專利名稱：：使用親和色譜法純化蛋白質的精氨酸洗滌液的制作方法
技術領域：
：本申請案涉及蛋白質純化。具體來說，本申請案涉及純化與介質結合的蛋白質的方法，所述方法是利用使至少一種含有精氨酸或精氨酸衍生物的洗滌液通過所述介質，且收集經(jīng)純化的蛋白質。
背景技術：
：隨著重組蛋白技術的出現(xiàn)，所關注蛋白質可使用工程改造成表達所述蛋白質的經(jīng)培養(yǎng)的真核或原核宿主細胞系來產(chǎn)生。所需重組蛋白于醫(yī)藥應用的用途通常取決于能夠可靠地從雜質(諸如宿主細胞蛋白、蛋白質變異體和來自培養(yǎng)基的化合物)中回收足夠含量的蛋白質。常規(guī)蛋白質純化方法被設計成是基于尺寸、電荷、溶解度和疏水性程度的差異來從雜質中分離所關注蛋白質。所述方法包括色譜法，諸如親和色譜法、離子交換色譜法、尺寸排阻色譜法、疏水性相互作用色譜法、固定金屬親和色譜法和羥基磷灰石色譜法。這些方法常常利用可設計成選擇性粘附所關注蛋白質或雜質的分離介質。在結合-洗脫模式(bind-elutemode)中，所需蛋白質與分離介質選擇性結合且通過不同溶劑從介質分別洗脫。在導流模式(flow-throughmode)中，雜質與分離介質特異性結合，而所關注蛋白質并不結合，由此可回收"導流"中的所需蛋白質。當前純化蛋白質(諸如抗體)的方法包括兩個或兩個以上色譜步驟。舉例來說，所述蛋白質純化方案中的第一步可包括利用所關注蛋白質與固定捕獲劑之間的特異性相互作用的親和色譜法步驟。蛋白A吸附劑尤其適用于蛋白質(諸如含有Fc區(qū)的抗體)的親和捕獲。然而，使用蛋白A色譜法進行蛋白質純化存在諸多缺點。在一些情況下，蛋白A捕獲劑的滲漏導致經(jīng)洗脫的蛋白質產(chǎn)物受污染，而在其它情況下，親和捕獲并不從所關注蛋白質中分離蛋白質變異體(諸如蛋白質的聚集形式)。另外，在中和pH值后，蛋白A洗脫匯集物中會形成不同程度的混濁度和/或沉淀。這一混濁度和/或沉淀會導致經(jīng)中和的蛋白A洗脫匯集物中產(chǎn)物大量損失。因此，需要減少產(chǎn)物損失且提高洗脫匯集物中的產(chǎn)物純度的純化方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明部分涉及從含有產(chǎn)物(諸如抗體)和一或多種雜質的負載流體中分離產(chǎn)物的方法，所述方法是利用使所述負載流體通過結合所述產(chǎn)物的介質，接著使至少一種含有精氨酸或精氨酸衍生物的洗滌液通過所述介質，且使用洗脫液收集所述產(chǎn)物。一方面，提供一種分離產(chǎn)物的方法。所述方法包含提供包含產(chǎn)物和一或多種雜質的負載流體和使所述負載流體與可在適合于結合所述產(chǎn)物的條件下結合產(chǎn)物的介質接觸，由此獲得經(jīng)結合的介質。所述方法進一步包含使所述經(jīng)結合的介質與一或多種包含精氨酸或精氨酸衍生物的洗滌液接觸，由此獲得經(jīng)洗滌的介質。所述方法進一步包含在適合于洗脫產(chǎn)物的條件下使所述經(jīng)洗滌的介質與洗脫液接觸。接著可收集包含產(chǎn)物的洗脫物。也可將產(chǎn)物進一步純化和/或調配以供治療使用。在此方面的一些實施例中，產(chǎn)物是蛋白質，例如治療性蛋白。在某些實施例中，產(chǎn)物是抗體。在特定實施例中，所述抗體是針對以下一種或針對以下一種而產(chǎn)生生長和分化因子-8(GrowthandDifferentiationFactor墨8，GDF-8)、白細胞介素-13(IL-13)、白細胞介素-22(IL-22)、A-(3、晚期糖基化終產(chǎn)物受體(ReceptorforAdvancedGlycationEndproduct,RAGE)和5T4。在一些實施例中，產(chǎn)物是抗原結合片段。在一些實施例中，產(chǎn)物是融合蛋白。在特定實施例中，產(chǎn)物是Ig-融合蛋白。在某些實施例中，產(chǎn)物是Fc-蛋白、免疫結合物、細胞因子、白細胞介素、激素或治療性酶。在此方面的一些實施例中，所述介質是基質、樹脂或色譜柱。在特定實施例中，介質是蛋白A色譜柱，例如重組蛋白A柱，或蛋白G色譜柱，例如重組蛋白G柱。在此方面的一些實施例中，所述洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約0.1M到約2.0M。在某些實施例中，洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約O.lM到約0.9M。在一實施例中，洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約1M。在某些其它實施例中，洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約1.1M到約2.0M。在其它實施例中，洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約0.5M到約1.0M。在其它實施例中，洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度大于約0.5M且小于約2.0M。在另一實施例中，洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度大于約0.5M且小于約1.0M。在特定實施例中，精氨酸衍生物為乙酰精氨酸、胍丁胺、羥基精氨酸(arginicacid)、N-a-丁?；?L-精氨酸或N-a-特戊?；彼?。在此方面的一些實施例中，洗滌液的pH值為約4.5到約8.0。在某些實施例中，洗滌液的pH值大于約4.5且小于約8.0。在一些實施例中，洗滌液的pH值為約7.5。在此方面的一些實施例中，洗脫液包含以下一種氯化鈉、精氨酸或精氨酸衍生物、甘氨酸、HEPES和乙酸。在某些實施例中，洗脫緩沖液具有約2.0到4.0的pH值。在一特定實施例中，洗脫緩沖液具有約3.0的pH值。在此方面的某些實施例中，雜質中的一或多者為宿主細胞蛋白、核酸、產(chǎn)物變異體、內(nèi)毒素、蛋白A、蛋白G、病毒或其片段、來自細胞培養(yǎng)基的成分或產(chǎn)物變異體，例如經(jīng)由二硫鍵鍵結的(underdisulfide-bonded)產(chǎn)物、低分子量產(chǎn)物、高分子量產(chǎn)物、截短產(chǎn)物和/或錯折疊產(chǎn)物。在至少一種雜質與產(chǎn)物結合的一些實施例中，使經(jīng)結合的介質與一或多種通過經(jīng)結合的介質的洗滌液接觸，由此去除至少一種與產(chǎn)物結合的雜質。在此方面的某些實施例中，洗脫物包含經(jīng)分離的產(chǎn)物且與洗漆液中使用小于約0.1M的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，所述經(jīng)分離的產(chǎn)物的純度增加。在一些實施例中，洗脫物包含經(jīng)分離的產(chǎn)物，且與洗滌液中不使用可檢測量的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，所述產(chǎn)物與至少一種雜質的比率增加。在某些實施例中，洗脫物包含產(chǎn)物，其中與洗滌液中使用小于約0.1M的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，所述產(chǎn)物與宿主細胞蛋白的比率增加。在其它實施例中，洗脫物包含產(chǎn)物，其中與洗滌液中不使用可檢測量的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，所述產(chǎn)物與宿主細胞蛋白的比率增加。在此方面的另一實施例中，與洗滌液中使用小于約0.1M的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，洗脫物的混濁度降低。在一些實施例中，與洗滌液中不使用可檢測量的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，洗脫物的混濁度降低。另一方面，提供一種分離抗體的方法。所述方法包含提供包含所述抗體和一或多種雜質的負載流體，和使所述負載流體與蛋白A介質或蛋白G介質接觸，其中所述介質可在適合于結合所述抗體的條件下結合抗體，由此得到經(jīng)結合的介質。方法進一步包含使所述經(jīng)結合的介質與一或多種洗滌液接觸，其中至少一種洗滌液包含濃度大于0.5M且小于約l.OM的精氨酸或精氨酸衍生物，由此提供經(jīng)洗滌的介質。方法進一步包含在適合于洗脫抗體的條件下使所述經(jīng)洗滌的介質與洗脫液接觸；和收集包含抗體的洗脫物。由于實施這種方法，因此與洗滌液中不使用可檢測量的精氨酸的相應方法中所回收的洗脫物相比，所述洗脫物中的抗體與宿主細胞蛋白的比率增加且洗脫物具有降低的混濁度。在此方面的一些實施例中，洗滌液的pH值大于約5.0且小于約8.0。另一方面，提供一種降低包含產(chǎn)物的洗脫物混濁度的方法。所述方法包含提供包含10所述產(chǎn)物和一或多種雜質的負載流體，和使所述負載流體與介質接觸，其中所述介質可在適合于結合產(chǎn)物的條件下結合產(chǎn)物，由此提供經(jīng)結合的介質。方法進一步包含使所述經(jīng)結合的介質與一或多種洗滌液接觸，其中至少一種洗滌液包含精氨酸或精氨酸衍生物，由此提供經(jīng)洗滌的介質。方法進一步包含在適合于洗脫產(chǎn)物的條件下使所述經(jīng)洗滌的介質與洗脫液接觸，由此產(chǎn)生包含產(chǎn)物的洗脫物，和中和所述洗脫物的pH值。方法提供與洗滌液中不使用可檢測到的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比混濁度降低的洗脫物。在此方面的一些實施例中，經(jīng)中和的洗脫物的pH值介于約6.5與約8.2之間。在某些實施例中，洗滌液包含濃度大于0.5M且小于約l.OM的精氨酸或精氨酸衍生物。在一些實施例中，洗滌液的pH值大于5.0且小于約8.0。在此方面的一些實施例中，方法并不包含陰離子上游吸附過濾。在某些實施例中，將洗脫物中的產(chǎn)物進一步純化和/或調配以供治療使用。另一方面，提供一種降低包含產(chǎn)物的洗脫物混濁度并減少雜質的方法。所述方法包含提供包含所述產(chǎn)物和一或多種雜質的負載流體，和使所述負載流體與介質接觸，其中所述介質可在適合于結合產(chǎn)物的條件下結合產(chǎn)物，由此提供經(jīng)結合的介質。方法進一步包含使所述經(jīng)結合的介質與一或多種洗滌液接觸，其中至少一種洗滌液包含精氨酸或精氨酸衍生物，由此提供經(jīng)洗滌的介質。方法進一步包含在適合于洗脫產(chǎn)物的條件下使所述經(jīng)洗滌的介質與洗脫液接觸，由此產(chǎn)生包含產(chǎn)物的洗脫物，和中和。方法提供洗脫物，其中與洗滌液中不使用可檢測到的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，所述洗脫物中的產(chǎn)物與至少一種雜質的比率增加且其中洗脫物具有降低的混濁度。在此方面的一些實施例中，經(jīng)中和的洗脫物的pH值介于約6.5與約8.2之間。