專利名稱：治療心瓣膜病的方法和化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)方法和化合物的普遍領(lǐng)域，且特別涉及治療心瓣膜病 的方法和化合物。
背景技術(shù)：
心臟的功能是提供心血管系統(tǒng)中血液循環(huán)所需要的能量。在各器官的 血液流動(dòng)是纟皮動(dòng)的，且只有通過(guò)心臟的泵作用(pumping action)保4爭(zhēng)動(dòng)脈 壓高于靜脈壓時(shí)發(fā)生。右心臟泵提供血液在肺血管中流動(dòng)所需的能量，左 心臟泵提供引起在系統(tǒng)臟器(systemic organs )中流動(dòng)的能量。
"l爭(zhēng)月永血經(jīng)由上下月空"l爭(zhēng)月永(superior and inferior venae cavae ) 乂人系統(tǒng)月左器 回到右心房。血液穿過(guò)三尖瓣進(jìn)入右心室，再泵過(guò)肺動(dòng)脈瓣經(jīng)肺動(dòng)脈進(jìn)入 肺循環(huán)。含氧的肺靜脈血在肺靜脈中流至左心房，再經(jīng)過(guò)二尖瓣進(jìn)入左心 室。/人此處，血液泵過(guò)主動(dòng)月永瓣進(jìn)入主動(dòng)脈并分配到系統(tǒng)臟器。
因此，在正常的運(yùn)轉(zhuǎn)下，富含氧氣的血液由心臟的左心室通過(guò)主動(dòng)脈 泵入身體的脈管系統(tǒng)的動(dòng)脈中。當(dāng)心臟泵動(dòng)時(shí)，位于左心室和主動(dòng)脈之間 的主動(dòng)脈瓣張開(kāi)和閉合以控制血液流動(dòng)方向。更加具體地，在心搏或收縮 期間，主動(dòng)脈瓣張開(kāi)允許血液從左心室流入主動(dòng)脈。而在心搏之間或舒張 期間，主動(dòng)脈瓣關(guān)閉形成密封，防止血液滲漏回心室。
所述瓣的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)只允許一個(gè)方向的流動(dòng)，且依據(jù)穿過(guò)他們的壓力方向的不同被動(dòng)地張開(kāi)和關(guān)閉。通常，主動(dòng)脈瓣是由三個(gè)纖維性瓣葉或尖
(leaflets or cusps )組成。在血液心室射血期間，所述瓣葉逆主動(dòng)月永壁強(qiáng)制 張開(kāi)，而在舒張期期間落回，他們的自由邊縛^姿合以防止血液回到心臟。
每個(gè)主動(dòng)脈瓣尖后的主動(dòng)脈壁向外凸起，形成三個(gè)稱為主動(dòng)脈竇 (sinuses of Valsalva)的結(jié)構(gòu)。兩個(gè)最前面的瓣膜主動(dòng)脈尖由于來(lái)自各自 主動(dòng)脈竇的左和右的冠狀動(dòng)脈的起源而被稱為左和右冠狀尖，且剩余的后 面的瓣膜尖被稱為非冠狀尖。
因?yàn)樵S多原因中的任何一個(gè)，主動(dòng)脈瓣以某種方式損壞和變狹窄是可 以發(fā)生的。當(dāng)這發(fā)生時(shí)，所述主動(dòng)脈瓣不能夠張開(kāi)到它的正常程度，而且 阻礙了從心臟進(jìn)入主動(dòng)脈的血液流動(dòng)。這導(dǎo)致了通常一皮稱作主動(dòng)脈瓣狹窄 的心"莊病癥。
主動(dòng)脈瓣狹窄的一般病因?qū)W包括先天畸形、風(fēng)濕熱、老齡患者中的鈣 化變性(degeneration with calcification)。 二尖瓣是最普通的先天畸形，而 且通常在主動(dòng)脈尖中的一個(gè)上有縫隙，其表明連合的發(fā)育是失敗的。4艮少 見(jiàn)i也，出生時(shí)可以為單瓣或四尖瓣(unicuspidorquadricuspidvalve)。盡管二 尖瓣最初并非是狹窄的，但是纖維化和加厚(thickening)最終導(dǎo)致鈣化且縮 小的孔尺寸。的確，機(jī)械剪切應(yīng)力(mechanical sheer stress)通常會(huì)導(dǎo)致鈣化 損傷(calcific injury)。
風(fēng)濕熱損傷所述瓣葉的邊緣，且最終連合融合和鈣化。發(fā)現(xiàn)超過(guò)50% 的有主動(dòng)脈瓣狹窄的成人有二尖瓣，但是纖維化和鈣化可以使辨別是二尖 瓣還是三尖瓣變得困難。
在有變性主動(dòng)脈瓣狹窄的老齡患者中，鈣沉積物通常發(fā)生在竇和環(huán) 上，而瓣葉邊緣通常沒(méi)有4丐化。
目前，提出了許多關(guān)于主動(dòng)脈瓣狹窄的細(xì)胞病理生理學(xué)理論。這些理 論包括心血管風(fēng)險(xiǎn)因子激發(fā)對(duì)損傷的應(yīng)答、機(jī)械剪切應(yīng)力、自身免疫現(xiàn)象 引起的變性、慢性增加的心搏量以及改變的鈣代謝(例如在腎衰竭、Paget 病等中發(fā)生的)。
不論其病因?qū)W為何，主動(dòng)脈瓣狹窄導(dǎo)致了左心室收縮壓的升高。心室
5腔內(nèi)收縮性高血壓被心壁(myocardialwall)的向心型肥大補(bǔ)償，允許壁應(yīng)力 保持正常。低順應(yīng)性的、增厚的左心室變得更加依賴于心房對(duì)舒張期充盈 的貢獻(xiàn)，以致當(dāng)心房收縮消失時(shí)(例如在心房纖維性顴動(dòng)或房室分離期間)， 左心室的工作情況惡化。在舒張期期間，增厚左心室異常的舒張和增加的 硬度也導(dǎo)致舒張功能障礙以及左心室和左心房舒張壓的升高。
心肌衰竭最終由慢性嚴(yán)重性心瓣堵塞以及收縮狀態(tài)的減少(depression of contractile state)發(fā)展而來(lái)。左心室擴(kuò)張也可以發(fā)生在一些患者。心肌氧 耗量因左心室收縮壓的升高以及左心室質(zhì)量的增加而保持在高水平。此 外，增加的左心室舒張壓減少了心肌灌注所需要的壓力梯度。因此，嚴(yán)重 的主動(dòng)脈瓣狹窄產(chǎn)生了其中減少的氧氣供應(yīng)不足以滿足高心肌需氧量的 疾患(condition),其導(dǎo)致心內(nèi)膜下缺血。
最終，在心肌變力狀態(tài)減少下，射血分?jǐn)?shù)降至正常范圍以下(有或沒(méi)有 相關(guān)的左心室擴(kuò)張)。左心室舒張末期壓的進(jìn)一步升高(繼發(fā)于伴隨或未伴 隨收縮功能障礙的舒張功能障礙)導(dǎo)致了肺靜脈高血壓。在有灌注缺損 (underperfused)的心內(nèi)膜下心肌的主動(dòng)脈瓣狹窄中，增加的心肌需氧量 可以引起心絞痛、心律不齊以及甚至是猝死。
在嚴(yán)重的主動(dòng)脈瓣狹窄的情況中，任何主要癥狀的發(fā)展表示重大的生 命危險(xiǎn)也表示需要進(jìn)行手術(shù)治療。癥狀出現(xiàn)后平均生命期望值為2-3年， 如果癥狀與心臟衰竭相關(guān)，期望值會(huì)更少。由于癥狀(而且有可能是捽死) 通常伴隨著強(qiáng)體力活動(dòng)，因此主動(dòng)脈瓣狹窄的患者應(yīng)該避免強(qiáng)體力活動(dòng)和 竟技性運(yùn)動(dòng)，即使它只有輕微至中等的嚴(yán)重性。因此，主動(dòng)脈瓣狹窄不但 與高死亡率相關(guān)，而且與高發(fā)病率相關(guān)。
鉤化主動(dòng)脈瓣狹窄可以解釋大部分主動(dòng)脈瓣狹窄的病例。所述疾患以 在主動(dòng)脈瓣葉的上面或上表面建立鈣化小結(jié)為特征。這些小結(jié)降低了瓣葉 的屈曲性，因此限制了他們移動(dòng)以及完全張開(kāi)的能力。
三種技術(shù)^^皮用于治療主動(dòng)脈瓣狹窄，即瓣膜置換術(shù)、術(shù)中的脫鈣或清 創(chuàng)術(shù)，或者心臟瓣和^求嚢瓣膜成形術(shù)(balloonvalvuloplasty)。
在開(kāi)胸手術(shù)中的瓣膜置換術(shù)是目前對(duì)于癥狀性主動(dòng)脈瓣狹窄的標(biāo)準(zhǔn)治療。對(duì)于單獨(dú)的主動(dòng)脈瓣膜置換，十年存活率是相當(dāng)不錯(cuò)的，甚至是對(duì) 老年患者。然而，這種技術(shù)要求患者足夠健康以經(jīng)受胸骨切開(kāi)術(shù)(開(kāi)胸)和 開(kāi)胸手術(shù)。這一過(guò)程的手術(shù)死亡率(特別是老年人)是相當(dāng)高的。
