專(zhuān)利名稱(chēng)：：Atap肽、編碼atap肽的核酸以及相關(guān)的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及多肽、編碼所述多肽的核酸、免疫特異性結(jié)合所述多肽的4元體以及相關(guān)的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
：尾錨定(tail-anchored,TA)蛋白質(zhì)，包括Bcl-2家族成員，特;f正'〖生;l也在羧基(C)末端通過(guò)單發(fā)u7jc節(jié)4殳(singlehydrophobicsegment)束縛于磷脂雙層，其中分子的大部分位于胞質(zhì)溶膠中。Bcl-2是哺乳動(dòng)物基因家族和它們產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的原型。Bcl-2相關(guān)蛋白的生物功能不可避免地與它們的特定的亞細(xì)胞定位相關(guān)聯(lián)；細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜或線(xiàn)粒體外膜(MOM)。研究表明Bcl-2家族成員可調(diào)節(jié)線(xiàn)并立體外力莫透4匕作用(MOMP)并且可以促凋亡(例30,Bax、BAD、Bak、Bok、Bcl-Xs、Bik、Bim、Bid、Egl-l、以及Diva等等)或抗凋亡(例廿口，Bcl畫(huà)2proper、Bcl-xL、Mcl-l、CED-9、Al、Bcl-w、以及Bfl-l等等)。Bcl-2家力矣成員和若干病癥有關(guān)，包4舌癌癥，例如黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、和肺癌；神經(jīng)性障礙，例如精神分裂癥；以及免疫紊亂。癌癥和增生包i舌各種非常復(fù)雜的疾??；然而，它們均具有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即所有細(xì)胞是高度增殖的并且能夠持續(xù)分裂，且不進(jìn)行終末分化。這就證實(shí)了在這些以及其他的相關(guān)病癥的病因中只于于減少凋亡的4乍用。雖然目前的幾種癌癥療法可促進(jìn)癌細(xì)力包死亡和抑制癌細(xì)力包生長(zhǎng)，但這些中的許多療法對(duì)于癌癥患者是高度毒性的并且它們的給藥導(dǎo)致許多使人不愉快的和不堪忍受的副作用。此外，許多目前可應(yīng)用的癌癥療法表明^U于特定病因的癌癥或增生有歲文。因此，非常期望這樣的治療，即可以在大量的癌細(xì)胞類(lèi)型和起源的范圍內(nèi)促進(jìn)癌細(xì)胞死亡，并且對(duì)于患者在很大程度上是無(wú)毒性的。近來(lái)，我們-i正明了抗凋亡Bfl-l在氨基酸147-175處包含獨(dú)特的兩親性尾錨定肽(ATAP)。如本文所述，Bfl-lATAP包含帶電荷的氨基酸，其線(xiàn)性連接于(liningto)(x-螺旋的一側(cè)。在人基因組中，同源ATAP序列存在于另一種腫瘤抑制基因中，即人子宮頸癌抑制基因-l(HCCS-l)。在HCCSl的N端的另外的線(xiàn)粒體靶向信號(hào)(MTS)有助于其線(xiàn)粒體靶向和凋亡功能。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATAP肽能夠調(diào)節(jié)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，ATAP肽可以適合用于高效治療劑以治療多種疾病，包括細(xì)菌感染、癌癥以及增生。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及用于在耙細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明涉及令人意外的和意想不到的發(fā)現(xiàn)，即在原核細(xì)胞中以及在真核細(xì)胞中兩親性尾錨定肽(ATAP)是細(xì)胞凋亡的強(qiáng)效刺激劑。在真核細(xì)月包中ATAP能夠特異性地靶向線(xiàn)粒體并豫導(dǎo)凋亡。ATAP的凋亡i秀導(dǎo)活性表明，這些肽可以用作研究和i貪斷工具以及用于治療各種疾病和病癥的治療劑。此外，同樣驚人和意想不到的是，本發(fā)明的ATAP肽表現(xiàn)出強(qiáng)殺菌活性。因此，本發(fā)明的ATAP核酸和多狀也可以用于治療一系列細(xì)菌感染。如在本文中所《吏用的，"凋亡"用于泛指細(xì)胞死亡，真核以及原核細(xì)胞(死亡)。在某些方面，本發(fā)明包括ATAP核酸、包含ATAP核酸的核酸載體、宿主細(xì)胞、ATAP抗體、重組ATAP肽和蛋白質(zhì)、假肽(pseudopeptide)、融合蛋白、4匕學(xué)4匕合物、以及用于生產(chǎn)和應(yīng)用它們的方法。一方面，本發(fā)明涉及包含通式(I):bXaXbuunnunnanXGbnXann(X)L6nn(X)o-2b(I)的ATAP肽的組合物。其中，！1=非極性(疏水)氨基酸；X-任何一種氨基酸；u—及性、不帶電荷的氨基酸；b-堿性氨基酸；3=酸性氨基酸。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括核酸，其包含編碼化學(xué)式I的ATAP的區(qū)域。在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括多肽，其由肽合成儀合成，其中該多肽包含化學(xué)式I的ATAP。在其他的某些方面，本發(fā)明涉及用于在耙細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的組合物和方法。在某些示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明包括，通過(guò)例如體內(nèi)、體夕卜(invitro)、或離體回凈lr(exvivo)的方>去*會(huì)予有歲丈量的用于在細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的本發(fā)明的治療性組合物。本文還描述了用于治療與細(xì)力包高度增殖有關(guān)的疾病或病癥(例如，癌癥或增生；細(xì)菌感染；或免疫紊亂)的方法，該方法包括給予對(duì)其需要的受試者治療有承丈量的編石馬ATAP的纟亥酸、或ATAP本身以及藥用載體。以上僅通過(guò)舉例方式給出一般的應(yīng)用領(lǐng)域，并不是要用來(lái)限制本發(fā)明披露內(nèi)容和所附權(quán)利要求的范圍。根據(jù)本發(fā)明的權(quán)利要求、說(shuō)明書(shū)、以及實(shí)施例，本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員將理解本發(fā)明的另外的目的和優(yōu)點(diǎn)，并且其顯然包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。圖1.兩親性尾錨定肽(ATAP)在Bfll和HCCS1中是保守的(參見(jiàn)SEQIDNO.2、3、以及52)。(A)分別在人染色體15q24.3和15q25.1上的SEQIDNO.l)和(SEQIDNO.54)基因的示意性基因組結(jié)構(gòu)。黑棒表示外顯子，而紅棒表示5CZZ4/和//CCS7基因的保守性外顯子-3。(B)來(lái)自SCLZ4/和/ZCC^基因的外顯子-3序列的比對(duì)。相同的序列以灰色陰影表示而單石咸基間隙(basegap)以黑色陰影表示。終止密碼子為黃色。(C)Bfll和HCCS1的TA區(qū)的一級(jí)序列比4交。水平紅4奉表示Bfll和HCCS1的ATAP序列。綠線(xiàn)表示預(yù)測(cè)的a-螺旋區(qū)。藍(lán)線(xiàn)表示HCCS1的線(xiàn)粒體輩巴向信號(hào)(MTS)。(D)Bfll和HCCS1的ATAP序列的螺旋輪示圖。(E)來(lái)自人抗凋亡Bcl2家族蛋白和Al、人Bfll的小鼠同源物、以及ATAP序歹'K參見(jiàn)SEQIDNO.2-7)的TA區(qū)的氨基酸序列比對(duì)。F-G:HEK293細(xì)胞的FLAG-TA誘導(dǎo)的半胱天冬斷半胱天冬蛋白酶，caspase)依賴(lài)性細(xì)胞死亡的瞬時(shí)表達(dá)。在沒(méi)有或有50泛半胱天冬酶(泛半月光天冬蛋白酶，pan-caspase)抑制劑，OPH的情況下，用1.0|ng指定的表達(dá)質(zhì)粒和0.1|ug的pCMV-|3-gal共轉(zhuǎn)染細(xì)月包。共轉(zhuǎn)染24小時(shí)以后，用碘化丙啶(PI)對(duì)細(xì)胞染色并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)測(cè)(F)。通過(guò)相對(duì)于用FLAG模擬品(mock)和pCMV-(3-gal報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞的p-半乳糖普酶活性來(lái)測(cè)量細(xì)胞活力(cellviability)(G)。H:使用針對(duì)FLAG標(biāo)簽表位的抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法來(lái)確定FLAG-標(biāo)簽蛋白和TA肽的相對(duì)表達(dá)水平。圖2.ATAP-i秀導(dǎo)的凋亡與Bax和Bak活性無(wú)關(guān)。(A)HEK293細(xì)胞的Flag-ATAP誘導(dǎo)的半胱天冬酶依賴(lài)性細(xì)胞死亡的瞬時(shí)表達(dá)。在;殳有或有50OPH的'lt況下，用1才莫擬品或Flag-ATAP表達(dá)質(zhì)粒并用0.1|ig的pCMV-P畫(huà)gal共轉(zhuǎn)染纟田月包。通過(guò)相對(duì)于用模擬質(zhì)粒和pCMV-P-gal報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞的P-半乳糖苷酶活性來(lái)測(cè)量細(xì)胞活力(左邊)。使用針對(duì)Flag標(biāo)簽表位的抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法來(lái)確定Flag-ATAP肽的相對(duì)表達(dá)水平(右邊)。(B,C)以半胱天冬酶依賴(lài)性方式，GFP-ATAP-誘導(dǎo)的凋亡核形態(tài)和亞Gl群體的瞬時(shí)表達(dá)。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，固定GFP-ATAP-轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞，用DAPI染色并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)測(cè)(B)。用指定的表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后18小時(shí)，收集細(xì)胞、固定、然后用PI染色。然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析GFP-陽(yáng)性細(xì)胞的DNA含量(C)。(D)各種癌細(xì)胞中GFP-ATAP豫導(dǎo)的急性細(xì)胞死亡的瞬時(shí)表達(dá)，這些癌細(xì)胞包括HEK293、HeLa、半胱天冬酶-3缺陷型MCF-7細(xì)胞以及BMKD3細(xì)胞，其源自敲除Bax和Bak基因的新生小鼠的腎臟。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，通過(guò)PI排除(PIexclusion)測(cè)量細(xì)胞存活。圖中示出獲自HEK293細(xì)胞的典型圖像。(E)通過(guò)PI-陰性細(xì)胞與總GFP-陽(yáng)性細(xì)胞的比率來(lái)確定存活細(xì)胞的百分比。對(duì)來(lái)自三個(gè)不同領(lǐng)域的約300個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分。數(shù)據(jù)表示為平均值士s.e.，棒，lOjmi。10圖3.ATAP的促凋亡活性要求兩親性。(A)GFP-ATAP構(gòu)建體(SEQIDNO.45-51)的示意性圖示，其中點(diǎn)突變被引入ATAP的疏水富集(hydrophobicrich,HR)區(qū)。(B)在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在用1的GFP-ATAP突變構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中通過(guò)PI排除測(cè)量細(xì)胞存活。(C)Flag-mHR3肽顯示出降低的促凋亡活性。用0.1的pCMV-P-gal報(bào)告質(zhì)粒和1jug的Flag-ATAP或Flag-mHR3表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)月包。在共轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，通過(guò)(3-半乳4唐芬酶活性來(lái)測(cè)量細(xì)胞活力(左邊)。使用針對(duì)Flag標(biāo)簽表位的抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法來(lái)確定Flag-標(biāo)簽肽的相對(duì)表達(dá)水平(右邊)。(D)在HCCS1的凋亡功能中涉及ATAP的兩親特性。用0.1|ug的pCMV-P-gal才艮告質(zhì)粒和1.0的HCCSl-GFP或HCCS1-GFP(E46Q/E53Q)(包含對(duì)應(yīng)于BfllATAP的mHR3突變)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。共轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，通過(guò)P-半乳4唐香酶活性來(lái)測(cè)量細(xì)力包活力。lt據(jù)表示為平均值士s.e.。圖4.ATAP的促凋亡活性涉及靶向線(xiàn)粒體。(A)GFP-ATAP構(gòu)建體(參見(jiàn)SEQIDNO.38-44)的示意性表示，其中點(diǎn)突變被引入ATAP的側(cè)翼區(qū)(flankingregion)。(B)在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在用1GFP-ATAP突變構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中，通過(guò)PI排除來(lái)測(cè)量細(xì)胞存活。(C)融合于GFP的ATAP突變體的亞細(xì)胞定位。用0.5jug指定的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)月包。在有50OPH的情況下進(jìn)4亍細(xì)胞培養(yǎng)，以防止快速細(xì)月包死亡。轉(zhuǎn)染后18小時(shí)，在包含50nMMitoTracker的培養(yǎng)基中孵育細(xì)月包兩小時(shí)，然后利用4%多聚曱醛進(jìn)行固定。利用共聚焦顯微鏡術(shù)來(lái)觀(guān)測(cè)GFP融合蛋白的定位。棒，10pm。(D)GFPATAP突變體對(duì)凋亡的細(xì)胞效果。用指定的質(zhì)并立瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，其中指定的質(zhì)粒表達(dá)融合于GFP的ATAP突變體。轉(zhuǎn)染后18小時(shí)，富集細(xì)胞、固定、然后用PI染色。然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析GFP-陽(yáng)性細(xì)胞的DNA含量(上圖)。通過(guò)在2%瓊脂糖凝膠上的電泳還分析了DNA片段(下圖)。SM,100bp的階梯尺寸(laddersize)標(biāo)記。(E)GFP-ATAP和GFP-ATAP突變體對(duì)HEK293細(xì)月包的時(shí)間過(guò)禾呈的影響(time-courseeffect)。在用1jagGFP-ATAP突變構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中，通過(guò)PI排除來(lái)測(cè)量細(xì)胞存活。圖5.MTS和ATAP均與HCCS1i秀導(dǎo)的線(xiàn)沖立體革巴向凋亡有關(guān)。(A)HCCS-1的GFP融合蛋白及其缺失突變體的示意性圖示。(B)GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位。用0.5pg指定的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。在有50pMOPH的情況下，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后18小時(shí)，在包含50nMMitoTracker的培養(yǎng)基中聘育細(xì)月包兩小時(shí)，然后利用4%多聚曱醛加以固定。利用共焦顯微鏡術(shù)觀(guān)測(cè)GFP融合蛋白的定位。棒，10jum。(C)在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在用1GFP融合構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中，通過(guò)PI排除來(lái)測(cè)量細(xì)胞存活。圖6.在平面脂雙層中，ATAP誘導(dǎo)線(xiàn)粒體月莫電位的損失并干擾膜通透性。(A)GFP-ATAP對(duì)線(xiàn)粒體膜電位的影響。利用MitoTrackerRed(CM-H2TMRos)染料觀(guān)測(cè)線(xiàn)粒體外膜電位。用GFP-ATAP、GFP-mHR7或GFP-TAxL轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)月包并在有50OPH的情況下進(jìn)4亍培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在包含50nMMitoTracker的i咅養(yǎng)基中孵育細(xì)胞兩小時(shí)，然后在熒光顯孩i鏡下進(jìn)行觀(guān)測(cè)。棒，10jum。(B)用來(lái)自三個(gè)不同的i或(或場(chǎng)，field)中的約300個(gè)GFP卩日性細(xì)胞量化綠色(GFP)和紅色(MitoTracker)雙陽(yáng)性細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示為平均值土s.e.。(C)ATAP對(duì)細(xì)胞色素c釋放的影響。左圖，用1的pEGFP(泳道1)、pEGFP-ATAP(泳道2)或pEGFPmHR7(泳道3)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)月包。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法^f吏用抗細(xì)月包色素c抗體分析20|tig線(xiàn)粒體游離細(xì)月包溶月交蛋白。右圖，用合成的ATAP和mHR7肽(100juM)孵育分離自BMK-D3細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜。ATAP誘導(dǎo)細(xì)胞色素c釋放進(jìn)入上清(S)，而細(xì)胞色素c保留在用mHR7和DMSO(作為對(duì)照)處理的制劑中的沉淀物(P)中。(D)合成ATAP和mHR7肽對(duì)平面脂雙層的膜通透性的影響。將肽(ll.lpM)力口入一邊的室(chamber)中。通過(guò)記錄200mMKC1(這邊)和50mMNaCl(另一邊)的;容液來(lái)測(cè)量在相應(yīng)〗呆持電位的電流專(zhuān)九跡(Currenttraces)。對(duì)于A(yíng)TAP,數(shù)據(jù)表示"=5，以及對(duì)于mHR7，凄t據(jù)表示">35。圖7.it明TA的促凋亡活性的示意圖。源自Bfl-l的TA結(jié)構(gòu)域可以借助于特定的胞內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制通過(guò)耙向線(xiàn)粒體外膜(MOM)來(lái)誘導(dǎo)凋亡。在尾錨定(TA)序列中部，帶電荷殘基的存在給予跨膜節(jié)段兩親螺旋特點(diǎn)，并可能與線(xiàn)粒體膜電位的干擾有關(guān)。(TC-易位復(fù)合體)。具體實(shí)施例方式如本文所描述的，ATAP肽和多肽能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此，ATAP基因表達(dá)、多肽合成、活性或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用^表一種新的治療性干預(yù)，用于疾病和病癥相關(guān)的功能失常的細(xì)胞增殖和細(xì)菌感染。在某些方面，本文的描述涉及PCT/KR2004/001324(WO2004/110474)、Yangetal.，《/Ce〃.5/oc/;ew.，94:1234-1247(2005)、以及Koetal.,/Ce〃5W"Aug.15;120(16):2912-23的主題，出于本發(fā)明提供了新的多核苷酸以及由其編碼的包含兩親性尾錨定肽ATAP的多肽。核酸序列在本文中統(tǒng)稱(chēng)為"ATAP核酸"或"ATAP多核苷酸"而相應(yīng)的編石馬多肽可互換J也稱(chēng)作"ATAP多肽"、"ATAP肽"、"ATAP蛋白質(zhì)"、"包含ATAP的多肽"或"包含ATAP的蛋白質(zhì)"。除非另有說(shuō)明，"ATAP"意指本文中教導(dǎo)或提示的任何一種新的核酸或肽序列。"ATAP結(jié)合蛋白"、以及"ATAP受體"蛋白是指這樣的肽或蛋白質(zhì)，其包含對(duì)兩親性尾錨定肽(ATAP)的結(jié)合位點(diǎn)，其中兩親性尾錨定肽包括其結(jié)構(gòu)域、融合蛋白、嵌合體、或片段。13如在本文中所z使用的，"ATAP受體基因"或"ATAP受體結(jié)構(gòu)基因"包括ATAP受體基因的5'UTR、3'UTR、啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列、內(nèi)含子和外顯子DNA、以及ATAP受體基因mRNA或cDNA序列。包括Bcl-2家族成員的尾錨定(TA)蛋白質(zhì)通過(guò)在羧基(C)末端的單疏水節(jié)段特征性地束縳于磷脂雙層，其中分子的大部分位于胞質(zhì)溶液中。因?yàn)锽cl-2蛋白的凋亡功能與它們革巴向ER或MOM相關(guān)聯(lián)，因此理解構(gòu)成它們的亞細(xì)胞分布基礎(chǔ)的分子機(jī)制是目前凋亡研究的主要工作重點(diǎn)。Bfl-l是人抗凋亡Bcl-2家族蛋白，其保護(hù)細(xì)胞免于各種凋亡刺激，其包括TNF死亡受體的激活作用、化療藥物的治療、以及Bax或Bid的過(guò)度表達(dá)。如本文所述，Bfl-l是雙功能的，因?yàn)镋GFP融合于Bfl-l的氨基(N)末端可將Bfl-l的抗凋亡特性轉(zhuǎn)化成強(qiáng)效促凋亡分子，其靶向線(xiàn)粒體依賴(lài)性凋亡途徑。然而，在本描述之前，導(dǎo)致Bfl-l的雙功能能力的分子才幾制并不知道。線(xiàn)粒體外膜(MOM)靶向尾錨定(TA)區(qū)經(jīng)常包含一個(gè)短疏水結(jié)構(gòu)域，該疏水結(jié)構(gòu)域在兩端臨近由若干帶正電荷的氨基酸。Bfl-l靶向于MOM似乎涉及TA結(jié)構(gòu)域，因?yàn)樵贑末端17個(gè)氨基酸的缺失引起B(yǎng)fl-l遠(yuǎn)離線(xiàn)粒體的錯(cuò)誤靶向。此外，Bfl-lS，Bfl-l的一種可替換剪接變體，具有不同的C端結(jié)構(gòu)域，定位于細(xì)胞核。因?yàn)锽fl-lTA結(jié)構(gòu)域在疏水節(jié),殳內(nèi)包含三個(gè)帶電荷殘基，其可作為穩(wěn)、定插入膜環(huán)境的屏障，所以廣泛認(rèn)為Bfl-l的羧基末端不可能起真正的TA的4乍用。本文提供的描述和實(shí)施例證明了源自Bfl-l的TA結(jié)構(gòu)域的短肽(即ATAP)的驚人和意想不到的MOM靶向和強(qiáng)效促凋亡活性(參見(jiàn)圖1)。帶正電荷的賴(lài)氨酸殘基(K147和K151)導(dǎo)致ATAP靶向于MOM，并且ATAP的促凋亡活性似乎需要TA的兩親性。因此，一方面，這種短肽可以用作有用的探針，說(shuō)明構(gòu)成線(xiàn)粒體依賴(lài)性凋亡途徑起始的基礎(chǔ)分子事4牛。另一方面，ATAP肽還可以用作潛在的治療劑，用于治療增生性病癥，例如，癌癥。如上所述，抗凋亡Bcl-2成員在其C端包含特征性TA基序，包括^危7jc的TMS(l8或19個(gè)氨基酸)和兩個(gè)旁側(cè)區(qū)(FR-1和FR-2)(包含保守的賴(lài)氨酸殘基)。不同于其他成員，來(lái)自Bfl-l的TA包含在TMS中部的帶電荷殘基，其產(chǎn)生獨(dú)特的兩親結(jié)構(gòu)。一種類(lèi)似的ATAP序列可以形成在另一種基因中，HCCS1，其通常與bcl2基因家族無(wú)關(guān)。HCCS1，一種最近鑒定的腫瘤抑制基因，其細(xì)^I包功能還有^f寺確定(Kim等，2002)。HCCS1的基因組序列緊靠第15號(hào)染色體上的Bfll的基因組序列而定位。除ATAP之外，HCCS1還包含在N端的新的MTS。因?yàn)槿鄙費(fèi)TS的HCCS1可以革巴向線(xiàn)粒體并"i秀導(dǎo)半胱天冬酶依賴(lài)性細(xì)胞死亡，因此表明ATAP有助于HCCS1的固有線(xiàn)粒體耙向性。除線(xiàn)粒體耙向之外，我們還觀(guān)測(cè)到，ATAP的促凋亡活性隨Bfll和HCCSl中相應(yīng)帶電荷殘基的突變而發(fā)生平4亍變4b。我們的結(jié)果表明，ATAP的促凋亡功能在Bfll和HCCS1中是保守的。因此，一方面，本發(fā)明涉及包含通式I的ATAP肽的組合物bXaXbuunnunnanXGbnXann(X)!—6nn(X)?！?b(I)。其中，"=非極性(疏水)氨基酸；義=任何一種氨基酸；"=極性、不帶電荷的氨基酸；6=堿性氨基酸；以及a-酸性氨基酸。另一方面，本發(fā)明涉及包含通式(II)的ATAP肽的組合物(K/R)n(E/D)(P)(K/R)SGW(M/L)(S/T)FL(E/D)nTG(K/R)I(X)(E/D)ML(X)mLL(XV2(K/R)(11)。其中"、X，、w、6、以及"如上文所定義。如在本文中所使用的，堿性氨基酸包括組氨酸、精氨酸、以及賴(lài)氨酸；酸性氨基酸包括天冬氨酸、以及谷氨酸；非極性(疏水)氨基酸包括苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、曱硫氨酸、異亮氨酸、色氨酸、脯氨酸、以及纈氨酸；極性、不帶電荷氨基酸包括半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、絲氨酸、酪氨酸、以及蘇氨酸。在這里，我們證明了ATAP肽呈現(xiàn)強(qiáng)效促凋亡活性，其來(lái)自?xún)蓚€(gè)保守的功能基序，一個(gè)基序允許靶向線(xiàn)粒體膜而另一個(gè)基序提供對(duì)肽的兩親性。ATAP可以誘導(dǎo)線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換并用作凋亡的強(qiáng)效刺激劑。雖然所有抗凋亡Bcl2成員在其C端包含TA特征性基序，但Bfll和HCCS1的ATAP是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼈冊(cè)谑杷患瘏^(qū)的中部包含三個(gè)帶電荷殘基，因此具有兩親特性。