在某些實施例中，洗滌液包含濃度大于0.5M且小于約l.OM的精氨酸或精氨酸衍生物。在一些實施例中，洗滌液的pH值大于5.0且小于約8.0。在此方面的一些實施例中，方法并不包含陰離子上游吸附過濾。在某些實施例中，將洗脫物中的產(chǎn)物進一步純化和/或調配以供治療使用。本發(fā)明還涉及如本文隨附的權利要求書中所述的各種方法和產(chǎn)物。除非另外規(guī)定，否則本文所使用的所有技術和科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的技術人員通常所理解相同的含義。盡管與本文所述的那些方法和材料類似或等效的方法和材料可用于本發(fā)明的實施或測試，但適合的方法和材料如下所述。所有公開案、專利申請案、專利和本文所提及的其它參考案都以全文引用的方式并入。另外，材料、方法和實例僅為說明性的且不希望有限制性。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將由實施方式、圖式和權利要求書而顯而易見。圖l是描繪在蛋白A柱步驟后測定GDF-8mAb-l的回收百分比(％)、混濁度、HCP("宿主細胞蛋白")和LRV("對數(shù)去除值")的實驗結果的柱狀圖。圖2是描繪在蛋白A柱步驟后測定GDF-8mAb-2的回收百分比(％)、混濁度、HCP和LRV的實驗結果的柱狀圖。圖3是描繪在蛋白A柱步驟后測定IL-13mAb-l的回收百分比(％)、混濁度、HCP和LRV的實驗結果的柱狀圖。圖4是描繪在蛋白A柱步驟后測定IL-22mAb的回收百分比(％)、混濁度、HCP和LRV的實驗結果的柱狀圖。圖5是描繪在蛋白A柱步驟后測定RAGEmAb的回收百分比(％)、混濁度、HCP和LRV的實驗結果的柱狀圖。圖6是描繪在蛋白A柱步驟后測定IL-13mAb-2混濁度的實驗結果的柱狀圖。具體實施例方式本發(fā)明提供使用包括精氨酸洗滌液或具有精氨酸衍生物的洗滌液的程序從含有一或多種雜質的負載流體中純化和回收產(chǎn)物的方法。本發(fā)明可應用于蛋白質的大規(guī)模制備以用于治療和/或診斷目的。A.定義為了使本發(fā)明可更易于理解，定義如本文中所使用的某些術語。其它定義在整個實施方式中闡述。術語"產(chǎn)物"是指由人類或由天然過程產(chǎn)生的分子。"產(chǎn)物"可包括(但不限于)蛋白質，例如治療性蛋白，包括Ig融合蛋白，包括含F(xiàn)c蛋白。其它蛋白質包括免疫結合物、細胞因子、白細胞介素、激素、治療性酶、病毒、治療性血清、毒素、抗毒素、疫苗、血液成分或衍生物或任何類似產(chǎn)物。所述蛋白質可為分泌性蛋白。蛋白質可例如為抗體、抗體的抗原結合片段、可溶性受體、受體融合物、細胞因子、生長因子、酶或凝血因子。如本文中所使用，術語"產(chǎn)物"和"所關注蛋白質"可互換使用。如本文中所使用，術語"蛋白質"是指一或多種可充當單元的多肽。如本文中所使用，術語"多肽"是指經(jīng)由肽鍵鍵聯(lián)在一起的氨基酸的序列鏈。治療性蛋白可例如為分泌性蛋白。治療性蛋白包括抗體、抗體的抗原結合片段、可溶性受體、受體融合物、細胞因子、生長因子、酶或凝血因子，其中一些在下文進行更詳細描述。以上蛋白質的列表在性質上僅為示范性的，且不希望為限制性敘述。所屬領12域的技術人員應理解根據(jù)本發(fā)明可使用任何蛋白質且將能夠按需要選擇待產(chǎn)生的特定蛋白質。如本文中所使用，術語"條件培養(yǎng)基"是指通過分離方法(諸如離心和/或微過濾)從已暴露于宿主細胞的細胞培養(yǎng)基中去除細胞和細胞碎片所產(chǎn)生的上清液，所述宿主細胞可分泌所關注的所需重組多肽。條件培養(yǎng)基可例如含有所分泌的重組多肽或所關注產(chǎn)物；所選營養(yǎng)物(例如維生素、氨基酸、輔因子和礦物質)；其它生長因子/補充劑，包括胰島素；和其它外源性或宿主細胞蛋白和雜質。術語條件培養(yǎng)基包括經(jīng)澄清的條件培養(yǎng)基、經(jīng)過濾的條件培養(yǎng)基和條件細胞培養(yǎng)基。術語"負載流體"是指含有待分離的產(chǎn)物和一或多種雜質的液體。在如下所述的本發(fā)明操作條件下使負載流體接觸介質(例如，穿過介質)。術語"雜質"是指存在于溶液(諸如負載流體)中的任何外來或不合需要的分子。雜質可為同時存在于待純化的所關注蛋白質的樣品中的不同于待純化的所關注蛋白質的生物大分子，諸如DNA、RNA或蛋白質。雜質包括例如不合需要的蛋白質變異體，諸如聚集蛋白質、錯折疊蛋白質、經(jīng)由二硫鍵鍵結的蛋白質、高分子量物質、低分子量物質和片段以及脫酰胺化物質；來自分泌待純化的蛋白質的宿主細胞的其它蛋白質；宿主細胞DNA;來自細胞培養(yǎng)基的成分；為用于親和色譜法的吸附劑的一部分、在先前純化步驟期間浸入樣品中的分子，例如蛋白A;內(nèi)毒素；核酸；病毒，或上述任一種的片段。術語"介質"是指可在大分子分離過程期間經(jīng)受與待分離產(chǎn)物的配體-生物大分子相互作用的親和基質或樹脂。所述介質可為(但不限于)蛋白A色譜柱或蛋白G色譜柱。術語"經(jīng)結合的介質"是指與待分離的產(chǎn)物結合且也與一或多種雜質結合的介質。經(jīng)結合的介質可利用在適合于結合產(chǎn)物的條件下使負載流體通過介質來形成。術語"經(jīng)洗滌的介質"是指以一或多種洗滌液洗滌的經(jīng)結合的介質，且至少一種洗滌液含有精氨酸或精氨酸衍生物。經(jīng)洗滌的介質可通過使經(jīng)結合的介質與一或多種洗滌液接觸來形成，且至少一種洗滌液含有精氨酸或精氨酸衍生物。在經(jīng)洗滌的介質中，待分離產(chǎn)物的純度通常相對于經(jīng)結合介質中的負載流體有所增加(即，產(chǎn)物與一或多種雜質的比率增加)。術語"結合-洗脫模式"是指一種產(chǎn)物制備技術，其中負載流體中所含的至少一種產(chǎn)物與介質(例如色譜樹脂)結合。術語"抗體"是指任何免疫球蛋白或其片段，且涵蓋包含抗原結合位點的任何多肽。本術語包括(但不限于)多克隆、單克隆、單特異性、多特異性、非特異性、人源化、人類、單鏈、嵌合、合成、重組、雜交、突變、移植和活體外產(chǎn)生的抗體?？贵w片段包括Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb，其可保留抗原結合功能。通常，所述片段包括抗原結合域。術語"IL-13"是指白細胞介素-13，包括IL-13的全長未加工前體形式，以及從翻譯后裂解得到的成熟形式。白細胞介素-13(IL-13)是一種由T淋巴細胞和肥大細胞分泌的先前表征的細胞因子(麥肯錫(McKenzie)等人(1993)美國國家科學院院刊(尸rac.胸/.Acad.Sc!'.C/SA)90:3735-39;博斯特(Bost)等人(1996)免疫學(/mm畫〖。gy)87:663-41)。本術語還指IL-13的維持至少一些與成熟IL-13相關的生物學活性的任何片段和變異體，包括己經(jīng)被修飾的序列。術語"IL-13"包括人類IL-13，以及源自脊椎動物物種的其它IL-13。數(shù)個待決申請案揭示了針對人類和猴IL-13的抗體、IL-13肽、載體和產(chǎn)生可用于本文所述的方法的這些的宿主細胞，例如美國申請公開案第2006/0063228A號和第2006/0073148號。所有這些公開案的內(nèi)容都以全文引用的方式并入本文中。IL-13與IL-4共有數(shù)種生物學活性。舉例來說，IL-4或IL-13均可引起B(yǎng)細胞中的IgE同型轉換(湯金森(Tomkinson)等人(2001)免疫學雜志(J./wmwoZ.)166:5792-5800)。另外，已在哮喘患者中報告細胞表面CD23和血清CD23(sCD23)的含量增加(桑切斯-格雷羅(Sanchez-Guererro)等人(1994)過敏49:587-92;蒂羅倫左(DiLo腿o)等人(1999)過敏與哮喘會刊(她rgyAw/ww尸rac.)20:119-25)。另外，IL-4或IL-13均可上調II型MHC和低親和力IgE受體(CD23)于B細胞和單核細胞上的表達，這導致抗原呈遞增強和巨噬細胞功能得到調節(jié)(湯金森(Tomkinson)等人，見上)。這些觀察結果說明IL-13在氣道嗜酸粒細胞增多(airwayeosinophilia)和氣道高反應性(airwayhyperresponsiveness，AHR)的發(fā)展中起重要作用(湯金森(Tomkinson)等人，見上；威爾斯-卡普(Wills-Karp)等人(1998)科學(Srie打ce)282:2258-61)。因此，抑制IL-13可適用于改善某些炎癥性和/或過敏性病狀的病理學，所述病狀包括(但不限于)呼吸病癥，例如哮喘;慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD);涉及氣道炎癥的其它病狀、嗜酸粒細胞增多、纖維化和過量粘液產(chǎn)生，例如囊腫性纖維化和肺纖維化；異位性病癥，例如異位性皮膚炎、蕁麻疹、濕疹、過敏性鼻炎；皮膚(例如異位性皮膚炎)、胃腸器官(例如炎癥性腸疾病(inflammatoryboweldisease,IBD)，諸如漬瘍性結腸炎和/或克羅恩氏病(Crohn'sdisease))、肝(例如硬化、肝細胞癌)的炎癥性和/或自身免疫病狀；硬皮??；腫瘤或癌癥(例如軟組織或實體腫瘤)，諸如白血病、膠質母細胞瘤和淋巴瘤，例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma);病毒感染(例如HTLV-1);其它器官的纖維化，例如肝纖14維化(例如由B型和/或C型肝炎病毒引起的纖維化)。術語"GDF-8"是指生長和分化因子-8和結構上或功能上與GDF-8有關的因子，例如BMP-ll和屬于TGF-p超家族的其它因子。本術語是指GDF-8的全長未加工前體形式，以及從翻譯后裂解得到的成熟和前肽(propeptide)形式。術語還指GDF-8的維持至少一些與成熟gdf-8相關的生物學活性的任何片段和變異體，包括已經(jīng)被修飾的序列。已揭示人類GDF-8以及其它脊椎動物物種(包括鼠類、狒狒、牛類和雞)GDF-8的氨基酸序列，例如US2004-0142382、US2002-0157125和麥克弗倫(McPherron)等人(1997)美國國家科學院院刊(/W淑.Aca"d.U.S.A.)，94:12457-12461'所有所述參考案的內(nèi)容都以全文引用的方式并入本文中。針對GDF-8的中和抗體的實例揭示于例如US2004-0142382中，且可用于治療或預防需要增加肌肉組織或骨密度的病狀。示范性疾病和病癥包括肌肉和神經(jīng)肌肉失調，諸如肌肉萎縮癥(包括杜興氏肌肉萎縮癥(Duchenne'smusculardystrophy);肌萎縮性側索硬化；肌肉萎縮；器官萎縮；脆性；腕管綜合癥；充血性阻塞性肺病；骨骼肌減少癥、惡病質和其它肌肉消耗綜合癥；脂肪組織病癥(例如肥胖)；2型糖尿??；葡萄糖耐受不良；代謝綜合癥(例如綜合癥X);由損傷(諸如灼傷或氮平衡失調)誘發(fā)的胰島素抵抗；骨退行性疾病(例如骨關節(jié)炎和骨質疏松癥)。