fā)明從連翹中提取四環(huán)三萜類化合物達瑪-24-烯-3 p -乙酰氧基 -20s-醇的結(jié)構(gòu)式。圖2——連翹中提取的四環(huán)三薛類化合物達瑪-24-烯-3 乙酰氧基-20s-醇 對人消化道腫瘤細胞的生長抑制作用(IC50)。圖3——達瑪-24-烯-3&-乙酰氧基-20s-醇對人胃癌細胞MKN-28的形態(tài)學(xué)影響。圖4一一本發(fā)明從連翹中提取五環(huán)三薛類化合物安博立酸的結(jié)構(gòu)式。圖5——連翹中提取的五環(huán)三薛類化合物安博立酸對人消化道肺瘤細胞的生 長抑制作用(IC50)。圖6—一安博立酸對人胃癌細胞MKN-28的形態(tài)學(xué)影響。
具體實施方式
下面，使用具體的實施例來說明提取方法，以及這些化合物的抗腫瘤作用。當(dāng)然這些提:f又方法并非只限于下列實施例。 實施例1:將干燥的連翹果實粉碎，用10倍量的95%乙醇浸泡10-15日。合并提取液， 減壓濃縮除去提取液中的溶媒，得乙醇浸膏。將該浸膏混懸于蒸餾水中，加入乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，得到乙酸 乙酯提取液。接著將剩下浸膏蒸餾水混懸液分別用正丁醇和水提取，得到正丁醇，水提取液。乙酸乙酯提取物溶解于適量的水中，上硅膠柱層析，硅膠是用的100-200 目；以20: 1的石油醚和乙酸乙酯混合物洗脫，得到三碎類化合物(達瑪烷化合 物)達瑪-24-烯-3 p -乙酰氧基-20s-醇(Dammar-24-ene-3 p -acetate-20s-o1 )。 達瑪-24-烯-3 0-乙酰氧基-20s-醇的結(jié)構(gòu)式，如圖l所示 達瑪-24-烯-3 |3 -乙酰氧基-203-醇數(shù)據(jù)Dammar-24-ene-3p-acetate-20S-ol: C32H5403, colorless crystal. EI-MS: m/z 468 [M-H20]+. 1H NMR (300MHz, CDC13): 5H5.11 (1H， t， H-24), 4. 48 (1H， dd, H-3), 2.04(3H, s, CH3C00-)， 1.68 (3H, s, H-26), L62(3H， s， H-27), 1. 13(3H， s， H-21), 0. 95(3H， s, H—18), 0. 87 (3H， s， H-30), 0. 87 (3H, s， H-23), 0.84(3H， s， H—28)， 0.84 (3H， s, H-29). 13C NMR (300MHz, CDC13): 5C 171. 1 (CH3C00—)， 131.6 (C-25)， 124.9(C-24), 81.1(C-3)， 75.4(C-20)， 56.1(C-5)， 50. 7(C-9), 50. 4 (C-14)， 49. 9(C-17), 42. 4(C-13), 40. 7(C-22), 40.5(C-8)， 38.9(C-1)， 38. 0(C-4), 37.2(C-10), 35. 3(C-7), 31. 3(C-15),28. l(C-28), 27. 6 (C-12)， 25.9(C-26), 25.5 (C-21)， 24. 9 (C—16), 23.8(C-2), 22. 7(C-23)， 2L7(C-11)， 21. 4 (CH3C00-), 18. 3(C-6)， 17. 8(C-27)， 16. 6(C-29), 16, 6(C-30)， 16. 4(C-19), 15. 6(C-18). 下面，說明由實施例l得到的三薛類化合物的體外生物活性實驗。 實施例2:連翹中五環(huán)三萜類化合物達瑪-24-烯-3 p -乙酰氧基-20s-醇對腫瘤細胞的 生長抑制作用1. 取對數(shù)生長期的腫瘤細胞，接種于96孔板，每孔O. 2ral，所含細胞數(shù)為 3000個/孔。細胞板內(nèi)的細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清，100IU/ml青霉素和100 jug/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37。C和5 %002下培養(yǎng)24h后，分別加入不 同濃度的達瑪-24-烯-3p-乙酰氧基-20s-醇，溶于DMS0，各組設(shè)4個平行空，空 白對照設(shè)DMSO組。加藥后繼續(xù)孵育72h，實驗終止前加入2mg/ml MTT溶液20 n 1， 再培養(yǎng)4h,測試前加入二曱亞砜(DMS0) IOOili 1,充分振勻后，測定每孔490nm 下的吸光度0D值，按下述公式求出生長抑制率(IR)，通過由IR對濃度作圖求 出半數(shù)抑制濃度(IC5。)