專利名稱：：巴西蘇木紅素的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及以蘇木為原料提取的巴西蘇木紅素在醫(yī)藥方面的新用途，屬于中藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：蘇木，為豆科植物蘇木Caesa7A/zw'asafloa/7L.的干燥心材。分布于我國的廣西，廣東，臺(tái)灣，貴州，云南，四川等地。全年可采。除去外皮及邊材，取心材，曬干。含有巴西蘇木素(brasilin)，巴西蘇木紅素(brasilein)等成分。以蘇木為原料提取的巴西蘇木紅素(C16H1205)的結(jié)構(gòu)式如下物理化學(xué)特征紅棕色晶體(MeOH)，mp260-265。C(dec.),，[aV"-1008(MeOH;c0.6)。波譜特征UV(MeOH)麼276，446,556。EIMS(m/z):284[M]+畫R如下表'Hand3CNMRdataofBrazileiinDMSO-d6(500MHzfor'Hand125MHzfor13C，Sinppm，/inHz)No.力_"C"I7.82(1H,d,J=8.5Hz)130.5la110.826.58(1H'dd,J=8.5,2.0Hz)110.83162.246.36(1H,d，J=2.0Hz)102.84a157.764.lO(lH，d,J=11.5Hz),4.47(1H,d,J=11.5Hz)72.972.86(2H，s)39.87a158.986.33(1H,s)117.59179.310152.3117.11(1H，S)lla12104.1126.0151.5《本草綱目》記載蘇木具有"破血，排膿止痛"的功效。主治婦人血?dú)庑母雇?，消癰腫撲損瘀血"，《中藥大辭典-上冊》記載蘇木具有"行血破瘀，消腫止痛"的功效。蘇木作為腦血管藥用的記載比較少見，尤其未見報(bào)道蘇木或巴西蘇木紅素在制備治療腦缺血，腦內(nèi)過氧化物增高所引起疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種巴西蘇木紅素在醫(yī)藥方面的新用途，該用途為巴西蘇木紅素在制備治療因腦缺血導(dǎo)致腦內(nèi)過氧化物過多所引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。巴西蘇木紅素在制備治療因腦缺血導(dǎo)致腦血流供應(yīng)不足所引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的巴西蘇木紅素采用以下方法得到首先將藥材重量的515倍80%95%乙醇回流提取,提取次數(shù)一般為13次，每次13小時(shí)。將提取液在常壓或減壓，溫度在309CTC濃縮，回收乙醇，干燥，稱重。加甲醇溶解，用聚酰胺或硅膠拌樣，裝柱，然后分別用48倍柱體積的水和3090%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液部分。將收集的洗脫液在3080°C溫度下減壓濃縮，減壓干燥或冷凍干燥，得到巴西蘇木紅素。加水溶解，石油醚萃取，萃取物常壓濃縮，得到巴西蘇木紅素。將上述方法制得的巴西蘇木紅素采用高效液相色譜法在波長446nm處進(jìn)行測定，巴西蘇木紅素(C16H1205)含量在8098%之間。在治療腦內(nèi)過氧化物過多，腦血流供血不足及其由此引起的疾病時(shí)，以巴西蘇木紅素為活性成分，以常規(guī)的制劑工藝，單獨(dú)使用或與其他藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物。如散劑，丸劑，膠囊劑，片劑，微囊劑，軟膠囊劑，膜劑，栓劑，注射劑，膏劑，酊劑，散劑，沖劑，氣霧劑，各種外用制劑等。本發(fā)明的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巴西蘇木紅素具有一定地抑制腦組織MDA生成的作用，有一定的抗氧化作用。巴西蘇木紅素可以明顯升高小鼠腦膜血流量，具有一定地?cái)U(kuò)張腦血管的作用。巴西蘇木紅素體外可以明顯抑制紅細(xì)胞膜^+，1(+ATP酶活性，提示可以降低腦能量代謝，具有一定保護(hù)腦神經(jīng)原的作用。