GDF-8(又稱肌肉生長抑制素(myostatin))是一種分泌性蛋白并且是結構上相關生長因子的轉化生長因子-P(TGF-P)超家族的成員，所述生長因子全部都具有生理學上重要的生長調節(jié)和形態(tài)形成性質(金斯利(Kingsley)等人(1994)基因和發(fā)育(Gct"Z)".),8:133-146;胡德萊斯(Hoodless)等人(1998)微生物學與免疫學的當前課題(Q^r.r甲"臉威o,./m謹o/.),228:235-272)。類似于TGF-(3，人類GDF-8是以375個氨基酸長的前體蛋白形式合成。前體GDF-8蛋白形成均二聚體。在加工期間，于Arg-266處裂解去氨基末端前肽。所裂解的前肽(稱為"潛伏相關肽"(latency-associatedpeptide,LAP))可保持與所述均二聚體非共價結合，由此使復合物失活(宮園(Miyazono)等人(1988)生物化學雜志(丄S!'o/.C/zem.)263:6407-6415;威克菲爾德(Wakefield)等人(1988)生物化學雜志(義5!'oLC/em.)263:7646-7654;布朗(Brown)等人(1990)生長因子(GtowAFactors),3:35-43;和提思(Thies)等人(2001)生長因子(Grav^/z,18:251-259)。成熟GDF-8與前肽的復合物通常被稱為"小潛伏復合物"(簡崔(Gentry)等人(1990)生物化學Woc/i麵勿)，29:6851-6857;德里克(Derynck)等人(1995)自然,316:701-705;和馬薩戈(Massague)(1990)細胞生物學年評(A"".Ce〃編,),12:597-641)。也已知其它蛋白質與成熟GDF-8結合且抑制其生物學活性。所述抑制性蛋白包括卵泡抑素(follistatin)和卵泡抑素相關蛋白(伽姆(Gamer)等人(1999)發(fā)育生物學(Dev.5!'o/"),208:222-232)。術語"RAGE"是指晚期糖基化終產(chǎn)物受體。RAGE是免疫球蛋白超家族的多配體細胞表面成員。RAGE由胞外域、單跨膜域和胞質尾組成。受體的胞外域由一個V型免疫球蛋白域、接著兩個C型免疫球蛋白域組成。RAGE也存在可溶性形式(sRAGE)。RAGE是一種模式識別受體，其結合數(shù)種不同內(nèi)源性分子，引起多種細胞反應，包括細胞因子分泌、細胞氧化應激增加、軸突長出和細胞遷移。RAGE的配體包括晚期糖基化終產(chǎn)物(advancedglycationendproduct,AGE),其在長期高血糖狀態(tài)下形成。除AGE外，RAGE的已知配體包括具有為淀粉樣沉積物和促炎介質特征的(3-折疊原纖維的蛋白質，包括S100/鈣粒蛋白(calgranulins)(例如S100A12、S100B、S100A8-A9)、血清淀粉樣蛋白(serumamyloid,SAA)(纖絲形式)、p-淀粉樣蛋白(A-|3)和高遷移率族box-1染色體蛋白1(highmobilitygroupbox-1chromosomalprotein1，腹GB1，也稱為兩性蛋白(amphoterin))。RAGE由許多細胞類型(例如，內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞、巨噬細胞和淋巴細胞)表達，且在許多不同組織(包括肺、心臟、腎、骨骼肌和腦)中表達。在慢性炎癥狀態(tài)(諸如類風濕性關節(jié)炎和糖尿病性腎病)下，表達增加。盡管生理功能尚不清楚，但RAGE與炎癥反應有關且可能在包括成肌細胞分化和神經(jīng)發(fā)育在內(nèi)的多種發(fā)育過程中具有作用。許多重要人類病癥與RAGE配體的產(chǎn)生增加相關或與RAGE自身的產(chǎn)生增加相關。這些病癥包括例如許多慢性炎癥性疾病，包括類風濕性和牛皮癬性關節(jié)炎和腸道疾病、癌癥、糖尿病和糖尿病性腎病、淀粉樣變性、心血管疾病和膿毒病。舉例來說，已顯示RAGE配體中的一種，HMGB-1，在鼠類膿毒病的兩個模型中是致命性的晚期介質，且認為RAGE與配體(諸如HMGB1)之間的相互作用在膿毒病和其它炎癥性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。術語"A-(3"是指腦中的淀粉樣蛋白斑塊的主要成分。A-f3肽是一種稱為淀粉樣前體蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)的較大跨膜糖蛋白的39-43個氨基酸的4-kDa內(nèi)部片段。由于不同分泌酶對APP的蛋白水解加工，因此A-(3主要以短形式(長度為40個氨基酸)和長形式(長度范圍為42-43個氨基酸)存在。APP的疏水性跨膜域的一部分見于A-p的羧基末端處，且可解釋A-P聚集成斑塊的能力，尤其在長形式的情況下。淀粉樣蛋白斑塊積累于腦中最終導致神經(jīng)元細胞死亡。與這種神經(jīng)惡化相關的身體癥狀表示阿茲海默氏癥(Alzheimer'sdisease,AD)的特征。淀粉樣蛋白斑塊積累于腦中也與唐氏綜合癥(Down'ssyndrome)和其它認知病癥相關。已將APP蛋白中的數(shù)種突變與AD的存在相關聯(lián)(參見例如，勾特(Goate)等人,自然(Nature)349:704，1991(纈氨酸717變?yōu)楫惲涟彼?;沙爾捷哈蘭(ChartierHarlan)等人自然(Nature)353:844,1991(纈氨酸717變?yōu)楦拾彼?；默雷爾(Murrell)等人，科學(Science)254:97,1991(纈氨酸717變?yōu)楸奖彼?；穆蘭(Mullan)等人，自然-遺傳學(NatureGenet.)1:345,1992(使賴氨酸595-甲硫氨酸596變?yōu)樘於０?95-亮氨酸596的雙突變)，其中每一參考案均以全文引用的方式并入本文中)。認為所述突變通過增加或改變APP加工為A-(3，尤其APP加工為增加量的A-P長形式(即，A-(31-42和A-pi-43)而引起AD。認為其它基因(諸如早老蛋白基因，PS1和PS2)中的突變間接影響APP的加工而產(chǎn)生增加量的長形式A-P(參見哈代(Hardy),TINS20:154,1997，其以全文引用的方式并入本文中)。在某些實施例中，根據(jù)本發(fā)明純化抗-A-P抗體。如本文中所使用，術語"IL-22"是指白細胞介素-22，包括IL-22的全長未加工前體形式，以及從翻譯后裂解得到的成熟形式。本術語還指IL-22的維持至少一些與成熟IL-22相關的生物學活性的任何片段和變異體，包括已經(jīng)被修飾的序列。術語"IL-22"包括人類IL-22,以及其它脊椎動物物種IL-22。人類和嚙齒動物IL-22以及針對IL-22的抗體的氨基酸和核苷酸序列揭示于例如美國申請公開案第2003-0157106號、第2005-0153400號、第2005-0042220號和第2005-0158760號和美國專利第6，939，545號中。所有這些公開案的內(nèi)容都以全文引用的方式并入本文中。白細胞介素-22(IL-22)是一種先前表征的II型細胞因子，其顯示與IL-10的序列同源性。其表達在T細胞中被IL-9或刀豆球蛋白A(ConcanavalinA，ConA)上調(勞'杜穆蒂爾(DumoutierL.)等人(2000)美國國家科學院院刊(PracWa"AcWSc!'USA)97(18):10144-9)。研究已顯示IL-22mRNA的表達在活體內(nèi)響應于脂多糖(LPS)投與而誘發(fā)，和IL-22調節(jié)表示急性期反應的參數(shù)(勞《杜穆蒂爾(DumoutierL.)等人(2000)見上；德皮特曼(PittmanD.)等人(2001)基因與免疫(Ge""/mmim!'ty)2:172)，和通過使用中和抗-IL-22抗體降低IL-22活性在小鼠膠原蛋白誘發(fā)性關節(jié)炎(mousecollagen-inducedarthritis,CIA)模型中改善炎癥性癥狀。因此，IL-22拮抗劑(例如中和抗-IL-22抗體和其片段)可用于活體內(nèi)誘發(fā)免疫抑制，例如用于治療自身免疫病癥(例如關節(jié)炎病癥，諸如類風濕性關節(jié)炎)；呼吸病癥(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD));例如皮膚(例如牛皮癬)、心血管系統(tǒng)(例如動脈粥樣硬化)、神經(jīng)系統(tǒng)(例如阿茲海默氏癥)、腎(例如腎炎)、肝(例如肝炎)和胰腺(例如胰腺炎)的炎癥性病狀。術語"宿主細胞蛋白(hostcellprotein,HCP)"是指在細胞培養(yǎng)或發(fā)酵期間由宿主細胞產(chǎn)生的非產(chǎn)物蛋白質。因此，在一些實施例中，含有產(chǎn)物的洗脫物具有以小于百萬分之一百(100ppm)HCP(例如小于約50ppm或小于約20ppm)存在的HCP。HCP組合物極不均勻且依賴于蛋白質產(chǎn)物和所用的純化程序。在生物產(chǎn)品得到用于治療用途的任何上市批準之前，必須根據(jù)ICH和FDA準則來定量測量產(chǎn)物中污染蛋白質(諸如HCP)的含量。術語"柱流出物"是指在負載循環(huán)期間或在正施加負載的時期中離開介質或柱的液體。B.實施方式本發(fā)明提供使用包括用精氨酸或精氨酸衍生物洗滌經(jīng)結合的介質的程序從含有一或多種雜質的負載流體中純化和回收產(chǎn)物的方法。在一優(yōu)選實施例中，所述介質是蛋白A色譜柱。在一實施例中，產(chǎn)物是蛋白質，例如治療性蛋白，包括肽抗體。在其它實施例中，所述產(chǎn)物是分泌性蛋白；融合蛋白，例如受體融合蛋白或Ig-融合蛋白，包括Fc-融合蛋白；可溶性受體；生長因子；酶；凝血因子；含F(xiàn)c蛋白；免疫結合物；細胞因子；白細胞介素；激素；或治療性酶。在本發(fā)明的其它實施例中，產(chǎn)物是蛋白質，例如抗體，其具有Ch2/Ch3區(qū)并因此適合通過蛋白A色譜法純化。術語"CH2/CH3區(qū)"是指免疫球蛋白分子Fc區(qū)中的與蛋白A相互作用的那些氨基酸殘基。在一些實施例中，所述Ch2/Ch3區(qū)含有完整Ch2區(qū)，接著是完整CH3區(qū)。在其它實施例中，CH2/CH3區(qū)含有免疫球蛋白的Fc區(qū)。含有CH2/CH3區(qū)的蛋白質的實例包括抗體、免疫粘附素和融合蛋白，其包括與CH2/CH3區(qū)融合或結合的所關注蛋白質。在某些實施例中，當將負載流體加載到介質上時，至少一種雜質與介質和/或產(chǎn)物結合，且使用至少一種含有精氨酸或精氨酸衍生物的洗滌液來去除與介質和/或產(chǎn)物結合的雜質。所述蛋白質可為分泌性蛋白。蛋白質可為抗體、抗體的抗原結合片段、可溶性受體、受體融合物、細胞因子、生長因子、酶或凝血因子。在本發(fā)明的一些實施例中，使用本發(fā)明的方法純化的蛋白質是抗體或其抗原結合片段。如本文中所使用，術語"抗體"包括包含至少一個且通常兩個VH域或其部分和/或至少一個且通常兩個VL域或其部分的蛋白質。在某些實施例中，所述抗體是兩個免疫球蛋白重鏈和兩個免疫球蛋白輕鏈的四聚體，其中所述免疫球蛋白重鏈和輕鏈通過例如二硫鍵相互連接?？贵w或其一部分可從任何來源獲得，包括(但不限于)嚙齒動物、靈長類動物(例如人類和非人類靈長類動物)、駱駝類、鯊魚以及重組產(chǎn)生，例如嵌合、人源化和/或活體外產(chǎn)生(例如通過所屬領域的技術人員所熟知的方法)。