。IR(%)=1-用藥組平均0D值 對照組平均OD值結(jié)果如圖2所示。2. 達瑪-24-烯-3 P -乙酰氧基-20s-醇對人胃癌細胞林MKN-28的生長抑制作 用(72h)，如圖3所示。上述結(jié)果清楚的表明實施例1中得到的連翹中四環(huán)三碎類化合物達瑪-24-烯-3 p -乙酰氧基-20s-醇，對消化道腫瘤細胞有較強的生長抑制作用。連翹的三碎類化合物達瑪在抗腫瘤藥物的用途，連翹(Forsythia suspensa Thunb. Vahl)的干燥果實粉碎，用乙醇浸泡10日得乙醇浸膏， 一般而言，乙醇 浸膏提取物經(jīng)過正幾烷、石油醚、脂類溶劑、正丁醇等醇類溶劑、水的遞次提取。 其順序是從"輕"溶劑到水，亦可以是從上述順序中直接選定一種溶劑提取，所 得提取物基本相近。例如乙醇浸膏直接經(jīng)石油醚類溶劑l-4次萃取提取得到石油 醚提取液；或者直接用同樣的將浸膏蒸餾水混懸液分別用乙酸乙酯等脂類1-4次, 得到脂類提取液。所得混合物再用硅膠柱層析進行進一步分離，所得的四環(huán)三萜 類化合物達瑪-24-烯-3 p -乙酰氧基-208-醇用于抗腫瘤。實施例3:將干燥的連翹果實粉碎，用IO倍量的95%乙醇浸泡10-15日。合并提取液， 減壓濃縮除去提取液中的溶媒，得乙醇浸膏。將該浸膏混懸于蒸餾水中，加入乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，得到乙酸 乙酯萃取液。接著將剩下浸膏蒸餾水混懸液分別用正丁醇和水提取，得到正丁醇，水提取液。乙酸乙酯提取物溶解于適量的水中，上硅膠柱層析，硅膠是用的100-200目； 以不同比例的石油醚和乙酸乙酯混合物洗脫，在石油醚乙酸乙@旨=5: l得到五 環(huán)三碎類化合物安博立酸(Ambolic acid, Morolic acid, Agauriolic acid)。 三辟類化合物安博立酸數(shù)據(jù)，如圖4所示 安博立酸Morolic acid (Agauriolic acid; Ambrolic acid): C30H4803, whitecrystalline needles, m. p. 273-274 .[ct]^)0+33 (MeOH; c0.3). EI-MS:m/z 456 [M]+. 1H NMR (300MHz, CDC13): 5H5.01(1H， s, H-19), 4.26(1H， d， J=5. 4Hz, H-3), 0. 93(3H, s) ， 0. 92(3H， s), 0. 89(3H， s), 0. 87(3H， s) ， 0. 80(3H, s), 0.73(3H, s), 0.65(3H, s). 13C NMR (300MHz, CDC13): 5 C 177. 4 (C-28)， 137.5 (C-18), 131.3(C-19)， 76.8 (C-3), 55.0(C-5), 50.5(C-9)' 47.3(C-17)， 42.1(C-14), 40. 8(C-8), 40. 6(C-13)， 38. 9(C-4), 38.5(C-1)， 36. 7(C-10)， 34.1(C-7)， 33.2(C-16), 33. 1(C-21)， 33. l(C-22), 32.9 (C-20), 30. 3(C-29), 28. 9(C-15)， 28. 9(C-30)， 28. 0(C-23), 27. l(C-2)， 25. 6 (C—12)， 20. 5(C-11), 17.9(C-6), 16. 4(C-22)， 16.4(C-26)， 15. 8(C-25), 14. 7 (C-27). 下面，說明由實施例3得到的三萜類化合物的體外生物活性實驗。 實施例4:連翹中五環(huán)三碎類化合物安博立酸對肺瘤細胞的生長抑制作用1.取對數(shù)生長期的腫瘤細胞，接種于96孔板，每孔O. 2ml，所含細胞數(shù)為 3000個/孔。細胞板內(nèi)的細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清，100IU/ml青霉素和100 iag/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37。C和5 %002下培養(yǎng)24h后，分別加入不 同濃度的五環(huán)三萜類化合物_—安博立酸，溶于DMSO,各組設(shè)4個平行空，空白 對照設(shè)DMSO組。加藥后繼續(xù)孵育72h,實驗終止前加入2mg/ml MTT溶液20 p 1， 再培養(yǎng)4h，測試前加入二曱亞砜(DMSO) 100m 1，充分振勻后，測定每孔490nm下的吸光度0D值，按下述公式求出生長抑制率(IR),通過由IR對濃度作圖求 出半數(shù)抑制濃度(IC5。)。