專利名稱：：用于毒素的腸吸附和處理的包含鋁硅酸鈣粘土的組合物的制作方法用于毒素的腸吸附和處理的包含鋁硅酸鈞粘土的組合物本申請(qǐng)要求2006年6月27日提交的、發(fā)明名稱為"在具有肝細(xì)胞癌和急性黃曲霉毒素中毒風(fēng)險(xiǎn)的人群中用于黃曲霉毒素的腸吸附和處理的組合物及方法"的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/816,824的優(yōu)先權(quán)，其4^P內(nèi)^if過(guò)參考并入本文。聯(lián)邦資助研究所得發(fā)明的權(quán)利聲明本發(fā)明的研究來(lái)自NIH、USDA和USAID的聯(lián)邦經(jīng)費(fèi)或資助(NIHP42-ES04917,USDAAnimalHealthGrant9700579，USAIDLAG畫(huà)G"00誦96-90013"00，TAESH6215以及NIHCenterGrantES09106)。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明一般地涉及用于降低系統(tǒng)中毒素的生物利用度和毒性/致癌性的基于粘土的吸附劑組合物以及方法，其通過(guò)在胃腸道中螯合這些毒素(即腸吸附)來(lái)實(shí)現(xiàn)。更具體地，描述了口服組合物，其用作腸吸附劑治療以減輕黃曲霉毒素對(duì)具有黃曲霉毒素中毒和肝癌風(fēng)險(xiǎn)的人群的不良效應(yīng)(急性的和慢性的)。這種風(fēng)險(xiǎn)的提高來(lái)自飲食中頻繁的和高水平的黃曲霉毒素暴露。所述組合物包含有效量的經(jīng)加工的粉劑形式鋁硅酸釣粘土。該經(jīng)加工的鋁硅酸釣粘土具有低于EPA、JECFA和WHO所推薦的人體每日可容許攝入量的四氯二苯并對(duì)二噁英(TCDD)和優(yōu)先有^T屬污染(prioritytoxicmetalcontamination)。該組合物和方法被用作口月艮治療的一部分。另外，本發(fā)明的粘土不干擾所治療系統(tǒng)或介質(zhì)對(duì)天然存在于飲食中的重要維生素及其他微量營(yíng)養(yǎng)素的利用。本發(fā)明的經(jīng)加工粘土在胃腸道中以高親和力和大容量?jī)?yōu)先地結(jié)合黃曲霉毒素，導(dǎo)致暴露顯著減少(才艮據(jù)黃曲霉毒素特異性生物標(biāo)志物來(lái)測(cè)定)。對(duì)來(lái)自受污染飲食的黃曲霉毒素暴露的減少可降低由這些毒物所致的患病和死亡的風(fēng)險(xiǎn)。黃曲霉毒素14^_對(duì)動(dòng)物和人所食用食物的質(zhì)量和安全問(wèn)題的關(guān)切已引發(fā)人們對(duì)與黃曲霉毒素化學(xué)物相關(guān)的重要危險(xiǎn)的持續(xù)關(guān)注。在歷史上，食物中的黃曲霉毒素問(wèn)M由來(lái)已久、難以避免并且似乎是無(wú)法解決的。黃曲霉毒素(Af)是霉菌生長(zhǎng)的有害副產(chǎn)品，對(duì)人和動(dòng)物可能是致命的。重要的是，黃曲霉毒素是熱穩(wěn)定的，能承受多種食品加工工序，并成為大多數(shù)食物(特別是來(lái)源于玉米和花生的那些食物)的污染物。黃曲霉毒素Bi(AfB》是四種天然黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的(圖1)，它是一種直接作用的誘變劑并已顯示破壞參與致癌作用和肺瘤抑制的基因。它在體內(nèi)與DNA反應(yīng)得到作為主要黃曲霉毒素-DNA加合物的反式-8，9-二氫-8-(N:quanyl)-9-羥基-黃曲霉毒素它與乙型肝炎病毒感染均已成為肝細(xì)胞癌(HCC)的可能誘因。黃曲霉毒素Bi還顯示出免疫毒性和抗?fàn)I養(yǎng)性。在美國(guó)，人所食用食物中Af的作用水平已被設(shè)定為20ppb。最近在肯尼亞爆發(fā)的黃曲霉毒素中毒涉及食用含有高達(dá)8,000ppb水平的食物，il^明迫切需要用于減輕處于黃曲霉毒素中毒高風(fēng)險(xiǎn)人群中急性黃曲霉毒素中毒的治療方案。^41_干旱是真菌感染和黃曲霉毒素產(chǎn)生增加的常見(jiàn)原因。這在M中國(guó)家(赤道南北綽40。)尤為明顯，在這些國(guó)家中人和動(dòng)物飲食中的黃曲霉毒素基本上得不到監(jiān)控。這個(gè)問(wèn)題對(duì)最貧困的A^造成影響，因?yàn)樗麄冏钣锌赡苁秤帽稽S曲霉毒素污染的食物并遭受包括疾病和急性死亡的后果。因此，減輕人和動(dòng)物中黃曲霉毒素中毒的飲食干預(yù)和治療是當(dāng)務(wù)之急；利用可食用蒙脫石粘土作為黃曲霉毒素腸吸附劑可提##對(duì)該問(wèn)題的實(shí)用且低成本高效的方法。調(diào)節(jié)黃曲霉毒素代謝的化學(xué)預(yù)防策略避免食用黃曲霉毒素污染的食物可顯著降低系統(tǒng)、介質(zhì)或受試者中急性或慢性黃曲霉毒素中毒的風(fēng)險(xiǎn)；然而，在iL艮中國(guó)家，改變飲食通常是行不通的。解決該問(wèn)題的一個(gè)方法是在高風(fēng)險(xiǎn)人群中進(jìn)行化學(xué)預(yù)防。該策略包括利用天然的或合成的藥劑來(lái)阻斷、延遲、逆轉(zhuǎn)或調(diào)節(jié)致癌過(guò)程。已經(jīng)研究了許多化學(xué)預(yù)防藥劑，其中某些為人飲食中的天然成分(例如在水果和蔬菜中發(fā)現(xiàn)的那些成分)。這些成分中的某些已顯示出抗多種致癌物質(zhì)的保護(hù)效力；然而，它們大多數(shù)在營(yíng)養(yǎng)均衡的膳食中含量很低，并且不易被胃腸道所吸收。在中國(guó)，已研究了抗血吸蟲(chóng)藥奧f^f拉(oltipraz)作為化學(xué)預(yù)防劑對(duì)暴露于飲食黃曲霉毒素的系統(tǒng)或受試者的用途。在臨床試驗(yàn)中，研究人員已證明奧M4M1高了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶所介導(dǎo)的黃曲霉毒素8，9-環(huán)氧化物綴合，并抑制細(xì)胞色素P4501A2的活性。另一些工作已顯示，奧^f扭&可通過(guò)提高p53水平來(lái)抑制乙型肝炎病毒(HBV)的轉(zhuǎn)錄，這同樣也有利于HCC化學(xué)預(yù)防。天然產(chǎn)物例如葉綠酸也可用于吸附黃曲霉毒素，并減少毒素到達(dá)肝臟的量。葉綠酸是人飲食的組成部分，已發(fā)現(xiàn)它在幾個(gè)動(dòng)物模型中是有效的抗癌物質(zhì)。認(rèn)為葉綠酸增強(qiáng)代謝并通過(guò)與致癌物質(zhì)(例如AffiJ結(jié)合而作為攔截分子起作用，從而減少了生物利用度。在一例中國(guó)的臨床試驗(yàn)中，將參與者隨機(jī)分成兩個(gè)組，在四個(gè)月中分別一天三次地給予100mg葉綠酸或安慰劑。與服用安慰劑組相比，每餐服用葉綠酸使黃曲霉毒素-N7-鳥(niǎo)噪呤加合物的尿中值水平(medianurinarylevel)總體減少55%(Egner等，2001)。將這些化合物擴(kuò)展用于人尚需認(rèn)真進(jìn)行評(píng)估，這包括對(duì)酶調(diào)節(jié)的長(zhǎng)期效應(yīng)以及對(duì)來(lái)自飲食的必需營(yíng)養(yǎng)物之吸收的潛在干擾。源自綠茶的多酚類作為用于HCC高風(fēng)險(xiǎn)人群的可能干預(yù)手段也正在研究中。在多種動(dòng)物模型中的不同器官部位，這些化合物均是高效的抗癌化學(xué)預(yù)防劑。研究已表明，綠茶通過(guò)調(diào)節(jié)Af^代謝來(lái)抑制大鼠中AffiJ斤誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生。使用B6C3F1小鼠的另一些研究顯示，施用綠茶(水中3%)可防止由狄氏劑誘導(dǎo)的肝局灶性損傷擴(kuò)大。綠茶輔助治療還造成小鼠肝局灶性損傷中凋亡指數(shù)增加。在人中，也觀察到了綠茶服用水平與癌癥發(fā)病的發(fā)生和/或時(shí)間之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系。減少黃曲霉毒素生物利用度的食用粘土干預(yù)自傳統(tǒng)人類社會(huì)以來(lái)，有關(guān)食用粘土(食土癬)的記錄已達(dá)數(shù)個(gè)fr紀(jì)，并且其在非洲和中國(guó)是"文化上可接受的"。我們實(shí)驗(yàn)室使用多種動(dòng)物模型已揭示鈣蒙脫石粘土可有效地防止食用黃曲霉毒素引起的不良效應(yīng)。通it^t飲食中加入多種結(jié)合劑或吸附劑來(lái)減少食源性接觸真菌毒素的策略已得到相當(dāng)?shù)年P(guān)注。早在1979年，有報(bào)道稱吸附劑粘土礦物與液體中的黃曲霉毒素Bi結(jié)合。另夕卜，發(fā)現(xiàn)用于加工芥花籽油的漂白粘土減弱了T-2毒素的作用。對(duì)飲食中黃曲霉毒素的HSCAS腸吸附劑干預(yù)在最初的黃曲霉毒素腸吸附劑的研究中，有報(bào)道稱HSCAS(HSCAS)——作為動(dòng)物飼料抗結(jié)塊添加劑出售的鈣蒙脫石粘土一一在水溶液中以高親和力和大容量吸附黃曲霉毒素B"并且挽救了受飲食中7,500ppb黃曲霉毒素毒性影響的肉仔雞和來(lái)亨雞仔雞。自從這些早期研究以來(lái)，HSCAS及其他類似的蒙脫石和膨潤(rùn)土已被報(bào)道在多種動(dòng)物幼仔(包括嚙齒動(dòng)物、雞雛、火雞雛、鴨雛、羔羊、豬、貂和鱒魚(yú))中降低了黃曲霉毒素的作用。HSCAS還已經(jīng)顯示出在家禽、大鼠和豬中降低放射性標(biāo)記的黃曲霉毒素的生物利用度，并減少黃曲霉毒素殘留(圖2)。在飲食中加入HSCAS還減少了來(lái)自泌乳牛和山羊的乳中黃曲霉毒素]V^的水平。HSCAS吸附黃曲霉毒素的分子機(jī)制和熱力學(xué)對(duì)Affit吸附在HSCAS表面上的認(rèn)識(shí)來(lái)自于以下觀察某些黃曲霉毒素類似物之間的立體化學(xué)差異導(dǎo)致對(duì)結(jié)合緊度的顯著影響(即使羰基官能團(tuán)是相同的)。這些結(jié)果還提示，黃曲霉毒素吸附在HSCAS上的分子機(jī)制可能有利于呋喃背向表面排列的最佳朝向?；谖降臒崃W(xué)以及估計(jì)的吸附熱(焓)約40kJ/mol，Affii與HSCAS牢固地結(jié)合?？山忉屵@些結(jié)果的可能的化學(xué)反應(yīng)是電子供體受體(EDA)機(jī)制。該機(jī)制涉及將來(lái)自粘土負(fù)電表面的電子與部分帶正電的所吸附分子中原子共享。黃曲霉毒素中包含二叛基系統(tǒng)的^i部分帶正電的(缺電子的)，并且也已顯示對(duì)吸附過(guò)程是必需的。當(dāng)用每個(gè)配體之羰基官能團(tuán)碳的部分電荷的總和對(duì)結(jié)合強(qiáng)度作圖時(shí)，存在顯著的相關(guān)性。當(dāng)從測(cè)試化合物組中除去分子中與二氫呋喃官能團(tuán)相對(duì)的一側(cè)上不是平面的配體時(shí)，相關(guān)性顯著提高。來(lái)自具有立體化學(xué)限制性基團(tuán)的化合物的干擾也可對(duì)吸附過(guò)程起重要作用。對(duì)于包含使其大于Affii的官能團(tuán)的類似物來(lái)說(shuō)，其在粘土表面上的插入、錨定和吸附而將中間層槽(interplayerchannel)隔開(kāi)的現(xiàn)象可能受到限制。HSCAS對(duì)黃曲霉毒素的特異性研究支持下述結(jié)論:HSCAS在0.5%(重量/重量)或更低的水平(針對(duì)動(dòng)物飼料中抗結(jié)塊活性的推薦水平)下對(duì)飲食中水平的黃曲霉毒素具有明顯偏好(和容量)。例如，在家禽飲食中0.5%水平的HSCAS不削弱對(duì)肌醇六磷酸鹽或無(wú)機(jī)磷的利用。在其它的家禽營(yíng)養(yǎng)研究中，加入0.5%濃度的HSCAS不削弱對(duì)核黃素、維生素A、錳或鋅的利用。同樣，在早先的研究中，已顯示HSCAS(0.5%的加入比例)保護(hù)仔雞抵抗很高水平的黃曲霉毒素(即7,500ppb)。雖然基于粘土的干預(yù)對(duì)黃曲霉毒素明顯奏效，M沒(méi)有用于其它重要真菌毒素的類似技術(shù)。這在很大程度上是因?yàn)?，未?jīng)改良的NS粘土不與其它結(jié)構(gòu)多樣的真菌毒素(例如玉米赤霉烯酮、脫ltA萎鐮菌醇、T-2毒素、赭曲毒素A、環(huán)匹阿尼酸(cyclopiazonic)、麥角胺和串珠鐮孢毒素)"緊密地"結(jié)合，當(dāng)包含在動(dòng)物飲食中時(shí)它們也不顯著防止這些真菌毒素的不良效應(yīng)。例如，在家禽中針對(duì)真菌毒素(除黃曲霉毒素以外)的腸p及附劑研究中，在飲食中加入HSCAS不顯著地防止環(huán)匹阿尼酸、T-2毒素、蛇形菌素、赭曲毒素A和串珠鐮孢毒素的不良效應(yīng)。在喂飼赤霉烯酮的貂中使用粘土有助于減輕某些胎兒毒性，但不降低高雌激素效應(yīng)。同樣，在飲食中加入0.5和1.0%(重量/重量)的粘土不影響暴露于脫IU^萎鐮菌醇的豬的平均每曰體重增加。在該研究中，減少脫氧瓜萎鐮菌醇毒性的唯一有效方法是用未污染的玉米稀釋污染的玉米。還研究了向家畜飲食中補(bǔ)充HSCAS以防止羊茅中毒的可能性。盡管體外實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)麥角胺與蒙脫石粘土在水溶液中結(jié)合良好，但是HSCAS(2.0%(重量)水平)不保護(hù)大鼠或綿羊免受羊茅中毒。為了進(jìn)一步!HtHSCAS對(duì)Af^的特異性，開(kāi)發(fā)了如下方案將HSCAS在石英表面上形成納米結(jié)構(gòu)薄膜并使用所得到的復(fù)合材料作為針對(duì)污染介質(zhì)中黃曲霉毒素的親和探針。我們的發(fā)現(xiàn)提示，該復(fù)合介質(zhì)(當(dāng)包裝在潔凈的小玻璃柱中時(shí))與VICAM的Aflatest親和柱的選擇性是相當(dāng)?shù)?。HSCAS的長(zhǎng)期動(dòng)物研究在最初的使用HSCAS的短期動(dòng)物研究中，在飲食中攝取粘土后未報(bào)道有可觀察到的副作用。在最近的研究中，Sprague-Dawley(S-D)大鼠在孕期全程中在飲食中攝取濃度高達(dá)2.0%的HSCAS，母體和胎兒均未顯示毒性，并且在多種組織中也不顯示顯著的微量金屬生物利用度。還使用嚙齒動(dòng)物模型來(lái)評(píng)估通過(guò)飲食慢性暴露于HSCAS的相對(duì)安全性。該研究涉及在6.5個(gè)月期間隨意用定量含有0、0.25、0.5、1.0和2.0o/o水平的NS粘土飼喂的雌性和雄性Sprague-Dawley大鼠。該研究的結(jié)M明，用飲食中的0.25-2%NS粘土處理的大鼠在體重增加、飼料轉(zhuǎn)化率、相對(duì)器官重量、主要器官的粗略解剖和組織學(xué)外觀、血液學(xué)和血清生物化學(xué)^lt方面不顯示劑量依賴的或HSCAS相關(guān)的副作用。另外，所選必需營(yíng)養(yǎng)物(包括維生素A和E、鐵和鋅)未受影響。這些發(fā)現(xiàn)提示，用HSCAS進(jìn)行腸吸附劑治療或飲食干預(yù)可能是在高風(fēng)險(xiǎn)A^中處理黃曲霉毒素中毒的可能選擇。在系統(tǒng)或受試者中使用HSCAS的不良效應(yīng)試驗(yàn)基于嚙齒動(dòng)物的長(zhǎng)期研究，在健康的人類志愿者中進(jìn)行HSCAS的兩周短期安全性評(píng)估。該I期不良效應(yīng)試驗(yàn)意在確定受試者中HSCAS的短期安全性和耐受性。在包封前，分析HSCAS中多種環(huán)境污染物的濃度，包括二噁英/呋喃和重金屬，以確保符合美國(guó)聯(lián)邦政府標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(表l)。例如，HSCAS的衍生劑量中重金屬污染量要低于聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JointFAO/WHOExpertCommissiononFoodAdditives,JECFA)的標(biāo)準(zhǔn)。更具體地，每日3gHSCAS的衍生劑量中等同于的鈷、鉻、鋅、鉬、硒、鎳、汞、鉛、鎘、砷和二噁英(TCDD和OCDD)低于JECFA的標(biāo)準(zhǔn)。HSCAS在包封迎歐嚢前在121'C滅菌。在無(wú)菌4Hf下參照美國(guó)藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(U.S.GoodManufacturingPractices)生產(chǎn)HSCAS膠嚢。在對(duì)人的研究中，整個(gè)方案遵循隨機(jī)化和雙盲的I期臨床試驗(yàn)原則。有總共50個(gè)滿足招募標(biāo)準(zhǔn)的成年人自愿地加入該研究。將他們隨機(jī)分為兩個(gè)研究組。其中低劑量組一天三次服用三個(gè)HSCAS膠嚢(0.5g)，共兩周。高劑量組一天三次服用三個(gè)HSCAS膠嚢(1.0g)，共兩周。所有膠嚢的顏色和大小均一樣。所述兩個(gè)劑量水平由先前已公開(kāi)的動(dòng)物研究推知。結(jié)果表明，該研究中使用的這兩個(gè)HSCAS劑量對(duì)所有研究參與者均是可耐受的。在某些受試者中發(fā)現(xiàn)胃腸副作用，其中1.58組中有24%(6/25)，3.0g組中有28。/。(7/25)。癥狀包括胃氣脹(bloating)、便秘、腹瀉、蒯限(flatulence)以M部不適。低劑量(1.5gHSCAS)組中兩名參與者報(bào)告發(fā)生了某種程度的頭暈，這在高劑量(3.0gNS)組中不明顯。所述的全部癥狀均在服用NS膠嚢后最初的2天中記錄到，而其后沒(méi)有記錄到任何癥狀(或不適)。除了一名參與者以外，其它所有報(bào)告的副作用均認(rèn)定為是輕微的，并且兩個(gè)處理組之間沒(méi)有觀察到顯著差異。該研究的結(jié)果顯示，如生化和血液學(xué)參數(shù)以及身體檢查的分析所證明的，在14天中以1.5-3.0g/天向健康受試人拖用HSCAS膠嚢是相對(duì)安全的。已推測(cè)某些粘土礦物可吸附維生素；然而，在該研究中用任一劑量HSCAS處理后均未觀察到維生素A和E血清水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這一證據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了HSCAS與AF特異性結(jié)合而不與維生素A和E相互作用。所分析的大多數(shù)礦物水平均^MC現(xiàn)顯著差異，只有兩個(gè)例外低劑量組中無(wú);M^濃度較低，以及兩組中鍶濃度均較高。這些發(fā)現(xiàn)的臨床意義尚不可知，在將來(lái)的干預(yù)研究中將繼續(xù)對(duì)其監(jiān)測(cè)。黃曲霉毒素致癌性人肝細(xì)胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的癌癥之一，并且是中國(guó)和非洲某些地區(qū)的主要死亡原因，在這些地區(qū)中乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染以及飲食中接觸黃曲霉毒素被認(rèn)為是主要的病因。