有兩種類型的修復(fù)心臟瓣，即僅由非來(lái)自生物有才幾體的材料組成的機(jī)
械瓣和全部或部分由生物材料組成的生物^修復(fù)瓣(bio-prosthetic valves)。目 前使用的機(jī)械瓣具有球籠結(jié)構(gòu)、傾斜的盤結(jié)構(gòu)(l或2盤)或者是有鉸鏈的瓣 葉結(jié)構(gòu)。
生物修復(fù)瓣通常包括一個(gè)支撐支架和多個(gè)瓣葉。所述瓣葉通常由生物 材料組成，而支架當(dāng)存在時(shí)通常包括至少部分非生物材料。瓣葉的生物材 料可以為自體組織，例如心包、闊筋膜或者心瓣膜?？蛇x擇地，所述材料 可以來(lái)源于同源組織(例如用于人移植的非自體人組織)或可以是異源的。
各種類型的修復(fù)心臟瓣均有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。機(jī)械心臟瓣使用持久，且因 此更有可能產(chǎn)生持久功能，但是由于血栓栓塞的危險(xiǎn)，需要長(zhǎng)期小心抗凝。 然而，長(zhǎng)期抗凝治療會(huì)引起大出血的危險(xiǎn)，其發(fā)生率同血栓事件的殘留危 險(xiǎn)(residual risk)的發(fā)生率相似。
生物修復(fù)瓣起始地接近自然瓣的血液動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。它們出現(xiàn)繼發(fā)于血 栓的并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)比機(jī)械瓣小。然而，這種瓣發(fā)生鈣化的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于機(jī) 械瓣。因?yàn)楣δ芡嘶?functionallycompromised)的生物修復(fù)心臟瓣的處理經(jīng) 常需要置換新的瓣(且因此二次開(kāi)胸手術(shù))，所以生物修復(fù)心臟瓣的有效生 命期望的限制對(duì)患者和醫(yī)療系統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)損耗都是嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問(wèn)題。
此外，所有修復(fù)心臟瓣都有稍微狹窄。繼發(fā)于血栓形成或鈣化的修復(fù) 功能障礙可以導(dǎo)致增加堵塞或引起反流。反流也可以由瓣周漏(perivalvular leak)引起，這個(gè)漏位于所述瓣的縫合環(huán)區(qū)域。與瓣功能障礙相關(guān)的波動(dòng)可 以《I起溶血和貧血。甚至是正常功能的修復(fù)瓣也會(huì)在一些患者中引起溶 血。
在使用修復(fù)心臟瓣的患者中，心內(nèi)膜炎是另一個(gè)潛在且主要的并發(fā) 癥。在牙、胃腸和泌尿生殖外科手術(shù)以及菌血癥相關(guān)的其他操作法之前必 須施用抗生素預(yù)防。
7此外， 一些患者的主動(dòng)脈尺寸不是足夠的大以輕易容納傳統(tǒng)的置換瓣。因此對(duì)于相當(dāng)數(shù)量的患者，瓣膜置換是不可能的、不切實(shí)際的或者不受歡迎的。
主動(dòng)脈瓣的術(shù)中機(jī)械脫4丐或清創(chuàng)術(shù)在機(jī)械置換瓣出現(xiàn)之前已經(jīng)應(yīng)用多年。在這一技術(shù)中，手術(shù)中進(jìn)入主動(dòng)脈，但與人工置換瓣不同的是，外科醫(yī)生使用合適的外科工具清除鈣化沉積物。最近，已經(jīng)證實(shí)超聲清創(chuàng)術(shù)有效地清除鈣化沉積物。然而，這一技術(shù)同樣需要患者足夠健康以從胸腔手術(shù)中生存和恢復(fù)，以及包括這種手術(shù)伴隨而來(lái)的所有的花費(fèi)和風(fēng)險(xiǎn)。
用于治療主動(dòng)脈瓣狹窄的第三種技術(shù)包括經(jīng)皮球嚢主動(dòng)脈瓣成形術(shù)。在這一過(guò)程中， 一個(gè)可膨脹氣球?qū)Ч鼙凰瓦M(jìn)主動(dòng)脈瓣，通過(guò)膨脹擠壓和粉碎鉤化小結(jié)以嘗試提高瓣葉的活動(dòng)性。盡管這一過(guò)程避免了前面兩種技術(shù)所具有的許多的風(fēng)險(xiǎn)和缺點(diǎn)，但是一年內(nèi)再狹窄是非常普通的，這也限制了所述技術(shù)針對(duì)那些不適合做手術(shù)或拒絕做手術(shù)的患者的臨時(shí)緩解癥狀的應(yīng)用。
因此，需要一種針對(duì)主動(dòng)脈瓣狹窄和其他心瓣膜病的非手術(shù)療法。
本發(fā)明顯著不同于現(xiàn)有技術(shù)和當(dāng)前趨勢(shì)的是通過(guò)提供一種使用脂質(zhì)逆向4專送〗敫動(dòng)劑(reverse lipid transport agonist)的方法不^f旦可以予貞防主動(dòng)脈瓣狹窄的發(fā)展，而且減輕狹窄程度。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種心瓣膜病的新穎非手術(shù)療法。發(fā)明概述
在廣泛方面，本發(fā)明提供了 一種預(yù)防或治療受治療者瓣膜狹窄的方法，所述方法包括向需要其的受治療者施用治療有效量的脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑。例如，所述脂質(zhì)傳送激動(dòng)劑是膽固醇逆向傳送激動(dòng)劑。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述瓣膜狹窄是主動(dòng)脈瓣狹窄、鈣化瓣狹窄或任何其他的瓣膜狹窄。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑是選自由HDL、具有HDL-樣生理學(xué)功效的肽、復(fù)合脂質(zhì)的具有HDL-樣生理學(xué)功效的肽、HDL-模擬劑、CETP調(diào)質(zhì)(modulator )、 SRB1調(diào)質(zhì)、LXR/RXR激動(dòng)劑、ABCA1激動(dòng)劑、PPAR激動(dòng)劑和載脂蛋白A-I(ApoA-l)模擬肽/磷脂復(fù)合體組成的組。
在這后面的實(shí)例中，施用所述ApoA-l ^t擬狀/磷脂復(fù)合體可以包括對(duì)受治療者注射ApoA-l模擬肽/磷脂復(fù)合體。在這一實(shí)例中，劑量的例子是從約1將到約10g每千克受治療者體重，約1 mg到約.5g每千克受治療者體重，和約25mg每千克受治療者體重。
例如，ApoA-l模擬肽具有如下所述的SEQIDNO:l序列，ApoA-l模擬肽可以同卵鞘磷脂以及1,2- 二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DPPC)復(fù)合。
在某些實(shí)施方案中，所述受治療者為哺乳動(dòng)物，例如人。
在另 一廣泛方面，本發(fā)明提供了 一種預(yù)防或治療受治療者瓣膜鈣化的方法，所述方法包括向需要其的受治療者施用治療有效量的脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑。
在又另 一 廣泛方面，本發(fā)明提供了 一種控制受治療者瓣膜狹窄的方法，所述方法包括增加需要其的受治療者的膽固醇逆向傳送。
在又另 一廣泛方面，本發(fā)明提供了 一種預(yù)防或逆轉(zhuǎn)(reversing)瓣膜狹窄的方法，所述方法包括向需要其的患者施用脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑。
在又另一廣泛方面，本發(fā)明提供了一種控制受治療者瓣膜狹窄的方法，所述方法包括向需要其的受治療者施用治療有效量的脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑。
