專利名稱：：診斷和治療妊娠并發(fā)癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：總體地說(shuō)，本發(fā)明涉及患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥的受試者的檢測(cè)和治療。
背景技術(shù)：
：先兆子癇是高血壓、水腫和蛋白尿的綜合征，其影響5-10%的妊娠，并導(dǎo)致顯著產(chǎn)婦和胎兒發(fā)病率及死亡率。先兆子癇造成全世界每年至少200,000名產(chǎn)婦死亡。先兆子癇的癥狀一般地在妊娠第20周后出現(xiàn)，且通常是通過(guò)常規(guī)測(cè)量婦女的血壓和尿而4企測(cè)出來(lái)的。然而，這些監(jiān)控方法不能有效診斷早期綜合征，如果采取有效的治療，所述診斷就可減少對(duì)受試者或發(fā)育中胎兒的危險(xiǎn)。目前還沒(méi)有已知的先兆子癇療法。先兆子癇的嚴(yán)重程度可從輕度直至威脅生命。輕度形式的先兆子癇可通過(guò)臥床休息和經(jīng)常監(jiān)控來(lái)治療。對(duì)于中度至嚴(yán)重的病例，建議住院并接受血壓藥物治療或抗驚厥劑藥物治療，以防止癲癇發(fā)作。如果狀況威脅到母親或嬰兒的生命，則要終止妊娠并在預(yù)產(chǎn)期前分娩出嬰兒。胎兒和胎盤的正確發(fā)育是由幾種生長(zhǎng)因子或血管發(fā)生因子介導(dǎo)的。這些血管發(fā)生因子中的一種是內(nèi)皮糖蛋白，其也稱作CD105。內(nèi)皮糖蛋白是一種同二聚體細(xì)胞膜糖蛋白，其主要在內(nèi)皮細(xì)胞(如合胞滋養(yǎng)層、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和血管內(nèi)皮細(xì)胞)上表達(dá)。內(nèi)皮糖蛋白與P聚糖，即一種III型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-p受體共有序列同一性。已經(jīng)表明，內(nèi)皮糖蛋白是TGF-(3受體復(fù)合物的調(diào)節(jié)組分，其調(diào)節(jié)血管發(fā)生、增殖、分化和細(xì)胞凋亡。內(nèi)皮糖蛋白也結(jié)合TGF-(3超家族的幾種其它成員，包括激活蛋白-A、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2和BMP-7。具體地，內(nèi)皮糖蛋白以高親和力結(jié)合TGF-pi和TGF-(33,并與TGF-(M言號(hào)傳導(dǎo)受體1和II型形成異三聚體締合。內(nèi)皮糖蛋白基因的編碼區(qū)的突變?cè)斐?型出血性毛細(xì)管擴(kuò)張(HHT1)，這是一種顯性遺傳的血管病癥，其特征在于多系統(tǒng)的血管發(fā)育異常和復(fù)發(fā)性出血。盡管以前已經(jīng)在轉(zhuǎn)移性乳腺癌和結(jié)腸直腸癌患者的血漿中檢測(cè)到增高水平的內(nèi)皮糖蛋白免疫反應(yīng)性，但還沒(méi)有確定其生化特征，并且其在癌癥的發(fā)病機(jī)理中的確切功能作用還不清楚。尚未4艮道可溶內(nèi)皮糖蛋白生成與先兆子癇或正常妊娠有關(guān)。已經(jīng)報(bào)道幾種因子與胎兒和胎盤發(fā)育有關(guān)，且更具體地與先兆子癇有關(guān)。它們包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、可溶的Flt-i受體(sFlt-l)和胎盤生長(zhǎng)因子(P1GF)。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的促分裂原、血管發(fā)生誘導(dǎo)物和血管通透性的介質(zhì)。已經(jīng)表明VEGF對(duì)于腎小球毛細(xì)血管修復(fù)是重要的。VEGF作為同二聚體與兩種同源跨膜酪氨酸激酶受體(fms-樣酪氨酸激酶(Flt-l)和激酶結(jié)構(gòu)域受體(KDR))之一結(jié)合，所述受體在從很多不同組織獲得的內(nèi)皮細(xì)胞中差別表達(dá)。Flt-l(而不是KDR)由促成胎盤形成的滋養(yǎng)層細(xì)胞高度表達(dá)。P1GF是VEGF家族成員，其也參與胎盤發(fā)育。P1GF由細(xì)胞滋養(yǎng)層及合胞滋養(yǎng)層表達(dá)，且能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及活化。P1GF作為同二聚體與Flt-l受體結(jié)合，但不與KDR受體結(jié)合。P1GF和VEGF均可對(duì)促有絲分裂活性和血管發(fā)生作出貢獻(xiàn)，后者對(duì)于發(fā)育中的胎盤是至關(guān)重要的。近來(lái)已經(jīng)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中鑒別了sFlt-l,其缺少受體的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，并隨后在胎盤組織中證實(shí)了體內(nèi)表達(dá)。sFlt-l以高親和力與VEGF結(jié)合，但不會(huì)刺激內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂發(fā)生。小心地調(diào)節(jié)血管發(fā)生和促有絲分裂信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)于由發(fā)育中的胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞維持適宜的增殖、遷移和血管發(fā)生是至關(guān)重要的。需要準(zhǔn)確診斷有風(fēng)險(xiǎn)患有或患有先兆子癇或子癇的受試者的方法，特別是在發(fā)作最嚴(yán)重的癥狀之前。還需要進(jìn)行治療。發(fā)明概述我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了診斷和治療妊娠相關(guān)的高血壓病癥(包括先兆子癇和子癇)的方法。利用基因表達(dá)分析，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在來(lái)自患有與高血壓有關(guān)的妊娠并發(fā)癥(包括先兆子癇)的孕婦的胎盤組織樣品中，可溶內(nèi)皮糖蛋白(sEng)的水平顯著提高。采用蛋白印跡，我們也發(fā)現(xiàn)可溶內(nèi)皮糖蛋白水平在獲自患有妊娠相關(guān)高血壓病癥，如先兆子癇和子癇的女性的血清樣品中提高。可溶內(nèi)皮糖蛋白可以由蛋白水解酶切割膜結(jié)合形式的胞外部分而形成。我們發(fā)現(xiàn)在這些樣品中檢測(cè)到的可溶內(nèi)皮糖蛋白最少含有全長(zhǎng)內(nèi)皮糖蛋白的氨基末端部分的前381個(gè)氨基酸(排除前導(dǎo)肽，包括前導(dǎo)肽則是406個(gè))。如本文描述的，先兆子癇中的過(guò)量可溶內(nèi)皮糖蛋白可以通過(guò)阻止TGF-P1與內(nèi)皮細(xì)胞上的TPRII結(jié)合而導(dǎo)致信號(hào)傳遞減少，從而從胎盤消耗必要量的這些必須血管發(fā)生和促有絲分裂因子。我們也發(fā)現(xiàn)了可溶內(nèi)皮糖蛋白干擾內(nèi)皮細(xì)胞中的TGF-P1信號(hào)傳遞和內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)激活，從而破壞維持血管健康所必須的關(guān)鍵平衡機(jī)制。我們證明了可溶內(nèi)皮糖蛋白阻止TGF-P1與內(nèi)皮細(xì)胞上的TPRII結(jié)合而導(dǎo)致信號(hào)傳遞減少。由于循環(huán)TGF-P1與潛伏相關(guān)肽和潛伏TGF-P1結(jié)合蛋白復(fù)合，它不能結(jié)合其受體，除非被激活。因此，可溶內(nèi)皮糖蛋白可能僅僅在產(chǎn)生活性TGF-P1的部位局部抑制TGF-P1作用。綜合考慮，這些數(shù)據(jù)提示了內(nèi)皮糖蛋白在聯(lián)系TGF-P受體激活與一氧化氮(NO)合成中的關(guān)鍵作用。此外，我們的功能研究提示可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFltl分別通過(guò)干擾TGF-卩1和VEGF信號(hào)傳遞而協(xié)同誘導(dǎo)血管破壞和HELLP綜合征，這可能是通過(guò)抑制NOS的下游激活。在本發(fā)明中，使用結(jié)合或中和可溶內(nèi)皮糖蛋白的化合物來(lái)降低提高的水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白并且治療與高血壓相關(guān)的妊娠并發(fā)癥，包括先兆子癇或子癇。例如，也提供了可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體以及用于降低生物活性可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平的RNA干擾和反義核堿基(nucleobase)寡聚體。本發(fā)明也涉及任何降低可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平或生物活性，或提高可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白(如可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白(如TGF-P1，TGF-P3,激活蛋白A,骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2和BMP-7)、NOS和前列環(huán)素的水平或生物活性的化合物(如多肽、小分子、抗體、核酸和模擬物)在治療或預(yù)防受試者中的妊娠相關(guān)高血壓病癥，如先兆子癇或子癇中的用途，上述化合物是單獨(dú)的或與彼此組合，或與任何降低sFlt-l的水平或提高VEGF或P1GF的水平或活性的化合物(參見(jiàn)例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20040126828,20050025762,和20050170444以及PCT公開(kāi)號(hào)WO2004/008946和WO2005/077007)組合。本發(fā)明也涉及測(cè)量單獨(dú)的或與sFlt-l、VEGF、P1GF、TGF-P、eNOS或PGl2組合的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平的方法，作為早期診斷和控制妊娠相關(guān)高血壓病癥，包括先兆子癇和子癇的檢測(cè)工具。因此，第一方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防受試者中的妊娠相關(guān)的高血壓病癥的方法，該方法包括給受試者施用(i)能夠降低可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)水平或生物活性的化合物，和(ii)能夠降低SFlt-l表達(dá)水平或生物活性的化合物，施用的時(shí)間和量足以治療或預(yù)防妊娠相關(guān)的高血壓病癥。妊娠相關(guān)的高血壓病癥包括例如先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征和具有小于胎齡(smallforgestationalage，SGA)嬰兒的妊娠。優(yōu)選地，妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇或子癇?？扇軆?nèi)皮糖蛋白或sFlt-l表達(dá)水平或生物活性的測(cè)定是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選的化合物將使可溶內(nèi)皮糖蛋白或sFlt-l表達(dá)水平或生物活性降低至少10Q/q,20%，30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%或更多。能夠降低可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)水平或生物活性的化合物的非限制性實(shí)例包括任何特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的化合物，例如純化的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗體、可溶內(nèi)皮糖蛋白抗原結(jié)合片段，或可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白(例如TGF-P1,TGF-P3,激活蛋白A，BMP-2和BMP-7)。能夠降低可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)水平或生物活性的化合物的其它實(shí)例包括任何抑制蛋白水解酶(如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、組織蛋白酶和彈性蛋白酶)的化合物或提高能夠結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的生長(zhǎng)因子水平的化合物。生長(zhǎng)因子如TGF-P1，TGF-P3，激活蛋白A,BMP-2，BMP-7或其片段是提高能夠結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的生長(zhǎng)因子水平的化合物的實(shí)例，環(huán)孢菌素、a生育酚、美西麥角、溴隱亭和愛(ài)道美也是這樣的化合物。能夠降低sFlt-l表達(dá)水平或生物活性的化合物的非限制性實(shí)例包括能夠特異性結(jié)合sFlt-l的化合物，例如純化的sFlt-l抗體或sFlt-l抗原結(jié)合片段；提高能夠結(jié)合sFlt-l的生長(zhǎng)因子水平的化合物，如煙堿，茶堿，腺普，硝苯地平，米諾地爾和硫酸鎂，VEGF(如VEGF121，VEGF165,或VEGF的修飾形式)，P1GF,或其片段。在上述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，能夠降低可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)水平或生物活性的化合物，或能夠降低sFlt-l表達(dá)水平或生物活性的化合物，或這兩者，也能夠使一氧化氮合酶(NOS)活性提高至少10%,20%,30%,40%，50%，60%,70%,80%，90%或更多。NOS活性的測(cè)定是本領(lǐng)域已知的，并且在本文中描述。第二方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防受試者中的妊娠相關(guān)高血壓病癥的方法，該方法包括給受試者施用能夠提高NOS的表達(dá)水平或生物活性的化合物的步驟，施用的時(shí)間和量足以治療或預(yù)防受試者中的妊娠相關(guān)的高血壓病癥。理想地，NOS是eNOS。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物是增加eNOS的Ser1177的磷酸化的化合物，如VEGF(如VEGF121，VEGF165,或VEGF的修飾形式)或其生物活性片段，或P1GF或其生物活性片段。在另一實(shí)施方案中，所述化合物是增加eNOS的Thr495的去磷酸化的化合物，如TGF-P1或TGF-P3、激活蛋白A、BMP-2和BMP-7。在另一實(shí)施方案中，所述化合物是阻止eNOS的水平降低或增加eNOS的穩(wěn)定性的化合物。任選地，該方法進(jìn)一步包括給受試者施用能夠降低可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)水平或生物活性的化合物，其中所述施用足以治療或預(yù)防受試者中的妊娠相關(guān)的高血壓病癥。能夠降低可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)水平或生物活性的化合物的非限制性實(shí)例包括特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的純化抗體或可溶內(nèi)皮糖蛋白抗原結(jié)合片段或抑制選自基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、組織蛋白酶和彈性蛋白酶的蛋白水解酶的化合物，或生長(zhǎng)因子如TGF-P1、TGF-P3、激活蛋白A、BMP-2、BMP-7或其片段。特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的示例性抗體包括結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的抗體，所述多肽包括選自圖30B所示人內(nèi)皮糖蛋白序列的氨基酸26-437、40-406或26-587、的氨基酸序列。用于本發(fā)明的方法中的其它示例性抗體包括結(jié)合人內(nèi)皮糖蛋白上的表位的抗體，所迷表位包括圖30B所示人內(nèi)皮糖蛋白序列的氨基酸40-86、144-199、206-222、289-304或375-381。在一個(gè)實(shí)施方案中，妊娠相關(guān)的高血壓病癥的特征在于與正常參照相比提高的sFlt-l多肽水平。任選地，該方法進(jìn)一步包括給受試者施用能夠降低sFlt-l表達(dá)或生物活性的化合物，其中所述施用足以治療或預(yù)防受試者中的妊娠相關(guān)的高血壓病癥。能夠降低可溶sFlt-l表達(dá)或生物活性的化合物的非限制性實(shí)例包括特異性結(jié)合sFlt-l的純化抗體或sFlt-l抗原結(jié)合片段，或生長(zhǎng)因子如VEGF(如VEGF121、VEGF165或VEGF的修飾形式)、P1GF或其結(jié)合sFlt-l的片段。對(duì)于任何上述方法，該方法可進(jìn)一步包括給受試者施用抗高血壓化合物的步驟。在任何上述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者是妊娠的人、分娩后的人或非人(如牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗和貓)。對(duì)于任何上述方法，該方法可以進(jìn)一步包括監(jiān)測(cè)受試者中妊娠相關(guān)的高血壓病癥的步驟，其中所述監(jiān)測(cè)包括測(cè)量來(lái)自受試者的血清或血漿樣品中可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平。如果測(cè)定可溶內(nèi)皮糖蛋白的絕對(duì)水平，低于25ng/ml的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平表明妊娠相關(guān)的高血壓病癥的改善?；蛘呋虼送?，可以在兩種或多種場(chǎng)合下測(cè)量可溶內(nèi)皮糖蛋白水平或與陽(yáng)性參照樣品(例如來(lái)自患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥的受試者)比較，其中測(cè)量值之間或與陽(yáng)性參照相比可溶內(nèi)皮糖蛋白的減少是妊娠相關(guān)的高血壓病癥改善的指標(biāo)?？扇軆?nèi)皮糖蛋白水平的測(cè)量可以包括使用免疫學(xué)測(cè)定?？