在較發(fā)達(dá)的國(guó)家中，充足的糧食供給以及監(jiān)控食物中這些黃曲霉毒素水平的規(guī)定提供了保護(hù)和減少A^接觸黃曲霉毒素的手段。在你硪橫行且沒(méi)有食品質(zhì)量規(guī)定的國(guó)家中，每天暴露于黃曲霉毒素顯著地增加了患HCC及其他人體健康不良效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。在多數(shù)這些情況下，扔掉和/或替換這些真菌毒素污染的食物不是可行的做法。遺憾的是，這樣的生存狀況在21世紀(jì)的今天依然存在，因此減少或消除飲食接觸黃曲霉毒素以改善這些高風(fēng)險(xiǎn)人群的健康狀況和生活品質(zhì)的重要性愈加突出。黃曲霉毒素是多種黃曲霉(Asperg///"*/7flvws)和寄生曲霉(y4sp^^i7/"spflmsiY/ci/s1)菌林產(chǎn)生的二呋喃香豆素衍生物；特別地，黃曲霉是農(nóng)業(yè)中常見(jiàn)的污染物。這些產(chǎn)毒的真菌物種遍布4^界，相比于溫帶的環(huán)境，其在溫暖的亞熱帶和熱帶氣候中更加盛行。谷物、油籽、堅(jiān)果、水果、煙草和許多其它農(nóng)產(chǎn)品的天然污染是經(jīng)常發(fā)生的。在曲霉屬所產(chǎn)生的四種主要的黃曲霉毒素同類物(BpB2、G和G2)中，黃曲霉毒素Bi(AffiJ是最強(qiáng)的致肝癌物質(zhì)并極大地威脅人類健康。肝臟是所攝取的黃曲霉毒素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的主要部位。首先，Af^被細(xì)胞色素P450CYPlA2和CYP3A4所氧化，得到兩種黃曲霉毒素-8，9-環(huán)氧化物立體異構(gòu)體。外環(huán)氧化物(一種高活性中間體)與鳥(niǎo)嘌呤的N7原子反應(yīng)形成促突變DNA加合物——AfBrl^-鳥(niǎo)噤呤。該黃曲霉毒素-DNA加合物是不穩(wěn)定的，并發(fā)生脫嘌呤作用繼而在尿中排泄。該外環(huán)氧化物還能夠與血清白蛋白及其它細(xì)胞蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基結(jié)合.CYP1A2還催化Affii的羥基化作用而產(chǎn)生AfMi(其是人體中主要的黃曲霉毒素代謝產(chǎn)物)，還產(chǎn)生另外的氧化產(chǎn)物例如AfPi和AfQi。這些代謝產(chǎn)物可不經(jīng)過(guò)進(jìn)一步生物轉(zhuǎn)化就被排泄掉，或者它們可通過(guò)UDP-葡糖醛g轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行綴合，然而AflV^不是葡醛酸綴合反應(yīng)(glucuronidation)的底物。黃曲霉毒素-8，9-環(huán)氧化物中間產(chǎn)物也;l谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的底物，其產(chǎn)生在膽汁中排出的穩(wěn)定、無(wú)毒、極性產(chǎn)物。所述黃曲霉毒素-谷胱甘肽產(chǎn)物進(jìn)一步在肝和腎中依序代謝，最終作為3JL^尿酸(黃曲霉毒素-N-乙酰半胱氨酸)在尿中排泄。黃曲霉毒素最初在1993年由國(guó)際癌癥研究W^(InternationalAgencyonResearchinCancer)劃定為人類致癌物質(zhì)，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究表明黃曲霉毒素暴露與HCC之間密切相關(guān)。僅在中國(guó)，HCC每年造成超過(guò)200,000人死亡，是癌癥死亡的第三大主要原因。特別是在中國(guó)東部的江蘇省啟東市，HCC是癌癥死亡的主要原因，并且在某些鄉(xiāng)鎮(zhèn)地區(qū)中占所有成年人死亡的多達(dá)10%。早先有關(guān)黃曲霉毒素暴露與HCC相關(guān)的證據(jù)大都基于對(duì)黃曲霉毒素^X的估計(jì)(如對(duì)污染食物進(jìn)行測(cè)量或者來(lái)自飲食調(diào)查問(wèn)巻)。進(jìn)一步的研究依賴于將測(cè)量尿和血中的多種生物標(biāo)志物作為一種將黃曲霉毒素暴露與HCC發(fā)生相關(guān)聯(lián)的更精確的手段。尿中的AFB-N7鳥(niǎo)嘌呤加合物已被用于許多針對(duì)介質(zhì)、系統(tǒng)或受試者的Affii研究中，作為暴露于黃曲霉毒素的定量指標(biāo)。AfMi是Af^^X后排泄的主要尿代謝產(chǎn)物，其也可用作黃曲霉毒素暴露的線性生物標(biāo)志物。另夕卜，血清中的黃曲霉毒素-白蛋白加合物已被用于長(zhǎng)期暴露估計(jì)。這些黃曲霉毒素特異性生物標(biāo)志物的獲得和應(yīng)用有助于更好地表征高風(fēng)險(xiǎn)人群中人對(duì)黃曲霉毒素的暴露以及敏感度。例如，在二十世紀(jì)九十年代初期上海進(jìn)行的巢式病例對(duì)照生物標(biāo)志物研究顯示了黃曲霉毒素暴露與HCC之間顯著的關(guān)聯(lián)性，并且當(dāng)黃曲霉毒素暴露伴隨慢性乙型肝炎感染時(shí)肝癌風(fēng)險(xiǎn)增加六十倍之多。隨后在臺(tái)灣和啟東的研究也實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。Phillips等人在1993年1月12日授權(quán)的發(fā)明名稱為"溶液中真菌毒素的選擇性固定和檢測(cè)"的美國(guó)專利5，178，832描述了某些礦物、特別是多種天然形式的氧化鋁優(yōu)先從真菌毒素混合物中選擇性結(jié)合選定的真菌毒素。當(dāng)將這些吸附劑與現(xiàn)有技術(shù)的吸附劑以不同組合和/或聯(lián)合使用時(shí)，可以構(gòu)建可分析溶液中真菌毒素的檢測(cè)管并提供對(duì)飼料或食品樣品中真菌毒素濃度的半定量熒光測(cè)定。所述檢測(cè)管包含裝填有選定礦物的分離層的透明管。將來(lái)自可能污染真菌毒素之樣品的溶劑提取物通過(guò)該柱。隨著真菌毒素混合物通過(guò)所述檢測(cè)管并與多種礦物吸附劑接觸，選定的真菌毒素被固定在特定礦物上，而其它真菌毒素和共提取的有機(jī)化合物則通過(guò)該層在隨后的下游礦物層上被固定。通過(guò)在長(zhǎng)波UV光源下檢測(cè)發(fā)光的檢測(cè)管來(lái)確定真菌毒素的存在。Taylor等人在1992年11月24日授權(quán)的發(fā)明名稱為"使動(dòng)物飼料中存在的真菌毒素失活的動(dòng)物飼料添加劑和方法"的美國(guó)專利5,165,946描述了能夠使真菌毒素失活的干固體動(dòng)物飼料組合物。當(dāng)飼料被真菌毒素污染并且與包含能夠使真菌毒素失活的層狀硅酸鹽礦物顆粒的真菌毒素失活劑混合時(shí)，所述混合物質(zhì)增強(qiáng)所述層狀硅酸鹽的真菌毒素失活能力。用于針對(duì)黃曲霉毒素治療的粘土本發(fā)明的基于粘土的組合物可用于結(jié)合與治療對(duì)環(huán)境毒素的暴露、治療急性黃曲霉毒素中毒以及預(yù)防黃曲霉毒素誘發(fā)的肝癌和慢性黃曲霉毒素中毒。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)了解到存在許多不同類型的粘土，并且在人類歷史上對(duì)粘土的用途和應(yīng)用已經(jīng)有充分的記載。粘土是水合硅酸鹽顆粒聚集物的通稱。一般地，粘土由多種層狀硅酸鹽礦物(通常富含硅和鋁的氧化物)和氫氧化物組成。粘土以其小尺寸、呈薄片或分層的形狀、對(duì)水的親和性以及高塑性指數(shù)而不同于土壤中存在的其它小顆粒(例如泥沙)。層狀硅酸鹽粘土主要分為高呤石、蒙脫石-蒙皂石、伊利石和綠泥石。蒙脫石粘土通常作為低硅巖的風(fēng)化產(chǎn)物形成。蒙^5是蒙皂石的一員，12并且是膨潤(rùn)土的主要成分。紋泥(或明顯分層的粘土)是具有可見(jiàn)年層的粘土，其由侵蝕和有機(jī)物含量的季節(jié)性差異形成。這類沉積物在來(lái)自先前水河時(shí)期的冰川湖中很常見(jiàn)。流粘土是一種獨(dú)特類型的海相粘土(marineclay)，它是挪威、加拿大和瑞典的冰蝕地形所特有的。這是一種高靈敏性粘土，易于液化，并已引發(fā)幾次非常危險(xiǎn)的滑坡。粘土的另外的名稱包括HSCAS、Akipula、硅酸鋁、無(wú)7JC珪酸鋁、askipula、貝保蒙脫石(beidelliticmontmorillonite)、benditos、生物電礦物(bioelectricalmineral)、cipula、白堊、粘土灰(claydirt)、粘土塵(claydust)、粘土錠劑(claylozenge)、粘土懸浮產(chǎn)品、粘土片劑、膠體礦物、膠體微量礦物、硅藻土、腐殖頁(yè)巖、印第安愈合粘土(Indianhealingclay)、高冷土、kipula、巖粉(mountainmeal)、panitodelsenor、植物源液體礦物、tirrasanta、雜褐鐵埃洛石(Terrasigillata)、白粘土、白泥等。粘土的醫(yī)藥用途?，F(xiàn)在，粘土已在許多工業(yè)工藝中用于制造磚、烹飪用鍋、藝術(shù)品、餐具、火花塞殼、水泥產(chǎn)品以及化學(xué)過(guò)濾器。根據(jù)民間傳說(shuō)，食用粘土具有許多醫(yī)藥用途，但科學(xué)文^明^某些粘土可能對(duì)食用者有害。粘土的化學(xué)性質(zhì)可使得它們吸附多種可能有害的物質(zhì)。例如，裝有糖果(Jarritos牌Tamarindo糖果)的粘土罐已在美國(guó)被食品和藥物管理局召回，其原因是糖果中含有來(lái)自粘土罐的高水平的鉛。粘土制品可含有不同含量的鋁、砷、鋇、鉛、鎳、4UL其他微量金屬。此外，在農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)的鯰魚(yú)以及用含有密西西比礦山球粘土的飼料飼養(yǎng)的雞所產(chǎn)的蛋中已發(fā)現(xiàn)高水平的2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二噁英。另夕卜，長(zhǎng)期食用粘土可能與微量元素缺乏癥有關(guān)。然而，應(yīng)當(dāng)指出，在制陶工業(yè)中主^f吏用的以及系統(tǒng)或受試者食用的粘土種類是高嶺土(球粘土)。為此，^LA體所攝取的粘土(尤其是高冷土)不應(yīng)含有高水平的有毒物質(zhì)。本發(fā)明的經(jīng)加工粘土可用于治療或預(yù)防黃曲霉毒素毒性。盡管粘土在非洲、印度和中國(guó)以及被美洲土著人用于醫(yī)療已經(jīng)歷了數(shù)個(gè)世紀(jì)，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解，長(zhǎng)期口服攝入某些粘土可能導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。如下所述，科學(xué)界和醫(yī)學(xué)界認(rèn)為這些副作用有可能大大超過(guò)任何可能的益食用泥土、粘土或其它非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的做法可稱為"異食癖"或"食土癬"，常見(jiàn)于幼年以;sj^神障礙或精神病患者。一些證據(jù)證明礦物質(zhì)缺乏(例如鐵缺乏)可導(dǎo)致異食痺，這在it艮中國(guó)家和貧困地區(qū)尤為常見(jiàn)。長(zhǎng)期攝入粘土可導(dǎo)致鐵吸收不良以及加劇此癥狀。對(duì)于將粘土用于任何醫(yī)學(xué)病癥，尚無(wú)充分的科學(xué)證據(jù)進(jìn)行支持或反對(duì)。長(zhǎng)期口服^粘土的潛在副作用有可能大大超過(guò)任何可能的益處。粘土制品可含有不同含量的鋁、砷、鋇、鉛、鎳、仗良其他微量金屬。某些膠體礦物添加物還可能包含非安全濃度的放射性金屬。當(dāng)用于懷孕期或哺乳期的患者時(shí)，或者用于兒童時(shí)，^某些粘土可能是不安全的。某些粘土可具有結(jié)^4f的能力，長(zhǎng)期a^這些粘土與嚴(yán)重的低鉀血癥有關(guān)，特別是在腎功能不全的患者中。已提示，經(jīng)常性食用高嶺土(異食癖或食土癖)可導(dǎo)致鐵吸收不良以及嚴(yán)重缺乏，并可能與貧血和鉛中毒有關(guān)。以下是所才艮道的"異食痺"或"食土癖"的生理問(wèn)題對(duì)某種粘土產(chǎn)生變態(tài)^^應(yīng)/^^:感性，其特征為出現(xiàn)水腫、擴(kuò)張性心肌病、多尿以及死亡。另外，注意到受試者的上下肢皮膚干燥、皮膚潰瘍。神經(jīng)病/CNS:異食癖與兒童發(fā)生鉛中毒有關(guān)，并可帶來(lái)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的風(fēng)險(xiǎn)。在一份病例報(bào)告中，一名6歲女孩在^來(lái)自釉面粘土罐的梓檬汁后死于鉛中毒并發(fā)癥和腦病。埃塞俄比亞的病例對(duì)照研究中報(bào)道，當(dāng)用粘土器具烹調(diào)山黧豆時(shí)，患神經(jīng)型山黨豆中毒(一種引起導(dǎo)致癱瘓的身體痙攣性輕截癱的神經(jīng)退行性不可逆病癥)的風(fēng)險(xiǎn)增加了四倍。精神病習(xí)慣性異食癖可發(fā)生于患有精神疾病(包M神病)的患者中。肺/呼吸在二十世紀(jì)六十年代,有報(bào)道稱有異食痺病史的兒童比健康兒童更易于發(fā)生更頻繁的和嚴(yán)重的呼吸道感染。慢性支氣管炎、呼吸困難和塵肺也與重粘土工業(yè)中的灰塵暴露有關(guān)。心血管有凈艮道稱異食癖與擴(kuò)張性心肌病和死亡有關(guān)。胃腸食用粘土可導(dǎo)致^更秘或腹瀉。還報(bào)道了飯后的胃灼熱、劇限、食欲不振和嘔吐。食用粘土還與引起腸穿孔的腸梗阻和壞死性小腸兒童中發(fā)現(xiàn)結(jié)腸結(jié)石。食土痺也與肝脾大有關(guān)。腎粘土具有結(jié)合鉀的能力,長(zhǎng)期^V粘土與嚴(yán)重的低鉀血癥有關(guān)，特別是在腎功能不全的患者中，而在接受血液透析的患者中卻尚未發(fā)現(xiàn)。內(nèi)分泌在一個(gè)^UV大量粘土的病例報(bào)告中已報(bào)道由嚴(yán)重低鉀血癥引起的肌病。泌尿生殖長(zhǎng)期食用粘土與多尿和緊迫性尿失禁以及性腺功能減退有關(guān)。血液學(xué)異食癖可導(dǎo)致鐵吸收不良以及嚴(yán)重缺乏，并與貧血有關(guān)。肌骨胳長(zhǎng)期攝入粘土與肌炎有關(guān)。已報(bào)道大量粘土攝入導(dǎo)致由嚴(yán)重低鉀血癥引起的肌病。感染性疾病粘土^A還與鉤蟲(chóng)感染有關(guān)。已報(bào)道，在食用粘土的嬰兒中以;sj^帶被粘土包覆的新生兒中感染來(lái)自粘土的破傷風(fēng)。鐵、鈣、鎂某些粘土可作為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。這些粘土中的鉀和鎂可與鐵良生交換，由于形成不溶的鐵^^物使鐵難以利用?？砂l(fā)生鐵缺乏，并且鉀或鎂的水平可提高。鉀某些粘土具有結(jié)合鉀的能力，并與低鉀血癥有關(guān)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可理解，對(duì)于將某些粘土用于醫(yī)學(xué)用途，文獻(xiàn)中尚無(wú)充分的科學(xué)和臨床證據(jù)進(jìn)行支持或反對(duì)，然而，當(dāng)前醫(yī)學(xué)中的實(shí)例傾向于教導(dǎo)不要將使用粘土作為黃曲霉毒素中毒患者或易患肝癌患者的安全治療。本發(fā)明的方法和組合物應(yīng)用通常不被系統(tǒng)/受試者食用、或用于陶瓷餐炊器具制造的經(jīng)分離粘土組合物。本發(fā)明的經(jīng)加工粘土具有特別的化學(xué)組成，當(dāng)口服施用時(shí)其不會(huì)對(duì)健康造成有害影響(基于對(duì)人和動(dòng)物的廣泛的科學(xué)研究)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一方面是口服組合物，其用作在受試者中減輕環(huán)境毒素(特別是黃曲霉毒素)所污染食物之效應(yīng)的預(yù)防性治療，所述受試者由于暴露于高水平黃曲霉毒素而具有發(fā)生肝癌和黃曲霉毒素中毒的風(fēng)險(xiǎn)。所述組合物包含有效量的經(jīng)加工的粉末形式鋁硅酸鉀粘土，其中所述經(jīng)加工的鋁珪酸釣粘土含有低于EPA、JECFA和WHO推薦的人體每日可容許^量的四氯二苯并對(duì)二噁英(TCDD)和優(yōu)先有4^屬污染。此外，該粘土對(duì)黃曲霉毒素具有大容量和高親和力。所述經(jīng)加工的鋁硅酸釣粘土具有的化學(xué)組成包含高于3.2%的CaO;4.0-5.4%的MgO;5.4-6.5的Fe203;0.50-0.卯%的K20;0.10-0.30%的Na20;0.01-0.03%的MnO;14.8-18.2%的A1203;62.4-73.5%的Si02;其中，該化學(xué)組成以重量百分比給出。優(yōu)選的經(jīng)加工鋁珪酸釣粘土具有小于80微米的平均粒徑以及5~9的pH值。本發(fā)明的第二方面是減輕受試者中食源性黃曲霉毒素效應(yīng)的方法，所述受試者具有發(fā)生HCC和/或黃曲霉毒素中毒的高風(fēng)險(xiǎn)。所述方法包擬a)口服施用有效量的經(jīng)加工的粉末形式鋁硅酸釣("CAS")，其中CAS包含可接受水平的TCDD和優(yōu)先有*^屬污染，并能夠與黃曲霉毒素結(jié)合；(b)針對(duì)急性中毒，等待一段時(shí)間(例如小于約24小時(shí))；以及(c)重復(fù)步驟(a)-(b),直到黃曲霉毒素的效應(yīng)被減輕；(d)針對(duì)慢性中毒，施用CAS直到不再具有暴露于黃曲霉毒素的風(fēng)險(xiǎn)。優(yōu)選的CAS具有的化學(xué)組成包含高于3,2。/。的CaO;4.0-5.4%的MgO;5.4-6.5的Fe203;0.50-0.卯％的K20;0.10-0.30%的Na20;0.01-0.03%的MnO;14.8-18.2%的A1203;62.4-73.5%的Si02;其中，該化學(xué)組成以重量百分比給出。優(yōu)選的經(jīng)分離CAS具有小于80微米的平均粒徑以及5~9的pH值。本發(fā)明基于粘土的組合物也稱為CAS，其能夠減輕任何環(huán)境毒素的效應(yīng)，盡管不如黃曲霉毒素有效。以下附圖構(gòu)成本i兌明書(shū)的一部分，其用于進(jìn)一步闡明本發(fā)明的某些方面。通過(guò)將這些附圖的一幅或多幅與本文所給出之具體實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明結(jié)^來(lái)參考，可以更好地理解本發(fā)明。圖l顯示主要的黃曲霉毒素同類物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖2顯示使用HSCAS的體內(nèi)研究結(jié)果。圖3顯示規(guī)則的HSCAS對(duì)比破碎的HSCAS之等溫曲線。