18術語抗體的"抗原結合片段"中所涵蓋的結合片段的實例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，即包含在鉸鏈區(qū)由二硫橋鍵聯(lián)的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CHl域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH域組成的Fv片段；(v)dAb片段，其由VH域組成；(vi)駱駝類或駱駝化可變域，例如VHH域；(vii)單鏈Fv(scFv);(viii)雙特異性抗體；禾B(ix)與Fc區(qū)融合的免疫球蛋白的一或多個抗原結合片段。此外，盡管Fv片段的兩個域VL和VH由單獨基因編碼，但可使用重組方法，通過使其能夠形成為單蛋白質鏈(其中VL和VH區(qū)配對形成單價分子)的合成連接子將其接合(稱為單鏈Fv(scFv);參見例如，伯德(Bird)等人(1988)科學"c/匿e)242:423-26;休斯頓(Huston)等人(1988)美國國家科學院院刊脂/.AcfldUD85:5879-83)。所述單鏈抗體也希望涵蓋于術語抗體的"抗原結合片段"中。這些抗體片段是使用所屬領域的技術人員已知的常規(guī)技術來獲得，且以與完整抗體相同的方式評估片段的功能。在一些實施例中，術語"抗原結合片段"涵蓋單域抗體。單域抗體可包括互補決定區(qū)為單域多肽的一部分的抗體。實例包括(但不限于)重鏈抗體、天然缺少輕鏈的抗體、源自常規(guī)4鏈抗體的單域抗體、工程化抗體和不同于源自抗體的那些的單域骨架。單域抗體可為此項技術中的任一者或任何未來單域抗體。單域抗體可源自任何物種，包括(但不限于)小鼠、人類、駱駝、美洲駝、山羊、兔、母牛和鯊魚。根據(jù)本發(fā)明的一方面，如本文中所使用的單域抗體是稱為缺少輕鏈的重鏈抗體的天然存在的單域抗體。所述單域抗體例如揭示于WO9404678中。為明確起見，這種源自天然缺少輕鏈的重鏈抗體的可變域在本文中稱為VHH或納米抗體以使其區(qū)別于4鏈免疫球蛋白的常規(guī)VH。這類VHH分子可源自例如駱駝、美洲駝、單峰駝、羊駝和原駝的駱駝科(Camelidae)物種中所產(chǎn)生的抗體。除駱駝科外的其它物種可能產(chǎn)生天然缺少輕鏈的重鏈抗體；這類VHH在本發(fā)明的范圍內(nèi)。抗原結合片段可任選地進一步包括增強例如穩(wěn)定性、效應細胞功能或補體固定中的一或多者的部分。舉例來說，抗原結合片段可進一步包括聚乙二醇化部分、白蛋白或者重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)。另外，本發(fā)明的方法可用于純化小分子免疫藥物(SMIPTM)類藥物(Trubion制藥公司，華盛頓州西雅圖(TrubionPharmaceuticals,Seattle,WA))。SMIP是包含對于相關結構(cognatestructure)(諸如抗原、反受體(counterreceptor)等)的結合域、具有一個半胱氨酸殘基或無半胱氨酸殘基的鉸鏈區(qū)多肽和免疫球蛋白CH2和CH3域的單鏈多肽(亦參見www.trubion.com)。SMIP和其用途與應用揭示于例如美國公開專利申請案第2003/0118592號、第2003/0133939號、第2004/0058445號、第2005/0136049號、第2005/0175614號、第2005/0180970號、第2005/0186216號、第2005/0202012號、第2005/0202023號、第2005/0202028號、第2005/0202534號和第2005/0238646號以及其相關專利族成員中，其全部都以全文引用的方式并入本文中。除了"雙特異性"或"雙功能性"抗體，抗體所具有的每一結合位點相同。"雙特異性"或"雙功能性"抗體是具有兩個不同重鏈/輕鏈對和兩個不同結合位點的人工雜合抗體。雙特異性抗體可通過包括雜交瘤的融合或Fab'片段的連接在內(nèi)的多種方法來產(chǎn)生。參見例如，宋斯維萊(Songsivilai)和拉赫曼(Lachmann),臨床與實驗免疫學(C"Vz./mm畫Z.)79:315-321(1990);克斯特林(Kostelny)等人，免疫學雜志(J.//nmw"oZ.)148,1547-1553(1992)。在蛋白質是抗體或其片段的實施例中，其可包括至少一個或兩個全長重鏈和至少一個或兩個輕鏈?；蛘?，抗體或其片段可僅包括抗原結合片段(例如Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv片段)。抗體或其片段可為單克隆或單特異性抗體?？贵w或其片段也可為人類、人源化、嵌合、CDR移植或活體外產(chǎn)生的抗體。在其它實施例中，抗體具有選自例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恒定區(qū)。在另一實施例中，抗體具有選自例如k或X的輕鏈。在一實施例中，改變(例如突變)所述恒定區(qū)以改變抗體的性質(例如增加或減少以下一或多者Fc受體結合、抗體糖基化、半胱氨酸殘基的數(shù)目、效應細胞功能或補體功能)。通常，抗體或其片段與預定抗原特異性結合，例如與例如神經(jīng)退化性、代謝、炎癥性、自身免疫和/或惡性病癥的病癥相關的抗原?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法分離的示范性抗體包括(但不限于)針對RAGE、A-(3肽、白細胞介素-13(IL-13)、白細胞介素-22(IL-22)、5T4和生長和分化因子-8(GDF-8)的抗體。用于本文所述的方法的抗體制劑可來自許多來源，包括(但不限于)免疫動物的血清、腹水流體、雜交瘤或骨髓瘤上清液、源自培養(yǎng)表達所述抗體分子的重組細胞系的條件培養(yǎng)基，或源自產(chǎn)抗體細胞的細胞提取物。在本發(fā)明的一實施例中，產(chǎn)物是來自產(chǎn)抗體重組細胞系的條件培養(yǎng)基的抗體。盡管基于本文的揭示內(nèi)容，在不同細胞系之間和各種不同的抗體產(chǎn)物之間會存在一些變化，但使本文的本發(fā)明適應于抗體蛋白與產(chǎn)生細胞系的特定組合是完全處在所屬領域技術人員的能力范圍內(nèi)。在某些實施例中，當將負載流體加載到介質時，至少一種雜質與介質和/或產(chǎn)物結合，且使用至少一種含有精氨酸或精氨酸衍生物的洗滌液來去除與介質和/或產(chǎn)物結合的雜質。在本發(fā)明的一實施例中，純化產(chǎn)物含有小于60%的雜質(例如宿主細胞蛋白)，在一實施例中小于40%的雜質，在一實施例中小于20%的雜質，在一實施例中小于10%的20雜質，在一實施例中小于5%的雜質，在一實施例中小于3%的雜質，且在另一實施例中小于1%的雜質。雜質包括(但不限于)不合需要的蛋白質變異體，諸如聚集蛋白、高分子量物質、低分子量物質和片段以及脫酰胺化物質；來自分泌待純化的蛋白質的宿主細胞的其它蛋白質；宿主細胞DNA;來自細胞培養(yǎng)基的成分；為用于親和色譜法的吸附劑的一部分、在先前純化步驟期間浸入樣品中的分子，例如蛋白A和蛋白G;內(nèi)毒素；核酸；病毒，或上述任一種的片段。用于本文所述的方法中的介質為例如親和色譜柱、疏水性相互作用色譜柱、固定金屬親和色譜柱、尺寸排阻色譜柱、滲濾、超濾、病毒去除過濾和/或離子交換色譜柱、蛋白A色譜柱或蛋白G色譜柱。蛋白A色譜柱可為例如PROSEP-Atm(密理博公司，英國(Millipore，U.K.))、蛋白A瓊脂糖FASTFLOW(通用電氣醫(yī)療集團，新澤西州皮斯卡塔韋(GEHealthcare,Piscataway,N丄))、TOYOPEARL650M蛋白A(東槽達公司，賓夕法尼亞州費城(TosoHassCo.,Philadelphia,Pa.))或MabSelectTM柱(通用電氣醫(yī)療集團，新澤西州皮斯卡塔韋(GEHealthcare,Piscataway,N丄))。在使介質與負載流體接觸之前，可能有必要調節(jié)諸如pH值、離子強度和溫度以及在一些情況下不同種類物質的添加等參數(shù)。因此，任選步驟是通過用溶液(例如用于調節(jié)pH值、離子強度等或用于引入洗滌劑的緩沖液)洗滌介質來進行介質的平衡，從而產(chǎn)生產(chǎn)物的結合和純化的必要特征。在本發(fā)明的一實施例中，用含有精氨酸或精氨酸衍生物的洗滌液來平衡和洗滌蛋白A柱，由此產(chǎn)生純化所述產(chǎn)物的必要特征。在本發(fā)明的一實施例中，可使用含有鹽(例如約100mM到約150mMNaP04、約100mM到約150mM乙酸鈉和約100mM到約150mMNaCl)的溶液來平衡蛋白A柱。平衡緩沖液的pH值可在約6.0到約8.0的范圍內(nèi)。在一實施例中，平衡緩沖液的pH值為約7.5。平衡緩沖液可含有約10mM到約50mM的Tris。在另一實施例中，緩沖液可含有約20mM的Tris。使介質(例如蛋白A柱)與負載流體接觸后，洗滌經(jīng)結合的介質。根據(jù)本發(fā)明，用于本文所述的方法中的洗滌液含有精氨酸或精氨酸衍生物。所述精氨酸衍生物可為(但不限于)乙酰精氨酸、胍丁胺、羥基精氨酸、N-ct-丁?；?L-精氨酸或N-a-特戊酰基精氨酸。洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度介于約0.1M與約2.0M之間(例如0.1M、0.4M、0.5M、1.0M、1.5M或2.0M)，或介于約0.5M與約1.0M之間(例如0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M或1.0M)。在某些實施例中，洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M或0.9M。在某些實施例中，洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M或2.0M。在某些實施例中，洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度大于約0.5M且小于約2.0M(例如0.55M、0.75M、1.0M、1.25M、1.5M或1.75M或2.0M)，或大于約0.5M且小于約1.0M(例如0.55M、0.75M或1.0M)。在一實施例中，精氨酸的濃度不為1M。在一些實施例中，洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度大于1M。在一些實施例中，洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度小于1M。在其它實施例中，洗滌液可含有約0.1M到約0.9M的精氨酸或精氨酸衍生物。在某些實施例中，精氨酸或精氨酸衍生物的濃度可為約0.2M到約0.8M、約0.3M到約0.7M或約0.4M到約0.6M。在其它實施例中，洗滌液可含有約1.1M到約3.0M或約1.1M到約2.0M的精氨酸或精氨酸衍生物。