扇軆?nèi)皮糖蛋白可以包括游離的、結(jié)合的或總的可溶內(nèi)皮糖蛋白或降解或酶切得到的內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平。監(jiān)測(cè)方法也可以包括本文描述的用于診斷先兆子癇或子癇的任何度量標(biāo)準(zhǔn)。例如，監(jiān)測(cè)方法可以包括測(cè)量受試者中妊娠的前三個(gè)月和妊娠的次三個(gè)月中sFlt-l和可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平，并且用以下公式計(jì)算每個(gè)三月期中sFltlx可溶內(nèi)皮糖蛋白(sEng)的S乘積[d乘積(dproduct)=妊娠的次三個(gè)月中的(sFltlxsEng)-妊娠的前三個(gè)月中的(sFltlxsEng)],其中大于0、1、2或更高的值，包括其分?jǐn)?shù)，(例如正值)是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。該值隨時(shí)間的減少表明妊娠相關(guān)的高血壓病癥的改善。在另一實(shí)例中，計(jì)算妊娠的前三個(gè)月和妊娠的次三個(gè)月之間sFlt-l水平(dsFlt-l)或sEng水平(dsEng)之間的5乘積，并且對(duì)于(dsFlt-l)或(dsEng),大于O、1、2或更高的值，包括其分?jǐn)?shù)，(例如正值)是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。該值隨時(shí)間的減少表明妊娠相關(guān)的高血壓病癥的改善。對(duì)于任何所述監(jiān)測(cè)方法，該方法可以用于確定化合物的治療劑量。該方法也可以進(jìn)一步包括測(cè)量來(lái)自受試者的樣品中sFlt-l、VEGF或P1GF多肽中至少一種多肽的水平，這些水平之間的關(guān)系也可以，但不是必須用度量標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算。示例性度量標(biāo)準(zhǔn)包括[(sFlt-l+0.25可溶內(nèi)皮糖蛋白)/PlGF]、[(可溶內(nèi)皮糖蛋白+sFlt-l)/PlGF]、[sFlt-lx可溶內(nèi)皮糖蛋白]，和上文描述的[d乘積=妊娠的次三個(gè)月中的(sFltlxsEng)-妊娠的前三個(gè)月中的(sFltlxsEng)〗。另一方面，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體結(jié)合人內(nèi)皮糖蛋白上的表位，所述表位包括圖30B所示人內(nèi)皮糖蛋白序列的氨基酸40-86、144-199、206-222、289-304或375-381。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段防止生長(zhǎng)因子(如TGF-P1,TGF-P3，激活蛋白A,BMP-2和BMP-7)與可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合。所述抗體可以是任何類型的抗體或抗體片段，包括單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、缺乏Fc部分的抗體，是F(ab，)2、Fab或Fv結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段存在于藥學(xué)可接受的載體中。另一方面，本發(fā)明涉及診斷患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥或具有患所迷病癥的傾向的受試者的方法，該方法包括測(cè)量來(lái)自受試者的樣品中可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和至少一種另外的多肽的水平，所述至少一種另外的多肽選自可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白(如TGF-卩1，TGF-P3，激活蛋白A,BMP2和BMP7)和可溶內(nèi)皮糖蛋白信號(hào)傳遞的下游介質(zhì)(如eNOS和PGI2),其中與正常參照樣品、標(biāo)準(zhǔn)或水平相比，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的提高和至少一種另外的多肽的水平的降低，是妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向的診斷指標(biāo)。另一方面，本發(fā)明涉及診斷患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥或具有患所述病癥的傾向的受試者的方法，該方法包括測(cè)量來(lái)自受試者的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和sFlt-l多肽的水平，并且用[可溶內(nèi)皮糖蛋白xsFlt-l]度量標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt-l水平之間的關(guān)系，其中相對(duì)于正常參照樣品，受試者樣品中該度量標(biāo)準(zhǔn)的增加是受試者中妊娠相關(guān)的高血壓病癥的診斷指標(biāo)。另一方面，本發(fā)明涉及診斷患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥或具有患所述病癥的傾向的受試者的方法，該方法包括測(cè)量受試者妊娠的前三個(gè)月和妊娠的次三個(gè)月中sFlt-l和可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平，并且用以下公式計(jì)算每個(gè)三月期中sFltlx可溶內(nèi)皮糖蛋白(sEng)的5乘積[d乘積=妊娠的次三個(gè)月中的(sFltlxsEng)-妊娠的前三個(gè)月中的(sFltlxsEng)]，其中大于0、1、2或更高的值，包括其分?jǐn)?shù)(例如正值)，是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。正值也可以是早發(fā)先兆子癇的指標(biāo)。可以在妊娠的前三個(gè)月和妊娠的次三個(gè)月的許多場(chǎng)合下進(jìn)行所述測(cè)量，并且可以隨時(shí)間跟蹤d乘積。另一方面，本發(fā)明涉及診斷患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥或具有患所述病癥的傾向的受試者的方法，該方法包括測(cè)量受試者中妊娠的前三個(gè)月和妊娠的次三個(gè)月中sFlt-l和可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平，并且計(jì)算妊娠的前三個(gè)月和妊娠的次三個(gè)月之間sFlt-l水平(dsFlt-)或sEng水平(dsEng)的5乘積，其中對(duì)于(dsFlt-l)或(dsEng),大于0、1、2或更高的值，包括其分?jǐn)?shù)(例如正值)，是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。對(duì)于本發(fā)明的任何診斷方法，該測(cè)量可以包括利用免疫學(xué)測(cè)定，如ELISA。在一個(gè)實(shí)施方案中，正常參照樣品是來(lái)自患者的先前的樣品。在另一實(shí)施方案中，度量標(biāo)準(zhǔn)也包括母親的體重指數(shù)或胎兒的胎齡。樣品可以是受試者的體液(例如，尿、羊水、血液、血清和血漿)、細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、單核細(xì)胞和來(lái)源于胎盤的細(xì)胞)或組織(如胎盤組織)，其中可溶內(nèi)皮糖蛋白通常是可檢測(cè)的。受試者可以是非妊娠的人、妊娠的人、產(chǎn)后的人，或非人類(例如，牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗或貓)，并且該方法可以用于i貪斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向(例如，在癥狀發(fā)作前至少4周)。另一方面，本發(fā)明涉及用于診斷受試者中的妊娠相關(guān)的高血壓病癥的試劑盒，該試劑盒包含(i)可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合劑，和(ii)至少一種另外的結(jié)合劑，其結(jié)合選自TGF-P1、TGF-P3、eNOS和PGl2的多肽；和(iii)使用(i)的結(jié)合劑和(ii)的至少一種結(jié)合劑來(lái)診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向的說(shuō)明書(shū)。結(jié)合劑可以是特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段，或特異性結(jié)合TGF-P1、TGF-P3、eNOS或PGI2的抗體或其抗原結(jié)合片段。任選地，該試劑盒也包含VEGF、sFlt-l或P1GF結(jié)合分子。另一方面，本發(fā)明涉及鑒定改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物的方法，該方法包括以下步驟(a)使細(xì)胞與可溶內(nèi)皮糖蛋白化合物接觸；(b)在與可溶內(nèi)皮糖蛋白化合物接觸后確定細(xì)胞中eNOS的Thr495的磷酸化狀態(tài)；(c)使細(xì)胞與候選化合物接觸；(d)在細(xì)胞與候選化合物接觸后確定細(xì)胞中eNOS的Thr495的磷酸化狀態(tài)；和(e)比較步驟(b)和步驟(d)中確定的磷酸化狀態(tài)，其中與步驟(b)相比，步驟(d)中eNOS的Thr495的去磷酸化的增加，鑒定候選化合物為改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物。另一方面，本發(fā)明涉及鑒定改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物的方法，該方法包括以下步驟(a)使細(xì)胞與Smad2/3依賴性報(bào)道構(gòu)建體和可溶內(nèi)皮糖蛋白化合物接觸；(b)確定步驟(a)的細(xì)胞中Smad2/:3報(bào)道構(gòu)建體的激活水平；(c)使步驟(a)的細(xì)胞與候選化合物接觸；(d)確定步驟(c)的細(xì)胞中Smad2/3報(bào)道構(gòu)建體的激活水平；和(e)比較步驟(b)和步驟(d)中確定的Smad2/3報(bào)道構(gòu)建體的激活水平，其中與步驟(b)相比，步驟(d)中Smad2/3報(bào)道構(gòu)建體的激活水平的增加，鑒定候選化合物為改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物。對(duì)于任何上述方面，妊娠相關(guān)的高血壓病癥可以是先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征，和具有SGA嬰兒的妊娠。在一個(gè)實(shí)施方案中，妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇或子癇。如下文所述，我們發(fā)現(xiàn)可溶內(nèi)皮糖蛋白/TGF-P和sFlt-1/VEGF/P1GF信號(hào)傳遞途徑這兩者的下調(diào)可以一起作用于妊娠相關(guān)的高血壓病癥的病理。因此，本發(fā)明也涉及本文描述的方法與美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20040126828,20050025762,20050170444，2006/0067937和20070104707以及PCT公開(kāi)號(hào)WO2004/008946，WO2005/077007和WO06/034507中描述的任何治療、診斷或監(jiān)測(cè)方法的組合。就本發(fā)明的目的而言，在下面定義了下列縮寫和術(shù)語(yǔ)。"改變"指一種變化(提高或降低)。改變可以包括通過(guò)諸如下文描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)已知方法檢測(cè)的基因或多肽的表達(dá)水平的改變。如本文所使用的，改變包括表達(dá)水平10%的改變、優(yōu)選表達(dá)水平25%的改變、更優(yōu)選表達(dá)水平40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大的改變。"改變"還指本發(fā)明任意多肽(例如，可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-l、VEGF、P1GF、eNOS或TGF(3家族成員)的生物活性的改變(提高或降^J。如本文所使用的，改變包括生物活性10%的改變、優(yōu)選生物活_性25%的改變、更優(yōu)選生物活性40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大的改變。可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物活性的實(shí)例是血管發(fā)生和與諸如激活蛋白-A、BMP2、BMP-7、TGF-卩1和TGF-(33的底物的結(jié)合。通過(guò)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的或本文所述的配體結(jié)合測(cè)定、免疫測(cè)定和血管發(fā)生測(cè)定，可以測(cè)量可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物活性。這樣的測(cè)定的一個(gè)實(shí)例是，體外matrigel內(nèi)皮管形成測(cè)定，其中內(nèi)皮糖蛋白信號(hào)傳遞的拮抗作用導(dǎo)致毛細(xì)管形成的大量喪失(Li等，F(xiàn)asebJournal14:55-64(2000))。eNOS的生物活性的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的，并且包括催化從氧和精氨酸形成一氧化氮或"NO"。TGF-P的生物活性的實(shí)例包括調(diào)節(jié)許多細(xì)胞類型的生長(zhǎng)、分化、運(yùn)動(dòng)性、組織重塑、神經(jīng)發(fā)生、創(chuàng)傷修復(fù)、凋亡和血管發(fā)生?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知或本文描述的測(cè)定方法測(cè)量所述活性。TGF-P也抑制很多細(xì)胞類型的細(xì)胞增殖并且可以刺激基質(zhì)蛋白的合成。P1GF或VEGF的生物活性的其它實(shí)例包括通過(guò)免疫測(cè)定、配體結(jié)合測(cè)定或Scatchard印跡分析測(cè)量的與受體的結(jié)合，和通過(guò)BrdU標(biāo)記法、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)或DNA合成的定量測(cè)定，如3^胸苷摻入而測(cè)量的細(xì)胞增殖或遷移的誘導(dǎo)。sFlt-1的生物活性的實(shí)例包括通過(guò)免疫測(cè)定、配體結(jié)合測(cè)定或Scatchard印跡分析測(cè)量的與P1GF和VEGF的結(jié)合。本文描述了每種多肽的生物活性測(cè)定的其它實(shí)例。"反義核堿基寡聚體"指核堿基寡聚體，不管多長(zhǎng)，其與內(nèi)皮糖蛋白基因的編碼鏈或mRNA互補(bǔ)。"核堿基寡聚體"指包括至少8個(gè)核堿基、優(yōu)選至少12個(gè)、且最優(yōu)選至少16個(gè)堿基的鏈的化合物，它們通過(guò)連接基團(tuán)連接在一起。在此定義中包括天然的和非天然的寡核苷酸，它們是修飾和未修飾的，以及寡核苷酸模擬物，如蛋白核酸、鎖定核酸和阿糖核酸。很多核堿基和連接基團(tuán)都可用于本發(fā)明的核堿基寡聚體中，包括在引入本文作為參考的美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)20030114412(見(jiàn)例如，公開(kāi)文本的27-45段)和20030114407(見(jiàn)例如，公開(kāi)文本的35-52段)中描述的那些。所述核堿基寡聚體還可把向翻譯起始和終止位點(diǎn)。優(yōu)選地，反義核堿基寡聚體包含約8-30個(gè)核普酸。反義核堿基寡聚體還可包含至少40、60、85、120或更多個(gè)連續(xù)的核苷酸，它們與內(nèi)皮糖蛋白mRNA或DNA互補(bǔ)，且可像全長(zhǎng)mRNA或基因一樣長(zhǎng)。"結(jié)合"表示將兩個(gè)分子保持在一起的非共價(jià)或共價(jià)相互作用，優(yōu)選非共價(jià)相互作用。例如，兩個(gè)這樣的分子可以是配體及其受體、酶和該酶的抑制劑、酶及其底物，或抗體和抗原。非共^f介相互作用包括但不限于氫鍵鍵合、帶電基團(tuán)之間的離子相互作用、范得華相互作用和非極性基團(tuán)之間的疏水相互作用。這些相互作用中的一種或多種可以介導(dǎo)兩個(gè)分子彼此結(jié)合。結(jié)合可以顯示區(qū)別特性，如特異性或選擇性。"體重指數(shù)"指使用身高和體重測(cè)量產(chǎn)生的數(shù)字，它會(huì)給出體重是否屬于健康范圍的一般信息。通常用于確定體重指數(shù)的公式是，以千克計(jì)的人體重除以以米計(jì)的人身高的平方，或體重(kg)/(身高(m))"化合物"指任意的小分子化合物(肽基或非肽基)、抗體、核酸分子、多肽，或其片段。特別用于本發(fā)明的治療方法的化合物可以使可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平或生物活性改變(優(yōu)選降^f氐)至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80°/。、90%或更多。"嵌合抗體"指一種多肽，其至少含有與另一種蛋白的至少部分(通常，免疫球蛋白的恒定區(qū))相連的抗體分子的抗原結(jié)合部分。"雙鏈RNA(dsRNA)"指包含有義和反義鏈這兩者的核糖核酸分子。dsRNA通常用于介導(dǎo)RNA干擾。"內(nèi)皮糖蛋白"或"Eng"也稱作CD105,指具有內(nèi)皮糖蛋白生物活性的哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)因子(見(jiàn)Fonsatti等，Oncogene22:6557-6563,2003;Fonsatti等，Curr.CancerDrugTargets3:427-432，2003;和Cheifetz等，丄S/o/.CTze肌267:19027-19030(1992)),且與下述GenBank編號(hào)中的任一個(gè)定義的蛋白同源AAH29080和NP—031958(小鼠)；AAS67893(大鼠);NP—000109,P17813,VSP—004233,CAA80673(豬)；以及CAA50891和AAC63386(人)，或記載在美國(guó)專利號(hào)6,562,957中。