例如，控制所述瓣膜狹窄可以包括降低瓣膜狹窄發(fā)展速率，或至少部分逆轉(zhuǎn)瓣膜狹窄。
在又另一廣泛方面，本發(fā)明提供了脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑用于控制受治療者瓣膜狹窄的應(yīng)用。
在又另 一廣泛方面，本發(fā)明提供了脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑用于制備控制受治療者瓣膜狹窄的藥物組合物物質(zhì)的應(yīng)用。
在變化方案中，所述方法包括施用治療有效量的一種化合物，此后被
稱為化合物A,其模擬載脂蛋白A-l(ApoA-l)的生物性質(zhì)。化合物A和其他合適的化合物在發(fā)表于2001年9月11日美國(guó)專利號(hào)為6,287,590和發(fā)表于2003年1月14日美國(guó)專利號(hào)為6,506,799中描述，在此其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入。的確，可以相信鑒于當(dāng)前關(guān)于這些專利中所述化合物和分子的作用的知識(shí)，這些化合物和分子可以得到與本文所述那些相似的結(jié)果。
有利地，所提議的方法代替了相對(duì)侵入性的或相對(duì)無(wú)效的針對(duì)心瓣膜病的已有療法。同時(shí)，除了延緩心瓣膜病的發(fā)展，所提議的方法也逆轉(zhuǎn)瓣膜狹窄。因此，所提議的療法不但具有延緩或阻止主動(dòng)脈瓣狹窄和其他心瓣膜病發(fā)展的潛力，同時(shí)導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣狹窄和其他心瓣膜病的消退。
主動(dòng)脈瓣狹窄(AVS)是最普通的心瓣膜病，且標(biāo)準(zhǔn)治療療法仍然是開(kāi)胸手術(shù)的心臟瓣膜置換。為了驗(yàn)證脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑是否具有預(yù)防或治療AVS的潛力，ApoA-l模擬肽輸注被試驗(yàn)以確定它們是否誘導(dǎo)了 AVS的消退。為此目的，十五只雄性新西蘭白兔獲得了富含膽固醇的飲食和維生素D2，直到通過(guò)超聲心動(dòng)描記術(shù)檢測(cè)到顯著的AVS。然后動(dòng)物們隨機(jī)地獲得鹽水(對(duì)照組，11=8)或ApoA-l模擬肽(處理組，n=7),共2周每周3次。執(zhí)行一系列超聲心動(dòng)圖和死后瓣組織學(xué)(post mortem valve histology)分析。與對(duì)照組相比，處理組的主動(dòng)脈瓣面積顯著增加，為治療后7天(21.9士3.6mm2 vs. 19.6 ± 1.8 mm2， ？=0.019)(14.2%和3.9%的增加)、10天(23.0±4.1mm2 vs. 20.3 ± 2.4 mm2，P=0.006)(19.8% vs. 7.6%)和14天(23.8 ±3.1 mm2 vs.21.3 ±2.4 mm2, P=0.012)(24.6% vs. 12.9%)。在處理組中，經(jīng)過(guò)14天的處理，主動(dòng)脈瓣的厚度減少了 21%，而在對(duì)照組中沒(méi)有變化(0.094 士 0.034 cmvs. 0.075 ±0.033 cm) (P二0.0006)。處理組的瓣葉和主動(dòng)月永竇的基部的損傷程度比對(duì)照組小(52.8 ± 12.5% vs. 66.7 ± 9.9%, P=0.032)。同樣觀察到了減少4丐化面積的強(qiáng)趨勢(shì)(1.6±2.0% vs. 6.9±6.7%， P=0.063)。因此，ApoA-l模擬肽的輸注導(dǎo)致了實(shí)一驗(yàn)AVS的消退。
本發(fā)明其他目的、優(yōu)點(diǎn)和特征通過(guò)對(duì)其優(yōu)選實(shí)施方案的后續(xù)非限定性描述的閱讀會(huì)變得更加清楚，所述優(yōu)選實(shí)施方案僅通過(guò)與附圖相關(guān)的例子
10給出。附圖簡(jiǎn)述
在附圖中


圖1表明在ApoA-l才莫擬肽處理期間通過(guò)超聲心動(dòng)圖測(cè)量獲得的主動(dòng)脈瓣面積值。第"0"天對(duì)應(yīng)于膽固醇加維生素D2飲食結(jié)束和ApoA-l模擬肽處理期開(kāi)始時(shí)，*^<0.05; ** 《0.01. (b)，主動(dòng)月永瓣厚度值，0.001;
圖2表明在ApoA-l模擬肽處理期間通過(guò)超聲心動(dòng)圖測(cè)量獲得的主動(dòng)脈瓣厚度值。第"0"天對(duì)應(yīng)于膽固醇加維生素D2飲食結(jié)束和ApoA-l模擬肽處理期開(kāi)始時(shí)，*尸《0.05; **尸《0.01, 0.001;
圖3表示在對(duì)照組和處理組中，主動(dòng)脈瓣中的損傷面積(LA)對(duì)分析區(qū)域(ROA)的百分比對(duì)比，"=0.032。
圖4表示兩組中主動(dòng)脈瓣面積(AVA)同主動(dòng)脈瓣中損傷面積(LA)對(duì)分析區(qū)域(ROA)的百分比之間的關(guān)系；以及
圖5表示兩組中超聲心動(dòng)描記術(shù)中主動(dòng)脈瓣的厚度與動(dòng)物主動(dòng)脈竇面積中4丐化面積的百分比之間的關(guān)系。注意，在圖的左側(cè)底部， 一個(gè)對(duì)照動(dòng)物的值(方塊)被兩個(gè)三角隱藏。
發(fā)明詳述
本發(fā)明描述涉及許多公開(kāi)文件，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入。組織病理學(xué)、實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)表明4丐化主動(dòng)脈瓣狹窄(AVS)是一個(gè)主動(dòng)性疾病過(guò)程(active disease process)并伴隨著脂蛋白沉積、炎癥和主動(dòng)性瓣葉4丐化(1)。雖然AVS與動(dòng)脈粥樣硬化之間有相似，但是它們的生理病理學(xué)和治療顯著不同。就生理病理學(xué)而言，二葉主動(dòng)脈瓣(bicuspid aortic valve )是存在的，而且大約一半患者的AVS是由它引起的，而動(dòng)脈粥樣硬化并非由于結(jié)構(gòu)先天畸形。風(fēng)濕性心臟病也可以引起AVS,但是它與動(dòng)脈粥樣硬化沒(méi)有關(guān)聯(lián)。
li老年人的4丐化AVS是西方國(guó)家最常見(jiàn)的類型，通常導(dǎo)致獨(dú)立的主動(dòng)脈瓣置換且不需要相關(guān)的冠狀動(dòng)脈架橋手術(shù)。就醫(yī)學(xué)治療而言，已經(jīng)證明他汀類
藥物(statins)可以保護(hù)冠心病的患者，阻止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展或誘導(dǎo)其消退(3);相反，近期隨機(jī)臨床試驗(yàn)表明，加強(qiáng)的他汀類藥物治療不能阻止AVS的發(fā)展(4)。相似地，在許多大規(guī)模的臨床試驗(yàn)中已經(jīng)表明血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶抑制劑具有心肌保護(hù)，但沒(méi)有成功的延緩AVS的發(fā)展?？傊?，動(dòng)脈粥樣硬化和AVS是不同的疾病，影響不同的患者人群。