在某些實施例中，精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約1.2M到約2.8M、約1.3M到約2.6M、約1.4M到約2.4M、約1.5M到約2.2M、約1.6M到約2.0M或約1.8M到約2.0M。在某些實施例中，精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約1.2M到約1.9M、約1.3M到約1.8M、約1.4M到約1.7M或約1.5M到約1.6M。洗滌液的pH值通常介于約4.5與約8.0之間，例如4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5禾n8.0。在一些情況下，洗滌液的pH值大于5.0且小于約8.0,例如5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。洗滌液可含有20mM到50mM的Tris(例如20mM、30mM、40mM或50mM)。在一實施例中，用5柱體積的洗滌液洗滌經(jīng)結合的介質，接著為洗脫步驟。在本發(fā)明的某些實施例中，產(chǎn)物可從經(jīng)洗滌的介質(例如蛋白A柱)洗脫。為了從蛋白A柱洗脫產(chǎn)物，使經(jīng)洗滌的介質與洗脫緩沖液接觸。在一些實施例中，所述洗脫緩沖液含有約15mM到約50mM的NaCl。在其它實施例中，洗脫緩沖液可含有約50mM到約150mM的精氨酸或精氨酸衍生物。在其它實施例中，洗脫緩沖液可含有50mM到150mM的甘氨酸。洗脫緩沖液也可含有約20mM到約30mM的HEPES。洗脫緩沖液也可含有約25mM到約50mM的乙酸。洗脫緩沖液的pH值可在約2.0到約4.0的范圍內(nèi)。在一實施例中，洗脫緩沖液的pH值為約3.0。在洗脫抗體后可任選地清洗介質(即洗提和再生)。這一程序通常定期進行以使雜質在固相表面上的積累最少和/或使基質滅菌以避免產(chǎn)物受微生物污染。緩沖液成分可根據(jù)所屬領域技術人員的知識來調節(jié)。樣品緩沖液組成范圍在以下實例中提供。并非所有緩沖液或步驟都是必要的，而提供僅是為了說明。如實例中所述，可使用高通量篩選法來有效地最優(yōu)化蛋白A柱色譜法的緩沖條件。在方法的一實施例中，洗脫物包括經(jīng)分離的產(chǎn)物且與洗滌液中使用小于約0.1M的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，所述經(jīng)分離的產(chǎn)物的純度增加。22在另一實施例中，洗脫物包括經(jīng)分離的產(chǎn)物，且與洗滌液中不使用可檢測量的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，所述產(chǎn)物與至少一種雜質的比率增加。在一些情況下，洗脫物含有產(chǎn)物，且與洗滌液中使用小于約0.1M的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，所述產(chǎn)物與宿主細胞蛋白的比率增加。洗脫物可包括產(chǎn)物且與洗滌液中不使用可檢測量的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，所述產(chǎn)物與宿主細胞蛋白的比率增加?；鞚岫忍峁Σ蝗苄援a(chǎn)物、不溶性雜質和產(chǎn)物與雜質的不溶性復合物的度量?；鞚岫纫部捎蓙喖毎⒘：图毎槠稹Ｒ话愣?，洗脫物混濁度越低，產(chǎn)物質量越合乎需要?；鞚岫瓤墒褂么隧椉夹g中已知的方法來測定。舉例來說，可使用散射測濁法(nephelometricmethods)(貝克(Baker)等人，生物技術動向(TrendsBiotechnoU2002年4月；20(4):149-56)或光學密度。光學密度通常通過在約320nm到約650nm的范圍下測量吸光度來測定。在一些情況下，與洗滌液中使用小于約0.1M的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法中的洗脫物混濁度相比，所述洗脫物的混濁度降低。在某些方法中，與洗滌液中不使用可檢測量的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，所述洗脫物的混濁度降低。在某些實施例中，本發(fā)明的方法使得含有產(chǎn)物的洗脫物混濁度降低。在其它實施例中，與洗滌液中不使用可檢測量的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，本方法使得含有產(chǎn)物的洗脫物混濁度降低以及雜質減少。在某些實施例中，本方法并不包括使用任何另外的上游過濾，例如陰離子上游吸附過濾。盡管可單獨使用本發(fā)明的純化方法，但其可與其它純化技術組合使用。在一實施例中，在采用本文所述的方法的同時，可使用一或多種工藝(例如)來制備負載流體以降低污染物或雜質負載挑戰(zhàn)。在一些情況下，使用一或多種工藝來加工洗脫物，例如去除洗脫物中的污染物或雜質。本發(fā)明還涉及一種根據(jù)本文所述的方法制備的產(chǎn)物。一般而言，通常將需要進一步分離和/或純化根據(jù)本發(fā)明分離的產(chǎn)物且根據(jù)標準方法將其調配以用于醫(yī)藥用途。關于蛋白質，參見例如蛋白質純化原理與實踐(7VWe!'"PKn/i'ca"o"尸""c/pZesa"d尸racrice)第2^f,施普林格出版社(Springer-Verlag),紐約(NewYork),1987;蘇'杰*希金斯(Higgins，S丄)和本嚼奴姆斯(Hames，B.D.)(編)，以及馬'皮多伊徹(Deutscher,M.P.),馬'萊灑蒙(Simon,M丄)，杰纟內(nèi)阿貝爾森(Abelson,J.N.)(編)，蛋白質純化指南酶學方去(Gm'defoiVofe/w尸Kn/i'cariowMef/i。(is1五nz:ymoZog;y)(酶學方7去系歹U(MethodsinEnzymologySeries),第182巻)，學術出版社(AcademicPress),1997，以引用的方式23并入本文中。所屬領域的技術人員應理解所用的準確技術將依產(chǎn)物的特征而變化。具有藥理學活性的本發(fā)明產(chǎn)物將適用于制備藥物?？蓪⑦@些藥物投與個體或者可先加以調配來通過任何可利用的途徑傳遞，所述途徑包括(但不限于)非經(jīng)腸(例如靜脈內(nèi))、皮內(nèi)、皮下、經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)支氣管、經(jīng)眼、透皮(局部)、透粘膜、經(jīng)直腸和經(jīng)陰道途徑。根據(jù)此項技術中已知的方法，將產(chǎn)物的醫(yī)藥組合物調配為與其預期投藥途徑相容，參見例如，"雷明登氏藥學的理論與實踐(Remington:TheScience&PracticeofPharmacy)",第19版，威廉姆斯公司(Williams&Williams),(1995),和"醫(yī)師桌上手冊(Physician'sDeskReference)",第52版，醫(yī)藥經(jīng)濟公司(MedicalEconomics),新澤西州蒙特威爾(Montvale，N丄)(1998)。在一些實施例中，使用無菌水(例如SWFI)、緩沖生理鹽水(例如磷酸鹽緩沖生理鹽水)、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)或其適合的混合物調配產(chǎn)物?？墒褂帽疚乃龅姆椒ɑ厥盏漠a(chǎn)物的非限制性實例包括蛋白質或肽，例如抗體、抗體片段、重組蛋白、天然分泌性蛋白、工程化而被分泌的蛋白質或肽、由細胞產(chǎn)生的非蛋白產(chǎn)物或上述產(chǎn)物的組合。實例本發(fā)明進一步通過下列實例來說明。所述實例的提供僅用于說明性目的。不應將其理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍或內(nèi)容。進行實驗以在使用親和介質作為分離工藝一部分的方案中鑒別適用于分離由細胞細菌或組織產(chǎn)生的產(chǎn)物的方法。在這些實驗中，使用MabSelectTM蛋白A柱結合所述產(chǎn)物。GDF-8mAb-1:蛋白A洗漆緩沖液在HCP和混濁度降低以及產(chǎn)物回收率方面的比狡首先使用高通量篩選(HTS)法對各種洗滌液進行評估。起初用來自中國倉鼠卵巢("CHO")細胞培養(yǎng)工藝的條件培養(yǎng)基裝載MabSelectTM蛋白A柱。接著使MabSelect樹脂成漿且將100pL樹脂漿料分配于96孔微量滴定板的各孔中。接著用評估中的測試溶液洗滌所述微量滴定板的各孔，且隨后用低pH值緩沖液洗脫。通過A320測定來自各孔的洗脫匯集物的峰值混濁度且通過A280測定產(chǎn)物回收率。基于HTS實驗的結果，選擇產(chǎn)生最高回收率和最低混濁度的測試溶液來使用小規(guī)模柱條件搜索運作(columnscoutingrun)進行進一步測試。在柱條件搜索運作中，用含有10mMTris、100mMNaClpH7.5的緩沖液平衡MabSelect蛋白A柱，且裝載含有GDF-8mAb-l的CHO條件培養(yǎng)基。接著用5柱體積(CV)的平衡緩沖液沖洗所述柱，且隨后用5CV評估中的測試溶液洗滌。隨后以低pH值緩沖液洗脫經(jīng)結合的產(chǎn)物。通過A320或通過濁度計測量經(jīng)中和的峰值混濁度，通過A280測定產(chǎn)物回收率，且通過ELISA測定HCP含量。用于初始評估的柱尺寸是直徑0.5cm或1.1cm和床高度8cm到25cm。表1總結實例1中所述的所有實驗的柱操作條件。表1:MabSeiectTM蛋白A柱操作條件柱操作的階溶液組成體積(柱體積)線速度(cmhr-"盤平衡10mMTris、100mMNaCl，dH7.5》360/450裝載條件培養(yǎng)基不適用240裝載后沖洗10mMTris、100mMNaCl，dH=7.5240洗滌1可變(參見表2)300洗脫前沖洗10mMTris、lOOmMNaCl,oH=7.5450洗脫50mMNaCl、100mML-精氨酸鹽酸鹽，。H=1503.0中和2MHEPES,dH=8.0添加5.0%(v/v)洗脫后沖洗50mMTris，pH=8.5450洗提6M鹽酸胍150洗提后沖洗10mMTris、100mMNaCl，pH=7.5150/450儲存16%(v/v)乙醇4360對于每一次運作，用5柱體積的10mMTris、100mMNaCl(pH7.5)平衡MabSeiectTM蛋白A柱且隨后裝載到約35毫克產(chǎn)物/毫升樹脂上。接著用l柱體積的平衡緩沖液和5柱體積(CV)的評估中的測試洗滌液(參見表2)沖洗柱。在洗滌階段后用5CV的10mMTris、100mMNaCl(pH7.5)沖洗。接著用100mML-精氨酸、50mMNaCl(pH3.0)從柱洗脫經(jīng)結合的產(chǎn)物。隨后用2MHEPES(pH8.0)將產(chǎn)物匯集物中和到pH7.5。用2CV的6M鹽酸胍洗提柱。用4CV的10mMTris、100mMNaCl(pH7.5)從柱去除所述胍，隨后儲存于16%乙醇(4CV)中。所有柱操作均在室溫下進行。表2中列出評估HCP和峰值匯集物混濁度降低的各種洗滌液。