內(nèi)皮糖蛋白是同二聚體細(xì)胞膜糖蛋白，其在來(lái)自胎盤的增殖中的血管內(nèi)皮細(xì)胞和合胞滋養(yǎng)層中高水平地表達(dá)。內(nèi)皮糖蛋白存在兩種不同的同工型，即L和S,它們的不同之處是在胞質(zhì)尾的47個(gè)氨基酸。兩種同工型都包含在本文使用的術(shù)語(yǔ)內(nèi)皮糖蛋白中。內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合TGF-(3家族成員，且在有TGF-(3存在下，內(nèi)皮糖蛋白可以締合TGF-(3信號(hào)傳遞受體RI和RII,并加強(qiáng)對(duì)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)。內(nèi)皮糖蛋白生物活性包含結(jié)合底物，如TGF-(3家族成員，如激活蛋白-A、BMP2、BMP-7、TGF-pi和TGF-p3;誘導(dǎo)血管發(fā)生，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、附著、遷移、侵入；和激活內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮糖蛋白生物活性的測(cè)定是本領(lǐng)域已知的，且包括配體結(jié)合測(cè)定或斯卡查德圖分析；用于測(cè)量細(xì)胞增殖的BrdU標(biāo)記、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)或DNA合成的定量測(cè)定(如3H-胸苦摻入)；和血管發(fā)生測(cè)定，如在本文或在McCarty等，Intl.丄Oncol.21:5-10,2002;Akhtar等Clin.Chem.49:32-40，2003;和Yamashita等，J.Biol.Chem269:1995-2001，1994中所述的那些。"可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽"或"sEng"表示內(nèi)皮糖蛋白的任何循環(huán)的、非膜結(jié)合形式，其包括內(nèi)皮糖蛋白的胞外部分的至少一部分，并且與編碼內(nèi)皮糖蛋白的胞外部分的氨基酸序列基本相同(如60%，70%,80%,90%,995%,96%,97%,98%,99%或100%)(參見(jiàn)圖1和2B)。可溶內(nèi)皮糖蛋白可以通過(guò)蛋白水解酶切割內(nèi)皮糖蛋白的膜結(jié)合形式而得到。一個(gè)可能的切割位點(diǎn)是在人內(nèi)皮糖蛋白的氨基酸437,產(chǎn)生包括內(nèi)皮糖蛋白多肽的氨基酸1-437的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽，包括肽前導(dǎo)序列，其典型地在ER中切掉(參見(jiàn)圖3A和3B),或產(chǎn)生與內(nèi)皮糖蛋白多肽的氨基酸1-437基本相同的蛋白。本發(fā)明考慮的可溶內(nèi)皮糖蛋白的其它形式包括與圖30B所示的人內(nèi)皮糖蛋白的氨基酸40(甘氨酸)-406(精氨酸)基本相同的蛋白、與人內(nèi)皮糖蛋白的氨基酸1-587基本相同的蛋白(整個(gè)胞外域，包括肽前導(dǎo)序列，可從R&DSystems商購(gòu)，目錄號(hào)1097-EN)、與圖30B所示的人內(nèi)皮糖蛋白的氨基酸40-587基本相同的蛋白(這是排除了肽前導(dǎo)序列的整個(gè)胞外域)、任何包括在圖30B中以粗體和下劃線標(biāo)示的肽的多肽，和任何包括結(jié)合TGF-卩或TGF-P受體所需的可溶內(nèi)皮糖蛋白區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的多肽。應(yīng)該注意，內(nèi)皮糖蛋白和可溶內(nèi)皮糖蛋白的編號(hào)都依賴于是否包括前導(dǎo)肽序列。圖30B中所示內(nèi)皮糖蛋白的編號(hào)從氨基酸26開(kāi)始(其中缺失的前導(dǎo)肽序列應(yīng)該是氨基酸1-25)?？扇軆?nèi)皮糖蛋白也可以包括由內(nèi)皮糖蛋白的酶切得到，并且保持內(nèi)皮糖蛋白生物活性的循環(huán)降解產(chǎn)物或片段。優(yōu)選的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽具有可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物活性，如與諸如TGF-P家族成員或TGF-P受體的底物結(jié)合、抑制TGF-P家族成員的生物活性，或逆轉(zhuǎn)血管發(fā)生，或使血管發(fā)生抑制至少10%，20%,30%，40%,50%,60%，70%,80%,90%或更多。測(cè)量這些活性的測(cè)定的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的，并且描述于美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20060067937,20050267021和20070104707和PCT公開(kāi)號(hào)No.WO06/034507,在此引入作為參考。例如，可溶內(nèi)皮糖蛋白生物活性可以包括逆轉(zhuǎn)、減少或抑制TGF-p誘導(dǎo)的血管發(fā)生的能力，或逆轉(zhuǎn)Smad2/3的激活或Smad2/3依賴性轉(zhuǎn)錄激活的能力。也可以從多種來(lái)源分離可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽，例如哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞(如胎盤組織或細(xì)胞)，或通過(guò)重組或合成方法制備。術(shù)語(yǔ)可溶內(nèi)皮糖蛋白也包括對(duì)多肽的修飾、內(nèi)皮糖蛋白多肽的片段、衍生物、類似物和變體，其實(shí)例描述于下文。"內(nèi)皮糖蛋白核酸"指編碼任一種上述的內(nèi)皮糖蛋白的核酸。例如，人內(nèi)皮糖蛋白的基因由14個(gè)外顯子組成，其中外顯子l編碼信號(hào)肽序列，外顯子2-12編碼胞外域(包括外顯子9a和9b)，外顯子13編碼跨膜域，且外顯子14編碼C-末端胞質(zhì)域(見(jiàn)圖1、2A和2B)。理想地，內(nèi)皮糖蛋白核酸編碼上文描述的任何可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽或與圖2A所示核酸序列基本相同(60%，65%，70%,75%，80%,85%,90%，95%,96%,97%,98%，99%或100%)。應(yīng)該注意，預(yù)測(cè)循環(huán)蛋白缺乏肽前導(dǎo)序列(氨基酸1-25)。"表位，，表示一種氨基酸序列，由于線性結(jié)構(gòu)或三維構(gòu)象，形成抗體的結(jié)合位點(diǎn)。"表達(dá)"指通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)基因或多肽。例如，多肽表達(dá)常常通過(guò)蛋白印跡檢測(cè)，DNA表達(dá)常常通過(guò)DNA印跡或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)，而RNA表達(dá)常常通過(guò)RNA印跡、PCR、或RNA酶保護(hù)測(cè)定檢測(cè)。測(cè)量蛋白表達(dá)水平的方法通常包括但不限于蛋白印跡、免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、免疫沉淀、表面等離子共振、化學(xué)發(fā)光、熒光極化、磷光、免疫組化、基質(zhì)輔助的激光解吸/電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜、顯微細(xì)胞計(jì)數(shù)、微陣列、顯微術(shù)、熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)和流式細(xì)胞術(shù)，以及基于蛋白特性的測(cè)定，所迷特性包括但不限于酶活性或與其它蛋白配偶體的相互作用。示例性測(cè)定詳細(xì)描述于美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2006/0067937和PCT公開(kāi)號(hào)WO06/034507。任何使可溶內(nèi)皮糖蛋白水平降低至少10%,20%,優(yōu)選30%,更優(yōu)選至少40%或50%,最優(yōu)選至少60%，70%,80%,90%或更多的化合物都認(rèn)為是本發(fā)明的治療性化合物。"片段"指多肽或核酸分子的一部分。優(yōu)選地，該部分含有參照核酸分子或多肽的整個(gè)長(zhǎng)度的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。片段可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、1800或更多個(gè)核苷酸，或10、20、30、40、50、60、70、80、90、訓(xùn)、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、640或更多個(gè)氨基酸?？扇軆?nèi)皮糖蛋白的示例性片段包括1-437個(gè)氨基酸(包括肽前導(dǎo)序列)、26-437個(gè)氨基酸(排除前導(dǎo)序列)、40-406個(gè)氨基酸，或1-587個(gè)氨基酸，以及1-1311、10-1311、80-1030或1-1761個(gè)核苷酸。"胎齡"指胎兒年齡，其從母親的最后一次月經(jīng)期的第一天開(kāi)始計(jì)起，通常按周計(jì)。"妊娠高血壓，，指妊娠20周后沒(méi)有蛋白尿的高血壓的發(fā)展。"先兆子癇或子癇史"指以前在受試者自身或相關(guān)家族成員中診斷的先兆子癇或子癇或妊娠誘發(fā)的高血壓。"同源的"指在比較序列的長(zhǎng)度上，與已知基因或蛋白序列具有至少30%同源性、更優(yōu)選40%、50%、60%、70%、80%、且最優(yōu)選90%或更高同源性的任何基因或蛋白序列。"同源的"蛋白還可具有比較蛋白的至少一種生物活性。通常，就蛋白而言，比較序列的長(zhǎng)度為至少IO個(gè)氨基酸，優(yōu)選地20、30、40、50、60、70、80、90、100、UO、120、130、140、150、200、250、300、350、400、437或至少587個(gè)氨基酸或更多。就核酸而言，比較序列的長(zhǎng)度通常為至少25、50、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、1311或至少1761個(gè)核苷酸或更多。"同源性"還指用于產(chǎn)生抗體的表位與抗體針對(duì)的蛋白或其片段之間的相當(dāng)大相似性。在該情況下，同源性指足以引發(fā)可以特異性地識(shí)別討論中的蛋白的抗體產(chǎn)生的相似性。"人源化抗體"指能夠結(jié)合預(yù)定抗原的免疫球蛋白氨基酸序列變體或其片段。通常，抗體至少包含輕鏈和重鏈的可變區(qū)?？贵w還可以包含重鏈的CH1、鉸鏈、CH2、CH3或CH4區(qū)。人源化抗體包含主要具有人免疫球蛋白氨基酸序列的構(gòu)架區(qū)(FR)和主要具有非人免疫球蛋白氨基酸序列("輸入"序列)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。通常，人源化抗體具有從非人來(lái)源引入其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。通常，人源化抗體基本上包含至少一個(gè)、且通常兩個(gè)可變區(qū)(Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv)的全部，其中全部或基本上全部CDR區(qū)與非人免疫球蛋白的那些相對(duì)應(yīng)，且全部或基本上全部FR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體最優(yōu)地將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少部分，通常是人免疫球蛋白恒定區(qū)的部分。"互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)"指在每個(gè)免疫球蛋白輕鏈和重鏈中的可變區(qū)的3個(gè)高變序列。"構(gòu)架區(qū)(FR)"指位于免疫球蛋白輕鏈和重鏈的3個(gè)高變序列(CDR)的任一側(cè)的氨基酸序列。人源化抗體的FR和CDR區(qū)不需要與親代序列準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)，例如，輸入CDR或共有FR可以通過(guò)取代、插入或缺失至少一個(gè)殘基來(lái)誘變，從而使得在該位點(diǎn)的CDR或FR殘基不與共有或輸入抗體相對(duì)應(yīng)。然而，這種突變將不是廣泛的。通常，至少75%、優(yōu)選90%、且最優(yōu)選95%的人源化抗體殘基將與親本FR和CDR序列的殘基相對(duì)應(yīng)。"雜交，，指在各種嚴(yán)格性條件下，在互補(bǔ)多核苷酸序列或其部分之間配對(duì)以形成雙鏈分子(見(jiàn)，例如，Wahl和Berger，MeAoAE"2^ywo/.152:399,1987;Kimmel,MeAo^￡>z_ymo/.152:507,1987)。例如，嚴(yán)格的鹽濃度通常低于約750mMNaCl和75mM檸檬酸三鈉，優(yōu)選低于約500mMNaCl和50mM檸檬酸三鈉，且最優(yōu)選低于約250mMNaCl和25mM檸檬酸三鈉。低嚴(yán)格性雜交可在沒(méi)有有機(jī)溶劑(例如曱酰胺)存在的條件下獲得，而高嚴(yán)格性雜交可在有至少約35%甲酰胺、且最優(yōu)選至少約50。/。曱酰胺存在下獲得。嚴(yán)格的溫度條件通常包括至少約3(TC、更優(yōu)選至少約37。C、且最優(yōu)選至少約42'C的溫度。各種其它參數(shù)，如雜交時(shí)間，去污劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)的濃度，以及包含或排除載體DNA，都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通過(guò)根據(jù)需要組合這些不同條件，實(shí)現(xiàn)各種嚴(yán)格性水平。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交在3(TC,在750mMNaCl、75mM檸檬酸三鈉和1%SDS中進(jìn)行。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交在37。C，在500mMNaCl、50mM桿檬酸三鈉、1%SDS、35%甲酰胺和100pg/ml變性鮭精DNA(ssDNA)中進(jìn)行。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交在42。C,在250mMNaCl、25mM檸檬酸三鈉、1%SDS、50%甲酰胺和200(ag/mlssDNA中進(jìn)行。對(duì)這些條件的有用變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。對(duì)于絕大多數(shù)應(yīng)用而言，雜交之后的洗滌步驟還可在嚴(yán)格性方面有變化。洗滌嚴(yán)格性條件可由鹽濃度和溫度來(lái)限定。如上所述，洗滌嚴(yán)格性可通過(guò)降低鹽濃度或提高溫度來(lái)提高。例如，洗滌步驟的嚴(yán)格鹽濃度優(yōu)選^f氐于約30mMNaCl和3mM檸檬酸三鈉，且最優(yōu)選低于約15mMNaCl和1.5mM檸檬酸三鈉。洗滌步驟的嚴(yán)格溫度條件通常包含至少約25。C、更優(yōu)選至少約42'C、且最優(yōu)選至少約68。C的溫度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌步驟將在25。C，在30mMNaCl、3mM檸檬酸三鈉和0.1%SDS中進(jìn)行。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌步驟將在42"C,在15mMNaCl、1.5mM檸檬酸三鈉和0.1%SDS中進(jìn)行。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌步驟將在68°C,15mMNaCl、1.5mM檸檬酸三鈉和0.1。/。SDS中進(jìn)行。這些條件的其它變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。雜交技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，且在下面描述，侈'H口Benton和Davis(Sc/ewce196:180，1977);Grunstein和Hogness(尸roc.A^/.」cadSc/.,USA72:3961，1975);Ausubel等(Cwrre",尸ro〖o(jì)coAs1/力A/o/ecw/ar5z'o/ogy,WileyInterscience,NewYork,2001);Berger和Kimmel(Gw/t/eiV/o/ecw/"/"C7om力g7fec/zm々wes，1987,AcademicPress,NewYork);和Sambrook等,M/ecw/wC7oC"g.'」Z^orafoA"少M(fèi)mwa/,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork。"子宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)"指導(dǎo)致出生重量比胎兒胎齡的預(yù)測(cè)胎兒重量低10%的綜合征。目前世界衛(wèi)生組織有關(guān)低出生重量的標(biāo)準(zhǔn)是重量低于2，500gm(5lbs.8oz.),或根據(jù)美國(guó)通過(guò)種族、經(jīng)產(chǎn)數(shù)和嬰兒性別得出的胎齡出生重量表，低于胎齡的第10個(gè)百分位(Zhang和Bowes，(9""/.Qy"eco/86:200-208，1995)。這些低出生重量的嬰兒還被稱作"小于胎齡(SGA)"。已知先兆子癇是與IUGR或SGA有關(guān)的狀況。"度量標(biāo)準(zhǔn)"指一種測(cè)量。度量可用于，例如，比較目標(biāo)多肽或核酸分子的水平。示例性的度量標(biāo)準(zhǔn)包含但不限于，數(shù)學(xué)公式或算法，如比值。所用度量標(biāo)準(zhǔn)是這樣的，其可最好地區(qū)別患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的受試者與正常對(duì)照受試者之間的可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-l、VEGF、P1GF的水平，或其任意組合。根據(jù)所用度量標(biāo)準(zhǔn)，妊娠相關(guān)的高血壓病癥的診斷指標(biāo)可顯著高于或低于參照值(例如，來(lái)自未患妊娠相關(guān)的高血壓病癥的對(duì)照受試者)。通過(guò)測(cè)量游離的、結(jié)合的(即，結(jié)合于生長(zhǎng)因子)或總的(即，游離的+結(jié)合的)可溶內(nèi)皮糖蛋白的量，可以確定可溶內(nèi)皮糖蛋白水平。