圖4顯示攝入不同水平CAS的三個(gè)組在不同時(shí)間段后的維生素A水平。圖5顯示攝入不同水平CAS的三個(gè)組在不同時(shí)間段后的維生素E水平。圖6顯示NS干預(yù)試驗(yàn)的總體研究設(shè)計(jì)。圖7顯示NS干預(yù)對(duì)血清AFBr白蛋白加合物水平的劑量效應(yīng)。圖8顯示NS干預(yù)對(duì)血清AFBr白蛋白加合物水平的時(shí)間效應(yīng)。圖9顯示NS干預(yù)對(duì)尿AFMi水平的劑量效應(yīng)。圖10顯示NS干預(yù)對(duì)尿AFMi水平的時(shí)間效應(yīng)。發(fā)明詳述在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不局限于特定的組合物或組合物遞送系統(tǒng)，它們是可以改變的。還要理解本文使用的術(shù)語(yǔ)目的僅在于描述特定的實(shí)施方案，而不旨在限制。另外，在描述本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)施方案之前，有必要對(duì)用于描述本發(fā)明的定義進(jìn)行闡明。所闡明的定義僅適用于本專利中使用的術(shù)語(yǔ)，并且可能不適用于他處(例如在科學(xué)文獻(xiàn)或者其它專利或申請(qǐng)中，包括本發(fā)明人或轉(zhuǎn)讓給共同所有人的其它申請(qǐng))使用的同樣術(shù)語(yǔ)。另外，當(dāng)給出實(shí)施例時(shí)，它們僅旨在示例性而非限制性的。必須指出，除非上下文明確指明，否則本i兌明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中使用的單數(shù)形式包含復(fù)數(shù)含義。因此，例如，"藥理學(xué)活性劑"包括兩種或更多種這樣的化合物的混合物，"基質(zhì)"包括兩種或更多種基質(zhì)的混合物，等等。在本發(fā)明的描述和權(quán)利要求中，下列術(shù)語(yǔ)將參照如下定義來(lái)使用。"活性劑"、"藥理學(xué)活性劑"、"組合物"和"藥物"在本文中可互換使用，其指可用于預(yù)防和治療黃曲霉毒素中毒和黃曲霉毒素所誘導(dǎo)肝癌的組合物和藥物。該術(shù)語(yǔ)還包括這些藥物的可藥用、藥理學(xué)活性的衍生物和類似物，其包括但不限于鹽、酯、酖胺、前藥、活性代謝物、包合物、類似物等。所以，當(dāng)^_用術(shù)語(yǔ)"活性劑"、"藥理學(xué)活性劑"或"藥物"時(shí)，應(yīng)理解申請(qǐng)人旨在包括活性組合物本身以及可藥用、藥理學(xué)活性的鹽、酯、酰胺、前藥、活性代謝物、包合物、類似物等，其在本文中統(tǒng)稱為"可藥用衍生物"。本發(fā)明涉及使用有效量粘土作為黃曲霉毒素結(jié)合劑或吸附劑來(lái)預(yù)防或治療黃曲霉毒素中毒的組合物和方法。黃曲霉毒素是一類主要由真菌黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的致癌真菌毒素，并且其常常在食品和農(nóng)產(chǎn)品中檢測(cè)到。這些化合物是熱穩(wěn)定的，并且可承受多種食品加工工序；因此黃曲霉毒素可能是大多數(shù)食物和家畜飼料中"不可避免的"污染物。在四種天然黃曲霉毒素(BpB2、Gi和G2)中，黃曲霉毒素Bi是毒性最強(qiáng)的，并已顯示出破壞參與致癌和腫瘤抑制的基因。另外，一些研究提示，暴露于低水平黃曲霉毒素可引M疫系統(tǒng)的抑制以及增加對(duì)疾病的易感性。盡管不希望被理論所局限，尚沒(méi)有可在多種農(nóng)產(chǎn)品中完全消除真菌毒素污染的確切方法；然而，基于粘土的方法的確提供了一種用于減少飲食暴露于黃曲霉毒素的經(jīng)濟(jì)實(shí)用的解決辦法。此外，食用黃曲霉毒素腸吸附劑和非特異性結(jié)合劑用于預(yù)防和治療黃曲霉毒素中毒的用途將在下文實(shí)施例中進(jìn)行描述。本發(fā)明還涉及使用有效量的粘土作為毒素結(jié)合劑或吸附劑來(lái)預(yù)防或治療任何環(huán)境毒素效應(yīng)的組合物和方法。實(shí)施例提供下列實(shí)施例以進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明及其實(shí)施方式進(jìn)行舉例說(shuō)明。然而，應(yīng)理解實(shí)施例中給出的具體細(xì)節(jié)僅僅是選來(lái)用于舉例說(shuō)明的，而不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1用于處理農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的一些策略是可用的，其中最簡(jiǎn)單的是需要分離并破壞污染源。然而，該方法常常是不實(shí)用的，這是因?yàn)榭赡軟](méi)有可替代的食物供應(yīng)，或者替代供應(yīng)可能是經(jīng)濟(jì)上不允許的。用于在家畜中預(yù)防黃曲霉毒素中毒的一個(gè)最有前景且研究充分的方法涉及將粘土或多種"結(jié)合劑"摻入受這些毒素污染的飲食中。該添加劑減少了毒素在胃腸道中的生物利用度；也即，它們作為該毒素的螯合劑(腸吸附劑)，因此降低了在血液和靶器官中的吸收和分布。已報(bào)道，吸附性粘土礦物與液體中的黃曲霉毒素Bi結(jié)合。在第一個(gè)18有關(guān)黃曲霉毒素的腸吸附劑研究中，常用作動(dòng)物飼料抗結(jié)塊添加劑的鈣蒙脫石粘土顯示出在水溶液中以高親和力和大容量顯著吸附黃曲霉毒素B"并保護(hù)了肉用仔雞和來(lái)亨雞免受飲食中7,500ppb黃曲霉毒素的毒性作用。從這一最初研究開(kāi)始，已有報(bào)道稱鈣蒙脫石粘土及其它類似的蒙脫石粘土在多種動(dòng)物幼仔(包括嚙齒動(dòng)物、雞雛、土雞雛、鴨雛、羊羔、貂和豬)中降低了黃曲霉毒素的毒性作用。飲食中的粘土還顯示出降低了乳中的黃曲霉毒素1V^水平。最近，通過(guò)加入鈣蒙脫石粘土減少了狗中的Afl^暴露的尿中生物標(biāo)志物。因此，飼料中0.5%(重量/重量)的CAS保護(hù)免受同樣飼料中7,500ppb黃曲霉毒素的不良效應(yīng)。正常情況下，食物或飼料的污染物中不會(huì)有如此高的黃曲霉毒素水平，因此，這代表了"最壞的情況(worstcasescenario)"。飲食中低至0.25%(重量/重量)的水平可顯示出黃曲霉毒素保護(hù)。推及人的情況，膠嚢中約3g劑量的CAS近似于食物中0.25%的水平，這是基于加納的食物攝入數(shù)據(jù)以及70Kg體重來(lái)推算的。體內(nèi)使用粘土的GRAS狀態(tài)和安全性研究。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，科學(xué)出版物支持將鈣蒙脫石粘土作為黃曲霉毒素結(jié)合劑用于動(dòng)物飼料中。本文描述了在多種動(dòng)物物種中涉及鈣蒙脫石粘土的多項(xiàng)體內(nèi)研究的匯編(參見(jiàn)圖2)。例如，根據(jù)生產(chǎn)或飼養(yǎng)的質(zhì)量管理規(guī)范，通常認(rèn)為7jC合鋁硅酸鈉釣以不超過(guò)2%的水平在飼料中使用時(shí)是安全的。在涉及釣蒙脫石粘土的動(dòng)物研究中，尚未有報(bào)道稱粘土治療(以高達(dá)飲食中2.0%的水平)具有副作用。在最近使用嚙齒動(dòng)物的研究中，在懷孕Sprague-Dawley大鼠的整個(gè)懷孕期間，在飲食中高水平(2.0%重量/重量)暴露后對(duì)潛在的毒性以及微量金屬的生物利用度進(jìn)行評(píng)估。以2.0%(重量/重量)水平將粘土添加到懷孕期間Sprague-Dawley大鼠的均衡飲食中。在懷孕第16天進(jìn)行毒性評(píng)估，除了胚胎吸收以外，還包括母體體重、母體飼料攝入、幼仔重量。收集肝、腎、脛骨、腦、子宮、合并的胎盤(pán)以及合并的胚胎，并稱重。將組織凍干，然后進(jìn)行中子活化分析(neutronactivationanalysis,NAA)。NAA所考慮的元素包括鋁、溴、鈣、鈰、鈷、鉻、銫、銅、鏑、銪、鐵、鉿、鉀、鑭、镥、鎂、錳、鈉、釹、鎳、銣、硫、銻、鈧、硒、釤、鍶、鉭、釷、碲、釷、鈦、鉈、鈾、釩、鐿、鋅和鋯。電感耦合等離子體-質(zhì)鐠進(jìn)一步確定腦中的鋁低于檢出限(0.5卯m)，這表明該金屬由于在胃腸道中與粘土相互作用而沒(méi)有顯著的生物利用度。補(bǔ)充任一粘土的動(dòng)物在毒性評(píng)估和金19屬分析方面與對(duì)照類似，只是補(bǔ)充粘土后腦中的銣有所減少?？偟膩?lái)說(shuō)，該研究的結(jié)果揭示出，在懷孕大鼠中粘土在高飲食濃度下沒(méi)有產(chǎn)生明顯的毒性，也沒(méi)有影響礦物質(zhì)的吸收或利用。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)粘土的GRAS狀態(tài)、優(yōu)先微量金屬純度和二噁英水平來(lái)選擇用于測(cè)試的粘土，參見(jiàn)表l。在嚙齒動(dòng)物和受試者中進(jìn)行的其它研究證實(shí)了鈣蒙脫石粘土用于人類飲食的安全性。在嚙齒動(dòng)物研究中，用含約0、0.25、0.5、1.0和2.0%水平之鈣蒙脫石粘土的飼料來(lái)飼養(yǎng)大鼠。在研究結(jié)束時(shí)測(cè)量、標(biāo)準(zhǔn)化并比較體重、體重增加、器官重量、組織病理、血漿生化性質(zhì)、血清維生素A和E以及微量營(yíng)養(yǎng)物(鐵和鋅)，以確定毒性以及粘土與重要營(yíng)養(yǎng)物的任何相互作用。暴露于粘土6周后，在治療組中未觀察到患病或死亡。主要器官、血清生化性質(zhì)或微量營(yíng)養(yǎng)物水平?jīng)]有變化。在每種性別的治療組中，肝、腎、肺、心、腦、脾和脛骨的器官重量與最終體重的比例沒(méi)有顯著差異，對(duì)肝和腎進(jìn)行組織病理學(xué)分析表明對(duì)照與粘土治療組之間沒(méi)有差異。這些結(jié)果表明，飲食中包含水平低于2.0%(重量/重量)的粘土不會(huì)導(dǎo)致明顯的毒性，并可安全地用于減少胃腸道中黃曲霉毒素的暴露。在人體研究中，首先檢測(cè)鉤蒙脫石粘土的微量金屬和二噁英含量，以確定物質(zhì)組成并確保低水平污染。然后將鈣蒙脫石粘土加熱滅菌，裝入膠嚢以用于研究。該研究設(shè)計(jì)基于2個(gè)治療組(l)低劑量一一3x500mg膠嚢x3次/天，共2周，以及(2)高劑量——3x1,000mg膠嚢x3次/天，共2周。所述2周試驗(yàn)由50個(gè)健康成年人組成，年齡2240歲，通過(guò)最初的體檢、體液(biologicalfluid)實(shí)驗(yàn)室分析和問(wèn)巻調(diào)查來(lái)挑選。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠制備根據(jù)上文所述修飾的劑量有所變化的膠嚢，參見(jiàn)Remmington，sPharmaceuticalSciences第17版。然后，在飯前用礦泉水將粘土膠嚢施用給參與者。醫(yī)療人員在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)有無(wú)任何癥狀或不良效應(yīng)。在2周結(jié)束時(shí)取血樣和尿樣，并再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室分析和體檢。根據(jù)NIH的指南對(duì)任何不良效應(yīng)進(jìn)行報(bào)告。在2周的研究期間，對(duì)給藥的依從性達(dá)到100%。用于監(jiān)測(cè)不良效應(yīng)的臨床分析和生化數(shù)據(jù)、針對(duì)肝和腎功能的血和尿參數(shù)未顯示任何具體的不良效應(yīng)。作用模式和機(jī)理研究。一些體外研究已對(duì)黃曲霉毒素吸附至水合鋁硅酸鈉鈣粘土(HSCAS)表面上進(jìn)行了評(píng)估。水溶液中的HSCAS顯示出緊密并優(yōu)先吸附Affii以及在分子結(jié)構(gòu)中含有完整p-二羰基體系的黃曲霉毒素Bi(AfBi)類似物。Af^吸附至HSCAS的等溫分析顯示出高親和力和大容量的特點(diǎn)，并且還提示AfBi吸附在粘土表面可能有不同的位點(diǎn)和/或作用機(jī)制來(lái)參與。Af^吸附的焓(約40kJ/mo1)顯示出某些變化，這提示HSCAS上的各位點(diǎn)具有不同的熱力學(xué)性質(zhì)。這些發(fā)現(xiàn)表明，HSCAS表面上的多個(gè)位點(diǎn)可化學(xué)吸附AfBn并且Affii分子的最佳取向很有可能是平鋪在夾層粘土表面上。黃曲霉毒素類似物上的官能團(tuán)可能在空間上阻礙在HSCAS表面上的吸附，或者可能通過(guò)與夾層區(qū)域相互作用而阻斷吸附。Affii吸附至HSCAS表面的其它機(jī)制可能涉及與占優(yōu)勢(shì)的夾層陽(yáng)離子(例如鈣以及多種其它的邊緣位置金屬)可能發(fā)生螯合。成分描述和特征。鋁硅酸鈣粘土(CAS)與水合鋁硅酸鈉釣(HSCAS)粘土具有不同的組成，后者為深棕褐色。CAS的外觀為灰白色至灰綠色的自由流動(dòng)粉末。CAS是無(wú)味的，比重約為2.4。經(jīng)分離的CAS在水中基本不溶，pH為約59。由于含有珪石成分和鋁硅酸鹽成分，因此如果吸入經(jīng)分離CAS的干燥顆粒會(huì)導(dǎo)致一些不良反應(yīng)，但是尚未發(fā)現(xiàn)攝入所述顆粒對(duì)健康造成不良影響。典型的數(shù)值如下典型的物理性質(zhì)游離水分(LOD)松密度緊密度粒徑分布典型化學(xué)分析:9%0.64g/cc，40磅/英尺30.80g/cc，50磅/英尺35%+100目18%+200目60%+325目利用X射線分級(jí)(XRF)鐠的化學(xué)％CaO3.2-4.8分析(重量百分比)％MgO4.0-5.4%Fe2035.4-6.5%&00.50-0.卯%Na200.10-0.30%MnO0.01-0,03%A120314.8-18.2%Si0262.4-73.5另外，對(duì)來(lái)自Engelhard，s(現(xiàn)為BSAF)，Jackson,MS工廠的經(jīng)加工粘土產(chǎn)品的檢測(cè)證實(shí)，CAS中含有低水平的TCDD(<0.33份/萬(wàn)億份(ppt))。Engelhard(BASF)的說(shuō)明書(shū)中將TCDD作為食品成分中存在二噁英的指標(biāo)。等溫吸附分析的分析步驟和方法。使用由純的Af^晶體(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)溶于乙腈制備的黃曲霉毒素(AfBi)儲(chǔ)液進(jìn)行等溫吸附分析。然后，將一定體積的儲(chǔ)液注射進(jìn)純水(去離子水)中，得到8嗎/mL的Af^工作溶液。然后用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)來(lái)校驗(yàn)工作溶液的濃度Umax=362nm;s=21，865)。分批等溫步驟需要將含有100嗎吸附劑的樣品與濃度遞增的溶質(zhì)(AffiJ(0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4、4.8、6、6.4、7.2和8pg/mL)接觸。該研究中針對(duì)每種溶質(zhì)濃度重復(fù)三次。所述溶質(zhì)濃度通過(guò)將適量的Affii工作溶液加至17x100mm無(wú)菌聚丙烯離心試管中、然后補(bǔ)充純7jC至總體積為5mi/管來(lái)獲得。在16x125mm—次性硼珪玻璃試管中稱取約10mg吸附劑，向該吸附劑中加入純水，得到2mg/mL的懸液。將該吸附劑/水懸液渦旋混勻3秒，然后用自動(dòng)移液器將每50jiL轉(zhuǎn)移到每個(gè)重復(fù)中。在每次轉(zhuǎn)移前再次進(jìn)行混勻。除了樣品以外還有三組對(duì)照，其由5mL純水、5mL不含吸附劑的AfBi工作溶液以及5mL不含吸附劑的最低濃度Af^組成。將樣品和對(duì)照封蓋，并分別置于15、25或37。C孵箱中的電動(dòng)定軌搖床上，以1,000rpm孵育24小時(shí)。振搖后，將樣品在與振搖相同的溫度下以10,000rpm離心15分鐘。用分光光度計(jì)測(cè)量樣品和對(duì)照的上清液中剩余AfBi的紫外可見(jiàn)光吸收。在最高的Affir濃度水平下，保留上清用于HPLC分析以檢查任何降解的化合物，這是因?yàn)樵撐接?jì)算依賴于不同的計(jì)算方法。數(shù)據(jù)計(jì)算和曲線擬合。使用紫外可見(jiàn)光吸附數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的溶液中Affii剩余量以及吸附量。使用7ii6/eCWve2D軟件(SystatSoftwareInc.,Richmond,CA)，將這些數(shù)據(jù)擬合Langmuir等溫方程<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>)其中q是所吸附AfBi的量，Qmax是所吸附Affii的最大量，Cw是溶液中Affii的平衡濃度，Kd是分配常數(shù)。將Langmuir方程作為用戶自定義的函數(shù)輸入7ii6/eOin^2D程序，并且其變量參數(shù)具有限制以及一級(jí)近似。Qmax的參數(shù)限制為0至最大1mol/kg的正數(shù)。Kd的參數(shù)限制為0至lxl025。由rM/eCWveID來(lái)確定參數(shù)Q咖x和Kd的初始估計(jì)值。將這些值輸入rW/eCWve2D中的Langmuir用戶自定義函數(shù)后，擬合這些數(shù)據(jù)，獲得Q,和Kd的理論值。利用以下方程通過(guò)比較在15、25和37匸時(shí)的各Kd值來(lái)計(jì)算AHads(吸附焓)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>通過(guò)從以下Langmuir方程中解出Kd得到IQ的定義<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>將Langmuir方程擬合15、25和37。C的吸附數(shù)據(jù)得出Qmax。測(cè)量COLE指標(biāo)的方法。一種膨脹性質(zhì)的度量，即線性膨脹系數(shù)(coefficientoflinearextensibility,COLE)指標(biāo)是潤(rùn)濕后土壤體積與潤(rùn)濕前土壤體積的比值再減去一。COLE=(潤(rùn)濕后粘土體積/潤(rùn)濕前粘土體積)-1。COLE指標(biāo)值大于0.03標(biāo)志著樣品中存在大量的蒙皂石(膨脹粘土)。一般步驟總結(jié)如下1、將5mL(5cm3)干燥粘土加至25mL量筒中；2、將蒸餾水加至粘土，使總體積達(dá)到25mL;3、劇烈振搖或攪拌，以確保粘土徹底潤(rùn)濕；4、使懸液在室溫靜置24小時(shí)；5、測(cè)量沉淀下來(lái)的粘土的膨J^體積。脹縮潛力(shrink-swellpotential)與粘土的種類和量密切相關(guān)。最大脹縮潛力出現(xiàn)在含有大量2:1晶格粘土(例如蒙皂石)的土壤中。