專利名稱：：雙鏈斷裂誘餌及其應(yīng)用的制作方法雙鏈斷裂誘館及其應(yīng)用本發(fā)明涉及了在哺乳動物細(xì)胞中干擾DNA修復(fù)途徑的組合物和方法。具體來說，本發(fā)明涉及了干擾DNA損傷的感應(yīng)、信號傳導(dǎo)和/或修復(fù)途徑、特別是雙鏈斷裂(DSB)修復(fù)的非同源性末端連接(NHEJ)途徑的核酸分子，以及它們的應(yīng)用，特別是用于觸發(fā)經(jīng)歷了抗癌癥療法的腫瘤的細(xì)胞致死。本發(fā)明公開一類新型核酸分子，被稱為"DSB誘餌"或"Dbait(雙鏈斷裂誘餌)"，可用于哺乳動物對象中的各種不同的治療性病癥，用于干擾DNADSB修復(fù)途徑。
背景技術(shù)：
：放射療法和化學(xué)療法、單獨地或與外科手術(shù)相結(jié)合，是針對人類癌癥的主要治療手段。離子化輻射直接或間接地引起雙鏈斷裂(DSBs)并觸發(fā)細(xì)胞/組織死亡(壞死或凋亡)。離子化輻射的細(xì)胞毒性效應(yīng)形成了廣泛用于人類癌癥治療的放射療法的基礎(chǔ)。目前，放射療法的效率受到了某些腫瘤(例如，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、頭頸鱗狀上皮細(xì)胞腺癌)的放射性抗性以及輻射鄰近正常組織引起的副作用(例如在乳腺癌和宮頸癌的治療中)的限制。在過去的幾年，許多研究集中于與離子化輻射反應(yīng)有關(guān)的生物學(xué)機(jī)制，以便獲得對潛伏在腫瘤細(xì)胞的放射性敏感性或放射性抗性之下的現(xiàn)象的復(fù)雜性的了解。對精細(xì)調(diào)控對離子化輻射的反應(yīng)的不同途徑的理解，是朝向鑒定新的藥物和療法的分子靶的一個重要步驟，這些新的藥物和療法與放射療法相結(jié)合，可以增加從對輻射具有高度抗性的腫瘤，例如腦部或頭頸腫瘤復(fù)原的機(jī)會。化療藥劑的使用可能引起DNA損傷，包括直接或間接的DSBs。使用最多的化療藥劑(化學(xué)細(xì)胞毒性藥劑)家族的例子是拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑(喜樹堿/拓?fù)涮婵?，表柔比?依托泊苷)，DNA交聯(lián)劑(順鉑/卡鉑/奧沙利鉑)，DNA烷基化試劑(卡莫司汀/達(dá)卡巴嗪)或抗代謝藥劑(5-氟尿嘧啶/吉西他濱/卡培他濱)，以及有絲分裂紡錘體抑制劑(紫杉醇/多烯紫杉醇/長春瑞濱)。開發(fā)生物藥物(單克隆抗體、細(xì)胞因子/激酶抑制劑、免疫治療劑/疫苗)中的最新進(jìn)展已經(jīng)證明了它們對一部分腫瘤的效力和特異性。但是它們通常與化學(xué)細(xì)胞毒性藥劑結(jié)合使用。盡管在開發(fā)新的細(xì)胞毒性藥物中有許多進(jìn)展，但是對化學(xué)療法的藥物抗性仍然是癌癥治療中的主要臨床關(guān)注的問題。對于涉及藥物攝入/流出、代謝降解、耙的誘變、增強(qiáng)的修復(fù)、細(xì)胞死亡(凋亡和壞死)的信號傳導(dǎo)的藥物抗性的機(jī)制的理解，對于特別是在某些對治療有抗性的腫瘤中保證化療的效力和改善治療指標(biāo)是非常必要的。化學(xué)療法和放射療法的結(jié)合被廣泛用于癌癥治療中。盡管還沒有完全闡明，但細(xì)胞毒性藥劑的作用的生物學(xué)基礎(chǔ)依賴于細(xì)胞機(jī)制，例如細(xì)胞周期或DNA損傷，它們對于放射性誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡也是重要的，因此當(dāng)在癌癥治療中組合不同的治療方法時導(dǎo)致了加成的或甚至更好的協(xié)同效益。在最近10年中，在該領(lǐng)域進(jìn)行了許多研究，對輻射作出反應(yīng)的信號傳導(dǎo)的復(fù)雜性進(jìn)行描述。在這一方面，特別感興趣的作為離子化輻射的耙的基因是參與輻射誘導(dǎo)的致死機(jī)制的調(diào)控，例如凋亡或DNA修復(fù)的基因。因為DSBs是最致命的DNA損傷，當(dāng)DSB修復(fù)增加時，離子化輻射的效力降低了。兩種機(jī)制參與了DSBs的修復(fù)非同源性末端連接(NHEJ，不依賴于序列的途徑)和同源重組(HR，序列依賴性途徑)(綜述在Jackson,2002中)。對參與這兩種主要DSB修復(fù)途徑的基因進(jìn)行的定向到目前為止導(dǎo)致了很少或中度的放射性敏感性，這依賴于所使用的方法和癌癥細(xì)胞系(Belenkov等，2002;Mamngoni等，2000;Ohnishi等，1998)。Ku(例如Ku70和Ku80)和DNA-PKcs蛋白在放射性或化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的DNADSBs的修復(fù)中是重要的。如果損傷沒有被及時修復(fù)，細(xì)胞將死亡。因此，它們代表了用于使靶細(xì)胞和組織對放射療法和化學(xué)療法致敏的潛在有興趣的分子靶。據(jù)此，已經(jīng)設(shè)想了許多方法并進(jìn)行了嘗試，以抑制這些參與在哺乳動物細(xì)胞中占優(yōu)勢的NHEJ途徑的關(guān)鍵蛋白(Ku70/Ku80，DNA隱PKcs等)1)PI3K抑制劑(磷脂酰肌醇-3-激酶)(即DNA-PKcs、ATM、ATR)(Boulton等，2000;D腦nt&Ka腿，2003;Willmore等，2004;Vauger等2004);2)顯性失活的肽(KU80的C-末端)(Marangoni等，2000;Kim等，2002);3)單鏈抗體可變區(qū)片段(scFv)(DNA-PKcs)(Li等，2003);4)RNA適體(Aptamer)(SELEX:RNA結(jié)合的Ku)(Yoo&Dynan:1998);5)反義物(Ku70，Ku80，DNA-PKcs)(Li等，2003b;Marangoni等，2000;Sak等，2002);6)siRNA(DNA陽PKcs)(Peng等，2000)。盡管作出了這些極大的努力，將參與DNA修復(fù)途徑的基因的靶向與癌癥療法相結(jié)合仍然處于早期實驗階段，到目前為止，還沒有臨床研究顯示出任何被證明的益處。值得注意的是上面描述的方法具有共同的特點它們靶向于參與具有可能的旁路或補(bǔ)償途徑的復(fù)雜的級聯(lián)途徑(例如NHEJ)的單個效應(yīng)子(蛋白)。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及在哺乳動物細(xì)胞中干擾DNA修復(fù)途徑的新的組合物和方法。具體來說，本發(fā)明涉及以非基因特異性方式干擾DNA損傷的感應(yīng)、信號傳導(dǎo)和/或修復(fù)途徑的核酸分子，以及它們的應(yīng)用，特別是用于觸發(fā)經(jīng)歷了抗癌癥療法的腫瘤的細(xì)胞致死。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞對直接或間接DNA損傷療法的敏感性可以通過使用(化學(xué)修飾的或未修飾的)短dsDNA分子來加強(qiáng)，這些短dsDNA分子用作斷裂DNA片段的模擬物，并被識別成DNA損傷治療所誘導(dǎo)的DSB位點(即DSB的底物模擬物)。正如在實施例中顯示的，本發(fā)明的分子在體外和體內(nèi)都有效，可用于賦予或增加任何腫瘤細(xì)胞對DNA損傷性癌癥療法的敏感性。因此，本發(fā)明的一個目標(biāo)涉及這樣的dsDNA分子，也被命名為"DSB誘餌"分子(縮寫為Dbait(雙鏈斷裂誘餌))，它們能夠增加對治療有抗性的腫瘤對放射療法和化學(xué)療法的反應(yīng)。正如將在下面進(jìn)一步公開的那樣，Dbait子通過引誘和劫持DNA修復(fù)酶的全復(fù)合物(holocomplex)起作用，從而干擾DNA損傷的感應(yīng)、信號傳導(dǎo)和/或修復(fù)過程。這種新的方法被命名為"DNA誘餌"。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及Dbait分子，它是核酸分子，其中該分子含有至少24bp的雙鏈部分，具有至少一個游離末端，無CpG，與人類基因組中的任何基因具有小于70%的序列同一性，在每條鏈的末端或至少在3'末端鏈上含有一個或幾個硫代磷酸酯或具有甲基膦酸酯骨架的核苷酸，其中所述分子是參與雙鏈斷裂(DSB)修復(fù)的NHEJ途徑的至少Ku蛋白的結(jié)合底物。優(yōu)選情況下，Dbait分子選自Dbait32Ha、Dbait32Hb、Dbait32Hc、Dbait32Hd、Dbait32Hc-3，mp、Dbait32Hc國5，3，mp、Dbait32Hc-Cy3、Dbait32Hc-Cy5禾nDbait32Hd-FITC。更優(yōu)選情況下，Dbait分子是Dbait32Hc。本發(fā)明的另一個目的是含有Dbait分子和可藥用的載體或賦形劑的組合物。在具體的實施方案中，該組合物適合于口服途徑或用于靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)或皮下注射，或用于顱內(nèi)或動脈內(nèi)注射或灌注或用于局部施用。本發(fā)明的另一個目的是Dbait分子與能夠直接或間接引起DNA的DSBs的物理手段和/或化學(xué)試劑的組合。具體來說，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的Dbait分子和能夠直接或間接引起DNA的雙鏈斷裂的化學(xué)藥劑的藥物產(chǎn)品，作為組合的制備物用于治療癌癥。優(yōu)選情況下，Dbait分子在化學(xué)藥劑之前或同時施用。本發(fā)明的另一個目的是使用Dbait分子和直接或間接引起DNA損傷的療法的組合，治療增殖性疾病(例如癌癥)的方法。因此，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的Dbait分子制造用于治療癌癥的藥物，該藥物與DNA損傷性抗癌癥療法組合使用。具體來說，DNA損傷性抗癌癥療法選自放射療法和化學(xué)療法。優(yōu)選情況下，Dbait分子將在放射療法之前使用?；蛘?，Dbait分子在化學(xué)療法之前或同時施用。在具體的實施方案中，分子將通過口服途徑，或通過靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)或皮下注射，或通過顱內(nèi)或動脈內(nèi)注射或灌注或用于局部施用。優(yōu)選情況下，癌癥選自CNS、頭頸、結(jié)腸直腸、肝臟、胃腸道、生殖泌尿道、肺、皮膚、乳腺癌和宮頸癌。本發(fā)明的另一個目的涉及使用Dbait分子制造抗癌癥療佐劑，用于增加癌癥治療的效力，特別是對于對放射和/或化學(xué)療法反應(yīng)不強(qiáng)的腫瘤。本發(fā)明的另一個目的是增加腫瘤對DNA損傷性抗癌癥療法的敏感度的方法，該方法包括給對象施用上面定義的Dbait分子。因此，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的Dbait分子制造用于增加腫瘤對DNA損傷性抗癌癥療法的敏感度的藥物。具體來說，DNA損傷性抗癌癥療法選自放射療法和化學(xué)療法。優(yōu)選情況下，Dbait分子將在放射療法之前施用?；蛘?，Dbait分子在化學(xué)療法之前或同時施用。在具體的實施方案中，分子將通過口服途徑，或通過靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)或皮下注射，或通過顱內(nèi)或動脈內(nèi)注射或灌注施用或用于局部施用。優(yōu)選情況下，癌癥選自CNS、頭頸、結(jié)腸直腸、肝臟、胃腸道、生殖泌尿道、肺、皮膚、乳腺癌和宮頸癌。本發(fā)明的另一個目的是治療癌癥的方法，該方法包括給對象施用Dbait分子和DNA損傷性抗癌癥療法的組合。本發(fā)明的另一個目的是與DNA斷裂治療，特別是放射療法或化學(xué)療法相結(jié)合使用的組合物，所述組合物含有至少一種與可藥用載體組合的Dbait分子，以有效量導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞的核中。本發(fā)明可用于在哺乳動物對象，特別是人類對象中的各種不同類型的癌癥中，賦予對癌癥療法的敏感性，所述癌癥為例如實體癌和白血病，特別是對放射療法或化學(xué)療法具有抗性的癌癥。圖l.l:在存在不同量的Hep2細(xì)胞的核提取物(0、10、20、40、80、160、320ng/|iil)的情況下對不同的32P放射性標(biāo)記的Dbait分子進(jìn)行的帶移動分析。移動的帶被編號為1和2。3號帶是載樣孔。圖1.2:在包括Hep2細(xì)胞核提取物(0、20、80、320ng/pl)中的蛋白的不同32P放射性標(biāo)記的Dbait分子的蛋白阻滯的條帶中鑒定Ku蛋白的存在。在a-Ku泳道中，指示了在將樣品上樣到凝膠之前在結(jié)合反應(yīng)中加入(+)或沒加入(-)抗Ku抗體。移動的帶被編號為1、2和3，對于在結(jié)合了抗Ku抗體后顯示出遷移變化的條帶，在編號上加上星號。圖1.3:使用20(igHep2核蛋白提取物進(jìn)行的DNA末端連接分析。上圖在20pl分析緩沖液中，在不存在和存在20iuMDbait的情況下，經(jīng)過不同的時間，0.2(iM^P標(biāo)記的DNA片段的連接。條帶l-4指示了初始的605-bpDNA片段(單體[l])以及與二體[2]、三體[3]或四體[4]一樣移動的連接產(chǎn)物。下圖連接產(chǎn)物的百分率被定量并顯示成時間的函數(shù)(菱形，不含Dbait;圓圈，含有200nMDbait32H)以及Dbait分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)的函數(shù)(在與200nM各種不同的Dbait溫育2小時后)。圖1.4:在1.5嗎Hep2核蛋白提取物中，對多種具有不同長度、序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)包括修飾的骨架的以下2figDbait分子進(jìn)行的DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)活性分析Dbait32ss和Dbait32css是兩個32-nt的單鏈DNA;Dbait32C是啞鈴狀的32-bp的雙鏈DNA(不具有游離的平末端);Dbait8H、Dbaitl6H、Dbait24H和Dbait32H是發(fā)夾狀雙鏈DNA，莖分別為8、16、24和32-bp;Dbait32H、Dbait32Hb、Dbait32Hc和Dbait32Hd是32-bp的發(fā)夾狀DNA，具有不同的序列但是具有同樣的堿基組成；Dbait32d-F和DbaitHc-cy3分別是帶有熒光和花青素3標(biāo)簽的Dbait32Hd和Dbat32Hc;Dbait32H-po是全長磷酸二酯Dbait32H，與它相比其它的Dbait分子在游離的平末端具有3-bp的磷酸硫酯，只有DbaitHc-3，mp和Dbait32Hc-5'3，mp除外，它們分別在3，末端或5，和3'末端具有3-nt的甲基膦酸酯。