通過(guò)測(cè)量游離的、結(jié)合的(即，結(jié)合于生長(zhǎng)因子)或總的sFlt-l(游離的+結(jié)合的)的量，可以測(cè)量sFlt-l水平。通過(guò)測(cè)量游離P1GF或游離VEGF(即，未結(jié)合于sFlt-l)的量，可以確定VEGF或P1GF水平。一個(gè)示例性的度量是[sFlt-l/(VEGF+P1GF)]，也稱作先兆子癇抗血管發(fā)生指數(shù)(PAAI)。另一個(gè)實(shí)例是下面的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)(sFlt-l+0.25(可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽))/P1GF。另一個(gè)示例性的度量如下(可溶內(nèi)皮糖蛋白+sFlt-l)/P1GF。與正常參照相比，這兩個(gè)示例性度量標(biāo)準(zhǔn)的任意一個(gè)的值的增加，是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。另一個(gè)實(shí)例包括測(cè)量受試者中妊娠的前三個(gè)月和妊娠的次三個(gè)月中的sFlt-l和可溶內(nèi)皮糖蛋白水平，并且用以下公式計(jì)算每個(gè)三月期中sFltlx可溶內(nèi)皮糖蛋白(sEng)的5乘積[d乘積=妊娠的次三個(gè)月中的(sFltlxsEng)-妊娠的前三個(gè)月中的(sFltlxsEng)],其中大于0、1、2或更高的值(例如正值)，是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。另一度量標(biāo)準(zhǔn)包括妊娠的前三個(gè)月和妊娠的次三個(gè)月之間sFlt-l水平(dsFlt-l)和sEng水平(dsEng)的d乘積，其中對(duì)于(dsFlt-l)或(dsEng),大于0、1、2或更高的值(例如正值)，是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。本發(fā)明的任何度量標(biāo)準(zhǔn)可以進(jìn)一步包括母親的BMI或嬰兒的胎齡，或經(jīng)產(chǎn)數(shù)。任何度量標(biāo)準(zhǔn)也可以包括eNOS、TGF-pi或P3或PGI2水平。"一氧化氮合酶"或"NOS，，表示催化從氧和精氨酸形成一氧化氮(NO)的酶。NOS是一種復(fù)合酶，其包含一些輔因子、作為催化位點(diǎn)的一部分的血紅素基團(tuán)、N末端加氧酶結(jié)構(gòu)域(其屬于血紅素-硫醇鹽蛋白類)和與NADPH:P450還原酶同源的C末端還原酶結(jié)構(gòu)域。NOS通過(guò)催化L-精氨酸(L-Arg)的胍基氮的5-電子氧化而產(chǎn)生NO。通過(guò)兩個(gè)連續(xù)單加氧反應(yīng)發(fā)生L-Arg向L-瓜氨酸的氧化，產(chǎn)生N-羥基-L-精氨酸作為中間體。加氧酶和還原酶結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)構(gòu)域間接頭含有CaM結(jié)合序列。NO在低濃度作為很多不同的生理過(guò)程中的信號(hào)而起作用，所述過(guò)程例如血壓控制、神經(jīng)傳遞、學(xué)習(xí)和記憶，并且在高濃度下作為防御性細(xì)胞毒素。在哺乳動(dòng)物中，三種獨(dú)特的基因編碼NOS同工酶神經(jīng)元型(nNOS或NOS-l)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)型(iNOS或NOS-2)和內(nèi)皮型(eNOS或NOS-3)。eNOS是膜結(jié)合的，并且eNOS向內(nèi)皮膜的定位是通過(guò)共翻譯N末端豆蔻?；头?if后棕櫚酰化介導(dǎo)的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，NOS是eNOS。"先兆子癇抗血管發(fā)生指數(shù)(PAAI)"是指用作抗血管發(fā)生活性指標(biāo)的sFlt-l/VEGF+P1GF的比值。大于10,更優(yōu)選大于20的PAAI,指示妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇或先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)。"可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)"指(sFlt-l+0.25可溶內(nèi)皮糖蛋白)/PlGF比值。例如，75或更高、優(yōu)選地100或更高、或更優(yōu)選地200或更高的值，是與高血壓相關(guān)的妊娠并發(fā)癥(如先兆子癇或子癇)的指示。"可操作地連接的"指在適宜的分子(例如，轉(zhuǎn)錄激活蛋白)與調(diào)節(jié)序列結(jié)合時(shí)，基因和調(diào)節(jié)序列以允許基因表達(dá)的方式連接。"藥學(xué)可接受的載體，，指對(duì)于所治療的哺乳動(dòng)物而言生理學(xué)上可接受的且仍然保留與其一起施用的化合物的治療性質(zhì)的栽體。一種示例性的藥學(xué)可接受的載體物質(zhì)是生理鹽水。其它生理學(xué)上可接受的載體和它們的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且在下列文獻(xiàn)中描述，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,(第20版)，ed.A.Germaro,2000,Lippincott，Williams&Wilkins,Philadelphia,PA。"胎盤生長(zhǎng)因子(P1GF)"指哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)因子，它與GenBank編號(hào)P49763限定的蛋白同源，且具有P1GF生物活性。P1GF是屬于VEGF家族的糖基化同二聚體，且可通過(guò)可變剪接才幾理以兩個(gè)不同的同工型發(fā)現(xiàn)。P1GF由胎盤中的細(xì)胞滋養(yǎng)層及合胞滋養(yǎng)層表達(dá)，且P1GF生物活性包含誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞(特別是滋養(yǎng)層細(xì)胞)的增殖、遷移及活化。"多態(tài)性"指可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-l、P1GF或VEGF核酸分子中的基因變異、突變、缺失或添加，它是發(fā)展先兆子癇或子癇的素因的指示。這樣的多態(tài)性是熟練的技術(shù)人員已知的，且記栽在，例如，Raab等(Biochem.J.339:579-588，1999)和Parry等(Eur.JImmunogenet.26:321-323，1999)。多態(tài)性可以存在于基因的啟動(dòng)子序列、可讀框、內(nèi)含子序列或非翻譯3'區(qū)中。內(nèi)皮糖蛋白基因的這樣的多態(tài)性的已知實(shí)例包括內(nèi)含子7中的6堿基GGGGGA插入，該插入在超過(guò)外顯子7的3'末端26個(gè)堿基處(Ann.Neurol.41:683-6，1997)。"妊娠相關(guān)的高血壓病癥"指與血壓提高有關(guān)或特征在于血壓提高的任何狀況或疾病或妊娠。這些狀況中包括先兆子癇(包括過(guò)早先兆子癇、重度先兆子癇)、子癇、妊娠高血壓、HELLP綜合征(溶血、提高的肝酶、低血小板)、胎盤早剝、慢性高血壓、具有子宮內(nèi)發(fā)育限制的妊娠和具有小于胎齡(SGA)嬰兒的妊娠。應(yīng)當(dāng)指出，盡管具有SGA嬰兒的妊娠并非經(jīng)常與高血壓有關(guān)，但它也包含在該定義中。"先兆子癇"指多系統(tǒng)病癥，其特征在于具有蛋白尿或水肺或兩者的高血壓、腎小球功能障礙、腦水腫、肝水腫或凝血異常，這是由于妊娠或新近妊娠的影響。所有形式的先兆子癇，如過(guò)早的、輕度的、中度的和重度先兆子癇，都包含在該定義中。先兆子癇通常發(fā)生在妊娠第20周后。先兆子癇通常被定義為下列癥狀的一些組合(l)妊娠20周后，收縮壓(BP)>140mmHg且舒張壓〉90mmHg(通常測(cè)量2次，間隔4-168小時(shí))，(2)新發(fā)作的蛋白尿(利用浸漬片進(jìn)行尿分析為l+,24小時(shí)尿收集中的蛋白^OOmg，或單次隨機(jī)的尿樣的蛋白/肌酸酐比〉0.3),和(3)到產(chǎn)后12周，高血壓及蛋白尿消除。重度先兆子癇通常被定義為U)舒張壓〉110mmHg(通常測(cè)量2次，間隔4-168小時(shí))或(2)蛋白尿，其特征在于24小時(shí)尿收集中的蛋白測(cè)量值為3.5克或更高，或利用浸漬片測(cè)量，2份隨機(jī)的尿樣具有至少3+蛋白。在先兆子癇中，高血壓和蛋白尿通常彼此在7天內(nèi)發(fā)生。在重度先兆子癇中，可同時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重高血壓、嚴(yán)重蛋白尿和HELLP綜合征(溶血、提高的肝酶、低血小板)或子癇，或每次僅出現(xiàn)一個(gè)癥狀。HELLP綜合征的特征在于血小板減少癥(<100000細(xì)胞/pl)、提高的LDH(〉600IU/L)和提高的AST(〉70IU/L)的跡象》有時(shí)候，重度先兆子癇可導(dǎo)致癲癇發(fā)作的發(fā)展。這種嚴(yán)重的綜合征形式被稱作"子癇"。子癇還可包含幾種器官或組織的功能障礙或損害，如肝臟(例如，肝細(xì)胞損害、門靜脈周壞死)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(例如，腦水腫和腦出血)。認(rèn)為癲癇發(fā)作的病因是由腦水腫和腎臟小血管局灶痙攣的發(fā)展繼發(fā)的。"早發(fā)先兆子癇"指在<37周或<34周發(fā)作癥狀的先兆子癇。"前列環(huán)素，，或"PGI2"是指已知為類二十烷酸的脂質(zhì)分子家族成員。其在內(nèi)皮細(xì)胞中通過(guò)酶-前列環(huán)素合酶的作用從前列腺素H2(PGH2)產(chǎn)生，并且主要由血管內(nèi)皮和平滑肌合成。PGL生物活性包括血小板聚集的抑制、平滑肌的松弛、通過(guò)直接血管舒張導(dǎo)致的全身和肺血管阻力減少，以及腎臟中的尿鈉排泄。"蛋白，，或"多肽"或"多肽片段"指任何多于兩個(gè)氨基酸的鏈，不管翻譯后的修飾如何(例如，糖基化或磷酸化)，其構(gòu)成天然存在的多肽或肽的全部或部分，或構(gòu)成非天然存在的多肽或肽。"參照樣品"指用于比較目的的任何樣品、標(biāo)準(zhǔn)或水平。"正常的參照樣品"可以是從相同受試者采取的在先樣品、來(lái)自不患有任何妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的妊娠受試者的樣品、來(lái)自妊娠且在妊娠早期(例如，在妊娠的前三個(gè)月或妊娠的次三個(gè)月，或在檢測(cè)到妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)之前)采取樣品的受試者、妊娠且不具有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)史的受試者、未妊娠的受試者、在已知正常濃度(即，不指示妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇)的純化參照多肽的樣品。"參照標(biāo)準(zhǔn)或水平"指源自參照樣品的值或數(shù)字。正常的參照標(biāo)準(zhǔn)或水平可以是源自正常受試者的值或數(shù)字，所述正常受試者與樣品受試者在至少一項(xiàng)下面的標(biāo)準(zhǔn)方面匹配胎兒的胎齡、母親年齡、妊娠之前的母親血壓、妊娠過(guò)程中的母親血壓、母親的BMI、胎兒體重、先兆子癇或子癇的以前診斷，和先兆子癇或子癇的家族史。"陽(yáng)性參照"樣品、標(biāo)準(zhǔn)或值是源自已知患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的受試者的樣品或值或數(shù)字，所述受試者與樣品受試者在至少一項(xiàng)下面的標(biāo)準(zhǔn)方面匹配胎兒的胎齡、母親年齡、妊娠之前的母親血壓、妊娠過(guò)程中的母親血壓、母親的BMI、胎兒體重、妊娠相關(guān)的高血壓病癥的以前i貪斷，和妊娠相關(guān)的高血壓病癥的家》矣史。"降低或抑制"指通過(guò)前述測(cè)定(見(jiàn)"表達(dá)")檢測(cè)的，與未處理的樣品相比，引起蛋白或核酸水平總體降低優(yōu)選20%或更多、更優(yōu)選40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的變4匕的能力。"樣品，，指組織活檢物、細(xì)胞、體液(例如，血液、血清、血漿、尿、唾液、羊水或腦脊液)或從受試者得到的其它樣品。合意地，生物樣品包括可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸分子或多肽或二者。"小干擾RNA(siRNA)"指分離的dsRNA分子，優(yōu)選長(zhǎng)度超過(guò)10個(gè)核苷酸(nt),更優(yōu)選長(zhǎng)度超過(guò)15個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選長(zhǎng)度超過(guò)19個(gè)核苷酸，其用于鑒別將要降解的靶基因或mRNA。19-25個(gè)核苷酸是siRNA的最優(yōu)選大小。siRNA還可包含短發(fā)夾RNA,其中siRNA雙鏈體的兩個(gè)鏈都包含在單一RNA分子中。siRNA包含任何形式的dsRNA(更大dsRNA的蛋白酶剪切產(chǎn)物、部分純化的RNA、基本純的RNA、合成的RNA、重組產(chǎn)生的RNA)，以及與天然存在的RNA不同之處在于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失、取代和/或變化的改變的RNA。這種改變可包含非-核苷酸物質(zhì)的添加，例如向19、20、21、22、23、24或25ntRNA的末端添加或內(nèi)部添加(在RNA的一個(gè)或多個(gè)核苷酸上)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA分子包含3'羥基。本發(fā)明RNA分子中的核苷酸還可包含非鏈的核苷酸，包括非天然存在的核苷酸或脫氧核糖核苷酸。共同地，將所有這種改變的RNA稱作RNA的類似物。本發(fā)明的siRNA只需與具有介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的能力的天然RNA充分相似。如本文所使用的，RNAi指通過(guò)向細(xì)胞或生物中引入小干擾RNA或dsRNA所致的特定mRNA分子的ATP-依賴性的粑向切割和降解。如本文所使用的，"介導(dǎo)RNAi"指區(qū)別或鑒別要降解哪個(gè)RNA的能力。"可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合分子"指結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的蛋白或小分子化合物?？扇軆?nèi)皮糖蛋白結(jié)合分子可以是，例如，抗體、抗體相關(guān)肽、可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)或可溶內(nèi)皮糖蛋白相互作用蛋白。"可溶Flt-](sFlt-l)"(也稱作sVEGF-Rl)指可溶形式的Flt-l受體，其與GenBank編號(hào)U01134定義的蛋白同源，且具有sFlt-l生物活性。sFlt-1多肽的生物活性可使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，例如，通過(guò)測(cè)定與VEGF結(jié)合的sFlt-l。sFlt-l缺少Flt-l受體的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。sFlt-l可以以高親和力結(jié)合VEGF和P1GF，但不能誘導(dǎo)增殖或血管發(fā)生，并因此與Flt-l和KDR受體在功能上有所不同。sFlt-l最初從人臍內(nèi)皮細(xì)胞純化，且隨后表明在體內(nèi)由滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生。如本文所使用的，sFlt-l包含任何sFlt-l家族成員或同工型。sFlt-l也可以指源自Flt-l受體的酶切割且保留sFlt-l生物活性的降解產(chǎn)物或片段。在一個(gè)實(shí)例中，從胎盤釋放出的特定金屬蛋白酶可以切割Flt-l受體的胞外域，以將Flt-lN-末端部分釋放到循環(huán)中。"特異性結(jié)合"指識(shí)別并結(jié)合本發(fā)明的多肽、但基本上不識(shí)別并結(jié)合樣品(例如生物學(xué)樣品)中的其它分子的化合物或抗體，其自然包含本發(fā)明的多肽。在一個(gè)實(shí)例中，特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體不結(jié)合膜結(jié)合的內(nèi)皮糖蛋白。在另一個(gè)實(shí)例中，特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體結(jié)合內(nèi)皮糖蛋白的胞外域內(nèi)的表位，特別是氨基酸26-437(排除肽前導(dǎo)序列)、人內(nèi)皮糖蛋白的氨基酸40-406(參見(jiàn)圖30B)，或氨基酸26-587(排除肽前導(dǎo)序列)內(nèi)的表位，所述表位可能是或不是可溶內(nèi)皮糖蛋白獨(dú)特的(例如在可溶內(nèi)皮糖蛋白的三維結(jié)構(gòu)中)。在另一實(shí)例中，特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體識(shí)別圖30B中以粗體和下劃線顯示的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列。"受試者"指哺乳動(dòng)物，包括但不限于，人或非人哺乳動(dòng)物，如牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗或貓。在該定義中包含妊娠的、產(chǎn)后的和未妊娠的哺乳動(dòng)物。"基本相同的"指，當(dāng)最佳地比對(duì)時(shí)，例如，使用下述的方法，與第二個(gè)核酸或氨基酸序列(例如，內(nèi)皮糖蛋白或可溶內(nèi)皮糖蛋白序列)共有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核酸或氨基酸序列。"顯著同一性，，可以用于指各種類型和長(zhǎng)度的序列，如全長(zhǎng)序列、表位或免疫原性肽、功能結(jié)構(gòu)域、編碼和/或調(diào)節(jié)序列、外顯子、內(nèi)含子、啟動(dòng)子和基因組序列。通過(guò)屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的各種方式，可以確定兩個(gè)多肽或核酸序列之間的百分比同一性，例如，使用可公開(kāi)得到的計(jì)算機(jī)軟件，如SmithWatermanAlignment(Smith,T.F.