隨水分含量的變化，伊利石粘土的受影響程度居中，而高嶺石粘土受影響最小。圖3顯示規(guī)則的HSCAS和熱破碎的HSCAS在25。C時(shí)的吸附等溫曲線。實(shí)施例2原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)具有獨(dú)特的地理、性別和年齡分布，其可能由特定的致病因素(即肝炎和黃曲霉毒素暴露)來(lái)決定。根據(jù)地理位置的不同，HCC的發(fā)病率有很大不同。在同一國(guó)家的不同種族中以及在同一國(guó)家的不同區(qū)域中HCC的分布也不一樣。高發(fā)病地區(qū)(每年每100,000人中超過(guò)15例)包括撒哈拉以南的非洲、中國(guó)、香港和臺(tái)灣。所有HCC病例中超過(guò)40。/。發(fā)生在中國(guó)，其每年發(fā)生137,000例。相反，北美、南美、歐洲大部分地區(qū)、澳大利亞和中東部分地區(qū)的發(fā)病率很低，每年每100，000人中報(bào)道少于3例。但是，在過(guò)去20年中美國(guó)的發(fā)病率有所增加，這可能由于許多人患長(zhǎng)期慢性丙型肝炎所致。男性比女性更易患HCC，據(jù)稱在高發(fā)病地區(qū)更加懸殊，其男性患病率為女性的2.1至5.7倍(平均為3.7:1)。在中等發(fā)病地區(qū)，該比值降至2.4:1,在低發(fā)病地區(qū)則更低。盡管尚未完全弄清楚，但是性別分布的這些差異被認(rèn)為是由于肝炎攜帶狀態(tài)、暴露于環(huán)境毒素以及雄性激素營(yíng)養(yǎng)作用的差異所致。絕大多數(shù)HCC發(fā)生于患有慢性肝病或肝硬化的患者中。因此，患有長(zhǎng)期肝病的老年患者更易發(fā)生HCC。在亞洲和西歐進(jìn)行的一些大，前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)病的平均年齡在50至60歲之間。但是，在撒哈拉以南非洲，HCC發(fā)病的平均年齡偏低，其發(fā)病平均年齡為33歲。嘗試了解HCC獨(dú)特的分布特點(diǎn)使我們加深了對(duì)患該病的風(fēng)險(xiǎn)因素的了解。因此，已有多種導(dǎo)致HCC發(fā)病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素被鑒定出。這些因素包括乙型肝炎攜帶狀態(tài)、黃曲霉毒素、慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染、遺傳性血色素沉著病以及由幾乎任何原因?qū)е碌母斡不?。但是，HCC也發(fā)24生在無(wú)已知風(fēng)險(xiǎn)因素的患者中。下面分別討論對(duì)所有這些疾病進(jìn)行監(jiān)視的情況。乙型肝炎攜帶狀態(tài)。乙型肝炎攜帶狀態(tài)與肝細(xì)胞癌之間的相關(guān)性已在若干基于大量人群的研究中以及其它報(bào)道中得以表明。例如，在一份報(bào)告中，在1975年至1978年間跟蹤研究了臺(tái)灣的22，707名男性政府雇員，其中15。/。是HBV攜帶者(乙型肝炎表面抗原呈陽(yáng)性)。這些HBsAg攜帶者患HCC的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)是非攜帶者的223倍。在另一系列研究中，HBsAg的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)917位患肝硬化或慢性肝炎的日本患者中為6.9。黃曲霉毒素。黃曲霉毒素可導(dǎo)致HCC發(fā)病。黃曲霉毒素是常見(jiàn)于污染玉米和花生的真菌毒素。^X高比率的黃曲霉毒素與HCC有關(guān)。例如，臺(tái)灣的澎湖列島具有極高的HCC發(fā)病率，其不完全由HBV攜帶所造成。在一個(gè)研究中，對(duì)來(lái)自該地區(qū)的20名HCC患者與86名年齡匹配的對(duì)照進(jìn)行比較，患者中更大可能含有黃曲霉毒素Br白蛋白加合物(65%對(duì)37%;調(diào)整后的優(yōu)勢(shì)比(adjustedoddsratio)為5.5);94%的患者是HBsAg攜帶者。在另一個(gè)來(lái)自上海的研究中，攜帶HBV且暴露于黃曲霉毒素的個(gè)體發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)是正常A^發(fā)病率的59.4倍。已表明，在長(zhǎng)期暴露于黃曲霉毒素的肝細(xì)胞癌患者中p53腫瘤抑制基因發(fā)生突變。在肝癌發(fā)生動(dòng)物模型中也已證實(shí)了類似發(fā)現(xiàn)，其中在暴露于HBV和黃曲霉毒素的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中觀察到p53突變。在表達(dá)乙型肝炎表面抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠中已證明這些風(fēng)險(xiǎn)因素的加強(qiáng)作用；在一個(gè)研究中，使其中一些小鼠缺少一個(gè)p53等位基因和/或暴露于黃曲霉毒素。在13個(gè)月齡時(shí)，具有所述三種風(fēng)險(xiǎn)因素的所有7只小鼠均發(fā)生嚴(yán)重的HCC，相比較地，暴露于黃曲霉毒素的具有兩個(gè)p53等位基因的小鼠中有62%患病，而缺少一個(gè)p53等位基因但未暴露于黃曲霉毒素的小鼠中有25%患病。食用已被確定為HCC致病劑的黃曲霉毒素是危險(xiǎn)的。但是，世界上許多低社會(huì)^居民常常要在食用污染食物與饑俄之間做出選擇。在這種選擇之下，患HCC的風(fēng)險(xiǎn)要優(yōu)于饑餓和確定的死亡。本發(fā)明的一個(gè)方面是在易患HCC的人中減輕黃曲霉毒素效應(yīng)的方法，其包括至少每天一次(優(yōu)選每頓飯前、飯時(shí)或飯后)口服施用有效量的粉末形式、片劑或膠嚢形式的經(jīng)分離低鈉的、鋁硅酸鉀粘土。所述經(jīng)分離的低鈉的、鋁硅酸釣粘土基本不含二噁英和有毒重金屬污染，并能夠結(jié)合黃曲霉毒素。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述經(jīng)分離的低鈉的、鋁硅酸鉤粘土具有如下化學(xué)組成(重量百分比)高于3.2%的CaO;約4.0-5.4%的MgO;約5.4-6.5的Fe203;約0.50-0.卯％的K20;約0.10-0.30%的Na20;約0.01-0.03%的MnO;約14.8-18.2%的A1203以及約62.4-73.5%的Si02。另外，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述經(jīng)分離的鋁硅酸鉀粘土具有小于約80微米的平均粒徑。但是，為了均一性和純度，選擇標(biāo)稱為200目的粒徑。這些特征對(duì)于研究和比較黃曲霉毒素在多種粘土表面上的吸附以及描繪出該過(guò)程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)是理想的。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)了解粘土礦物在結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)上是多樣的。許多對(duì)于吸附黃曲霉毒素是無(wú)效的和/或非選擇性的。本發(fā)明的CAS經(jīng)評(píng)估含有(a)可接受的配體吸附熱力學(xué)性質(zhì)；(b)優(yōu)先金屬(prioritymetal)和二噁英/呋喃的可接受水平；(c)在多種動(dòng)物物種中有功效；(d)長(zhǎng)期研究的安全性；(e)以及與維生素和微量營(yíng)養(yǎng)物的相互作用可忽略不計(jì)。實(shí)施例3黃曲霉毒素(AF)是霉菌生長(zhǎng)的有害副產(chǎn)物，其主要由真菌黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生。天然存在的AF(例如BpB2、Gi和G2)已被列為單獨(dú)或同時(shí)存在于人和動(dòng)物食用的多種食物中的危險(xiǎn)污染物。黃曲霉毒素Bi(AFBJ已表征為具有基因毒性、免疫毒性和致肝癌性。急性黃曲霉毒素中毒的人和動(dòng)物通常基于劑量具有包括黃疽、低熱、胃腸道出血、水肺、抑郁、厭食、腹瀉、脂肪肝、腹水、腹痛以及有可能肝衰竭和死亡的癥狀。先前的報(bào)道揭示了暴露于AF與生長(zhǎng)障礙特別是發(fā)育障礙(反映慢性營(yíng)養(yǎng)不良)及體重過(guò)輕(標(biāo)志急性營(yíng)養(yǎng)不良)之間具有強(qiáng)的劑量應(yīng)答關(guān)系，如在貝寧、多哥和西非的兒童中所見(jiàn)到的。最嚴(yán)重的急性AF中毒爆發(fā)之一最近良生于肯尼亞(東非)，其與食用當(dāng)?shù)胤N^保管不善的、污染了高達(dá)8，000ppb水平之AF的玉米制得的食物有關(guān)。此次中毒爆發(fā)奪走了125條生命，約為2004年1月至7月20日所報(bào)道的317例病例的39.4%。先前的報(bào)道還指出，由于管理和保存不善，人用的食物(特別是玉米和花生)的AF污染成為加納主要的食品安全問(wèn)題。例如，Awuah和Kpodo(1996)報(bào)道了加納市場(chǎng)上的花生樣品中AF水平為5.7~22,168卯b。另一項(xiàng)在加納的研究表明，在94%的所收集樣品中，"kenkey"(—種常見(jiàn)的基于玉米的食物)中的AF總水平為6.2~196.1ppb，平均值為50.9ppb。26與長(zhǎng)期AFBi暴露有關(guān)的最常見(jiàn)效應(yīng);Ut細(xì)胞癌(HCC)發(fā)病率增加。AFBi已成為HCC發(fā)病的一個(gè)主要風(fēng)險(xiǎn)因素，特別是在撒哈拉以南非洲、東南亞和南美的熱帶地區(qū)。在乙肝病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)呈陽(yáng)性的個(gè)體中，AFBi的致癌效力比在HBsAg陰性個(gè)體中高出約30倍。因此，有必要開(kāi)發(fā)并執(zhí)行有^t抗飲食中AF的干預(yù)策略，特別是對(duì)于具有黃曲霉毒素中度高風(fēng)險(xiǎn)或AF協(xié)同風(fēng)險(xiǎn)(例如由HBV導(dǎo)致的HCC)的人來(lái)說(shuō)。考慮到估計(jì)有80。/。的HCC病例發(fā)生于t艮中國(guó)家，那么預(yù)防方案應(yīng)當(dāng)是經(jīng)濟(jì)上可行的、文化上可接受的以及可持續(xù)的?，F(xiàn)存的科技文獻(xiàn)中已充分證明，AF是多種食品中"f"i泉的天然污染物，并與人和動(dòng)物的疾病和死亡有關(guān)。盡管該問(wèn)題可能不會(huì)嚴(yán)重威脅發(fā)達(dá)國(guó)家，但是食品中的AF污染仍然給ib艮中世界帶來(lái)嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，缺乏無(wú)污染食品供應(yīng)以及貧窮仍是這些國(guó)家的主要且長(zhǎng)期的挑戰(zhàn)。避免食用AF污染的食物是減少人黃曲霉毒素中毒風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)M本手段。但是，對(duì)于M中國(guó)家的許多地區(qū)來(lái)說(shuō)這是行不通的，因此迫切需要可行的干預(yù)方案來(lái)處理受黃曲霉毒素污染的飲食以及治療黃曲霉毒素中毒。一種方法是化學(xué)預(yù)防。該策略包括使用天然或合成藥劑來(lái)阻斷、延遲、逆轉(zhuǎn)或調(diào)節(jié)AF的致癌過(guò)程。已研究了多種化學(xué)預(yù)防劑，一些作為人飲食中的天然成分存在。在大量臨床試驗(yàn)中，研究人員已經(jīng)證明化學(xué)預(yù)防性的化學(xué)物質(zhì)(例如奧M拉、葉綠酸和綠茶來(lái)源的多酚)在多種動(dòng)物模型和人中有效對(duì)抗AF。由于這些化合物被胃腸道所吸收并影響細(xì)胞代謝，將它們?cè)谌梭w中長(zhǎng)期應(yīng)用尚需非常謹(jǐn)慎的評(píng)估，包括對(duì)酶調(diào)節(jié)的長(zhǎng)期影響以及對(duì)來(lái)自飲食的必需營(yíng)養(yǎng)物攝取的干擾。在本實(shí)施例中，對(duì)飲食中加入鋁硅酸釣粘土進(jìn)行研究，所述鋁硅酸鈣粘土不會(huì)被吸收、可優(yōu)先結(jié)合胃腸道中的AF并且降低血、肝和其它器官對(duì)毒素的生物利用度。NovaSil(NS)(EnglehardChemicalCorp.,Iselin，NJ)是用作抗結(jié)塊劑的天然經(jīng)加工鈣蒙脫石粘土。平衡吸附等溫曲線和分子建模研究顯示，NS優(yōu)先與含有平面酮內(nèi)酯系統(tǒng)的AF結(jié)合。先前對(duì)嚙齒動(dòng)物、雞雛、火雞雛、豬、羔羊、泌乳山羊和牛的短期研究中證實(shí)，飲食中加入NS顯著保護(hù)免受AF侵害。在所有這些研究中，沒(méi)有報(bào)道食用NS粘土后可觀察到的不良效應(yīng)。在發(fā)育毒性研究中，用高達(dá)2%(重量/重量)濃度的食用NS飼喂懷孕期間的Sprague-Dawley(S-D)大鼠，沒(méi)有檢測(cè)到NS相關(guān)的母體或胎兒毒性，并且在多種母體和胎兒組織中對(duì)微量金屬的生物利用度也沒(méi)有發(fā)生顯著變化。在最近的長(zhǎng)期研究(6.5個(gè)月)中，用0.25-2%(重量/重量)的食用NS粘土飼喂S-D大鼠，在體重增加、相對(duì)器官重量、主要器官的整體外觀和組織學(xué)外觀或者血液學(xué)和血清生化參數(shù)方面沒(méi)有劑量依賴性的或NS相關(guān)的副作用。另夕卜，必需營(yíng)養(yǎng)物(包括維生素A和E)以及微量營(yíng)養(yǎng)物Fe和Zn的水平未受影響。在開(kāi)始本實(shí)施例所述的臨床研究之前，先分析NS粘土的潛在有4^屬和二噁英污染物，以確保(1)符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和聯(lián)邦標(biāo)準(zhǔn)，以及(2)水平低于基于JECFA標(biāo)準(zhǔn)的食物中的TDI(每日可耐受攝入量)。結(jié)果顯示于下文表1中，其表明NS粘土未包含任何超過(guò)明文規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。表1.NS中的優(yōu)先金屬和二噁英類/吹喃類<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>二噁英類/呋喃類i:Ns)^^g-BW/天TDI(pg/Kg-BW/天TCDD,TCDF，等ND------2.3OCDD+HpCDD_0.0679_0.0029__8基于EPA(Superfund)和聯(lián)合國(guó)^J^組織/世界衛(wèi)生組織的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)先有4^屬和和二噁英/呋喃；b在原始NS中測(cè)定優(yōu)先有a屬和二噁英/呋喃濃度；。對(duì)應(yīng)于3gNS的推算金屬劑量和二噁英/呋喃的毒性當(dāng)量(TEQ)(推測(cè)總濃度的生物利用度)；d基于JECFA標(biāo)準(zhǔn)的來(lái)自食物的每日可耐受攝入量。世界范圍內(nèi)對(duì)來(lái)自食物和水的Sr^UV的估計(jì)中值為1-5mg/天(WHO)。基于在多種動(dòng)物模型中所證明的NS的安全性和效力，推測(cè)基于NS的干預(yù)對(duì)于治療頻繁暴露于高水平黃曲霉毒素并處于黃曲霉毒素中毒風(fēng)險(xiǎn)中的人是有益的。在加納，作為用NS進(jìn)行人臨床試驗(yàn)的前導(dǎo)，進(jìn)行了短期(2周)雙盲I期研究，用以(1)在50個(gè)健"志愿者中評(píng)估NS膠嚢的安全性和耐受性；以及(2)建立用于人干預(yù)研究的最佳方案。NS攝入(1.5和3.0g/天)14天后，參與者的依從性(99.1%)很好；#結(jié)果、、血清生化和血液學(xué)^未受影響；血清礦物質(zhì)以及維生素A和E的水平與基線值沒(méi)有顯著差異(Wang等，2005)。除了其所證實(shí)的安全性之外，用于臨床干預(yù)試驗(yàn)的每天3.0g劑量的NS是從先前的體外和體內(nèi)研究(包括Pimpukdee等，2004)推出的，所述研究顯示，飲食中0.25%的NS是保護(hù)雞雛免受AF毒性的最小有效劑量。該研究為目前在西非加納Ashanti區(qū)的Ejura-Sekyedumase地區(qū)(ESD)的IIa期人干預(yù)研究奠定了基礎(chǔ)?；谝韵聢?bào)告將Ashanti區(qū)的ESD選作干預(yù)研究地點(diǎn)，所述報(bào)告中稱在收集自該區(qū)域研究參與者的140份血清樣品中的100%以及91份尿樣品中的91.2%檢測(cè)到AFBr白蛋白加合物和黃曲霉毒素Ml代謝物(Jolly等，2006)。Wild等(1992)報(bào)道的來(lái)自東非和西非國(guó)家的絕大多數(shù)(75-100%)人的血液AFBr白蛋白加合物測(cè)試呈陽(yáng)性支持了這些發(fā)現(xiàn)。在該報(bào)告中，我們主要的目的是評(píng)估NS施用給人用于治療黃曲霉毒素中毒時(shí)NS的安全性，其通過(guò)以下步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)(1)確定NS在3個(gè)月期間內(nèi)在人受試者中的可能不良效應(yīng)，和(2)建立用于在人受試者中進(jìn)行長(zhǎng)期(IIb或III期)研究的基礎(chǔ)和劑量測(cè)定。Ejura-Sekyedumase地區(qū)(ESD)是加納Ashanti區(qū)的21個(gè)地區(qū)之一。其氣候條件和土勤巴沃程度有利于作物生長(zhǎng)，大約76%的居民從事農(nóng)業(yè)。在該地區(qū)生產(chǎn)并消費(fèi)的主要作物包括玉米、花生、山藥、木薯、棉花和煙草(Adu和Mensah-Ansah1995;地區(qū)衛(wèi)生部門(mén)(DistrictHealthDirectorate),Ejura/Sekyedumase2005)。地區(qū)衛(wèi)生主管及其它醫(yī)務(wù)人員對(duì)1社區(qū)進(jìn)行了協(xié)調(diào)，并將研究小組介紹給6個(gè)社區(qū)的領(lǐng)導(dǎo)和居民，他們構(gòu)成了該地區(qū)超過(guò)一半的人口。研究之前，建立了4個(gè)社區(qū)的AF基線29數(shù)據(jù)和人口統(tǒng)計(jì)學(xué)信息(Jolly等2006)。另外兩個(gè)社區(qū)在Ejura分區(qū)，它們擁有整個(gè)地區(qū)中最多的人口。