IR(%)=1-用藥組平均0D值 對照組平均0D值結(jié)果如圖5所示。2.安博立酸對人胃癌細胞林MKN-28的生長抑制作用(72h)，如圖6所示。 上述結(jié)果清楚的表明實施例1中得到的連翹中五環(huán)三碎類化合物安博立酸， 對消化道腫瘤細胞有較強的生長抑制作用。連翹中四環(huán)三薛類化合物達瑪-24-烯-3 p -乙酰氧基-20s-醇的提取方法連 翹(Forsythia suspensa Thunb. Vahl)的干燥果實，粉碎，用70%—100%乙醇浸 泡10-15日。合并提取液，減壓濃縮除去提取液中的溶媒，得乙醇浸膏。將該浸 膏混懸于蒸餾水中，用溶劑提取，加入乙酸乙酯1-4次萃取，合并萃取液，得乙 酸乙酯提取液。減壓濃縮除去這些提取液中的溶媒，得乙酸乙酯提取物。所得提 取物上100-200目的硅膠柱，用不同比例的石油醚和乙酸乙酯混合物依次洗脫， 在石油醚乙酸乙酯=20: 1時得到達瑪-24-烯-3p-乙酰氧基-20s-醇。連翹中五環(huán)三辟類化合物安博立酸的提取方法連翹(Forsythia suspensa Thunb. Vahl)的干燥果實，粉碎，用70-95%乙醇浸泡10-15日。合并提取液， 減壓濃縮除去提取液中的溶^^某，得乙醇浸膏。將該浸膏混懸于蒸餾水中，用溶劑 提取，加入乙酸乙酯1-4次萃取，合并萃取液，得乙酸乙酯提取液。減壓濃縮除 去這些提取液中的溶媒，得乙酸乙酯萃取物。所得提取物上100-200目的硅膠柱， 用不同比例的石油醚和乙酸乙酯混合物依次洗脫，在石油醚乙酸乙酯=5: l時 得到安博立酸。
權(quán)利要求
1.從連翹中分離抗腫瘤的三萜類化合物的提取方法，其步驟在于(1)將干燥的連翹果實粉碎；(2)將粉碎的連翹放入95％乙醇中浸泡；(3)待乙醇揮干后，得浸膏；(4)將浸膏用乙酸乙酯萃取后，硅膠拌樣；(5)將硅膠拌樣進行硅膠柱層析；(6)然后用石油醚、乙酸乙酯混合溶液分次洗脫；(7)將分次洗脫的溶液點板合并，靜置；(8)靜置后析出結(jié)晶；(9)經(jīng)重結(jié)晶，得三萜類化合物，即五環(huán)三萜類化合物安博立酸和四環(huán)三萜類化合物達瑪烷化合物。1.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從連翹中分離抗腫瘤的三萜類化合物的提取方法，其特征在于步驟(6)中石油醚、乙酸乙酯比例為20∶1，洗脫得四環(huán)三萜類化合物達瑪-24-烯-3 β-乙酰氧基-20s-醇。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從連翹中分離抗腫瘤的三薛類化合物的提取方法，其 特征在于步驟(6)中石油醚、乙酸乙酯比例為20: 1，洗脫得四環(huán)三碎類化 合物達瑪-24-烯-3 p -乙酰氧基-20s-醇。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從連翹中分離抗腫瘤的三辟類化合物的提取方法，其 特征在于步驟(6)中石油醚、乙酸乙酯比例為5: 1，洗脫得安博立酸。
4. 安博立酸作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用，其特征在于將安博立酸制備成粉劑、針劑、 口服肢囊。
5. 達瑪烷化合物作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用，其特征在于將達瑪烷化合物制備成粉 劑、針劑、口服膠囊。
全文摘要
本發(fā)明涉及從常用中藥連翹中分離出三萜類化合物的提取方法及應(yīng)用。本發(fā)明步驟是將干燥的連翹果實粉碎并放入95％乙醇中浸泡，乙醇揮干后得浸膏，將浸膏用乙酸乙酯萃取后，硅膠拌樣，進行硅膠柱層析，用石油醚、乙酸乙酯混合溶液分次洗脫，點板合并，靜置后析出結(jié)晶，經(jīng)重結(jié)晶，得三萜類化合物五環(huán)三萜類化合物安博立酸和四環(huán)三萜類化合物達瑪烷化合物即達瑪-24-烯-3β-乙酰氧基-20s-醇。。本發(fā)明克服了連翹只在抗菌、抗病毒、抗炎、解熱、保肝等方面的應(yīng)用局限，提供了安博立酸新的提取方法且提取效率高，并將提取的安博立酸、達瑪-24-烯-3β-乙酰氧基-20s-醇應(yīng)用于抗腫瘤，毒副作用小，可制成粉劑、針劑、口服膠囊。
文檔編號A61K31/575GK101230081SQ20081001917
公開日2008年7月30日 申請日期2008年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月15日
發(fā)明者劉寶瑞, 婧 孫, 錢曉萍 申請人:南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院