發(fā)明內(nèi)容圖1巴西蘇木紅素結(jié)構(gòu)圖2巴西蘇木紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3巴西蘇木紅素的紫外可見光掃描圖譜;圖4巴西蘇木紅素高效液相色譜圖。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例及藥效實(shí)驗(yàn)資料使本發(fā)明所說的巴西蘇木紅素的制備及其用途得以證實(shí)，同時(shí)又不應(yīng)將下列實(shí)施例看作是對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1:取蘇木0.5公斤用其重量6倍的80%乙醇回流提取1次，每次1小時(shí)。將提取液減壓，溫度45。C下濃縮，回收乙醇，干燥，稱重。加甲醇溶解，拌入聚酰胺裝柱，然后分別用4倍柱體積的水和4倍柱體積的90%乙醇洗脫，收集后一部分洗脫液。將收集的洗脫液在3(TC溫度下減壓濃縮，減壓干燥，得到巴西蘇木紅素。采用高效液相色譜法進(jìn)行測定，巴西蘇木紅素含量為80%左右。實(shí)施例2:取蘇木0.5公斤用藥材重量的15倍80%乙醇回流提取2次，每次3小時(shí)。將提取液濃縮回收乙醇，拌硅膠裝柱，用6倍柱體積的乙醇-氯仿(20:80)洗脫，收集洗脫液。將收集的洗脫液在60'C溫度下減壓濃縮，沉淀物常壓干燥，得到巴西蘇木紅素。巴西蘇木紅素采用高效液相色譜法進(jìn)行測定，巴西蘇木紅素含量為90%左右。實(shí)施例3:取蘇木0.5公斤用其重量10倍的95%乙醇回流提取，回流溫度80。C，提取3次，每次1小時(shí)。將提取液在減壓，溫度在5(TC濃縮，回收乙醇，加水，用石油醚萃取，萃取物常壓濃縮，得到巴西蘇木紅素。巴西蘇木紅素采用高效液相色譜法進(jìn)行測定，巴西蘇木紅素含量為92%左右。在藥劑應(yīng)用上就是將巴西蘇木紅素單獨(dú)地或者加入復(fù)方中以常規(guī)的制劑工藝制備成藥劑。其藥劑可以是臨床上能夠使用的各種不同劑型。巴西蘇木紅素測定，采用高效液相色譜法對其進(jìn)行含量測定。1、試藥與儀器Waters高效液相色譜儀，515泵，996型二極管陣列紫外可見光檢測器。紫外可見光分光光度計(jì)(TU-1800PC)。1/100000分析天平。巴西蘇木紅素(Brasilein,C16H1205.分子量284)對照品清華大學(xué)藥物藥理研究室自制(批號030716)，高效液相色譜儀標(biāo)定，純度98%。其佘試劑均為分析純。(1)對照品溶液的制備精密稱取巴西蘇木紅素適量，加甲醇制成0.34mg/ml的對照品液。(2)對照品最大吸收峰的確定取對照品液，在TU-1800PC紫外可見分光光度計(jì)上進(jìn)行光譜掃描，掃描范圍為200-600nm，掃描圖譜如附圖2所示。由圖中得知，巴西蘇木紅素最大吸收波長為446nm。(3)色譜條件色譜柱HypersilODS柱(100X4.6誦i.d.5m中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所)；預(yù)柱0DS柱，柱溫22°C(室溫)，流動(dòng)相乙腈-水(20:80)，流速lml/min，檢測波長446皿。進(jìn)樣量IOW。(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線制做取上述對照品液，分別進(jìn)樣2，4，6，8，10，以峰面積為縱座標(biāo)(Y)，以樣品質(zhì)量為橫座標(biāo)(X)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求線性關(guān)系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>其線性圖見附圖2。藥效實(shí)驗(yàn)例l:對小鼠腦組織的抗氧化作用觀察本發(fā)明巴西蘇木紅素對小鼠腦內(nèi)MDA(丙二醛)生成的抑制作用。本發(fā)明所用巴西蘇木紅素，批號030716。用時(shí)以生理鹽水配制成所需濃度。實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為雄性二級ICR小鼠，非近交系封閉群，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重為18-22g。實(shí)驗(yàn)室室溫20-22。C，相對濕度40%60%，換氣扇通氣，自然光源12h/日，籠養(yǎng)，每籠10只，每三日清掃籠舍一次。取正常小鼠，處死后取腦，加入生理鹽水做勻漿液(與腦比例為5:1)。4'C冰箱靜置5分鐘，取上部均勻混濁液。每管加入腦組織液150uL，加入不同濃度藥液50ul，37°C水浴孵育30分。依次加入畫DS0.lml，50%冰醋酸硫代巴比妥酸液0.5ml和1%鹽酸液2ml。沸水浴15分鐘，取出后冷水置10分鐘，1500轉(zhuǎn)離心15分鐘，取上清于532nm處測吸光度A值。每組做三個(gè)平行管。所得數(shù)據(jù)經(jīng)EXCEL軟件處理。組間t檢驗(yàn)。