每個(gè)社區(qū)的領(lǐng)導(dǎo)召集研究人員開(kāi)會(huì)以確定研究的目的、持續(xù)時(shí)間、期限、可能的參與者和監(jiān)測(cè)者的責(zé)任以及其它方面，并給居民留出時(shí)間提問(wèn)和回答。在1社區(qū)和信息獲知過(guò)程之后，來(lái)自所述6個(gè)社區(qū)的總共507位居民自愿參與該研究。在解釋了知情同意文件之后，志愿者們?cè)谠撐募虾炞植⑼瓿蓡?wèn)巻調(diào)查(包括健康史和進(jìn)食頻率問(wèn)巻)。然后給予受試者識(shí)別編碼，并提供給其帶蓋的無(wú)菌杯讓他們收集早晨的首次M品。在樣品收集當(dāng)天，志愿者接受了當(dāng)?shù)蒯t(yī)生進(jìn)行的刷全。他們還提供了尿樣用于M和人絨毛膜促性腺激素(HCG)測(cè)試，以確定是否懷孕，并抽出總共15ml血分裝在兩支管里(一管5ml,另一管10ml)以用于AF暴露分析、肝功能和腎功能以;5Uk液學(xué)分析。將5ml分裝的血樣送至加納Ashanti區(qū)Ejura地區(qū)醫(yī)院，進(jìn)行血液學(xué)分析(主要是WBC計(jì)數(shù)、血紅蛋白和血細(xì)胞比容)。從所述10ml血樣收集的血清等分試樣用于在阿克拉勒貢加納大學(xué)NoguchiMemorial醫(yī)學(xué)研究所(NoguchiMemorialInstituteforMedicalResearch(NMIMR)，UniversityofGhana,Legon，Accra)進(jìn)行肝功能和腎功能測(cè)試。將剩余的血清樣品保存于-20。C，之后運(yùn)至德克薩斯理工大學(xué)(TTU)以確定每個(gè)志愿者的AFBr白蛋白加合物水平。合格的研究受試者個(gè)體(男性和女性)符合以下標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)體檢結(jié)果處于健康狀態(tài)，18-58歲，一周至少4次1基于玉米和/或花生的食物，血液AFBr白蛋白加合物水平^爭(zhēng)毫克白蛋白加合物0.5pmolAFBjLOD=每亳克白蛋白0.05pmolAFBi)，無(wú)慢性病史，未使用慢性病或急性病的處方藥，女性處于非懷孕和/或非哺乳期，血液學(xué)M、肝功能和腎功能指標(biāo)(血液參數(shù)和尿參數(shù))范圍正常并簽署同意書(shū)。具有異常肝功能值(ALT)的受試者從研究中排除。因此，研究中不包括急性肝炎患者(無(wú)論他們是否HBV攜帶——HBsAg+或HBsAg-)。在507名志愿者中，有302位受試者符合除AF-Alb加合物水平之外的所有納入標(biāo)準(zhǔn)。從該組中，僅根據(jù)加合物水平選擇180位受試者作為乾標(biāo)人群。為了確定NS是否有效并進(jìn)一步評(píng)估其安全性，根據(jù)美國(guó)NIH指南(2006)針對(duì)II期臨店^研究所要求的100~300位受試者的標(biāo)準(zhǔn)，選擇總共180位受試者的樣本M(每個(gè)治療組60位)。在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，2名女性和1名男性受試者退出，其余177位(101位男性，76位女性)成為最終的研究參與者。NovaSil粘土(NS)獲得自EngelhardChemicalCorporation(Iselin,NJ，USA)。首先，對(duì)用于人類研究之NS粘土中可能的環(huán)境污染物(包括多氯二苯并對(duì)二噁英類/呋喃類(PCDD/PCDF)和重金屬)進(jìn)行評(píng)估。由哥倫比亞分析服務(wù)公司(ColumbiaAnalyticalServices(CAS),Inc.,Houston,TX,USA)對(duì)NS進(jìn)行美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(USEnvironmentalProtectionAgency(USEPA))制定的優(yōu)先二噁英類/呋喃類(17)評(píng)估。USEPA方法的標(biāo)準(zhǔn)化步驟使用高分辨率毛細(xì)管柱氣相色譜/高分辨率質(zhì)鐠來(lái)進(jìn)行樣品制備、清理和分析(USEPA方法1613B)。同樣，由CAS公司(Kelso,WA，USA)來(lái)分析NS粘土的重金屬(例如砷、鎘、汞和鉛)。金屬分析步驟遵循標(biāo)準(zhǔn)USEPA方案(例如方法6010B和7471A)。NS粘土(含有可接受水平的污染物)被送至藥研院(ColoradoSprings,CO，USA)用于在符合生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的無(wú)菌條件下進(jìn)行膠嚢封裝。根據(jù)之前的劑量測(cè)定方案(Wang等2005),配制含有500mgNS、250mgNS或安慰劑的具有相同大小、形狀和顏色的膠嚢。然后利用電子束照射(NationalCenterforElectronBeamFoodResearch,TexasA&MUniversity)在密封塑料容器中對(duì)膠嚢滅菌(每個(gè)容器中約含180個(gè)膠嚢)。應(yīng)用靶劑量范圍8.2-9.4KGy，并參照與在美國(guó)對(duì)人類食物進(jìn)行滅菌類似的方案。所使用的所有其它化學(xué)品、試劑和溶劑均購(gòu)買所能獲得的最高純度的產(chǎn)品。整個(gè)研究設(shè)計(jì)參照隨機(jī)化、雙盲、安慰劑對(duì)照的II期臨床試驗(yàn)。研究方案在加納獲得了TAMU科^Hf價(jià)委員InstitutionalReviewBoard,IRB)以及針對(duì)倫理許可的NMIMR-IRB的批準(zhǔn)。從2005年9月開(kāi)始篩選志愿者。該試驗(yàn)開(kāi)始于2005年12月，完成于2006年4月(包括1個(gè)月的試驗(yàn)后隨訪)。將符合招募標(biāo)準(zhǔn)的志愿者根據(jù)血清AFBr白蛋白加合物水平隨機(jī)分為三個(gè)研究組(60位/組)。將具有最高AF暴露水平的前三個(gè)受試者隨機(jī)分到所述三個(gè)組中，然后將接下來(lái)三個(gè)最高暴露水平的參與者如上隨機(jī)分配，依此類推直至所有180位受試者均被分到各組中。作為雙盲研究，參與者、當(dāng)?shù)蒯t(yī)生、護(hù)士以及所有其它現(xiàn)場(chǎng)工作人員都不知im嚢的內(nèi)容物。為了確保對(duì)所制定治療方案的最大M性、保證對(duì)NS膠囊重量的不知情和保證參與者的健康，受過(guò)訓(xùn)練的研究監(jiān)測(cè)者每^JC皿嚢，親眼看見(jiàn)其艮用并記錄受試者可能感覺(jué)到的任何癥狀。每月進(jìn)行體檢，以評(píng)估研究受試者的整體健康狀況。在^NS的一開(kāi)始(第0個(gè)月)、第1、2和3個(gè)月收集來(lái)自每個(gè)參與者的尿和血液樣品。^LAJ^嚢3個(gè)月后，在不進(jìn)行NS治療的又一個(gè)月里監(jiān)測(cè)受試者。在第4個(gè)月結(jié)束時(shí)，參與者進(jìn)行最后的^并收集其血液;M^。將EDTA-血液樣品送至加納庫(kù)馬西的KomfoAnokye教學(xué)醫(yī)院(KATH)以使用自動(dòng)分析儀SysmexKX-21(SysmexCorporation,Kobe,Japan)來(lái)進(jìn)行血液學(xué)分析。在NMIMR使用化學(xué)自動(dòng)分析儀(EosBravoPlus;HospitexDiagnostics,Italy)進(jìn)行血清生化分析。在NMIMR使用電解質(zhì)(Na/K)自動(dòng)分析儀(Humalyte;HumanDiagnostic,Germany)來(lái)進(jìn)行電解質(zhì)分析。將部分尿和血清樣品送至TAMU和TTU進(jìn)行效力評(píng)估。簡(jiǎn)言之，按照經(jīng)Sarr等(1995)和Wang等(1999)修改的Groopman等(1992)所報(bào)道的方案，分析>^#中的急性AF暴露生物標(biāo)志物AFM1。使用Wang等(1996)所報(bào)道的方案，測(cè)量血清中的AFBr白蛋白加合物(表明長(zhǎng)期暴露AF的另一種生物標(biāo)志物)。給予參與者ID號(hào)，并隨機(jī)分配到下列3個(gè)治療組之一中高劑量(HD)、低劑量(LD)或安慰劑(PL)，it^示他們?cè)?個(gè)月期間一天三次(飯前服用，并與至少100ml水一起服下份別服用兩個(gè)含有500mgNS、250mgNS和250mg安慰劑的膠嚢?？偣玻鯤D和LD組每天分別接受3.0和L5gNS。作為安全性預(yù)防，選擇3.0gNS作為最高劑量，這是因?yàn)榛谙惹暗膭?dòng)物研究，它代表了NS針對(duì)AF的MED(最少有效劑量)。該研究的劑量選#^基于從先前發(fā)表的動(dòng)物模型中劑量測(cè)定數(shù)據(jù)(Phillips1999;Phillips等2002，2006)以及在美國(guó)用于短期人類研究的NS水平(Wang等2005)所作出的推斷。所述HD(3.0gNS/天)表示加納人平均每天消耗食物估計(jì)量的約(K25。/。的NS(重量/重量)。另外，飲食中多至2%的NS(重量/重量)(8倍于本研究中所述的HD水平)在暴露6.5個(gè)月后的嚙齒動(dòng)物中沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的副作用(Afriyie-Gyawu等2005)。為了監(jiān)測(cè)NS^的潛在毒性，列出了癥狀清單，其包括每日記錄工作表(DailyDiaryWorksheet,DDW)作為評(píng)估工具。研究監(jiān)測(cè)者記錄任何不fc^應(yīng)，并需要向上級(jí)和/或當(dāng)?shù)蒯t(yī)生報(bào)告任何健康問(wèn)題。研究團(tuán)隊(duì)中的醫(yī)生每?jī)芍軐忛喴淮蜠DW。根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估癥狀輕度(l級(jí))，輕微困擾，對(duì)癥治療后緩解；中度(2級(jí))，困擾并干擾了活動(dòng)，對(duì)癥治療后僅部分緩解；重度(3級(jí))，妨礙了常規(guī)活動(dòng)，對(duì)癥治療后未緩解。不論何時(shí)報(bào)告癥狀，都要進(jìn)行體檢和實(shí)驗(yàn)室分析以進(jìn)行確認(rèn)，如有必要可在研究過(guò)程中進(jìn)行。由當(dāng)?shù)蒯t(yī)生對(duì)受試者進(jìn)行治療，如果認(rèn)為癥狀與NS^無(wú)關(guān)，則對(duì)其繼續(xù)進(jìn)行研究。如果癥狀與NS膠嚢有關(guān)，則對(duì)參與者進(jìn)行治療并停止繼續(xù)^膠嚢。當(dāng)?shù)蒯t(yī)生可以使用美國(guó)NIH指南制定的不良>^應(yīng)凈艮告文件，從而向研究人員以及NMIMR和TAMU的IRB報(bào)告任何不K應(yīng)。所有數(shù)據(jù)均由NMIMR的數(shù)據(jù)處理團(tuán)隊(duì)使用受試者的識(shí)別碼進(jìn)行錄入。除研究人員之外的工作人員無(wú)法獲知參與者的姓名。使用MicrosoftExcel軟件對(duì)來(lái)自問(wèn)巻、臨床報(bào)告以及針對(duì)攝入、毒性監(jiān)測(cè)和不良反應(yīng)事件的DDW的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入和處理。在數(shù)據(jù)錄入完成后，兩個(gè)研究人員獨(dú)立地審閱所記錄的數(shù)據(jù)以確保精確。為了顯示NS膠嚢攝入的安全性，統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估著眼于對(duì)不同治療水平和不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較。計(jì)算每個(gè)參數(shù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和中值，除非另有說(shuō)明，否則參數(shù)的值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。對(duì)于正態(tài)分布的參數(shù)，使用雙因素ANOVA和Bonferroni方法來(lái)比較不同治療組和時(shí)間的平均值之間的顯著差異。使用卡方檢驗(yàn)來(lái)分析不良反應(yīng)/毒性數(shù)據(jù)的相關(guān)性和發(fā)生率。對(duì)于非正態(tài)分布的^^l:來(lái)說(shuō)，使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)來(lái)比較不同治療組和不同時(shí)間點(diǎn)的差異。P值小于0.05(雙尾)被認(rèn)為具有顯著性。所有分析均使用SAS軟件9.1.3版(SASInstituteInc.,Cary，NC,USA)來(lái)進(jìn)行。對(duì)NS粘土中二噁英/呋喃和金屬的量進(jìn)行分析。在17種USEPA優(yōu)先PCDD/PCDF中，1，2，3,4,6，7，8-七氯二苯并對(duì)二噁英(HpCDD)和八氯二苯并對(duì)二噁英(OCDD)是NS中存在的僅有的兩種高于檢出限(對(duì)于HpCDD，LOD4.11份/萬(wàn)億份(ppt)，對(duì)于OCDD是1.91ppt)的污染物。NS粘土中HpCDD和OCDD的平均濃度分別是4.42和23.74ppt。應(yīng)用毒性當(dāng)量因子(toxicequivalentfactor,TEF)(WHO1998)，對(duì)HpCDD和OCDD計(jì)算得到這些二噁英的毒性(或TCDD)當(dāng)量(TEQ)值分別是0.0442和0.00237ppt，再加上NS中另外的TEQ0.0466ppt。在所述HD治療中，3.0g的NS提供了0.1397pg/天的TEQ。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，TCDD的人可耐受攝入量(tolerablehumanintake,THI)為2.3pg/kg體重/天，也就是說(shuō)，對(duì)于70kg的男性來(lái)說(shuō)為161pg/天，對(duì)于60kg的女性來(lái)i兌為138pg/天。才艮據(jù)這些值，3.0gNS/天的TEQ對(duì)于女性和男性平均而言分別33比每日WHO-THI標(biāo)準(zhǔn)低約1,000和I，IOO倍。在每天3gNS中，重金屬(例如砷、鎘和鉛)的水平比標(biāo)準(zhǔn)推薦值(JECFA1998)低7至80倍(數(shù)據(jù)未顯示)。根據(jù)所使用的分析方法，發(fā)現(xiàn)汞低于檢出限(LOD=0.009mg/kgNS)。篩選出的所有507名志愿者都是血清AFBr白蛋白加合物陽(yáng)性的(范圍0.1-4.7pmolAFB^亳克白蛋白)。下表2描述了參與4^f究之受試者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征。首先，我們根據(jù)所確定的納入標(biāo)準(zhǔn)選擇了總共180人的研究群體，并基于參與者的血清AFBr白蛋白加合物水平將他們隨機(jī)分為3個(gè)組(每組60人)一一HD、LD和PL。治療一開(kāi)始便撤去了三個(gè)受試者(一個(gè)來(lái)自LD組，兩個(gè)來(lái)自PL組)，這是因?yàn)閮擅詰言?，一位男性由于新工作的緣故選擇退出。在NS攝入三個(gè)月后，生理參數(shù)(例如年齡、體重和舒張壓)未受到明顯影響。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，分別與121.9±23.1和129.9±24.5mmHg的基線值相比，LD(112.7±15.0mmHg)和PL(117.4±19.8mmHg)的收縮壓(SBP)平均值顯著降低(PO.01)，盡管這沒(méi)有臨床意義。HD組的SBP未變化。表2.人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和生理^人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征參與者高劑量治療絲去慰刺性別男女社區(qū)DromankomaEjuiaGroupNJkwantaHiawoanwuKaseiKotokoliLine年齡(歲)體重0tg)a試驗(yàn)前試驗(yàn)后t收縮壓(SBP)(mmHg)"*試驗(yàn)前試驗(yàn)后舒張壓(DBP)(mmHg)"試驗(yàn)前60342613106181038.^±，3.060.9±10,26M±10.l121.(^20.079.1±15.879.(^16.2$931281288，5II77.1±15-27S.0±1I.35837212012962.砂861.3±10,9U9,9±24.581.5±14.777,2±13.7a平均值士標(biāo)準(zhǔn)差；bSBP/DBP的正常值為120/80;*P<0.05，**P<0.01(相比于基線值)。對(duì)于HD、LD和PL來(lái)說(shuō)，完成全部三個(gè)月試驗(yàn)的研究參與者的百分?jǐn)?shù)分別是90.0、89.8和94.8%，完成該研究的受試者總數(shù)占91.5°/。。在34177位研究受試者中一共有15位(6位來(lái)自HD組，6位來(lái)自LD組以及3位來(lái)自PL組)沒(méi)有完成該研究。就^UMli而言，在HD、LD和PL組中分別有97.4、96.4和98.6%的參與者根據(jù)所述研究方案堅(jiān)持NS治療方案。不論是否完成該研究，參與者中整體堅(jiān)持率(服用膠嚢的次數(shù))超過(guò)97%。表示參與者依從性與研究完成性的數(shù)據(jù)總結(jié)于表3中。表3、參與者M(jìn)性與治療方案的完成性參與者向研究監(jiān)測(cè)者報(bào)告的癥狀如下表4中所示。所述NS劑量水平(1.5或3.0g/天)對(duì)HD和LD組中的參與者是可耐受的。所凈艮告的癥狀包括惡心、嘔吐、腹瀉、腹部不適、胃灼熱和頭暈。超過(guò)50%的所報(bào)告癥狀發(fā)生于研究的頭兩周，其余癥狀在之后間或被報(bào)告，直至研究結(jié)束。所有三個(gè)組中有45位研究參與者(約56%女性和44%男性)凈艮告了這些癥狀中的至少一種，所述參與者分別為17人(37.8%)來(lái)自HD組，13人(28.9%)來(lái)自LD組以及15人(33.3%)來(lái)自PL組。除了惡心癥狀以外，所有這些效應(yīng)均不是劑量依賴性的或與NS有關(guān)的。這些癥狀中絕大部分由一至三名任意組的受試者報(bào)告，嘔吐、腹瀉、胃灼熱和頭暈除外(它們由超過(guò)三個(gè)人報(bào)告，但劑量依賴性趨勢(shì)不明顯)。例如，HD組中一位44歲女性受試者占了所記錄28次頭暈中的20次(表3)。在LD組中胃灼熱發(fā)生率似乎也較高，但是僅有兩名受試者報(bào)告了該反應(yīng)，其中一名報(bào)告了22次記錄中的18次。大多數(shù)癥狀被評(píng)定為"輕度"，少數(shù)為"中度"，沒(méi)有"重度"癥狀發(fā)生。