和M.S.Waterman(1981)JMolBiol147:195-7);包含在GeneMatcherPlus頂中的"BestFit"(Smith和Waterman,AdvancesinAppliedMathematics,482-489(1981)),Schwarz和Dayhof(1979)AtlasofProteinS叫uenceandStructure,Dayhof,M.O.，Edpp353-358;BLAST程序(BasicLocalAlignmentSearchTool;(Altschul，S.F.,W.Gish,等(1990)JMolBiol215:403-10),BLAST-2，BLAST-P，BLAST-N,BLAST-X,WU-BLAST-2，ALIGN,ALIGN-2，CLUSTAL，或Megalign(DNASTAR)軟件。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測(cè)量比對(duì)的適當(dāng)參數(shù)，包括在對(duì)比的序列長(zhǎng)度上達(dá)到最大比對(duì)所需的任何算法。通常，就蛋白而言，對(duì)比序列的長(zhǎng)度是至少10個(gè)氨基酸，優(yōu)選地20、30、40、50、60、70、80、90、100、10、120、130、140、150、200、250、300、350、400、437或至少587個(gè)氨基酸或更多。就核酸而言，對(duì)比序列的長(zhǎng)度通常是至少25、50、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、1311或至少1761個(gè)核苷酸或更多。應(yīng)當(dāng)理解，為了確定序列同一性的目的，當(dāng)對(duì)比DNA序列和RNA序列時(shí)，胸腺嘧啶核普酸相當(dāng)于尿嘧啶核苷酸。保守取代通常包含下列組內(nèi)的取代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。"先兆子癇的癥狀"指下列任何一個(gè)(1)妊娠20周后，收縮壓(BP)>140mmHg且舒張壓〉90mmHg,(2)新發(fā)作的蛋白尿(利用浸漬片進(jìn)行尿分析為l+,24小時(shí)尿收集中的蛋白〉300mg,或隨機(jī)尿蛋白/肌酸酐比>0.3)，和(3)到產(chǎn)后12周，高血壓及蛋白尿消除。先兆子癇的癥狀還可包含腎功能障礙和腎小球內(nèi)皮增生或肥大。"子癇的癥狀"指由于妊娠或新近妊娠的影響所致的下列癥狀中任何一個(gè)的發(fā)展癲癇發(fā)作、昏迷、血小板減少癥、肝水腫、肺水腫和腦水腫。"轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(3(TGF-P)"指哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)因子，其具有TGF-P生物活性，且是在脊推動(dòng)物中普遍存在的結(jié)構(gòu)上有關(guān)的旁分泌多肽家族的成員，且是后生動(dòng)物生長(zhǎng)、分化和形態(tài)發(fā)生因子大家族的原型(綜述見(jiàn)，Massaque等AnnRevCellBiol6:597-641(1990);Massaque等TrendsCellBiol4:172-178(1994);KingsleyGeneDev.8:133-146(1994);和Sporn等JCellBiol119:1017-1021(1992)。如上面的Kingsley所述，TGF-P超家族具有至少25個(gè)成員，且可以分成具有高度相關(guān)序列的不同亞家族。最明顯的亞家族包含下面的這些TGF-(3亞家族，其包含至少4個(gè)與TGF-(M的相似性比與TGF-(3超家族的其它成員更高的基因；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；激活蛋白亞家族，其包含同或異二聚體或兩個(gè)亞基抑制素P-A和抑制素(3-B。包括哺乳動(dòng)物因子BMP2和BMP4的decapentaplegic亞家族，當(dāng)植入皮下或肌肉中時(shí)，可以誘導(dǎo)異位骨和軟骨的形成。包括許多哺乳動(dòng)物同源物成員的60A亞家族具有骨誘導(dǎo)活性，包括BMP5-8。TGF-P超家族的其它成員包括總分化因子1(GDF-1)、GDF-3/VGR-2、背蛋白、結(jié)節(jié)的(nodal)、苗勒氏(mullerian)抑制物質(zhì)(MIS)和神經(jīng)膠質(zhì)衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子(GDNF)。應(yīng)當(dāng)指出，DPP和60A亞家族的彼此相關(guān)性比與TGF-P超家族的其它成員的相關(guān)性更緊密，且經(jīng)常一起歸入稱作DVR(dpp和vgl相關(guān)的)的更大分子集合的部分。除非在它使用的上下文中可以看出，在貫穿本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)TGF-P應(yīng)當(dāng)理解為，通常指適合的TGF-(3超家族的成員(Massague等，Annu.Rev.Biochem.67:753-91,1998;Josso等，Curr.Op.Gen.Dev.,7:371-377,1997)。TGF-(3起調(diào)節(jié)許多細(xì)胞類型的生長(zhǎng)、分化、運(yùn)動(dòng)性、組織重建、神經(jīng)發(fā)生、創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡和血管發(fā)生的功能。TGF-(3也抑制許多細(xì)胞類型的細(xì)胞增殖，并可以刺激基質(zhì)蛋白的合成。"治療量"指通過(guò)直接施用于患者或通過(guò)離體方法給患有先兆子癇或子癇的患者施用時(shí)，足以引起本文所述先兆子癇或子癇癥狀的定性或定量減輕的量。"治療量"還指當(dāng)通過(guò)直接施用于患者或通過(guò)離體方法給患有先兆子癇或子癇的患者施用時(shí)，如通過(guò)本文所述的測(cè)定測(cè)得的，足以引起可溶內(nèi)皮糖蛋白或sFlt-I表達(dá)水平降低、或VEGF或P1GF表達(dá)水平提高的量。"治療"指為了治療目的，施用化合物或藥物組合物。"治療疾病"或用于"治療性處理，，指給已經(jīng)患病的受試者施用治療，以改善受試者狀況。優(yōu)選地，基于下迷任何一個(gè)特征癥狀的鑒別，或使用本文所述的診斷方法，診斷受試者患有與高血壓有關(guān)的妊娠并發(fā)癥，如先兆子癇或子癇。"預(yù)防疾病"指預(yù)防性地處理還沒(méi)有發(fā)病，但易感或另外有發(fā)展特定疾病風(fēng)險(xiǎn)的受試者。優(yōu)選地，使用本文所述的診斷方法，確定受試者有發(fā)展先兆子癇或子癇的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在權(quán)利要求和實(shí)施方案中，治療是為了治療或預(yù)防目的而施用于哺乳動(dòng)物的。"滋養(yǎng)層"指覆蓋胚泡的中外胚層細(xì)胞層，其侵蝕子宮粘膜，且胚胎通過(guò)它從母體接受營(yíng)養(yǎng)；該細(xì)胞有助于胎盤的形成。"血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)"指哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)因子，其與美國(guó)專利號(hào)5，332，671;5,240,848;5,194,596;和Charnock-Jones等(5/。/./^;ro^/w"/o",48:1120-1128，1993)中定義的生長(zhǎng)因子同源，且具有VEGF生物活性。VEGF以糖基化同二聚體的形式存在，且包含至少4種不同的可變剪接的同工型。天然VEGF的生物活性包括，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞或臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的選擇性生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)血管發(fā)生。如本文所使用的，VEGF包含任何VEGF家族成員或同工型(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF189、VEGF165或VEGF121)。優(yōu)選地，VEGF是VEGF121或VEGF165同工型(Tischer等，J.腸/.C7z緩266，11947-11954,1991;Neufed等，C騰w她/"血,;y15:153-158，1996)，其在引入本文作為參考的美國(guó)專利號(hào)6,447,768;5,219,739;和5,194,596中描述。還包含VEGF的突變體形式，如在Gille等(J.Biol.Chem.276:3222-3230，2001)中描述的KDR-選擇性VEGF和Flt-選擇性VEGF。如本文所使用的，VEGF也包括任何修飾形式的VEGF,如LeCouter等(Science299:890-893,2003)所述的那些。雖然優(yōu)選人VEGF，但本發(fā)明不限于人形式，且包含VEGF的其它動(dòng)物形式(例如，小鼠、大鼠、狗或雞)。"載體"指DNA分子，其通常來(lái)源于質(zhì)?；蚴删w，向其中可插入或克隆DNA片段。重組載體將包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的限制位點(diǎn)，且能夠在規(guī)定的宿主或載體生物中自主復(fù)制，從而使得克隆的序列可復(fù)制。載體包含與基因或編碼區(qū)可操作地連接的啟動(dòng)子，這樣，轉(zhuǎn)染進(jìn)受體細(xì)胞后，可表達(dá)RNA。從其優(yōu)選實(shí)施方案的下列描述以及權(quán)利要求中，可以明白本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。附圖簡(jiǎn)迷圖1是顯示內(nèi)皮糖蛋白蛋白的示意圖。SP:信號(hào)肽(也稱作肽前導(dǎo)序列)，ZP:透明帶結(jié)構(gòu)域，CL:潛在切割位點(diǎn)(氨基酸437),以釋放可溶內(nèi)皮糖蛋白，TM:跨膜結(jié)構(gòu)域，Cyto:胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。一旦信號(hào)肽被切除，剩余的成熟蛋白在氨基酸26的谷氨酸殘基開(kāi)始。圖2A顯示了可溶內(nèi)皮糖蛋白的預(yù)測(cè)的cDNA序列(SEQIDNO:1)。圖2B顯示了可溶內(nèi)皮糖蛋白的預(yù)測(cè)的氨基酸序列(SEQIDNO:2),其包括信號(hào)肽(氨基酸1-25)。應(yīng)該注意，該序列包括正常情況下將在ER中被切除的前導(dǎo)肽序列。圖3是顯示來(lái)自正常妊娠的胎盤(N)、來(lái)自早產(chǎn)先兆子癇妊娠的胎盤(p)和來(lái)自足月先兆子癇妊娠的胎盤(P)的內(nèi)皮糖蛋白mRNA水平的RNA印跡。圖4是顯示胎盤中的內(nèi)皮糖蛋白蛋白水平的蛋白印跡。樣品來(lái)自兩個(gè)先兆子癇患者p32和p36，其在2003提供給BethIsraelDeaconess醫(yī)學(xué)中心，且產(chǎn)婦血清來(lái)自妊娠婦女。使用從SantaCruzBiotechnology,Inc.,(SantaCruz，CA)得到的N-末端抗體，探測(cè)蛋白印跡，其顯示了胎盤中的HOkD帶和存在于胎盤和血清樣品中的更小的63kD帶。圖5中的圖顯示了可溶內(nèi)皮糖蛋白在具有正常妊娠、輕度先兆子癇、重度先兆子癇和并發(fā)早產(chǎn)的無(wú)先兆子癇妊娠的婦女中的循環(huán)濃度。在分娩前24小時(shí)內(nèi)，得到所有血液樣品。使用購(gòu)自R&DSystems,MN(目錄號(hào)DNDG00)的ELISA試劑盒，測(cè)量可溶內(nèi)皮糖蛋白。這些數(shù)據(jù)表明，在臨床疾病時(shí)，先兆子癇患者中的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平顯著提高。圖6中的圖顯示了在各個(gè)胎齡組窗口期間，5個(gè)不同研究組的妊娠婦女在整個(gè)妊娠中的平均可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度。圖7中的圖顯示了在各個(gè)胎齡組窗口期間，5個(gè)不同研究組的妊娠婦女在整個(gè)妊娠中的平均sFltl濃度。圖8中的圖顯示了在各個(gè)胎齡組窗口期間，5個(gè)不同研究組的妊娠婦女在整個(gè)妊娠中的平均P1GF濃度。圖9中的圖顯示了在臨床癥狀之前采取的樣品的先兆子癇抗血管發(fā)生的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)值。圖10中的圖顯示了根據(jù)臨床過(guò)早的先兆子癇(PE<37周)之前的周數(shù)的可溶內(nèi)皮糖蛋白的平均濃度。圖11中的圖顯示了根據(jù)臨床過(guò)早的先兆子癇(PE〈37周)之前的周數(shù)的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)值。圖12中的圖顯示了對(duì)于在癥狀之前和之后的足月先兆子癇(PE^7周)，整個(gè)妊娠過(guò)程中的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的變化。圖13中的圖顯示了對(duì)于在癥狀之前和之后的足月先兆子癇(PE>37周)，整個(gè)妊娠過(guò)程中的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)水平的變化。圖14中的圖顯示了在妊娠高血壓期間和在妊娠高血壓之前(妊娠高血壓前l(fā)-5周(在妊娠的33-36周))的婦女和血壓正常對(duì)照中測(cè)得的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平。圖15中的圖顯示了在妊娠高血壓期間和在妊娠高血壓之前(妊娠高血壓前l(fā)-5周(在妊娠的33-36周))的婦女和血壓正常對(duì)照中測(cè)得的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)水平。圖16中的圖顯示了在33-36周妊娠窗口期間，在患有重度SGA、輕度SGA的婦女和血壓正常對(duì)照中測(cè)得的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平。圖17中的圖顯示了在33-36周妊娠窗口期間，在患有重度SGA、輕度SGA的婦女和血壓正常對(duì)照中測(cè)得的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)水平。圖18中的圖顯示了相同妊娠患者中的sFltl和可溶內(nèi)皮糖蛋白的濃度的彼此關(guān)系圖。圖19顯示了在25.2周采取的先兆子癇胎盤的內(nèi)皮糖蛋白(紅色)和平滑肌肌動(dòng)蛋白(綠色)的雙免疫焚光染色的顯微照片。用于檢測(cè)內(nèi)皮糖蛋白的抗體將全長(zhǎng)內(nèi)皮糖蛋白和可溶內(nèi)皮糖蛋白都染色。適當(dāng)?shù)娜焉锎翱诘膶?duì)照胎盤源自早產(chǎn)患者。圖20顯示了在41.3周采取的先兆子癇胎盤的內(nèi)皮糖蛋白(紅色)和平滑肌肌動(dòng)蛋白(綠色)的雙免疫焚光染色的顯微照片。用于檢測(cè)內(nèi)皮糖蛋白的抗體將全長(zhǎng)內(nèi)皮糖蛋白和可溶內(nèi)皮糖蛋白都染色。適當(dāng)?shù)娜焉锎翱诘膶?duì)照胎盤源自早產(chǎn)患者。圖21A顯示使用先兆子癇胎盤和血清兩者進(jìn)行內(nèi)皮糖蛋白的免疫沉淀法和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)得到的放射自顯影圖。圖21B顯示使用先兆子癇胎盤進(jìn)行內(nèi)皮糖蛋白的免疫沉淀法和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)得到的放射自顯影圖。3種不同的N和P樣品代表著單個(gè)的患者。就兩幅圖而言，使用商業(yè)上可得到的單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀法，并使用多克隆抗體進(jìn)行蛋白印跡。產(chǎn)生的這兩種抗體都針對(duì)內(nèi)皮糖蛋白蛋白的N-末端區(qū)，并檢測(cè)全長(zhǎng)和截短的可溶內(nèi)皮糖蛋白蛋白兩者。圖22中的圖顯示了使用在生長(zhǎng)因子減少的matrigel中的HUVEC進(jìn)行血管發(fā)生測(cè)定的結(jié)果。在有可溶內(nèi)皮糖蛋白或sFltl或二者存在下，進(jìn)行血管發(fā)生測(cè)定，并定量?jī)?nèi)皮管長(zhǎng)度。C-代表對(duì)照，E-代表1pg/ml的可溶內(nèi)皮糖蛋白，且S代表1|ig/ml的sFltl。E+S代表1|ag/mlE+lpg/mlsFltl的組合。數(shù)據(jù)代表著3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖23中的圖顯示了如材料和方法中所述，使用伊文思藍(lán)(Evansblue)滲漏，在小鼠中評(píng)估的幾種器官床中的微血管通透性。C-對(duì)照(GFP),E-可溶內(nèi)皮糖蛋白，S-sFltl，且S+E-sFltl+可溶內(nèi)皮糖蛋白。數(shù)據(jù)代表著4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖24中的圖顯示了在有劑量范圍為200pg/ml-200ng/ml的TGF-(31(Bl)和TGF-P3(B3)存在下，進(jìn)行微血管反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)的大鼠腎微血管直徑的百分比變化。在有1ng/ml可溶內(nèi)皮糖蛋白(E)存在下，重復(fù)這些相同的實(shí)驗(yàn)。顯示的這些數(shù)據(jù)代表著4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖25中的圖顯示了在有1ng/mlVEGF(V)、TGF-(M(Bl)和組合(V+B1)存在下，腎微血管的血管直徑的百分比變化。還顯示了在有各1|ag/ml的sFltl(S)和可溶內(nèi)皮糖蛋白(E)(V+B1+S+E)存在下，該組合的作用。數(shù)據(jù)代表著4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖26A是在處死時(shí)從注射了sFltl和對(duì)照腺病毒(CMV)的組合的妊娠大鼠采取的血液樣品的外周涂片的照片。圖26B是在處死時(shí)從注射了sFltl和表達(dá)可溶內(nèi)皮糖蛋白的腺病毒的組合的妊娠大鼠采取的血液樣品的外周涂片的照片，并表現(xiàn)出活性溶血，如由裂紅細(xì)胞和提高的網(wǎng)狀細(xì)胞計(jì)數(shù)所證實(shí)的。箭頭代表裂紅細(xì)胞。圖27A-D的一系列顯微照片顯示了表8所述的各種動(dòng)物組的腎組織學(xué)(H&E染色)。圖27A顯示了對(duì)照組的腎組織學(xué)，沒(méi)有腎小球內(nèi)皮增生的跡象。圖27B顯示了可溶內(nèi)皮糖蛋白注射組的腎組織學(xué)，沒(méi)有腎小球內(nèi)皮增生的跡象。