本試驗(yàn)巴西蘇木紅素給藥終濃度分別為1X10—6g/ml,1X10—5g/ml，1X10、/ml。本試驗(yàn)空白對照為等體積生理鹽水.陽性藥對照為抗壞血酸，北京芳草醫(yī)藥化工制藥公司生產(chǎn)，批號010621。實(shí)驗(yàn)終濃度為1X10—3g/ml。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以Excel軟件處理。其數(shù)據(jù)見下表l。表1:巴西蘇木紅素體外對小鼠腦MDA生成的影響(x土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>與生理鹽水組相比，*P<0.05，**P<0.01。n=3本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巴西蘇木紅素體外有較強(qiáng)地抑制缺糖缺氧腦組織MM生成的作用，最低有效濃度為1X10—5g/ml。提示巴西蘇木紅素具有一定的抗氧化的的作用。藥效實(shí)驗(yàn)例2:對小鼠腦膜血流量的影響觀察本發(fā)明巴西蘇木紅素對小鼠腦膜血流量的作用。巴西蘇木紅素，批號030716。用時(shí)以生理鹽水配制成所需濃度。試驗(yàn)動(dòng)物為雄性ICR小鼠，非近交系封閉群，體重18-22g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)室室溫20-22°C，相對濕度40%60%，換氣扇通氣，自然光源12h/日，籠養(yǎng)，每籠5只，每三口清掃籠舍一次。取小鼠烏拉坦(1.0g/kg)麻醉后，固定頭部，切開皮膚，于大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)(APL2)安置激光探頭(MDL-1型多功能激光多譜勒分析儀，天津南開大學(xué)生產(chǎn))，待穩(wěn)定5-10分鐘后開始測試腦血流，記錄給藥前后腦膜血流量的變化。本試驗(yàn)觀察指標(biāo)及指標(biāo)表達(dá)所測結(jié)果直接經(jīng)MDL軟件處理，腦膜血流量以KHz(千赫茲)表示，腦膜血流量增加百分值[二(給藥后血流量-給藥前血流量)/給藥前血流量]。本試驗(yàn)給藥劑量分別為15mg/kg，5mg/kg;給藥途徑為尾靜脈給藥；給藥體積為0.05ml/10g小鼠。本試驗(yàn)空白對照為等體積生理鹽水，陽性藥對照為腎上腺素注射液，10mg/ral。上海天豐制藥廠生產(chǎn)，批號020601，小鼠用量為0.01mg/kg。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以Excel軟件處理。其數(shù)據(jù)見下表2、3。表2:巴西蘇木紅素對正常小鼠腦血流量的作用(x士s)_^J1腦血流量(KHz)—(mg/kg)~5i^^15(分鐘)與同時(shí)間對照組相比，P<0.05。n=5表3:巴西蘇木紅素對正常小鼠腦血流量增加百分比值O(士s)劑量腦血流量增加百分比值(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>巴西蘇木502.5±11.38±13.99±17.86±17.46±紅素6.4712.7110.75*12.33*11.32*巴西蘇木2.507.30±2.26±7.57±20.15±29.61±_15.08.465.65_14.34*33.2*，同時(shí)間對照組相比，*P〈0.05，P<0.01。n=5^實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巴西蘇木紅素對小鼠腦膜血流量有明顯增加的作用。一般在給藥后1分鐘即有腦血流升高，5-15分鐘腦血流升高明顯；表明巴西蘇木紅素對腦血管有直接地?cái)U(kuò)張作用，提示對于腦缺血及其血管性痙攣所引起的疾病有較好的作用。藥效實(shí)驗(yàn)例3:對紅細(xì)胞膜Na+-K+ATP酶活性的影響本發(fā)明所用SD大鼠，非近交系封閉群，體重250-270g。購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司。實(shí)驗(yàn)室室溫20-22i:，相對濕度40%60%，換氣扇通氣，fi然光源12h/日，籠養(yǎng)，每籠5只，每三H清掃籠舍一次。本發(fā)明所用巴西蘇木紅素，批號030716。陽性對照藥為去乙酰毛花苷注射液，0.4mg/2ml，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號021001。752紫外可見光分光光度計(jì)。