在研究過(guò)程中超過(guò)99。/。的時(shí)間里，參與者未報(bào)告不良的健康后果。表4、所報(bào)告的健康狀況_治療組_高劑量低劑量安慰劑，gTF幼外58177545355162卯,OVo89抓94.8%9135%14847I柳715035445793卯54322011531523715240152554573297.496.49ft,697.S>數(shù)數(shù)月>次次數(shù)>個(gè)w案囊囊次w者G率方膠膠告率與始成成療用過(guò)報(bào)持參起完完治服錯(cuò)t堅(jiān)a表明所凈艮告健康狀況的次數(shù)在血液學(xué)分析中(在下文表5中顯示)，無(wú)論3個(gè)月試驗(yàn)之前還是之后，三個(gè)治療組中的任何M均沒(méi)有顯著的劑量依賴效應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。在時(shí)間效應(yīng)方面，僅有白細(xì)胞(WBC)差異分析中的單核細(xì)胞百分比顯示顯著降低，其出現(xiàn)在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)與基線值(3.2±2.1%)相比的HD組中(2.2±1.7%，平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)(PO.05);試驗(yàn)結(jié)束時(shí)與基線值(3.4±1.7%)相比的PL對(duì)照組中(2.5±2.1%)(PO.01)(表4)。該效應(yīng)在LD組中未觀察到。所有其它M均未受影響。另夕卜，在NS治療組(HD和LD)以及安慰劑組(PL)的所有所評(píng)估^t之間未觀察到顯著差異。表5、血液學(xué)分析_治療組_一嵩剖臺(tái)'低奏j量安慰刊^_試驗(yàn)前試驗(yàn)后試驗(yàn)前試驗(yàn)后試驗(yàn)前試驗(yàn)后臨床參考a平均值士標(biāo)準(zhǔn)差；*P<0.05，**P<0.01，與相應(yīng)基線值相比是顯著的。血清生化分析表明如下文表6中給出的少數(shù)M具有孤立的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。與基線值相比，丙氨酸JL^轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平僅在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的PL組中顯著降低(P<0.05)。與基線值相比，總膽紅素(T-BILI)含量在^LANS3個(gè)月之后的HD(P<0.01)和PL(P<0.05)組中《^下降。__治療組_^__■高劑量低劑量安慰劑總計(jì)WBC(IO，，1)RBC(10'mm,HEMOGL(gdTl)HEMATOC傷)MCV(fl)MCH(pg)MCHC(gd11)PLT(109l")LYMPHO(W)MONO<%)EOSINO(%)BASO(%)282132810112000015,148(99.42%)15,152(99.42%)15'l卯(99.77%)45,49，(99.47%)89(0.58%)明(0.58%)65(0.43%)242(0.53%)5.6±，.5>5.0^0.613-9±1.543-2^4.428.1±2.832.2±1.436趕7-S46.1±7.92>2±1.7±15.0±8.84.9±1.54.8^0.513.5±1.842.7^4.889.1土7響228.1土3.031.5±1.4223.6±96.032.2±8.92.6+1.6I5.Q±10.00.1^0.45.6+1.54.9±0.643.1^5.187.6±8.128.1±3.431.6土2.6240.6±75.135.5土10-52.1±1.65.S+2.I3.4-95.0±0.62.5-5.513.8+1.6U.7-16-S42.9±4.537.1-51.486糾.786~11028.62.526~3831.2+5.331-37231.^60.997-35637,8±10.140-7547.5+8.42"52.5±2.1"2-1012.2+5.7140.1±0.4<1應(yīng)良振適用率反不不不熱脹作生良化心吐秘瀉脹欲部灼暈眠氣副發(fā)不消惡嘔使腹氣食l胃頭失胃無(wú)悉<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>而該效應(yīng)在LD組中沒(méi)有出現(xiàn)。另外，與基線值相比，血液尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)水平在研究結(jié)束時(shí)的所有治療組中顯著降低。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，血清肌酸酐(CREAT)水平在所有組中均有略微提高(P<0.01)。與基線值相比，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)HD和LD組中的鈉7jC平顯著提高。而該效應(yīng)在PL組中未出現(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)PL組中的鉀水平相比于基線值,降低(P<0.01)。在所有這些生化效應(yīng)中，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)NS治療組和安慰劑組之間未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。其它所有被評(píng)估的血清生化^L均未受影響。兩名醫(yī)生(一名加納的執(zhí)業(yè)醫(yī)生以及一名美國(guó)的非執(zhí)業(yè)醫(yī)生)確認(rèn)了研究中所評(píng)估的所有參數(shù)的結(jié)果。表6、血清生化性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>a平均值土標(biāo)準(zhǔn)差；*P<0.05，**P<0.01，與相應(yīng)基線值相比是顯著的。該研究的結(jié)果表明，如體檢、血液學(xué)M和生化參數(shù)所證明的，在3個(gè)月的時(shí)期內(nèi)施用NS膠嚢(1.5和3.0g/天)顯然是安全的。除了隨機(jī)化、雙盲以及安慰劑對(duì)照的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以外，還進(jìn)行了相當(dāng)多的工作以使可能的混淆變量最少。例如，對(duì)PCDD/PCDF的分析表明，HD和LD組所接受的NS膠嚢中的二噁英比WHO-THI標(biāo)準(zhǔn)要低1000和2000倍。由于PCDD/PCDF同類物可在脂肪組織中積累并對(duì)人具有高度毒性，因此上述問(wèn):SI^很重要的(Startin等19卯；Jensen2001)。研究參與者是根據(jù)既定的納入標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行挑選的，但隨機(jī)化過(guò)程根據(jù)他們的血清AFBr白蛋白加合物濃度來(lái)嚴(yán)M行。這種刻意的設(shè)計(jì)使得代表各性別和各社區(qū)的參與者(每組中)數(shù)目相差懸殊。體重和血壓值不以劑量依賴形式受到影響。參與者對(duì)該治療方案的堅(jiān)持情況非常好(超過(guò)97%)，并且超過(guò)卯％的研究受試者完成了該研究，這一點(diǎn)對(duì)于一項(xiàng)為期337個(gè)月研究來(lái)說(shuō)是值得稱道的(表II)。所述NS劑量水平對(duì)參與者來(lái)說(shuō)是可耐受的。除惡心以外，所才艮告的癥狀中無(wú)一與NS有關(guān)。但是，在3個(gè)月試驗(yàn)過(guò)程中，在HD和LD組中分別僅有一人報(bào)告了6次惡心，一人報(bào)告了4次惡心。血液學(xué)分析表明，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)NS治療組和PL對(duì)照組之間沒(méi)有劑量依賴性的顯著差異。在HD和PL組中，WBC差異分析顯示基線值和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)之間單核細(xì)胞百分比顯著降低。但是，該效應(yīng)完全在臨床參考范圍內(nèi)，并且MLD組中觀察到(表4)。在NS治療組和安慰劑對(duì)照之間的所有其它^lbi統(tǒng)計(jì)學(xué)相當(dāng)?shù)?。這提示，食用NS不太可能促成炎性過(guò)程、損害免疫力、造成骨髓改變或者導(dǎo)致感染性疾病發(fā)生率提高。血清生化分析顯示，少數(shù)參數(shù)具有孤立的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，而沒(méi)有特定的相關(guān)性趨勢(shì)或劑量依賴性趨勢(shì)(表5)。另外，所有測(cè)量的^均在正常生理范圍內(nèi)。總的來(lái)說(shuō)，這些參數(shù)的效應(yīng)缺乏劑量依賴性，因此提示NS對(duì)這些標(biāo)準(zhǔn)生化^的生理水平?jīng)]有顯著的不良效應(yīng)。該IIa期臨床干預(yù)試驗(yàn)評(píng)估了NS粘土在預(yù)防人受試者接觸飲食AF中的安全性和效力。盡管觀察到幾個(gè)>#*的顯著改變，但是這些效應(yīng)似乎均不是NS相關(guān)性或劑量依賴性的，并且所有M都在正常生理界限內(nèi)。該證據(jù)提示，短期攝入最小有效劑量(MED)(0.25%(重量/重量))的NS不太可能在人體中產(chǎn)生明顯的毒性。重要的是，這些發(fā)現(xiàn)為將來(lái)使用NS來(lái)挽救和保護(hù)急性暴露于高水平飲食AF的人提供了支持。接下來(lái)的研究要確保使NS的劑量測(cè)定和遞送方法最優(yōu)化。還需要IIb期和III期干預(yù)和流行病學(xué)研究來(lái)發(fā)汪NS用于長(zhǎng)期治療的安全性和效力，以及將其加入HBV高力流行地區(qū)以及具有黃曲霉毒素中毒高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的人類食物中的可能性。實(shí)施例4除了造成肝損傷以外，飲食暴露黃曲霉毒素(AF)會(huì)降低血清和組織的維生素(Vit)A和E水平。為了進(jìn)一步評(píng)估NS對(duì)人體中這兩種維生素利用的影響，從上文實(shí)施例3中進(jìn)行的2a期臨床試驗(yàn)中收集第0、1和3個(gè)月時(shí)個(gè)體的655份血清樣品，利用HPLC法測(cè)量其VitA和E水平，所述個(gè)體包括接受為期3個(gè)月的1.5gNS/天(低劑量)、3.0gNS/天(高劑量)或安慰劑的177名健康加納志愿者。在開(kāi)始時(shí)(時(shí)間為0，基線(BL))、38第1個(gè)月(第4周，W4)、第3個(gè)月(第12周，W12)和試驗(yàn)完成后1個(gè)月時(shí)(第16周，W16)收集來(lái)自每位參與者的血樣。使用液液萃取方法提取血清VitA和E，然后用帶有UV檢測(cè)器的ThermoFinnigan(Waltham，MA)HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。調(diào)整梯度以同時(shí)洗脫VitA(在325nm處檢測(cè))和維生素E(在292nm處檢測(cè))。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線以進(jìn)行樣品定量。通過(guò)血清樣品的體積來(lái)調(diào)節(jié)VitA和E濃度。更具體地，根據(jù)先前所述的步驟(Ruperez等2004)在柔和的紅光下提:ftA血清維生素A(VA)和E(VE)。簡(jiǎn)言之，將人血清樣品(50ml)與150ml乙醇:氯仿(3:1(體積/體積)，含0.01%BHT抗氧化劑)混合以沉淀蛋白，并在1.5ml微量離心管中用300ml己烷進(jìn)一步提取。離心后，除去己烷層，利用Centrivap(Labconco，Kansas,MS)進(jìn)行干燥。用300ml流動(dòng)相重溶殘余物，用于根據(jù)Burri等(2003)的步驟進(jìn)行HPLC分析。使用帶有P訓(xùn)00泵、有100ml通道(loop)的AS3000自動(dòng)進(jìn)樣器以及UV6000LP光電二極管陣列檢測(cè)器的ThermoFinnigan;M目色鐠(ThermoSeparationProducts,RivieraBeach，F(xiàn)L)進(jìn)行分才斤。利用具有150mm4.6mmID和5mm凈立徑的Microsorb100-5C18柱(Varian，PaloAlto，CA)使用流動(dòng)相A(ACN:THF:MeOH:AA為85:5:5:5，體積/體積/體積/體積)和流動(dòng)相B(ACN:THF:MeOH:AA為55:35:5:5，體積/體積/體積/體積)在iml/分鐘的流速下以50ml的注射體積進(jìn)行色鐠分離。洗脫譜在最初5分鐘由95%A和5%B組成，然后在13分鐘內(nèi)漸變?yōu)?%A和950/。B。之后，保持該^^2分鐘，然后用95。/。A和5。/。B清洗該柱8分鐘。總運(yùn)行時(shí)間是28分鐘。基于將峰面積和保留時(shí)間與參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較來(lái)對(duì)兩種維生素進(jìn)行定量。計(jì)算了血清VitA和E濃度的平均值、中值和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，將數(shù)值表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。通過(guò)使用ANOVA或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)對(duì)三個(gè)處理組在不同時(shí)間點(diǎn)的血清VitA和E水平進(jìn)行比較。使用非^混合模型分析NS治療對(duì)VitA和E水平的劑量和時(shí)間效應(yīng)。P值小于0.05(軋C)被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。所有數(shù)據(jù)均使用SAS軟件9.1.3版(SASInstituteInc.,Cary，NC)進(jìn)行分析。下文表7中顯示研究受試者中血清VitA水平的結(jié)果。安慰劑組(2.09±0.56nmo!/L)、低劑量組(2.15±0.74jimol/L)和高劑量組(2.14±0.92Hmol/L)中的血清VitA基線水平是相當(dāng)?shù)?P=0.8702)(圖4a)。在第139個(gè)月的樣品中，在低劑量(2.28±0.85nmol/L)、高劑量(2.21±0.95nmol/L)和安慰劑(2.21±0.57jimol/L)組之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異(P=0.7324)(圖4b)。在第3個(gè)月的樣品中，在低劑量(2.22±0.87pmol/L)、高劑量(2.30土0.71nmol/L)和安慰劑(2.32±0.83ftmol/L)組之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異(P=0.7305)(圖4c)。另外，在試驗(yàn)后l個(gè)月時(shí)收集的樣品中，治療組和安慰劑組之間VitA的水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P=0.3665)(圖4d)。表7、所t個(gè)組在不同時(shí)間點(diǎn)的VitA水平(nmol/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>BL(基線)，W4(第4周)，W12(第12周)，W16(第16周)下文表8中顯示研究受試者中血清VitE水平的結(jié)果。安慰劑組(16.07±4.74nmol/L)、低劑量組(16.40±5.08jimol/L)和高劑量組(15.64±4.97pmol/L)中的血清VitE基線水平也是相當(dāng)?shù)?P=0.6798)(圖5a)。在第1個(gè)月的樣品中，在低劑量(17.9±4.99fimol/L)、高劑量(17.08±4.83fimol/L)和安慰劑(17.32±4.97pmol/L)組中;ML現(xiàn)顯著性(P=0.5868)(圖5b)。在第3個(gè)月的樣品中，在低劑量(17.03±4.71jimol/L)、高劑量(17.33±4.21nmol/L)和安慰劑(18.01±6.29jimol/L)組中iML現(xiàn)顯著性(P=0.7618)(圖5c)。另外，在試驗(yàn)后1個(gè)月時(shí)收集的治療組和安慰劑組樣品的VitE水平(P=0.1543)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖5d)。表8、所C個(gè)組在不同時(shí)間點(diǎn)的VitE水平(jimol/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>BL(基線)，W4(第4周)，W12(第12周)，W16(第16周)該結(jié)果顯示，在3個(gè)月的期間里使用NS粘土飲食干預(yù)并未顯著影響研究參與者血清中VitA和E的水平。這些結(jié)M明，在具有黃曲霉毒素中毒(以及可能的營(yíng)養(yǎng)不良)高風(fēng)險(xiǎn)的人群中進(jìn)行NS干預(yù)不會(huì)干擾這些重要微量營(yíng)養(yǎng)物的利用。實(shí)施例5為了進(jìn)一步評(píng)估NS對(duì)人的影響，在研究開(kāi)始和結(jié)束時(shí)測(cè)量上述實(shí)施例3中所進(jìn)行的2a期臨床試驗(yàn)的受試者血清樣品中的礦物質(zhì)(分為營(yíng)養(yǎng)物和非營(yíng)養(yǎng)物)濃度。營(yíng)養(yǎng)物礦物質(zhì)包括Cu、Fe、K、Mg、Na、P、S、Zn、Co、Cr、Mn、Mo、Ni和Se。非營(yíng)養(yǎng)物礦物質(zhì)包括Ag、Al、As、Ba、Be、Cd、Hg、Li、Pb、Sb、Sr、Ti、Tl、U和V。該研究中的個(gè)體包括分別接受了為期3個(gè)月的1.5gNS/天(低劑量)、3.0gNS/天(高劑量)或安慰劑的177個(gè)健康加納志愿者。分析AjfiL清樣品中的微量礦物質(zhì)如下進(jìn)行測(cè)量。將血清樣品(約0.45g)與200ml自酸在15ml離心管中混合，在卯'C加熱過(guò)夜，而后冷卻。然后加入100111130%的11202，將樣品在70'C加熱一小時(shí)，然后冷卻；然后加入50ml濃鹽酸，將樣品在70。C加熱一小時(shí)，然后冷卻；然后加純水使樣品終體積為10ml。用氯化錫作為還原劑4吏用M-7500(CetacTechnologies,Omaha,NE)通過(guò)冷蒸氣原子吸收法(CVAA)來(lái)測(cè)定汞(Hg)濃度。