HDL-膽固醇的血漿水平與冠心病之間負(fù)相關(guān)。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)脈粥樣硬化的研究已經(jīng)證明ApoA-1 Milano/磷脂復(fù)合體快速地移動(dòng)膽固醇，因而減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊負(fù)荷(5,6)。此外，兩個(gè)臨床研究表明輸注再造的HDL可以誘導(dǎo)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的迅速改善(7,8)。我們已經(jīng)假設(shè)以HDL為基礎(chǔ)的療法也可以誘導(dǎo)AVS的消退。如果這能夠安全地完成，AVS的醫(yī)學(xué)治療以及消退可以轉(zhuǎn)變我們對(duì)這種常見(jiàn)疾病的臨床療法。載脂蛋白A-I(ApoA-l)是HDL的一個(gè)結(jié)構(gòu)組分，它可以介導(dǎo)其許多有益效果包括加強(qiáng)膽固醇的逆向傳送(9)。在我們的研究中，使用的肽在脂質(zhì)存在下能夠形成兩親性a螺旋，例如ApoA-l(lO，ll)。因此，我們已經(jīng)測(cè)試了模擬新生的HDL的與磷脂復(fù)合的這種ApoA-l模擬肽在前文所述的兔模型中誘導(dǎo)鈣化AVS消退的能力(12)。
眾所周知，血漿中脂蛋白的主要功能是運(yùn)輸脂質(zhì)，例如膽固醇和甘油三酯。為在血漿中運(yùn)輸，膽固醇，通常是膽固醇酯以及甘油三酯被包含在脂蛋白粒子中，在其中它們形成疏水核。所述核被包含磷脂、未酯化的膽固醇和被稱為載脂蛋白的蛋白質(zhì)的表面包衣所包圍。后者負(fù)責(zé)脂質(zhì)的運(yùn)輸而且，此外， 一些可以和脂質(zhì)代謝中的許多酶相互作用。目前，鑒定了至少IO種載脂蛋白，即A國(guó)l、 A-2、 A畫4、 B-48、 B-100、 C國(guó)I 、 C-II、 C國(guó)III、 D和E。
我們已經(jīng)假設(shè)通過(guò)適當(dāng)化合物的使用來(lái)針對(duì)增加脂質(zhì)逆向傳送機(jī)制效率的策略，其可能是心瓣膜病治療的方法。這也可能清除鈣化沉積物，因而有效治愈瓣膜狹窄。
用于檢驗(yàn)這一假設(shè)的化合物(此后稱為化合物A)是一種脂蛋白，其模擬載脂蛋白A-I(ApoA-l)的生物性質(zhì)。這種類型的化合物(一種Apo A-I模擬物或激動(dòng)劑)在2002年4月23日授予Dasseux等人的美國(guó)專利號(hào)為6,376,464名為"Lipid complexes of APO A-1 agonist compounds(APO A-1 ;敫
動(dòng)劑化合物的脂質(zhì)復(fù)合體)"的專利中進(jìn)一步詳細(xì)描述。本文件在此全部通過(guò)引用并入。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些化合物包括肽或其類似物，它們?cè)谥|(zhì)存在下能夠形成兩親性oc螺旋并才莫擬ApoA-1的活性。因此它們被稱作ApoA-1激動(dòng)劑。所述激動(dòng)劑具有作為它們主要特征的由15-29個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選22個(gè)氨基酸殘基或其類似物組成的"核心"肽，其中肽的至少一個(gè)酰胺4建被取代的酰胺、酰胺的電子等排物或模擬酰胺(amide mimetic)代替。
這些ApoA-1激動(dòng)劑部分地依據(jù)下述發(fā)現(xiàn)改變22-mer共有序列的基本序列中某些被認(rèn)為對(duì)活性關(guān)鍵的氨基酸殘基，產(chǎn)生表現(xiàn)出活性的合成肽，其活性接近，或者在某些實(shí)施方案中甚至超過(guò)天然ApoA-1的活性，所述22-mer共有序列公開(kāi)于Venkatachalapathi等，1991, Mol. Conformationand Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B: 585-596
(PVLDEFREKLNEELEALKQKLK;此后"Segrest共有22-mer"或"共有22-mer")。發(fā)現(xiàn)使用疏水Leu殘基取代Segrest共有22-mer肽的三個(gè)帶電荷的氨基酸殘基(Glu-5、 Lys-9和Glu-13)提供了模擬ApoA-1的結(jié)構(gòu)和功能特性達(dá)到了本領(lǐng)域前所未有程度的肽。
化合物A包含具有以下序列的肽
H-Pro-Val-Leu-Asp-Leu-Phe-Arg-Glu-Leu-Leu-Asn-Glu-Leu-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys-Gln-Lys-Leu隱Lys-OH(SEQ ID NO:l)
以及該月太由Polypeptide Laboratories(Torrance， CA， USA)合成。4吏用高效液相色i普法評(píng)估純度，且質(zhì)譜分析超過(guò)98%。所述肽與卵鞘磷脂和1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DPPC)(Avanti Polar Lipids)(10)以1:1:1的重量比復(fù)合，所述復(fù)合通過(guò)將各成分在鹽水中混合，并進(jìn)行多次加熱和冷卻循環(huán)直到溶液變得十分澄清而完成。低壓凍千所述包含復(fù)合體的溶液以等^f分試樣長(zhǎng)期保存。每周在保持4。C且無(wú)菌的條件下重建新鮮溶液。在大鼠中測(cè)試復(fù)合體的生物活性，所述生物活性指在靜脈注射所述肽后轉(zhuǎn)移
13膽固醇以及提高血液中HDL-膽固醇的能力(數(shù)據(jù)未顯示)。
根據(jù)它們已知的生物活性和結(jié)構(gòu)，可以認(rèn)為其他的化合物，例如上文
提到的美國(guó)專利號(hào)6,376,464中出現(xiàn)的化合物，將表現(xiàn)出與化合物A相似的效果。
術(shù)語(yǔ)一種狀態(tài)、疾病、失調(diào)或病癥的"治療(treating)"或"治療(treatment)" 包括
(1) 預(yù)防或延緩受治療者的狀態(tài)、疾病、失調(diào)或病癥的臨床癥狀的出現(xiàn)，所述受治療者可以是受到狀態(tài)、疾病、失調(diào)或病癥的折磨或易受到狀態(tài)、疾病、失調(diào)或病癥的感染，但并未經(jīng)歷或者表現(xiàn)出狀態(tài)、疾病、失調(diào)或病癥的臨床或亞臨床癥狀；
(2) 抑制所述狀態(tài)、疾病、失調(diào)或病癥，即阻止或減輕狀態(tài)、疾病、失調(diào)或病癥或至少其一種臨床或亞臨床癥狀的發(fā)展；或
(3) 緩解所述狀態(tài)、疾病、失調(diào)或病癥，即導(dǎo)致所述狀態(tài)、疾病、失調(diào)或病癥或至少其一種臨床或亞臨床癥狀的消退。
受治療者從治療中獲得的益處是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的或者至少是所述受治療者或醫(yī)生可以感覺(jué)到的。
所述術(shù)語(yǔ)"受治療者"包括哺乳動(dòng)物(特別是人)和其他動(dòng)物，如家畜(如，家養(yǎng)寵物包括貓和狗)以及非家畜(如野生動(dòng)物)。
"治療有效量"是指一種化合物的量，當(dāng)施用于受治療者以治療狀態(tài)、疾病、失調(diào)或病癥時(shí)，可足以實(shí)現(xiàn)所述治療。所述"治療有效量"根據(jù)以下因素變化化合物、狀態(tài)、疾病、失調(diào)或病癥和其嚴(yán)重性以及接受治療的受治療者的年齡、體重、身體狀況和響應(yīng)度。
藥物組合物
本發(fā)明的藥物組合物包括至少 一種本發(fā)明的化合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑(如藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑)。優(yōu)選地，所述藥物組合物包括治療有效量的本發(fā)明所述的化合物。本發(fā)明所述的化合物可與藥學(xué)上可接受的賦形劑(如載體或稀釋劑)結(jié)合，或被載體稀釋，或被封入載體，該載體可以為膠嚢、香嚢(sachet)、紙或其他容器的形式。