29個(gè)氨基酸的ATAP足以將報(bào)告分子(EGFP)定位在線(xiàn)粒體上。我們的結(jié)果揭示了側(cè)翼區(qū)(旁側(cè)區(qū)，flankingregion)內(nèi)的三個(gè)堿性氨基酸決定靶向線(xiàn)粒體的特存在于細(xì)胞質(zhì)中。此夕卜，在FR-1和FR-2內(nèi)三個(gè)賴(lài)氨酸殘基的突變導(dǎo)致來(lái)自線(xiàn)粒體的TA的完全錯(cuò)誤定位(接頭-mFR-7)。先前，Bfll的ATAP已凈皮排除作為真正的TA,這是基于帶電荷殘基的存在作為肽穿透和分配到脂雙層力莫的屏障(CoryandAdams,2002;Grossetal.,1999)。在這里，我們i正明了，ATAP足以將報(bào)告分子(GFP)定位在線(xiàn)粒體。我們的結(jié)果進(jìn)一步揭示了，在FR-1和FR-2區(qū)(圖l)內(nèi)的三個(gè)石威性殘基，例如，賴(lài)氨酸或精氨酸，對(duì)于耙向線(xiàn)粒體是關(guān)鍵的。在所有已知尾錨定蛋白質(zhì)(包括抗凋亡Bcl-2家族蛋白)中，來(lái)自Bfl-1和HCCS-1的TMS的兩親性是獨(dú)特的。有趣的是，在Bfll旁側(cè)區(qū)內(nèi)沒(méi)有堿性殘基的情況下，包含相鄰于TA的N端的石咸性殘基的外側(cè)序歹ll(externalsequence)也可以起用于線(xiàn)4立體輩巴向的^f叚旁側(cè)區(qū)(pseudo-flankingregion)的4乍用。這i兌明在A(yíng)TAP的N端的堿性殘基的位置對(duì)有效的線(xiàn)粒體耙向來(lái)說(shuō)是必需的。位于疏水富集(HR)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的帶電荷殘基對(duì)ATAP的促凋亡活性來(lái)說(shuō)是必需的。不受限于任何特定理論，本發(fā)明的發(fā)明人提出，這些帶電荷的氨基酸(在BfllATAP中的E159、K163以及E166;以及在HCCS1ATAP中的E46、K50、以及E53)與寡聚化有關(guān)，并且也許與干擾線(xiàn)粒體膜完整性的水相孔道(aqueouspore)的形成有關(guān)(參見(jiàn)圖1和圖7)。此外，本發(fā)明的發(fā)明人假定，帶電荷殘基(例力口，E159、K163以及E166)，其面向ot-螺、i走的一側(cè)，可參與？K才目離子傳導(dǎo)孔道的形成，因此，干擾線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換。這得到我們以下發(fā)現(xiàn)的支持ATAP肽可以改變重建脂雙層的離子通透性。我們具有廣泛的數(shù)據(jù)表明，Bfl-lATAP本身可能導(dǎo)致強(qiáng)效促凋亡活性，因?yàn)樵谏?匕、細(xì)月包生物和成i象分4斤中，用FLAG-TA和EGFP-TA觀(guān)測(cè)到類(lèi)A乂歲文應(yīng)。利用脂雙層重建系統(tǒng)，我們^〖正明了，合成野生型ATAP肽對(duì)脂雙層膜的陽(yáng)離子通透性產(chǎn)生顯著影響，而突變體mHR7肽可以結(jié)合于線(xiàn)粒體膜但對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，并不影響脂雙層膜的傳導(dǎo)性。在離體系統(tǒng)中ATAP介導(dǎo)的通透性變化并不呈現(xiàn)依據(jù)成孔通道可預(yù)期的典型的穩(wěn)定的傳導(dǎo)特性。ATAP可以與預(yù)先存在的通道相互作用或調(diào)節(jié)預(yù)先存在的通道以改變線(xiàn)粒體膜通透性，或潛在地Bfll或HCCS1蛋白的其他結(jié)構(gòu)域可以有助于體內(nèi)觀(guān)測(cè)到的膜通透性的改變。已知觸發(fā)線(xiàn)粒體凋亡的兩種一般類(lèi)型的肽目前正在進(jìn)^于作為潛在癌癥治療劑的臨床試驗(yàn)。一種類(lèi)型是兩親性肽，其包含高含量的衍生自抗菌肽的石威性殘基(Chenetal.,2001;Ellerbyetal.,1999;Maietal.，2001)。這些肽革巴向線(xiàn)粒體是依靠肽中帶正電荷的殘基與帶負(fù)電荷的線(xiàn)粒體膜脂之間的靜電相互作用。在靶向線(xiàn)粒體膜以后，這些肽破壞線(xiàn)粒體功能并通過(guò)脂膜變形或在線(xiàn)粒體膜中形成孔而引起細(xì)月包色素c釋》文。這種才幾制可以類(lèi)似于它們?cè)趲ж?fù)電荷的細(xì)菌膜上的抗樣吏生物功能(ShaiandOren，2001)。然而，因?yàn)檫@些肽的細(xì)胞毒活性取決于肽的高細(xì)胞內(nèi)濃度(由于靶向線(xiàn)粒體的效率低)，所以必須最大化它們靶向癌細(xì)胞的特異性以實(shí)現(xiàn)有效的臨床應(yīng)用。其他類(lèi)型的肽是那些源自?xún)HBH3促凋亡Bd2家族蛋白如Bad和Bid(Letaietal"2002;Schimmeretal"2001;Walenskyetal.，2004)的肽。Bid的BH3肽可以直4^結(jié)合于促凋亡Bax和Bak以激活它們，乂人而"i秀導(dǎo)凋亡，或可以結(jié)合于纟元凋亡Bcl2和Bcl-xL以防止它們抑制Bax和Bak(Letaietal.,2002)。最近的研究表明，源自Bid的穩(wěn)定BH3肽可以特異性地誘導(dǎo)若干白血病細(xì)胞的凋亡，這突出了它們的治療潛力(Walenskyetal.,2004)。然而，促凋亡蛋白的下調(diào)和/或抗凋亡蛋白的上調(diào)經(jīng)常向癌細(xì)胞纟是供對(duì)于凋亡療法的抗性才幾制。因?yàn)槿L(zhǎng)Bfll和HCCS1具有相反的功能，一種是抗凋亡而另一種是促凋亡，所以引起關(guān)注的是，在各種組織中觀(guān)測(cè)它們的表達(dá)水平?？色@得的mRNA微陣列數(shù)據(jù)和EST表達(dá)鐠的分析揭示了在才企查的19種組織的16種組織中5C丄Z47和//CC^的表達(dá)是互斥的，這提示在細(xì)力包增殖和再生中它們可能具有互補(bǔ)的組織特異性功能。有趣的是，發(fā)現(xiàn)僅淋巴結(jié)和腎臟包含Bfll和HCCS1的高水平轉(zhuǎn)錄物。該結(jié)果4是示，Bfll可能與作為促凋亡因子的HCCS1共有類(lèi)似的生物功能，以根據(jù)在淋巴結(jié)和腎臟的細(xì)胞狀態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)凋亡的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。為了支持此4叚i殳，Kucharczak等(Kucharczaketal.，2005)發(fā)現(xiàn)，在FL5.12pro-B細(xì)月包系(^且B細(xì)月包系)中，響應(yīng)TNFa的刺;敫并通過(guò)蛋白7K解哞爭(zhēng)4匕(proteolyticturnover),Bfll可以謬皮專(zhuān)爭(zhēng)4b成促凋亡因子，這表明發(fā)生在淋巴結(jié)中的B細(xì)胞選擇過(guò)程中可以涉及Bfll的促凋亡活'l"生。為了試圖才企查HCCS1的腫瘤抑制劑功能，我們4吏用RT-PCR來(lái)檢查/7CCS7在正常人組織(包括肺、乳腺以及子宮頸)、以及在各種已成熟建立的癌細(xì)月包系中的表達(dá)水平。為了區(qū)分/ZCCS7和5CZZ4/轉(zhuǎn)錄物，我們使用對(duì)于FCCS7和SCZZ4/的外顯子1區(qū)特異的引物乂于。在正常肺、乳尿泉以及子宮頸《且織中，；險(xiǎn)測(cè)到豐富的//CCS7產(chǎn)物，而SC丄Z^產(chǎn)物則顯著缺乏，其與微陣列數(shù)據(jù)一致，這表明這些組織包含豐富水平的HCCS1而不是Bfll。有趣的是，在6個(gè)乳&，癌細(xì)月包系中有兩個(gè)，例如MDA-MB231和MDA-MB435,檢測(cè)到//CCW的非常低的表達(dá)水平，這表明HCCS1在胂瘤發(fā)生中可能的作用。引人注意的是，HeLa-子宮頸癌細(xì)胞系-也呈現(xiàn)降低的HCCS1的表達(dá)。HCCS1的下調(diào)是否直接與癌細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)、HCCS1的靶向改變是否在其促凋亡功能中發(fā)揮作用，需要進(jìn)一步加以片企觀(guān)。我們的結(jié)果表明，ATAP還可以作為強(qiáng)效抗生素。當(dāng)達(dá)到高水平的表達(dá)時(shí)，在大腸桿菌中ATAP的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞溶解。這表明，ATAP的兩親能力不4又可以破壞MOM的滲透性，而且還可以在具有類(lèi)似脂質(zhì)組成的細(xì)菌膜中產(chǎn)生類(lèi)似效應(yīng)。通常，由于膜組成的差異，真核細(xì)胞質(zhì)膜將不會(huì)受到這些類(lèi)型肽的影響。因此，ATAP作為抗菌劑具有有益的應(yīng)用，其可以用來(lái)治療整個(gè)身體的各種細(xì)菌感染。另外，因?yàn)檫@似乎是膜通透性的物理石皮壞，所以這種抗生效應(yīng)將較少可能導(dǎo)致抗生素抗性，抗生素抗性可能常常由于使用靶向代i射途徑的抗生素而導(dǎo)致。ATAP肽可以用作治療癌癥、增生、以及細(xì)菌感染的強(qiáng)歲文劑。ATAP與陽(yáng)離子抗菌肽的區(qū)別在于主動(dòng)和特異性地靶向線(xiàn)粒體膜(在真核細(xì)胞中)。ATAP不同于BH3肽，這是由于它與線(xiàn)粒體膜直接相19互作用，不需要Bcl2家族蛋白的參與?？沟蛲鯞cl-xL不能阻斷ATAP誘導(dǎo)的凋亡，因此ATAP的促凋亡功能不需要Bax或Bak的促凋亡活性。因此，ATAP具有潛力來(lái)克服癌細(xì)胞對(duì)通過(guò)Bc12家族蛋白的表達(dá)水平改變所產(chǎn)生的凋亡刺激的抗性。本文中我們描述了新的策略來(lái)開(kāi)發(fā)4吏用ATAP序列的癌癥治療劑，其中ATAP序列可以特異性地革巴向線(xiàn)粒體以石皮壞線(xiàn)4立體膜完整性。因此，用于治療增生性病癥或細(xì)菌感染的新方式采用了ATAP及其促凋亡突變體。雖然不受限于任何特定理論，但數(shù)據(jù)支持在破壞線(xiàn)粒體膜電位以及誘導(dǎo)凋亡中ATAP的直接作用(至少在真核細(xì)胞中)。該模型得到兩個(gè)關(guān)鍵證據(jù)的支持。首先，雖然在Bfl-lTMS中部的兩個(gè)帶負(fù)電荷的殘基(E159和E166)對(duì)于Bfl-lTA的促凋亡活性是重要的，但具有帶正電荷殘基(E159K/E166K)的mHR5也具有與野生型TA相當(dāng)?shù)膹?qiáng)效促凋亡活性(圖3和圖5)。這意p未著對(duì)于Bfl-lTA的促凋亡活性起關(guān)鍵作用的是TMS的兩親性，而不是E159和E166殘基與其他分子間氨基酸殘基的特定的電荷相互作用。其次，在我們?cè)噲D產(chǎn)生細(xì)菌表達(dá)重組TA時(shí)，我們使用了兩種細(xì)菌TA表達(dá)載體。在兩種情況下，我們均觀(guān)測(cè)到Bfl-lTA肽的表達(dá)對(duì)于大腸桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)是有毒性的(數(shù)據(jù)未示出)。因?yàn)閬?lái)自革蘭氏陰性菌如大腸桿菌的膜包含高含量的非常像線(xiàn)粒體膜的帶負(fù)電荷的脂質(zhì)，所以TA的毒性作用可能來(lái)自對(duì)脂膜的直接作用。這些結(jié)果一起表明這樣的可能性，即在乾向MOM以后ATAP肽可以直"f妄損傷MOM的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的ATAP與源自目前已知的抗菌肽的陽(yáng)離子兩親肽的區(qū)別在于主動(dòng)和特異性地耙向MOM。此外，ATAP與BH3肽的區(qū)別在于它對(duì)MOM的直接毒性作用，其并不需要與Bcl-2家族蛋白的相互作用?？沟蛲鯞cl-xL和Bfl-l不能阻斷由Bfl-lTAi秀導(dǎo)的凋亡并且ATAP促凋亡活性并不需要Bax或Bak的促凋亡活性(圖2)。因此，ATAP具有克月良癌細(xì)胞對(duì)通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家力矣蛋白的水平所產(chǎn)生的凋亡刺激的抗性的潛力，并且還具有克"艮細(xì)菌對(duì)目前已知類(lèi)型的抗生素(例如，糖香類(lèi)、孢菌素類(lèi)(sporins)、糖肽類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、磺胺類(lèi)等)的耐藥性問(wèn)題的潛力。因此，本發(fā)明提供了一種新方法來(lái)開(kāi)發(fā)使用了促凋亡ATAP肽的癌癥治療肽，其中促凋亡ATAP肽可以特異性地耙向線(xiàn)粒體并石皮壞線(xiàn)粒體力莫完整性。此外，包含多肽的ATAP可以單獨(dú)或與現(xiàn)有的抗菌劑聯(lián)合用作抗菌藥。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的包含ATAP肽的多肽組合物總長(zhǎng)度為約25個(gè)氨基酸至約300個(gè)氨基酸。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的包含ATAP肽的多肽組合物總長(zhǎng)度為約26至約100、90、80、70、60、50、40、或30個(gè)氨基酸。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的ATAP核酸分子，該ATAP核酸分子編碼ATAP多肽，其包括一種核酸序列，該核酸序列與在SEQIDNO:37或59中所4皮露的核酸具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的同一'I"生。在某些實(shí)施方式中，分離的ATAP核酸分子將在嚴(yán)才各條件下雜交于一核酸序列，該核酸序列互補(bǔ)于包括ATAP核酸序列的蛋白質(zhì)編碼序列的核酸分子。本發(fā)明還包括一種分離的核酸，其編碼ATAP多肽、或其片l殳、同系物、類(lèi)似物、融合蛋白、Wi肽、擬肽或衍生物。例如，該核酸可以編碼與來(lái)自Bfl-l或HCCS1的ATAP區(qū)具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%同一性的多肽。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽包括SEQIDNO:36、38-51、53中的至少一種肽或它們的組合。本發(fā)明考慮的核酸可以是，例如，基因組DNA片段或cDNA分子，其包含與來(lái)自Bfl-l或HCCS1的ATAP區(qū)(SEQIDNO,37和59)具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%同一性的核酸序列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸包括SEQIDNO:37和59中的至少一種的多核苦酸。本發(fā)明還包括寡核苷酸，例如，包含ATAP核酸(例如，SEQIDNO:37或59)的至少6個(gè)連續(xù)一亥苦酸的寡一亥苦酸、或所述寡4亥苷酸的互^卜體(complement)。本發(fā)明還包括基本上純化的ATAP多肽，例如，通式I的ATAP肽bXaXbuurmurmanXGbnXann(X)j-6rm(X)0-2b(I)。其中，"=非極性(疏水)氨基酸；1=任何一種氨基酸；"=極性、不帶電荷的氨基酸；6=堿性氨基酸；以及"=酸性氨基酸。在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括SEQIDNO:36、38-51、53的ATAP肽或它們的組合。在某些實(shí)施方式中，ATAP多肽包括一種氨基酸序列，其基本上與人Bfl-l或HCCSlATAP多肽的氨基酸序列對(duì)目同。本發(fā)明的抗體的特征還在于免疫選擇性地結(jié)合于A(yíng)TAP多肽、或其片羊殳、同族物、類(lèi)似物、,i肽、擬肽或衍生物。另一方面，本發(fā)明包括藥物組合物，該藥物組合物包括治療或預(yù)防有效量的治療用核酸、多肽、以及藥用載體。治療劑可以是，例如，ATAP核酸，例如，肽核酸、cDNA、或RNA,如抑制性小RNA(smallinhibitoryRNA);ATAP多肽；或?qū)τ贏(yíng)TAP多肽特異的抗體。另一方面，本發(fā)明包4舌在一個(gè)或多個(gè)容器中的治療或預(yù)防有效量的上述藥物組合物。另一方面，本發(fā)明包括在允許表達(dá)由DNA編碼的ATAP多肽的條件下通過(guò)培養(yǎng)包含內(nèi)源性或外源表達(dá)ATAP核酸的細(xì)胞以產(chǎn)生多肽的方法。如果需要的i舌，然后可以回j^:ATAP多肽。另外一方面，本發(fā)明包括通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生多肽的方法，其中細(xì)胞包含位于內(nèi)源性、外源性、或異源性啟動(dòng)子上游或下游的外源性ATAP核酸。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)同源重組、《連斷裂或確晉配修復(fù)機(jī)制，將外源性啟動(dòng)子引入宿主細(xì)胞的基因組。在某些實(shí)施動(dòng)子的控制下進(jìn)行。另一方面，本發(fā)明包括編碼ATAP的核酸，其中核酸除編碼ATAP的多核普酸之外還包含這樣的多核苷酸部分，其編碼ATAP抑制劑多肽以致該抑制劑能夠掩蔽ATAP的細(xì)胞毒性作用直到需要的時(shí)刻。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，可以通過(guò)蛋白酶切割位點(diǎn)將抑制性多肽連接于A(yíng)TAP。在細(xì)胞暴露于特定刺激以后，蛋白酶被激活，從而從ATAP多肽釋放抑制性多肽，然后"游離"ATAP多肽能夠在細(xì)胞中i秀導(dǎo)凋亡。在另一實(shí)施方式中，ATAP抑制劑是一種化學(xué)部分，如小分子，其可以類(lèi)似地自ATAP多肽被酶促切割，以使ATAP可以i秀導(dǎo)凋亡。另一方面，本發(fā)明包括才僉測(cè)樣品中ATAP多肽存在的方法。在該方法中，將才羊品與一種化合物4妾觸，該化合物在允"i午多肽和化合物之間形成復(fù)合物的條件下選擇性地結(jié)合于多肽。4企測(cè)上述復(fù)合物(如果存在的話(huà))，/人而鑒定才羊品中的ATAP多肽。本發(fā)明還包括基于A(yíng)TAP核酸、多肽或ATAP融合多肽它們的表達(dá)來(lái)鑒定特異性細(xì)胞或組織類(lèi)型的方法。在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括融合蛋白(其包含"標(biāo)記/標(biāo)簽，，或指示部分(indicatorportion)和ATAP部分)以及只于其進(jìn)行編碼的核酸。在某些方面，標(biāo)記/標(biāo)簽或指示部分可以是適合于純化目的的肽，例如，F(xiàn)LAG標(biāo)簽、6xHis標(biāo)簽等等。在其他方面，標(biāo)簽肽包括適合于提供信號(hào)的肽，如抗體表位或熒光肽。其他方面包括ATAP與適合于介導(dǎo)激活作用、亞細(xì)胞定位或移位穿過(guò)細(xì)胞膜的肽的融合，例如，來(lái)自HIV病毒的TAT融合蛋白。本發(fā)明還包括一種方法，該方法用于通過(guò)使樣品接觸ATAP核酸探針或引物來(lái)檢測(cè)樣品中ATAP核酸分子的存在，以及檢測(cè)核酸:探針或引物是否結(jié)合于樣品中的ATAP核酸分子。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于調(diào)節(jié)ATAP多肽活性的方法，其中通過(guò)使包含ATAP多肽的細(xì)胞樣品接觸足夠量的結(jié)合于A(yíng)TAP多肽的化合物，以調(diào)節(jié)所述多肽的活性。如本文進(jìn)一步描述的，上述化合物可以是，例如，小分子，如核酸、肽、多肽、擬肽、碳水化合物、脂質(zhì)或其他有機(jī)(含碳)或無(wú)機(jī)分子。本發(fā)明還包括在制備用于治療或預(yù)防病癥或綜合征的藥劑中訂夸ATAP用作治療劑的應(yīng)用，其中上述病癥或綜合4正包4舌，例如，心血管病、心月幾病、動(dòng)月永粥才羊石更化、高血壓、先天性心臟缺陷、主動(dòng)脈狹窄、房間隔缺損(ASD)、房室(A-V)管缺損、動(dòng)脈導(dǎo)管、肺動(dòng)脈瓣狹窄、主動(dòng)脈瓣下狹窄、室間隔缺損(VSD)、瓣膜病、高凝、血友病、潰瘍、傷口、損傷、切口、磨損癥、氧化損傷、與年齡有關(guān)的組織變性、手術(shù)相關(guān)損傷、燒傷、肌肉無(wú)力、肌萎縮、結(jié)締組織病、特發(fā)性血小板減少性紫瘋、心力衰竭、由心力衰竭和高血壓引起的繼發(fā)性病理特征、低血壓、心絞痛、心肌梗死、結(jié)節(jié)性硬化、硬皮病、移一直、自身免疫病、紅斑纟良皰、病毒/細(xì)菌/寄生性感染、多發(fā)性硬化、自身免疫病、變態(tài)反應(yīng)、免疫缺陷、移植物抗宿主病、哮喘、氣腫、ARDS、免疫應(yīng)答的炎癥和調(diào)節(jié)、病毒性發(fā)病4幾制、衰老相關(guān)疾病、Thl炎性疾病如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、炎性腸病、AIDS、傷口修復(fù)、心肌梗死、心力衰竭、月幾營(yíng)養(yǎng)不良、褥癡、辟唐尿病性潰瘍、氧化損傷、以及組織損傷如鼻竇炎或粘力莫炎、皺紋、濕滲或皮炎、皮月夫干燥、肥胖癥、糖尿病、內(nèi)分泌病、厭食癥、貪食癥、腎動(dòng)脈狹窄、間質(zhì)性腎炎、腎小球腎炎、多囊腎病、系統(tǒng)性、腎小管性酸中毒、IgA腎病、腎臟病、高鈣血癥、萊-尼綜合征、希-林(VHL)綜合征、創(chuàng)傷、再生(體外和體內(nèi))、希爾施普龍病、克羅恩病、闌尾炎、子宮內(nèi)膜異位癥、喉炎、4艮屑病、光化性角化病、痤療、毛發(fā)生長(zhǎng)/損失、殼發(fā)(allopecia)、色素沉著癥、重癥月幾無(wú)力、oc-甘露if唐苷貯積癥、P-甘露^f唐苦貯積癥、其〗也貯積、癥、過(guò)氧化物酶病如澤爾韋格綜合征、嬰兒雷夫敘姆病、肢根軟骨發(fā)育不良(肢根的點(diǎn)狀軟骨發(fā)育不良，)、以及高哌啶酸血癥、骨質(zhì)疏+>、肌肉疾病、尿潴留、奧爾布賴(lài)特遺傳性骨營(yíng)養(yǎng)不良、潰瘍、阿爾茨海默病、卒中、帕金森病、亨廷頓病、大腦性癱瘓、癲癇、萊-尼綜合征、多發(fā)性硬化、毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)、行為障礙、成癮性、焦慮、疼痛、神經(jīng)保護(hù)、卒中、無(wú)晶狀體、神經(jīng)變性病、神經(jīng)紊亂、發(fā)育缺陷、與GRK2在腦中以及在調(diào)節(jié)趨化因子受體中的作用有關(guān)的病癥、腦脊髓炎、焦慮、精神分裂癥、躁狂抑郁癥、儋妄、癡呆、重癥精神發(fā)育遲緩和運(yùn)動(dòng)障礙、日勒德拉圖雷特綜合征、腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、癌癥、乳Ai癌、CNS癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、腎癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、以及子宮頸癌、瘤形成如BPH、腺癌、淋巴瘤、子宮癌、良性前列腺肥大、生育力、生長(zhǎng)和發(fā)育/分化相關(guān)功能的控制例如但不限于成熟、哺乳期和青春期、生殖功能障礙、和/或其他類(lèi)似的病理特征和病癥。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的治療性組合物包含，例如，ATAP核酸；結(jié)合ATAP編碼核酸的核酸；ATAP多肽、基于其的肽類(lèi)似物、假肽或擬肽；ATAP或ATAP蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的小分子調(diào)節(jié)物；或ATAP特異性抗體或其生物活性書(shū)f生物或片,殳。如本文25所述，ATAP介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。因此，乾向這些核酸、多肽、以及它們的同系物的表達(dá)和/或活性將為各種急性和慢性疾病和病癥(例如，那些與增生性功能不良有關(guān)的疾病和病癥)的新療法創(chuàng)造條件。本發(fā)明包纟舌用于治療或改善與細(xì)力包增殖有關(guān)的疾病和/或病癥的方法，該方法包括將有效量的本發(fā)明的組合物給予對(duì)其需要的受試者。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包4舌用于治療任《可類(lèi)型的癌癥的方法，該方法包括將有效量的本發(fā)明的治療性組合物給予對(duì)其有需要的受試者。在本文描述的任何實(shí)施方式中，本發(fā)明的治療性組合物可以包含ATAP編碼核酸、ATAP多肽、融合蛋白、假肽等等以及藥用載體。在本發(fā)明的任何方面，本發(fā)明的治療性組合物可以是任何藥用形式并通過(guò)任何藥用途徑給予，例如，可以通過(guò)口服給藥(一天給藥一次或單次給藥)給予治療性組合物，用于治療由于心月/l梗死、硬化性病變引起的肌肉損傷、或由于體育相關(guān)活動(dòng)引起的肌肉撕裂，以促進(jìn)受損月幾肉組織的再生和〗f復(fù)。上述藥用載體和賦形劑以本發(fā)明的多肽可以用作免疫原以產(chǎn)生特異于本發(fā)明的抗體，以及可以用作疫苗。它們還可以用來(lái)篩選潛在的激動(dòng)劑和拮抗劑化合物。此夕卜，編碼ATAP的cDNA可以用于基因治療，并且當(dāng)主合予對(duì)其需要的受試者時(shí)，ATAP是有用的。作為非限制性實(shí)例，本發(fā)明的組合物對(duì)于治療患有上文纟皮露的疾病和病癥和/或其他類(lèi)似、的病理特征和病癥的患者是有效的。此外，本發(fā)明涉及核酸(包括干擾核酸)、以及編碼ATAP相互作用蛋白的多肽。本發(fā)明進(jìn)一步包括用于篩選病癥或綜合征的調(diào)節(jié)物的方法，其中上述病癥或綜合4正包^"，例如，上文4皮露的疾病和病癥和/或其^f也類(lèi)似的病理特征和病癥。上述方法包括〗吏試驗(yàn)化合物接觸ATAP多肽并確定試-瞼化合物是否結(jié)合于所述ATAP多肽。試—驗(yàn)化合物與ATAP多肽的結(jié)合是指試-驗(yàn)化合物對(duì)上述病癥或綜合4正的活動(dòng)、潛《犬4犬態(tài)(latency)或易感'f生(predispodition)的調(diào)節(jié)。本發(fā)明還包括用于篩選Bfl-l或HSSC1活性的調(diào)節(jié)物的方法，該方法包括提供小分子化合物庫(kù)并篩選與ATAP的結(jié)合情況?；衔锱cATAP多肽結(jié)合暗示是Bfl-l或HSSC1活性的潛在調(diào)節(jié)物。在其他方面，本發(fā)明包括用于評(píng)估上迷化合物的治療潛力的方法，該方法包括將ATAP結(jié)合分子給予試驗(yàn)受試者，例如，細(xì)胞或未受損動(dòng)物，以及相對(duì)于對(duì)照，測(cè)量在試驗(yàn)受試者中化合物誘導(dǎo)或抑制凋亡的活性或能力。接著，比較在試驗(yàn)動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物中的活性。相對(duì)于對(duì)照動(dòng)物，在試驗(yàn)動(dòng)物中的活性變化表明試驗(yàn)化合物是病癥或綜合4正的調(diào)節(jié)物。又一方面，本發(fā)明包4舌一種方法，該方法用于確定在受^式者(例如，人受試者)體內(nèi)包含ATAP的多肽、核酸、或兩者的類(lèi)型或水平的變^(匕與疾病的存在或易感'f生(predisposition)的關(guān)系。該方法包括在來(lái)自受試者的試樣中確定ATAP多肽的序列并比較試樣和對(duì)照或參比序列中的基因型或單元型(haplotype)。和對(duì)照才羊品相比，試樣中ATAP多肽的基因型改變表明在受試者中存在疾病或?qū)膊〉囊赘行浴?yōu)選地，易感性包4舌，例如，上文4皮露的疾病和病癥和/或其他類(lèi)似的病理特征和病癥。此外，本發(fā)明的新的多肽的表達(dá)水平可以用于篩查各種病癥以及確定特定病癥的階卓爻(stage)的方法中。另一方面，本發(fā)明包括在哺乳動(dòng)物中用于治療或預(yù)防與病癥有關(guān)的病理^犬態(tài)的方法，該方法以足以減輕或預(yù)防病理4犬態(tài)的量3夸ATAP多肽、ATAP核酸、或ATAP特異性抗體給予受試者(例如，人受試者)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該病癥包括，例如，上文4皮露的疾病和病癥牙口/或其4也類(lèi)4以的病J里4寺;j正和病癥。又一方面，通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