當使用1MNaCl對照洗滌液時(圖1)，在蛋白A洗脫匯集物中觀察到嚴重的沉淀和產(chǎn)物損失。另外，通過蛋白A柱步驟的HCP清除率小于1log1Q。與諸如10%異丙醇(IPA)、0.5M鹽酸胍(GuHCl)或2MTris-HCl的替代性洗滌液相比，精氨酸洗滌液更有效地減少HCP和降低洗脫匯集物混濁度，同時維持良好的產(chǎn)物回收率(圖l)。25表2:所評估的洗滌液列表<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實例2GDF-8mAb-2:蛋白A洗滌緩沖液在HCP和混濁度降低以及產(chǎn)物回收率方面的比逡使用MabSelectTM蛋白A柱小規(guī)模地純化來自CHO細胞培養(yǎng)工藝的含有GDF-8mAb-2的條件培養(yǎng)基。用于初始評估的柱尺寸是直徑0.5cm或1.1cm和床高度8cm到25cm。用于GDF-8mAb-2純化的蛋白A操作條件以及評估HCP和峰值匯集物混濁度降低的洗滌液與實例1中所用的那些相同(所評估的測試溶液參見表2)。當使用1MNaCl對照洗滌液時(圖2)，在蛋白A洗脫匯集物中觀察到嚴重的沉淀和產(chǎn)物損失。另外，通過蛋白A柱步驟的HCP清除率小于1log1Q。與諸如10%異丙醇、0.5M鹽酸胍(GuHCl)或2MTris-HCl的替代性洗滌液相比，精氨酸洗滌液更有效地去除HCP和降低洗脫匯集物混濁度，同時維持產(chǎn)物回收率大于75%(圖2)。實例3IL-13mAb-l:蛋白A洗滌緩沖液在HCP和混濁度降低以及產(chǎn)物回收率方面的比鉸起初使用高通量篩選(HTS)法對通過蛋白A柱步驟的數(shù)種洗滌液的混濁度降低和HCP減少進行評估。用MabSelectTM樹脂裝填25mL柱且裝載CHO細胞條件培養(yǎng)基到每毫升樹脂25mglL-13mAb-1的最終負載挑戰(zhàn)。接著使樹脂成漿且將100^L樹脂漿料分配于96孔微量滴定板的各孔中。接著用評估中的測試溶液洗滌所述微量滴定板的各孔，且用50mM甘氮酸、35mMNaCl(pH3.0)洗脫經(jīng)結合的產(chǎn)物。表3列出本研究中所評估的所有洗滌液。通過A320測定來自各孔的洗脫匯集物的峰值混濁度且通過A280測定產(chǎn)物回收率。表3:以1號HTS篩評估的洗滌液<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>*帶電的十六烷基三甲基溴化銨(lmM=CMC)**3-[(3-膽酰胺丙基)-二甲基-銨]-1-丙烷磺酸鹽通過比較經(jīng)中和的洗脫匯集物的標準化A320值來評定評估中的洗滌液的有效性。五種測試溶液，精氨酸、CaCl2、鹽酸胍、IPA和Tris比1MNaCl對照洗滌液更有效地降低經(jīng)中和的峰值匯集物混濁度值。使用小規(guī)模柱條件搜索運作進一步測試精氨酸、CaCl2、Tris禾CIIPA。使用1.1cm(直徑)X8cm(床高度)的柱進行這些評估。使用在室溫下操作的MabSelectTM蛋白A柱小規(guī)模地純化來自CHO細胞培養(yǎng)的含有所述單克隆抗體的條件培養(yǎng)基。對于這些運作將負載挑戰(zhàn)定為30mg/mL樹脂。表4中總結用于條件搜索運作的操作條件。簡單說來，平衡MabSdectTM蛋白A柱且裝載含有IL-13mAb-1的CHO細胞條件培養(yǎng)基。接著用5柱體積的高鹽緩沖液、接著5柱體積的評估中的洗滌液洗滌所述柱。接著用一系列低鹽溶液洗滌柱而為洗脫步驟作準備。接著用50mM甘氨酸、15mMNaCl(pH3.0)洗脫經(jīng)結合的產(chǎn)物。通過濁度計測量經(jīng)中和的峰值混濁度，通過A280測定產(chǎn)物回收率，且通過ELISA測定HCP含量。本實驗的結果總結于圖3中。表4:用于條件搜索運作的操作條件操作溶液組成柱體積流速(cm(CV)hr-1)平衡150mMNaCl、20mMTris:pH=7.5300裝載條件培養(yǎng)基300裝載后沖洗l.OMNaCl、20mMTris:dH=7.5300洗滌測試溶液300洗脫前沖洗135mMNaCl、50mMTris;pH=7.5300洗脫前沖洗25mMNaCl、lOmMTris;pH=7.5300洗脫15mMNaCl、50mM甘氨酸dH=3.05(3CV峰300值體積)洗提6.0M鹽酸胍300儲存16%(v/v)乙醇300中和2.0MTris;dH8.51%(v/v)300當使用1MNaCl對照洗滌液時，經(jīng)中和的峰值匯集物混濁度值為約20NTU，且顯著低于實例1和2中所報告的值。與1MNaCl對照組相比，精氨酸、CaCh禾PTris更有效地降低經(jīng)中和的峰值匯集物混濁度。然而，在有效降低經(jīng)中和的峰值匯集物混濁度的三種洗滌液中，精氨酸更有效地減少HCP而不影響產(chǎn)物回收率。通過用0.4M精氨酸(pH5.0)洗滌液的MabSelectTM蛋白A步驟的HCP減少是用1MNaCl對照洗滌液的對應值3.5倍高(圖3)。實例4IL-22mAb:蛋白A洗滌緩沖液在HCP和混濁度降低以及產(chǎn)物回收率方面的比較起初使用HTS法對通過蛋白A柱步驟的數(shù)種洗滌液的混濁度降低和HCP減少進行評估。用MabSelectTM樹脂裝填25mL柱且裝載CHO細胞條件培養(yǎng)基到每毫升樹脂25mgIL-22mAb的最終負載挑戰(zhàn)。接著使樹脂成漿且將100樹脂漿料分配于96孔微量滴定板的各孔中。接著用評估中的測試溶液洗滌所述微量滴定板的各孔，且用低pH值緩沖液洗脫經(jīng)結合的產(chǎn)物。接著用高pH值緩沖液中和洗脫匯集物且通過A320測定峰值混濁度并通過A280測定產(chǎn)物回收率?；贖TS實驗的結果，選擇產(chǎn)生最高回收率和最低混濁度的測試溶液來使用小規(guī)模柱條件搜索運作進行進一步測試，其條件總結于表5中。表5:用于柱條件搜索運作的測試條件28<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>如圖4中所示，所有測試條件產(chǎn)生相當?shù)漠a(chǎn)品回收率。用于運作2中的精氨酸洗滌液和用于運作5中的Tris洗滌液使HCP減少最大。然而，用于運作2中的精氨酸洗滌液具有比用于運作5中的Tris洗滌液接近2倍低的混濁度值。實例5RAGEmAb:蛋白A洗滌緩沖液在HCP和混濁度降低以及產(chǎn)物回收率方面的比較起初使用HTS法對通過蛋白A柱步驟的數(shù)種洗滌液的混濁度降低和HCP減少進行評估。用MabSelectTM樹脂裝填25mL柱且裝載CHO細胞條件培養(yǎng)基到每亳升樹脂25mgRAGEmAb的最終負載挑戰(zhàn)。接著使樹脂成漿且將100樹脂漿料分配于96孔微量滴定板的各孔中。接著用評估中的測試溶液洗滌所述微量滴定板的各孔，且用低pH值緩沖液洗脫經(jīng)結合的產(chǎn)物。接著用高pH值緩沖液屮和洗脫匯集物且通過A320測定峰值混濁度并通過A280測定產(chǎn)物回收率。對于大多數(shù)測試溶液，HTS實驗產(chǎn)生可接受的回收率和混濁度?；谶@些結果和先前經(jīng)驗，評估精氨酸且選擇作為這種產(chǎn)物的洗滌條件。用5柱體積(CV)的20mMTris、150mMNaCl(pH7.5)平衡5cm(d)X23cm(h)MabSdectTM蛋白A柱且隨后裝載到約35毫克產(chǎn)物/毫升樹脂。接著用5CV的0.5M精氨酸、50mMTris(pH7.5)洗滌所述柱。在洗滌階段后用3CV的39mMNaCl、5mMTris(pH7.5)進行洗脫前沖洗。接著用22mMNaCl、50mM甘氨酸(pH3.0)從柱洗脫經(jīng)結合的產(chǎn)物且用2.0MTris(pH8.2)中和到pH7.5。用5CV的50mMNaOH、500mm硫酸鈉洗提柱且儲存于5CV的16%(v/v)乙醇、50mMTris(pH7.5)中。所有柱操作均在室溫下進行且總結于表7中。表7:用于柱條件搜索運作的操作條件操作溶液組成柱體積流速(CV)(cmhr")平衡150mMNaCl、20mMTris:300dH7.5裝載條件培養(yǎng)基300洗滌0.5M精氨酸、50mMTris，300dH7.5洗脫前沖洗39mMNaCl、5mMTris:dH3007.5洗脫22mMNaCl、50mM甘氨酸；5(3CV峰值體積)300dH3.0洗提50mMNaOH、500mM硫酸鈉300儲存16%(v/v)乙醇、50mMTris,300中和2.0MTris，dH8.20.9%(v/v)30030如圖5中所示，精氨酸洗滌液產(chǎn)生可接受的產(chǎn)品回收率，同時提供所需水平的HCP去除和經(jīng)中和的峰值混濁度降低。實例6A-BmAb:蛋白A洗滌緩沖液在HCP和混濁度降低以及產(chǎn)物回收率方面的比較首先使用高通量篩選(HTS)法對各種洗滌液進行評估。起初用來自中國倉鼠卵巢(CHO)細胞培養(yǎng)工藝的條件培養(yǎng)基裝載MabSelect蛋白A柱。接著使MabSelect樹脂成漿且將100^iL樹脂漿料分配于96孔微量滴定板的各孔中。接著用評估中的測試溶液(參見表8)洗滌所述微量滴定板的各孔，且隨后用低pH值緩沖液洗脫。通過A320測定來自各孔的洗脫匯集物的峰值混濁度且通過A280測定產(chǎn)物回收率?；贖TS實驗的結果，選擇產(chǎn)生最高回收率和最高HCP去除的測試溶液來使用小規(guī)模柱運作進行進一步測試。這些洗滌液是精氨酸和CaCl2。表8:所測試的HTS洗滌液洗滌賦形劑濃度NaCl0.5M、1.0M、1.5M、2.0M精氨酸0.5M、1.0M、1.5M、2.0MCaCl20.5M、1.0M、1.5M、2.0MTris0.5M、1.0M、1,5M、2.0M在柱運作中，使用1.6cm(直徑)X15cm(床高度)的柱進行這些評估。用含有50mMTris、0.15MNaClpH7.5的緩沖液平衡MabSelect蛋白A柱，并裝載含有A-(3mAb的CHO細胞條件培養(yǎng)基到40mg/mL。接著用2柱體積(CV)的平衡緩沖液沖洗所述柱，且隨后用5CV的精氨酸或CaCl2洗滌。接著用10mMTris、10mMNaClpH7.5洗滌柱而為洗脫步驟作準備。隨后用50mM甘氨酸、10mMNaClpH3.0洗脫經(jīng)結合的產(chǎn)物。通過A320或通過濁度計測量經(jīng)中和的峰值混濁度，通過A280測定產(chǎn)物回收率，且通過ELISA測定HCP含量。表9總結本實例中所述的所有實驗的柱操作條件。表9:蛋白A柱操作條件柱操作溶液組成體積(CV)線速度(cm/hr)平衡50mMTris、0.15MNaClpH7.5<300裝載條件培養(yǎng)基不適用<30031<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表10顯示A-pmAb洗滌實驗的回收率和HCP值的結果。精氨酸和CaCl2是減少宿主細胞蛋白和降低最終峰值匯集物混濁度的相當洗滌液?；谠谙礈炱陂g較低的產(chǎn)物損失，選擇0.5M精氨酸作為A-(3mAb工藝的洗滌液。實例7IL-13mAb-2:蛋白A洗滌緩沖液在HCP和混濁度降低以及產(chǎn)物回收率方面的比狡起初使用高通量篩選(HTS)法對通過蛋白A柱步驟的數(shù)種洗滌液的混濁度降低進行評估。