合適載體的例子包括且不限于水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、多羥乙氧基蓖麻油、花生油、橄欖油、明膠、乳糖、白土、蔗糖、糊精、碳酸鎂、糖、環(huán)糊精、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯樹膠、硬脂酸或纖維素的低級(jí)烷基醚、硅酸、脂肪酸、脂肪酸胺、脂肪酸甘油一酸酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、聚氧乙烯、羥甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。
所述載體或稀釋劑可以包括一種持續(xù)釋放的材料，如單獨(dú)或與蠟混合的甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
所述藥物組合物也可以包括一種或多種藥學(xué)上可接受的助劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、影響滲透壓的鹽、緩沖劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、或前述的任何組合。本發(fā)明所述藥物組合物可以通過(guò)使用本領(lǐng)域所熟知的步驟配制，以對(duì)受治療者提供施用后活性成分的快速、持續(xù)、或延緩釋放。
本發(fā)明所述藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)制備，如在Remington: TheScience and Practice of Pharmacy, 20th Ed" 2003 (Lippincott Williams &Wilkins)中描述的。例如，所述活性化合物可以同載體混合，或i皮載體稀釋，或被封入載體，其可以為安瓿、膠囊、香嚢、紙或其他容器的形式。當(dāng)載體作為稀釋劑時(shí)，它可以是固體、半固體、或者液體材料，其作為所述活性化合物的運(yùn)載體、賦形劑或介質(zhì)。所述活性化合物可以被吸附在顆粒狀固體容器(如在香嚢中)上。
所述藥物組合物可以為常規(guī)形式，例如，膠嚢、片劑、氣溶月交、溶液、懸浮液或用于局部應(yīng)用的產(chǎn)品。
施用途徑可以是任何將本發(fā)明的活性化合物有效地運(yùn)送到合適或期望的作用部位的途徑。合適的施用途徑包括且不限于口服、鼻、肺、含服、皮下、皮內(nèi)、經(jīng)皮、胃腸外、直腸、貯庫(kù)(depot)，皮下、靜脈內(nèi)、尿道內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、眼(如用眼用溶液)或局部(如用局部軟膏)。
15實(shí)施例
在兔中已經(jīng)建立主動(dòng)脈瓣狹窄的復(fù)合動(dòng)物模型。所述模型引起的以鈣 化為特點(diǎn)的主動(dòng)脈瓣狹窄與在人臨床環(huán)境中觀察到的相似。
方法
動(dòng)物和實(shí)聰r
使用根據(jù)Drolet等的描述(12)所修改的一種動(dòng)物模型。用一種富含 0.50/。膽固醇的飲食(Harlan, Indianapolis, lndiana)加上含有維生素D2(50000 UI每天；Sigma, Markham, Canada)的飲用水喂養(yǎng)十五只雄性新西蘭白兔 (2.7-3.0 kg，年齡12-13周)直到出現(xiàn)顯著的AVS，所述顯著AVS可以通過(guò) 主動(dòng)脈瓣面積(AVA)或5爭(zhēng)瓣速率比(transvalvular velocities ratio)(Vi/V2)的減 少> 10%來(lái)定義，可以通過(guò)超聲心動(dòng)描記術(shù)檢測(cè)(12.9 ± 2.4周)。
然后所述動(dòng)物恢復(fù)標(biāo)準(zhǔn)飲食(沒(méi)有維生素D2)來(lái)模擬膽固醇降低，且隨 機(jī)地被分配到接受鹽水(對(duì)照組，11=8)或所述ApoA-l模擬肽(處理組，n=7)。 兔通過(guò)耳緣靜脈注射鹽水或復(fù)合磷脂(化合物A)的ApoA-l模擬肽(25 mg/kg)2周，每周3次。在全部隨機(jī)處理期間，每3至4天連續(xù)地(見(jiàn)超聲 心動(dòng)描記術(shù)方法)執(zhí)行超聲心動(dòng)圖。最后輸注后兩天，所述動(dòng)物接受最后的 超聲心動(dòng)圖并處死，然后采集主動(dòng)脈瓣進(jìn)行組織學(xué)分析。處理前和處死前 通過(guò)其耳動(dòng)脈獲得在基線的血液樣本。全部膽固醇、HDL膽固S孚、甘油三
面旨和4丐水平通過(guò)自動(dòng)濾光光度計(jì)系統(tǒng)(automated filter photometer system)(Dimension RxL Max, Dade Behring, IL)觀'J量。
動(dòng)物護(hù)理和程序遵守加拿大動(dòng)物飼養(yǎng)協(xié)會(huì)的準(zhǔn)則(Canadian Council on Animal care guidelines), 并一皮動(dòng)物研究才幾構(gòu)道德委員'會(huì)(institutional ethics committee for animal research)批準(zhǔn)。
超聲心動(dòng)描記術(shù)
在以下時(shí)間執(zhí)行經(jīng)胸廓的超聲心動(dòng)圖的研究在基線，在高膽固醇的 飲食直到產(chǎn)生顯著的AVS的8周中從開(kāi)始以每周為基礎(chǔ)進(jìn)行一次，以及用 ApoA-l模擬肽或鹽水對(duì)照處理后4、 7、 10和14天。研究用S12探針使 用標(biāo)準(zhǔn)的超聲心動(dòng)圖系統(tǒng)(Sonos 5500, Philips Medical Imaging, MA)執(zhí)行。肌肉內(nèi)注射氯胺酮(45 mg/kg)和咪達(dá)唑侖(0.75 mg/kg)用于鎮(zhèn)靜。
主動(dòng)脈瓣的胸骨旁長(zhǎng)軸和短軸圖被記錄下來(lái)以評(píng)估瓣葉形態(tài)學(xué)。在放 大的胸骨旁長(zhǎng)軸圖中測(cè)量左心室流出道(LVOT)的直徑，且LVOT的截面積 (CSAlvot)根據(jù)以下計(jì)算CSALVOT = tt (Dlvot/2)2。在頂端5腔圖中用最接 近于主動(dòng)脈瓣的脈沖波Doppler采樣以獲得LVOT的速率(V1)和速率時(shí)間 積分(VTlLvoT)。在同一圖中，使用穿過(guò)主動(dòng)脈瓣的連續(xù)波(CW)D叩pler 詢問(wèn)獲得跨瓣最大速率(V2)和VTI(VTIAO)。在前處理期計(jì)算Vl/V2比來(lái)確 定AVS的發(fā)展。通過(guò)以下的連續(xù)等式獲得在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的主動(dòng)脈瓣面積 (AVA): AVA= CSALVOT x (VTILV0T/ VTIAO)。中間部位的主動(dòng)脈瓣厚度在舒 張末期在放大的胸骨旁長(zhǎng)軸圖中分別在基線、隨機(jī)治療前和最后的超聲心 動(dòng)圖的檢查時(shí)進(jìn)行測(cè)量。
三個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期的均值被用于每次測(cè)量。通過(guò)在繼續(xù)研究前回顧以 前的記錄，特別注意到在系列檢測(cè)中的獲得相似的成像平面。整個(gè)方案中 所有的超聲心動(dòng)圖的成像和測(cè)量是由對(duì)隨機(jī)處理安排未知的同 一有經(jīng)驗(yàn) 的研究者進(jìn)行。
組織形態(tài)測(cè)定