中若干常用纟支術(shù)的4壬何一種，本發(fā)明可以用于鑒定包含ATAP的多肽的細(xì)胞受體和下游效應(yīng)物(effector)的方法中。這些I支術(shù)包括W旦不限于只又雜交系統(tǒng)、親和純化法、與抗體或其他特異性相互作用分子的共沉淀。除非另有限定，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有和本發(fā)明所屬?zèng)_支術(shù)領(lǐng)域的普通4支術(shù)人員通常所理解的相同的含義。然而在實(shí)施或試驗(yàn)本發(fā)明時(shí)可以〗吏用與本文所述類(lèi)似或等效的方法和材料，下文描述了適宜的方法和材料。本文提及的所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、突的情況下，以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法、以及實(shí)施例僅是說(shuō)明性的而不是限制性的。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"ATAP拮抗劑"或"ATAP的拮抗劑"一般用來(lái)指能夠直接或間接抑制ATAP表達(dá)、翻譯、和/或活性的制劑。此外，如在本文中所使用的，"ATAP受體"一般涉及能夠結(jié)合于A(yíng)TAP蛋白質(zhì)的任何一種蛋白質(zhì)或其片段。某些方面，調(diào)節(jié)ATAP活性是通過(guò)以下方式完成的，例如，4吏用或調(diào)節(jié)ATAP結(jié)合伴倡(partner)，即，結(jié)合于A(yíng)TAP并中和它的生物學(xué)活性的因子，如中和抗ATAP、ATAP受體、ATAP受體片段、以及ATAP受體類(lèi)似物；使用ATAP受體拮抗劑，如抗體、<艮肽、肽類(lèi)似物或擬肽，其結(jié)合并破壞ATAP-受體相互作用；使用小分子，其4中制ATAP活性或分子間相互作用、或改變ATAP的正常構(gòu)型、或抑制有效的(productive)ATAP/ATAP-受體結(jié)合；或^f吏用衫f生自ATAP基因和/或ATAP受體基因的核苷酸序列，包括編碼、非編碼、和/或調(diào)節(jié)序列，以防止或減少ATAP的表達(dá)通過(guò)例如反義、核酶、和/或三股螺;旋方式。另一方面，本發(fā)明沖是供了一種試劑盒，該試劑盒包括合適的容器、本發(fā)明的ATAP核酸或多肽、及其使用說(shuō)明。另一方面，本發(fā)明涉及一種用于診斷或監(jiān)測(cè)病癥或疾病或進(jìn)展的方法，該方法包括通過(guò)4企測(cè)ATAP區(qū)或ATAP受體基因或蛋白質(zhì)或兩者的表達(dá)7jc平來(lái)4全測(cè)Bfl-l或HCCS1的ATAP部分中沖亥苦酸多態(tài)性的存在。已確定，多態(tài)性與疾病嚴(yán)重性相關(guān)。(參見(jiàn)，Zhongetal"AWez'cv4"AL2005Aug2;33(13):el21;Donnetal.,^W/^fei/7eww.2004May;50(5):1604-10;出于各種目的將上述的全部文獻(xiàn)以引用方式結(jié)合于本文)普通技術(shù)人員將理解根據(jù)本發(fā)明的方法，ATAP、以及與疾病有關(guān)的ATAP受體基因多態(tài)性可以用作i貪斷標(biāo)簽，并且可以出現(xiàn)在任何先前4是及的核酸區(qū)。用于鑒定和監(jiān)測(cè)多態(tài)性的4支術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的并且在授權(quán)給Wohlgemuth的美國(guó)專(zhuān)利第6,905,827號(hào)中已有詳細(xì)描述，出于各種目的將其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。本發(fā)明的某些方面包括用一種或多種DNA分子來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)或多態(tài)性的方法，其中所述一種或多種DNA分子具有一種核苷酸序列，其才僉測(cè)對(duì)應(yīng)于在序列表中所描述的寡核苷酸的基因的表達(dá)。在一種形式中，寡核苦酸檢測(cè)差異表達(dá)基因的表達(dá)?；虮磉_(dá)系統(tǒng)可以是候選文庫(kù)、診斷劑、診斷寡核苦酸組合(set)或診斷探針組合。DNA分子可以是基因組DNA、RNA、蛋白核酸(PNA)、cDNA或合成寡核苷酸。按照本文教導(dǎo)的步驟，可以鑒定對(duì)于分析基因表達(dá)或多態(tài)性有意義的序列。這樣的序列可以是疾病狀態(tài)的預(yù)兆。29本發(fā)明的i貪斷寡核苷酸如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"核酸分子"旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)，RNA分子(例如，mRNA)，利用核苦酸類(lèi)似物產(chǎn)生的DNA或RNA類(lèi)似物，以及它們的書(shū)f生物、片,殳和同系物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但優(yōu)選由雙鏈DNA組成。在某些方面，本發(fā)明涉及診斷寡核苷酸和i貪斷寡核苦酸組合，對(duì)于寡核苷S臾序列來(lái)說(shuō)，在個(gè)體的健康狀態(tài)和RNA或蛋白產(chǎn)物(對(duì)應(yīng)于該核普酸序列)的個(gè)體表達(dá)之間存在相關(guān)性。在某些情況下，對(duì)于這樣的檢測(cè)僅需要一種寡核苷酸。診斷寡核香酸組合的成員可以通過(guò)能夠檢測(cè)RNA或蛋白產(chǎn)物的表達(dá)或多態(tài)性的任何方式加以鑒定，上述方式包括但不限于差異表達(dá)篩選、PCR、RT-PCR、SAGE分析、高通量測(cè)序、纟效陣列、液體或其他陣列、基于蛋白質(zhì)的方法(例如，蛋白質(zhì)印跡法、蛋白質(zhì)組學(xué)、質(zhì)譜法、以及本文描述的其他方法)、以及數(shù)據(jù)挖掘方法(如本文進(jìn)一步描述的)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可以4姿照眾所周知的分子生物學(xué)4支術(shù)對(duì)核酸和/或蛋白質(zhì)進(jìn)4亍凈乘作。"i午多上述方法的詳細(xì)方案描述在，例如，Ausubeletal.CurrentProtocolsinMolecularBiology(supplementedthrough2000)JohnWiley&Sons,NewYork("Ausubel");Sambrooketal.MolecularCloning-ALaboratoryManual(2ndEd.),Vol.1-3,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y"1989("Sambrook"),andBergerandKimmelGuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymologyvolume152AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.("Berger")?；蚍中统吮磉_(dá)譜和臨床資料的相關(guān)性或結(jié)合表達(dá)譜和臨床資料的相關(guān)性，經(jīng)常需要使表達(dá)模式與受試者在一個(gè)或多個(gè)基因座的基因型相關(guān)或使表達(dá)譜和基因座數(shù)據(jù)均與臨床資料相關(guān)。所選擇的基因座可以是，例如，乂于應(yīng)于4矣選文庫(kù)的一個(gè)或多個(gè)成員的染色體基因座、用于標(biāo)簽基因座的多態(tài)等位基因、或已知或作I定與疾病(或疾病標(biāo)準(zhǔn))有關(guān)的可替換的疾病相關(guān)基因座(不影響候選文庫(kù))。當(dāng)然應(yīng)當(dāng)明了，在基因座處的(多態(tài))等位基因與疾病(或與對(duì)疾病的易感性)有關(guān)的情況下，等位基因的存在本身可以是疾病標(biāo)準(zhǔn)(diseasecriterion)。許多眾所周知的方法可以用來(lái)評(píng)估個(gè)體的基因型，除了許多其J也有用的方》去之夕卜，上述方法還包4舌DNA分才斤(southernanalysis)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分4斤(例如，^f昔助于PCR、Taqman或分子標(biāo)i己(molecularbeacon))。許多上述方法容易適合于高通量和/或自動(dòng)化(或半自動(dòng)化)樣品制備和分析方法。大多凄t可以用4昔助于簡(jiǎn)單禾呈序回收自相同樣品(產(chǎn)生用于表達(dá)譜的材料)的核酸樣品進(jìn)4于。在例如Sambrook、以及Ausubel(上文)中描述了典型的技術(shù)。本發(fā)明的核酸分子的特征還在于，例如酶促核酸分子、反義核酸分子、誘物(decoys)、雙鏈RNA、三鏈寡核苷酸、和/或適體(aptamer),以及用來(lái)調(diào)節(jié)例如編碼ATAP區(qū)或ATAP受體結(jié)合蛋白或ATAP受體蛋白的基因的基因表達(dá)的方法。具體而言，本發(fā)明的特征在于基于核酸的分子以及用來(lái)調(diào)節(jié)Bfl-l蛋白、HCCS1蛋白或ATAP受體蛋白的表達(dá)的方法。本文參照在序列表中提供的典型的ATAP核酸描述了各個(gè)方面和實(shí)施方式。然而，上述各個(gè)方面和實(shí)施方式還涉及這樣的基因，其編碼ATAP蛋白質(zhì)、ATAP結(jié)合蛋白、以及ATAP受體基因的同系物、直系同源物(orthologs)、以及旁系同源物(paralogs)，并且包括所有亞型(或同種型，isoforms)、剪4妄變體、以及多態(tài)性。利用針對(duì)ATAP蛋白質(zhì)、ATAP結(jié)合蛋白、以及ATAP受體基因所描述的方法，可以對(duì)那些另外的基因進(jìn)行靶位點(diǎn)方面的分析。因此，如本文所述，可以實(shí)施其他基因的抑制和這種抑制的效應(yīng)。"下調(diào)"是指基因的表達(dá)、或編碼一種或多種蛋白質(zhì)的RNA或等爻文RNA的7K平、或一種或多種蛋白質(zhì)的活性，如ATAP核酸、以及ATAP受體基因，被降低到低于在不存在本發(fā)明的核酸分子時(shí)所》見(jiàn)測(cè)到的7jc平。在一種實(shí)施方式中，酶促片亥酸分子的氺卩制或下調(diào)優(yōu)選低于無(wú)酶促活性或酶促活性衰減分子存在的情況下所觀(guān)測(cè)到的水平，其中無(wú)酶促活性或酶促活性衰減分子能夠結(jié)合于在草巴RNA上的相同位點(diǎn)，但不能切割上述RNA。在另一種實(shí)施方式中，反義寡核苷酸的抑制或下調(diào)優(yōu)選低于例如包含錯(cuò)義序列或包含錯(cuò)配的寡核香酸存在的情況下所^L測(cè)到的水平。在另一種實(shí)施方式中，利用靶向ATAP區(qū)、ATAP結(jié)合蛋白、以及ATAP受體基因的RNA分子并4吏用本發(fā)明的核酸分子對(duì)Bfl-l或HCCS1的抑制或下調(diào)，在核酸分子存在的情況下，其大于不存在核酸分子的情況。"上調(diào)"是指基因的表達(dá)、或編碼一種或多種蛋白質(zhì)亞單位的RNA或等效RNA的水平、或一種或多種蛋白質(zhì)亞單位(如ATAP蛋白質(zhì)、ATAP結(jié)合蛋白、以及ATAP受體基因)的活性高于不存在本發(fā)明的核酸分子的情況下所觀(guān)測(cè)到的水平?？梢栽黾樱?，基因的表達(dá)，如ATAP蛋白質(zhì)、ATAP結(jié)合蛋白、以及ATAP受體基因，以治療、預(yù)防、改善、或調(diào)節(jié)由缺少或低水平基因表達(dá)所引起或力口劇的病理一犬態(tài)。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及通過(guò)上調(diào)ATAP蛋白質(zhì)、ATAP結(jié)合蛋白、以及ATAP受體基因的表達(dá)、釋放、和/或活性來(lái)治療或子貞防過(guò)度增生性病癥的方法。"調(diào)節(jié)"是指基因的表達(dá)、編碼一種或多種蛋白質(zhì)的RNA或等效RNA的水平、或一種或多種蛋白質(zhì)的活性一皮上調(diào)或下調(diào)，以致上述表達(dá)、水平、或活性高于或低于不存在本發(fā)明的核酸分子的情況下所，見(jiàn)測(cè)到的情況。"基因"是指編碼RNA的核酸，例如，包括但不限于編碼多肽的節(jié)段的核酸序列。"互補(bǔ)性"是指通過(guò)傳統(tǒng)的沃森-克里克或其他非傳統(tǒng)類(lèi)型核酸與另一種RNA序列形成一個(gè)或多個(gè)氫^T建的能力。"RNA"是指包含至少一個(gè)核糖核苷酸殘基的分子。"核糖核苷酸"或"2'-OH"是指在D-呋喃核糖部分的2'位具有羥基基團(tuán)的核芬酸。"核苦酸"是指在與磷酸化糖(phosphorylatedsugar)形成的N-糖香鍵中的雜環(huán)含氮堿基。在本
技術(shù)領(lǐng)域：
認(rèn)為核苷酸包括天然堿基(標(biāo)準(zhǔn))、以及本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的修飾堿基。這樣的堿基通常位于核香酸糖部分的l'位。核香酸通常包含石咸基、糖、以及磷酸基團(tuán)。核香酸在糖、磷酸和/或堿基部分可以是未修飾的或修飾的(還可互換地稱(chēng)作核苷酸類(lèi)似物、修飾核苷酸、非天然核苷酸、非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸以及其4也沖亥苦酸；參見(jiàn)例長(zhǎng)口，Usman和McSwiggen，上文；Eckstein等，InternationalPCTPublicationNo.WO92/07065;Usman等，InternationalPCTPublicationNo.WO93/15187;Uhlman&Peyman,上文，所有這些以引用方式結(jié)合于本文)。有本沖支術(shù)領(lǐng)域已知的i奮飾4亥酉吏石威基的若干實(shí)例，j口由Limbachetal.，1994,NucleicAcidsRes.22,2183所總結(jié)的?？梢証t引入核酸中的化學(xué)々務(wù)飾的和其他天然的核酸堿基的一些非限制性實(shí)例包括，例如，肌苦、嘌呤、吡啶-4-西同(pyridin-4-one)、p比口定國(guó)2-酉同(pyridin-2-one)、笨基、々爻尿口密口定、2,4,6-三曱氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-曱基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸核苷)、5-卣代尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮雜嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-曱基尿香)、丙炔、Q核苷(quesosine)、2"克代尿苷、4-碌u代尿苷、wybutosine、wybutoxosine、4-乙醜氛酸(acetyltidine)、5-(歡基羥曱基)尿苷、5'-羧曱基氨甲基-2-疏代尿苷、5-羧曱基氨甲基尿苷、P-D-半乳糖基Q核苷、l-甲基腺苷、l-曱基肌苷、2，2-二曱基鳥(niǎo)苷、3-曱基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥(niǎo)苷、N6-甲基腺苷、7-曱基鳥(niǎo)苷、5-甲氧基氨曱基-2-硫代尿苷、5-曱氨基甲基尿苷、5-曱基羰基曱基尿苦(5畫(huà)methylcarbonyhnethyluridine)、5-曱氧基尿普、5-甲基-2-石危代尿苷、2-曱硫基-N6-異戊烯基腺苷、(3-D-甘露糖基Q核苷、尿苷-5-羥基乙酸(uridine-5-oxyaceticacid)、2"克月包*、蘇氨酸書(shū)1"生物等(Burginetal"1996,Biochemistry,35,14090;Uhlman&Peyman,上文)。在這方面，"修飾堿基"是指不同于在r位的腺。票呤、鳥(niǎo)嘌呤、月包嘧，定以及尿嗜，定的核苷酸石威基或它們的等^丈物(equivalents);這樣的堿基可以用在任何位置，例如，在酶促核酸分子的催化核心內(nèi)和/或在核酸分子的底物結(jié)合區(qū)。如在本文中所使用的，"核酸分子"是指具有核苷酸的分子。核酸可以是單鏈、雙鏈、或多《連并且可以包含<奮飾或未<奮飾核苷酸或非核香酸或它們的各種混合物和組合。ATAP蛋白質(zhì)、ATAP結(jié)合蛋白、以及ATAP受體基因的"等效"或"相關(guān)"RNA旨在包括那些天然存在的RNA分子，其具有與包含ATAP的蛋白質(zhì)、ATAP結(jié)合蛋白、以及ATAP受體基因的同源性(部分或完全)，編碼各種生物體中與ATAP蛋白質(zhì)、ATAP結(jié)合蛋白、以及ATAP受體蛋白具有類(lèi)似功能的蛋白質(zhì)，上述生物體包括人、嚙齒類(lèi)動(dòng)物、靈長(zhǎng)類(lèi)、兔、豬、原生動(dòng)物、真菌、植物、以及其他樣i生物和寄生物。等歲丈RNA序列除編石馬區(qū)之外還包4舌:^5'-非翻譯區(qū)、3'-非翻i,區(qū)、內(nèi)含子、內(nèi)含子-外顯子接合區(qū)域等。"同源性"是指兩種或更多種核酸分子的核苷酸序列是部分或完全相同的。在某些實(shí)施方式中，同源核酸與ATAP編碼核酸，例如，SEQIDNO.34白、和/或ATAP受體基因具有30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%的同源寸生。"載體"是指任何一種基于核酸的用來(lái)遞送所期望核酸的技術(shù)，例如，細(xì)菌質(zhì)沖立、病毒核酸、HAC、BAC等。本發(fā)明的核酸分子，單獨(dú)地、或結(jié)合或與其他藥物組合，可以用來(lái)治療上述疾病或病癥。例如，如只t本^頁(yè)^y支術(shù)人員來(lái)il顯而易見(jiàn)的是，在適合于治療的條件下，單獨(dú)地或結(jié)合一種或多種藥物，可以治療受試者，或可以治療其他適當(dāng)?shù)募?xì)胞。如在本文中所使用的，"細(xì)胞"是在通常的生物意義上加以〗吏用，并且并不指整個(gè)多細(xì)胞生物體。細(xì)胞可以是，例如，在體內(nèi)、在體外或離體回llr，例如，在細(xì)J包培養(yǎng)中，或存在于多細(xì)月包生物體中，多細(xì)胞生物包括，例如，鳥(niǎo)、植物以及哺乳動(dòng)物如人、母牛、羊、類(lèi)人猿、猴、豬、狗、以及貓。細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(例如，細(xì)菌細(xì)月包)或真纟亥細(xì)"包(例如，哺乳動(dòng)物或纟直物細(xì)月包)?？梢灾?姿加入本發(fā)明的核酸，或可以用陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合本發(fā)明的核酸，將本發(fā)明的核酸包裝在脂質(zhì)體內(nèi)，或?qū)⒈景l(fā)明的核酸遞送到靶細(xì)胞或組織中。在將它們加入或沒(méi)有加入生物多聚體中的情況下，可以在體外、離體回ilr或在體內(nèi)，通過(guò)注射或l俞液泵，將核酸或核酸復(fù)合物局部地給予有關(guān)的組織。利用本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法合成寡核苦酸(例如，反義，GeneBlocs),如在Camthersetal.，1992,MethodsinEnzymology211,3-19;Thompsonetal.,InternationalPCTPublicationNo.WO99/54459;Wincottetal.,1995，NucleicAcidsRes.23,2677-2684;Wi謡ttetal.，1997,MethodsMol.Bio.,74,59;Bren賺etal.,1998,BiotechnolBioeng.，61,33-45;以及Brennan,美國(guó)專(zhuān)利第6,001,311號(hào)中所描述的。所有這些參考文獻(xiàn)以引用方式結(jié)合于本文。在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，用394AppliedBiosystems,Inc.的合成4義進(jìn)4亍小規(guī)才莫的合成?？商鎿Q地，可以分段地合成本發(fā)明的核酸分子并在合成后連4妄在一起，例3。通過(guò)連4妄反應(yīng)(Mooreetal.，1992,Science256，9923;Draperetal"InternationalPCTpublicationNo.WO93/23569;Shabarovaetal.，1991,NucleicAcidsResearch19,4247;Bellonetal.，1997，Nucleosides&Nucleotides,16,951;Bellonetal"1997，BioconjugateChem.8,204)。可以廣泛地修飾本發(fā)明的核酸分子，以通過(guò)用耐核酸酶基團(tuán)，例如，2'國(guó)氨基、2'-C-烯丙基、2'-氟基、2'-0-曱基、2'-H的修飾來(lái)增強(qiáng)穩(wěn)定性(綜述，參見(jiàn)UsmanandCedergren，1992,TIBS17,34;Usmanetal.，1994,NucleicAcidsSymp.Ser.31,163)。雖然用硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、和/或5'-甲基磷酸酯鍵對(duì)寡核苷酸的核苷酸間鍵進(jìn)行的化學(xué)修飾可以改善穩(wěn)定性，但這些修飾中的許多l(xiāng)奮飾可以引起一定的毒性。因此當(dāng)設(shè)計(jì)核酸分子時(shí)，應(yīng)使這些核香酸間鍵的量降低到最'J、程度。這些鍵濃度的降低可降低毒性，導(dǎo)致這些分子效力增加和特異性提高。提供了具有化學(xué)修飾的核酸分子，其可以保持或增強(qiáng)活性。并且這樣的核酸通常比未修飾核酸更耐核酸酶。核酸分子優(yōu)選耐核酸酶以用作有效的細(xì)胞內(nèi)治療劑。RNA和DNA的化學(xué)合成的改進(jìn)(Wincottetal"1995NucleicAcidsRes.23，2677;Caruthersetal"1992,MethodsinEnzymology211,3-19，(以引用方式結(jié)合于本文)已擴(kuò)大了通過(guò)引入核苷酸#~飾來(lái)〗奮飾核酸分子乂人而增強(qiáng)它們的核酸酶穩(wěn)定性的能力(如上所述)。本發(fā)明的基于核酸的分子的應(yīng)用，通過(guò)4是供纟且合療法(或聯(lián)合治療，combinationtherapies)的可能寸生(例如，耙向不同基因的多種反義或酶促核酸分子、耦合于已知小分子抑制劑的核酸分子、或用分子和/或其他化學(xué)或生物分子的組合進(jìn)行的間歇治療)，可以導(dǎo)致對(duì)疾病進(jìn)展的更好治療。用核酸分子對(duì)受試者進(jìn)行治療還可以包括不同類(lèi)型的核酸分子的組合應(yīng)用。核酸分子的給予。用于遞送核酸分子的方法描述于A(yíng)khtaretal.，1992,TrendsCellBio.,2,139以及DeliveryStrategiesforAntisenseOligonucleotideTherapeutics,ed.Akhtar,1995,其以引用方式結(jié)合于本文。Sullivan等，PCTWO94/02595,進(jìn)一步描述了用于遞送酶促RNA分子的一^:方法。這些方法可以用于遞送幾乎^f壬^r斗亥&復(fù)分子?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)i或才支術(shù)人員已知的各種方法將核酸分子給予細(xì)月包，上述方法包括^旦不限于，嚢封(encapsulation)在脂質(zhì)體中，通過(guò)離子導(dǎo)入，或通過(guò)加入其他載體中，如水凝月交、環(huán)糊精、生物可降解的納米力交嚢、以及生物粘附孩U求體。可^^t奐;也，可以通過(guò)直4妄注射或通過(guò)4吏用輸液泵來(lái)局部給予核酸/載體組合。遞送的其他途徑包括但不限于口服(片劑或丸劑形式)和/或鞘內(nèi)遞送(Gold,1997，Neuroscience,76,1153-1158)。其他方式包括使用各種運(yùn)豐命和載體系統(tǒng)，例如，通過(guò)4吏用扼合物(conjugate)和生物可降解的聚合物。關(guān)于藥物遞送方法(包括CNS遞送)的綜述，參見(jiàn)Hoetal.,1999,Curr.Opin.Mol.Ther.，1，336-343和Jain,DrugDeliverySystems:TechnologiesandCommercialOpportunities,DecisionResources,1998以及Groothuisetal.，1997，J.NeuroVirol"3,387-400。本發(fā)明的分子可以用作藥劑。這些藥劑可以預(yù)防、抑制受試者疾病狀態(tài)的發(fā)生，或治療(減輕癥狀到一定禾呈度，優(yōu)選所有癥狀)受i式者的疾病^)犬態(tài)?？梢酝ㄟ^(guò)4壬4可標(biāo)準(zhǔn)方式來(lái)給予本發(fā)明的帶負(fù)電荷的多核苷酸(例如，RNA、DNA或蛋白質(zhì))并引入受試者，其中使用或不使用穩(wěn)定劑、緩沖劑等，以形成藥物組合物。當(dāng)期望使用脂質(zhì)體遞送機(jī)制時(shí)，可以按照用于形成脂質(zhì)體的標(biāo)準(zhǔn)步驟。還可以配制本發(fā)明的組合物并用作用于口服的片劑、力交嚢劑或酏劑；用于直腸纟會(huì)予的才全37劑；無(wú)菌溶液；用于注射纟合予的混懸劑；以及本纟支術(shù)4頁(yè)域已知的其4也組合物。本發(fā)明還包括所述化合物的藥用劑型。這些劑型包括上述化合物的鹽，例如，酸加成鹽，例如，鹽酸、氫溴酸、乙酸、以及苯磺f臾的鹽。藥物組合物或劑型是指具有適合于給予(例如，系統(tǒng)給予)細(xì)胞或受試者(優(yōu)選人)的形式的組合物或劑型。"系統(tǒng)給予"是指體內(nèi)系統(tǒng)吸收或積聚血流中并隨后分布于整個(gè)身體的藥物。適宜的形式部分地取決于進(jìn)入Y吏用或途徑，例如口月艮、透過(guò)皮月夫、或通過(guò)注射。上述形式不應(yīng)阻止組合物或劑型達(dá)到靶細(xì)胞(即，帶負(fù)電荷的聚合物期望纟皮遞送到的細(xì)力包)。例如，注入血流的藥物組合物應(yīng)是可溶的。其他因素在本