Dbait32Hc5，5，具有3，陽3，鍵合，因此表現(xiàn)出5V5'平末端；對于這些Dbait分子的詳細(xì)情況可以參考表1.1和表1.2。數(shù)據(jù)代表了至少3次獨立實驗的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖2.1:在存在不同Dbait分子的情況下用來自137銫源的7-射線進(jìn)行4x0.5Gy(間隔2小時)的輻射后，Hela細(xì)胞的克隆存活分析。圖A:在存在Dbait32和Dbait32H的情況下歸一化的存活克隆數(shù)的劑量依賴性。圖B:在存在83nM(培養(yǎng)基中的濃度)的不同Dbait分子的情況下歸一化的存活克隆數(shù)。圖2.2:在存在不同Dbait分子的情況下用來自137銫源的，射線進(jìn)行4x0.5Gy(間隔2小時)的輻射后，Hela細(xì)胞的附加的克隆存活分析。上圖在存在Dbait32H和Dbait8H的情況下歸一化的存活克隆數(shù)的劑量依賴性。下圖在存在2pg不同Dbait分子的情況下歸一化的存活克隆數(shù)。圖2.3:2昭Dbait32H分子對帶有編碼新霉素抗性基因的線性質(zhì)粒片段(2昭)的輻射增強(qiáng)的非正常整合的抑制。圖2.4:各種不同Dbait32分子(2pg)對帶有編碼嘌呤霉素抗性基因的線性質(zhì)粒片段(2昭)的輻射增強(qiáng)的非正常整合的抑制的附加分析。上圖在存在分步(4x0.5Gy)輻射(實心圓圈)或不存在輻射(實心三角形)的情況下Dait32H分子的劑量依賴性；下圖在存在2昭各種不同Dbait分子或200pMDNA-PK抑制劑(渥曼青霉素(wortmannin)或NU7026)的情況下，使用輻射(黑色)或不使用輻射(灰色)時的質(zhì)粒整合效率。圖2.5:在2Gy輻射后2小時，通過熒光Dbait32H-FITC分子轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞中的y-H2AXfoci顯示出的雙鏈斷裂(DSB)位點的免疫檢測。左圖通過核中的y-H2AX抗體的免疫熒光檢測到的Dbait32H-FITC(亮點和小片)和DSB位點的熒光；右圖通過y-H2AX抗體的免疫熒光和DAPI復(fù)染檢測到的帶有DSB位點的核的相同照片。左下角的箭頭顯示在核中不存在Dbait32H-FITC和y-H2AX信號。右上角的箭頭顯示協(xié)同定位的Dbait32H-FITC禾口y-H2AX信號。圖2.6:上圖組蛋白H2AX被PIKKs磷酸化。通過western印跡分析總細(xì)胞提取物的磷酸化形式的組蛋白H2AX(y-H2AX)的水平，并與總H2AX蛋白進(jìn)行比較。用各種不同Dbait分子32Hc、24H、16H和8H轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞5小時，或不轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染結(jié)束時將它們輻射，溫育1小時，然后進(jìn)行分析。結(jié)果表示成y-H2AX/H2AX的歸一化比率的柱形圖。下圖通過對y-H2AXfoci的FACS顯示的輻射過(IR)的細(xì)胞中DSB位點的持久性的動力學(xué)Dbait32Hc+IR(實線)；單獨的IR(虛線)和未處理的(點線)。圖3.1:未處理的GMA32細(xì)胞、單獨轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、或通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)用不同Dbait分子轉(zhuǎn)染的、但是沒有進(jìn)一步輻射或用有絲分裂抑制劑處理的細(xì)胞的FACS分析。Ml期顯示了處于表明細(xì)胞死亡的亞Gl期的細(xì)胞的百分率。圖3.2:在未處理的GMA32細(xì)胞、單獨轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、或通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺用不同Dbait分子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中通過y-H2AX標(biāo)記(核中的亮點或小片)進(jìn)行的DNA修復(fù)位點的免疫檢測。細(xì)胞膜和細(xì)胞核的復(fù)染用FITC-DiOC6和DAPI進(jìn)行。圖3.3:未處理的GMA32細(xì)胞、單獨轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、或通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺用不同Dbait分子轉(zhuǎn)染的、但是沒有進(jìn)一步輻射或用有絲分裂抑制劑處理的細(xì)胞的p53的15位絲氨酸殘基的磷酸化狀態(tài)的Western印跡分析。圖3.4:在存在不同Dbait分子的情況下，未處理的和用4Gy輻射或用不同的有絲分裂抑制劑(200nM諾考達(dá)唑、100nM異長春花堿(長春瑞濱)或200nM紫杉醇(太平洋紫杉醇))處理的GMA32細(xì)胞的克隆存活性。圖4.1:處理和未處理的小鼠上異體移植的人類喉腫瘤的生長，被監(jiān)測為t時的腫瘤體積與初始體積的比率(Vt/Vi)。圖A:未處理的小組(n=38);圖B:使用20pl培養(yǎng)基(MEM)+3x2Gy/周輻射的對照小組(n=30);圖C:使用1nmole(20fig)Dbait32H+3x2Gy/周輻射的小組(n=35)。MEM或Dbait32H在輻射之前5小時通過腫瘤內(nèi)注射來遞送。每兩天中的一天給予分份的輻射劑量(2Gy)，每周三次。處理持續(xù)5周，總輻射劑量為30Gy。點代表了每只小鼠的腫瘤體積的時間過程。實線是最佳的多項式擬合。圖D顯示了腫瘤體積的增加(Vt/Vi)小于5的所有小鼠的Kaplan-Meier圖。圖4.2:裸鼠中Hep2異體移植腫瘤中花青素C3標(biāo)記的Dbait32H的分布。將20(ig用Superfect(轉(zhuǎn)染試劑)配制的Dbait32H-Cy3注射到1.5ci^Hep2腫瘤中。在注射后6小時將小鼠處死。取出腫瘤，低溫切片，不用固定進(jìn)行分析。DAPI用于核染色。圖4.3:裸鼠中Hep2異體移植腫瘤的放射性致敏作用。在進(jìn)行了不同處理的4組IO只動物中，監(jiān)測了處理期間(在35天中進(jìn)行了15期處理；灰色背景)和處理后(白色背景)腫瘤的生長。對于每只動物標(biāo)出了每個腫瘤的生長。處理方法在頂部標(biāo)明。對于每期處理期間，在2Gy輻射之前5小時，將2嗎用轉(zhuǎn)染試劑(PEI)配制的Dbait32H注射到腫瘤中。也標(biāo)出了每組的腫瘤體積增加5倍所用的平均時間。對每個接受組合處理的組計算p-值，并與只接受輻射的組進(jìn)行比較。圖4.4:上圖Hep2腫瘤皮下異體移植的裸鼠的存活率的Kaplan-Meier表示法。處理方法描述在圖4.3中。5個組包括了未處理的，模擬轉(zhuǎn)染和輻射的，通過組合的輻射和增加量的Dbait32H(20，60和120pg/期)處理的。每組動物的數(shù)量在表3.2中標(biāo)出?；疑尘氨硎咎幚淼臅r期。下圖在處理開始后15天、處理結(jié)束時(35天)和處理結(jié)束后13天(35+13天)拍攝的代表3個組(未處理，用20和60嗎Dbait32H/期與2Gy輻射聯(lián)合處理的)的腫瘤的照片。圖4.5:在處理中期(7期處理)異體移植的Hep2腫瘤的組織學(xué)分析。腫瘤在標(biāo)明的各種不同處理方法開始后20天取出。將它們固定在福爾馬林中，將組織切片用蘇木精、曙紅和番紅花色素染色。對于每種處理方法通過顯微鏡分析兩個腫瘤。圖a:每種方法的代表性視野的照片。比例尺表示400mm(圖1-4)和100mm(圖5-8)。一旦需要可以獲得彩色照片。圖b:壞死的程度被表示為被分析為壞死的組織切片的表面積的比例。有絲分裂的細(xì)胞和凋亡的細(xì)胞的數(shù)量從高倍率下分析的大約1,000個細(xì)胞的代表性非壞死視野來估算。圖4.6:在處理中期(7期處理)時異體移植的Hep2腫瘤的NMR成像。顯示了未處理的腫瘤、用輻射(2Gy/期)處理的腫瘤和用組合的Dbait32H(20嗎/期)和輻射(2Gy湖)處理的腫瘤的三個代表性的橫截面照片。腫瘤用白色圓圈勾畫出。腫瘤中的灰色實體表示壞死的區(qū)域。圖4.7:用不同腫瘤(Hep2:鱗狀細(xì)胞癌；U87:成膠質(zhì)細(xì)胞瘤；LU1205和SK28:兩種類型的黑素瘤)皮下異體移植的裸鼠的存活率的Kaplan-Meier表示法。處理的時期用灰色區(qū)域標(biāo)明。圖5.1:圖A:用于3組/小組的平均年齡為12周的K-Rasvl2GxApc1638N轉(zhuǎn)基因小鼠的處理方法對照組(未處理)，用5FU+CPT11處理的組，用5FU+CPT11和Dbait32H處理的組。進(jìn)行了三輪的處理。每輪包括腹膜內(nèi)注射0.6mg5FU和0.6mgCPTll，以及口服O.lmgDbait32H，一周三次，然后休息一周。每組中涉及的小鼠的數(shù)量標(biāo)在括號中。終點是存活時間；圖B:三個組的存活曲線的Kaplan-Meyer作圖；圖C:圖B中顯示三個組的中值存活時間。圖5.2:在用5FU+CPT11以及5FU+CPT11禾卩Dbait32H處理的組中通過放大鏡或組織學(xué)檢査在每只動物的消化道中發(fā)現(xiàn)的腫瘤的平均數(shù)量。每個組中動物的數(shù)量標(biāo)在括號中。在上圖中顯示的方法后2周(第18周)，將所有小鼠處死。對照小組(未處理的組，n=101)的平均數(shù)量是30.8/動物(數(shù)據(jù)未顯示)。圖5.3:消化道組織的熒光顯微鏡分析。圖A:方法圖解(i.p.:腹膜內(nèi)注射；O.:口服)。圖B:在按照圖A中給出的方法處理的動物的腫瘤組織的5pm切片上，Dbait32H-FITC分子(左)和免疫熒光標(biāo)記的Y-H2AX(右)的熒光。下面的部分顯示了上面部分(使用10x透鏡，白框)中標(biāo)出的區(qū)域的詳細(xì)情況(使用63x透鏡)。在DAPI復(fù)染的核上的亮點顯示了熒光Dbait32H-FITC和標(biāo)記的y-H2AX的協(xié)同定位(co-localization)。發(fā)明詳述正如上面討論的，本發(fā)明公開了一類新型的治療性分子，它們能夠以非基因特異性的方式干擾哺乳動物細(xì)胞中的DNA修復(fù)系統(tǒng)。這些被命名為Dbait分子的新分子，是參與NHEJ途徑(不依賴于序列的途徑)的蛋白、特別是Ku和/或DNA-PKcs蛋白的全復(fù)合物的底物，并且可以中和細(xì)胞的DNA修復(fù)能力，從而增加它們對DNA損傷性治療的敏感性。因此，本發(fā)明涉及了這樣的分子，它們的制造和它們的治療性應(yīng)用，特別是與DNA損傷性治療相結(jié)合用于治療增殖性疾病。本發(fā)明的Dbait分子可以根據(jù)多種特征來定義，所述特征例如為它們的極小長度、至少存在游離末端、以及存在雙鏈部分。正如下面將要討論的那樣，Dbait分子的重要特征是它們的具體核苷酸序列基本上不影響它們的活性。此外，Dbait分子可以含有修飾的和/或非天然的骨架。因此，本發(fā)明的第一個目的是核酸分子，其中所述分子含有至少大約16bp的雙鏈部分，具有至少一個游離末端，并至少與參與NHEJ途徑的Ku復(fù)合物結(jié)合。分子優(yōu)選為非人類來源的(即其核苷酸序列和/或構(gòu)象(例如發(fā)夾)不原樣存在于人細(xì)胞中)，最優(yōu)選為重組和/或合成來源的。根據(jù)Dbait分子的作用機(jī)制，Dbait分子的序列如果有作用的話發(fā)揮了很小的作用。因此，與在現(xiàn)有技術(shù)中使用的用于基因/蛋白特異性靶向的分子(例如反義分子、抗原、siRNA、適體、核酶等)相反，Dbait分子可以不與已知的基因、啟動子、增強(qiáng)子、5'-或3'-上游序列、外顯子、內(nèi)含子等具有任何顯著程度的序列同源性或同一性。換句話說，Dbait分子干擾NHEJ途徑的作用是不依賴于序列的，Dbait分子可以與人類基因組中的任何基因具有少于70%、甚至少于50%的序列同一性。這種不依賴于序列的作用機(jī)制是Dbait分子的標(biāo)志，這將它們與其它基因特異性或蛋白特異性(序列依賴性)治療試劑例如反義寡核苷酸、小干擾RNA(siRNA、shRNA和miRNA)、免疫刺激性CpG寡核苷酸以及被設(shè)計用于捕獲特異性蛋白的適體清楚地區(qū)分開來。在優(yōu)選實施方案中，Dbait分子的序列與人類核酸序列的總體同一性程度小于大約70%、60%、55%或50%。確定序列同一性的方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的，并且包括例如Blast。在具體的實施方案中，Dbait分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下不與人類基因組DNA雜交。典型的嚴(yán)謹(jǐn)條件是能夠允許將完全互補(bǔ)的核酸與部分互補(bǔ)的核酸區(qū)分開來的條件(參考例如Sambrook等)。在優(yōu)選實施方案中，Dbait分子的序列不含有CpG，以避免眾所周知的toll樣受體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，如果不想要這樣的效應(yīng)的話。CpG是指由胞嘧啶后面跟著鳥嘌呤構(gòu)成的二核苷酸?？紤]到它們的作用機(jī)制，Dbait分子的長度可以是不同的，只要它足以允許與Ku蛋白復(fù)合物的適當(dāng)結(jié)合就行。實驗部分顯示出為了確保與Ku復(fù)合物的結(jié)合，Dbait分子的最小長度是大約16bp。