圖27C顯示了sFltl注射的大鼠的腎組織學(xué)，顯示出中等內(nèi)皮增生(用箭頭指示)。圖27D顯示了可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFltl注射的大鼠的腎組織學(xué)，顯示出非常肺脹的腎小球和嚴(yán)重的腎小球內(nèi)皮增生，在足細(xì)胞內(nèi)存在蛋白再吸收小滴。在60X(原始放大率)拍攝所有光顯微照片。圖28中的圖顯示實(shí)施例3中描述的具有各種程度的先兆子癇患者、對(duì)照妊娠和4個(gè)非妊娠健康志愿者的血清中可溶內(nèi)皮糖蛋白(sEng)和sFltl的ELISA結(jié)杲。*與早產(chǎn)對(duì)照相比尸<0.05,#與重度先兆子癇相比尸<0.05。圖29中的圖顯示實(shí)施例3中描述的、在產(chǎn)前(0-12小時(shí))和產(chǎn)后(48小時(shí)取血的一個(gè)亞組的妊娠患者的可溶內(nèi)皮糖蛋白ELISA結(jié)果(正常"=6;先兆子癇"=11)。*與T=0樣品相比尸<0.05。圖30A是顯示純化先兆子癇患者血清后的可溶內(nèi)皮糖蛋白的蛋白印跡。在還原條件下在SDS-PAGE上對(duì)從44G4-IgG(抗-Eng)瓊脂糖凝膠洗脫的級(jí)分4和5進(jìn)行電泳，并且采用內(nèi)皮糖蛋白的多克隆抗體通過(guò)蛋白印跡進(jìn)行測(cè)試。對(duì)洗脫的級(jí)分進(jìn)行質(zhì)譜分析(3次運(yùn)行)。圖30B顯示人內(nèi)皮糖蛋白的序列(SEQIDNO:5)。通過(guò)質(zhì)語(yǔ)鑒定的肽以粗體和下劃線顯示。加下劃線的氨基酸代表人細(xì)胞表面內(nèi)皮糖蛋白的跨膜域。注意氨基酸序列編號(hào)從26開(kāi)始，因?yàn)榘被?-25代表前導(dǎo)肽。注意序列表中列為SEQ1DNO:5的序列從氨基酸1開(kāi)始，因此圖中的氨基酸26是序列表中的氨基酸1，圖中的氨基酸658是序列表中的氨基酸633。根據(jù)參照序列調(diào)整氨基酸編號(hào)(即圖30B中序列的氨基酸26-658與SEQIDNO:5所示序列的氨基酸1-633相同)。圖31顯示一系列顯微照片，其中顯示可溶內(nèi)皮糖蛋白抑制毛細(xì)血管形成并且增加血管通透性。在lMg重組可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFltl或這兩者存在下，在生長(zhǎng)因子減少的MatrigelTM中，用HUVEC進(jìn)行血管發(fā)生測(cè)定，并且對(duì)內(nèi)皮管長(zhǎng)度進(jìn)行定量。顯示了代表性實(shí)驗(yàn)("=4),其中在圖片下面指出了以像素表示的管長(zhǎng)度。圖32是一系列圖，其中顯示通過(guò)可溶內(nèi)皮糖蛋白抑制腸系膜血管中TGF-P1介導(dǎo)的血管反應(yīng)性。在200pg/ml-200ng/ml的TGF-P1或TGF-(33存在下，測(cè)量大鼠腸系膜微血管的微血管反應(yīng)性。在lyg/ml重組可溶內(nèi)皮糖蛋白存在下重復(fù)實(shí)驗(yàn)。顯示了4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SE(上圖)。也顯示了1ng/ml的L-NAME對(duì)TGFP1的阻斷作用(下圖)。圖33是一系列顯微照片，其中顯示妊娠大鼠的腎小球內(nèi)皮增生。顯示了來(lái)自對(duì)照妊娠大鼠(上圖)、可溶內(nèi)皮糖蛋白(sEng)處理的妊娠大鼠(中圖)和組合組-可溶內(nèi)皮糖蛋白(sEng)+sFltl(下圖)的腎小球的電子顯微照片(EM)。這些照片對(duì)于上圖和中圖是以6200X(原始放大)拍攝的，下圖是以5000X(原始放大)拍攝的。圖34A-H是一系列顯^t瞎、片，其中顯示可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFltl處理后妊娠大鼠中的腎、胎盤和肝臟組織學(xué)改變和外周血涂片。對(duì)照(圖34A)、sEng(圖34B)、sFltl(圖34C)和sFltl+sEng(圖34D)組的胎盤組織學(xué)(H&E染色)?？扇軆?nèi)皮糖蛋白和sFltl處理的動(dòng)物都顯示在對(duì)照中沒(méi)有觀察到的、在母體-胎兒連接處的彌漫性炎癥(箭頭)。在sFlt1十sEng處理的胎盤的蛻膜中(箭頭)存在出血性梗塞和纖維蛋白樣壞死，伴有母體血管腔阻塞(箭頭)(圖34D)。比例尺是200pm(圖34E-H)。對(duì)照(圖34E)、sEng(圖34F)、sFltl(圖34G)和sFltl+sEng(圖34H)組中的肝臟組織學(xué)。在sFltl+sEng組中注意到了具有多病灶壞死(箭頭)的缺血性改變(圖34H)。對(duì)照組和給予sEng或sFltl的大鼠沒(méi)有顯示改變。比例尺是200Mm。圖35A-D是一系列圖和放射自顯影照片，其中顯示重組sEng減弱TGF-卩1結(jié)合和活性以及它通過(guò)eNOS激活對(duì)血管舒張的作用。圖35A的照片顯示腎血管對(duì)1ng/mlVEGF、TGF-P1及其組合的微血管反應(yīng)。顯示了sFltl和sEng各100ng/ml對(duì)組合反應(yīng)的作用("=4)。也顯示了L-NAME對(duì)TGFP1和VEGF刺激的反應(yīng)的阻斷作用。圖35B是[1125]TGF-P1與小鼠內(nèi)皮細(xì)胞上的TPRII的結(jié)合的劑量依賴性增加的代表性放射自顯影照片和圖。用5nM重組可溶內(nèi)皮糖蛋白處理，顯著減少了在50pM和100pM的纟i合(*與未處理組相比尸<0.05)。在100pM[I125]TGF-P1處理的細(xì)胞中與40倍過(guò)量的冷TGF-P1的竟?fàn)?，消除了受體結(jié)合，并且作為本底對(duì)照。圖35C的圖顯示在HUVEC中轉(zhuǎn)染的Smad2/3依賴性CAGA-Luc報(bào)道構(gòu)建體的顯著增加的TGF-P誘導(dǎo)的激活和用sEng處理導(dǎo)致的抑制。("=3,"與sENg未處理組相比尸<0.01)。圖35D是代表性蛋白印跡和圖("=4),顯示用TGF-pi處理后eNOSThr495上的顯著去磷酸化和sEng導(dǎo)致的減弱(*與未處理組相比尸<0.05)。磷酸化在Serll77未改變，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中eNOS的總水平保持恒定。圖36顯示大鼠血漿的兩個(gè)蛋白印跡，證明重組sFltl和可溶內(nèi)皮糖蛋白的表達(dá)。上圖按照方法中的描述使用來(lái)自妊娠大鼠的血漿標(biāo)本(在妊娠的前三個(gè)月的早期)。泳道1、2和3代表用作陽(yáng)性對(duì)照的200pg、500pg和2ng重組小鼠Fltl-Fc蛋白。顯示了來(lái)自一只對(duì)照大鼠和兩只sFltl處理的大鼠的20pl血漿標(biāo)本。在sFltl處理的大鼠中檢測(cè)到了sFltl(53kDa)條帶。用商購(gòu)ELISA進(jìn)行sFltl表達(dá)的定量(表8)。下圖用來(lái)自妊娠大鼠的血漿標(biāo)本(在妊娠的前三個(gè)月的早期)才全測(cè)sEng表達(dá)。泳道1代表500pg重組人可溶內(nèi)皮辟唐蛋白，泳道2和3代表分別來(lái)自sEng處理的大鼠和對(duì)照大鼠的30)Lil血漿。印跡顯示在對(duì)照大鼠中沒(méi)有可溶內(nèi)皮糖蛋白，但在處理的大鼠中有重組sEng的強(qiáng)表達(dá)。用商購(gòu)ELISA進(jìn)行可溶內(nèi)皮糖蛋白的定量(表8)。圖37的圖顯示對(duì)照、所有先兆子癇和<37周的先兆子癇中SsFltl和SsEng(妊娠的前三個(gè)月-妊娠的次三個(gè)月的值)的分布。圖38的圖顯示對(duì)照、所有先兆子癇和<37周的先兆子癇中妊娠的前三個(gè)月(乘積l)、妊娠的次三個(gè)月(乘積2)、S乘積(乘積l-乘積2)的sFltxsEng乘積的分布。圖39的圖顯示根據(jù)5乘積的三分位數(shù)(tertiles)的先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)。與5乘積小于-1的女性相比，5乘積水平大于+1[aOR5.5,95%CI1.4-22.4]的組中早產(chǎn)先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的增加是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P0.05)。圖40A是蛋白印跡，顯示內(nèi)皮糖蛋白是TGF-P1誘導(dǎo)的Thr495上的eNOS去磷酸化所必須的。圖40B的圖顯示相對(duì)于總eNOS，eNOSThr495磷酸化的百分比。結(jié)果顯示在可溶內(nèi)皮糖蛋白存在下，在TGF-P1存在下磷酸化的Thr495的水平降低，而不存在可溶性內(nèi)皮糖蛋白時(shí)并非如此。詳述我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在從患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的女性采集的血清樣品中，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平提高?？扇軆?nèi)皮糖蛋白可以由蛋白水解酶切割膜結(jié)合形式的胞外部分來(lái)形成。胎盤中可變剪接變體和本文描述的純化可溶內(nèi)皮糖蛋白的部分肽序列檢測(cè)的缺乏表明，它是全長(zhǎng)內(nèi)皮糖蛋白的N末端剪接產(chǎn)物。過(guò)量的可溶內(nèi)皮糖蛋白可以耗盡胎盤中必須量的這些必須的血管發(fā)生和促有絲分裂因子。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，患者中過(guò)量循環(huán)濃度的可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFltl導(dǎo)致先兆子癇和其它妊娠相關(guān)高血壓病癥的致病。我們也發(fā)現(xiàn)，可溶內(nèi)皮糖蛋白干擾TGF-P1和TGF-(33與其受體的結(jié)合，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞中信號(hào)傳遞的減少，例如eNOS激活的減少，從而破壞保持血管健康所必須的關(guān)鍵平衡機(jī)制。這些數(shù)據(jù)表明內(nèi)皮糖蛋白在將TGF-p受體激活聯(lián)系于NO合成方面的關(guān)鍵作用。此外，我們發(fā)現(xiàn)可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFltl協(xié)同作用，可能通過(guò)抑制eNOS的下游激活而分別干擾TGF-P1和VEGF信號(hào)傳遞，從而誘導(dǎo)血管破壞和妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇。本發(fā)明涉及干擾可溶內(nèi)皮糖蛋白與生長(zhǎng)因子結(jié)合的治療劑、降低可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)或生物活性的試劑，或提高生長(zhǎng)因子水平的試劑的用途，可以用于治療或預(yù)防受試者中的妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇。所述試劑包括但不限于，結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白并且抑制可溶內(nèi)皮糖蛋白生物活性的抗體、降低可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的反義寡核苷酸或RNAi、提高結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的生長(zhǎng)因子水平的化合物、阻止膜結(jié)合形式的內(nèi)皮糖蛋白的蛋白水解切割從而防止可溶內(nèi)皮糖蛋白釋放的化合物，和結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白并阻斷生長(zhǎng)因子結(jié)合位點(diǎn)的小分子。此外或替代地，本發(fā)明涉及任何提高TGF-P、eNOS和PGI2的水平或生物活性的化合物(如多肽、小分子、抗體、核酸和模擬物)在治療或預(yù)防受試者中的妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇中的用途。此外，本發(fā)明涉及任何降低sFit-1的水平或提高VEGF或P1GF的水平或活性的化合物(參見(jiàn)例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20040126828，20050025762和20050170444以及PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2004/008946和WO2005/077007)與上文描述的任何治療性化合物組合用于治療或預(yù)防受試者中的妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇中的用途。此外，本發(fā)明涉及單獨(dú)或組合的可溶內(nèi)皮糖蛋白、eNOS、TGF-P或PGI2作為妊娠相關(guān)的高血壓病癥，包括先兆子癇和子癇的診斷標(biāo)記的用途。盡管本文提供的詳細(xì)描述具體地涉及可溶內(nèi)皮糖蛋白、TGF-(31、eNOS、sFlt-l、VEGF或P1GF，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白，該詳述也應(yīng)用于可溶內(nèi)皮糖蛋白、TGF-(31、eNOS、sFlt-l、VEGF或P1GF的家族成員、同工型和/或變體。診斷我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在從患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的女性采集的血清樣品中，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平提高。可溶內(nèi)皮糖蛋白在先兆子癇的臨床癥狀出現(xiàn)前6-10周開(kāi)始出現(xiàn)。因此，測(cè)量血清中的可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFltl(任選與游離P1GF組合)的診斷測(cè)試將具有增強(qiáng)的敏感性和特異性，并且提供預(yù)防先兆子癇導(dǎo)致的死亡的強(qiáng)有力的工具。該診斷測(cè)試可以包括測(cè)量單獨(dú)的游離VEGF;TGF-P家族成員，優(yōu)選TGF-Pl,TGF-游離激活蛋白-A,BMP2,BMP7;NOS,優(yōu)選eNOS;或PGI2的水平，或其任意組合。任何所述蛋白水平的改變可以診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇。在一個(gè)實(shí)例中，游離BMP2、BMP7或激活蛋白A水平的降低，可以診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇。本發(fā)明的診斷和監(jiān)測(cè)方法適用于任何妊娠相關(guān)的高血壓病癥，包括但不限于，妊娠高血壓、具有小于胎齡(SGA)嬰兒的妊娠、HELLP、慢性高血壓、先兆子癇(輕度、中度和重度)和子癇。在受試者樣品中測(cè)量可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平，無(wú)論是游離的、結(jié)合的還是總的水平，并將其用作先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的指標(biāo)?；加邢日鬃影B、子癇或具有患所述狀況的傾向的受試者，會(huì)表現(xiàn)出可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的表達(dá)的增加?？扇軆?nèi)皮糖蛋白多肽可包含全長(zhǎng)可溶內(nèi)皮糖蛋白、降解產(chǎn)物、可溶內(nèi)皮糖蛋白的可變剪接的同工型、可溶內(nèi)皮糖蛋白的酶切割產(chǎn)物等。特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的抗體，可以用于診斷先兆子癇或子癇，或鑒別具有發(fā)展這樣狀況的風(fēng)險(xiǎn)的受試者。在本發(fā)明的方法中有用的抗體的一個(gè)實(shí)例是抗內(nèi)皮糖蛋白的N-末端區(qū)的單克隆抗體，其在商業(yè)上可從SantaCruzBiotechnology,Inc.(目錄號(hào)sc-20072)得到》另外的實(shí)例包括特異性結(jié)合內(nèi)皮糖蛋白的胞外域(如內(nèi)皮糖蛋白的氨基酸1-437、內(nèi)皮糖蛋白的氨基酸-587，或圖30B中以粗體和下劃線顯示的任何氨基酸序列)的抗體。已知許多種測(cè)量這樣的多肽的表達(dá)變化的規(guī)程，包括免疫學(xué)方法(如ELISA和RIA),且其提供診斷先兆子癇或子癇或發(fā)展這樣狀況的風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)。提高水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白是先兆子癇或子癇的陽(yáng)性指標(biāo)。例如，如果可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平相對(duì)于正常參照提高(例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多)，則認(rèn)為這是先兆子癇或子癇的陽(yáng)性指標(biāo)。另外，可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-l、VEGF或PIGF的水平相對(duì)于正常水平的任何可檢測(cè)的變化，是子癇、先兆子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的指標(biāo)。通常，在非妊娠狀態(tài)期間，可溶內(nèi)皮糖蛋白的循環(huán)血清濃度范圍是2-7ng/ml,而在正常妊娠期間，是10-20ng/ml。認(rèn)為提高的可溶內(nèi)皮糖蛋白的血清水平(大于15ng/ml、優(yōu)選地大于20ng/ml、且最優(yōu)選地大于25ng/ml或更高)，是先兆子癇的陽(yáng)性指標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，與sFlt-l、VEGF或P1GF多肽或核酸的水平、或其任意組合，結(jié)合測(cè)量可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平。測(cè)量sFlt-l、VEGF和P1GF的方法，記載在這里整體引作參考的美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20040126828，20050025762和20050170444,以及PCT公開(kāi)號(hào)WO2004/008946和WO2005/077007中。