技術(shù)領(lǐng)域：
是已知的，并且包括一些要考慮的問(wèn)題如毒性和形式，其會(huì)阻止組合物或劑型發(fā)揮其效應(yīng)。導(dǎo)致系統(tǒng)吸收的給予途徑包括《旦不限于靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、吸入、口月l、肺內(nèi)以及肌內(nèi)途徑。研究表明，藥物進(jìn)入循環(huán)的速率是關(guān)于分子量或大小的函數(shù)。包含本發(fā)明的化合物的脂質(zhì)體或其他藥物載體的〗吏用可以潛在地定位藥物，例如，在某些組織類(lèi)型中，如網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)組織。可以促進(jìn)藥物與細(xì)胞(如，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)表面結(jié)合的脂質(zhì)體劑型也是有用的。藥用劑型是指這樣的組合物或劑型，其便于將本發(fā)明的核酸分子有效分布于最適合于它們的所期望發(fā)揮活性的物理位置(或身體位置，physicallocation)。適用于包含本發(fā)明的核酸分子的劑型的試劑的非限制性實(shí)例包括PEG結(jié)合的核酸，磷脂結(jié)合的核酸，包含親脂部分的核酸，石克代磷酸酯，P-糖蛋白抑制劑(如PluronicP85)，其可以增強(qiáng)藥物進(jìn)入各種組織，例如CNS(Jolliet-Riant和Tillement，1999，F(xiàn)undam.Clin.Pharmacol.,13，16-26);生物可卩條解的聚合物，如聚丙交酯-乙交酯共聚物孩O求體，用于植入以后的緩釋遞送(Emerich,DFetal,1999,CellTransplant,8,47-58)Alkermes,Inc.Cambridge,Mass.;以及加載的納米顆粒，如那些由聚氰基丙烯酸丁酯構(gòu)成的納米顆粒，其可以遞送藥物穿過(guò)血腦屏障并且可以改變神纟至元才聶取才幾制(ProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry,23,941-949,1999)。遞送方法(包括CNS遞送核酸分子)的其他非限制性實(shí)例包4舌在Boadoetal.，1998，J.Pharm.Sci.，87，1308-1315;Tyleretal,1999，F(xiàn)EBSLett.，421,280-284;Pardridgeetal"1995，PNASUSA.,92，5592-5596;Boado，1995,Adv.DrugDeliveryRev"15，73-107;Aldrian-Herradaetal"1998,NucleicAcidsRes.，26，4910-4916;以及Tyleretal"1999，PNASUSA.,96,7053-7058中所描述的材料。所有這些參考文獻(xiàn)以引用方式結(jié)合于本文。本發(fā)明的特征還在于4吏用包含表面^奮飾脂質(zhì)體的組合物，其中表面修飾脂質(zhì)體包含聚乙二醇脂質(zhì)(PEG修飾的、或長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體或隱形脂質(zhì)體(stealthliposome))。本發(fā)明的核酸分子還可以包含各種分子量的共價(jià)結(jié)合的PEG分子。這些劑型提供了一種方法來(lái)增加藥物在革ei且織中的積聚。這種類(lèi)型的藥物載體可阻止單核吞p簠細(xì)胞系統(tǒng)(MPS或RES)的調(diào)理作用和消除，/人而可以獲得更長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間并增強(qiáng)組織暴露于月交嚢4匕藥物(Lasicetal.Chem.Rev.1995:95，2601-2627;Ishiwataetal"Chem.Pharm.Bull.1995,43,1005-1011)。和陽(yáng)離子脂質(zhì)體相比，長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體還可以在更大程度上保護(hù)藥物免于核酸酶降解，這基于它們避免積聚在代謝攻擊性MPS組織如肝和脾中的能力。所有這些參考文獻(xiàn)以引用方式結(jié)合于本文。本發(fā)明還包括為貯藏或給予所制備的組合物，其包含藥物有效量的在藥用載體或稀釋劑中的所期望的化合物。用于治療用途的可接受的載體或稀釋劑在制藥領(lǐng)域中是眾所周知的，并且描述于，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)中，其以引用方式結(jié)合于本文?？梢?是供，例如，防腐劑、穩(wěn)定劑、染料以及增香劑。上述防腐劑包括苯甲酸鈉、山梨酸以及對(duì)羥基苯甲酸的酯。此外，可以-使用抗氧化劑和懸浮劑。藥物有效劑量或藥物有效量是為預(yù)防、抑制疾病狀態(tài)的發(fā)生、或治療(減輕癥狀至一定禾呈度，優(yōu)選所有癥狀)疾病狀態(tài)所需要的劑量。藥物有效劑量取決于疾病類(lèi)型、所用的組合物、給予途徑、被治療的哺乳動(dòng)物類(lèi)型、所考慮的特定哺乳動(dòng)物的物理特性、同時(shí)纟合藥的藥物(concurrentmedication)、以及本4頁(yè)i或^支術(shù)人員^!尋明白的其他因素。通常，給予0.1mg/kg至1000mg/kg體重/天的活性成分量，其取決于帶負(fù)電荷聚合物的效能。可以以給藥單位劑型來(lái)口服、局部、腸胃外、通過(guò)吸入或噴霧或直腸給予上述劑型，其中給藥單位劑型包含常規(guī)的無(wú)毒性藥用載體、佐劑以及賦形劑。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)腸胃外包括經(jīng)皮、皮下、血管內(nèi)(例如，靜脈內(nèi))、肌內(nèi)、或鞘內(nèi)注射或輸注技術(shù)等。此外，提供了一種藥物劑型，其包含本發(fā)明的核酸分子和藥用載體?？梢源嬖谝环N或多種本發(fā)明的核酸分子，其連合一種或多種無(wú)毒性藥用載體和/或稀釋劑和/或佐劑，以及如果需要連合其他活性成分。本發(fā)明的藥物組合物可以具有適用于口月良的形式，例如，作為片劑、含片、錠劑、含水或油性混懸劑、可分散的散劑或顆粒、乳劑、硬或軟"交嚢、或糖漿或酏劑。用于口服的組合物可以按照在制備藥物組合物的領(lǐng)域中已知的任何方法加以制備并且這樣的組合物可以包含一種或多種這樣的甜p未劑、增香劑、著色劑或防腐劑，以4是供藥物上4交好的和可口的制劑。片劑包含與適合于制備片劑的無(wú)毒性藥用賦形劑混合的活性成分。這些賦形劑可以是例如，惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳斗唐、^粦酸釣或》粦酸鈉；造粒和崩解劑，例如，玉米淀4分、或海藻酸；粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；以及潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。片劑可以是未涂覆的或可以通過(guò)已知技術(shù)對(duì)它們進(jìn)4亍涂覆(coat)。在某些情況下，可以通過(guò)已知技術(shù)來(lái)制備上述涂層以延遲在腸胃道中的崩解和吸收，乂人而提供在凈交長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)的持續(xù)作用。例如，可以采用時(shí)間延遲材料如甘油單硬脂酸或甘油二硬脂酸?？诜┬瓦€可以制作成為硬膠嚢，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如，碳酸鈣、磷酸4丐或高嶺土)混合，或提供為軟膠嚢，其中活性成分與水或油介質(zhì)(例如花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。含水混懸劑包含與適合于制備含水混懸劑的賦形劑混合的活性材料。上述賦形劑是懸浮劑，例如羧曱基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基曱基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹(shù)膠以及阿拉伯樹(shù)膠；分散或潤(rùn)濕劑可以是天然產(chǎn)生的磷脂，例如，卵磷脂、或烯烴氧化物與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯石更脂酸酯，或環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪族醇的縮合產(chǎn)物，例如十七乙烯氧基十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或環(huán)氧乙》克與有亍生自脂肪酸和己泮唐醇的偏酯的縮合產(chǎn)物如聚氧乙烯山梨糖醇單油酯，或環(huán)氧乙烷與書(shū)亍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。含水混懸劑還可以包含一種或多種防腐劑，例如對(duì)羥基苯曱酸乙酯、或?qū)αu基苯甲酸正丙酯，一種或多種著色劑，一種或多種增香劑，以及一種或多種甜味劑，如蔗糖或糖精。可以通過(guò)將活性成分懸浮在植物油(例如花生油、橄欖油、麻油或椰子油)或礦物油(如液體石蠟)中來(lái)配制油性混懸劑。油性混懸劑可以包含增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟(或固體石蠟)或十六醇?？梢约尤胩鹞秳┖驮鱿銊┮蕴峁┛煽诘目诜苿??？梢酝ㄟ^(guò)加入抗氧化劑如抗壞血酸來(lái)^f呆存這些組合物。41通過(guò)加入水、適合于制備含水混懸劑的可分散的散劑和顆粒劑提供與分散或潤(rùn)濕劑、懸浮劑以及一種或多種防腐劑混合的活性成分。適宜的分散或潤(rùn)濕劑或懸浮劑通過(guò)上文已提及的那些來(lái)舉例說(shuō)明。還可以存在另外的賦形劑，例如甜P未劑、增香劑以及著色劑。本發(fā)明的藥物組合物還可以具有水包油乳劑的形式。油相可以是植物油或礦物油或它們的混合物。適宜的乳化劑可以是天然產(chǎn)生的樹(shù)膠，例如阿拉伯樹(shù)膠或黃蓍樹(shù)膠，天然產(chǎn)生的磷脂，例如大豆、卵磷脂、以及衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如山梨糖醇酐單油酸酯，以及所述偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯山梨4唐醇酐單油酸酯。乳劑還可以包含甜P未劑和增香劑。4唐漿和酏劑可以配制有甜P木劑，例如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖。這樣的劑型還可以包含緩和劑、防腐劑、增香劑以及著色劑。藥物組合物可以具有無(wú)菌可注射含水或含油混懸劑的形式。這種混懸劑可以按照已知的技術(shù)方法并利用上文已提及的那些適宜的分散或潤(rùn)濕劑以及懸浮劑來(lái)配制。無(wú)菌可注射制劑還可以是在無(wú)毒性腸胃外用(parentallyacceptable)稀釋劑或〉容劑中的無(wú)菌可注射溶液或混懸劑，例如作為在1，3-丁二醇中的溶液。在可以采用的可接受的賦形劑和溶劑中，可以采用水、林格氏液以及等滲氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌的固定油常規(guī)地用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可以采用任何溫和的固定油，其包括合成單甘油酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可用于制備可注射物。還可以以栓劑的形式給予本發(fā)明的核酸分子，例如，用于直腸給予藥物或經(jīng)由導(dǎo)管直接給予膀胱本身?？梢酝ㄟ^(guò)混合藥物與適宜的3卄刺激性賦形劑來(lái)制備這些組合物，其中非刺激性賦形劑在通常溫度下是固體但在直腸溫度下是液體，因而將在直腸中融化以釋放藥物。這樣的材料包括可可脂和聚乙二醇?？梢栽跓o(wú)菌介質(zhì)中腸外給予本發(fā)明的核酸分子。藥物，取決于所使用的賦形劑和濃度，可以被懸浮或溶解在賦形劑中。有利地，佐劑如局部麻醉劑、防腐劑以及緩沖劑可以被溶解在賦形劑中?？梢越Y(jié)合于載體材料以產(chǎn)生單給藥型的活性成分的量依賴(lài)于-故治療的宿主和特定的給藥方式而變化。給藥單位形式通常包含約1mg至約1000mg的活性成分。應(yīng)當(dāng)理解，用于任何特定患者或受試者的具體劑量水平取決于各種因素，其包括所采用的具體化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀態(tài)、性別、飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速率、藥物組合、以及經(jīng)受治療的特定疾病的嚴(yán)重性。為了歡會(huì)予非人動(dòng)物，還可以^l夸組合物力o入動(dòng)物飼^?；颉┐笥盟?。可以方使_;也配制動(dòng)物飼4牛和々大用水《且合物，以致動(dòng)物與其々大食一起攝取治療適量的組合物。還可以方便地將組合物提供為預(yù)混合料，用于加入祠料或飲用水。還可以連同其他治療性化合物將組合物纟合予受試者以增加總治療效果。4吏用多種化合物來(lái)治療一種適應(yīng)癥可以增加有益歲文果同時(shí)減少副作用的存在。表達(dá)(例如，IzantandWeintraub，1985，Science,229，345;McGarryandLindquist，1986，Pro"Natl.Acad.Sci"USA83,399;Scanlonetal"1991，Pro"Natl.Acad.Sci.USA，88，10591-5;Kashani畫(huà)Sabetetal"1992，AntisenseRes.Dev.,2，3-15;Dropulicetal.，1992，J.Virol"66，1432-41;Weerasingheetal.，1991,J.Virol"65，5531-4;Ojwangetal"1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,10802-6;Chenetal.，1992，NucleicAcidsRes.，20，4581-9;Sarveretal"1990Science,247,1222-1225;Thompsonetal,1995，NucleicAcidsRes.,23，2259;Goodetal.,1997,GeneTherapy,4,45;所有這些參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文)。本領(lǐng)i或4支術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解通過(guò)適當(dāng)?shù)腄NA/RNA載體，4壬4可核酸都可以在真核細(xì)月包中表達(dá)。一方面，本發(fā)明的表達(dá)性載體的特征在于，該載體包含編碼至少一種本發(fā)明的核酸分子的核酸序列。編碼本發(fā)明的核酸分子的核酸序列，以允許表達(dá)該核酸分子的方式可才喿作地連4妾。核酸分子序列的轉(zhuǎn)錄由用于真核RNA聚合酶I(pol1)、RNA聚合酶ii(poin)、或RNA聚合酶in(poini)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。來(lái)自poin或poini啟動(dòng)子的壽爭(zhēng)錄物以高7K平表達(dá)在所有細(xì)力包中；在給定細(xì)月包類(lèi)型中給定polII啟動(dòng)子的水平取決于附近存在的基因調(diào)節(jié)序列(增強(qiáng)子、沉默子等)的特性。還使用原核RNA聚合酶啟動(dòng)子，只要原沖亥RNA聚合酶表達(dá)在適當(dāng)?shù)募?xì)月包中(Elroy畫(huà)SteinandMoss，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87，6743-7;GaoandHuang1993,NucleicAcidsRes.，21,2867-72;Lieberetal"1993，MethodsEnzymol.，217，47-66;Zhouetal"1990,Mol.Cell.Biol"10,4529-37)。所有這些參考文獻(xiàn)以引用方式結(jié)合于本文。若干研究者已證明，核酸分子，如從上述啟動(dòng)子表達(dá)的核酶，可以在哺乳動(dòng)物細(xì)月包中起作用(例如，Kashani-Sabetetal"1992,AntisenseRes.Dev.,2,3-15;Ojwangetal"1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,10802-6;Chenetal,1992，NucleicAcidsRes.,20，4581-9;Yuetal"1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,6340-4;L'Huillieretal"1992，EMBOJ.，11，4411-8;Lisziewiczetal.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90，8000-4;Thompsonetal"1995,NucleicAcidsRes.，23,2259;Sullenger&Cech,1993,Science,262，1566)。另一方面，本發(fā)明的表達(dá)性載體的特征在于，該載體包含以允許表達(dá)核酸分子的方式編碼至少一種本發(fā)明的核酸分子的核酸序列。在一種實(shí)施方式中，上述表達(dá)性載體包含a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)編碼至少一種所述核酸分子的核酸序列；并且其中所述序列以允許表達(dá)和/或遞送所述核酸分子的方式可操作;也連4妾于所述起始區(qū)和所述終止區(qū)。本發(fā)明的另一目的是提供一種試劑盒，該試劑盒包括適宜的容器、力欠置在其中的本發(fā)明的藥用形式的治療劑、以及其^f吏用i兌明。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的核酸分子包括一種核酸分子，其是編碼本發(fā)明的ATAP、ATAP結(jié)合蛋白、和/或ATAP受體的核脊酸序列的互補(bǔ)體。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)的"是指核酸分子的核苷酸單位之間的沃森-克里克或Hoogsteen堿基配對(duì)，而術(shù)語(yǔ)"結(jié)合"是指兩種多肽或化合物或有關(guān)多肽或化合物或它們的混合物之間的物理或化學(xué)相互作用。結(jié)合包括離子相互作用、非離子相互作用、范德華力相互作用、疏水性相互作用等。物理相互作用可以是直才妄的或間才妄的。如在本文中所使用的，"片段"被定義為至少6個(gè)(連續(xù))核酸或至少4個(gè)(連續(xù))氨基酸的序列，其長(zhǎng)度足以在核酸的情況下允許特異性雜交或在氨基酸的情況下允許表位的特異性識(shí)別，并且最多是小于全長(zhǎng)序列的某個(gè)部分。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包括這樣的細(xì)胞，其可以用來(lái)攜帶異源性核酸、或表達(dá)由異源性核酸編碼的肽或蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以包含在天然(非重組)形式的細(xì)月包內(nèi)未發(fā)現(xiàn)的基因、在天然形式的細(xì)月包(其中通過(guò)人工方式基因#1修飾和再引入細(xì)胞)中發(fā)現(xiàn)的基因、或內(nèi)源于細(xì)胞(其被人工修飾但沒(méi)有將核酸移出細(xì)胞而)的核酸。宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。細(xì)菌培養(yǎng)所必須的一般生長(zhǎng)條件可在如BERGEY'SMANUALOFSYSTEMATICBACTERIOLOGY,Vol.1，N.R.Krieg，ed.，WilliamsandWilkins，Baltimore/London(1984)中找到。"宿主細(xì)胞"還可以是這樣的一種宿主細(xì)胞，其中內(nèi)源性基45因或啟動(dòng)子或兩者已被修飾以產(chǎn)生本發(fā)明的復(fù)合物的一種或多種多肽成分。"衍生物"是由天然化合物直接地、通過(guò)修飾、或通過(guò)部分取代而形成的組合物。"類(lèi)似物"是具有類(lèi)似于但不相同于天然化合物的結(jié)構(gòu)的核酸序列或氨基酸序列。本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)的衍生物或類(lèi)似物包括但不限于，包含基本上同源于本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)區(qū)域的分子，在各種實(shí)施方式中，相對(duì)于相同大小的核酸或氨基酸序列或當(dāng)與對(duì)比序列比較時(shí)(其中通過(guò)本才支術(shù)領(lǐng)域已知的計(jì)算才幾同源性程序進(jìn)4亍序列比對(duì))，達(dá)到至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%的同一性(其中優(yōu)選同一性為80-95%),或其編碼核酸是能夠在嚴(yán)格、中等嚴(yán)格、或低嚴(yán)格條件下雜交于編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的序列的互補(bǔ)體。參見(jiàn)例如，Ausubel,etal.,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y"1993。核酸衍生物和修飾包括通過(guò)基因替換、位點(diǎn)特異性突變、缺失、才翁入、重纟且、寸奮復(fù)、重纟且(shuffling)、內(nèi)"fe沖亥酸酶消^f匕、PCR、亞克隆、以及相關(guān)4支術(shù)獲得的那些。"同系物"可以是天然產(chǎn)生的，或通過(guò)人工合成一種或多種具有相關(guān)序列的核酸、或通過(guò)^f奮飾一種或多種核酸以產(chǎn)生相關(guān)核酸而產(chǎn)生的。當(dāng)核酸天然或人工地衍生自共同祖先序列時(shí)，則核酸是同源的(例如，直系同源物或旁系同源物)。如果沒(méi)有特意描述兩種核酸之間的同源性，則可以通過(guò)兩種或更多種序列之間的核酸比較來(lái)推導(dǎo)同源性。如果序列表現(xiàn)一定程序的序列相似性，例如，在一級(jí)氨基酸結(jié)構(gòu)水平大于約30%，則可以斷定它們共享共同的3且先。7十本發(fā)明來(lái)說(shuō)，如果核酸序列足夠類(lèi)似以允許在低嚴(yán)格條件下進(jìn)行重組和/或雜交，則基因是同源的。如在本文中所使用的，"雜交"是指在低、中、高嚴(yán)格條件下，分子僅結(jié)合雙鏈(duplexing)、或雜交于特定核苷酸序列，包括當(dāng)序列存在于復(fù)雜混合物(例如，總細(xì)月包)DNA或RNA中時(shí)。此外，普通技術(shù)人員會(huì)理解"保守突變，，還包括核酸的取代、缺失或添加，其會(huì)改變、添加或刪除編碼序列中的單氨基酸或少量氨基酸，其中核酸改變導(dǎo)致化學(xué)上類(lèi)似的氨基酸的取代。可以彼此保守取代的氨基酸包括堿性的精氨酸(R)、賴(lài)氨酸(K)、組氨酸(H);酸性的天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);親水的甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I);疏水的苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);含發(fā)u的甲石克氨酸(M)、半胱氨酸(C)。此外，差別在于保守變異的序列通常是同源的?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的分子生物技術(shù)(包括誘變、PCR、克隆等)的描述包括BergerandKimmel,GUIDETOMOLECULARCLONINGTECHNIQUES,METHODSINENZYMOLOGY,volume152,AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.(Berger);Sambrooketal.，MOLECULARCLONING—ALABORATORYMANUAL(2ndEd.),Vol.1-3，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989;和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,F.M.Ausubeletal"eds.，CurrentProtocols,GreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.合資(或合作)；Berger、Sambrook、Ausubel、以及Mullis等，美國(guó)專(zhuān)利第4,683,202號(hào)(1987);PCRPROTOCOLSAGUIDETOMETHODSANDAPPLICATIONS(Innisetal.eds),AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.(1990)(Innis);Arnheim&Levinson(Oct1,1990)。在又一實(shí)施方式中，利用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，在哺乳動(dòng)物細(xì)月包中表達(dá)本發(fā)明的核酸。關(guān)于用于原核和真核細(xì)月包的適宜的表達(dá)系統(tǒng)參見(jiàn)，例如，Chapters16and17ofSambrook，etal"MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL.2nded"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989。多核苷酸可以是DNA分子、cDNA分子、基因組DNA分子、或RNA分子。作為DNA或RNA的多核苦酸可以包括一種序列，其中T(胸香)還可以是U(尿嘧啶)。如果在多核苷酸的某個(gè)位置的核苷酸能夠與在反向平行DNA或RNA鏈中的相同位置的核苷酸形成沃S^-克里克配只于，那么多核苷酸和DNA或RNA分子在上述4立置處是彼此互補(bǔ)的。當(dāng)在每個(gè)分子中足夠數(shù)目的對(duì)應(yīng)位置被能夠彼此雜交的核苷酸占據(jù)以實(shí)現(xiàn)所期望的過(guò)程時(shí)，則多核苷酸和DNA或RNA分子是基本上4皮此互補(bǔ)的?？梢酝ㄟ^(guò)如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)用重組DNA來(lái)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。"轉(zhuǎn)化"是指在加入新DNA(即，對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)是外源的DNA)以后在細(xì)胞中誘導(dǎo)的永久或瞬時(shí)基因變化。在另一實(shí)施方式中，重組哺乳動(dòng)物表達(dá)載體能夠引導(dǎo)核酸優(yōu)先在特定細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)(例如，應(yīng)用組織特異性調(diào)節(jié)元件來(lái)表達(dá)核酸)。