升主動(dòng)脈和主動(dòng)脈瓣縱向打開(kāi)且3個(gè)瓣膜尖被分開(kāi)。兩個(gè)瓣膜尖立即 在包埋劑(OCTTissue-Tek; Sakura， USA)中冷凍，且在-80。C下保存。第三個(gè) 瓣膜尖在4。C下在10%緩沖福爾馬林中浸入固定24小時(shí)且包埋入石蠟中。 從每個(gè)瓣膜尖的中間三分之一獲得的染色的或免疫組織化學(xué)標(biāo)記的組織
切片用以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的數(shù)字成像系統(tǒng)(Image Pro Plus, 5.1版本)來(lái)分析， 所述以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的數(shù)字成像系統(tǒng)使用了連接到數(shù)字?jǐn)z影機(jī)(Qcolor3, Olympus)的光學(xué)顯微鏡(BX41, Olympus)。分析區(qū)域(ROA)是由從瓣葉基部 開(kāi)始的1000 pn的主動(dòng)力永竇和乂人瓣葉基部開(kāi)始的500 pm的瓣葉組成。測(cè) 量損傷面積(LA)和瓣葉損傷長(zhǎng)度(LLL)。
組織化學(xué)
制備蘇木精-根皮紅(phloxin)-番紅(safran)、von Kossa和天狼猩紅(Sirius red) (F3B, BDH, UK)染色的切片分別用于常規(guī)檢查、組織4丐化和膠原蛋白
17研究。如前所述(13)，在偏振光下確定用天狼猩紅苦味酸染色的切片的膠 原蛋白纖維I型和III型的數(shù)量。為了免疫組織化學(xué)評(píng)估，所有切片用抗兔
巨噬細(xì)胞的鼠IgG2a單克隆抗體(RAM11, Dako, Canada)(l:100稀釋)或兔平 滑肌細(xì)胞oc-肌動(dòng)蛋白(Clone 1A4, Dako, Canada)(l:200稀釋)預(yù)培養(yǎng)。應(yīng)用 物種-適當(dāng)(species-appropriate)的生物素化二級(jí)抗體，隨后應(yīng)用鏈霉親和素 辣根過(guò)氧化酶復(fù)合體，用偶氮乙基咔唑(azoethylcarbazol)(AEC)顯像，并通 過(guò)邁爾氏(Mayer's)蘇木精復(fù)染色。在40X放大獲得的數(shù)字影像上確定 ROA中平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和鈣化面積的數(shù)量。每個(gè)切片的影像均在同 樣光照設(shè)置下數(shù)字化捕捉，其針對(duì)所有樣本，在同樣的顏色閾下執(zhí)行自動(dòng) 化的以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的分析。數(shù)據(jù)表示為ROA中標(biāo)記面積的百分比。
為了評(píng)估組織游離膽固醇，在PBS(pH7.4)中固定于4%多聚甲醛的5 pm的冷凍切片用菲律賓菌素染色(13)。在室溫下，切片在溶解于DMSO 的菲律賓菌素復(fù)合體(Sigma, Canada)中培養(yǎng)1小時(shí)并用PBS稀釋，固定在 Vectashield(Vector Laboratories, USA)上，通過(guò)使用具有DAPI濾光裝置的 Zeiss Axiovert 200M顯微鏡的熒光顯微鏡方法觀察。使用安裝有0.63 x C 支座轉(zhuǎn)接器(C-mount adapter)的AxioCam MRm數(shù)字照相機(jī)獲取圖像。 菲律賓菌素?cái)?shù)據(jù)表示為熒光強(qiáng)度的任意單位。
統(tǒng)計(jì)分析
數(shù)據(jù)表示為均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。在"前處理，，時(shí)期，使用重復(fù)測(cè)量方差 分析(ANOVA)模型研究跨時(shí)間和組間(處理組vs.對(duì)照組)的超聲心動(dòng)圖和 血清的測(cè)量。使用以時(shí)間、組、組x時(shí)間相互作用作為獨(dú)立變量的模型， 且只在出現(xiàn)顯著的組x時(shí)間相互作用時(shí)開(kāi)始在給定的時(shí)間點(diǎn)對(duì)比各組。否 則，根據(jù)所述模型主要的組的影響來(lái)得出整體結(jié)論。在隨機(jī)處理時(shí)期，使 用重復(fù)測(cè)量協(xié)方差分析(ANCOVA)模型研究跨時(shí)間和組之間(處理組vs.對(duì) 照組)的超聲心動(dòng)圖和血清的測(cè)量，調(diào)整反應(yīng)變量的基線值。所述ANCOVA ;溪型也包括組x時(shí)間相互作用，且只在出現(xiàn)顯著的組x時(shí)間相互作用時(shí)開(kāi) 始在給定的時(shí)間點(diǎn)對(duì)比各組。否則，根據(jù)所述模型主要的組的影響確定整 體結(jié)論。使用Studentt-檢驗(yàn)對(duì)比處理組和對(duì)照組之間的組織學(xué)變量。使用 Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)估組織形態(tài)測(cè)定和超聲心動(dòng)圖的變量之間的關(guān)系。所有
18的分析使用SAS release 8.2(SAS Institute Inc., Cary, NC)執(zhí)行，且在0.05顯 著性水平進(jìn)行。
結(jié)果
血脂和4丐血
在前處理時(shí)期(高膽固醇的飲食期間)，組之間的總膽固醇(尸=0.942)、 HDL-膽固醇(iM).787)、甘油三酯(尸=0.906)和鈣血(尸=0.727)的血清水平?jīng)] 有顯著差異。在2周的處理期間，兩組中的總膽固醇水平仍然是統(tǒng)計(jì)相似 的(尸=0.470)。對(duì)照組和處理組的值分別為在隨才幾化時(shí)20.46 ±3.52 mmol/L 和20.13 ± 5.18 mmol/L以及在處理結(jié)束時(shí)13.78 ± 6.24 mmol/L和17.57 ± 10.32 mmol/L。在處理期間，各組的HDL-膽固醇水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)顯著差異 (尸=0.374)。 HDL-膽固醇在隨機(jī)化時(shí)為0.50 ±0.20 mmol/L和0.50 ±0.15 mmol/L以及在處理結(jié)束時(shí)為0.39 ± 0.17 mmol/L和0.45 ± 0.17 mmol/L。在 此期間，甘油三酯水平也相似(尸=0.544)。在處理期間，各組的4丐血沒(méi)有顯 著差異(尸=0.832)，在各組中隨機(jī)化前的值為3.31 ±0.29 mmol/L和3.15 ± 0.37 mmol/L以及在處理結(jié)束時(shí)為3.22 ± 0.11 mmol/L和3.22 ± 0.12 mmol/L。
在高膽固醇的飲食和維生素D7補(bǔ)充期間AVS的發(fā)展
通過(guò)膽固醇加維生素D2飲食的AVS誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)對(duì)照組和處理組是相 似的(12.8士2.2 vs. 13.0±2.9星期；P=0.852)。在基線和在高膽固醇的飲食 期結(jié)束時(shí)的AVA之間具有顯著差異(尸0.0001)。兩組中的AVA減少，且對(duì) 照兔和處理兔的值幾乎相同(在對(duì)照組中為從在基線24.2 ±4.1 mn^到19.0 ± 2.7 mm2 J^及在處玉里纟且中為乂人24.7 ±3.9 mm2 到19.1 ±2.6 mm2)。因此各 組在AVS發(fā)展期間AVA沒(méi)有顯著差異(尸二0.852)。因此，在隨機(jī)處理前對(duì) 照組和處理組中的AVA減少了 20.5 ± 4.2%和21.6 ± 3.7%。
在基線和在高膽固醇的飲食期結(jié)束時(shí)測(cè)量的Vt/V2比也具有顯著差異 (尸<0.0001)。在這些時(shí)間點(diǎn)之間比的減少在各組間沒(méi)有顯著差異 (尸=0.914)。