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，還測(cè)量體重指數(shù)(BM1)和胎兒的胎齡，并包括診斷度量標(biāo)準(zhǔn)。在另一實(shí)施方案中，與可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-l、VEGF或PIGF多肽或核酸的水平組合測(cè)量TGF-P1、TGF-&3或eNOS多肽或核酸的水平。用于測(cè)量TGF-P1和P3多肽水平的抗體是可以商購(gòu)的，例如，購(gòu)自Abeam,Abgent,BDBiosciencesPharmingen,Chemicon,Gene丁ex和R&DSystems。PGI2的水平也可以與任何上述多肽的水平組合使用。例如，在上述任何診斷測(cè)定中用PGh受體作為結(jié)合分子，或采用例如尿前列環(huán)素比色ELISA試劑盒(AssayDesigns),可以確定PGI2的水平。用于測(cè)量eNOS多肽水平的抗體是可以商購(gòu)的，例如，購(gòu)自ResearchDiagnosticsInc.,SantaCruz，CaymanChemicals和BDBiosciences,在另一實(shí)施方案中，與可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-l、VEGF或PIGF多肽的生物活性組合測(cè)量TGF-P1、TGF-p3或eNOS多肽中任何一種或多種的生物活性，并且生物活性的降低是先兆子癇或子癇的陽(yáng)性指標(biāo)。可以例如采用用于酶活性或用于下游信號(hào)傳遞活性的測(cè)定方法測(cè)量生物活性。在一個(gè)實(shí)例中，通過(guò)測(cè)量瓜氨酸轉(zhuǎn)化確定eNOS的酶活性，并且eNOS的酶活性的降低是先兆子癇或子癇的陽(yáng)性指標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用包含可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-l、VEGF或PIGF、或其中的任意組合的度量標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)確定至少兩種蛋白的水平之間的關(guān)系是否可指示先兆子癇或子癇。在一個(gè)實(shí)例中，度量標(biāo)準(zhǔn)是PAAI(sFlt-l/VEGF+PIGF),其與可溶內(nèi)皮糖蛋白測(cè)量組合，用作抗血管發(fā)生指數(shù)，后者可診斷先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向。如果可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平相對(duì)于參照樣品提高(例如，1.5倍、2倍、3倍、4倍或甚至高達(dá)10倍或更高)，且PAAI大于10、更優(yōu)選地大于20，則認(rèn)為受試者患有先兆子癇、子癇，或處于發(fā)展它們的急迫風(fēng)險(xiǎn)中。PAAI(sFlt-l/VEGF+PIGF)比值僅僅是可以用作診斷指標(biāo)的有用度量標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)實(shí)例。它無(wú)意限制本發(fā)明?；旧?，可以檢測(cè)受試者中相對(duì)于正常對(duì)照的可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-l、P1GF或VEGF的水平的變化或其任意組合的任何度量標(biāo)準(zhǔn)，都可以用作診斷指標(biāo)。另一個(gè)實(shí)例是下面的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)(sFlt-1+0.25(可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽))/PIGF。隨時(shí)間或與參照樣品或值相比可溶內(nèi)皮糖蛋白度量標(biāo)準(zhǔn)的該值的增加，是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。超過(guò)IOO、優(yōu)選地超過(guò)200的可溶內(nèi)皮糖蛋白指數(shù)是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。其它實(shí)例包括下面的指數(shù)(可溶內(nèi)皮糖蛋白+sFlt-l)/P1GF或sFlt-lx可溶內(nèi)皮糖蛋白。另一實(shí)例包括測(cè)量受試者中妊娠的前三個(gè)月和妊娠的次三個(gè)月中SFlt-l和可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平，并且用以下公式計(jì)算每個(gè)三月期中sFltlx可溶內(nèi)皮糖蛋白(sEng)的5乘積[d乘積=妊娠的次三個(gè)月中的(sFltlxsEng)-妊娠的前三個(gè)月中的(sFltlxsEng)],其中大于0、1、2或更高的值，包括其分?jǐn)?shù)(例如正值)是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。正值也可以是早產(chǎn)先兆子癇的指標(biāo)。所述測(cè)量可以在妊娠的前三個(gè)月和妊娠的次三個(gè)月的許多場(chǎng)合進(jìn)行，并且可以隨時(shí)間跟蹤d乘積。此外，也可以計(jì)算妊娠的前三個(gè)月和妊娠的次三個(gè)月之間單獨(dú)的sFlt-l水平(dsFlt-l)和sEng水平(dsEng)的d乘積，其中對(duì)于(dsFlt-l)或(dsEng),大于0、1、2或更高的值，包括其分?jǐn)?shù)(例如正值)是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。此外，該度量標(biāo)準(zhǔn)可以進(jìn)一步包括TGF-P1、TGF-P3、PGI2或eNOS多肽的水平。任何度量標(biāo)準(zhǔn)都可以進(jìn)一步包括母親的BMI或嬰兒的GA。標(biāo)準(zhǔn)方法可用于測(cè)量任何體液(包含但不限于，尿、血清、血漿、唾液、羊水或腦脊液)中的可溶內(nèi)皮糖蛋白、游離VEGF、游離P1GF、sFlt-l、TGF-01、GF-(33、PGI2或eNOS多肽的水平。這類方法包含使用針對(duì)可溶內(nèi)皮糖蛋白、游離VEGF、游離P1GF、sFlt-l、TGF-P1、GF-P3、PGh或eNOS多肽的抗體的免疫測(cè)定，ELISA，蛋白印跡，以及定量酶免疫測(cè)定4支術(shù)，如Ong等(ObstetGynecol.98:608-611，2001)和Su等(Obstet.Gynecol.，97:898-卯4，2001)描述的那些。ELISA是測(cè)量可溶內(nèi)皮糖蛋白、VEGF、P1GF、sFlt-l、TGF-(31、GF-03、PGh或eNOS多肽的水平的優(yōu)選方法。優(yōu)選地，測(cè)量單獨(dú)的或與其余多肽的任意一種或多種組合的可溶內(nèi)皮糖蛋白。源自內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-l、P1GF或VEGF核酸序列的寡核苷酸或更長(zhǎng)的片段，可以用作探針，來(lái)不僅監(jiān)控表達(dá)，而且養(yǎng)別具有內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-l、P1GF或VEGF核酸分子的遺傳變異、突變或多態(tài)性的受試者，這些分子是發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向的指示。所述方法詳細(xì)描述于Abdalla等，//w肌Mw"/.25:320-321(2005),美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2006/0067937和PCT公開(kāi)號(hào)WO06/034507。優(yōu)選的寡核苷酸將在高度嚴(yán)格條件下與內(nèi)皮糖蛋白的胞外域或編碼圖30B中以粗體和下劃線顯示的任何肽的核酸序列雜交。本文所述的任一種核酸或多肽的測(cè)量，可以發(fā)生在至少兩個(gè)不同的場(chǎng)合，并將與正常參照水平相比隨時(shí)間的水平變化用作先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的指標(biāo)。在一個(gè)實(shí)例中，存在于患有先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的受試者的體液中的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽或核酸的水平，與正常對(duì)照受試者的水平相比，或與以前從相同受試者的相同體液得到的采樣相比，可以增加少至10%、20%、30%或40%或多至50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。在另一實(shí)例中，從一次測(cè)量至下一次測(cè)量，存在于患有先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的受試者的體液中的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽或核酸的水平，可以隨時(shí)間改變少至10%、20%、30%或40%或多至50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%。與患有先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的受試者的體液中的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平結(jié)合測(cè)量的sFlt-l、VEGF或P1GF的水平，與正常對(duì)照中的sFlt-l、VEGF或PIGF的水平相比，可以改變少至10%、20%、30%或40%或多至50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。從一次測(cè)量至下一次測(cè)量，與患有先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的受試者的體液中的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平組合測(cè)量的sFlt-l、VEGF或P1GF的水平，可以隨時(shí)間改變少至10%、20%、30%或40%或多至50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%。在一個(gè)實(shí)施方案中，在發(fā)作先兆子癇癥狀前的妊娠早期，收集受試者的體液(例如，尿、血漿、血清、羊水或腦脊液)樣品。在另一實(shí)例中，樣品可以是在發(fā)作先兆子癇癥狀前的妊娠早期收集的組織或細(xì)胞。組織和細(xì)胞的非限制性實(shí)例包含胎盤組織、胎盤細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞如單核細(xì)胞。在人類中，例如，在妊娠的前三個(gè)月、次三個(gè)月或第三個(gè)三個(gè)月期間，收集孕婦肘前靜脈的產(chǎn)婦血清樣品。優(yōu)選地，在妊娠的前三個(gè)月(例如在4、6、8、10或12周)期間，或其中的任何時(shí)間間隔進(jìn)行測(cè)定，或在妊娠的次三個(gè)月(例如在M、16、18、20、22或24周)期間，或其中的任何時(shí)間間隔進(jìn)行測(cè)定。在一個(gè)實(shí)例中，該測(cè)定在妊娠的13-16周進(jìn)行。這樣的測(cè)定還可在妊娠的次三個(gè)月結(jié)束時(shí)或妊娠的第三個(gè)三個(gè)月時(shí)進(jìn)行，例如，在26、28、30、32、34、36或38周，或其中的任何時(shí)間間隔。優(yōu)選地，在該時(shí)間段內(nèi)，將可溶內(nèi)皮糖蛋白和/或本文描述的任何其它多肽的水平測(cè)量?jī)纱巍＞彤a(chǎn)后先兆子癇或子癇的診斷而言，可溶內(nèi)皮糖蛋白的測(cè)定可在產(chǎn)后進(jìn)行。就先兆子癇或子癇的傾向的診斷而言，在妊娠開(kāi)始之前或在發(fā)展先兆子癇或子癇的癥狀之前進(jìn)行測(cè)定。在一個(gè)實(shí)例中，就治療的監(jiān)測(cè)和控制而言，在診斷先兆子癇后、在妊娠過(guò)程中和/或在治療過(guò)程中進(jìn)4亍測(cè)定。在一個(gè)特定的實(shí)例中，可在妊娠過(guò)程中收集系列血液樣品，并通過(guò)ELISA測(cè)定可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和/或本發(fā)明的任何其它多肽的水平。在另一個(gè)實(shí)例中，在妊娠的次三個(gè)月期間和第三個(gè)三個(gè)月的早期收集樣品，且從第一次取樣到下一次取樣時(shí)可溶內(nèi)皮糖蛋白或本發(fā)明的任何其它多肽的水平的增加，是先兆子癇或子癇或發(fā)展其中任一種的傾向的指示。本發(fā)明也包含測(cè)量受試者體液(優(yōu)選尿)中的任何可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白(例如，TGF-pi、TGF-|33、激活蛋白-A、BMP-2和BMP-7)或可溶內(nèi)皮糖蛋白信號(hào)傳遞的下游介質(zhì)(如PGh和eNOS),且可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白水平的變化(例如，增加或減少)是先兆子癇或子癇的指示。測(cè)量本文描述的可溶內(nèi)皮糖蛋白的方法和時(shí)間也可以用于測(cè)量任何可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白、PGh或eNOS。在獸醫(yī)實(shí)踐中，可在妊娠過(guò)程中的任何時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，^旦優(yōu)選;也在妊娠早期、發(fā)作先兆子癇癥狀前進(jìn)行。已知妊娠期限在物種之間廣泛變化，測(cè)定時(shí)間選擇將由獸醫(yī)決定，但通常與人類妊娠過(guò)程的測(cè)定時(shí)間選擇相對(duì)應(yīng)。可以單獨(dú)地，或與本文所述的任何其它診斷方法組合4吏用本文所述的診斷方法，以更準(zhǔn)確地診斷先兆子癇或子癇的存在、嚴(yán)重程度或估計(jì)的發(fā)作時(shí)間。此外，本文所述的診斷方法可與用于準(zhǔn)確診斷先兆子癇或子癇的存在、嚴(yán)重程度或估計(jì)的發(fā)作時(shí)間的任何其它診斷方法組合使用。本文所述診斷方法還可用于監(jiān)測(cè)并控制受試者的先兆子癇或子癇。在一個(gè)實(shí)例中，施用治療，直到血液、血漿或血清可溶內(nèi)皮糖蛋白水平小于25ng/ml或直到血清可溶內(nèi)皮糖蛋白水平(或可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白、PGh或eNOS水平)回到在先兆子癇或子癇發(fā)作前確定的基線水平。在另一個(gè)實(shí)例中，如果測(cè)得受試者具有相對(duì)于正常對(duì)水平，則可以施用治療，直到血清P1GF水平提高到約400pg/mL或回到先兆子癇或子癇發(fā)作前的基線水平。在該實(shí)施方案中，重復(fù)測(cè)量可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-l、P1GF、VEGF、可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白、PGI2、eNOS，或它們中的任一種或全部的水平，作為不僅診斷疾病，而且監(jiān)測(cè)先兆子癇和子癇的治療和控制的方法。診斷試劑盒本發(fā)明還提供診斷測(cè)試試劑盒。例如，診斷測(cè)試試劑盒可包含特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的結(jié)合劑(如多肽或抗體)，和用于檢測(cè)、且更優(yōu)選用于評(píng)價(jià)結(jié)合劑與可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽之間的結(jié)合的工具。對(duì)于檢測(cè)，對(duì)結(jié)合劑或可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽進(jìn)行標(biāo)記，且結(jié)合劑或可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽是結(jié)合基質(zhì)的，這樣在結(jié)合劑與可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽之間結(jié)合后，通過(guò)測(cè)定附著到基質(zhì)上的標(biāo)記的量，就可以確定可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽-結(jié)合劑的相互作用。常規(guī)的ELISA是本領(lǐng)域已知的檢測(cè)抗體-基質(zhì)相互作用的常見(jiàn)方法，且可以與本發(fā)明的試劑盒一起提供。實(shí)際上，可在任何體液(包含但不限于尿、血清、血漿、唾液、羊水或腦脊液)中檢測(cè)可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽。本發(fā)明也提供了包含可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸的診斷測(cè)試試劑盒，所述可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸可以用于檢測(cè)和確定可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸的水平。測(cè)定可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平相對(duì)于參照(如存在于正常對(duì)照中的水平)的變化(例如提高)的試劑盒，可用作本發(fā)明方法中的診斷試劑盒。本發(fā)明的診斷試劑盒可以包含用于檢測(cè)美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20040126828、20050025762和20050170444和PCT^>開(kāi)號(hào)WO2004/008946和WO2005/077007所述的sFlt-l、VEGF或P1GF多肽或核酸的抗體或核酸。在另一實(shí)施方案中，試劑盒也可以包括用于檢測(cè)可溶內(nèi)皮糖蛋白配體的結(jié)合劑，包括但不限于TGF-P1、TGF-P3、或PGI2或eNOS多肽。用于測(cè)量TGF-P1和P3多肽水平的抗體是可商購(gòu)的，例如，購(gòu)自Abcam，Abgent，BDBiosciencesPharmingen,Chemicon，GeneTex和R&DSystems。