組織特異性調(diào)節(jié)元件在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是已知的。適宜的組織特異性啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括白蛋白啟動(dòng)子(肝特異的；Pinkert,etal.,1987.GenesDev.1:268-277)、淋巴特異性啟動(dòng)子(CalameandEaton,1988.Adv.Immunol.43:235-275)、尤其是T細(xì)月包受體的啟動(dòng)子(WinotoandBaltimore,1989.EMBOJ.8:729-733)和免疫3求蛋白(Banerji，etal.，1983.Cell33:729-740;QueenandBaltimore,1983.Cell33:741-748)、神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子(例如，神經(jīng)絲啟動(dòng)子；ByrneandRuddle,1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473-5477)、胰特異性啟動(dòng)子(Edlund,etal.,1985.Science230:912-916)、以及乳&,特異性啟動(dòng)子(例如，乳清啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利第4,873,316號(hào)以及歐洲申請(qǐng)7>開(kāi)第264,166號(hào))。還包括發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子(developmentally國(guó)regulatedpromoter)，侈寸^口,小鼠hox(murinehox)啟動(dòng)子(KesselandGmss，1990.Science249:374-379)以及甲胎蛋白啟動(dòng)子(CampesandTilghman，1989.GenesDev.3:537-546)。在任何實(shí)施方式中，編碼ATAP、ATAP結(jié)合蛋白、和/或ATAP受體的核酸可以呈現(xiàn)為一種或多種棵DNA;位于適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中并附加游離地(episomally)4呆持的一種或多種核酸；力口入宿主細(xì)胞的基因組中的一種或多種核酸；編碼復(fù)合物的組分的內(nèi)源性基因的<資飾形式；與一種或多種調(diào)節(jié)核酸序列結(jié)合的一種或多種核酸；或它們的混合物。核酸可以可選地在5，端、3，端、或在ORF內(nèi)的1"壬^T位置包含連"I妄肽(linkerp印tide)或融合蛋白組分，例^口，His-Tag、FLAG-Tag、焚光蛋白、GST、TAT、抗體部分、信號(hào)肽等。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸包含編碼ATAP受體的可溶(即，細(xì)胞外)部分的多核苷酸。利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物和遺傳方法，可以實(shí)施本文描述的任何實(shí)施方式。在宿主是原核細(xì)胞如大腸桿菌的情況下，能夠纟聶取DNA的感受態(tài)細(xì)胞可以由這樣的細(xì)胞制備，其在指數(shù)生長(zhǎng)期以后被收集隨后通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的方法用CaCl2法加以處理。可替換地，可以使用MgCl2、RbCl、月旨質(zhì)體、或脂質(zhì)體-蛋白質(zhì)復(fù)合物。還可以在形成宿主纟田月包的原生質(zhì)體以后或通過(guò)電穿孔來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。這些實(shí)例并不是限制本發(fā)明；存在許多技術(shù)來(lái)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且其應(yīng)當(dāng)考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)宿主是真核宿主時(shí)，上述用DNA進(jìn)行的轉(zhuǎn)染方法包括磷酸4丐共沉淀，常規(guī)4M^戒方法如孩"主射、電穿孔、嵌入包裹在脂質(zhì)體、或病毒栽體中的質(zhì)粒，以及可以-使用本^支術(shù)領(lǐng)域已知的其他轉(zhuǎn)染方法。真核細(xì)胞可以是酵母細(xì)月包(例如，S良酒酵母)或可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其包括人細(xì)胞。為了長(zhǎng)期、高產(chǎn)量生產(chǎn)重組蛋白，穩(wěn)定表達(dá)是優(yōu)選的。多肽在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的核酸分子，其編碼ATAP、ATAP結(jié)合蛋白、和/或ATAP受體多肽、抗體多肽、或它們的生物活性部分。可以例如^t姿照標(biāo)準(zhǔn)方法利用肽合成^f義，或通過(guò)在細(xì)胞或細(xì)胞提取物中分開(kāi)表達(dá)每種多肽，然后分離和純化多肽，來(lái)形成復(fù)合物的多肽。抗體如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"抗體"是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，其中抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性地結(jié)合抗原(與抗原進(jìn)行免疫反應(yīng))，抗體包含至少一個(gè)并且優(yōu)選兩個(gè)重(H)鏈可變區(qū)(本文中縮寫(xiě)為VH)、以及至少一個(gè)并且優(yōu)選兩個(gè)輕(L)鏈可變區(qū)(本文中縮寫(xiě)為VL)。上述抗體包括j旦不限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab、Fab'和F(ab')2片4殳，以及Fab表達(dá)文庫(kù)。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步尋皮細(xì)分為高變異區(qū)(regionofhypervariability)，^M乍"互詳卜決定區(qū)"("CDR")，其散在分布有更保守的區(qū)，稱(chēng)作"框架區(qū)"(FR)?？蚣軈^(qū)和CDR的范圍已被精確限定(參見(jiàn)，Kabat,E.A.，etal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242,以及Chothia,C.etal.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,其以引用方式結(jié)合于本文)。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，/人氨基末端排列至羧基末端其以以下順序排列FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。通常，獲自人類(lèi)的抗體分子涉及以下任^可類(lèi)型IgG、IgM、IgA、IgE以及IgD，其彼此間的差異在于分子中存在的重鏈的特性。某些類(lèi)型還具有亞類(lèi)，如IgGi、IgG2等。此外，在人類(lèi)中，輕鏈可以是K鏈或人鏈。本文所指的抗體包括人抗體種類(lèi)的所有上述類(lèi)、亞類(lèi)以及類(lèi)型。抗體可以制備自完整多肽或片a，其包括可用作免疫劑的感興趣的肽。優(yōu)選的抗原多肽片段是ATAP、ATAP結(jié)合蛋白、或ATAP受體蛋白的15-100個(gè)連續(xù)氨基酸。在一種實(shí)施方式中，肽位于多肽的非^爭(zhēng)膜結(jié)構(gòu)域，例如，位于細(xì)胞外或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。一種典型的抗的功能。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包4舌這樣的抗體，其可以識(shí)別ATAP、ATAP結(jié)合蛋白、和/或ATAP受體蛋白、它們的變體、部分和/或組合的一個(gè)或多個(gè)表位并且對(duì)于所述表位是特異的。在可替換的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體可以靶向并干擾ATAP/ATAP受體相互作用以抑制信號(hào)傳送。單克隆抗體的制備在本
技術(shù)領(lǐng)域：
是熟知的；參見(jiàn)例如，Harlowetal.,Antibodies:ALaboratoryManual,第726頁(yè)(ColdSpringHarborPub.1988)?？梢酝ㄟ^(guò)用包含抗原的組合物注射小鼠或兔來(lái)獲得單克隆抗體，并通過(guò)下述方法來(lái)ii實(shí)抗體產(chǎn)物的存在除去血清才羊品，除去脾以獲得B淋巴細(xì)胞，融合淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以產(chǎn)生雜交瘤，克隆雜交瘤，選4奪對(duì)抗原產(chǎn)生抗體的陽(yáng)性克隆，以及從雜交瘤培養(yǎng)物分離抗體。通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的技術(shù)可以從雜交瘤培養(yǎng)物分離和純化單克隆抗體。在其j也實(shí)施方式中，可以重組產(chǎn)生抗體，例如，通過(guò)謹(jǐn)菌體展示或通過(guò)纟且合的方法(combinatorialmethod)產(chǎn)生。p藍(lán)菌體展示和組合方法可以用來(lái)分離重組抗體，其結(jié)合于A(yíng)TAP、ATAP結(jié)合蛋白、和/或ATAP受體蛋白或它們的片段(如在例如，Ladner等，美國(guó)專(zhuān)利第5,223,409號(hào);Fuchsetal.(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hayetal.(1992)HumAntibodHybridomas3:81-85;Huseetal.(1989)Science246:1275-1281;Clacksonetal.(1991)Nature352:624-628;Grametal.(1992)PNAS89:3576-3580中所描述的)。還可以利用攜帶人免疫球蛋白基因而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)產(chǎn)生人單克隆抗體。來(lái)自這些轉(zhuǎn)基因小鼠(用感興趣的抗原加以免疫)的脾細(xì)胞用來(lái)產(chǎn)生雜交瘤，其分泌對(duì)于來(lái)自人蛋白的表^f立具有凈爭(zhēng)異親禾口力的人mAb(參見(jiàn)，例3口，Woodetal.InternationalApplicationWO91/00906;Lonberg，N.etal.1994Nature368:856-859;Green,L.L.etal.1994NatureGenet.7:13-21;Morrison,S.L.etal.1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855)。本發(fā)明的復(fù)合物的成分或復(fù)合物本身的對(duì)治療有用抗體可以衍生自"人源化"單克隆抗體。通過(guò)將小鼠互補(bǔ)決定區(qū)從小鼠免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)轉(zhuǎn)移到人可變結(jié)構(gòu)域，然后將人殘基引入小鼠對(duì)應(yīng)部分的框架區(qū)，來(lái)產(chǎn)生人源化單克隆抗體。使用衍生自人源化單克隆抗體的抗體成分可以避免與小鼠恒定區(qū)的免疫原性有關(guān)的潛在問(wèn)題。用于產(chǎn)生人源化單克隆抗體的4支術(shù)可以在Jonesetal"TVaf,321:522，1986以及Singeretal"乂/附應(yīng)"o/.150:2844,1993中找到?？贵w還可以源于分離自組合免疫J求蛋白文庫(kù)的人4元體片,殳；參見(jiàn)，侈'H口，Barbasetal"Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2,119，1991。此夕卜，通過(guò)剪接來(lái)自小鼠抗體的人抗體分子的基因，可以獲得嵌合抗體；參見(jiàn)，例如，Takedaetal.，A^w314:544-546,1985。嵌合抗體是一種抗體，其中不同部分衍生自不同的動(dòng)物物種?？筥個(gè)體基因型技術(shù)可以用來(lái)產(chǎn)生模擬表位的單克隆抗體。對(duì)于第一單克隆抗體構(gòu)成的抗獨(dú)特型單克隆抗體將具有在高可變區(qū)中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其是由第一單克隆抗體結(jié)合的表位的"圖像"。可替換地，用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)可以用來(lái)產(chǎn)生單鏈抗體。通過(guò)氨基52酸橋來(lái)連接Fv區(qū)的重和輕鏈片段以形成單鏈抗體，從而產(chǎn)生單鏈多肽。通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的技術(shù)可以產(chǎn)生識(shí)別特異性表位例如細(xì)胞外表位的抗體片段。這樣的片段包括通過(guò)蛋白水解消化而產(chǎn)生的Fab片段、以及通過(guò)還原二硫橋鍵所產(chǎn)生的Fab片段。當(dāng)用于免疫療法時(shí)，單克隆抗體、其片#爻、或兩者可以是未標(biāo)記的或標(biāo)記有治療劑。通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的技術(shù)，這些制劑可以直接或間接地耦合于單克隆抗體，并且包括這樣的制劑如藥物、放射性同位素、凝集素以及毒素。用于給予單克隆抗體的劑量范圍足夠大以產(chǎn)生所期望的效應(yīng)，而且將隨年齡、病癥、體重、性別、4寺治療的病癥的時(shí)期和程度而變化，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。劑量可以是約0.1mg/kg至約2000mg/kg?？梢砸造o月永內(nèi)、腹膜內(nèi)、月幾內(nèi)、和/或皮下方式給予單克隆抗體。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，由抗原肽包含的至少一個(gè)表位是ATAP、ATAP結(jié)合蛋白、和/或ATAP受體的一個(gè)區(qū)，其位于蛋白質(zhì)的表面上，例如，親水區(qū)。蛋白質(zhì)序列的疏水性分析將表明多肽的哪些區(qū)是特別親水的，因而可能編碼可用于靶向抗體產(chǎn)生的表面殘基。作為一種用于輩巴向抗體產(chǎn)生的方式，可以通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的4壬^"方法來(lái)產(chǎn)生顯示親水性區(qū)和疏水性區(qū)的親水性圖，上述方法包4舌，例如，KyteDoolittle或HoppWoods法，每種方法^f昔助于或不^f昔助于4專(zhuān)里葉變4奐。參見(jiàn)，例如，HoppandWoods,1981,尸rac7V^.^c^.Sc/.USA78:3824-3828;KyteandDoolittle1982，《/Mo/.腸/.157:105-142,上述每個(gè)文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。本文還提供了對(duì)于抗原蛋白內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域具有特異性的抗體、或其衍生物、片段、類(lèi)似物或同系物。本發(fā)明的蛋白質(zhì)、或其衍生物、片段、類(lèi)似物、同系物或直系同源物，在產(chǎn)生免疫特異性地結(jié)合這些蛋白成分的抗體時(shí)，可以用作免疫原。人抗體完全人抗體基本上涉及這樣的抗體分子，其中輕鏈和重《連的整個(gè)序列(包括CDR)產(chǎn)生于人基因。在本文中這樣的抗體稱(chēng)作"人抗體"、或"完全人抗體"?？梢酝ㄟ^(guò)三源雜交瘤技術(shù)(triomatechnique)、人B細(xì)月包雜交瘤4支術(shù)(參見(jiàn)Kozbor,etal.,1983ImmunolToday4:72)以及可產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(參見(jiàn)Cole:etal.，1985In:MONOCLONALANRIBODIESANDCANCERTHERAPY,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96)來(lái)制備人單克隆抗體。人單克隆抗體可以用于實(shí)施本發(fā)明并且可以通過(guò)利用人雜交瘤(參見(jiàn)Cote，etal.，1983.ProcNatlAcadSciUSA80:2026-2030)或通過(guò)用埃巴病毒體外轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞(參見(jiàn)Cole,etal.，1985In:MONOCLONALANTIBODIESANDCANCERTHERAPY,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96)加以制備。此外，還可以利用另外的^支術(shù)，包^"虔菌體展示文庫(kù)來(lái)制備人抗體(HoogenboomandWinter,/Mo/.飾/.227:381(1991);Marksetal.，JMo/.Ao/.，222:581(1991))。類(lèi)似地，可以通過(guò)將人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)制備人抗體，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如為，其中內(nèi)源性免疫^(guò)求蛋白基因已凈皮部分或完全滅活的小鼠。在刺激以后，7見(jiàn)測(cè)到人抗體產(chǎn)生，其在所有方面非常地類(lèi)似于在人類(lèi)中，見(jiàn)測(cè)到的情況，包括基因重排、組裝(assembly)、以及抗體性能(antibodyrepertoire)。例如，在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,545,807;5,545,806;5,569,825;5，625，126;5,633,425;5,661,016,以及在Marksetal.(5zo/:Tec;mo/og7，10:779-783(1992));Lonbergetal.(胸,，368:856-859(1994));Morrison(淑,，368:812-13(1994》；Fishwildetal，(淑廳B/她c/mo/ogy,14:845-51(1996));Neuberger14:826(1996));以及LonbergandHuszar(/w^t.iev./附ww"o/"13:65-93(1995))中描述了這種方式。另外可以利用轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物來(lái)制備人抗體，其中轉(zhuǎn)基因非人的內(nèi)源性抗體。在非人宿主中編碼免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的內(nèi)源性基因已被滅活(incapacitated),并且將編碼人免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的活性基因座插入宿主的基因組。例如，利用包含必要的人DNA節(jié)段的酵母人工染色體引入人基因。然后通過(guò)雜交繁育包含比完全互補(bǔ)體(fullcomplement)更少1奮飾的中間轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)獲得提供所有所期望的修飾的動(dòng)物作為子代。這樣的非人動(dòng)物的優(yōu)選實(shí)施方式是小鼠，并且稱(chēng)作Xenomouse,如在PCT乂^開(kāi)WO96/33735和WO96/34096中所4皮露的。Fab片段和單鏈抗體根據(jù)本發(fā)明，技術(shù)可以適合于生產(chǎn)對(duì)本發(fā)明的抗原蛋白具有特異性的單鏈抗體(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利第4,946,778號(hào))。此外，方法可以適合于構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(參見(jiàn)例^t口，Huse,etal"Sc/ewce246:1275-1281(1989))以允許快速和有效鑒定對(duì)于蛋白質(zhì)或其衍生物、片段、類(lèi)似物或同系物具有所期望的特異性的單克隆Fab片段。可以通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的技術(shù)來(lái)制備包含針對(duì)蛋白抗原的獨(dú)特型的抗體片段，其包括但不限于(i)通過(guò)胃蛋白酶消化抗體分子所制備的F(ab')2片段；(ii)通過(guò)還原F(ab')2片段的二碌u橋鍵所產(chǎn)生的Fab片4殳；(iii)通過(guò)用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子所產(chǎn)生的Fab片段；以及(iv)Fv片段。雙特異性抗體雙特異性抗體是單克隆的、優(yōu)選人或人源化抗體，其對(duì)于至少兩種不同的抗原具有結(jié)合特異性。在這種情況下，結(jié)合特異性之一是本發(fā)明的抗原蛋白。第二結(jié)合靶是任何一種其他抗原，并且有利地是細(xì)胞表面蛋白或受體或受體亞單位。用于制備雙特異性抗體的方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
是已知的。通常，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)是基于兩個(gè)免疫J求蛋白重鏈/輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中上述兩種重鏈具有不同的特異性(MilsteinandCuello,A^wre,305:537-539(1983))。由于免疫J求蛋白重鏈和輕鏈的隨才幾分配，這些雜交瘤(四體雜交瘤)會(huì)產(chǎn)生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中<又一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。在1993年5月13日公開(kāi)的WO93/08829以及Trauneckeretal.，五MS(9丄，10:3655-3659(1991)中才皮露了類(lèi)似的方法。可以將具有期望的結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變結(jié)構(gòu)域融合于免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。關(guān)于產(chǎn)生雙特異性抗體的詳情可參見(jiàn)，例3口，Sureshetal.,MeAoA五"zy附o/ogy,121:210(1986)以及Bren腿etal.,5W置e229:81(1985)。另外，可以從大腸桿菌直接回收Fab'片段并進(jìn)行化學(xué)耦合以形成雙特異性抗體。Shalabyetal.,/175:217-225(1992)描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab')2分子的生產(chǎn)。每種Fab'片段分別分泌自大腸桿菌并經(jīng)受體外定向化學(xué)耦合以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合于過(guò)度表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞，并且觸發(fā)針對(duì)人乳腺腫瘤靶的人毒性淋巴細(xì)胞的裂解活性。已描述了直4妄乂人重組細(xì)月包培養(yǎng)物來(lái)制備和分離雙特異性抗體片段的各種技術(shù)。例如，已利用亮氨酸拉鏈來(lái)生產(chǎn)雙特異性抗體。Kostelnyetal"J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。由Hollingeretal.,尸rac.iV""」cadUSA90:6444-6448(1993)描述的"雙體分子(雙價(jià)分子，diabody)"技術(shù)已提供一種可替換的機(jī)制來(lái)制備雙特異性抗體片段。還報(bào)告了通過(guò)利用單鏈Fv(sFv)二聚體來(lái)制備雙特異斗生4元體片革殳的另一種方法。參見(jiàn)，Gruberetal.,乂/wmwwo/.152:5368(l994)。可以考慮具有兩個(gè)以上化合^f介的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。Tuttetal.，//mwimo/.147:60(1991)。雙特異性抗體還可以用來(lái)將細(xì)胞毒劑引向表達(dá)特定抗原的細(xì)胞。這些抗體具有抗原結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒劑或放射性核素螯合劑的臂，如EOTUBE、DPTA、DOTA、或TETA。異源偶耳關(guān)抗體(heteroconjugateantibody)異源偶聯(lián)抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。異源偶聯(lián)抗體由兩個(gè)共<介連接的抗體組成。例如，已提出這樣的抗體將免疫系統(tǒng)細(xì)胞耙向不希望有的細(xì)月包(美國(guó)專(zhuān)利第4,676,980號(hào))，以及用于治療HIV感染(WO91/00360、WO92/200373、EP03089)?？紤]可以利用合成蛋白質(zhì)化學(xué)中的已知方法(包括那些涉及交聯(lián)劑的方法)來(lái)體外制備抗體。例如，可以利用二硫鍵交換反應(yīng)或通過(guò)形成硫酯鍵來(lái)構(gòu)建免疫毒素。用于此用途的適宜試劑的實(shí)例包纟舌亞氨基辟^醇鹽(iminothiolate)和甲基-4-巰基丁基亞氨(或2-亞氨基石危雜環(huán)戊烷，methyl畫(huà)4-mercaptobutyrimidate)以及例戈口在美國(guó)專(zhuān)利第4,676,980號(hào)中所披露的那些試劑。免疫偶耳關(guān)物(immunoconjugate)本發(fā)明還涉及免疫偶聯(lián)物，其包含結(jié)合于化學(xué)劑、或放射性同位素的抗體(即，放射性偶聯(lián)物)的抗體。利用各種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡咬基二碌u酚)丙酸酯(SPDP)、2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(如己二亞氨酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、雙疊氮基化合物(如雙(對(duì)疊氮苯曱酰基)己二胺)、雙重氮書(shū)f生物(如雙(對(duì)重氮苯曱?