取大鼠10%烏拉坦麻醉，腹主動(dòng)脈取血，肝素抗凝，分離紅細(xì)胞，用1Oramol/LTris-HCl緩沖液破紅細(xì)胞膜，離心(15000轉(zhuǎn)/分，6分鐘)去上清。得紅細(xì)胞膜液。以蒸餾水作空白，以白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)，測定紅細(xì)胞膜液的蛋白含量。將紅細(xì)胞膜液濃度定在0.l-1.0mg/ml范圍內(nèi)，每管加入樣品2ml，依次加入不同濃度的藥物血0.4ml，加入Mg"和Na+,K+液，37。C預(yù)熱5分鐘，加入ATP0.4ml，37'C振蕩30分鐘，4000轉(zhuǎn)離心3分鐘，取上清測定Pi含量(張均田?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法。第一版，北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社。1998:1015)。以單位時(shí)間內(nèi)Pi的變化值反應(yīng)ATP酶活性。Na+-K+ATP酶活性=總ATP酶活性-Mg2+ATP酶活性。每樣本做三個(gè)平行管。試驗(yàn)結(jié)果見下表4:表4:對大鼠紅細(xì)胞膜船+-1(+ATP酶活性的影響(x土s)藥物終濃度總ATP酶活性Mg2+ATP酶活性Na+_K+ATP酶活性(ug/ml)(腿olPi/mg.h)(,olPi/mg.h)(,olPi/mg.h)生理鹽水等體積0.801±0.0170,31±0.0180.519±0.048乙酰毛花苷10.401士0.0230.289±0.0130.109±0.034**巴西蘇木紅吝10.709±0.0230.393±0.0160.316±0.028**累巴西蘇木紅素0.50.697±0.0180.310±0.0230.402±0.045*與生理鹽水組相比，*P〈0.05，**P<0.01。n=3巴西蘇木紅素能明顯抑制Na+-K+ATP酶活性，在腦缺血再灌過程中可以減少腦組織的能量代謝，保護(hù)祌經(jīng)原。藥效實(shí)驗(yàn)例4:對小鼠體內(nèi)血栓形成的影響試驗(yàn)動(dòng)物為雄性ICR小鼠，非近交系封閉群，體重18-22g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)室室溫20-22。C，相對濕度40%60%，換氣扇通氣，自然光源12h/日，籠養(yǎng)，每籠10只，每三日清掃籠舍一次。本發(fā)明所用巴西蘇木紅素，批號030716。陽性對照藥為阿斯匹林，25mg/片，北京市曙光制藥廠生產(chǎn)，批號030205。752紫外可見光分光光度計(jì)。取小鼠隨機(jī)分組，腹腔給預(yù)不同劑量的藥物，給藥后半小時(shí)，每只小鼠尾靜脈注射血栓形成誘導(dǎo)劑(0.7mg去甲腎上腺素，2.5mg二磷酸腺苷/10ml),給藥體積0.lml/10g體重。記錄觀察從注射誘導(dǎo)劑后5分鐘內(nèi)小鼠的死亡情況。計(jì)算各組死亡百分率(死亡數(shù)/總數(shù)X100y。)。試驗(yàn)結(jié)果見下表5:表5:對小鼠體內(nèi)血栓形成的影響(x土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與生理鹽水組相比，*P<0.05，**P<0.01。巴西蘇木紅素能明顯抑制體內(nèi)血栓誘導(dǎo)劑所致的小鼠死亡，并有一定的量效關(guān)系，表明，巴西蘇木紅素有抗體內(nèi)血栓形成的作用。權(quán)利要求1.巴西蘇木紅素在制備治療腦內(nèi)過氧化物過多所引起疾病的藥物中的應(yīng)用。全文摘要巴西蘇木紅素的新用途，涉及一種以蘇木為原料制備的巴西蘇木紅素醫(yī)藥方面的新用途。具體地說，巴西蘇木紅素在制備治療腦缺血或腦出血，腦組織過氧化物升高并由此引起的腦功能改變疾病的藥物中應(yīng)用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究表明，巴西蘇木紅素具有抗氧化，保護(hù)腦神經(jīng)原，增強(qiáng)腦血流，抑制紅細(xì)胞膜Na-KATP酶活性的作用。對于腦缺血再灌注引起的腦組織損傷有明顯的作用。在治療上述疾病時(shí)，以巴西蘇木紅素為活性成分，單獨(dú)使用或與其他藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物。文檔編號A61P43/00GK101301286SQ20081000812公開日2008年11月12日申請日期2004年3月5日優(yōu)先權(quán)日2004年3月5日發(fā)明者怡丁,杜力軍,偉王,王如峰,趙玉男,邢東明申請人:清華大學(xué)