利用電感耦合等離子體發(fā)射光鐠儀(inductivelycoupledplasma-opticalemissionspectrometer,ICP-OES)，使用帶有軸向觀察和鐿(Yb)作為內(nèi)參的CirOS(SpectroAnalyticalInstruments,Fitchburg，MA)測(cè)定鋁(A1)、硼(B)、鋇(Ba)、鈹(Be)、釣(Ca)、鈷(Co)、銅(Cu)、鐵(Fe)、鉀(K)、鎂(Mg)、鉬(Mo)、鈉(Na)、磷(P)、硫(S)、硅(Si)、鍶(Sr)、鈦(Ti)、釩(V)和鋅(Zn)。利用電感耦合等離子體-質(zhì)鐠儀(ICP-MS)使用Elan6100(Perkin-Elmer,Wellesley，MA)測(cè)定銀(Ag)、砷(As)、鎘(Cd)、鉻(Cr)、錳(Mn)、鎳(Ni)、鉛(Pb)、硒(Se)和鉈(Tl)，其中As、Cr、Mn和Se在DRC模式中獲得，并以鉍(Bi)、鎵(Ga)和銠(Rh)作為內(nèi)參。除了空白、加標(biāo)空白、一式二份樣品和加標(biāo)樣品以外，每一批樣品均需制備并分析標(biāo)準(zhǔn)參比物質(zhì)(Seronorm，Billingstad,Norway)以！Hi結(jié)果。結(jié)果顯示于下文表9和表10中。表9、研究受試者的血清樣品中非營(yíng)養(yǎng)物礦物質(zhì)的分析基線水平對(duì)比試驗(yàn)結(jié)束時(shí)高劑量NS礦物質(zhì)試驗(yàn)前試驗(yàn)后Ag(銀)OigZL)0.23±0.030.26:i:0.27Al(鋁132.0871.92130.1773.56As(砷8.83±1.458.631.63Ba(鋇80.0715.23115.92士32.S9*Be(鈹1.110.061.110.12Cd(鎘0.700.380.710.39Hg(汞5.570.305.600.60Li(鋰22.301.1522.372.44Pb(鉛)(Mg/L)16.13士8.5515.039.25Sb(銻l.U0.011.13db0.15Sr(鍶71.5018.4799.94±28-24*Ti(鈦1U.436.00111.9112.0&Tl(鉈0.24土0.060.250.20u(鈾0.240.120.22±0.02v(釩)0g/L)11.140.6011.191.21*P<0.01表10、研究受試者的血清樣品中營(yíng)養(yǎng)物礦物質(zhì)的分析基線水平對(duì)比試驗(yàn)42結(jié)束時(shí)的高劑量NS礦物質(zhì)試驗(yàn)前試^險(xiǎn)后Ca(鈣)(mg/L)91.994.7795-17±6.27Cu(銅)(mg/L)1.330.331.270.22Fe(鐵)(mg/L)1.32±0.601.330.44K(鉀)(mg/L)218.77±24.15192.70±19.27Mg(鎂)(mg/L)18.361.5619.471,73Na(鈉)(mg/L)3113.3374.283183.50134.93P(磷)(mg/L)108.9312.82115.1215鄰S(硫)(mg/L)1224.50±77.621276.67105.04Zn(鋅)(mg/L)1.280.441.36±0.37Co(鈷)0ig/L)1.35±0.961.350.83Cr(鉻)Gig/L)6.577.956.163.36Mn(錳)(fig/L)5.84±6.045.818.30Mo(鉬)Gig/L)16.32±4.6822.23±11-58Ni(鎳)0*g/L)18.057.7018.16士6.32Se(硒)0ig/L)116.5022.06124.5723.41除了鈣、鉀和鉬以外，大多數(shù)所分析的礦物質(zhì)水平未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。血清Ca和K水平在正常范圍內(nèi)。Mo的正常范圍值尚不明確。血清鋇和鍶是僅有的在研究結(jié)束時(shí)顯著增加的非營(yíng)養(yǎng)物金屬。對(duì)這些二價(jià)陽(yáng)離子的增加進(jìn)fr^價(jià)是困難的，這是因?yàn)槠錄](méi)有可用的臨床參考。鍶和鋇都是食物和水中天然存在的，3g(高)劑量NS粘土中所^^有的Sr和Ba水平完全低于推定的食物TDI。總之，這些研究的結(jié)果為將來(lái)在人飲食中使用NS粘土來(lái)阻斷或顯著降低對(duì)AF的暴露以及在食用污染了AF^物的人中預(yù)防AF不良反應(yīng)提供了支持。另外，骨架礦物質(zhì)(frameworkmineral)例如鋁并非被胃腸道顯著利用。由于NS粘土暴露而顯著增加的礦物質(zhì)僅有Ba和Sr，而這兩種金屬的臨床參考正常范圍尚不明確。實(shí)施例6如前所述測(cè)量含有多種粒徑的CASAD粘土中存在的二噁英的量以及尺寸選擇后僅含有小于80微米顆粒的CASAD粘土中存在的二噁英的量。尺寸選擇前，所述CASAD粘土所含二噁英的量顯示于下文表11中。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>的真菌代謝產(chǎn)物(真菌毒素)，其長(zhǎng)期以來(lái)被i人為是食物的危險(xiǎn)污染物。黃曲霉毒素Bi(AFBJ具有肝毒性和基因毒性，并已被歸類為已知的人類致癌物質(zhì)(第I組)。如許多報(bào)道(包括最W肯尼亞爆發(fā)的)所證實(shí)的，經(jīng)由飲食急性暴露于高水平的AFBi會(huì)導(dǎo)致人類疾病(黃曲霉毒素中毒)和死亡。在非洲和東南亞的幾個(gè)地區(qū)，長(zhǎng)期暴露于低水平AF是患人肝細(xì)胞癌(HCC)的主要風(fēng)險(xiǎn)因素之一。重要的是，還顯示AFBi是動(dòng)物和人體中強(qiáng)的免疫毒劑。因此，開(kāi)發(fā)和應(yīng)用針對(duì)黃曲霉毒素中毒的實(shí)用且高效的干預(yù)策略與療法對(duì)于改善人類健康(尤其在高風(fēng)險(xiǎn)人群中)來(lái)說(shuō)是必要的。已有報(bào)道人和動(dòng)物(數(shù)個(gè)世紀(jì)以來(lái)，并且在大多數(shù)大陸上)食用粘土礦物(食土痔)。這種行為的原因一般難于解釋，但是食用粘土通常被認(rèn)為是有益且安全的。例如，與自然密切接觸的人們食用粘土是很常見(jiàn)的，在南美和非洲的許多地方，食用粘土是文化上可接受的。NovaSil粘土(NS)是天然存在并經(jīng)過(guò)熱處理的鈣蒙脫土，其常用作動(dòng)物飼料中的抗結(jié)塊添加劑。先前的研究已顯示，在動(dòng)物模型中當(dāng)飲食中包含高達(dá)0.5%(重量/重量)水平的NS時(shí)，NS是黃曲霉毒素的選擇性腸吸附劑。NS顯著地保護(hù)多種動(dòng)物幼仔(包括雞雛、火雞雛、豬、羔羊和嚙齒動(dòng)物)免受黃曲霉毒素中毒。另外，NS還降低泌乳牛和山羊的乳中AF的殘留，以及嚙齒動(dòng)物中AF暴露的生物標(biāo)志物。#理上講，NS降低了胃腸道中AF的吸收，這導(dǎo)致AF暴露及其隨后毒性的顯著降低。從平衡吸附等溫曲線和分子建^9f究推導(dǎo)出的信息表明NS偏好含有平面酮內(nèi)酯系統(tǒng)的AF。將NS添加至飲食后的短期動(dòng)物研究中尚未報(bào)道可觀察的不良效應(yīng)。在懷孕期間^bV濃度高達(dá)2.0%的NS的Sprague-Dawley(S-D)大鼠中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)母體或胎兒毒性。另外，在多種母體或胎兒組織中iML現(xiàn)微量金屬生物利用度的顯著變化。在一項(xiàng)長(zhǎng)期研究中，在6個(gè)月的時(shí)間里，用飲食中0.25-2.0%NS粘土治療的S-D大鼠未在體重增加、飼料轉(zhuǎn)化率、相對(duì)器官重量、主要器官的整體外觀和組織學(xué)外觀以及血液學(xué)和血清生化^lt方面表現(xiàn)出劑量依賴性不良效應(yīng)。此外，必需營(yíng)養(yǎng)物(包括維生素A和E、Fe和Zn)水平未受影響。考慮到NS在多種動(dòng)物模型中的安全性和效力及其低成本，在JCA中國(guó)家具有黃曲霉毒素中毒風(fēng)險(xiǎn)的人的飲食中加入NS可能是特別有益的。首先，在健康志愿者中為期兩周的I期臨床試驗(yàn)顯示每曰^A多至3g/天的NS對(duì)人受試者沒(méi)有明顯的不良效應(yīng)?；谠撗芯康陌l(fā)現(xiàn)，在飲食暴露于AF的180名加納人中進(jìn)行了為期3個(gè)月的隨機(jī)化、雙盲、安慰劑對(duì)照的IIa期干預(yù)研究。在該實(shí)施例中，通過(guò)分析在研究之前(基線)、在干預(yù)的第1個(gè)月和第3個(gè)月以;ML干預(yù)后1個(gè)月時(shí)收集的血清和M品中的生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)估NS干預(yù)的效力。該研究的結(jié)果為將iMt人飲食中使用NS來(lái)阻斷或顯著降^XtAF的暴露以及在食用污染了AF之谷物的人中預(yù)防AF不良反應(yīng)提供了支持。卩H國(guó)AFBi(28Ci/mmol)購(gòu)自MoravekBiochemicals(Brea，CA，USA)。標(biāo)準(zhǔn)AFBpMi和放射性免疫測(cè)定試劑獲得自Sigma(St.Louis，MO，USA)。單克隆抗體2B11由MIT的Dr.GN.Wogan友情提供。免疫親和柱購(gòu)自VICAM(Watertown，MA，USA)。NS粘土最初獲得自EngelhardChemicalCorporation(Iselin,NJ，USA),并進(jìn)一步檢測(cè)其可能的環(huán)境污染物(包括多氯二苯并對(duì)二噁英/呋喃(PCDD/PCDF)和重金屬，以確保符合聯(lián)邦標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，如前詳細(xì)描述地(Afriyie-Gyawu等，2007;Wang等，2005)。NS膠嚢在藥研院(ColoradoSprings,CO)按照藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)在無(wú)菌條件下進(jìn)行制備。所有膠嚢包括匹配安慰劑在內(nèi)都是相同尺寸、形狀和顏色的。除非另有說(shuō)明，所使用的所有化學(xué)品和試劑均以可獲得的最高純度購(gòu)得。挑選四個(gè)來(lái)自Ejura-Sekyedumase地區(qū)(ESD)的社區(qū)以及兩個(gè)來(lái)自Ejura分區(qū)的社區(qū)用于篩選研究受試者。這兩個(gè)地區(qū)屬于加納Ashanti區(qū)，在那里大約76%的居民主要從事農(nóng)業(yè)。在該區(qū)域種植的作物主要包括玉米、花生、山藥、木薯、棉花和煙草。研究之前，建立了其中4個(gè)社區(qū)的AF暴露數(shù)據(jù)和人口統(tǒng)計(jì)學(xué)信息(Jolly等2006)。試驗(yàn)開(kāi)始于2005年9月，完成于2006年4月。整個(gè)研究設(shè)計(jì)遵循如上文實(shí)施例中所述的隨機(jī)化、雙盲、安慰劑對(duì)照的II期臨床試驗(yàn)的指導(dǎo)。研究方案獲得了德克薩斯農(nóng)業(yè)機(jī)械大學(xué)科研評(píng)價(jià)委員會(huì)以及加納的NoguchiMemorial醫(yī)學(xué)研究所針對(duì)倫理許可的科^Hf價(jià)委員會(huì)的批準(zhǔn)。圖6顯示總體研究設(shè)計(jì)和樣品收集過(guò)程的流程圖。簡(jiǎn)言之，從總共507名所篩選志愿者中招募180位受試者，其符合以下標(biāo)準(zhǔn)知情同意；血清AFBr白蛋白加合物水平4毫克白蛋白0.5pmolAFB^18-58歲；根據(jù),結(jié)果、血液學(xué)參數(shù)、肝功能和腎功能標(biāo)志物表明處于健康狀態(tài)，以及無(wú)慢性病史；未使用慢性病或急性病的處方藥；女性處于非懷孕和/或非哺乳期。46將這些參與者隨機(jī)分配到下列3個(gè)治療組之一中一一3.0g、1.5g和安慰劑組，并且在3個(gè)月的時(shí)間里一天三次(飯前服用，并與至少100ml水一起服下)分別服用兩個(gè)含有500mgNS、250mgNS和250mg安慰劑的膠嚢。劑量選擇基于先前動(dòng)物研究中表明的NS的效力和安全性(Phillips1999;Phillips等2002，2006)以及來(lái)自美國(guó)短期A/f^研究的劑量測(cè)定數(shù)據(jù)(Wang等2005)。在研究開(kāi)始時(shí)(基線)、在干預(yù)的第1個(gè)月和第3個(gè)月以及試驗(yàn)結(jié)束后l個(gè)月時(shí)收集來(lái)自每個(gè)研究參與者的血樣和尿樣。立即將血清、血漿和血細(xì)胞分離，并儲(chǔ)存于-20。C。收集;IJl樣品，測(cè)量其體積，并以50ml分裝儲(chǔ)存于-20'C。將每種樣品的等分試樣冷凍運(yùn)送至德克薩斯農(nóng)業(yè)機(jī)械大學(xué)和德克薩斯理工大學(xué)，以進(jìn)行生物標(biāo)志物分析.進(jìn)行分析的實(shí)驗(yàn)人員對(duì)樣品來(lái)源是不知情的。利用定量RIA方法(Wang等1996)來(lái)測(cè)定血清AFBr白蛋白加合物。簡(jiǎn)言之，濃縮血清樣品，并重懸于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中。通過(guò)溴曱酚紫染料結(jié)合方法(Sigma，St.Louis，MO，USA)對(duì)血清白蛋白進(jìn)行定量,使用Bradford法(PierceBiotechnologyInc.，Rockport，IL,USA)確定總蛋白質(zhì)的量。然后，用鏈霉蛋白酶(Pronase)(Calbiochem,LaJolla，CA，USA)消化總蛋白質(zhì)，用丙酮提取該消化產(chǎn)物。對(duì)名^^有2mg蛋白質(zhì)的一式兩份血清蛋白質(zhì)消化物，使用RIA方法對(duì)AFB^白蛋白加合物進(jìn)行定量。使用合并的正常人血清標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma,St.Louis,MO，USA)來(lái)確定該測(cè)定中的非特異性抑制。使用非線性回歸法(Gange等，1996)建立RIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。AFBr白蛋白加合物的濃度表示為每毫克白蛋白中的AFBt量。該測(cè)定的檢出P艮是每亳克白蛋白0.01pmol。使用免疫親和柱純化繼而進(jìn)行HPLC-熒光檢測(cè)來(lái)分析尿樣中的AFMi水平，該方法如經(jīng)Sarr等(Sarr等，1995)和Wang等(Wang等，l"9)修改的Gro叩man等人(Gro叩man等，l"2)所述。簡(jiǎn)言之，用0.5ml的1.0M曱酸銨(pH4.5)絲份>^#(5.0ml)調(diào)整至酸性pH,加水至體積為lOml并渦旋混勻。然后，如先前所述(Wang等，1999)，以約0.3ml/分鐘的流速將樣品加樣到1ml制備型AflatestP免疫親和柱(VicamLP，Watertown，MA，USA)上。清洗之后，用80%甲醇洗脫經(jīng)純化的AF級(jí)分，并在N2下干燥以用于使用具有熒光檢測(cè)能力的WatersHPLC系統(tǒng)(WatersCorporation,Milford，MA)進(jìn)行分析。使用孔徑為100A、粒徑為5nm的250mmx4.6mmLiCrospherRP-18封端柱(AlltechAssociates,Deerfield，IL，USA)來(lái)分離AF代謝產(chǎn)物。其流動(dòng)相由以20mM甲酸銨(pH3.0)緩沖的22%乙醇水溶液組成。通過(guò)流動(dòng)相等強(qiáng)度洗脫20分鐘實(shí)現(xiàn)AF的色譜分離。將樣品(100^)注射到柱上，洗脫速率為1.0ml/分鐘。AFMi峰在約15.4分鐘的保留時(shí)間處檢測(cè)到。該方法針對(duì)AFlVd的檢出限是每毫升尿中10pg/ml。AFMi的尿中濃度表示為每毫克肌酸酐的pg數(shù)，以修正各個(gè)樣品中尿稀釋度的變化。所產(chǎn)生的所有數(shù)據(jù)保存于Excel數(shù)據(jù)庫(kù)中，并用SAS軟件9.3版(SASInstituteInc.,Cary，NC)進(jìn)行分析。計(jì)算AFB廣白蛋白加合物和AF1V^濃度的中值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和范圍，除非另有指明，否則所述數(shù)值表示為中值和平均值士SD。為了評(píng)估NS干預(yù)的效力，統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估著眼于對(duì)不同治療水平和不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較。對(duì)于正態(tài)分布的^，使用雙因素ANOVA和Bonferroni方法來(lái)比較不同治療組和時(shí)間的平均值之間的顯著差異。對(duì)于非正態(tài)分布的參數(shù)，使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和枱:驗(yàn)來(lái)比較不同治療組和不同時(shí)間點(diǎn)的差異。為了評(píng)估劑量和時(shí)間相互作用對(duì)NS治療的作用，如前所述應(yīng)用非M混合作用模型(Brunner等，2002)。P值小于0.05(雙尾)被認(rèn)為是具有顯著性的。該使用NS的干預(yù)試驗(yàn)總共招募了180位受試者，治療開(kāi)始時(shí)有177位受試者。參與者的總體堅(jiān)持情況以及用于生物標(biāo)志物分析的樣品可用性均是令人滿意的?？偣?62位受試者(91.5%)完成了為期3個(gè)月的試驗(yàn)。關(guān)于每個(gè)時(shí)間收集點(diǎn)用于分析血清中AFBr白蛋白加合物和尿中AFMi水平的樣品數(shù)詳細(xì)信息列于下文表13中。在樣品收集的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，從參與者收集了>95%的血樣和$900/。的尿樣；這證實(shí)了我們使用暴露于AFBi的生物標(biāo)志物來(lái)描述NS效力的正確性。表13血清尿基線第l個(gè)月第3個(gè)月第4個(gè)月安慰劑55565454NS1-5g57565251NS3.0g59575352安慰劑53525554NS1.5g53535143NS3.0g53525352分析了在為期4個(gè)月的研究期間所收集的總共656個(gè)血清樣品的AFBr白蛋白加合物。在下文表14中顯示不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)三個(gè)研究組(安慰劑、1.5gNS和3gNS)中血清AFB廣白蛋白加合物的平均水平(平均值士SD)和范圍。