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(如2，6-甲苯二異氰酸酯)、以及雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，來(lái)制備抗體和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物。如在Vitettaetal.,5We"ce,238:1098(1987)中所描述的，例如，可以制備蓖麻毒素蛋白免疫毒素。碳-14-標(biāo)記的1-異57硫氰酰節(jié)基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一種典型的螯合劑，用于將力文射性核苷酸共輒于抗體。參見(jiàn)WO94/11026。免疫脂質(zhì)體本文披露的抗體還可以配制成免疫脂質(zhì)體。通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法來(lái)制備包含抗體的脂質(zhì)體，如在Epsteinetal.,7Va"加c/.5W.USA,82:3688(1985);Hwangetal.,尸腦.淑/」cc^.5"c,..USA,77:4030(1980);以及美國(guó)專(zhuān)利第4，485，045號(hào)和第4,544,545號(hào)中所描述的。美國(guó)專(zhuān)利第5,013,556號(hào)披露了具有延長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體。通過(guò)反相蒸發(fā)法使用包含磷脂酰膽堿、膽固醇、以及聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組成，可以產(chǎn)生特別有用的脂質(zhì)體。通過(guò)規(guī)定孔徑的過(guò)濾器擠壓脂質(zhì)體以產(chǎn)生具有所期望直徑的月旨質(zhì)體。如在Martinetal.，/5/o/.C7e附.257:286-288(1982)中所描述的，可以借助于二硫鍵交換反應(yīng)，將本發(fā)明的抗體的Fab'片段結(jié)合于脂質(zhì)體。本發(fā)明的抗體的治療有效量一般是指為達(dá)到治療目標(biāo)所需要的量。如上所述，這可以是抗體和其靶抗原之間的結(jié)合相互作用，其在某些情況下干擾靶起作用，而在其他情況下則促進(jìn)生理應(yīng)答。此外需要給予的量將取決于抗體對(duì)于其特異性抗原的結(jié)合親和力，并且還將取決于給予的抗體從所給予其他受試者的自由容積排出的速率。本發(fā)明的抗體或抗體片段的治療有效劑量的常見(jiàn)范圍可以是，通過(guò)非限制性實(shí)例，約0.1mg/kg體重至約500mg/kg體重。通常的用藥頻率可以是，例如，每天兩次至每周一次?？梢砸运幬锝M合物的形式給予特異性地結(jié)合本發(fā)明的蛋白質(zhì)的抗體、以及通過(guò)本文披露的篩選測(cè)定所鑒定的其他分子，來(lái)治療各種病癥。在制備上述組合物時(shí)所涉及的原則和要考慮的問(wèn)題、以及成分選才奪的指導(dǎo)可以參見(jiàn)，例如，Remington:TheScienceAndPracticeOfPharmacy19thed.(AlfonsoR.Gennaro,etal"editors)MackPub.Co.,Easton，Pa.:1995;DrugAbsorptionEnhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,AndTrends,HarwoodAcademicPublishers,Langhorne,Pa"1994;以及PeptideAndProteinDrugDelivery(AdvancesInParenteralSciences,Vol.4)，1991，M.Dekker，NewYork。還可以將活性成分包封在孩M交嚢(例如，通過(guò)凝聚才支術(shù)或通過(guò)界面聚合而制得，例如，羥甲基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸甲酯)微膠嚢)中，分別在膠體給藥系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳、納米顆粒、以及納米膠嚢)中或粗乳狀液中。用于體內(nèi)給藥的劑型必須是無(wú)菌的。這可以容易地通過(guò)無(wú)菌濾膜的過(guò)濾來(lái)實(shí)王見(jiàn)?？梢灾苽渚忈屩苿?。緩釋制劑的適宜實(shí)例包括包含抗體的固體疏水聚合物的半透基質(zhì)，該基質(zhì)具有成形物品的形式，例如，薄膜、或微膠嚢。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專(zhuān)利第3,773,919號(hào))、L-谷氨酸和Y-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(可注射的微球體，由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成)、以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得能夠釋放分子100天以上，但某些水凝膠只能釋放蛋白質(zhì)較短的時(shí)間。ELISA測(cè)定用于才企測(cè)分析蛋白的制劑是能夠結(jié)合于分析蛋白的抗體，優(yōu)選具有可4全測(cè)標(biāo)記的抗體?？贵w可以是多克隆抗體，或更優(yōu)選為單克隆抗體。可以使用完整的抗體、或其片段(例如，F(xiàn)ab或F(ab)2)。相對(duì)于探針或抗體來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記的"旨在包括通過(guò)將可4企測(cè)物質(zhì)耦聯(lián)(即，物理連4妄)于探針或抗體所獲得的纟果針或抗體的直接標(biāo)記，以及通過(guò)與被直接標(biāo)記的另一種試劑的反應(yīng)性獲得探針或抗體的間接標(biāo)記。間接標(biāo)記的實(shí)例包括利用焚光標(biāo)記二抗和借助于生物素的DNA纟笨4十的末端標(biāo)記來(lái)4僉測(cè)一抗以致它可以用熒光標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素加以檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)"生物樣品"旨在包括分離自受試者的組織、細(xì)月包和生物流體，以及受試者體內(nèi)存在的《且織、細(xì)月包和流體。因此，應(yīng)用術(shù)語(yǔ)"生物樣品"包括血液和血液的部分或組分，其包括血清、血漿、或'淋巴液。即，本發(fā)明的才全測(cè)方法可以用來(lái)體外以及體內(nèi)^r測(cè)生物樣品中的分析物mRNA、蛋白質(zhì)、或基因組DNA。例如，用于4企測(cè)分析物mRNA的體外技術(shù)包括Northern雜交和原位雜交。用于檢測(cè)分析蛋白質(zhì)的體外技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀、以及免疫熒光。用于檢測(cè)分析物基因組DNA的體外技術(shù)包括Southern雜交。例如在"ELISA:TheoryandPractice:MethodsinMolecularBiology"，Vol.42，J.R.Crowther(Ed.)HumanPress,Totowa,N丄,1995;"Immunoassay",E.DiamandisandT.Christopoulus,AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif"1996;以及"PracticeandThoryofEnzymeImmunoassays",P.Tijssen，ElsevierSciencePublishers,Amsterdam,1985中描述了用于進(jìn)行免疫測(cè)定的程序。此外，用于檢測(cè)分析蛋白質(zhì)的體內(nèi)技術(shù)包括將標(biāo)記的抗分析蛋白質(zhì)的抗體引入受試者。例如，抗體可以標(biāo)記有放射性標(biāo)記，其在受試者中的存在和位置可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)成{象4支術(shù)，腔內(nèi)或透過(guò)皮月夫地，單獨(dú)或連同效應(yīng)細(xì)月包而加以才企測(cè)。用于癥會(huì)予本發(fā)明的治療劑的制劑包括無(wú)菌水溶液或非水溶液、混懸劑、以及乳劑。非水溶劑的實(shí)例是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，以及可注射有機(jī)酯如油酸乙酯。含水載體包括水、醇/水溶液、乳劑或混懸劑，其包括鹽水和緩沖介質(zhì)。賦形劑包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏靜脈內(nèi)賦形劑，其包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物(replenisher)、電解質(zhì)補(bǔ)充物等?？梢约尤敕栏瘎┖推鋇f也添加劑如抗孩i生物劑、抗氧4b劑、螯合劑以及惰性氣體等。本發(fā)明的化合物、核酸分子、多肽、以及抗體(本文中還稱(chēng)作"活性化合物")，以及其衍生物、片段、類(lèi)似物和同系物可以被加入適合于給予的藥物組合物。這樣的組合物通常包含核酸分子、蛋白質(zhì)、或抗體以及藥用載體。如在本文中所使用的，"藥用載體"旨在包括任何和所有與藥物給予相容的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。適宜的載體描述在最近的版本的Remington'sPharmaceuticalSciences-本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考教科書(shū)中,其以引用方式結(jié)合于本文。這樣的載體或稀釋劑的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于水、鹽水、4木才各氏液(finger'ssolution)、葡萄并唐溶液、以及5%人血清白蛋白。還可以使用脂質(zhì)體和非水載體如不揮發(fā)性油。上述用于藥物活性物質(zhì)的介質(zhì)和制劑的使用是本
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熟知的。除非任何常規(guī)的介質(zhì)或制劑與活性化合物不相容，否則可以考慮其用于組合物中。還可以將輔助性活性化合物加入組合物。將本發(fā)明的藥物組合物配制成與其所期望的給予途徑相容。給予途徑的實(shí)例包括腸胃外，例如，靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口月l(例如，吸入)、透過(guò)皮膚(即，局部)、透粘膜、腹腔內(nèi)、以及直腸給予。用于腸胃夕卜、皮內(nèi)、或皮下使用的溶液或混懸劑可以包括以下組分無(wú)菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸曱酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞石克酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA);緩沖劑如乙酸鹽、4外蒙酸鹽或A粦酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)張力的制劑如氯化鈉或葡萄4唐?？梢杂盟峄蚴?，如鹽酸或氫氧4b鈉，來(lái)調(diào)節(jié)pH?？梢詫⒛c胃外制劑裝入安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶(由玻璃或塑料制成)。適用于注射1"吏用的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(其中水溶性的)或分散體以及用于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或分散體(dispersion)的無(wú)菌散劑。對(duì)于靜脈內(nèi)給予，適宜的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor(BASF，Parsippany，N丄)或磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。在所有情況下，組合物必須是無(wú)菌的并且應(yīng)當(dāng)是流體可達(dá)到容易注射的禾呈度。它在制備和貯藏條4牛下必須是賴(lài)、定的，并且必須防止它受到樣吏生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、以及液體聚乙二醇等)、以及它們的適宜混合物。例如，通過(guò)使用涂層如卵磷脂、在分散體的情況下通過(guò)保持所需要的顆粒大小以及通過(guò)使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？梢酝ㄟ^(guò)各種抗菌和抗真菌劑，例如，對(duì)羥基苯曱酸酯類(lèi)、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等，來(lái)防止樣t生物的作用。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如，并唐、多元醇(如甘露醇、山梨醇)、氯4匕鈉?？梢酝ㄟ^(guò)在纟且合物中包括延遲吸收的制劑，例如，單硬脂酸鋁和明膠，來(lái)延長(zhǎng)可注射組合物的p及收?？梢酝ㄟ^(guò)將所需量的活性化合物(例如，本發(fā)明的治療性復(fù)合物)加入包含上述一種或多種成分的適當(dāng)溶劑中，當(dāng)需要時(shí)，接著過(guò)濾除菌，來(lái)制備無(wú)菌可注射溶液。通常，通過(guò)將活性化合物加入無(wú)菌賦形劑來(lái)制備分散體，其中無(wú)菌載體包含基本的分散介質(zhì)和需要的其他來(lái)自上述的成分。在用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌散劑的情況下，制備方法是真空干燥和冰凍干燥，其產(chǎn)生活性成分的粉末加上來(lái)自其先前無(wú)菌過(guò)濾溶液的任何另外的所期望的成分?？诜M合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體?？梢詫⑺鼈冄b入明膠膠嚢或壓制成片劑。對(duì)口服治療性給予來(lái)說(shuō)，活性化合物可以結(jié)合于4甫藥(excipient)并以片劑、含片(troche)或月交嚢劑的形式加以4吏用。還可以利用流體載體來(lái)制備口力良組合物，用作漱口劑，62其中在流體載體中的化合物是口服使用和發(fā)出嘩嘩聲并且被吐出或咽下。可以包括藥物相容粘合劑、和/或佐劑材料作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠嚢劑、含片等可以包含任何以下成分、或類(lèi)似特性的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃蓍樹(shù)膠或明膠；輔藥如淀凈分或乳4唐；崩解劑如海藻酸、Primogel、或玉米淀4分；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes;助流劑如膠態(tài)二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或增香劑如歐薄荷、水楊酸甲酯、或橙香料。為了口服給予，藥物組合物可以采用通過(guò)常規(guī)方式并借助于藥用輔藥，如粘合劑(例如，預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基曱基纖維素)；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫釣)；潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化硅)；崩解劑(例如，馬鈴薯淀4分或淀4分羥乙酸鈉)；或潤(rùn)濕劑(例如，月才圭碌^酸鈉)制成例如片劑或膠嚢劑的形式?？梢杂帽緵_支術(shù)領(lǐng)域熟知的方法來(lái)涂覆片劑。用于口服給予的液體制劑可以采用例如溶液、糖漿劑、或混懸劑的形式，或它們可以制成干產(chǎn)品，使用前與水或其他適宜載體混合?？梢酝ㄟ^(guò)常失見(jiàn)方式并借助于藥用添加劑，如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氬化食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水載體(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分餾^i物油)；以及防腐劑(例如，對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯曱酸丙酯或山梨酸)，來(lái)制備上述液體制劑。在適當(dāng)?shù)那闆r下，這些制劑還可以包含緩沖鹽、增香劑、著色劑、以及甜p未劑?？梢赃m當(dāng)?shù)嘏渲朴糜诳诜o予的制劑以控釋活性化合物。為了口含給予，組合物可以采用用常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。為了通過(guò)吸入給予，可以以來(lái)自力口壓包(pressurizedpacks)或噴霧器的噴霧劑的形式方便地遞送供根據(jù)本發(fā)明使用的化合物，其中借助于使用適宜的推進(jìn)劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化石友或其他適宜氣體。在加壓氣霧劑的情況下，可以通過(guò)^是供閥門(mén)來(lái)確定劑量單位以遞送計(jì)量的用量。供吸入器或吹入器之用的例如明膠的膠嚢劑和藥筒可以被配制成包含化合物和適宜粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物?；衔锟梢员慌渲瞥捎糜谀c胃外注射給予，例如，通過(guò)彈丸注射或連續(xù)llr注?？梢砸岳缭诎碴郴蛟诙鄤┝咳萜髦械膯挝粍┝啃问絹?lái)提供注射用劑型，其中加入有防腐劑。組合物可以采用這樣的形式如在油性或含7K賦形劑中的混懸劑、溶液、或乳劑，并且可以包含配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑、和/或分散劑?？蒦弄換地，〗吏用前，活性成分可以具有4分末形式，用于與適宜J3武形劑(例如，無(wú)菌無(wú)熱源7jC)混合。還可以;)夸化合物配制在直腸用組合物中，如^r劑或滯留型灌腸劑，例如，包含常規(guī)^全劑基質(zhì)如可可脂或其他甘油酯。除上述劑型以外，還可以將化合物配制成長(zhǎng)效倉(cāng)^f渚制劑(孩U求制劑，depotpreparation)?？梢酝ㄟ^(guò)植入(例如皮下或肌內(nèi))或通過(guò)肌內(nèi)注射來(lái)給予這樣的長(zhǎng)效劑型。因此，例如，可以用適宜的聚合或疏水材沖+(例如作為在可4妾受油中的乳劑)或離子交換樹(shù)脂來(lái)配制化合物，或化合物可以被配制成孩i溶衍生物，例如，配制成孩i溶鹽。為了通過(guò)吸入給予，可以以噴霧劑的形式遞送化合物，其中噴霧劑來(lái)自加壓容器或分配器(其包含適宜的推進(jìn)劑，例如，氣體如二氧化碳)或噴霧器。還可以通過(guò)透粘膜(或經(jīng)粘膜)或透過(guò)皮膚(或經(jīng)皮膚)方式來(lái)進(jìn)行系統(tǒng)給予。為了透粘膜或透過(guò)皮膚給予，可以在劑型中^f吏用適合于待滲透屏障的滲透劑。這樣的滲透劑在本
技術(shù)領(lǐng)域：
通常是已知的，并且包括，例如(用于透粘膜給予)，去污劑、膽鹽、以及夫西地酸書(shū)f生物。可以通過(guò)^f吏用鼻噴霧劑或;f全劑來(lái)完成透粘力莫給予。為了透過(guò)皮膚給予，可以將活性化合物配制到軟膏劑、藥膏、凝膠劑、或乳膏劑中(如本
技術(shù)領(lǐng)域：
通常已知的)。在一種實(shí)施方式中，可以用將保護(hù)化合物以免從體內(nèi)快速消除的載體來(lái)制備活性化合物，如控釋劑型，其包括植入物和微嚢化遞送系統(tǒng)。可以l吏用生物可降解的、生物相容聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、月交原、聚原酸酯、以及聚乳酸。用于制備料還可以商業(yè)上獲自AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals,Inc.。脂質(zhì)體懸浮液(包括靶向感染細(xì)胞的脂質(zhì)體，其具有相對(duì)于病毒抗原的單克隆抗體)也可以用作藥用載體。這些脂質(zhì)體懸浮液可以按照本領(lǐng)域:技術(shù)人員已知的方法加以制備，例如，如在美國(guó)專(zhuān)利第4,522,811號(hào)中所描述的。尤其有利的是，以劑量單位形式配制口服或腸胃外組合物，以1更于給予并實(shí)現(xiàn)劑量的均勻性。如在本文中所4吏用的，劑量單位形式是指適合于作為單位劑量的物理上分離的單位，用于待治療的受試者；每個(gè)單位包含預(yù)定量的活性化合物，用來(lái)連同所需要的藥物載體而產(chǎn)生所期望的治療效果。對(duì)本發(fā)明的劑量單位形式的技術(shù)要求(specification)受控于并依賴(lài)于活性化合物的獨(dú)特的特性和要達(dá)到的特定的治療效果、以及在復(fù)合這樣的用于治療個(gè)體的活性化合物的4支術(shù)領(lǐng)域中所固有的限制?？梢詫⒈景l(fā)明的核酸分子插入載體并用作基因治療載體?？梢酝ㄟ^(guò)，例如，靜月永注射、局部鄉(xiāng)會(huì)予(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利第5,328,470號(hào))或通過(guò)立體定向注射(參見(jiàn)例如，Chen,etal.，1994.iVoc.V加/.爿c"t/.5W.USA91:3054-3057)將基因治療載體遞送到受試者?；蛑委熭d體的藥物制劑可以包括在可接受稀釋劑中的基因治療載體，或可以包含其中包埋有基因遞送載體的緩釋基質(zhì)。可替換地，在可以從重組細(xì)胞完好地產(chǎn)生完整的基因遞送載體的情況下，例如，反轉(zhuǎn)錄病毒載體，藥物制劑可以包括產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的一種或多種65細(xì)胞?？梢詫⑺幬锝M合物與給藥說(shuō)明書(shū)，包括在容器、包、或分配器中。治療有效劑量是指足以改善或延遲癥狀的治療劑的量?？梢栽诩?xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中，通過(guò)例如用于確定LD50(導(dǎo)致50%的群體死亡的劑量)和ED50(可有效治療50%的群體的劑量)的標(biāo)準(zhǔn)制藥程序來(lái)確定上述化合物的毒性和治療效力。毒性和治療效果之間的劑量比率是治療指數(shù)并且它可以表示為比率LD50/ED50。呈現(xiàn)較大治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。雖然可以使用呈現(xiàn)毒性副作用的化合物，^旦應(yīng)當(dāng)小心i殳計(jì)這樣的遞送系統(tǒng)，其將上述化合物耙向受影響組織的部位以將對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損傷降低到最小程度，從而降低副作用。獲自細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)可以用于制定供人類(lèi)之用的劑量范圍。上述化合物的劑量?jī)?yōu)選在循環(huán)濃度的范圍內(nèi)，其中循環(huán)濃度包括ED50并具有4艮小或沒(méi)有毒性。劑量可以在該范圍內(nèi)變化，其取決于所采用的劑型和所使用的給予途徑。對(duì)于在本發(fā)明的方法中所使用的任何一種化合物，可以最初才艮據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定來(lái)估計(jì)治療有效劑量?？梢栽趧?dòng)物才莫型中配制一種劑量以達(dá)到這樣的循環(huán)血漿濃度范圍，其包括IC50(即，試驗(yàn)化合物的濃度，其達(dá)到癥狀的半最大抑制)，如在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的。上述信息可以用來(lái)更4青確;也確定在人類(lèi)中的有用劑量。可以，例力口，通過(guò)高步文液相層析，來(lái)測(cè)量血漿水平。才艮據(jù)本發(fā)明還4皮露了一種試劑盒或系統(tǒng)，其使用本文描述的任何一種方法、選才奪策略、材料、或成分。才艮據(jù)本發(fā)明4皮露內(nèi)容的典型的試劑盒將可選地、另外包括用于實(shí)施方法或測(cè)定的說(shuō)明書(shū)、包裝材料、一個(gè)或多個(gè)包含試樣的容器、裝置或系統(tǒng)部件等。根據(jù)本文的描述和優(yōu)選實(shí)施方式的實(shí)施例，本發(fā)明的另外的D的和優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言將是顯而易見(jiàn)的，并且明顯地包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例在Bfll和HCCS1中兩親尾4苗定結(jié)構(gòu)域是4呆守的。編碼Bfll(SCZZ4/或BCL2-相關(guān)蛋白Al)的基因位于染色體15q24.3上并且包含三個(gè)外顯子，其被轉(zhuǎn)錄到兩個(gè)可變剪接變體，Bfll(175a.a.)和Bflls(163a.a.)(Koetal.，2003b)中。Bfll(a.a.147-175)的尾錨定(TA)結(jié)構(gòu)域由外顯子3編碼。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索揭示了，在位于15q25.1上的HCCW(16.4kb)中5C丄Z47的外顯子3是保守的(圖1A)。5C丄Z4/和/ZCCS/的基因組序列的序列對(duì)比表明，包括外顯子3的^C丄Z4/的8.8kb片段和周?chē)姆蔷幋a區(qū)在//CCS7中是高度保守的，這可能是由于12個(gè)保守的基因片段的復(fù)制所致。的基因組序列還包含三個(gè)外顯子，其編碼91個(gè)氨基酸(圖1A)。HCCW的外顯子3的DNA序列與BC丄Z4J的DNA序列95°/"目同，并且分別開(kāi)始于HCCS1的E28和Bfll的E141,兩者具有相同的閱讀框(圖1B)。HCCS1包含一段28個(gè)氨基酸的序列(E28至L55),其相同于BfllTA的一段序列，只是在L35處的保守性改變(圖1C)。在HCCS1中在外顯子3的3'端的堿基對(duì)缺失導(dǎo)致讀框移位以及其后在HCCS1的C端處氨基酸序列的變化。序列對(duì)比表明Bcl2蛋白家族所有抗凋亡成員的TA結(jié)構(gòu)域的共同特點(diǎn)，其中疏水富集節(jié)段(HR)總是被N端旁側(cè)區(qū)(FR-1)和C端旁側(cè)區(qū)(FR-2)包圍(圖1E)。在FR-1和FR-2中的保守賴(lài)氨酸殘基相當(dāng)于TA肽的潛在MTS(參見(jiàn)下文)，而在Bfll(E159、K163以及E166)和HCCS1(E46、K50以及E53)的HR中的三個(gè)帶電荷殘基是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼈冊(cè)谄渌鸅c12家族蛋白中并不是保守的。