優(yōu)選情況下，Dbait分子包括16-200bp，最優(yōu)選情況下包括24-100bp。Dbait分子的具體例子含有24bp,最優(yōu)選32bp。正如在實施例中顯示的，這樣的長度足以允許結(jié)合含有Ku和DNA-PKc蛋白的Ku復(fù)合物。特別優(yōu)選的Dbait分子包括24-100bp，更有利情況下包括32-100bp。本發(fā)明的Dbait分子必須具有至少一個游離末端作為DSB的模擬物。該游離末端可以是游離的平末端，也可以是5'-/3'-突出末端。在具體的實施方案中，它們只含有一個游離末端。在另一個具體的實施方案中，它們含有兩個游離末端。Dbait分子可以是線性的，或者優(yōu)選情況下，由發(fā)夾狀雙鏈核酸制成。在這種情況下，環(huán)可以是核酸或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它化學(xué)基團(tuán)，優(yōu)選為連接子例如六甘醇或四脫氧胸苷酸(T4)。在優(yōu)選實施方案中，Dbait分子具有下列特征1)當(dāng)與可藥用載體/賦形劑一起使用時，雙鏈Dbait分子能夠被細(xì)胞/組織體攝取到細(xì)胞核內(nèi)；2)Dbait分子的至少一個游離末端能夠被參與DSB損傷感應(yīng)、信號傳導(dǎo)和/或修復(fù)過程的酶的全復(fù)合物識別；3)Dbait分子的至少一個游離末端可以被所述復(fù)合物接受以摻入到腫瘤細(xì)胞的基因組DNA中。在具體的實施方案中，由于它們的結(jié)構(gòu)和/或骨架，Dbait分子具有非復(fù)制性結(jié)構(gòu)。就此而言，本發(fā)明的Dbait分子可以只含有或主要(超過50%)含有天然的磷酸二酯骨架或化學(xué)修飾的磷酸二酯骨架，或者另一種具有化學(xué)基團(tuán)或化學(xué)基團(tuán)的混合物的骨架，只要修飾的dsDNA仍然是參與NHEJ途徑、特別是Ku和DA-PKcs蛋白、以及DSB損傷感應(yīng)或信號傳導(dǎo)途徑的全復(fù)合物的底物。有利的是，化學(xué)修飾被打算用于賦予Dbait分子以化學(xué)穩(wěn)定性，和/或防止它們在整合到染色體中之后進(jìn)一步復(fù)制(誘變效應(yīng)的潛在原因)，如果整合發(fā)生的話。它們也可以具有糖模擬物例如2'-0-垸基核糖、2'-0-烷基-C4'支鏈核糖、環(huán)丁基或其它碳環(huán)或己糖醇取代呋喃戊糖基團(tuán)。優(yōu)選的Dbait在一條或每條鏈的末端含有一個或幾個化學(xué)基團(tuán)。優(yōu)選的化學(xué)基團(tuán)包括硫代磷酸酯?；蛘?，優(yōu)選的Dbait具有存在甲基膦酸酯骨架的核苷酸。本發(fā)明的其它修飾骨架包括氨基磷酸酯，嗎啉代核酸、2'-0,4'-C亞甲基/亞乙基橋接的鎖核酸，肽核酸(PNA)，以及低級垸基或環(huán)垸基糖間鍵合，或具有可變長度的短鏈雜原子或雜環(huán)糖內(nèi)鍵合，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何修飾核苷酸。美國專利No.5,677,437描述了雜芳香寡核苷酸連鍵。氮連接子或含有氮的基團(tuán)也可用于制備寡核苷酸模擬物(美國專利No.5,792,844和No.5,783,682)。美國專利No.5,637，684描述了氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯寡聚化合物。還設(shè)想了具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的的寡核苷酸(美國專利No.5,034,506)。在其它實施方案中，例如肽核酸(PNA)骨架、寡核苷酸的磷酸二酯骨架，可以被聚酰胺骨架代替，堿基直接或間接結(jié)合到聚酰胺骨架的氮雜氮原子上。其它的合成寡核苷酸可以含有取代的糖基團(tuán)，它們在2'位置含有下列基團(tuán)之一OH;SH;OCH3;SCH3;F;OCN;OCH2CH20CH3;0(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n是l到大約10;Cl到C10低級低級烷基，取代的低級烷基，垸芳基或芳垸基；Cl;Br;CN;CF3;OCF3;0-S-;或N-烷基；0-、S-或N-鏈烯基；SOCH3;S02CH3;ONO;NO;N3。該不可復(fù)制的元件可以摻入到雙鏈片段的內(nèi)部位置或末端。它(它們)可以含有a)不能被用作DNA復(fù)制的模板的單元，例如聚乙二醇鏈，優(yōu)選為六甘醇鏈，或任何被一個或多個雜原子例如氧、硫、氮或含有一個或多個雜原子的雜芳基或雜環(huán)基最終中斷和/或取代的碳?xì)浠衔镦湥籦)不能被DNA聚合酶或外切核酸酶處理的作為阻斷元件的單元，例如3'-修飾的核苷酸或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它物質(zhì)；c)用在發(fā)夾片段的環(huán)中的天然寡核苷酸，例如Tn、例如四聚脫氧胸苷酸(T4)。所述鏈通過化學(xué)合成、半生物合成或生物合成、任意擴(kuò)增方法來制造，然后進(jìn)行任意提取和制備方法并進(jìn)行任意化學(xué)修飾。Dbait分子的生物活性可以通過體外和基于培養(yǎng)的細(xì)胞的分析進(jìn)行評估，例如在實施例2和3中描述的分析方法，和/或也可以通過體內(nèi)分析進(jìn)行評估，例如在實施例4和5中描述的。最容易和適合的分析是DNA依賴性蛋白激酶活性分析(參見實施例2，圖1.4)。到目前為止，這種簡單的分析方法被用于預(yù)測Dbait分子的體內(nèi)活性。但是，其它基于培養(yǎng)的細(xì)胞的分析方法，例如對輻射增強(qiáng)的非正常整合的抑制分析，也是適合的(參見實施例3，圖2.3和圖2.4)。在具體的實施方案中，本發(fā)明的Dbait分子能夠活化DNA-PK。在具體的實施方案中，本發(fā)明的Dbait分子能夠抑制輻射增強(qiáng)的非正常DNA整合。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明的Dbait分子在體外與Ku復(fù)合物結(jié)合，例如通過凝膠遷移分析測定的那樣。這樣的Ku復(fù)合物可以僅含有一個或幾個Ku蛋白，也可以是一個或幾個Ku蛋白與至少一個DNA-PKc蛋白的組合。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明的Dbait分子穿透細(xì)胞核。本發(fā)明的最優(yōu)選的Dbait分子兼有上述特征中的幾個或全部。在培養(yǎng)的細(xì)胞以及裸鼠和遺傳修飾小鼠上的異體移植腫瘤中進(jìn)行的實驗已經(jīng)顯示，本發(fā)明的Dbait分子觸發(fā)了進(jìn)行放射治療和/或化學(xué)治療的腫瘤的細(xì)胞/組織的致死。因此，本發(fā)明還涉及與DNA斷裂性治療結(jié)合使用的佐劑組合物，該組合物含有例如上面定義的Dbait分子以及可藥用的載體/賦形劑，以有效量導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞的核中。本發(fā)明還涉及用于增加腫瘤對抗癌癥療法的敏感性的方法，包括下面的組合-將例如上面定義的Dbait分子導(dǎo)入癌癥細(xì)胞/組織中，和-通過DNA損傷性方法在細(xì)胞中誘導(dǎo)DNA斷裂。按照本發(fā)明的實施方案，在該導(dǎo)入步驟中使用了轉(zhuǎn)染試劑?；谠隗w內(nèi)研究中使用的方法，本發(fā)明提供了使用Dbait分子與放射療法或化學(xué)療法的組合建立臨床方法的原理。任意方法之下的原理是當(dāng)DNA損傷性事件發(fā)生時，Dbait分子應(yīng)該被遞送到細(xì)胞的核中。因此，優(yōu)選情況下，Dbait分子應(yīng)該在放射療法之前施用，但是取決于給藥模式和每種藥物的藥物動力學(xué)，它們可以與化療藥劑一起給藥。典型的方法包括在輻射之前例如5小時使用Dbait分子。使用分級輻射是特別有效的，例如在6周內(nèi)15x2Gy，或在2周內(nèi)6x5Gy。有利的是，所述方法包括了將Dbait分子治療與雙重化療相結(jié)合。例如，將5FU和CPT11—起注射3次，連續(xù)3天，中間間隔一周的休息時間?；蛘?，Dbait分子的治療可以與放療相結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地將其改造以適用于人類，特別是根據(jù)患者的體重/身體表面積。在優(yōu)選實施方案中，Dbait分子是例如上面描述的以及在人類療法的其它實踐中使用的化學(xué)修飾的Dbait分子。在另一個實施方案中，Dbait分子不是化學(xué)修飾的，而是對應(yīng)于天然的核酸片段，但是表現(xiàn)出化學(xué)修飾的片段的特征，特別是具有對應(yīng)于該化學(xué)修飾的Dbait分子的堿基對數(shù)量和所定義的特性。更具體來說，DNA鏈的斷裂由離子化輻射(放射療法)或化學(xué)反應(yīng)(化學(xué)療法)來實現(xiàn)。這種方法是一種新的輔助性治療，與DNA損傷性療法一起用于治療由于不受控制的細(xì)胞增殖導(dǎo)致的疾病、特別是癌癥。換句話說，Dbait主要被打算用于抗癌癥療法，但是它也可以用于許多抗增殖治療，例如用于治療牛皮癬。本方法可定位于治療增殖性疾病它們可以是非惡性的，例如牛皮癬和血管增殖性狹窄/再狹窄。它們可以是惡性的。相關(guān)的器官或區(qū)域可以是肺和支氣管，頭頸，胃腸道，結(jié)腸直腸癌，生殖泌尿道，婦科器官，乳腺，內(nèi)分泌腺，皮膚，視網(wǎng)膜，CNS，血液器官，原發(fā)位點已知或未知的轉(zhuǎn)移腫瘤，遺留物(remnant)(例如胸腺)。組織學(xué)本質(zhì)可以是上皮的，鱗狀細(xì)胞癌，腺癌，移行性癌，成纖維細(xì)胞/成血管細(xì)胞來源的(肉瘤)，神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)來源的，內(nèi)分泌的，類癌瘤，胃腸基質(zhì)，內(nèi)皮的，造血的，胚胎的。本發(fā)明也涉及使用所述非化學(xué)修飾的Dbait分子制造抗癌癥藥物，用于治療腫瘤、特別是對放療和/或化療具有高度抗性的腫瘤，所述藥物與DNA斷裂(例如損傷性)治療、特別是放療或化療組合使用。在體內(nèi)，化學(xué)修飾的或未修飾的Dbait分子通過任意適合的途徑與適合的可接受的載體/賦形劑一起施用，例如口服，或靜脈內(nèi)或腫瘤內(nèi)施用，或皮下注射，或局部施用，等等。本發(fā)明的另一個目的是與DNA斷裂性治療，特別是放療和化療結(jié)合使用的組合物，所述組合物含有至少一種Dbait分子以及可藥用的載體，以有效的量被導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞的核中。例如，當(dāng)使用腫瘤內(nèi)給藥時，所述有效量是每1cn^腫瘤至少0.01mg，優(yōu)選為每1cm4中瘤0.1mg，最優(yōu)選為每lcn^腫瘤0.5mg。有效量可以在每日治療方案中使用(例如每周5天，連續(xù)3到6周，或每周3次，連續(xù)3到6周)。或者，每1cmS腫瘤至少0.1mg，優(yōu)選情況下每1cm1巾瘤0.5mg，最優(yōu)選情況下每1cn^腫瘤1mg的有效量，可以在每周治療方案中施用例如連續(xù)的3到6周。當(dāng)使用其它給藥路線時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以改變用量，以特別是在每日治療方案中獲得Dbait分子在腫瘤中的有效量為每1cn^腫瘤至少0.01mg，優(yōu)選為每1cn^腫瘤0.1mg，最優(yōu)選為每1cn^腫瘤0.5mg，或在特別是在每周治療方案中獲得Dbait分子在腫瘤中每1cm1中瘤至少0.1mg、優(yōu)選情況下每1cn^腫瘤0.5mg、最優(yōu)選情況下每1ci^腫瘤1mg的有效量。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮了化療和/或放療方案后可以對劑量和方案進(jìn)行改變。本發(fā)明的另一個目的是使用上面定義的Dbait分子制造藥物，以增加細(xì)胞(例如，腫瘤)對DNA損傷性療法的敏感性。本發(fā)明的另一個目的是使用上面定義的Dbait分子制造藥物，與DNA損傷性抗癌癥療法一起用于治療癌癥。優(yōu)選情況下，DNA損傷性抗癌癥療法選自放射療法和化學(xué)療法。更優(yōu)選情況下，所述分子在放療之前施用，和/或與化療一起施用。在下面的實施例中，參考隨附的圖和表，將給出本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點。實施例在裸鼠上異體移植的人類放射性抗性腫瘤(頭頸鱗狀細(xì)胞癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，黑色素瘤)中和轉(zhuǎn)基因小鼠消化道中Rasvl2CixApc1638N雙重突變誘導(dǎo)的腫瘤中，進(jìn)行了分子和細(xì)胞研究以及分析，以便i)評估Dbait分子的生物學(xué)活性；ii)通過在使抗癌癥療法的致敏中使用Dbait分子，來證實DNA誘餌方法；iii)闡明隱藏在觀察到的Dbait介導(dǎo)的致敏作用之下的分子和細(xì)胞機(jī)理。這些研究的結(jié)果在實施例中進(jìn)行了描述和概括。實施例l:Dbait分子的設(shè)計、合成和制備設(shè)計了兩種類型的Dbait分子線性的或發(fā)夾狀的dsDNA片段。對于發(fā)夾狀Dbait分子來說，使用六甘醇連接子或四聚脫氧胸苷酸作為環(huán)。通過摻入硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或3'-3'核苷酸鍵合，可以保護(hù)dsDNA莖的末端免受3'-外切核酸酶的化學(xué)降解。原則上說，其它的化學(xué)修飾也可以使用，只要它們與Ku70/Ku80的結(jié)合和DNA-PKcs的活化相容(Martensson&Hammarten,2002)。分析了具有各種不同莖長度8bp(Dbait8H)、16bp(Dbaitl6H)、24bp(Dbait24H)禾卩32bp(Dbait32H)，以及具有不同莖序列的Dbait分子。還設(shè)計了兩個末端被兩個六亞乙基環(huán)封閉的啞鈴狀dsDNA片段(Dbait32C)作為對照。