用MabSelectTM樹脂裝填25mL柱且裝載CHO條件培養(yǎng)基到每毫升樹脂50mgIL-13mAb-2的最終負載挑戰(zhàn)。接著使樹脂成漿且將100]iL樹脂漿料分配于96孔微量滴定板的各孔中。接著用評估中的測試溶液洗滌所述微量滴定板的各孔，洗脫經(jīng)結合的產(chǎn)物，且中和酸性洗脫匯集物。對于HTS，組合地且以不同濃度使用各種賦形劑洗滌液、洗脫緩沖液和滴定劑。用于HTS的賦形劑洗滌液是氯化鈣、氯化鈉、Tris和精氨酸。用于HTS的洗脫緩沖液是甘氨酸、HEPES和乙酸加上不同濃度的NaCl。用于HTS的滴定劑是Tris、HEPES和咪唑。'使用A320作為代用品進行沉淀，通過比較經(jīng)中和的洗脫匯集物的標準化A320值來評定洗滌液的有效性。精氨酸證實最有效地降低洗脫峰的A320讀數(shù)?；贖TS實驗的結果，選擇產(chǎn)生最高回收率和最低混濁度的測試溶液來使用小規(guī)模柱條件搜索運作進行進一步測試。此舉結果是對氯化鈣、精氨酸和氯化鈉(對照組)作為洗滌緩沖液在小規(guī)模柱試驗中進行進一步測試。使用在室溫下操作的MabSelectTM蛋白A柱小規(guī)模地純化來自CHO培養(yǎng)工藝的含有IL-13mAb-2的條件培養(yǎng)基。用于初始評估的柱尺寸是直徑1.1cm和床高度20cm到25cm。對于這些運作將負載挑戰(zhàn)定為35mg/mL樹脂。用于條件搜索運作的條件總結于表11中。表lh用于條件搜索運作的操作條件操作溶液組成柱體積(CV)流速(cmhr1)平衡150mMNaCl、50mMTris;pH=7.5300裝載條件培養(yǎng)基-240裝載后沖洗150mMNaCl、50mMTris;pH=7.5300洗滌測試溶液(參見表12)5300洗脫前沖洗10mMTris、NaCl濃度等于洗脫緩沖液，pH=7.53300洗脫參見表136CV(3CV峰值體積)300洗提50mMNaOH、500mM硫酸鈉180儲存16%(v/v)乙醇、50mMTris、150mMNaCI，pH=7.55300中禾口參見表13~1-5%.(v/v)表12:所評估的洗滌液列表參考溶液組成10.5M精氨酸、20mMTris，pH7.520.5M氯化鈣、20mMTris，pH7.530.5M氯化鈉、20mMTris，pH7.542.0M精氨酸、20mMTris,pH7.551.5M氯化鈣、20mMTris，pH7.56l.OM精氨酸、20mMTris，pH7.57l.OM氯化鈣、20mMTris，pH7.572.0M精氨酸、20mMTris，pH7.533表13:所用的洗脫和滴定緩沖液列表<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>簡單說來，平衡MabSelectTM蛋白A柱且裝載含有IL-13mAb-2的CHO條件培養(yǎng)基。接著用5CV的中度鹽緩沖液、接著5CV的評估中的洗滌液洗滌所述柱。接著用3CV的低鹽溶液洗滌柱而為洗脫步驟作準備。接著用含有甘氨酸或乙酸作為緩沖物質的溶液(pH3.1)來洗脫經(jīng)結合的產(chǎn)物。接著獨立地用三種不同滴定劑中和此峰值匯集物。用濁度計測量經(jīng)中和的峰值混濁度，通過A280測量產(chǎn)物回收率，且通過ELISA量化HCP含量。本實驗的結果總結于圖6中。在所試驗的每一濃度下和在各種洗脫緩沖液的情況下(參見表13),發(fā)現(xiàn)精氨酸比氯化鈣或氯化鈉更有效地降低酸性和經(jīng)中和的峰值匯集物混濁度。無論酸性匯集物是經(jīng)Tris、HEPES或是咪唑滴定劑中和，這一發(fā)現(xiàn)都是一致的(參見表13)。另外，證明精氨酸洗滌液的作用并不局限于經(jīng)中和的匯集物的最終、離散pH值。在7.5-8.2的pH值范圍內(nèi)(例如7.5、7.7、7.9、8.0、8.1禾B8.2)，經(jīng)中和的峰值混濁度值隨pH值增加而降低。然而，在這一相同范圍內(nèi)，使用精氨酸洗滌液總是產(chǎn)生NTU低于使用氯化鈣的情況。對于所試驗的各賦形劑洗滌液，所裝載產(chǎn)物的回收率均大于95%。HTS數(shù)據(jù)表明通過用大于1.5M的氯化鈣洗滌將會獲得顯著較小的回收率，這正是不試驗這一濃度的原因。所檢測的洗滌液物質不能根據(jù)峰值匯集物中HCP、HMW和蛋白A的最終濃度來區(qū)分。然而，對用l.OM精氨酸洗滌液洗脫的洗滌部分的分析一致揭露HCP的顯著含量。洗滌部分中的HCP含量為約49000卯m,而峰值中僅為約22000ppm。這正是精氨酸洗滌液選擇性去除HCP的證據(jù)。本文所引用的所有參考文獻都以全文引用的方式并入本文中且用于所有目的，所述引用的程度就如同已特定地及個別地將各個公開案、專利案或專利申請案以全文引用的方式并入用于所有目的一般。在以引用的方式并入的公開案和專利或專利申請案與本說明書中所含的揭示內(nèi)容相矛盾的情況下，本說明書希望取代和/或優(yōu)先于任何所述矛盾的材料。本說明書和權利要求書中所用的所有表示成分數(shù)量、反應條件等的數(shù)字應理解為在所有情況下由術語"約"修飾。因此，除非與此相反地指出，否則本說明書和隨附權利要求書中所述的數(shù)值參數(shù)為近似值，其可依設法通過本發(fā)明獲得的所需性質而變化。最低限度且不試圖限制將等同原則應用于權利要求書的范圍，各數(shù)值參數(shù)應根據(jù)有效位數(shù)的數(shù)目和普通舍入方法來解釋。如所屬領域的技術人員將顯而易見的，可在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下對本發(fā)明作出修改和變化。本文所述的具體實施例僅是以實例方式提供且不希望以任何方式施加限制。希望本說明書和實例僅視為示范性的，而本發(fā)明的真實范圍和精神由隨附權利要求書來說明。3權利要求1.一種分離產(chǎn)物的方法，所述方法包含(a)提供包含產(chǎn)物和一或多種雜質的負載流體；(b)使所述負載流體與介質接觸，其中所述介質可在適合于結合所述產(chǎn)物的條件下結合所述產(chǎn)物，由此提供經(jīng)結合的介質；(c)使所述經(jīng)結合的介質與一或多種通過所述經(jīng)結合的介質的洗滌液接觸，其中至少一種洗滌液包含精氨酸，其中精氨酸的濃度不為1M，由此提供經(jīng)洗滌的介質；(d)在適合于洗脫所述產(chǎn)物的條件下使所述經(jīng)洗滌的介質與洗脫液接觸；和(e)收集包含所述產(chǎn)物的洗脫物。2.—種分離產(chǎn)物的方法，所述方法包含-(a)提供包含產(chǎn)物和一或多種雜質的負載流體；(b)使所述負載流體與介質接觸，其中所述介質可在適合于結合所述產(chǎn)物的條件下結合所述產(chǎn)物，由此提供經(jīng)結合的介質；(c)使所述經(jīng)結合的介質與一或多種通過所述經(jīng)結合的介質的洗滌液接觸，其中至少一種洗滌液包含精氨酸，其中精氨酸的濃度為約0.1M到約0.9M,由此提供經(jīng)洗滌的介質；(d)在適合于洗脫所述產(chǎn)物的條件下使所述經(jīng)洗滌的介質與洗脫液接觸；和(e)收集包含所述產(chǎn)物的洗脫物。3.—種分離產(chǎn)物的方法，所述方法包含(a)提供包含產(chǎn)物和一或多種雜質的負載流體；(b)使所述負載流體與介質接觸，其中所述介質可在適合于結合所述產(chǎn)物的條件下結合所述產(chǎn)物，由此提供經(jīng)結合的介質；(c)使所述經(jīng)結合的介質與一或多種通過所述經(jīng)結合的介質的洗滌液接觸，其中至少一種洗滌液包含精氨酸，其中精氨酸的濃度為約1.1M到約2.0M，由此提供經(jīng)洗滌的介質；(d)在適合于洗脫所述產(chǎn)物的條件下使所述經(jīng)洗滌的介質與洗脫液接觸；和(e)收集包含所述產(chǎn)物的洗脫物。4.一種分離產(chǎn)物的方法，所述方法包含(a)提供包含產(chǎn)物和一或多種雜質的負載流體；(b)使所述負載流體與介質接觸，其中所述介質可在適合于結合所述產(chǎn)物的條件下結合所述產(chǎn)物，由此提供經(jīng)結合的介質；(c)使所述經(jīng)結合的介質與一或多種通過所述經(jīng)結合的介質的洗滌液接觸，其中至少一種洗滌液包含精氨酸衍生物，由此提供經(jīng)洗滌的介質；(d)在適合于洗脫所述產(chǎn)物的條件下使所述經(jīng)洗滌的介質與洗脫液接觸；和(e)收集包含所述產(chǎn)物的洗脫物。5.根據(jù)權利要求l-4中任一權利要求所述的方法，其中所述產(chǎn)物為蛋白質。6.根據(jù)權利要求1-4中任一權利要求所述的方法，其中所述產(chǎn)物為抗體。7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述抗體對于生長和分化因子-8(GDF-8)具特異性。8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述抗體對于白細胞介素-13(IL-13)具特異性。9.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述抗體對于白細胞介素-22(IL-22)具特異性。10.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述抗體對于晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)具特異性。11.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述抗體對于A-(3具特異性。12.根據(jù)權利要求l-4中任一權利要求所述的方法，其中所述產(chǎn)物為抗原結合片段。13.根據(jù)權利要求1-4中任一權利要求所述的方法，其中所述產(chǎn)物為Ig-融合蛋白。14.根據(jù)權利要求1-4中任一權利要求所述的方法，其中所述產(chǎn)物為融合蛋白、含F(xiàn)c蛋白、免疫結合物、細胞因子、白細胞介素、激素或治療性酶。15.根據(jù)權利要求l-14中任一權利要求所述的方法，其中所述介質為蛋白A色譜柱。16.根據(jù)權利要求l-14中任一權利要求所述的方法，其中所述介質為蛋白G色譜柱。17.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中所述洗漆液中的所述精氨酸衍生物的濃度為約0.1M到約2.0M。18.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述洗滌液中的精氨酸的濃度為約0.1M到約0.9M。19.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述洗滌液中的精氨酸的濃度為約1.1M到約2.0M。20.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中所述洗滌液中的精氨酸的濃度為約0.5M。21.