利用SOPMA(GeourjonandDeleage,1995)和Jpred(Cuffetal"1998)程序進(jìn)行的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析可以預(yù)測(cè)TA肽的a-螺旋結(jié)構(gòu)(圖1C)。在a-螺旋旋轉(zhuǎn)圖(a-helicalwheelplot)中氨基酸的序列對(duì)比揭示了來(lái)自Bfll和HCCS1的TA肽的兩親特性，其中三個(gè)帶電荷殘基排列在a-螺旋的一側(cè)(圖1D)。因此，我們稱(chēng)這種結(jié)構(gòu)域?yàn)閮捎H尾錨定肽(ATAP)。為了研究TA對(duì)凋亡的影響，在HEK293細(xì)月包中瞬時(shí)表達(dá)FLAG-TA融合肽。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，通過(guò)硤化丙啶(PI)染色來(lái)7見(jiàn)測(cè)細(xì)胞死亡。雖然FLAG-標(biāo)簽全長(zhǎng)Bfl-l(FLAG-Bfl-l)沒(méi)有顯示對(duì)細(xì)胞的毒性作用，^旦FLAG-TA顯著i秀導(dǎo)細(xì)月包死亡并且這種毒性:帔50|_iM的OPH(—種泛半胱天冬酶抑制劑)阻斷(圖1F)。利用(3-半乳糖苷酶凈艮告測(cè)定來(lái)量化FLAG-TA的細(xì)另包毒活性(Chittendenetal.，1995;Woodetal.，2000)。<昔助于包含F(xiàn)LAGBfl-l或Flag-TA的質(zhì)4立連同包含P-半乳糖苷酶基因的質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，細(xì)胞活力的喪失反映了P-半乳糖苦酶活性的降低。FLAG-TA的瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo)致P-半乳糖普酶活性降低68.1±3.9%(11=5),其被50nMOPH所抑制(圖1G)。有趣的是，F(xiàn)LAG-Bcl-xL或FLAG-Bfl-l的表達(dá)導(dǎo)致增加的(3-半乳糖苷酶活性(FLAG-Bcl-xL相對(duì)于對(duì)照為1.32±0.13倍(n^5);以及FLAG-Bfl-l相對(duì)于對(duì)照為l.ll±0.06(n=5))，可能只于應(yīng)于Bcl-xL和Bfl-l的促存活活性。FLAG-標(biāo)簽蛋白的表達(dá)水平與它們的P-半乳糖苦酶活性相關(guān)(圖1H)。值得注意地，通過(guò)用50pM的OPH進(jìn)行處理會(huì)增加FLAG-TA的表達(dá)，這提示TA肽在經(jīng)受凋亡的細(xì)胞中耙向蛋白水解降解、或輩巴向與TA的表達(dá)有關(guān)的細(xì)月包死亡。ATAP誘導(dǎo)與Bax和Bak無(wú)關(guān)的凋亡。為了試驗(yàn)ATAP的纟田月包功能，將Flag-ATAP融合肽瞬時(shí)表達(dá)在HEK293細(xì)胞中以1更于利用抗Flag抗體來(lái)^r測(cè)重組蛋白(圖2A)。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，利用(3-半乳糖普酶報(bào)告測(cè)定來(lái)量化Flag-ATAP的細(xì)胞毒活性(Chittendenetal.,1995;WoodandNewcomb,2000)。借助于包含P-半乳糖苷酶基因和Flag-ATAPcDNA的質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，(3-半乳沖唐苷酶活性的降^f氐反映了細(xì)胞活力的喪失。和用才莫擬質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，在用Flag-ATAP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀(guān)測(cè)到P-半乳糖苷酶活性降低68.1±3.9%0=5),其可以通過(guò)加入50jiMOPH(—種泛半胱天冬酶抑制劑)力口以防止(圖2A)。此夕卜，在用OPH處理的細(xì)胞中觀(guān)測(cè)到Flag-ATAP的表達(dá)升高，這提示，ATAP是細(xì)胞死亡的有效觸發(fā)物或該肽在經(jīng)受凋亡的細(xì)胞中靶向蛋白水解降解。我們裝配了GFP-ATAP融合構(gòu)建體以可以對(duì)ATAP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡進(jìn)4亍活細(xì)"包成《象。如圖2B所示，瞬時(shí)表達(dá)GFP-ATAP的纟田月包呈現(xiàn)凝聚和片段化染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，這說(shuō)明細(xì)胞死亡的凋亡特性。借助于加入OPH，可以防止GFP-ATAP誘導(dǎo)的染色質(zhì)片段化。利用FACS測(cè)定來(lái)定量分一斤HEK293細(xì)月包中的GFP-ATAPi秀導(dǎo)凋亡，其中亞Gl細(xì)胞群體的提高用作經(jīng)受凋亡細(xì)胞的指示(圖2C)。很顯然，GFP-ATAP的促凋亡活性類(lèi)似于、或也許強(qiáng)于GFP-Bax(—種眾所周知的促凋亡蛋白)的促凋亡活性(Panetal.,2001;Smailietal.,2001)(圖2C)。作為對(duì)照，我們發(fā)現(xiàn)，包含Bcl-xLTA結(jié)構(gòu)域(a.a.202-233)(其附著于GFP的C端)的GFP-TAxL的表達(dá)在HEK293細(xì)胞中并不顯示4壬何毒性活性。為了試-驗(yàn)是否存在A(yíng)TAP的〗壬-f可一種細(xì)爿包型依賴(lài)凌文應(yīng)，將GFP-ATAP瞬時(shí)表達(dá)在具有不同遺4專(zhuān)背景的細(xì)月包系中。除HEK293和HeLa細(xì)胞以夕卜，我們還在MCF-7，一種半胱天冬酶-3缺陷人乳A袈癌癌細(xì)月包系(Janickeetal.,1998)，以及BMK-D3，書(shū)亍生自Z>"x-/—6d—/—小鼠的一種幼小鼠腎細(xì)胞系(Degenhardtetal.，2002)中試-驗(yàn)了GFP-ATAP。利用石典化丙啶(PI)排除方法進(jìn)行的細(xì)胞死亡分析揭示了，>90%的所有細(xì)胞類(lèi)型在GFP-ATAP的瞬時(shí)表達(dá)以后經(jīng)受凋亡(圖2D、E)。因?yàn)樵谌鄙貰ax和Bak的BMK-D3細(xì)胞中觀(guān)測(cè)到顯著的凋亡(圖2E和補(bǔ)充材并牛圖S2),所以GFP-ATAP的促凋亡活性并不需要Bax和Bak的參與。此外，GFP-ATAP對(duì)MCF-7細(xì)月包的強(qiáng)促凋亡效應(yīng)提示，ATAP可以通過(guò)不同于半胱天冬酶-3的半胱天冬酶起作用。ATAP的兩親特性對(duì)于其促凋亡活性來(lái)說(shuō)是必需的。因?yàn)樵贐fll和HCCS1的HR中的帶電荷殘基并不存在于其他Bc12家族蛋白中，以及因?yàn)樗鼈冇兄贏(yíng)TAP的兩親凈爭(zhēng)性，戶(hù)斤以我們通過(guò)定4立誘變?cè)?驗(yàn)了E159、K163以及E166對(duì)ATAP在Bfll中的促凋亡功能的作用。為便于確定亞細(xì)胞定位，將各種ATAP突變體融合于GFP(圖3A)。雖然單殘基的突變對(duì)ATAP的凋亡活性幾乎沒(méi)有影響，Y旦雙突變，例如E159Q-E166Q(mHR3)或E159L-E166L(mHR4),則顯著降^f氐A(chǔ)TAP的促凋亡功能(圖3B)。在mHR3中另外的突變(K163L)進(jìn)一步P爭(zhēng)4氐了ATAP在mHR7中的毒4生。有趣的是，包含E159K-E166K突變的mHR5構(gòu)建體〗以乎并不影響ATAP的促凋亡活性(圖3B),這提示，電荷守恒而不是電荷的極性與其促凋亡功能有關(guān)。利用p-半乳糖苷酶報(bào)告測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)，和Flag-ATAP構(gòu)建體相比，F(xiàn)lag-mHR3(其中GFP序列被Flag序列取代)也呈現(xiàn)顯著降4氐的細(xì)萬(wàn)包毒性作用。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，和來(lái)自GFP4t染細(xì)月包的酶活性相比，在Flag-ATAP轉(zhuǎn)染細(xì)胞中P-半乳糖苷酶活性為26.0±5.2%,而在FlagmHR3轉(zhuǎn)染細(xì)月包中貝'J為62.0±7.8%(w=5,尸〈0.001)(圖3C)。為了試驗(yàn)ATAP的兩親特性是否也與HCCS1的凋亡功能有關(guān)，將帶電荷殘基的相應(yīng)突變引入全長(zhǎng)/ZCCS7基因。如圖3D所示，包含對(duì)應(yīng)于BfllATAP的mHR3的突變的HCCS1-GFP(E46Q/E53Q)呈現(xiàn)顯著降低的細(xì)胞毒活性。在進(jìn)一步的研究中，我們還試驗(yàn)了在缺少Bak和Bax的表達(dá)的BMK-D3細(xì)胞中以及在用Bcl-xL穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)月包中ATAP和mHR7的影響(Panetal.,2000)(參見(jiàn)補(bǔ)充材料圖S2)。在親代CHO細(xì)胞(和過(guò)度表達(dá)Bcl-xL的CHO細(xì)胞相比)中、以及在BMK-wt細(xì)胞(和BMK-D3纟田月包相比)中觀(guān)測(cè)到70ATAP的類(lèi)似細(xì)胞毒性作用，這表明，ATAP的促凋亡功能與Bax、Bak以及Bcl-xL無(wú)關(guān)。此夕卜，雖然GFP-ATAP對(duì)CHO和BMK細(xì)胞系均顯示出有效的細(xì)胞毒性作用，但GFPmHR7顯示出^艮少細(xì)胞毒性?？偟膩?lái)i兌，這些結(jié)果i兌明，ATAP的促凋亡活性與肽的兩親性能緊密相關(guān)。ATAP革巴向線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換以i秀導(dǎo)凋亡。共焦顯纟敬4竟成^f象顯示，在A(yíng)TAP的E159、E166或K163處的突變并沒(méi)有改變其胞內(nèi)耙向性能。事實(shí)上，所有mHRl至mHR7突變體被定位到線(xiàn)粒體膜，類(lèi)似于野生型GFP-ATAP,其是基于共定位才莫式，其中mRFP-Mito瞬時(shí)表達(dá)在HeLa細(xì)胞中(圖4C)。來(lái)自其他研究者的先前研究已表明，位于TA結(jié)構(gòu)域的N端或C端的帶正電荷的殘基與將TA肽耙向線(xiàn)粒體有關(guān)(Borgeseetal.，2003;Kaufmannetal"2003)。我們發(fā)現(xiàn)，位于FR-1和FR-2中的保守賴(lài)氨酸殘基在將ATAP革巴向線(xiàn)粒體膜中具有關(guān)鍵作用(圖4)。雖然單賴(lài)氨酸殘基、K147L、K151L或K172L的突變似乎并沒(méi)有改變ATAP的線(xiàn)粒體耙向性能，但K147L-K151L(mFR4)的雙突變會(huì)引起GFP-ATAP的遠(yuǎn)離線(xiàn)粒體的4晉i吳耙向(mistargeting)(圖4C)。mFR4突變體主要定4立于細(xì)月包質(zhì)并且經(jīng)常形成力包質(zhì)或4亥周凝集體，并且和其〗也mFR構(gòu)建體相比具有顯著降低的促凋亡活性(圖4B)。在經(jīng)受凋亡的細(xì)胞中，染色體DNA的降解可以在包含比健康細(xì)月包更〗氐DNA含量的亞Gl細(xì)力包群中加以測(cè)量，或可以纟皮檢測(cè)為在瓊脂糖凝膠上的約180bp的DNA梯狀條帶(DNAladder)。如圖4D所示，表達(dá)GFP-ATAP和mHR5的HEK293細(xì)胞顯示出顯著更高百分率的亞Gl細(xì)"包，并且比那些表達(dá)mFR4、mHR3、mHR4或mHR7的HEK293細(xì)胞具有更廣泛的DNA梯形圖案。這證實(shí)了由ATAP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的凋亡特性。利用PI排除方法進(jìn)一步測(cè)定了各種ATAP突變體^f凋亡的時(shí)間相關(guān)歲丈應(yīng)(圖4E)。用ATAP或mHR5轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后48小時(shí)，多于95%的細(xì)胞是PI陽(yáng)性的，而僅約38%的表達(dá)mHR3或mHR4的細(xì)胞是PI陽(yáng)性的。在mHR7轉(zhuǎn)染細(xì)胞的情況下，在48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)僅19。/。的細(xì)胞是PI卩日性的(圖4E)。有趣的是，用mFR4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)的后期階段(例如，轉(zhuǎn)染后多于36小時(shí))呈現(xiàn)逐漸的細(xì)胞死亡。雖然mFR4的線(xiàn)粒體耙向似乎受到損害，但在線(xiàn)粒體處檢測(cè)到部分蛋白質(zhì)(圖4C)。一種可能性是，mFR4的延遲的毒性作用來(lái)自分子在線(xiàn)粒體膜處的逐漸積聚。針對(duì)mFR7突變體，發(fā)現(xiàn)一個(gè)特殊的例外，其中在FR-1和FR-2中的所有三個(gè)賴(lài)氨酸殘基被誘變成亮氨酸。不同于mFR4，mFR7仍然保持其靶向線(xiàn)粒體并具有有效的促凋亡活性(圖4B)。GFP-mFR7的一級(jí)氨基酸序列的分析鑒定了來(lái)自GFP的C端部分和pEGFP-Cl質(zhì)粒(其存在于A(yíng)TAP序列的近側(cè))的多克隆位點(diǎn)(MCS)的其他帶電荷殘基。就電荷含量和定位而言，該外序列類(lèi)似于Bcl-xL的FR-1區(qū)，其在Bfll旁側(cè)區(qū)內(nèi)沒(méi)有帶正電荷殘基的情況下可以作為MTS的替代物(參見(jiàn)補(bǔ)充材料圖S3)。實(shí)際上，這些帶正電荷殘基的缺失會(huì)消除mFR7的線(xiàn)粒體靶向并因此消除其促凋亡功能。此外，將11個(gè)氨基酸4妄頭序列(linkers叫uence)插入MCS同樣會(huì)消除mFR7的線(xiàn)粒體靶向并降低其凋亡活性。這些結(jié)果與Kaufmann等的先前研究才目一致(Kaufmannetal.,2003)JournalofCellScience120(16)并進(jìn)一步提示，帶電荷殘基必須留在HR節(jié)段附近以4夸ATAP有歲文革巴向到MOM?？偟恼f(shuō)來(lái)，我們的資料提示，位于A(yíng)TAP的N端旁側(cè)區(qū)中的賴(lài)氨酸殘基對(duì)ATAP耙向到線(xiàn)粒體來(lái)說(shuō)是必需的，以及ATAP的促凋亡活性與它同線(xiàn)粒體的結(jié)合緊密相聯(lián)。MTS和ATAP均涉及由HCCS1誘導(dǎo)的凋亡。HCCS1的一級(jí)氨基酸結(jié)構(gòu)包含一段18個(gè)氨基酸的序列(a.a.1-18)，其鄰近于A(yíng)TAP序列，并且可以用作HCCS1的可替換MTS(參見(jiàn)圖1C)。為了探查MTS和ATAP對(duì)HCCS1的凋亡功能的作用，我們用各種HCCSl缺失突變體產(chǎn)生了GFP融合構(gòu)建體(圖5A)。由于由ATAP產(chǎn)生的高水平毒性，所以在實(shí)—驗(yàn)中在細(xì)胞培養(yǎng)基中必須包括50iLiMOPH，其中我們將各種GFP融合構(gòu)建體的線(xiàn)粒體定位才莫式可視化。如圖5B所示，在HeLa細(xì)月包中，HCCS1-GFP、以及GFP-ATAP(HCCS1)呈現(xiàn)與mRFP-Mito的緊密共定位，這說(shuō)明HCCS1特異性輩巴向線(xiàn)粒體月莫。GFP附著于缺少M(fèi)TS、GFP-HCCS1(AMTS)的HCCS1的N端，還揭示了特有的線(xiàn)粒體定位模式，這證實(shí)了我們的觀(guān)測(cè)結(jié)果HCCS1的ATAP結(jié)構(gòu)域包含內(nèi)在的MTS。有趣的是，GFP附著于缺少M(fèi)TS的HCCS1的C端會(huì)引起HCCS1(AMTS)-GFP遠(yuǎn)離線(xiàn)粒體的錯(cuò)誤靶向。這與早先的研究結(jié)果一致，其說(shuō)明較大部分加入TA蛋白的C端會(huì)石皮壞它們的胞內(nèi)乾向性能(Johnstonetal.,2002)。MTS-GFP還呈現(xiàn)典型的線(xiàn)粒體定位模式，這表明HCCS1的MTS結(jié)構(gòu)域具有線(xiàn)粒體耙向性能(圖5B)。因此，HCCS1包含用于線(xiàn)粒體定位的雙靶向信號(hào)，一個(gè)在N端(MTS)且一個(gè)在C端(ATAP)。利用PI排除方法進(jìn)行的細(xì)胞活力分析表明，MTS-GFP在HeLa細(xì)胞中沒(méi)有毒性作用，而HCCS1國(guó)GFP、GFP畫(huà)HCCS1(AMTS)以及GFP-ATAP(HCCS1)均呈現(xiàn)有效的促凋亡活性，其可以通過(guò)OPH加以抑制。此外，HCCS1(AMTS)-GFP，其離開(kāi)線(xiàn)灃立體進(jìn)4亍4晉革巴向，顯示出顯著更低的細(xì)胞毒性(圖3C)。這些結(jié)果進(jìn)一步支持以下看法ATAP導(dǎo)致HCCS1的促凋亡活性以及線(xiàn)粒體靶向是HCCS1的促凋亡功能所需要的。在脂雙層測(cè)定中，ATAP干擾力莫通透性。廣泛的研究已表明，在凋亡信號(hào)傳送中，線(xiàn)粒體膜電位的喪失作為細(xì)胞色素c釋放和半胱天冬酶激活作用的觸發(fā)物而發(fā)揮作用(Petitetal.，1995;Zamzamietal.，1995)。為了確定線(xiàn)粒體膜電位的喪失是否與ATAP-i秀導(dǎo)的凋亡iU姿相關(guān)，我們利用MitoTrackerRed(CM-H2TMRos)監(jiān)測(cè)了HeLa細(xì)胞中的線(xiàn)粒體膜電位，其僅在具有完整的線(xiàn)粒體膜電位的細(xì)月包中耙向線(xiàn)粒體并通過(guò)氧化而產(chǎn)生熒光。在有50|liMOPH的情況下，用GFP-ATAP、GFP-mHR7或GFP-TAxL轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)月包，以降^f氐半胱天冬酶激活作用對(duì)線(xiàn)粒體完整性的下游效應(yīng)(downstreameffect)。雖然用GFP-TAxL4爭(zhēng)染的大多凄史細(xì)"包是Y建康的并具有明亮的MitoTracker染色，^旦大多數(shù)GFP-ATAP轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯示彌散(diffuse)和低強(qiáng)度MitoTracker染色(圖6A)。平均來(lái)說(shuō)，65.0±8.7%0=5)的表達(dá)GFP-ATAP的HeLa細(xì)月包是MitoTracker陰性的，而<義19.0±9.3%的那些表達(dá)GFP-TAxL的HeLa細(xì)月包是MitoTracker陰性的(圖6B)。然而，用GFP-mHR7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示增力口的MitoTracker染色，其與用GFP-TAxL4爭(zhēng)染的細(xì)月包中的MitoTracker染色相當(dāng)。用其他mHR和mFR突變構(gòu)建體，獲得類(lèi)似的結(jié)果，JournalofCellScience120(16)，其中MitoTracker標(biāo)記的顯色(或顯影，development)與ATAP構(gòu)建體的毒性作用的降低緊密相關(guān)(未示出)。這些結(jié)果表明，ATAP誘導(dǎo)凋亡可能涉及線(xiàn)粒體外膜透化作用的直4妻誘導(dǎo)。利用脂雙層重建系統(tǒng)，我們證明了，合成野生型ATAP肽對(duì)脂雙層膜的陽(yáng)離子通透性產(chǎn)生顯著影響，而突變體mHR7肽，其可以結(jié)合于線(xiàn)粒體膜并對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，并不影響脂雙層膜的傳導(dǎo)性。在離體系統(tǒng)中ATAP介導(dǎo)的通透性變化并不顯示可以從成孔通道所預(yù)期的典型的穩(wěn)定的傳導(dǎo)特性。ATAP可以與預(yù)先存在的通道相互作用或調(diào)節(jié)預(yù)先存在的通道以改變線(xiàn)粒體膜通透性，或潛在地Bfll或HCCS1蛋白的其他結(jié)構(gòu)域可以有助于在體內(nèi)觀(guān)測(cè)到的膜通透性的變化。在線(xiàn)粒體凋亡途徑的起始中細(xì)胞色素c釋放是關(guān)鍵步驟。為了試-驗(yàn)ATAP和mHR7對(duì)來(lái)自線(xiàn)粒體的細(xì)月包色素c釋》文的影響，我們進(jìn)行兩個(gè)互補(bǔ)試驗(yàn)。首先，利用GFP-ATAP在HEK293細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)，在用GFP-ATAP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中顯著部分的細(xì)胞色素c^皮釋放進(jìn)入胞質(zhì)溶月交，而GFP-mHR7并沒(méi)有產(chǎn)生顯著的細(xì)胞色素c釋^t(圖6C，左邊)。其次，利用來(lái)自BMK-D3細(xì)胞的分離的線(xiàn)粒體膜制品，我們發(fā)現(xiàn)，加入合成ATAP肽會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的釋放，一種用mHR7肽沒(méi)有觀(guān)測(cè)到的效應(yīng)(圖6C，右邊)。作為ATAP對(duì)細(xì)胞膜的完整性的影響的直接試驗(yàn)，我們利用脂雙層重建系統(tǒng)進(jìn)4亍了電生理研究(Lametal.,1998;Maetal.,1988)。在大腸桿菌中ATAP的毒性作用(未示出)阻止純化足夠量的用于我們的功能研究的肽。因此，合成ATAP肽用于我們的雙層重建測(cè)定。如圖6D所示，力口入野生型ATAP肽(ll^M)會(huì)顯著影響脂雙層膜對(duì)單價(jià)陽(yáng)離子的通透性。在包含200mMKCl(順式)和50mMNaCl(反式)的i己錄溶液(recordingsolution)中，在0mV<呆持電4立下測(cè)4尋乂人順式到反式的外向電流，這提示，ATAP可影響脂雙層膜的陽(yáng)離子通透性("=5)。雖然電流痕跡在不同水平波動(dòng)而沒(méi)有可限定的單位電導(dǎo)值，但在-30mV下測(cè)得明顯的電流反轉(zhuǎn)電位，其接近于陽(yáng)離子的能斯特電位。更高濃度(>22.2jiM)的ATAP經(jīng)常引起雙層膜的不穩(wěn)定性，并在加入肽以后的30分鐘內(nèi)發(fā)生脂雙層的石皮裂(">30)。因此，高濃度的ATAP可以影響脂雙層膜的通透性，而沒(méi)有形成穩(wěn)定的孔結(jié)構(gòu)。在平行實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，在11-44)iM的濃度下，mHR7突變肽并不誘導(dǎo)膜傳導(dǎo)性的任何明顯變化0=35,圖6D)。此結(jié)果與細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的mHR7蛋白的降低的凋亡活性相一致。示例'J"生方法線(xiàn)粒體膜電位的測(cè)定和共聚焦顯孩i鏡術(shù)。按照Pratt和Niu的程序(2003)測(cè)量線(xiàn)粒體膜電位。在培養(yǎng)基中溫育瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)月包兩小時(shí)，其中i咅養(yǎng)基包含50nMMitoTrackerRedCM-H2Xros(MolecularProbes),其^f又在具有完整線(xiàn)粒體膜電位的細(xì)胞中顯現(xiàn)熒75光。用熒光顯樣i鏡對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行觀(guān)測(cè)和拍照。從至少200個(gè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)MitoTraker陽(yáng)性細(xì)胞。為了觀(guān)測(cè)EGFP融合蛋白的胞內(nèi)定位，將固定的HeLa細(xì)胞用于共焦顯微鏡術(shù)。如上所述在LabTekII腔室載3皮片(slide)上轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)月包并在有50(iMOPH的情況下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后18小時(shí)，用50nMMitoTrackerRedCM-H2Xros染色細(xì)月包并用PBS洗滌，沖妄著用4%曱醛固定。最后洗滌細(xì)月包，制作標(biāo)本(mount)并用裝備有63X物鏡的共焦顯樣t鏡ZeissLSM510(CarlZeissMicroscopy,Jena,德-國(guó))力口以分才斤。在室溫下獲取圖<象。質(zhì)粒構(gòu)建利用基于PCR的誘變和亞克隆來(lái)構(gòu)建所有在此研究中使用的質(zhì)粒(KoandMa，2005)。列出了用于亞克隆和i秀變的引物序列。利用pBfll-myc(Koetal.,2003b)作為模板來(lái)擴(kuò)增編碼ATAP的PCR產(chǎn)物，以及利用pEGFP-BclxL質(zhì)粒(Koetal.，2003a)作為4莫板來(lái)擴(kuò)增編碼Bcl-xL(E202-K233)的TA的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物克隆(框內(nèi)并在GFP序列后面)到在pEGFP-Cl(Clontech)中的X/wI和五coRI位點(diǎn)，以獲得pGFP-ATAP和pGFP-TAxL質(zhì)粒。包含HCCS1的全長(zhǎng)cDNA的MGC克隆584619購(gòu)自ATCC,并用作PCR模板來(lái)構(gòu)建pHCCSl-GFP、pHCCSl(_MTS)-GFP、pMTS-GFP、pGFP-HCCSlQVITS)以及pGFP-ATAP(HCCSl)。通過(guò)將PCR產(chǎn)物亞克隆到pEGFP-Nl(Clontech)載體的5s/El和五coRI位點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生具有融合于3_端的GFP的質(zhì)粒。為了產(chǎn)生pFLAG-ATAP和pFLAG-mHR3，用編碼Flag表位的cDNA片段替換編碼pGFP-TA和pGFP-mHR3質(zhì)粒的GFP的cDNA片段。我們使用以下寡核苦酸，其包含在正義和反義引物(粗斜體)之間互補(bǔ)的(斜體)23個(gè)堿基的3—端。對(duì)兩個(gè)重疊的寡核苷酸進(jìn)行退火并亞克隆到pGFP-ATAP和pGFPmHR3的X/wI和五coRI位點(diǎn)(并且體)。為了構(gòu)建Bfl-lFR突變體(參見(jiàn)本文)，在PCR反應(yīng)中使用了以下引物的各種組合并使用pBfl-l-myc作為模板。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>為了構(gòu)建Bfl-lFR突變體(參見(jiàn)本文)，在PCR反應(yīng)中4吏用了以下引物的各種組合并4吏用pBfl-1-myc作為才莫玲反。