通過用熒光素(Dbait32H-FITC)、花青素3(Dbait32H-Cy3)、花青素5(Dbait32Hc-Cy5)或生物素(Dbait32H-Biot)標(biāo)記的T，對一些Dbait分子進(jìn)行了標(biāo)記。表Ll、1.2禾卩1.3概述了在本工作中使用的Dbait分子的序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)。Dbait分子序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)Dbait32Dbait32-T4Dbait32H-poDbait32HDbait24HDbait16HDba畫Dbait32HaDbait32HbDbait32HcDbait32HdDbait32Hc-3'mpDbait32Hc-5'3'mpDbait32Hc-5'5'Dbait32-NH2Dbait32CDbait32ssDbait32Hcss-po'ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT3''TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA5'ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCTTGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGAACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT3'TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA5'ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT3TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA5ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGT3'TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACA5:〕ACGCACGGGTGTTGGG3TGCGTGCCCACAACCC5:〕ACGCACGG3''TGCGTGCC5:〕GCTAGGTCTGTTTGGTGGCTTTGCAGTGGCAC3'CGATCCAGACAAACCACCGAAACGTCACCGTG5'5'GCTAGGCTTGTTTGCTGGGTTGTAGGCACAGC3'3'CGATCCGAACAAACGACCCAACATCCGTGTCG55'C3'5'GCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA3'3'CGACACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT5'5'GCTAGGTCTGTTTGGTGGCTTTGCAGTGGCAC3'3'CGATCCAGACAAACCACCGAAACGTCACCGTG5'5'GCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA3'3'cgaCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT5'5'gctGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA3'3'cgaCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT5'5'GCTAGGCTTGTTTGCTGGGTTGTAGGCACAGC3'3'GATCCGAACAAACGACCCAACATCCGTGTCG5':〕〕〕〕5'ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT3'-NH23'TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA5'-NH。廣5'ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT3'、3'TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA5,〕5'ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT-3'5'GCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA3'表1.1:Dbait分子的序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)。大寫字母是具有磷酸二酯骨架的核苷酸。粗體大寫字母是具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸。半圓形實線表示六甘醇連接子。Dbait32-T4含有4個胸腺嘧啶(T4)作為連接子代替六甘醇連接子。Dbait32C是啞鈴狀(封閉的)分子。Dbait32Hc-5'5，具有互相換位的(shuffled)序列(同樣的堿基組成但次序不同，參考表1.1中的Dbait32Hb)禾tl3，-3'鍵合。Dbait32Ha、Dbait32Hb、Dbait32Hc和Dbait32Hd與Dbait32H序列相比具有同樣的堿基組成，但次序不同。Dbait分子序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)Dbait32H-FITCDbait32H-Cy3Dbait32H-BiotDbait8Hc-Cy35'ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCt3'3'TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA5'熒光素(FITC)'花青素3(Cy3)或生物素(Biot)-標(biāo)記的T5'GCTGTGCA3'3'CGACACGt5'/=花青素3(Cy3)-標(biāo)記的T(Dbait32Hc-Cy3Dbait32Hc-Cy55'GCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA3'3'CGACACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCt5'Dbait32Hd-FITC5'GCTAGGTCTGTTTGGTGGCTTTGCAGTGGCAC3'3'CGATCCAGACAAACCACCGAAACGTCACCGtG5'J:〕花青素3(Cy3)或花青素5(Cy5)-標(biāo)記的T________________:〕^=熒光素(FITC)-標(biāo)記的T表1.2:所示的各種不同的標(biāo)記的Dbait分子的序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)。大寫字母是具有磷酸二酯骨架的核苷酸。粗體大寫字母是具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸。粗體小寫字母是具有甲基膦酸酯骨架的核苷酸。半圓形實線表示六甘醇連接子。指示了各種不同標(biāo)記(花青素3或5，F(xiàn)ITC)的Dbat8Hc、Dbait32H、Dbait32Hc和Dbait32Hd分子。_Dbait分子_序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)_Dbait645。Dbait64L5'ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT——ACGCACGGTCGTTTGTTCGGTGTTGGCGATCT3'3'TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA——TGCGTGCCAGCAAACAAGCCACAACCGCTAGA5'表1.3:64-bp的Dbait64和Dbait64L分子的序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)。大寫字母是具有磷酸二酯骨架的核苷酸。粗體大寫字母是具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸。實線表示六甘醇連接子。所有Dbait分子通過自動固相寡核苷酸合成法(Eurogentec,Belgium)制備。它們通過變性反相HPLC純化。變性毛細(xì)管凝膠電泳。MALDI-TOF/LC-MS被用于質(zhì)量控制。超過90%的寡核苷酸是全長的。所有樣品在運輸前被冷凍干燥。收到后，將所有樣品溶解在雙蒸水中。Dbait分子的濃度根據(jù)在變性條件下(60°C-90°C,依賴于Dbait分子的熱穩(wěn)定性)260nm處的吸收值計算(Cantor&Warshaw，1970)。熒光染料標(biāo)記的Dbait分子的濃度根據(jù)在具體染料的適合波長下(FITC在490nm處￡=80000M".cm";Cy3在550nm處￡=150000M".cm";Cy5在650nm處5=250000M".cm")的吸光度計算。啞鈴狀dsDNA片段(Dbait32C)通過將兩個帶有六甘醇連接子并具有3'-突出和互補(bǔ)末端的半發(fā)夾結(jié)構(gòu)進(jìn)行退火并用DNAT4連接酶(BioLabs)連接來制備。基于熱力學(xué)和動力學(xué)考慮，按照它們的分子性，使用了下面的方法來制備Dbait分子的樣品-對于雙分子Dbait分子(Dbait32、Dbait32-NH2、Dbait64和Dbait64L)來說將溶解在雙蒸水中的每條鏈的儲液(以可能的最高濃度配制)的1:1的混合物在90°C加熱5分鐘以將每條鏈完全變性。通過平緩回復(fù)到室溫(樣品一般保留在水浴中)來進(jìn)行退火，將得到的雙鏈體分子分成小份儲存在-20。C。-對于單分子的Dbait分子(發(fā)夾)來說將含有200pM發(fā)夾狀Dbait分子的雙蒸水溶液在90°C加熱5分鐘以完全變性。通過將樣品在冰水(0°C)中冷卻來進(jìn)行退火。將等份試樣儲存在-20。C。實施例2:Dbait分子的生物化學(xué)分析作為剖析Dbait分子的作用機(jī)制的第一步，按照標(biāo)準(zhǔn)方法，在存在的情況下，使用不同的"P放射性標(biāo)記的Dbait分子進(jìn)行了一系列條帶遷移分析。典型情況下，將10nM"P放射性標(biāo)記的Dbait分子，在存在不同濃度的核蛋白(0、10、20、40、80、160和320ng/pL)的情況下，在TBE緩沖液中在30°C溫育10分鐘。然后將樣品上樣在5%丙烯酰胺非變性凝膠上。電泳在4。C以95V進(jìn)行2小日寸。將疑月交干燥，使用phosphorimager(MolecularDynamics)進(jìn)行掃描。圖1.1顯示了Hep2核蛋白提取物與不同長度的各種不同Dbait分子的滴定的滯留條帶圖譜。除了最短的8bp長的Dbait分子(Dbait8H)之外，對于較長的Dbait分子觀察到了最多2條滯留的條帶對于16-、24-bp長的Dbait分子(Dbaitl6H和Dbait24H)觀察到了一條滯留的條帶，而對于32-bp長的Dbait分子(Dbait32H、Dbait32H-po和Dbait32)觀察到了兩條滯留的條帶。對于32-bp的Dbait分子來說，隨著蛋白濃度的增加，滯留條帶1的強(qiáng)度先增加然后降低，而滯留條帶2的強(qiáng)度作為核蛋白提取物的濃度的函數(shù)增加。使用小鼠單克隆抗Ku70抗體(SantaCruzBiotechnology)進(jìn)行的免疫結(jié)合和條帶遷移分析的組合，表明滯留條帶l和2含有Ku復(fù)合物。在加入抗Ku70抗體后，條帶l和2進(jìn)一步遷移到條帶1*和2*(圖1.2)。可能條帶1有一個Ku70/80復(fù)合物結(jié)合到16到32-bp的Dbait上，而條帶2具有兩個Ku70/80復(fù)合物結(jié)合到32-bp的Dbait分子上。用純化的Ku蛋白進(jìn)行了對照實驗證實了這種解釋。Ku蛋白的鑒定清楚地表明Dbait分子以長度依賴性的方式與NHEJ機(jī)制相互作用。通過在存在各種不同Dbait分子的情況下將32P標(biāo)記的605-bp的線性DNA片段與Hep2核提取物進(jìn)行溫育，監(jiān)測DNA末端連接。連接產(chǎn)物從605-bp的單體開始，遷移到二體、三體或四體的位置。圖1.3顯示了在Hep2細(xì)胞核提取物中，各種不同Dbait分子對DNA末端連接反應(yīng)的影響。在溫育的前2個小時，大約16%的34標(biāo)記的平端線性雙鏈體DNA分子被連接成二體和三體。在16小時后，高分子量連接產(chǎn)物的量增加到高達(dá)總輸入DNA的30%。當(dāng)與線性32P標(biāo)記的片段相比摩爾數(shù)過量100倍的Dbait32H被加入到反應(yīng)中時，反應(yīng)被強(qiáng)烈抑制。使用從HeLa細(xì)胞制備的提取物時也觀察到了類似的對末端連接活性的抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。在大多數(shù)實驗中，Dbait32H與標(biāo)記的DNA片段同時加入到核提取物中。當(dāng)在加入片段前將Dbait32H與提取物溫育30分鐘時，抑制的程度是相似的。相比之下，當(dāng)Dbait32H在加入核提取物后30分鐘加入時，沒有對連接的抑制發(fā)生(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明Dbait分子是DNA末端連接反應(yīng)的競爭物，但是不置換所結(jié)合的復(fù)合物。通過將分子加入到核提取物中并與DNA片段溫育2小時，測試了各種不同的Dbait分子對無細(xì)胞分析的影響。短的分子(Dbait8H)、單鏈32-nt長分子(Dbait32ss)或啞鈴狀分子(Dbait32C)對連接沒有較大的影響。僅僅結(jié)合一個Ku異源二聚體的Dbait24H和Dbaitl6H，與Dbait32H同樣有效地抑制連接。這些數(shù)據(jù)表明DNA片段的重新連接被能夠募集Ku的Dbait分子強(qiáng)烈抑制。