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中所述精氨酸衍生物為乙酰精氨酸、胍丁胺、羥基精氨酸(arginicacid)、N-a-丁?；?L-精氨酸或N-a-特戊?；彼?。22.根據(jù)權利要求1-21中任一權利要求所述的方法，其中所述洗滌液的pH值為約4.5到約8.0。23.根據(jù)權利要求1-21中任一權利要求所述的方法，其中所述洗滌液的pH值為大于4.5且小于約8.0。24.根據(jù)權利要求1-21中任一權利要求所述的方法，其中所述洗滌液的pH值為約7.5。25.根據(jù)權利要求1-24中任一權利要求所述的方法，其中所述雜質中的一或多者為宿主細胞蛋白、核酸、產(chǎn)物變異體、內(nèi)毒素、蛋白A或蛋白G。26.根據(jù)權利要求1-24中任一權利要求所述的方法，其中所述雜質中的一或多者為病毒或其片段。27.根據(jù)權利要求1-26中任一權利要求所述的方法，其中所述洗脫液包含氯化鈉、精氨酸或精氨酸衍生物、甘氨酸、HEPES和乙酸中的至少一種。28.根據(jù)權利要求1-27中任一權利要求所述的方法，其中所述洗脫液具有介于約2與約4之間的pH值。29.根據(jù)權利要求1-28中任一權利要求所述的方法，其中所述洗脫物包含經(jīng)分離的產(chǎn)物且與洗滌液中使用小于約0.1M的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，所述經(jīng)分離的產(chǎn)物的純度增加。30.根據(jù)權利要求1-28中任一權利要求所述的方法，其中所述洗脫物包含經(jīng)分離的產(chǎn)物，且與洗滌液中不使用可檢測量的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，其中所述產(chǎn)物與至少一種雜質的比率增加。31.根據(jù)權利要求1-28中任一權利要求所述的方法，其中所述洗脫物包含產(chǎn)物，且與洗滌液中使用小于約0.1M的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，其中所述產(chǎn)物與宿主細胞蛋白的比率增加。32.根據(jù)權利要求1-28中任一權利要求所述的方法，其中所述洗脫物包含產(chǎn)物，且與洗滌液中不使用可檢測量的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，其中所述產(chǎn)物與宿主細胞蛋白的比率增加。33.根據(jù)權利要求1-32中任一權利要求所述的方法，與洗滌液中使用小于約0.1M的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，其中所述洗脫物的混濁度降低。34.根據(jù)權利要求1-32中任一權利要求所述的方法，與洗滌液中不使用可檢測量的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，其中所述洗脫物的混濁度降低。35.根據(jù)權利要求1-34中任一權利要求所述的方法，其中將所述洗脫物中的所述產(chǎn)物進一步純化和/或調配以供治療使用。36.—種產(chǎn)物，其是通過根據(jù)權利要求1-35中任一權利要求所述的方法而制備。37.根據(jù)權利要求1-35中任一權利要求所述的方法，其中在步驟(a)中至少一種雜質與所述產(chǎn)物結合且在步驟(c)中使所述經(jīng)結合的介質與一或多種通過所述經(jīng)結合的介質的洗滌液接觸，從而去除所述至少一種與所述產(chǎn)物結合的雜質。38.—種分離抗體的方法，所述方法包含(a)提供包含所述抗體和一或多種雜質的負載流體；(b)使所述負載流體與蛋白A介質或蛋白G介質接觸，其中所述介質可在適合于結合所述抗體的條件下結合所述抗體，由此提供經(jīng)結合的介質；(c)使所述經(jīng)結合的介質與一或多種洗滌液接觸，其中至少一種洗滌液包含精氨酸或精氨酸衍生物，其中精氨酸的濃度不為1M，由此提供經(jīng)洗滌的介質；(d)在適合于洗脫所述抗體的條件下使所述經(jīng)洗滌的介質與洗脫液接觸；和(e)收集包含所述抗體的洗脫物，其中與洗滌液中不使用可檢測量的精氨酸的相應方法中所回收的洗脫物相比，所述洗脫物中的所述抗體與宿主細胞蛋白的比率增加且其中所述洗脫物具有降低的混濁度。39.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中在步驟(c)中所述洗滌液的pH值為約4.5到約8.0。40.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中所述洗漆液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約0.1M到約0.9M。41.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中所述洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約1.1M到約2.0M。42.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中所述洗滌液中的精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約0.5M。43.—種降低包含產(chǎn)物的洗脫物混濁度的方法，所述方法包含(a)提供包含所述產(chǎn)物和一或多種雜質的負載流體；(b)使所述負載流體與介質接觸，其中所述介質可在適合于結合所述產(chǎn)物的條件下結合所述產(chǎn)物，由此提供經(jīng)結合的介質；(c)使所述經(jīng)結合的介質與一或多種洗滌液接觸，其中至少一種洗滌液包含精氨酸或精氨酸衍生物，其中精氨酸的濃度不為1M，由此提供經(jīng)洗滌的介質；(d)在適合于洗脫所述產(chǎn)物的條件下使所述經(jīng)洗滌的介質與洗脫液接觸，由此產(chǎn)生包含所述產(chǎn)物的洗脫物；和(e)中和所述洗脫物，其中與洗滌液中不使用可檢測到的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，所述洗脫物具有降低的混濁度。44.根據(jù)權利要求43所述的方法，其中所述經(jīng)中和的洗脫物的pH值介于約6.5與約8.2之間。45.根據(jù)權利要求43或44所述的方法，其中在步驟(c)中所述洗滌液包含濃度為約0.1M到約2.0M的所述精氨酸衍生物。46.根據(jù)權利要求43或44所述的方法，其中在步驟(c)中所述洗滌液包含濃度為約0.1M到約0.9M的精氨酸或精氨酸衍生物。47.根據(jù)權利要求43或44所述的方法，其中在步驟(c)中所述洗滌液包含濃度為約1.1M到約2.0M的精氨酸或精氨酸衍生物。48.根據(jù)權利要求43或44所述的方法，其中在步驟(c)中所述洗滌液包含濃度為約0.5M的精氨酸或精氨酸衍生物。49.根據(jù)權利要求43-48中任一權利要求所述的方法，其中所述洗滌液的pH值為約4.5到約8.0。50.根據(jù)權利要求43-49中任一權利要求所述的方法，其中所述方法并不包含陰離子上游吸附過濾。51.—種降低包含產(chǎn)物的洗脫物混濁度和減少雜質的方法，所述方法包含(a)提供包含所述產(chǎn)物和一或多種雜質的負載流體；(b)使所述負載流體與介質接觸，其中所述介質可在適合于結合所述產(chǎn)物的條件下結合所述產(chǎn)物，由此提供經(jīng)結合的介質；(c)使所述經(jīng)結合的介質與一或多種洗滌液接觸，其中至少一種洗滌液包含精氨酸或精氨酸衍生物，其中精氨酸的濃度不為1M，由此提供經(jīng)洗滌的介質；(d)在適合于洗脫所述產(chǎn)物的條件下使所述經(jīng)洗滌的介質與洗脫液接觸，由此產(chǎn)生包含所述產(chǎn)物的洗脫物；和(e)中和所述洗脫物，其中與洗滌液中不使用可檢測到的精氨酸或精氨酸衍生物的相應方法相比，所述洗脫物中的所述產(chǎn)物與至少一種雜質的比率增加且所述洗脫物具有降低的混濁度。52.根據(jù)權利要求51所述的方法，其中在步驟(c)中所述洗滌液中的所述精氨酸衍生物的濃度為約0.1M到約2.0M。53.根據(jù)權利要求51所述的方法，其中在步驟(c)中所述洗滌液中的所述精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約0.1M到約0.9M。54.根據(jù)權利要求51所述的方法，其中在步驟(c)中所述洗滌液中的所述精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約1.1M到約2.0M。55.根據(jù)權利要求51所述的方法，其中在步驟(c)中所述洗滌液中的所述精氨酸或精氨酸衍生物的濃度為約0.5M。56.根據(jù)權利要求51-55中任一權利要求所述的方法，其中所述洗滌液的pH值為約4.5到約8.0。57.根據(jù)權利要求51-56中任一權利要求所述的方法，其中所述方法并不包含陰離子上游吸附過濾。58.—種分離產(chǎn)物的方法，所述方法包含(a)提供包含產(chǎn)物和一或多種雜質的負載流體；(b)使所述負載流體與介質接觸，其中所述介質可在適合于結合所述產(chǎn)物的條件下結合所述產(chǎn)物，由此提供經(jīng)結合的介質；(c)使所述經(jīng)結合的介質與一或多種通過所述經(jīng)結合的介質的洗滌液接觸，其中至少一種洗滌液包含精氨酸，其中精氨酸或精氨酸衍生物的濃度大于l.OM，由此提供經(jīng)洗滌的介質；(d)在適合于洗脫所述產(chǎn)物的條件下使所述經(jīng)洗滌的介質與洗脫液接觸；和(e)收集包含所述產(chǎn)物的洗脫物。59.—種分離產(chǎn)物的方法，所述方法包含(a)提供包含產(chǎn)物和一或多種雜質的負載流體；(b)使所述負載流體與介質接觸，其中所述介質可在適合于結合所述產(chǎn)物的條件下結合所述產(chǎn)物，由此提供經(jīng)結合的介質；(c)使所述經(jīng)結合的介質與一或多種通過所述經(jīng)結合的介質的洗滌液接觸，其中至少一種洗滌液包含精氨酸，其中精氨酸或精氨酸衍生物的濃度小于l.OM，由此提供經(jīng)洗滌的介質；(d)在適合于洗脫所述產(chǎn)物的條件下使所述經(jīng)洗滌的介質與洗脫液接觸，和(e)收集包含所述產(chǎn)物的洗脫物。60.根據(jù)權利要求37到59中任一權利要求所述的方法，其中將所述洗脫物中的所述產(chǎn)物進一步純化和/或調配以供治療使用。全文摘要本發(fā)明涉及從包含產(chǎn)物和一或多種雜質的負載流體分離所述產(chǎn)物和/或降低混濁度和/或減少雜質的方法，所述方法是利用使所述負載流體通過介質，接著通過至少一種包含精氨酸或精氨酸衍生物的洗滌液，且使用洗脫液收集產(chǎn)物。本發(fā)明進一步涉及一種使用如本文所述的方法制備的產(chǎn)物。文檔編號A61K39/395GK101511387SQ200780032985公開日2009年8月19日申請日期2007年9月7日優(yōu)先權日2006年9月8日發(fā)明者克里斯托弗·加洛,孫淑君申請人:惠氏公司