處理時(shí)AVS的發(fā)展-超聲心動(dòng)描記術(shù)如圖l所示，在處理期間(從AVS檢測(cè)到處理2星期后)，觀察到AVA 顯著的組x時(shí)間相互作用(/^0.013)。使用重復(fù)測(cè)量ANCOVA模型，超聲 心動(dòng)圖測(cè)量反映出在處理7天(21.9士3.6 mm2 vs. 19.6 ± 1.8 mm2,尸=0.019) (14.2 ±3.5% vs. 3.9±3.4%的相對(duì)增加)、10天(23.0士4.1 mm2 vs. 20.3 ±2.4 mm2,尸=0.006) (19.8 ± 3.5% vs. 7.6 ± 4.2%的相對(duì)增加)、以及14天(23.8 ± 3.1 mm2 vs. 21.3 ±2.4 mm2,尸=0.012) (24.6 ±2.0% vs. 12.9 ± 3.5%的相對(duì)增力口) 后與對(duì)照組相比，處理組中的AVA顯著增加。
主動(dòng)脈瓣厚度通過(guò)超聲心動(dòng)描記術(shù)評(píng)估，且在隨才幾治療前和14天處 理后測(cè)量。同樣觀察到主動(dòng)脈瓣厚度的顯著的組x時(shí)間相互作用 (尸=0.005)。在隨機(jī)化時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)各組之間的顯著差異，但是觀察到在 處理14天后與對(duì)照組相比處理組中的主動(dòng)脈瓣厚度顯著減少。在處理兔 中，主動(dòng)脈瓣厚度在隨機(jī)化前為0.094 ± 0.034 cm以及在處理結(jié)束時(shí)0.075 ±0.033 cm,而在對(duì)照中同樣的時(shí)間點(diǎn)其為0.080 ±0.024 cm和0.080 ± 0.026 cm。
組織學(xué)
所有的動(dòng)物表現(xiàn)出主動(dòng)脈瓣損傷。損傷在于新組織帽(cap of neotissue)，所述新組織帽是由多層泡沫細(xì)胞逐漸被源于損傷約一半深處缺 少泡沫細(xì)胞的纖維化材料代替所形成。損傷一般從竇管(sinotubular)區(qū)域發(fā) 展，覆蓋整個(gè)主動(dòng)脈竇且延伸到瓣尖基部并上到靠近瓣葉小動(dòng)脈支(leaflet arterialis)的一半到三分之二。相反地，在瓣葉心室支(ventricularis)上的損 傷不常見(jiàn)也不嚴(yán)重。
組織形態(tài)測(cè)定
如圖3所示，用ApoA-l模擬肽處理的組與對(duì)照組相比，每ROA的 LA的百分比顯著減少(52.8 ± 12.5%/ROA vs. 66.7 ± 9.9%/ROA,尸=0.032)。 有趣地是，當(dāng)將兩組中組織形態(tài)測(cè)定的LA/ROA的百分比同超聲心動(dòng)描記 術(shù)確定的AVA匯集起來(lái)時(shí)，發(fā)現(xiàn)LA/ROA的百分比同AVA之間存在負(fù)相 關(guān)0 = -0.54,尸=0.039,圖4。相似地，來(lái)自兩組的匯集的數(shù)據(jù)的分析反映了 AVA同o/oLLL(即，損傷占總瓣葉長(zhǎng)度的百分比或LLL/總瓣葉長(zhǎng)度x 100) 之間的負(fù)相關(guān)(r = -0.70,尸=0.004)。然而，處理組和對(duì)照組之間的Q/oLLL差異沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著(55.7 ±24.3% vs, 72.3 ± 11.7%,尸=0.109)。 組織化學(xué)
在大多數(shù)動(dòng)物中觀察到鈣化病灶。在主動(dòng)脈竇的損傷核心中具有鈣沉 積物的兔的百分比為處理組57%(4/7)和對(duì)照組88%(7/8)。在von Kossa 染色上被鈣化占據(jù)的主動(dòng)脈竇面積的百分比的量反應(yīng)了一個(gè)強(qiáng)趨勢(shì)，所述 趨勢(shì)為與對(duì)照組相比，處理組中有77%的減少(1.6 ±2.0% vs. 6.9 ± 6.7%; P=0.063)。通過(guò)使用來(lái)自兩研究組中的匯集數(shù)據(jù)，所述竇面積中的鈣化病 灶面積的百分比同超聲心動(dòng)描記術(shù)確定的主動(dòng)脈瓣厚度顯著相關(guān)(r = 0.63, iM).012)(圖5)。
通過(guò)菲律賓菌素染色檢測(cè)的游離膽固醇出現(xiàn)在幾乎所有對(duì)照動(dòng)物的 整個(gè)主動(dòng)脈瓣損傷區(qū)域，而在大多數(shù)用ApoA-l模擬肽處理的動(dòng)物中，損 傷的腔邊緣的熒光信號(hào)趨于減弱。與對(duì)照相比，被處理動(dòng)物中的損傷腔邊 緣的第一個(gè)10pm中熒光信號(hào)的評(píng)估顯示游離膽固醇減少41%，但是這種 差異并沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著(221 ±54 vs. 377 ±229熒光強(qiáng)度任意單位， P=0.231)。巨噬細(xì)胞區(qū)域(34.5%)是"-肌動(dòng)蛋白正相區(qū)(17.1%)的大約2倍 大，各組之間沒(méi)有顯著差異。在ROA中，膠原m型纖維(綠光)的百分比高 于膠原T型纖維(紅-黃)(對(duì)照中TIT型19.7 ± 5.5%/ROA vs. T型6.6 ± 4.1%/ROA,尸=0.00009;處理兔中III型19.1 ± 11.3%/ROA vs. I型5.5 ± 5.6。/。/ROA,i^0.015)。然而，在ROA中膠原纖維(I和m型)的百分比在各 組之間是相似的(分別地尸=0.671和尸=0.883)。
討論
這些實(shí)驗(yàn)證明ApoA-l模擬肽的輸注導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)AVS顯著消退。相比于 對(duì)照組，ApoA-l模擬肽的輸注誘導(dǎo)了 AVA的更大改善以及主動(dòng)脈瓣厚度 的顯著減少。通過(guò)超聲心動(dòng)描記術(shù)，這些AVS嚴(yán)重性的有益變化伴隨著組 織學(xué)切片中瓣葉基部區(qū)域損傷程度的顯著減少以及減少鈣化的強(qiáng)趨勢(shì)。
使用由Drolet等(12)開(kāi)發(fā)的AVS兔模型，其允許模擬臨床情況，在所 述模型中主動(dòng)脈瓣鈣化顯著地且可重復(fù)地發(fā)生。在大約13星期的富含膽 固醇的飲食和維生素D2的補(bǔ)充后，超聲心動(dòng)圖測(cè)試表明AVA2P/。的減少。二維影像顯示了增加的瓣厚度和與瓣膜硬化和鈣化區(qū)域相容的回音
(echogenicity )。組織學(xué)檢驗(yàn)確定了在主動(dòng)脈竇和瓣葉基部的瓣膜增厚和4丐沉積。所述研究提供了 ApoA-1模擬肽對(duì)實(shí)驗(yàn)鈣化AVS的有益效果的超聲心動(dòng)圖和組織學(xué)證據(jù)。最早在主動(dòng)處理開(kāi)始后7天可以觀察到AVA的增加，在14天達(dá)到24%的改善。伴隨著ApoA-1模擬肽的輸注，AVA幾乎確實(shí)恢復(fù)到開(kāi)始所述高膽固醇的飲食前表現(xiàn)的正常值。相反地，對(duì)照組中富含膽固醇飲食和維生素D2補(bǔ)充的中止(模擬脂質(zhì)降低)僅導(dǎo)致了 AVA的輕微增加，其證明了所述肽的有益效果。如超聲心動(dòng)描記術(shù)所示，在用肽處理僅14天后，主動(dòng)脈瓣厚度也顯著減少。有趣地，由超聲心動(dòng)描記術(shù)確定的AVA同組織學(xué)中損傷程度的指數(shù)負(fù)相關(guān)(correlate inversely)。ApoA-1模擬肽的輸注也導(dǎo)致了瓣葉基部附近組織學(xué)分析區(qū)域中損傷面積百分比的顯著減少。此外，瓣膜鈣化程度在任意選擇的0.05水平幾乎達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著的巨大減少可能具有臨床重要性，因?yàn)槔夏耆说?丐化AVS是在發(fā)達(dá)國(guó)家中最常見(jiàn)的狹窄形式。這說(shuō)明主動(dòng)脈瓣鈣化的出現(xiàn)不但沒(méi)有阻止獲得肽的有益結(jié)果而且這種方法甚至可以消退瓣膜鈣化自身。所述發(fā)現(xiàn)也可以應(yīng)用于二尖瓣和/或環(huán)的4丐化。