使用試劑盒SignaTECTDNA依賴性蛋白激酶分析系統(tǒng)(Promega,Madison,USA)監(jiān)測了DNA-PK活性。在存在250nMDbait的情況下，分析了增加量的Hep2核提取物(通過DEAE-Sepharose過濾清除了內(nèi)源DNA)。按照制造商的說明，將生物素?；牡孜锖透鞣N不同量的核提取物與(Y-"P)ATP在30°C溫育5分鐘。將生物素?；孜锊东@在鏈親和素膜上，清洗，并在閃爍計數(shù)器中計數(shù)。通過用結(jié)合的放射活性除以每個樣品的(Y-"P)ATP的總數(shù)，計算出磷酸化的百分率。反應(yīng)(10在60mMKOAc、100|ig/mlBSA、0.5mMMg(Cl)2、1plT4DNA連接酶10X緩沖液(Promega，Madison，USA)中進(jìn)行。在加入32P標(biāo)記的DNA(10ng)前將核提取物和Dbait溫育2分鐘。將樣品在37°C溫育不同的時間，然后通過加入20mMEDTA和lmg/ml蛋白酶K將連接終止。將連接產(chǎn)物在0.7%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，然后進(jìn)行放射自顯影,用phosphorimaging進(jìn)行定量。圖1.4顯示了多種具有不同長度、序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)包括修飾的骨架的2嗎Dbait分子，在1.5i!gHep2核蛋白提取物中的DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)活性。激酶的活性直接依賴于Dbait分子的雙鏈"莖"的長度和結(jié)構(gòu)。使用被兩個Ku二體復(fù)合物結(jié)合的32-bp長的Dbait分子時，觀察到了高的DNA-PK活化。僅僅結(jié)合一個Ku二體的Dbait分子(Dbaitl6H禾CIDbait24H)與不結(jié)合Ku的短的Dbait8H同樣無效。類似地，沒有游離雙鏈末端的單鏈Dbait32ss/Dbait32css和啞鈴狀Dbait32C，不活化DNA-PK。此外，在游離平末端的各種不同的骨架修飾(硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、3'-3'鍵合)(最多3-bp)以及內(nèi)部標(biāo)記配體(例如熒光染料)，能夠活化DNA-PK活性。值得注意的是，DNA-PK活性對Dbait分子的序列的依賴性，如果有的話，也是不顯著的，正如Dbait32H、Dbait32Hb、Dbait32Hc禾flDbait32Hd所顯示的那樣。這種簡單的無細(xì)胞DNA-PK活性分析指出，只有Dbait分子的長度(至少大約32-bp)和具有游離末端的雙鏈DNA是激酶活化所必需的，在某種程度上與它們的序列和化學(xué)修飾無關(guān)。這與DNA-PK參與NHEJ途徑---種不依賴于序列的DNA末端連接機(jī)制相一致。實施例3:Dbait分子的體外活性通過在源自于女性宮頸癌(HeLa)禾BHNSCC(Hep2)的兩個放射性抗性人類癌癥細(xì)胞系中進(jìn)行與離子化輻射相關(guān)的克隆存活分析，通過抑制外源DNA片段的非正常整合，以及通過檢測在Dbait分子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中輻射后持續(xù)的DSB位點，研究了培養(yǎng)的細(xì)胞中Dbait分子的活性。已建立的人類細(xì)胞系Hep2(頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，HNSCC)、LU1205和SK28(黑素瘤)被用于動物研究。使用Hep2、HeLaS3(上皮宮頸癌)、M059K和M059J(成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)物研究。在含有10%熱失活的胎牛血清(FBS;Invitrogen,CergyPontoise，F(xiàn)rance)和抗生素(100lag/ml鏈霉素和100pg/ml青霉素)的完全DMEM中，將細(xì)胞在37°C、100%濕度、95%空氣和5%C02的條件下將細(xì)胞生長成單層培養(yǎng)物。將LU1205生長在含有4。/。熱失活的FBS、1%谷氨酰胺和抗生素(100pg/ml鏈霉素和100ng/ml青霉素)的MCDB中。將在6孔板中指數(shù)生長的細(xì)胞收獲，并與700ml含有Dbait分子和Superfect試劑(Qiagen，Courtaboeuf,France)混合物的完全DMEM進(jìn)行溫育，比例為每iigDNA10(ilSuperfect。在標(biāo)準(zhǔn)條件下在37°C溫育5小時后，將細(xì)胞用PBS清洗，加入完全DMEM。在指定的時間，在轉(zhuǎn)染開始后5小時將細(xì)胞暴露于一次處理(10Gy)，或在轉(zhuǎn)染開始后3、4、5和6小時將細(xì)胞暴露于用^Cs單位(1Gy/min)進(jìn)行的4次處理，每次0.5Gy，然后允許細(xì)胞生長2周。當(dāng)測量質(zhì)粒整合時，在轉(zhuǎn)染后48小時，將2嗎質(zhì)粒加入到Dbait轉(zhuǎn)染物中，將嘌呤霉素(1.7pg/ml)加入到生長培養(yǎng)基中。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率通過在FACScan流式細(xì)胞儀(FACSalibur,Beckton-Dicki勵n,USA)上分析10,000個細(xì)胞的GFP表達(dá)來估算。3.1)誘導(dǎo)的細(xì)胞致死在經(jīng)過8小時將Dbait分子轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中并用來自137Cs源的，射線進(jìn)行了四次間隔2小時的0.5Gy分步輻射(4x0.5Gy)后，與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，觀察到了克隆存活性的顯著降低。結(jié)果在圖2.1中給出，其中圖A給出了在存在Dbait32和Dbait32H的情況下歸一化的克隆存活數(shù)的劑量依賴性，而圖B給出了在存在83nM(培養(yǎng)基中的濃度)不同Dbait分子的情況下歸一化的存活克隆數(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)在添加了10%血清的MEM中進(jìn)行。Superfect(Qiagene)按照制造商的說明書被用作轉(zhuǎn)染試劑?？寺〈婊盥时还浪銥樘幚磉^的細(xì)胞形成的克隆的數(shù)量與未處理細(xì)胞的數(shù)量的比率。效應(yīng)以劑量依賴性的方式依賴于Dbait分子的長度和化學(xué)本質(zhì)。在該分析中，發(fā)夾狀Dbait分子(Dbait32H、Dbait32-T4和Dbait24H)以及線性雙鏈Dbait分子(Dbait64和Dbait64L)顯著降低了克隆存活率。值得注意的是，缺少游離dsDNA末端(由兩個末端的六甘醇連接子加帽)的啞鈴狀Dbait32C分子沒有顯示出任何效應(yīng)。環(huán)的化學(xué)本質(zhì)沒有影響(Dbait32H對Dbait32-T4)。這些觀察表明，在培養(yǎng)的細(xì)胞中，某些Dbait分子可以有效地增加細(xì)胞對離子化輻射的敏感性。圖2.2證實了前面的觀察，并為單鏈或短的8-bpDbait分子沒有任何效應(yīng)提供了附加的數(shù)據(jù)。此外，它顯示出效應(yīng)不是序列依賴性的(Dbait32H對Dbait32Hc)。處理存活率細(xì)胞株_fy^_^_%M059K無無100(4.41)10Gy無9.83(0.61)_10Gy_Dbait32Hc3.47(1.01;)M059J無無100(2.97)DNA-PK-無效10Gy無3.97(0.38)10GyDbait32Hc3.98(0.35)表2:用輻射和Dbait處理后DNA-PK感受態(tài)細(xì)胞(M059K)和DNA-PK缺陷細(xì)胞(M059J)的細(xì)胞存活率。將細(xì)胞稀釋并鋪于搖瓶中以形成克隆，然后進(jìn)行IOGy輻射和/或用2jigDbait32Hc轉(zhuǎn)染。當(dāng)兩種處理被結(jié)合使用時，輻射在轉(zhuǎn)染后5小時進(jìn)行。存活率被計算為處理后形成克隆的細(xì)胞數(shù)量除以在未處理樣品中形成克隆的細(xì)胞數(shù)量。從三次獨立的實驗計算出平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(在括號中)。通過克隆形成估算了Dbait32Hc轉(zhuǎn)染對p輻射后DNA-PK野生型和突變型細(xì)胞存活率的影響。輻射后的存活率從未轉(zhuǎn)染的M059K細(xì)胞中的9.83%降低到Dbait32Hc轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的3.47%。相比之下，在對應(yīng)的無DNA-PK突變體細(xì)胞系M059J中，存活率不受Dbait32Hc轉(zhuǎn)染的影響。在輻射過和Dbait32Hc轉(zhuǎn)染的野生型細(xì)胞系中的存活率水平，與僅僅進(jìn)行輻射的無DNA-PK突變體細(xì)胞中觀察到的相似(3.47%對3.97%)。這表明在野生型轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，Dbait32Hc抑制了DNA-PK依賴性修復(fù)。3.2)Dbait分子對外源DNA的非正常整合的抑制離子化輻射已知可以增加外源DNA的非正常整合，該過程被稱為輻射增強(qiáng)的整合。Hela細(xì)胞培養(yǎng)物被用于該分析。使用2嗎帶有新霉素抗性編碼基因的線性質(zhì)粒，以三種不同的DNA/superfect比例(1:2，1:5，1:10)在8小時的時間內(nèi)對細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染期間，將細(xì)胞暴露于不同的輻射方案沒有輻射，1Gy和2Gy的單次輻射，以及以每2小時0.5Gy的分步劑量遞送的2Gy輻射(4x0.5Gy)。通過在含有0.6mg/mlG418的培養(yǎng)基中篩選Ne(/細(xì)胞來監(jiān)測質(zhì)粒的整合。分步輻射方案明顯增加了質(zhì)粒的整合。當(dāng)在轉(zhuǎn)染混合物中加入2jagDbait32H分子時，輻射增強(qiáng)的整合消失(圖2.3)。圖2.4提供了附加的數(shù)據(jù)，顯示了只有32-bp的Dbait分子(Dbait32H和Dbait32Hc)能夠抑制帶有嘌呤霉素抗性編碼基因的環(huán)狀質(zhì)粒的輻射增強(qiáng)的非正常整合，而較短的Dbait分子(Dbaitl6H，Dbait8H)、單鏈或啞鈴狀Dbait分子(Dbait32ss和Dbait32C)沒有效果。使用了已知的PI3K(包括DNA-PK)的抑制劑Wortmann(Wort)和NU7026(NU)作為對照。這些實驗顯示出，需要Ku、DNA-PK和ATM蛋白的外源DNA的輻射增強(qiáng)的非正常整合(Nimuraeta1.，2002)，正如預(yù)期的那樣以不依賴于序列的方式被32-bp的Dbait分子抑制，因為這些Dbait分子的作用機(jī)制是通過綁架參與NHEJ途徑的蛋白來進(jìn)行的。3.3)在Dbait分子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中輻射后DSB位點的持久性核中的DSB位點可以通過結(jié)合在磷酸化的H2AX(組蛋白H2A的變體)上的y-H2AX抗體的免疫熒光來監(jiān)控。在輻射后大多數(shù)y-H2AX位點很快出現(xiàn)，并隨著DSB修復(fù)過程的進(jìn)展而消失。轉(zhuǎn)染和輻射方案與上面描述的那些相似。對于免疫檢測來說，將細(xì)胞生長在直徑5cm的皮氏培養(yǎng)皿中的蓋玻片表面上，用2(agFITC標(biāo)記的Dbait32H-FITC分子使用Superfect(Qiagene)按照制造商的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染開始后4小時，對細(xì)胞進(jìn)行輻射(2Gy)，然后在培養(yǎng)基中在37。C靜置2小時。經(jīng)過3輪清洗后，將細(xì)胞用2。/。PFA固定10分鐘。經(jīng)過再一次清洗后，使用在lxPBS、1%BSA中稀釋100倍的兔抗Y-H2AX抗體(4411-PC,Trevigen)檢測y-H2AX的存在。將細(xì)胞用lxPBS、0.5。/。TritonX-100清洗3次，然后在室溫與在lxPBS、1。/。BSA中稀釋IOO倍的羅丹明結(jié)合的山羊抗兔抗體溫育1小時。細(xì)胞通過落射熒光顯微鏡觀察。圖2.5顯示了在2Gy輻射后2小時從熒光Dbait32H-FITC分子轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞獲得的結(jié)果。左圖通過核中的Y-H2AX抗體的免疫熒光檢測到的Dbait32H-FITC(亮點和小片)和DSB位點的熒光；右圖通過Y-H2AX抗體的免疫熒光和DAPI復(fù)染檢測到的帶有DSB位點的核的同樣的照片。左下角的箭頭顯示在核中不存在Dbait32H-FITC和y-H2AX信號。右上角的箭頭顯示了Dbait32H-FITC和y-H2AX的協(xié)同信號。如圖2.5所示，在輻射(2Gy)后2小時，DSB位點仍保持在Dbait32H-FITC分子轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞中，正如Dbait32H-FITC和y-H2AX抗體的雙重?zé)晒鈽?biāo)記所顯示的。值得注意的是，在沒有被Dbait32H-FITC有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，DSB位點幾乎不能被檢測到。這些數(shù)據(jù)表明，在Dbait32H有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中DSB的修復(fù)受損，而在轉(zhuǎn)染不太好的細(xì)胞中DNA修復(fù)是完整的。