用于PCR反應(yīng)的引物組合是用于mFRl的KIL-F和TA-R;用于mFR2的K5L-F和TA-R、用于mFR3的TA-F和K26L-R、用于mFR4的K1,5L-F和TA-R;用于mFR5的KIL-F和K26L-R;用于mFR6的K5L-F和K26L-R;用于mFR7突變體的K1,5L-F和K26L-R。限制位點(diǎn)Xhol和EcoRI(粗體)用于將包含突變密碼子(下劃線(xiàn))的PCR產(chǎn)物亞克隆到pEGFP-Cl。為了構(gòu)建Bfl-lTMS突變體(參見(jiàn)本文)和pEGFP-TAxL(Bcl-xLC端的202-239個(gè)氨基酸)，使用了以下合成寡核苷酸的各種組合。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>E20L-R(SEQIDNO.21)TTGAATTCAACAGTATTGCTTCAGGAGAGATAGCATTAGACAGATCTTTCCTGTAACTTE13K-F(SEQIDNO.22)AACTCGAGCTAAGTTTGAACCTAAATCTGGCTGGATGACTTTTCTAAAGGTTACAGGAAAGATCTGTE20K-R(SEQIDNO.23)TTGAATTCAACAGTATTGCTTCAGGAGAGATAGCATCTTACAGATCTTTCCTGTAACTTK17L-F(SEQIDNO.24)AACTCGAGCTAAGTTTGAACCTAAATCTGGCTGGATGACTTTTCTAGAAGTTACAGGACTAATCTGTK17L-R(SEQIDNO.25)TTGAATTCAACAGTATTGCTTCAGGAGAGATAGCATTTCACAGATTAGTCCTGTAACTTKE2L-F(SEQIDNO.26)AACTCGAGCTAAGTTTGAACCTAAATCTGGCTGGATGACTTTTCTACAAGTTACAGGACTAATCTGTKE2L-R(SEQIDNO.27)TTGAATTCAACAGTATTGCTTCAGGAGAGATAGCATTTGACAGATTAGTCCTGTAACTTTAxL-F(SEQIDNO.28)AACTCGAGCTGAGAGCCGAAAGGGCCAGGAACGCTTCAACCGCTGGTTCCTGACGGGCATGACTGTGGCCGGCGTGGTTTAxL-R(SEQIDNO.29)TTGAATTCATTTCCGACTGAAGAGTGAGCCCAGCAGAACCACGCCGGCCACAGT寡核苷酸包含在正義和反義引物(粗斜體)之間互補(bǔ)的18個(gè)堿基的3，端。寡核苦酸的組合是用于mHRl的E13Q-F和sTA-R;用于mHR2的sTA-F和E20Q-R;用于mHR3的E13Q-F和E20Q-R;用于mHR4的E13L-F和E20L-R;用于mHR5的E13K-F和E20K-R;用于mHR6的K17L-F和K17L-R;以及用于mHR7突變體的KE2L-F和KE2L-R。TAxL-F和TAxL-R用于TAxL構(gòu)建體。對(duì)兩個(gè)重疊寡核苷酸進(jìn)4亍退火，i真補(bǔ)然后亞克隆到pEGFP-Cl的Xhol和EcoRI位點(diǎn)。為了產(chǎn)生pEGFP-TAAFR-l,對(duì)以下合成寡核苷酸進(jìn)行退火并亞克隆到pEGFP-Cl的Xhol和EcoRI位點(diǎn)。引物序列(5，至3，)TAAFR-1F(SEQIDNO.30)TCGAGGCTGGATGACTTTTCTAGAAGTTACAGGAAAGATCTGTGAAATGCTATCTCTCCTGAAGCAATGTAAFR-1R(SEQIDNO.31)AATTCATTGCTTCAGGAGAGATAGCATTTCACAGATCTTTCCTGTAACTTCTAGAAAAGTCATCCAGCC為了產(chǎn)生pGFP-接頭-ATAP和pGFP4妄頭-ATAP,通過(guò)用編石馬ATAP78突變質(zhì)粒中的cDNA序列來(lái)產(chǎn)生包括pGFP-接頭-mFR7的突變體。對(duì)以下合成寡核苷酸進(jìn)4亍退火并亞克隆到pGFP-ATAP和ATAP突變構(gòu)建體的5spEI和X/wI^f立點(diǎn):引物序列(5，至3，)接頭-F(SEQIDNO.32)CCGGACTCCCCGCCCAGATCACCTTCCTGAGCGTGCCCGGCTC接頭-R(SEQIDNO.33)TCGAGAGCCGGGCACGCTCAGGAAGGTGATCTGGGCGGGGAGT為了產(chǎn)生pFLAG-TA和pFLAG-mHR3，用編碼FLAG表位的cDNA片#爻替換編碼pEGFPTA和pEGFP-mHR3質(zhì)粒的EGFP的cDNA片4殳。我們〗吏用了兩個(gè)以下寡核苷酸，其包含在正義和反義引物(粗斜體)之間互補(bǔ)的23個(gè)堿基的3，端。對(duì)兩個(gè)重疊寡核苷酸進(jìn)4亍退火，^真補(bǔ)然后亞克隆到pEGFP-TA和pEGFPmHR3的Xhol和EcoRI位點(diǎn)。為了構(gòu)建表達(dá)載體mRFP-mito，利用pRSETB畫(huà)mRFP(Campbelletal.,2002)作為才莫一反來(lái)擴(kuò)增mRFP(紅色熒光蛋白單體)cDNA片,殳。將PCR產(chǎn)物亞克隆到pGFP-TAxL的7Wzel和J^pEI位點(diǎn)以用mRFP替換GFP并產(chǎn)生pmRFP-mito。通過(guò)DNA測(cè)序i正實(shí)所有構(gòu)建體。引物序列(5，至3，)FLAG/FP4-F(SEQIDNO.34)CCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGCTTGAATTCGATTTTCCACCTCCCFLAG/FP4-R(SEQIDNO.35)AGCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTAGCTGCCCAGTTCTTCATCGGTAGGGGGAGGTGGAAAATCGAATTCAA通過(guò)利用所描述的(KoandMa,2005)BsmBI進(jìn)行誘變來(lái)獲得pHCCS-l-GFP(E46Q/E53Q)。利用pHCCS-l-GFP作為PCR才莫板并利用以下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增引物序列(5，至3，)HCCS-mF(SEQIDNO.55)AACGTCTCAAGGAAAGATCTGTCAGATGCTCT丁CTGTCCTGAAGCAATAHCCS-mR(SEQIDNO.56)AACGTCTCATCCTGTAACCTGTAGAAAAGTCATCCAGCCAGATTTAHCCS-anchor-F(SEQIDNO.57)AATCCGGAATGAGAGTTTCATTCTGTCGCCCAGG79HCCS-anchor-R(SEQIDNO.58)AAGAATTCAAAAGTAGAAGTATGTGTTGGCAATCG將HCCS-1的突變cDNA片段亞克隆到pEGFP-Nl載體的丑5pEI禾口五coRI4立點(diǎn)。生物信息學(xué)分析乂人GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得人Bfll(GeneID597)和HCCSl(GeneID400410)的基因組序列，并利用BLAST程序進(jìn)行同源性搜索。包含5C丄Z47(Bfll)和7/CCW的基因組位置分別是在染色體15q24.3區(qū)上從78，040至78,050kb的NM—004049、以及在染色體15q25.1區(qū)上從77,978至77,994kb的XM—375224。借助于A(yíng)VID程序并利用100bp的窗口大小進(jìn)行5CZZ47和/ZCCS7的基因組序列的序列比對(duì)。借助于CLUSTALW程序進(jìn)行外顯子序列和一級(jí)氨基酸序列的序列比只寸。利用SOPMA(GeourjonandDeleage，1995)和Jpred(Cuffetal"1998)禾呈序來(lái)予貞測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用Targetpvl.l(Emanuelssonetal.，2000;Nielsenetal.,1997)來(lái)推導(dǎo)HCCS1的MTS。在正常人組織和癌細(xì)胞系中Bfll和HCCS1的mRNA表達(dá)。利用由NCBIUniGene服務(wù)器提供的可獲得的微陣列數(shù)據(jù)和EST表達(dá)譜，初步分析了SC丄Z47和/7CCS7轉(zhuǎn)錄物在正常人組織中的分布。通過(guò)RT-PCR并利用購(gòu)自Stratagene(LaJolla，CA)的人正常肺、乳腺以及子宮頸的總RNA，半定量評(píng)〗介了和//CCS7轉(zhuǎn)錄物。利用Tri試劑(Sigma)并按照制造商的說(shuō)明書(shū)，分離了癌細(xì)胞系的總RNA。在20—lcDNA合成反應(yīng)中4吏用l_gRNA,其中4吏用寡核苷酸(dT)18引物和莫洛尼小鼠白血病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶(Promega，Madison，WI，美國(guó))。cDNA混合物(2—l)用于PCR擴(kuò)增。作為對(duì)照，擴(kuò)增人J幾動(dòng)蛋白cDNA以確定RNA的完整性和cDNA合成的效率。引物是用于Bfll的5—-ACAAAATGTTGCGTTCTCAGTCCA-3一(正義)和5—-CGTTTTGCCTTATCCATTCTCC-3—2922JournalofCellScience120(16)(反義)；用于HCCS1的5—-TTGCCACAAATGGTGTGCTCTA-3—(正義)和5—-TCCTGGTGCCATGATTTACTGT-3—;用于—月幾動(dòng)蛋白的5—隱GATCAGCAAGCAGGAGTATGAC-3一(正義)和5—-ATGGCAAGGGACTTCCTGTAAC-3—(反義)。這些引物分別擴(kuò)增Bfll、HCCS1以及—肌動(dòng)蛋白的302、320以及352bp的PCR產(chǎn)物。基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞死亡的分析在將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293、HeLa、MCF-7或BMKD3細(xì)月包以后，監(jiān)測(cè)凋亡性細(xì)月包死亡。在35-mm孑L中并在補(bǔ)充有10%胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)2—105個(gè)細(xì)月包24小時(shí)。利用Lipofectamine2000i式劑(Invitrogen)并4昔助于1—g指定的表達(dá)質(zhì)粒來(lái)豸爭(zhēng)染細(xì)力包，并進(jìn)一步在沒(méi)有或有50一M泛半力光天冬酶抑制劑，Q-VD-OPH(OPH,EnzymeSystemsProducts)的情況下力口以培養(yǎng)。為了形態(tài)上估計(jì)凋亡性細(xì)月包死亡，將細(xì)月包以5_104個(gè)細(xì)胞/孔的密度平皿4妄種到LabTekII月空室載3皮片(NalgenNuncInternational)上。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在用4%甲醛進(jìn)4亍固定以前，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞。隨后，用包含1_g/mlDAPI的Vectasheild去于固液(VectorLaboratories)染色纟田月包并在A(yíng)xiovert100#]置落射熒光顯微鏡(CarlZeiss)下進(jìn)行可視化。具有波紋輪廓的細(xì)胞核和染色質(zhì)凝聚被認(rèn)為代表著凋亡性細(xì)胞死亡。還通過(guò)硤化丙啶(PI)排除來(lái)測(cè)量細(xì)胞死亡。在用GFP融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以后，將總共1—g/mlPI(MolecularProbes)加入細(xì)月包培養(yǎng)基。在包含大約200個(gè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的三個(gè)不同場(chǎng)，用熒光顯孩史鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀(guān)測(cè)和拍照。GFP和PI雙陽(yáng)性細(xì)胞被計(jì)數(shù)為死細(xì)胞。通過(guò)-半乳糖苷酶報(bào)告測(cè)定并按照所描述的程序(Chittendenetal.，1995;WoodandNewcomb，2000)來(lái)定量分4斤細(xì)胞活力。簡(jiǎn)單地it，用1g試-驗(yàn)質(zhì)粒加上O.lg表達(dá)-半81乳糖苷酶的pCMV(Sigma)質(zhì)粒來(lái)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，收集細(xì)月包并利用-半乳泮唐苷酶EnzymeAssaySystem(Promega)來(lái)測(cè)量-半乳沖唐苷酶活性。在每個(gè)實(shí)-驗(yàn)中，一式三4分地測(cè)試每種構(gòu)建體，并且重復(fù)實(shí)-驗(yàn)至少三次。細(xì)力包活力表示為相對(duì)于對(duì)照質(zhì)粒的一-半乳4唐香酶活性。DNA片段化測(cè)定和流式細(xì)胞術(shù)為了通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分析DNA片段化，如所描述地(Essmannetal.，2003)制備細(xì)胞DNA。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在37°C下將35mm孑L中的細(xì)月包溶解于包含0.25%NP-40和50—gRNA酶A的0.2ml裂解緩沖液(20mMTris-HC、0.5mMEDTA、pH8.0)30分鐘。在37°C下用0.2mg蛋白酶K處理每種;容月包產(chǎn)物30分鐘，然后在25。C和IO，OOOg下離心10分鐘。在2%瓊脂糖凝膠上對(duì)包含片段化DNA的上清進(jìn)行分析。還可以在用PI進(jìn)行DNA染色以后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)確定DNA片段化。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，隨后重懸浮在包含50g/mlPI和20g/mlRNA酶A的PBS中。分析前，在室溫下溫育細(xì)月包~30分鐘，并且避光。利用CoulterCytomicsFC500濟(jì)u式細(xì)月包4義(CoulterElectronics)分沖斤DNA含量。線(xiàn)粒體膜電位的估計(jì)和共焦顯微鏡術(shù)。按照Pratt和Niu的程序(PrattandNiu，2003)測(cè)量線(xiàn)粒體膜電位。在培養(yǎng)基中溫育瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)月包兩小時(shí)，其中培養(yǎng)基包含50nMMitoTrackerRed(CM-H2TMRos)(MolecularProbes),其在具有完整的線(xiàn)粒體月莫電位的細(xì)胞中顯現(xiàn)熒光。用焚光顯微鏡對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行觀(guān)測(cè)和拍照。/人至少200個(gè)GFP-陽(yáng)性細(xì)月包計(jì)凄tMitoTracker陽(yáng)性細(xì)月包。為了？見(jiàn)測(cè)GFP融合蛋白的胞內(nèi)定位，將固定的HeLa細(xì)胞用于共焦顯微鏡術(shù)。如上所述在LabTekII腔室載^皮片上轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞并在有50—MOPH的情況下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后18小時(shí)，用50nMMitoTrackerRed(CM-H2TMRos)染色細(xì)月包并用PBS洗滌，4妄著用4%曱醛加以固定。最后洗滌細(xì)胞，制標(biāo)本并用裝備有63一物鏡的共焦顯微鏡ZeissLSM510(CarlZeissMicroscopy,Jena，德國(guó))進(jìn)行分析。在室溫下獲取圖像。蛋白質(zhì)印跡法關(guān)于蛋白質(zhì)印跡法，單克隆抗GFP抗體和抗羊辣根過(guò)氧化物酶(HRP)4元體購(gòu)自SantaCruzBiotechnology。4元-月幾動(dòng)蛋白#元體購(gòu)自Sigma。單克隆4元Flag9E10.24元體購(gòu)自Invitrogen。4元小鼠HRP4元體購(gòu)自AmershamPharmacia。單克隆抗細(xì)月包色素c7H8.2C12抗體、單克隆抗Bcl-xL2H12抗體、單克隆抗Bax6A7抗體、多克隆抗Bak抗體分另ll購(gòu)自BDBiosciences、Sigma、ZymedLaboratory以及UpstateBiotechnology。關(guān)于免疫印跡分析，使20_g蛋白質(zhì)經(jīng)受SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，其用5%脫脂奶加以阻斷，用一抗:探測(cè)并利用ECL化學(xué)發(fā)光i式劑盒(AmershamPharmacia)力口以可一見(jiàn)4匕。肽合成和脂雙層實(shí)-驗(yàn)由Abgent(SanDiego,CA)合成了對(duì)應(yīng)于Bfll的C端的29單元(29-mer)ATAP肽(KFEPKSGWMTFLEVTGKICEMLSLLKQYC)以及其突變體mHR7(KFEP-KSGWMTFLQVTG-LICQMLSLLKQYC),純度為99%，如通過(guò)HPLC和質(zhì)譜法測(cè)得的。將這些肽溶解于DMSO以制才尋10mM原、液。石粦月旨購(gòu)自AvantiPolarLipids(Birmingham，AL)。^口所述(Lametal.,1998;Maetal.,1988),進(jìn)4亍電生理分沖斤。用溶解在正癸烷中濃度為50mg/ml的牛腦磷酯酰乙醇胺和牛腦磷脂酰絲氨酸的1:1混合物并穿過(guò)直徑為200—m的孔來(lái)形成脂雙層膜。記錄溶液包含順式，200mMKC1和10mMHEPES畫(huà)Tris(pH7.4);反式，8350mMNaCl、10mMHEPES-Tris(pH7.4)。將溶解在DMSO中的10mM肽的11加入9001的順式溶液并融合于雙層。利用Axopatch200A》文大器(AxonInstruments,福斯特i成，加利福尼亞)測(cè)量電壓4空制和電流。用pClamp和TIPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。測(cè)定/人線(xiàn)粒體的細(xì)"包色素c釋》丈如先前描述的(Koetal.,2003a)，制備沒(méi)有線(xiàn)粒體的胞質(zhì)溶膠。簡(jiǎn)單地說(shuō)，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，通過(guò)刮片來(lái)收集HEK293纟田胞，用冰冷的PBS洗滌兩次，懸浮在100—1^是取緩沖液(50mMPIPES-KOH、pH7.4、200mM甘露醇、70mM蔗糖、50mMKCl、5mMEGTA、2mMMgCl2、1mM二石克蘇糖醇以及蛋白酶抑制劑)中，然后在冰上溫育30分鐘。通過(guò)Dounce均一化作用來(lái)溶解細(xì)胞并在4°C和IOO，OOOg下離心勻漿液15分鐘。收集上清，并利用單克隆抗細(xì)月包色素c抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法來(lái)分析20g蛋白質(zhì)。為了離體分析細(xì)胞色素c釋放，利用線(xiàn)粒體分級(jí)分離試劑盒(ActiveMotif)并按照制造商的說(shuō)明書(shū)，從BMK-D3細(xì)胞分離富含在線(xiàn)粒體中的重膜。在4是取纟爰沖液中將分離的線(xiàn)粒體稀釋至1mg/ml的濃度，然后在37°C下用合成ATAP或mHR7肽(IOOM)或DMSO(作為對(duì)照)溫育1小時(shí)。然后在13,000g下離心反應(yīng)混合物(reactions)10分4中并通過(guò)SDS-PAGE分析獲得的沉淀物和上清。應(yīng)當(dāng)明了，本文描述的詳細(xì)實(shí)施例和實(shí)施方式是通過(guò)舉例方式給出的，僅是說(shuō)明性的，決不應(yīng)認(rèn)為其限制本發(fā)明。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，據(jù)此進(jìn)行的各種改進(jìn)或變化是顯而易見(jiàn)的并且包括在本申請(qǐng)的精神和范圍內(nèi)，因而被認(rèn)為是在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。例如，可以變化成分的相對(duì)量以?xún)?yōu)化所期望的,丈應(yīng)，可以力口入另夕卜的成分，和/或可以用類(lèi)似的成分代替一種或多種所描述的成分。沖艮據(jù)所附權(quán)利要求，與本發(fā)明的系統(tǒng)、方法、以及步驟有關(guān)的另外的優(yōu)點(diǎn)和功能將是明顯的。8權(quán)利要求1.一種多肽組合物，包含具有通式(I)的肽bXaXbuunnunnanXGbnXann(X)1-6nn(X)0-2b(I)其中n＝非極性(疏水)氨基酸；X＝任何一種氨基酸；u＝極性、不帶電荷氨基酸；b＝堿性氨基酸；以及a＝酸性氨基酸。2.—種經(jīng)分離的核酸分子，包含與SEQIDNO.37或59的至少一種具有至少30%序列同源性的多核苷酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)分離的核酸，其中，所述核酸序列進(jìn)一步包含與4又利要求1所述的多核苷酸鄰近的至少一種另外的多核苷酸成分。4.4艮據(jù)4又利要求3所述的經(jīng)分離的核酸，其中，所述另外的多核苦酸位于權(quán)利要求1所述的多核香酸的5，端、3'端或兩端。5.—種載體，包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列以及權(quán)利要求1所述的核酸分子。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，進(jìn)一步包含可操作地連接于所述核酸分子的啟動(dòng)子。7.—種宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求6所述的載體。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。10.—種組合物，包含片又利要求2所述的核酸分子和藥用載體。11.一種試劑盒，在一個(gè)或多個(gè)容器中包含權(quán)利要求8所述的組合物。12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)分離的核酸，其中，所述核酸序列編碼一種多肽，所述多肽包含與SEQIDNO.36或53具有至少30%序列同一性的氨基酸序列。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的核酸，其中，所述核酸編碼選白由SEQIDNO.38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、以及51纟且成的組中的多肽。14.一種經(jīng)分離的多肽，包含至少15個(gè)氨基酸，并且其中所述多肽與SEQIDNO.36具有至少30%的序列同源性。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的經(jīng)分離的多肽，其中，所述多肽是選自由SEQIDNO.38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、以及53組成的組中的成員。16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的經(jīng)分離的多肽，進(jìn)一步包含藥用載體、賦形劑或佐劑中的至少一種。17.—種用于在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方法，包括給予包含有效量多肽的組合物，其中所述多肽與SEQIDNO.36具有至少30%的同源性。18.—種治療受試者的癌癥或增生的方法，包括給予編碼多肽的核酸，其中所述多肽與SEQIDNO.36具有至少30%的同源性。19.一種抗體，能夠免疫特異性地結(jié)合于至少一種多肽，所述多肽選自由SEQIDNO.36、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、以及53組成的組。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的抗體，其中，所述抗體是選自由嵌合抗體、抗體片段、以及人源化抗體組成的組中的至少一個(gè)成員。21.—種融合蛋白，包含與SEQIDNO.36具有至少30%同源性的第一多肽部分和至少一個(gè)其〗也多肽部分，所述其〗也多月太部分4立于氨基末端或羧基末端中的任何一端、或者位于所述氨基末端和所述歡基末端，并且其中所述多肽部分位于同一個(gè)、鄰近的多肽鏈中。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的融合蛋白，其中，所述至少一個(gè)其他多肽部分包括熒光蛋白。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的融合蛋白，其中，所述至少一個(gè)其他多肽部分包4舌TAT多肽或其部分。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白進(jìn)一步包含HIS標(biāo)簽。25.—種治療性多肽組合物，包含與SEQIDNO.36具有至少30%同源性的肽和藥用賦形劑或載體的組合。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的治療劑，其中，所述治療性多肽是融合蛋白，所述融合蛋白包含與SEQIDNO.36具有至少30%同源性的肽和至少一個(gè)其他多肽部分，所述其他多肽部分位于氨基末端或羧基末端中的任何一端、或者位于所述氨基末端和所述羧基末端，并且其中所述多肽部分位于同一個(gè)、鄰近的多肽鏈中。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的治療劑，其中，所述治療性多肽包含至少一種選自由SEQIDNO.36、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、以及53組成的組中的多肽，和藥用載體。28.—種多肽，包含具有通式(II)的肽(K/R)n(E/D)(P)(K/R)SGW(M/L)(S/T)FL(E/D)nTG(K/R)I(X)(E/D)ML(X)wLL(X)o-2(K/R)(II)其中，n-非極性(疏水)氨基酸；以及XH"壬何一種氨基酸。29.—種治療細(xì)菌感染的方法，包括給予受試者有效量的組合物，所述組合物包含斥又利要求1所述的多肽以及藥用載體。全文摘要本文披露了編碼促凋亡多肽的核酸序列。還披露了由這些核酸序列編碼的多肽，免疫特異性地結(jié)合于所述多肽的抗體，以及上述多肽、多核苷酸、或抗體的衍生物、變體、突變體、或片段。本發(fā)明進(jìn)一步披露了利用本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)來(lái)診斷、治療、以及預(yù)防增生性病癥和細(xì)菌感染的治療、診斷以及研究方法。文檔編號(hào)A61K38/00GK101557818SQ200780044714公開(kāi)日2009年10月14日申請(qǐng)日期2007年10月3日優(yōu)先權(quán)日2006年10月3日發(fā)明者諾厄·魏斯勒德,金哲右,高載均,麻建杰申請(qǐng)人:新澤西醫(yī)科和牙科大學(xué)