與磷脂復(fù)合的ApoA-1模擬肽以和天然ApoA-1相似的方式刺激膽固醇逆向傳送(14)。與對(duì)照組相比(于處理2星期后觀察)，用肽處理的兔的總膽固醇的更高循環(huán)水平可以表明加強(qiáng)的組織膽固醇的移動(dòng)。
這個(gè)實(shí)施例證明對(duì)人使用任何合適的HDL為基礎(chǔ)的療法可以獲得相似的結(jié)果，舉例來(lái)說(shuō)，例如一種或多種HDL或具有HDL-樣效果的肽(有或沒(méi)有脂質(zhì))的輸注或推注、口服施用HDL-模擬劑、和/或施用膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)調(diào)質(zhì)、或B族1型(class B, member l)清道夫受體(SRBl)調(diào)質(zhì)或肝X受體(LXR)/類視黃醇X受體(RXR)激動(dòng)劑、或ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白l(ABCAl)激動(dòng)劑、或過(guò)氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)激動(dòng)劑、以及其他。
雖然本文所述的實(shí)驗(yàn)涉及調(diào)節(jié)主動(dòng)脈瓣狹窄，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人
22模型。
盡管此前通過(guò)其優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但可以在沒(méi)有偏離如附加的權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的精神和性質(zhì)下對(duì)其進(jìn)行改動(dòng)。
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權(quán)利要求
1. 一種預(yù)防或治療受治療者瓣膜狹窄的方法，所述方法包括向需要其的受治療者施用治療有效量的脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脂質(zhì)傳送激動(dòng)劑是膽固醇 逆向傳送5敫動(dòng)劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述瓣膜狹窄是主動(dòng)脈瓣狹窄。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述瓣膜狹窄是鉤化瓣狹窄。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑是選 自由高密度脂蛋白(HDL)、具有HDL-樣生理學(xué)功效的肽、復(fù)合脂質(zhì)的具有HDL-樣生理學(xué)功效的肽、HDL-模擬劑、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)調(diào)質(zhì)、 B族1型清道夫受體(SRB1)調(diào)質(zhì)、肝X受體/類視黃醇X受體(LXR/RXR) 激動(dòng)劑、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1 (ABCAl )激動(dòng)劑以及過(guò)氧化物酶體增生物 激活受體(PPAR)激動(dòng)劑組成的組。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑是載 脂蛋白A-l(ApoA-l)模擬肽/磷脂復(fù)合體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中施用所述ApoA-l模擬肽/磷脂 復(fù)合體包括注射所述ApoA-l模擬狀/磷脂復(fù)合體于所述受治療者。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述ApoA-l模擬肽/磷脂復(fù)合 體以從約1昭到約10g每千克所述受治療者體重的劑量注射。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述ApoA-l模擬肽/磷脂復(fù)合 體以從約1 mg到約.5 g每千克所述受治療者體重的劑量注射。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述ApoA-l模擬肽/磷脂復(fù)合 體以約25 mg每千克所述受治療者體重的劑量注射。
11. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述ApoA-l模擬肽具有SEQ IDNO:l中所列的序列。
12. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述ApoA-l模擬肽與卵鞘磷脂和1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DPPC)復(fù)合。
13. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述激動(dòng)劑包括具有SEQ ID NO:l中所列的序列的多肽。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受治療者為哺乳動(dòng)物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述受治療者為人。
16. —種預(yù)防或治療受治療者瓣膜釣化的方法，所述方法包括向需要 其的受治療者施用治療有效量的脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑。
17. —種控制受治療者瓣膜狹窄的方法，所述方法包括增加需要其的 受治療者的膽固醇逆向傳送。
18. —種預(yù)防或逆轉(zhuǎn)瓣膜狹窄的方法，所述方法包括向需要其的患者 施用脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑。
19. 一種控制受治療者瓣膜狹窄的方法，所述方法包括向需要其的受 治療者施用治療有效量的脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中控制所述瓣膜狹窄包括減少 所述瓣膜狹窄進(jìn)展速率。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中控制所述瓣膜狹窄包括至少 部分地逆轉(zhuǎn)所述瓣膜狹窄。
22. 脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑用于控制受治療者的瓣膜狹窄的應(yīng)用。
23. 脂質(zhì)逆向傳送激動(dòng)劑用于制備控制受治療者的瓣膜狹窄的藥物組 合物物質(zhì)的應(yīng)用。
全文摘要
一種治療瓣膜狹窄的方法。所述方法包括向哺乳動(dòng)物施用治療有效量的脂質(zhì)(特別是膽固醇)逆向傳送激動(dòng)劑。最優(yōu)選一種載脂蛋白A-1模擬肽/磷脂復(fù)合體，其肽由SEQ ID NO1的氨基酸序列定義。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101489577SQ200780026891
公開(kāi)日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2007年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月1日
發(fā)明者吉恩-克勞德·塔迪芙 申請(qǐng)人:蒙特利爾心臟病學(xué)研究所