使用兔抗phosphoThr68-Chk2單克隆抗體(CellSignalingTechnology,Denver,USA)，抗|3-肌動蛋白單克隆抗體AC-15克隆(Sigma:MS,USA)，抗H2AX抗體(CellSignalingTechnology,Denver,USA)和小鼠抗磷酸化組蛋白H2AX(Serl39)抗體(Upstate,Tempcula,CA，USA)進(jìn)行了Western印跡。圖2.6上圖顯示了磷酸化形式的組蛋白H2AX(y-H2AX)的western印跡分析，并與PIKKs對組蛋白H2AX的總H2AX蛋白的磷酸化進(jìn)行比較。用各種不同Dbait分子32Hc、24H、16H和8H轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞5小時，或不轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染結(jié)束時將它們輻射，溫育1小時，然后進(jìn)行分析。顯示出與對照細(xì)胞相比，Dbait32Hc極大地增加了磷酸化形式的H2AX(Y-H2AX)(都是輻射過的細(xì)胞，或都沒有輻射過)。其它較短的Dbait分子有低得多的或沒有效果。為了研究Dbait對離子化輻射誘導(dǎo)的y-H2AX位點的形成和喪失的影響，通過superfect(Qiagen)將Dbait32H-Cy3轉(zhuǎn)染到Hep2細(xì)胞中。對轉(zhuǎn)染的和未轉(zhuǎn)染的Hep2細(xì)胞進(jìn)行10Gy輻射。在不同時間將細(xì)胞固定(0分鐘，30分鐘，1小時，5小時，24小時，48小時，72小時和7天)。針對g-H2AX(ser139)的小鼠單克隆抗體(Upstate,Tempcula,CA,USA)作為第一抗體稀釋500倍使用，在0。C溫育2小時，然后用PBS緩沖液清洗，并與稀釋200倍的Alexa488結(jié)合的第二抗體抗小鼠IgG抗體(MolecularProbe,Eugene,OR,USA)在暗室中溫育1小時。通過用FACScan流式細(xì)胞儀(FACSalibur,Beckton-Dickinson,USA)檢測輻射過的細(xì)胞中的Y-H2AX，揭示了DSB位點所持續(xù)時間的動力學(xué)。圖2.6下圖顯示出與對照(輻射但未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或未處理的細(xì)胞)相比，在Dbait32H轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中Y-H2AX保持較高水平并在該水平持續(xù)較長時間。該實驗表明Dbait32H顯著阻止了離子化輻射誘導(dǎo)的DSBs的修復(fù)。實施例4:Dbait分子在GMA32細(xì)胞系中的效應(yīng)以及它們與輻射或有絲分裂抑制劑的關(guān)聯(lián)將允許DNA斷裂的GMA32中華倉鼠成纖維細(xì)胞維持在添加有l(wèi)mM丙酮酸鈉、2mM谷氨酰胺、lxMEM非必需氨基酸、lx青霉素/鏈霉素和10%馬血清的MEM培養(yǎng)集中(Gibco)。典型情況下，在用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺2000(LifeTechnologies)作為轉(zhuǎn)染試劑(以1:3的比率)按照制造商的說明書轉(zhuǎn)染不同Dbait分子(4.5pg)之前24小時，將2xl05到4"05個細(xì)胞接種到直徑為5cm的皮氏培養(yǎng)皿中不含抗生素的培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)染結(jié)束時，將細(xì)胞輻射(4Gy)或用如下有絲分裂抑制劑處理諾考達(dá)唑(200nM)、諾維本(100nM)或紫杉醇(200nM)。大約16小時后，除去藥物，允許細(xì)胞恢復(fù)。細(xì)胞輻射使用來自137Cs源的y-射線進(jìn)行。經(jīng)過24小時恢復(fù)后，收集細(xì)胞并用于FACS、western印跡分析，或用于確定克隆形成率(存活率)和每種處理的效果。圖3.1顯示了未處理的GMA32細(xì)胞，單獨轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺用不同Dbait分子轉(zhuǎn)染，但沒有進(jìn)一步輻射或用有絲分裂抑制劑處理的細(xì)胞的FACS分析。Ml期代表了處于表明細(xì)胞死亡的亞Gl期的細(xì)胞的百分率。僅僅在存在雙鏈Dbait32和發(fā)夾狀Dbait32H分子的情況下觀察到了顯著的細(xì)胞死亡，而發(fā)夾狀Dbaitl6H和單鏈Dbait32ss分別誘導(dǎo)了中度和溫和的細(xì)胞死亡。最短的發(fā)夾狀Dait8H與對照(只用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)相比，不能觸發(fā)細(xì)胞死亡。實驗使用FACScalibur流式細(xì)胞儀(BectonDickinson)進(jìn)行。收集細(xì)胞，懸浮在lml冷的GM緩沖液中(6.5mM葡萄糖，137mMNaCl，5.4mMKCl，2mMNa2HP04，lmMKHP04，0.5mMEDTA)，并在加入3ml冷的100%乙醇后在4°C保存至少2小時。在該階段，最后將細(xì)胞用lxPBS清洗，然后在室溫下在PI溶液(lxPBS緩沖液中含有50貼/ml碘化丙啶和25|ag/mlRNaseA)中染色30分鐘。使用Cellquest軟件分析10,000個事件，細(xì)胞聚集體被門控。具有亞G1DNA內(nèi)含物的細(xì)胞的百分率被記分。在同樣條件下，在未處理的GMA32細(xì)胞、單獨轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺用不同Dbait分子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，通過Y-H2AX標(biāo)記對139位的絲氨酸被磷酸化的，H2AX的DSB位點(核中的亮點或小片)進(jìn)行了免疫檢測。細(xì)胞膜和細(xì)胞核的復(fù)染通過FITC-DiOC6和DAPI進(jìn)行。觀察到了Dbait分子的類似的效果(圖3.2)。該實驗顯示出雙鏈Dbait32和發(fā)夾狀Dbait32H都能有效觸發(fā)類似的細(xì)胞應(yīng)答，就像在核中發(fā)生了DNA損傷。這為這些Dbait分子能夠用于捕獲經(jīng)過NHEJ途徑參與DSB修復(fù)的蛋白提供了看得到的證據(jù)。對于免疫檢測來說，在用不同的Dbait分子進(jìn)行轉(zhuǎn)染之前24小時，將細(xì)胞生長在直徑5cm的皮氏培養(yǎng)皿中的蓋玻片上。在轉(zhuǎn)染后1天，將FITC-DiOC6(分子探針)加入到培養(yǎng)基中，37。C5分鐘(以對膜進(jìn)行復(fù)染)。經(jīng)過3輪清洗后，將細(xì)胞用4。/。PFA固定20分鐘。經(jīng)過再次清洗后，使用在lxPBS、1%BSA中稀釋IOO倍的兔抗y國H2AX抗體(4411-PC,Trevigen)檢測在139位絲氨酸(？H2AX)上磷酸化的Y-H2AX。將細(xì)胞用lxPBS、0.5%TritonX-100清洗3次，然后與在lxPBS、1%BSA中稀釋100倍的山羊抗兔抗體Alexa594(MolecularProbes)在室溫溫育1小時。細(xì)胞通過落射熒光顯微鏡觀察。為了尋找DNA損傷信號傳導(dǎo)的證據(jù)，進(jìn)行了進(jìn)一步的實驗。p53蛋白是一種眾所周知的介導(dǎo)DNA損傷信號傳導(dǎo)以及通過改變其磷酸化狀態(tài)協(xié)調(diào)適當(dāng)反應(yīng)(DNA修復(fù)、凋亡等)的主要蛋白。具體來說，p53的15位殘基絲氨酸的磷酸化參與了與用作反饋控制的MDM2蛋白的相互作用。因此，通過Western印跡評估了p53的15位絲氨酸的磷酸化狀態(tài)。圖3.3顯示了當(dāng)細(xì)胞被雙鏈Dbait32或發(fā)夾狀Dbait32H分子轉(zhuǎn)染時，p53的15位絲氨酸被高度磷酸化，而較短的發(fā)夾狀Dbaitl6H誘導(dǎo)溫和的磷酸化。最短的Dbait8H和單鏈Dbaut32ss分子都不能在p53蛋白的15位絲氨酸上誘導(dǎo)顯著的磷酸化。該實驗提供了額外的證據(jù)，證明了GMA32細(xì)胞中雙鏈Dbait32和發(fā)夾狀Dbait32H的存在被檢測為DNA損傷，并可能通過ATM活化途徑誘導(dǎo)了對傳感器應(yīng)答的信號例如p53蛋白的磷酸化。對于Western印跡分析來說，將細(xì)胞在Laemmli緩沖液中裂解。將等量的裂解物在12%聚丙烯酰胺凝膠上分離。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶阻斷(1小時)，然后與在含有5%脫脂奶的TBST緩沖液(10mMTris-HClpH7.5，150mMNaCl，0.1%Tween20)中稀釋500倍的抗p53Serl5抗體(9284,CellSignaling)溫育過夜。然后將印跡與在TBST中稀釋5000倍的辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔IgG第二抗體(P0448,Dako)溫育。蛋白-抗體復(fù)合物通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(RPN2106ECL，Amersham)檢測。Dbait分子在GMA32細(xì)胞中的放射致敏和化學(xué)致敏效應(yīng)通過克隆形成(克隆存活)分析來評估。對于克隆形成分析來說，在對細(xì)胞計數(shù)后制備連續(xù)的稀釋液，用于以不同的細(xì)胞量接種5cm皮氏培養(yǎng)皿。細(xì)胞數(shù)量的范圍從100-200(對照細(xì)胞)到3000(轉(zhuǎn)染的或/和處理過的細(xì)胞)。IO天后，將細(xì)胞(形成克隆)用4%聚甲醛固定(20分鐘)，然后用亞甲基藍(lán)染色(15分鐘)，對每個平板(三份平行樣)中的克隆數(shù)量進(jìn)行計數(shù)。圖3.4顯示出在用雙鏈Dbait32或發(fā)夾狀Dbait32H分子轉(zhuǎn)染的GMA32細(xì)胞中觀察到了對4Gy輻射的輻射致敏。此外，對于用雙鏈Dbait32或發(fā)夾狀Dbait32H分子轉(zhuǎn)染的GMA32細(xì)胞來說，當(dāng)它們被有絲分裂抑制劑(200nM諾考達(dá)唑、100nM諾維本(長春瑞濱)或200nM紫杉醇(太平洋紫杉醇))處理時，也觀察到了化學(xué)致敏。這些藥物已知能夠作為微管聚合或解聚的潛在抑制劑。Dbait32和Dait32H能夠增加這些有絲分裂抑制劑的細(xì)胞毒性活性。實施例5:對裸鼠上異體移植的人類腫瘤的處理的放射致敏作用使用通過皮下注射放射抗性細(xì)胞系(源自于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌HNSCC的Hep2))或腫瘤片段(以前通過皮下注射源自于成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的U87細(xì)胞獲得的)獲得的異體移植人類腫瘤的裸鼠，評估了與放射療法結(jié)合的Dbait分子的體內(nèi)活性。研究主要在用放射性抗性人類HNSCC腫瘤異體移植的小鼠上進(jìn)行，以建立體內(nèi)概念的證據(jù)。輻射使用來自^Cs源的y-射線進(jìn)行，對小鼠進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)，以進(jìn)行腫瘤的定位輻射。典型的分析條件由在輻射前5小時，在腫瘤內(nèi)注射1nmoleDbait分子與轉(zhuǎn)染試劑(陽離子樹枝狀聚合物(dendrimer)(Superefct,Qiagene)，雙十八垸基酰氨基甘氨?；?精胺(DOGS，PolyplusTransfection)，聚乙烯亞胺(PEI,PolyplusTransfection))按照制造商的說明書制備的適合的制備物組成。在5周內(nèi)遞送了30Gy的總劑量i)3x2Gy/周(大約每兩天一次)；ii)5Gy/周；iii)15Gy/2周。腫瘤的大小每周測量2-3次。用輻射和腫瘤內(nèi)注射MEM培養(yǎng)基(Dbait稀釋緩沖液)進(jìn)行的處理，被用作不使用Dbait的輻射處理的對照。計算腫瘤的體積(V=2xaxb2，其中3=長度，b:寬度)。在t時測量的體積與起始體積的比率(Vt/Vi)被用作腫瘤進(jìn)程的指示。對小鼠跟蹤最多達(dá)到100天。試驗了至少4個獨立的動物組每組6只動物。結(jié)果顯示在圖4.1中(圖A:未處理的小組(n=38);圖B:使用20)il培養(yǎng)基(MEM)+3x2Gy/周輻射的對照小組(n=30);圖C:使用1nmole(20(ig)Dbait32H+3x2Gy/周輻射的小組(n=35)。MEM或Dbait32H在輻射前5小時通過腫瘤內(nèi)注射來遞送。每兩天遞送一次分步輻射劑量(2Gy)，一周三次。處理持續(xù)5周，總共30Gy輻射。點表示每只小鼠的腫瘤體積的時間過程。實線是最佳的多項式擬合。圖D顯示了所有腫瘤體積的增加(Vt/V》小于5的小鼠的Kaplan-Meyer作圖。在使用Dbait32H和3x2Gy/周輻射的小組上己經(jīng)積累了顯著量的數(shù)據(jù)(圖C，n=35)，與對照小組未處理的(圖A，n=38)，MEM+3x2Gy(圖B，n=30)相比，它們清楚地顯示出了放射性致敏作用。Man和Whitney統(tǒng)計學(xué)檢驗給出了Dbait32H+3x2Gy對MEM+3x2Gy小組的p-值=0.00067。在腫瘤體積小于初始體積的5倍(Vt/V,<5)的小鼠的Kaplan-Meyer作圖中觀察到了同樣的趨勢(圖D)。隨后對異體移植了人類HNSCC、U87、LU1205禾nSK28腫瘤的小鼠進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，以確定Dait分子的分子特征和體內(nèi)活性的最適方案。從被研究的群體獲得的數(shù)據(jù)與在生物化學(xué)和體外研究(參見實施例2、3和4)中觀察到的Dbait分子的分子特征相一致。此外，它顯示出放射性致敏作用依賴于Dbait32H的腫瘤內(nèi)注射和離子化輻射之間的停留時間5小時》1小時。