在整個(gè)研究期間，這三個(gè)組中總體AFBr白蛋白加合物水平的分布顯示于圖7和8中。箱圖(boxplot)顯示在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)每個(gè)組中AFBr白蛋白加合物的分布。箱值是總樣品的25~75%，其中的線表示中值。箱兩側(cè)的柱分別代表5~25%和75~95%的范圍。在基線樣品中觀察到高AFBr白蛋白加合物水平，在各組之間沒(méi)有顯著差異(P=0.2354)。在NS干預(yù)第1個(gè)月時(shí)三個(gè)研究組之間;5M見(jiàn)察到AFB^白蛋白加合物7JC平的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P=0.3645)。但是，相比于安慰劑組，1.5gNS和3gNS組中干預(yù)第3個(gè)月時(shí)觀察到AFBr白蛋白加合物水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的降低(PO.OOOl)。在第4個(gè)月時(shí)(即干預(yù)之后第一個(gè)月)，3個(gè)組之間未發(fā)現(xiàn)AFBr白蛋白加合物水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。如圖8所示，在4個(gè)月的研究期間，所有三個(gè)治療組中均可見(jiàn)加合物水平顯著降低，這顯示AFBr白蛋白加合物水平的顯著時(shí)間效應(yīng)。但是，時(shí)間效應(yīng)的模式在NS治療組和安慰劑組之間是不同的。對(duì)于安慰劑組來(lái)說(shuō)，在千預(yù)第1和第3個(gè)月時(shí)AFBr白蛋白加合物的降低率是16.1%和19.9%。分別對(duì)于1.5NS和3.0NS組來(lái)說(shuō)，在干預(yù)第1個(gè)月時(shí)，AFBr白蛋白加合物的降低率是22.3%和22.4%，在干預(yù)第3個(gè)月時(shí)，是42.8%和40.2%。在安慰劑組中，第3和第4個(gè)月之間沒(méi)有前后一致的變化；但是，在兩個(gè)干預(yù)組中，血清AFBr白蛋白加合物的水平顯著提高，并回到與安慰劑組在第4個(gè)月時(shí)相當(dāng)?shù)乃?。非M混合效應(yīng)模型分析進(jìn)一步顯示，劑量、時(shí)間和劑量-時(shí)間相互作用對(duì)降低血清AFB^白蛋白加合物7jC平的顯著作用，這種降低是由于NS干預(yù)所致的(下文表16)。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>*數(shù)據(jù)表示為如下形式平均值土SD(范圍)在為期4個(gè)月的研究期間，分析了總共624個(gè)M的AFMi。在不同時(shí)間點(diǎn)三個(gè)研究組(安慰劑、1.5gNS和3gNS)中AFMi的平均水平和范圍顯示于下文表15中。在整個(gè)研究期間這三個(gè)組中尿AF1V^水平的分布顯示于圖9和圖10中。箱圖顯示每個(gè)組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)AFMi水平的分布。箱值范圍是總樣品的25~75%,其中的線表示中值。箱兩側(cè)的柱分別代表5~25%和75~95%范圍的值。由于AFMi數(shù)據(jù)高度傾斜，因此使用非參數(shù)分析進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估。在基線時(shí)，三個(gè)研究組的中值A(chǔ)FMi水平之間沒(méi)有顯著性差異(P=0.2485)。在NS干預(yù)第1個(gè)月時(shí)，三個(gè)組的中值A(chǔ)FMi水平之間未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P=0.3342)。但是，在NS干預(yù)第3個(gè)月時(shí)，觀察到中值A(chǔ)FMi水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的降低(P=0.0445)。盡管安慰劑組和1.5gNS組的中值A(chǔ)FIV^水平是相當(dāng)?shù)?P=0.3951)，但^L現(xiàn)3gNS組和安慰劑組的中值A(chǔ)FM!水平降低率為58.7。/。(P-0.0391)。ii^L現(xiàn)3gNS組和1.5gNS組的中值A(chǔ)FJV^水平降低率為57.8%(P=0.0219)。在干預(yù)后第4個(gè)月時(shí)，也發(fā)現(xiàn)三個(gè)研究組的中值A(chǔ)FlVd水平的顯著性差異(P=0.0024)，這主要是由于1.5gNS組中較高的AF]V^水平所致。如圖10所示，在4個(gè)月研究期間，3.0gNS組中可見(jiàn)AF1V^水平顯著降低，其顯示顯著的時(shí)間效應(yīng)(P=0.009)。盡管在安慰劑組中也注意到顯著的時(shí)間效應(yīng)(P=0.002),但是AFlVd水平是高度可變的，如基線和第3個(gè)月的較高中值水平以及第1個(gè)月和第4個(gè)月的較低中值7jC平所示。在4個(gè)月研究過(guò)程中1.5gNS組中未發(fā)現(xiàn)AF]V^水平的顯著的時(shí)間效應(yīng)(P=0.3277)。非參數(shù)混合效應(yīng)模型分析也顯示降低尿AF1V^水平的顯著劑量-時(shí)間相互作用，該相互作用是由于NS干預(yù)所致的(表4)。表15治療組AFMi(pg/mg肌酸酑)*基線第l個(gè)月第3個(gè)月第4個(gè)月安慰劑53.41624.57652.37917.316644.224±2026.52794.709±160.128181.256±675.90356,837±110.138(0.018-13297.670)(0.018-798.106)(0.018-5006,335)(0.018-529.405)45.54234.18751.17432.868NS1.5g183.582±334.957202.064±639.731307細(xì)±1248.346358.585±1594.004(0.018-1547.3卯)(0.0184338.524)(0.018-8878.776)(0.018-10510.813)60.26620.98921.60912.221NS3.0g256.299*615.168175.094±818.40667.312±102.54470.392±155.679(0.018-3901.901)(0.018-5882.708)(0.018411.681)(0.018-873.717)*數(shù)據(jù)以如下形式表示平均值士SD(范圍)安全性和效力是評(píng)估潛在的治療和/或臨床干預(yù)藥劑的兩個(gè)最重要標(biāo)準(zhǔn)。NS的安全性(和劑量測(cè)定)已在動(dòng)物和人的研究中充分記載，包括在加納的為期3個(gè)月試驗(yàn)(Afriyie-Gyawu等，2007)。該研究的主要目的是確定NS在人體中的效力。NS能夠在胃腸道中優(yōu)先吸附AF，導(dǎo)致AF生物利用度和毒性降低，這已在多種動(dòng)物模型中得到明確證實(shí)。該研究的結(jié)果證實(shí)了我們?cè)趧?dòng)物中的工作，并顯示施用NS3個(gè)月顯著降低了人受試者中血清AFBi白蛋白加合物的水平和尿AFMi水平。就我們所知，這是第一項(xiàng)通過(guò)在具有黃曲霉毒素中毒風(fēng)險(xiǎn)的人群中監(jiān)測(cè)AF特異性生物標(biāo)記物來(lái)研究飲食加入NS粘土的效力和健康益處的研究。目前在人和動(dòng)物研究中使用的AF特異性生物標(biāo)記物包括AFBi代謝產(chǎn)物和AFBi大分子加合物，即尿中的AFMi和血清中的AFBi白蛋白加合物。AFBi白蛋白加合物(相比于尿中AF代謝產(chǎn)物)用作非常重要的生物標(biāo)志物，這是因?yàn)樗^長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期可反映較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的總體暴露。從與流行病學(xué)研究相關(guān)的實(shí)用前景來(lái)看，測(cè)量血清AFBr白蛋白加合物提供了可用于篩選非常大量人群(例如507個(gè)人)(Afriyie-Gyawu等2007)和其它干預(yù)研究的快速且容易的方法。AFBr白蛋白加合物也是研究AJ^露AF的最可靠分子生物標(biāo)志物。在世界上一些地區(qū)的人群中發(fā)現(xiàn)AFBr白蛋白加合物水平與AFBi^之間的高度顯著的相關(guān)性。另外，有報(bào)道所攝入AFBi的約2。/。與血清白蛋白共價(jià)結(jié)合，該數(shù)值與向大鼠施用AFBi時(shí)觀察到的非常相似。使用多種分析技術(shù)，在中國(guó)和多個(gè)非洲國(guó)家中幾乎100%的成人血清和12-100%的兒童血清中檢測(cè)到AFBr白蛋白加合物。除了研究AF暴露之外,AFBr白蛋白加合物在非洲已用作急性和慢性黃曲霉毒素中毒的生物學(xué)應(yīng)答標(biāo)志物、在臺(tái)灣、中國(guó)和非洲用作HCC風(fēng)險(xiǎn)的生物學(xué)應(yīng)答標(biāo)志物，以及用作感染性疾病相關(guān)免疫抑制的生物學(xué)應(yīng)答標(biāo)志物。另外，AFBr白蛋白加合物已常規(guī)用作在人干預(yù)試驗(yàn)中評(píng)估不同藥劑和技術(shù)的代用效力生物標(biāo)志物。在該研究中，在NS干預(yù)之前的基線時(shí)，在參與者中觀察到高水平的血清AFB^白蛋白加合物(1.52±0.34pmol/毫克白蛋白；范圍0.96-2.93pmol/亳克白蛋白)。這些水平高于在岡比亞、貝寧和英國(guó)所才艮道的水平，并且與中國(guó)處于高肝癌風(fēng)險(xiǎn)的A^中發(fā)現(xiàn)的水平相當(dāng)。因此，加納的研究參與者代表了具有高AF暴露風(fēng)險(xiǎn)的人群。在該研究中，發(fā)現(xiàn)每日施用NS膠嚢在降低血清AFBr白蛋白加合物方面產(chǎn)生顯著的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)(表14)。相比于安慰劑組，在l,5gNS和3gNS干預(yù)組中第3個(gè)月時(shí)都51觀察到顯著性(AFBr白蛋白加合物水平降低MO%)(表14和圖8)。盡管在兩個(gè)NS治療組中干預(yù)開(kāi)始后第1個(gè)月時(shí)也觀察到該生物標(biāo)志物7jC平降低，但是由于安慰劑組中加合物水平降低，因此未發(fā)現(xiàn)顯著差異。該研究中可見(jiàn)的加合物降低延遲與之前在中國(guó)啟東用奧替普拉進(jìn)行的化學(xué)預(yù)防試驗(yàn)相似，其中只有到治療5周后才觀察到血清AFBr白蛋白加合物水平顯著降低。該延遲可能由于白蛋白的長(zhǎng)半衰期，其在正常和健^體內(nèi)估計(jì)為約3周。重要的是，與白蛋白結(jié)合的AFBi(AFBi白蛋白加合物)可能在幾年內(nèi)是穩(wěn)定的。有報(bào)道稱，使用奧#*拉也有類似發(fā)現(xiàn)，其中直至白蛋白周轉(zhuǎn)經(jīng)過(guò)三個(gè)半衰期還可檢測(cè)到AFBr白蛋白加合物水平。在該研究中觀察到的顯著時(shí)間效應(yīng)(包括安慰劑組中的降低)，也與之前在奧替普拉試驗(yàn)和最近的教育干預(yù)研究中的發(fā)現(xiàn)相一致。在我們目前的研究中，1.5gNS和3gNS組中的AFBr白蛋白加合物水平在第4個(gè)月(干預(yù)結(jié)束后1個(gè)月)時(shí)都升高并回到安慰劑組的水平，其進(jìn)一步證實(shí)了NS降低飲食AFBi暴露的效力。AFMi是AFBi的代謝產(chǎn)物，在尿和乳中普遍存在，并且其從前體AFBi的形成在人體中主要是由肝CYP1A2進(jìn)行催化的。在尿中排泄AF1V^代表近期(即24或48小時(shí)內(nèi))暴露于AFB1(>因此，尿中AFMi水平可用作AFBi暴露的短期生物標(biāo)志物。血清AFBr白蛋白加合物和尿AF]V^均已被充分表征，并在大量人群中證實(shí)了其作為AFBi暴露之生物標(biāo)志物的效力。血清AFBr白蛋白加合物和人尿中排泄的AFMi的水平已顯示出與飲食^UVAF以UHCC風(fēng)險(xiǎn)的顯著相關(guān)性。與干預(yù)開(kāi)始后第3個(gè)月時(shí)血清AFBr白蛋白加合物水平降低一致的是，相比于該研究的其它治療組，在3gNS組中尿AF1V^水平也顯著降低(表15和圖9)。在用100mg葉綠酸進(jìn)行干預(yù)3個(gè)月后，3gNS治療組中發(fā)現(xiàn)的中值A(chǔ)F1V^水平的高達(dá)58.7%的降低率與中值A(chǔ)FBHV乙鳥(niǎo)氨酸水平的55%的降低率相當(dāng)。所述AFB^N:鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)物也是類似AFMi的短期生物標(biāo)志物。在該研究中，在1.5gNS組中未觀察到對(duì)尿AFMi水平的顯著影響，這可能是由于短期標(biāo)志物測(cè)量中可觀的個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間差異所導(dǎo)致的。在所有研究組中(包括安慰劑組)還都觀察到AFMi水平的顯著時(shí)間效應(yīng)，其可反映出每日飲食AF暴露水平的變化(圖10)。在之前對(duì)加納的類似人群(Jolly等2006)以及另一些人群(Wang等，2001)進(jìn)行的篩選研究中還觀察到尿AF1V^水平的變化。在我們的研究參與者中觀察到的非常寬的AFMi水平范圍(從不可檢出到13.3ng/亳克肌酸酐)提示AF代謝酶(例如CYP1A2)的基因52型或表型差異可能在個(gè)體對(duì)AF暴露的易感性方面起作用。盡管如此，在該研究中，與降低的尿AFMi水平(和血清AFB^白蛋白加合物)相關(guān)的顯著劑量-時(shí)間相互作用效應(yīng)(下表16)證實(shí)了通itJ歐囊施用NS的效力。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>總之，該研究的結(jié)果提示用NS粘土進(jìn)行干預(yù)可有效地降低暴露于來(lái)自被污染食物的AF，如血液和尿中AF特異性生物標(biāo)志物(即AFBr白蛋白加合物和AFMJ所表示的。最終需要長(zhǎng)期(IIb期或III期)研究以進(jìn)一步評(píng)估，當(dāng)包含在高風(fēng)險(xiǎn)A^的飲食中時(shí)，NS干預(yù)作為用于急性黃曲霉毒素中毒和用于預(yù)防慢性黃曲霉毒素誘導(dǎo)疾病的腸吸附劑療法的效力。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，本發(fā)明非常適于本文所述及其固有的目的并獲得本文所述的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。因此，很明顯，膠嚢形式和片劑形式的CAS組合物是不同的，這些不同形式的口服劑型可用于預(yù)防或治療中毒以及預(yù)防黃曲霉毒素相關(guān)肝癌的方法。另外，本發(fā)明涵蓋了所iiia合物和方法的變化。例如，可根據(jù)大,生產(chǎn)所述組合物的需要而改變技術(shù)，該工業(yè)，的組合物生產(chǎn)被認(rèn)為在本發(fā)明的精神范圍內(nèi)。本文所述的材料、方法、步驟和技術(shù)是優(yōu)選實(shí)施方案的現(xiàn)有代表，其旨在舉例但不意在對(duì)范圍進(jìn)行限制。應(yīng)理解，藥學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員可獲得許多藥學(xué)參考書(shū)，例如Remmington,sPharmaceuticalSciences17th版，AlfonsoGennaroeditor,MackPublishingCompanyEaston,Pennsylvania18042,其會(huì)允許對(duì)本發(fā)明組合物和方法進(jìn)行改進(jìn)和更改配方。同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)想到涵蓋在本發(fā)明的精神范圍內(nèi)或者由所附權(quán)利要求的范圍所限定的對(duì)其改變和其它用途。所引用參考文獻(xiàn)下述參考文獻(xiàn)以它們提供舉例步驟或其它細(xì)節(jié)以補(bǔ)充本文所述內(nèi)容的程度通過(guò)引用具體并入本文。美國(guó)專利文獻(xiàn)美國(guó)專利5,178,832，于1993年1月12日授予Phillips等，發(fā)明名稱為"SelectiveImmobilizationandDetectionofMycotoxinsinSolution."美國(guó)專利5，165，946，于1992年11月24日授予Taylor等，發(fā)明名稱為"AnimalFeedAdditiveandMethodforInactivatingMycotoxinsPresentinAnimalFeeds."其它出版物Renunington'sPharmaceuticalSciences17thEdition.AlfonsoGennaroeditor,MackPublishingCompanyEastern,Pennsylvania18042,EntireBook,pages1-1983.Reminjngton,sPharmaceuticalSciences17thEdition.AlfonsoGennaroeditor,MackPublishingCompanyEastoi^Pennsylvania18042,Chapter68,pages1278-1321.Remmington'sPhaimaeeuticalSciences17thEdition.AlfonsoGennaroeditor,MackPublishingCompany,Eastern^Pennsylvanialg042,Chapter84,pages1492-1517.Harvey,R.B.，D.E.Cl虹k^W.E.Huff,L.F.Kubena,D.E.ConierandT.D.Phillips:1988.Suppressionofserumironbindingcapacityandbone咖加wcellularityinpigsfedaflatoxin.Bull.Environ.Contam,Toxicol.40:576583.Harvey,R.B.,W,E.Huff,L.F.Kubena,D.E.ConierandT.D.Phillips:1988.ProgessJonofaflatoxicosisingrowingpigs.Am.丄Vet.Res.49(4):482487.Phillips,T.D.，L.F.Kuben^R.B.Hawey,D.R.TaylorandN.D.Heidelbaugh:1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