在異體移植了人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤腫瘤的小鼠中也觀察到了放射性致敏作用。成膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最高等級的腦腫瘤，其特征為它的具有快速致死結(jié)果的具有異常侵襲性的發(fā)展，以及對放療和化療的抗性。首先將2-3百萬個源自于人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的U87細(xì)胞皮下注射到裸鼠中。然后取出植入的腫瘤，用于隨后通過皮下移植大約8mmS成膠質(zhì)細(xì)胞瘤腫瘤來接種其它的裸鼠。表3.1顯示了一組實驗性的裸鼠上異體移植的人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤腫瘤的數(shù)據(jù)。在接受了腫瘤內(nèi)注射Dbait32H(lnmole)和輻射(lx15Gy/周或3x5Gy/周，隨后休息一周，然后進(jìn)行第二輪處理，離子化輻射的總劑量為30Gy)的小組中，50%的小鼠在處理開始后25天時具有小于4cn^的腫瘤體積，而在對照小組中(未處理的，或輻射和用鹽溶液(PBS)注射的)，100%的小鼠具有超過4cmS的腫瘤體積，并在分析結(jié)束前按照現(xiàn)有的動物倫理學(xué)法規(guī)在處理結(jié)束前處死。分析組(異體移值的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)在25天時腫瘤體積〈4cm3的小鼠的數(shù)量的(每組6只小鼠)未處理的PBS+lxl5Gy/周Dbait32H+lx15Gy/周PBS+3x5Gy/周Dbait32H+3x5Gy/周0/60/63/60/63/6表3.1:Dbait32H(1nmole/腫瘤內(nèi)注射)對裸鼠上異體移植的人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的放射性致敏的分析。使用了兩種輻射方案(腫瘤內(nèi)注射后5小時)lxl5Gy/周，或3x5Gy/周，然后休息一周，進(jìn)行第二輪處理?？偟妮椛鋭┝渴?0Gy。對照組是未處理的或接受了鹽溶液(PBS)注射的組。根據(jù)這些為Dbait分子可以有效增加放射療法的效率提供證據(jù)的鼓勵性的體內(nèi)數(shù)據(jù)，設(shè)計并進(jìn)行了進(jìn)一步的實驗，以提供與使用Dbait分子作為輔助試劑增加放射療法的敏感性相關(guān)的附加的數(shù)據(jù)，從而強(qiáng)化DNA誘餌方法在抗癌癥療法中的原理的證據(jù)。圖4.2顯示了裸鼠中Hep2(HNSCC細(xì)胞系)異體移植的腫瘤中花青素3標(biāo)記的Dbait32H的分布。將用Superfect(轉(zhuǎn)染試劑)配制的20(igDbait32H-Cy3注射到1.5cm3Hep2腫瘤中。在注射后6小時將小鼠處死。取出腫瘤，冷凍切片，用于不用固定的分析。DAPI用于核染色?；ㄇ嗨?的熒光顯示出Dbait32H-Cy3分子從血液毛細(xì)管分布到腫瘤組織中，并被定位于細(xì)胞核中。圖4.3顯示了在圖4.1中描述的Hep2異體移植腫瘤的另一個實驗。在四組(每組10只動物)進(jìn)行了不同處理的動物中(未處理，只用Dbait32H處理，只用輻射處理，以及Dbait32H和輻射的組合)，在處理過程中和處理后監(jiān)測腫瘤的生長。對于每只動物標(biāo)出了每個腫瘤的生長。處理方案與圖4.1中描述的相同。當(dāng)Hep2腫瘤的體積達(dá)到150-200mm3時開始實驗。對于每個處理時期，將按照制造商的說明書用聚乙烯亞胺(PEI,PolyplusTransfection，Strasbourg,France)配制的20^gDbait32H在2Gy輻射之前5小時注射到腫瘤中。在使用了Dbait32H和輻射的組合的組中，與用輻射或Dbait32H單獨處理的組相比，腫瘤的生長明顯減小了。圖4.4顯示了皮下異體移植了Hep2腫瘤的裸鼠的存活率的Kaplan-Meier表示。出于倫理學(xué)原因，當(dāng)動物的腫瘤達(dá)到2cm3時將動物處死。該終點在存活率分析中被用作死亡。處理方案描述在圖4.3中。5個組包括未處理的，模擬轉(zhuǎn)染和輻射的，通過組合的輻射和增加量的Dbait32H(20、60禾P120lig/期)處理的。每組動物的數(shù)量在表3.2中標(biāo)出。在用Dbait32H和2Gy輻射處理的組中觀察到了明顯的劑量依賴性效應(yīng)。在處理開始后15天，處理結(jié)束時(35天)和處理結(jié)束后13天(35+13天)，獲得了各個組(未處理的，用20和60嗎Dbait32H/期以及2Gy輻射處理的)的代表性的腫瘤照片。圖4.5顯示了在處理中期(7期處理)異體移植的Hep2腫瘤的組織學(xué)分析。腫瘤在圖4.3標(biāo)明的各種不同處理方案開始后20天取出。將它們固定在福爾馬林中，將組織切片用蘇木精、曙紅和番紅花色素染色。對于每種處理方案通過顯微鏡分析兩個腫瘤。在用Dbait32H和輻射組合處理的腫瘤中，與只用輻射處理的腫瘤相比，觀察到了壞死和凋亡的增加。圖4.6顯示了在處理中期(7期處理)時異體移植的Hep2腫瘤的NMR成像。顯示了未處理的腫瘤、用輻射處理的腫瘤和用Dbait32H(20pg/期)和輻射(2Gy/期)的組合處理的腫瘤的三個代表性的橫截面照片。在用Dbait32H和輻射處理的腫瘤中，與只用輻射處理的腫瘤相比，壞死區(qū)域更為重要。這與腫瘤的細(xì)胞學(xué)分析(參考圖4.5)相一致。圖4.7顯示了用Hep2、U87、LU1205和SK28腫瘤皮下異體移植的裸鼠以及它們的對照組(未處理的，只用輻射處理的)的存活率的Kaplan-Meier表示圖。Hep2的方案描述在圖4.3中。其它的腫瘤通過修改的方案處理，其中在連續(xù)的三天中施用了5Gy分步輻射，然后休息4天，然后將處理重復(fù)一次?？偟妮椛鋭┝?6x5Gy)與用于處理Hep2腫瘤的方案的劑量(15x2Gy)相等。在所有四種異體移植的人類腫瘤中觀察到了Dbaut32H和輻射的組合的有益的結(jié)果。由于Dbait分子的隱含作用機(jī)制以及在所有細(xì)胞中普遍的NHEJ途徑，預(yù)計對于具有不同組織學(xué)的其它腫瘤來說也將是這樣。對于每種處理和每個腫瘤類型進(jìn)行了腫瘤應(yīng)答的描述性分析。第1天是第一次處理時期的日期。所有的動物都被跟蹤至少150天，直到它們由于倫理學(xué)原因被處死。按照Kaplan-Meier方法估計中值壽命。通過從每個處理的組中的每只小鼠的腫瘤體積增加四倍所需的時間中減去對照組的腫瘤體積增加四倍所需的平均時間，計算出TGD。對于每個處理組，使用個體的測量值計算出平均TGD。通過Kaplan-Meier評算來評估總的存活曲線，并使用非參數(shù)LogRank檢驗進(jìn)行比較，因為數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布。分析使用了S-Plus6.2版軟件(MathSoftInc.,Seattle,WA)和statEL(adScience,Paris,France)。首先對具有同樣腫瘤類型的每個組進(jìn)行全面LogRank。然后將Dbait處理與模擬處理的對照進(jìn)行比較。動物的數(shù)量(n)、相對風(fēng)險(RR)和P值被報告在表3.2中。所有的檢驗在顯著性水平為0.05時被認(rèn)為是顯著的。表3.2總結(jié)了一部分上面描述的數(shù)據(jù)，并提供了在裸鼠中皮下異體移植的三種人類腫瘤細(xì)胞系中，通過不同方案(各種Dbait32分子+輻射與輻射+模擬注射)處理的異體移植動物的存活率的比較。此外，它顯示出Dbait分子的序列是不重要的，這由Dbait32Hc與Dbait32H相比相似的結(jié)果所證實。還顯示出單鏈Dbaut32ss即使是在高劑量下也是無活性的。應(yīng)該指出，在Dbait32Hc的序列中不含有CpG，以避免由于眾所周知的Toll樣受體介導(dǎo)的免疫刺激作用所引起的免疫反應(yīng)的影響?？傊闶笊袭愺w移植細(xì)胞系輯射DbaitDbait濃度Hep2H印2H印2Hep2Hep2Hep2H印2Hep2Hep2Hep215x2Gy15x2Gy15x2Gy15x2Gy15x2Gy15x2Gy15x2Gy32H32ssMock32H32Hc32H32Hc32H32ssl_ULU6x5GyMock6x5Gy32Hc15x20pg(1nmole)15x120|jg(12nmole)15x20pg(1nmole)15x20(jg(1nmole)15x60(jg(3nmole)15x60(jg(3nmole)15x120|jg(6nmole)15x120pg(12nmole)6x60pg(3nmole)SK---SK6x5GyMock-SK6x5Gy32H6x60(jg(3nmole)SK6x5Gy32Hc6x60(jg(3nmole)SK6x5G8H6x60pg(3nmole)治愈的小小鼠數(shù)置鼠的數(shù)量***(p值)平均TGD"STDTGD~范圍TGD"平均%TGDc0.62(p<0.24)0.71(p<0.29)C*0.42(p<9.55.10-3)0.55(p<0.14)0.28(p<4.16.10-4)0.36(p<1.2.10-3)0.18(|)<4.10-0.57(p<0.15)1249>56>83>59>91293.86.74.914.226.641.150.740.744.419.8-5;12-3;170;19-3;458;1346;139-3;1390;1391;1393;59100168156217561629880652952374CC*0.45(p<1.03.10'2)0>22272.829.213.8-4;4-7;140-7;5810034840049554661939412912315080213017154C08.2-19:1410086C*1719.5-3;831871760.226444.9-3;156422(p<1.27.10-4)1350.293226.9-8;100261(p<1.8910—3)760.68(p<0.46)1910.90;40194存間-值時天中活，1o22111o321222141o260017o2Qo2112oo45的人類放射性抗性腫瘤(Hep2、U87和SK28)和放射性敏感腫瘤(LU1205)的腫瘤生長的明顯減小，提供了證據(jù)，表明Dbait分子能夠有效增加這些放射療法對侵襲性腫瘤效應(yīng)的敏感性。因此，在體內(nèi)獲得了DNA誘餌方法的概念的證據(jù)。實施例6:在K-RasV^xApc"，轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)的消化道腫瘤的處理的化學(xué)致敏作用選擇了內(nèi)源小鼠腫瘤模型來評估Dbait分子增加抗癌癥化學(xué)療法敏感性的能力。為此，使用了帶有K-RasV^和Apc"，突變的轉(zhuǎn)基因小鼠。它們是通過將兩種轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交來獲得的一種帶有在小鼠villin啟動子控制下的K-Ras^2G突變(pVill/K-Rasvl2G)(Janssen等，2002)，另一種在一個等位基因上含有Apc^^突變(Fodde等，1994)。具有pVill/K-RasV^xApc"，突變的轉(zhuǎn)基因小鼠在大約5月齡時在消化道中發(fā)展出自發(fā)性腫瘤，并很快死亡。它們在平均12周齡時，按照圖5.1圖A中顯示的方案，用化療(5FU+CPT11)和Dbait32H的組合與單獨的化療進(jìn)行處理。方案包含了三輪循環(huán)。每輪由腹膜內(nèi)注射0.6mg5FU禾P0.6mgCPTll，同時口服施用0.1mgDbait32H組成，每周3次，然后休息一周。將5FU(5-氟尿嘧啶，Teva)在0.9%NaCl溶液中制備成濃度為50mg/ml。將CPTll/伊立替康(Campto,Aventis)在0.9。/。NaCl溶液中制備成濃度為20mg/ml。監(jiān)測小鼠的健康狀態(tài)和存活，直到死亡。沒有觀察到由Dbait分子引起的附加毒性效應(yīng)的臨床適應(yīng)癥。結(jié)果顯示在圖5.1中。圖A:用于3組/小組平均為12周齡的K-Rasvl2GxApc"皿轉(zhuǎn)基因小鼠的處理方案對照組(未處理)，用5FU+CPT11處理的組，用5FU+CPT11和Dbait32H處理的組。進(jìn)行了三輪的處理。每輪由腹膜內(nèi)注射0.6mg5FU和0.6mgCPT11，以及口服O.lmgDbait32H組成，一周三次，然后休息一周。每組中涉及的小鼠的數(shù)量標(biāo)在括號中。終點是存活時間；圖B:三個組的存活曲線的Kaplan-Meyer作圖；圖C:圖B中顯示的三個組的中值存活時間。盡管群體較小，但在接受了化療(5FU+11CPT)禾nDbait32H的組合的小組中(中值存活時間=226天，？-值=0.2)，與單獨化療(173天)和對照小組(175天)相比，觀察到了存活時間的增加(圖B和C)。其它增加5FU+CPTll+Dbait32H和5FU+CPT11小組的群體的分析目前正在進(jìn)行中，以增加統(tǒng)計學(xué)顯著性。在處理結(jié)束后兩周(平均為18周齡)，將一系列小鼠處死，以評估每只動物的腫瘤的平均數(shù)量。通過放大鏡和組織學(xué)檢查(用蘇木精-曙紅-番紅花色素進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)染色)來檢査腸。結(jié)果給出在圖5.2中。每組中的動物數(shù)量標(biāo)在括號中。所有的小鼠在圖5.1的圖A中顯示的方案后兩周(第18周)被處死。對照小組(未處理的組，n=101)的平均數(shù)量是30.8/動物。兩種檢査一致顯示出，在接受了5FU+CPT11和Dbait32H的組合的小組中(n=8)，與只接受化療的小組(n=7)相比，腫瘤數(shù)量明顯減少了(>30%)(圖5.2)。值得注意的是，對照小組(未處理的組，n=101)的平均數(shù)量是30.8/動物。使用免疫熒光染色方法，分析了從用熒光素標(biāo)記的Dbait分子(Dbait32H-FITC)和5FU+CPT11處理的動物中制備的腫瘤樣品。Y-H2AX標(biāo)記的位點用熒光素Dbait分子共染色，參見體外發(fā)現(xiàn)(參考實施例3.3和4)。圖5.3顯示了附加的分析，其中將18周齡的K-Rasvl2GxApc"3^轉(zhuǎn)基因小鼠用化療(5FU+CPT11)和Dbait32H-FITC連續(xù)處理3天，再按照圖A中指示的最后一次處理后2小時處死小鼠。取出腸并用PBS清洗。然后對腫瘤組織取樣并冷凍在-80。C。對于該分析來說，從冷凍的腫瘤組織通過低溫恒溫器制備5pm的組織學(xué)樣品。使用在PBS中稀釋500倍的兔抗Y-H2AX多克隆抗體(Trevigen)，然后用在PBS中稀釋200倍的花青素3標(biāo)記的山羊抗兔抗體(Jackson)通過免疫熒光檢測DNA修復(fù)位點。樣品也用DAPI復(fù)染。通過落射熒光顯微鏡觀察樣品。發(fā)現(xiàn)了Dbait32H-FITC的熒光在腫瘤組織中是非均質(zhì)散布的(腺體結(jié)構(gòu)之間的上皮和基質(zhì))，并具有優(yōu)選的核定位(圖5.3，圖B，左邊)。對于，H2AX位點發(fā)現(xiàn)了同樣的樣式(圖5.3，圖B,右邊)。幾乎總是觀察到共定位的Dbait32H-FITC和，H2AX信號。總之，存活的改善和每只動物的腫瘤數(shù)量的減少，一致地顯示了在帶有K-Rasvl2QxApc1638N突變的轉(zhuǎn)基因小鼠中用Dbait分子(Dbait32H)處理消化道腫瘤的化學(xué)致敏作用的證據(jù)。在處理過的動物中對腫瘤組織的深入分析，為Dbait分子干擾DNA修復(fù)過程提供了證據(jù)。應(yīng)該指出，在本研究中Dbait32H分子的口服施用不包含任何轉(zhuǎn)染試劑?？偟膩碚f，生物化學(xué)和體外數(shù)據(jù)與Dbait分子通過干擾經(jīng)NHEJ途徑的DSB修復(fù)的作用機(jī)制，以及由直接或間接的DNA損傷(離子化輻射或化學(xué)治療試劑)引起的修復(fù)信號傳導(dǎo)途徑明顯相一致。由于不依賴于序列的NHEJ途徑(Jackson，2002;Barnes,2001;Downs&Jackon,2004)的性質(zhì)，對于超出最小長度(大約32-bp)之外的Dbait分子的序列和長度沒有限制。體內(nèi)研究已經(jīng)證實了Dbait分子對小鼠中腫瘤的有效的放射性和化學(xué)致敏作用。合起來看，所有數(shù)據(jù)都一致地為DNA誘佴方法的概念提供了證據(jù)，表征了Dbait分子的分子特性。參考文獻(xiàn)Barnes,D.E.Non-homologousendjoiningasamechanismofDNArepair.(非同源性末端連接作為DNA修復(fù)的機(jī)制)Curr.Biol.(2001)11，R455-7.BelenkovAI,PaiementJP,PanasciLC,MoniaBP,ChowTY.AnantisenseoligonucleotidetargetedtohumanKu80messengerRNAsensitizesM059Kmalignantgliomacellstoionizingradiation,bleomycin,andetoposidebutnotDNAcross-linkingagents.(革巴向人類Ku80信使RNA的反義寡核苷酸使M059K惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對離子化輻射、博來霉素和依托泊苷致敏，但是對DNA交聯(lián)試劑沒有效果)CancerRes.(2002),62,5888-96.Bouton.,S.:Kyle.S.:Durkacz.B.W.Mechanismsofenhancementofcytotoxicityinetoposideandionisingradiation-treatedcellsbytheproteinkinaseinhibitorwortmannin.(在依托泊苷和離子化輻射處理的細(xì)胞中通過蛋白激酶抑制劑渥曼青霉素產(chǎn)生的細(xì)胞毒性的增加的機(jī)制)Eur.JCancer(2000),36,535-41.Cantor,C.R.;Warshaw,M.M.;Shapiro,H.Oligonucleotideinteractions.III.Conformationaldifferencesbetweendeoxy-andribodinucleosidephosphates(寡核苷酸相互作用III.磷酸脫氧核糖核苷和磷酸核糖核苷之間的構(gòu)象差異)Biopolymers(1970),9，1059-T7.Cary,R.B.;Peterson,S.R.;Wang,J.T.;Bear,D.G.;Bradbury,E.M.&Chen,D.J.DNAloopingbyKuandtheDNA國dependentproteinkinase.(Ku和DNA依賴性蛋白激酶引起的DNA環(huán)化)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94,4267-4272.Downs,J.A.;Jackson,S.PAmeanstoaDNAend:ThemanyrolesofKu.(對DNA末端的作用Ku的多種角色)Nat,Rev.Mol.Cell.Biol.(2004)，5,367-78.Durant,S.;Karran，P.Vanillins—anovelfamilyofDNA-PKinhibitors.(香蘭素——一個新的DNA-PK抑制劑家族)NucleicAcidsRes.(2003),31,5501-12.Fodde,R.;Edelmann,W.;Yang,K.;vanLeeuwen,C.;Carlson,C.;Renault,B.;Breukel，C.;Alt,E.;Lipkin,M.;Khan，P.M.Atargetedchain-terminationmutationinthemouseApegeneresultsinmultipleintestinaltumors.(小鼠Ape基因中的靶向鏈終止突變導(dǎo)致了多發(fā)性腸月中瘤)ProcNatlAcadSciUSA.(1994),91,8969-73.Jackson,S.P.SensingandrepairingDNAdouble-strandbreaks.(感應(yīng)和修復(fù)DNA雙鏈斷裂)Carcinogenesis.(2002)，23,687-96.Janssen,K.P.;el-Marjou,F.;Pinto，D.;Sastre,X.;Rouillard,D.;Fouquet,C.;Soussi，T.;Louvard，D.;Robine,S.TargetedexpressionofoncogenicK-rasinintestinalepitheliumcausesspontaneoustumorigenesisinmice.(癌基因K-ras在腸上皮細(xì)胞中的靶向表達(dá)在小鼠中引起了自發(fā)性腫瘤發(fā)生)Gastroenterology(2002),123,492-504.Kim,C.H.;Park,S.J.;Lee,S.H.;AtargetedinhibitionofDNA-dependentproteinkinasesensitizesbreastcancercellsfollowingionizingradiation.(DNA依賴性蛋白激酶的靶向抑制使離子化輻射后乳腺癌細(xì)胞的敏感性增加)J;Pharmacol.Exp.Ther.(2002)，303,753-9.Lee,H.;Sun,D.;Laraer,J.M.;Wu,F.S.Thetumorsuppressorp53canreducestabletransfectioninthepresenceofirradiation.(月中瘤抑制子p53在存在輻射的情況下可以減少穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)JBiomed.Sci.(1999)，6,285-92.Li,S.;Takeda,Y.;Wragg，S.;Barrett,J.;Phillips,A.;Dy腿，W.S.ModificationoftheionizingradiationresponseinlivingcellsbyanscFvagainsttheDNA-dependentproteinkinase.(針對DNA依賴性蛋白激酶的scFv引起的活細(xì)胞中離子化輻射應(yīng)答的改變)NucleicAcidRes.(2003)31,5848-57.Li,G.C.;He，F(xiàn).;Shao,X.;Urano,M.;Shen,L;Kim，D.;Borrelli,M.;Leibel,S.A.;Gutin,P.H.;Ling，C.C.Adenovirus國mediatedheat-activatedantisenseKu70expressionradiosensitizestumorcellsinvitroandinvivo.(腺病毒介導(dǎo)的熱激活反義Ku表達(dá)在體外和體內(nèi)使腫瘤細(xì)胞放射致敏)CancerRes.(2003b)，63,3268-74.Maacke,H.;Jost,K.;Opitz,S.;Miska,S.;Yuan,Y.;Hasselbach,L.;Luttges,J.;Kalthoff,H.;Sturzbecher,H.W.DNArepairandrecombinationfactorRad51isover-expressedinhumanpancreaticadenocarcinoma.(在人類胰腺腺癌中DNA修復(fù)和重組因子Rad51被過量表達(dá))Oncogene(2000).19,2791-5.Mallya,S.M.;Sikpi,M.O.Evidenceoftheinvolvementofp53ingamma-radiation-inducedDNArepairinhumanlymphoblasts.(在人類成淋巴細(xì)胞中p53參與"輻射誘導(dǎo)的DNA修復(fù)的證據(jù))vint.JRadiat.Biol,(1998),74,231-8.Marangoni,E.;Bay,J.O.;Verrelle,P.;Bourhis,J.Tranfertdegenepourmodifierlar6ponse&laradiotherapieCancerRadiother.(2000),4,175-80.Marangoni,E.;Foray,N.;O'Driscoll,M.;Douc-Rasy,S.;Bernier,J.;Bourhis,J.;Jeggo，P.AKu80fragmentwithdominantnegativeactivityimpartsaradiosensitivephenotypetoCHO-Klcells.(活性顯性失活的Ku80片段賦予了CHO-Kl細(xì)胞以放射性敏感的表現(xiàn)型)NucleicAcidRes.(2000a)，28,4778-82.Marangoni,E.;LeRomancer,M.;Foray,N,;Muller,C.;Douc陽Rasy,S.;Vaganay,S.;Abdulkarim,B.;Barrois,M.;Calsou，P.;Bernier,J.;Salles,B.;BourhisJ.TransferofKu80RNAantisensedecreasestheradioresistanceofhumanfibroblasts.(轉(zhuǎn)化Ku80RNA反義降低了人類成纖維細(xì)胞的放射性抗性)CancerGeneTher.(2000b),7,339-46.Martensson,S.;Hammarsten,O.DNA-dependentproteinkinasecatalyticsubunit:structuralrequirementsforkinaseactivitybyDNAends.(DNA依賴性蛋白激酶催化亞基激酶活性對DNA末端的結(jié)構(gòu)要求)JBiol.Che77i.(2002),277,3020-29.Mimori，T.;Hardin,J.A.MechanismofinteractionbetweenKuproteinandDNA.(Ku蛋白和DNA之間的相互作用機(jī)制)JBiol.Chem.(1986),261,10375-10379.Nimura,Y.;Ismail,S.M.;Kurimas,A.;Chen,D.J.;Stevens,C.W.DNA-PKandATMarerequiredforradiation-enhancedintegration.(DNA-PK禾PATM為輻射增強(qiáng)的整合所需)RadiatRes.(2002),157,562-7.O'Driscoll,M.;Jeggo,P.ImmunologicaldisordersandDNArepair.(免疫疾病與DNA修復(fù))MutatRes.(2002),509,109-26.Ohnishi,T.;Taki,T.;Hiraga，S.;Arita,N.;Morita,T.InvitroandinvivopotentiationofradiosensitivityofmalignantgliomasbyantisenseinhibitionoftheRAD51gene.(RAD51基因的反義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癌。26.權(quán)利要求20到25任一項的應(yīng)用，其中的分子通過口服途徑，或通過靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)或皮下注射，或通過顱內(nèi)或動脈內(nèi)注射或灌注施用，或用于局部施用。全文摘要本發(fā)明涉及用于干擾雙鏈斷裂(DSBs)的DNA修復(fù)的組合物和方法。本發(fā)明公開了新的雙鏈核酸分子，其用作誘餌并劫持負(fù)責(zé)DNADSB感應(yīng)、信號傳導(dǎo)和/或修復(fù)途徑，特別是DSB修復(fù)的非同源性末端連接(NHEJ)途徑的酶的全復(fù)合物。本發(fā)明公開了這些分子作為佐劑組合物，與可藥用載體組合，與DNA斷裂性治療特別是放射療法或化學(xué)療法結(jié)合使用，以有效量導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞的核中，以便暫時中和它們的DNA修復(fù)能力并觸發(fā)它們的死亡的應(yīng)用。文檔編號A61K38/00GK101528925SQ200780035205公開日2009年9月9日申請日期2007年9月20日優(yōu)先權(quán)日2006年9月21日發(fā)明者孫建生,馬里·迪特雷申請人:法國居里學(xué)院;法國國家科學(xué)研究中心;國家自然博物館;法國國家衛(wèi)生及研究醫(yī)學(xué)協(xié)會