用于測(cè)量eNOS多肽水平的抗體是可商購(gòu)的，例如，購(gòu)自ResearchDiagnosticsInc.,SantaCruz，CaymanChemicals和BDBiosciences。也可以包括用于檢測(cè)PGI2水平的結(jié)合劑，并且包括例如PGh受體或其片段，作為上文描述的任何診斷測(cè)定中的結(jié)合分子，或45采用例如尿前列環(huán)素比色ELISA試劑盒(AssayDesigns)。測(cè)定相對(duì)于正常參照或標(biāo)準(zhǔn)或水平(如存在于正常對(duì)照中的水平)，eNOS、TGF-pi或(33多肽或PGI2水平的改變(例如降低)的試劑盒可以用作本發(fā)明方法中的診斷試劑盒。測(cè)定相對(duì)于陽(yáng)性參照標(biāo)準(zhǔn)或水平，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的改變(例如降低)或可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白(如TGF-卩1,TGF-P3，激活蛋白A,BMP2和BMP7)或可溶內(nèi)皮糖蛋白信號(hào)傳遞的下游介質(zhì)(如eNOS和PGI2)水平的提高的試劑盒可以用于監(jiān)測(cè)先兆子癇或子癇的治療。合意地，試劑盒包含進(jìn)行上述的任一種診斷方法必需的所有組分。例如，試劑盒合意地包含膜，其中在該膜上固定了可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合劑或結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合劑的試劑。該膜可以支持在浸漬片結(jié)構(gòu)上，在那里通過(guò)將浸漬片結(jié)構(gòu)置于樣品中，將樣品沉積于膜上，或該膜可以支持在側(cè)向流盒中，在那里通過(guò)盒中的開(kāi)口，將樣品沉積于膜上。診斷試劑盒通常還包含關(guān)于試劑盒組分的預(yù)期用途的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)，和用于確立標(biāo)準(zhǔn)曲線的參照樣品或純化的蛋白。在一個(gè)實(shí)例中，試劑盒含有關(guān)于使用試劑盒來(lái)診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇、子癇或發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向的說(shuō)明書(shū)。在另一個(gè)實(shí)例中，試劑盒含有關(guān)于使用試劑盒來(lái)監(jiān)測(cè)治療先兆子癇或子癇的治療性處理或劑量方案的說(shuō)明書(shū)。診斷試劑盒也可以包含關(guān)于使用試劑盒來(lái)確定受試者樣品的PAAI或可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)、并將PAAI或可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)與參照樣品值相比較的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)。應(yīng)當(dāng)理解，參照樣品值將取決于試劑盒的預(yù)期用途。例如，可以將樣品與正常參照值相對(duì)比，其中PAAI或可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)或可溶內(nèi)皮糖蛋白值的增加，是先兆子癇或子癇或先兆子癇或子癇的傾向的指示。在另一個(gè)實(shí)例中，用于治療性監(jiān)測(cè)的試劑盒可以具有參照PAAI或可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)值或可溶內(nèi)皮糖蛋白值，它是先兆子癇或子癇的指示，其中與參照樣品相比受試者樣品的PAAI或可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)值的降j氐或可溶內(nèi)皮糖蛋白值的降低，可以用于指示治療性化合物的療效或有效劑量。取決于試劑盒的用途，也可以包括正常或陽(yáng)性參照范圍內(nèi)的純化蛋白水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線。治療本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防受試者的先兆子癇或子癇的方法和組合物。假設(shè)患有先兆子癇、子癇或具有這樣狀況的傾向的受試者中的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平提高，則降低可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽或核酸分子的表達(dá)水平和/或生物活性的任何化合物，都可以用于本發(fā)明的方法中。這樣的化合物包含TGF-(31、TGF-卩3、激活蛋白-A、BMP2或BMP7,其可以破壞可溶內(nèi)皮糖蛋白與配體的結(jié)合；特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的純化的抗體或抗原結(jié)合片段；反義核堿基寡聚體；和用于介導(dǎo)RNA干擾的dsRNA。其它有用的化合物包括可以改變可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物活性的任意化合物，例如，如通過(guò)血管發(fā)生測(cè)定所測(cè)得的。下面詳細(xì)描述了示例性的化合物和方法。這些方法也可以與如PCT公開(kāi)號(hào)WO2004/008946和美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)20040126828和20050170444所述的降低sFlt-l水平、或提高VEGF或P1GF水平、或降低sFlt-l水平的方法相組合。此外，任何提高TGF-P1或3、eNOS或PGI2的水平或生物活性的化合物都可以用于本發(fā)明的方法中。示例性化合物和方法在下文i乎細(xì)4苗述。應(yīng)該指出，我們發(fā)現(xiàn)，可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt-l途徑可以協(xié)同方式起作用，促進(jìn)先兆子癇或子癇的致病。因此，本發(fā)明包括本文描述的任何方法或組合物的組合，用于治療或預(yù)防妊娠相關(guān)的高血壓病癥。例如，把向可溶內(nèi)皮糖蛋白途徑(如下調(diào)可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)或生物活性，或上調(diào)TGF-P、eNOS或PGI2表達(dá)或生物活性)的化合物可以與靶向sFlt-l途徑(如下調(diào)sFlt-l表達(dá)或生物活性或上調(diào)VEGF或P1GF表達(dá)或生物活性)的化合物組合使用，用于治療或預(yù)防妊娠相關(guān)的高血壓病癥。rG尸-p^f傳爭(zhēng)途徑w治^TGF-(3是至少25種生長(zhǎng)因子的家族的原型，所述生長(zhǎng)因子在許多細(xì)胞類型中調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、分化、運(yùn)動(dòng)性、組織重建、神經(jīng)發(fā)生、創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡和血管發(fā)生。TGF-P也抑制許多細(xì)胞類型的細(xì)胞增殖，并可以刺激基質(zhì)蛋白的合成。除了在它使用的上下文中可以看出以外，在貫穿本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)TGF-(3應(yīng)當(dāng)理解為，通常指適合的TGF-P超家族的任一個(gè)或所有成員?？扇軆?nèi)皮糖蛋白結(jié)合TGF-(3家族的幾個(gè)特定成員，包括TGF-(31、TGF-(33、激活蛋白、BMP-2和BMP-7，且可以用于消耗發(fā)育中的胎兒或胎盤的必需的促有絲分裂因子和血管發(fā)生因子。本發(fā)明涉及提高這些配體的水平來(lái)結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白和中和可溶內(nèi)皮糖蛋白的作用的方法。#》治##^合#的^T溶力乂潛資冷應(yīng)傳在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，給受試者施用純化形式的任何可溶內(nèi)皮糖蛋白配體，如TGF-P家族蛋白，包含但不限于TGF-pi、TGF-(33、激活蛋白-A、BMP2和BMP7,以治療或預(yù)防先兆子癇或子癇。純化的TGF-(3家族蛋白包含任何下述的蛋白其氨基酸序列與TGF-卩l(xiāng)或TGF-(33或任何已知TGF-(3家族成員的氨基酸序列同源，更合意地基本相同，其可誘導(dǎo)血管發(fā)生。非限制性實(shí)例包含來(lái)自R&DSystems,MN的人TGF-|31(目錄號(hào)240-B-002)和人TGF-(33(目錄號(hào)243-B3-002)。用于本發(fā)明的方法中的優(yōu)選TGF-P家族蛋白將具有結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的能力(如Barbaraetal,J.Biol.Chem.274:584-94(1999))。#賴力乂潛齊^^仿教的^;^'^化合務(wù)我們已經(jīng)鑒別了內(nèi)皮糖蛋白的胞外域中的潛在切割位點(diǎn)，蛋白水解酶會(huì)在這里切割膜結(jié)合形式的內(nèi)皮糖蛋白，從而釋放出可溶形式的胞外域。我們的切割位點(diǎn)的序列比對(duì)表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)負(fù)責(zé)切割和釋放可溶內(nèi)皮糖蛋白?；蛘?，組織蛋白酶或彈性蛋白酶也可以參與切割事件。MMP也稱作膠原酶、明膠酶和溶基質(zhì)素，且存在26個(gè)已知的家力臭成員(綜述見(jiàn)Whittaker和Ayscough,CellTransmissions17:1(2001))。優(yōu)選的MMP是MMP9，已知它在先兆子癇患者的胎盤中受到上調(diào)(Lim等，Am.J.Pathol.151:1809-1818，1997)。通過(guò)酶原的激活和內(nèi)源抑制劑(如金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPS))的抑制，控制MMP的活性。MMP的抑制劑是鋅結(jié)合蛋白。存在4種已知的內(nèi)源抑制劑(TIMP1-4),其綜述見(jiàn)上面的Whittaker等。一種優(yōu)選的MMP抑制劑是膜型-MMP1的抑制劑，已經(jīng)表明它會(huì)切割(3聚糖，即與內(nèi)皮糖蛋白(enodglin)共有相似性的一種分子(Velasco-Loyden等，J.Biol.Chem.279:7721-7733(2004))。此外，已經(jīng)鑒別出了許多種天然存在的和合成的MMP抑制劑，且其綜述也見(jiàn)上面的Whittaker等。實(shí)例包含針對(duì)MMP的抗體，和各種化合物，包括馬馬司他、巴馬司他、CT1746、BAY12-9566、普馬司他(phnomastat)、CGS-27023A、D9120、BMS275291(BristolMyersSquibb)和trocade，其中的一些現(xiàn)在處于臨床試驗(yàn)中。已知MMP、組織蛋白酶或彈性蛋白酶在釋放和上調(diào)可溶內(nèi)皮糖蛋白水平中的潛在作用，本發(fā)明也提供了已知抑制參與可溶內(nèi)皮糖蛋白的切割和釋放的任意MMP、組織蛋白酶或彈性蛋白酶的活性的任意化合物(如上述的那些)在治療或預(yù)防受試者的先兆子癇或子癇中的用途。增>^T溶^犮潛f^潛合f由W治/A合浙本發(fā)明提供了已知刺激或提高可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白(包含但不限于TGF-pl、TGF-卩3、激活蛋白-A、BMP2和BMP7)的血清水平的任意化合物在治療或預(yù)防受試者的先兆子癇中的用途。可以單獨(dú)地，或與上文描述的純化的蛋白或用于提高本文所述的TGF-(3家族蛋白蛋白水平的任何其它方法組合使用這些化合物。在一個(gè)實(shí)例中，以每天兩次100-200mg的劑量，使用環(huán)孢菌素來(lái)刺激TGF-(31生產(chǎn)。^t^T溶^^:潛f^W我^^發(fā)i法^的治《^化合參使用血管發(fā)生測(cè)定，可以鑒別其它治療性化合物。例如，將具有提高水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白的先兆子癇血清加入matrigel管形成測(cè)定中，將誘導(dǎo)抗血管發(fā)生狀態(tài)。然后，可以將測(cè)試化合物加入測(cè)定中，且抗血管發(fā)生狀態(tài)逆轉(zhuǎn)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多，表明該化合物可以降低可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物活性，且可用作治療性化合物。提高NOS的水平或生物活性的治療性化合物NOS是一種復(fù)合酶，其包含一些輔因子、作為催化位點(diǎn)的一部分的血紅素基團(tuán)、N末端加氧酶結(jié)構(gòu)域(其屬于血紅素-硫醇鹽蛋白類)和與NADPH:P450還原酶同源的C末端還原酶結(jié)構(gòu)域。NOS通過(guò)催化49L-精氨酸(L-Arg)的胍基氮的5-電子氧化而產(chǎn)生NO。eNOS激活涉及Serl177磷酸化和Thr495去磷酸化的協(xié)同增加。我們發(fā)現(xiàn)TGF-P1使eNOS在Thr495去磷酸化，這對(duì)于增加Ca2+敏感性和酶活性是必須的，并且可能與通過(guò)使Serl177磷酸化而激活eNOS的VEGF協(xié)同起作用。因此，任何提高NOS,特別是eNOS的水平(例如通過(guò)提高穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄或翻譯或減少蛋白降解)或生物活性的化合物(如多肽、核酸分子、小分子化合物或抗體)或任何防止eNOS活性下調(diào)的化合物都可以用于本發(fā)明的方法中。所述化合物包括純化的NOS,優(yōu)選eNOS,或其生物活性片段、編碼NOS，優(yōu)選eNOS的核酸，或其生物活性片段、抑制素、釩酸鹽/酯、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、Akt、VEGF、TGF-p1或任何增加Serll77磷酸化或Thr495去磷酸化或這兩者的其它化合物。通過(guò)位于內(nèi)皮細(xì)胞和其它細(xì)胞中的一氧化氮合酶從L-精氨酸合成一氧化氮。也可以通過(guò)應(yīng)用多種一氧化氮供體，如硝普鈉、硝酸甘油、SIN-1、單硝酸異山梨酯、硝酸異山梨酯等而產(chǎn)生一氧化氮。因此，使NOS的水平或生物活性提高(例如至少10%,20%,30%,40%，50%，60%,70%，80%，90%或更多)的化合物可以任選與L-精氨酸或一氧化氮供體(如硝普鈉、硝酸甘油、SIN-1、單硝酸異山梨酯、硝酸異山梨酯)組合施用。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定NOS活性，包括但不限于瓜氨酸測(cè)定和全文引入本文作為參考的美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20050256199中描述的其它測(cè)定。eNOS的Thr495殘基位于eNOS的4丐調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合域內(nèi)。在Thr495上的eNOS的激動(dòng)劑誘導(dǎo)的去磷酸化增加CaM與酶的結(jié)合(Fleming等，Oc尺w.2001，88:E68-75),從而增加其鈣每文感性和激活。除了本文描述的TGF-(31,已經(jīng)顯示了其它激動(dòng)劑導(dǎo)致eNOS的Thr495去磷酸化，包括緩激肽、組胺和VEGF。可以通過(guò)蛋白激酶C(PKC)抑制劑Ro31-8220(Calbiochem)或在PKC下調(diào)后用佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)(SigmaAldrich)增強(qiáng)Thr495去磷酸化。此外，已經(jīng)顯示了激動(dòng)劑誘導(dǎo)的Thr495的去磷酸化是Ca^/鈣調(diào)蛋白依賴性的，并且可以被花萼海綿誘癌素A(SigmaAldrich),即一種磷酸酶l(PPl)抑制劑(FlemingI，等CircRes.2001,88:E68-75)抑制。實(shí)現(xiàn)Thr495上的eNOS去磷酸化的其它化合物包括組胺和緩激肽(SigmaAldrich)。提高尸G/2的水平或生物活性的治療性化合物前列環(huán)素是已知為類二十烷酸的脂質(zhì)分子家族成員。其在內(nèi)皮細(xì)胞中通過(guò)酶-前列環(huán)素合酶的作用從前列腺素H2(PGH2)產(chǎn)生。PGI2生物活性包括血小板聚集的抑制、平滑肌的松弛、通過(guò)直接血管舒張導(dǎo)致的全身和肺血管阻力減少，以及腎臟中的尿鈉排泄。PGl2是一種抗血栓形成因子，VEGF和TGF-(31都可以刺激它。PGI2生物活性包括抑制血小板聚集和松弛血管平滑肌，PGI2生物活性的測(cè)定包括任何血小板聚集測(cè)定或本領(lǐng)域已知的其它PGI2測(cè)定，如Jakubowski等，尸ra^"g/""力似47:404(1994)中描述的那些。本發(fā)明涉及通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法測(cè)量的、使PGl2的水平或活性提高(例如至少10%,20%,30%，40%,50%，60%,70%，80%,90%或更多)的任何化合物的用途，包括但不限于PGl2模擬物、伊落前列素、西卡前列素和阿司匹林。其它本領(lǐng)域已知的化合物和實(shí)例描述于U.S.P.N.5,910,482,在此引入其公開(kāi)內(nèi)容作為參考。純化的蛋白對(duì)于任何純化的蛋白或其片段，蛋白是用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備的。也包括上文描述的任何治療性蛋白的類似物或同源物，并且可以例如通過(guò)以下方式構(gòu)建制備殘基或序列的多種取代、去除生物活性所不需要的末端或內(nèi)部殘基，或添加可能增強(qiáng)生物活性的末端或內(nèi)部殘基。可以進(jìn)行氨基酸取代、缺失、添加或突變，從而改進(jìn)多種表達(dá)系統(tǒng)中蛋白的表達(dá)、穩(wěn)定性或溶解度。通常，進(jìn)行保守取代并且考慮對(duì)生物活性的影響。構(gòu)建用于表達(dá)類似物蛋白或其片段的核苷酸序列中的突變、缺失或添加當(dāng)然必須保留編碼序列的可讀框，并且優(yōu)選不會(huì)產(chǎn)生能夠雜交的互補(bǔ)區(qū)從而產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)，如環(huán)或發(fā)夾，這將不利地影響mRNA的翻譯。本發(fā)明的任何治療性化合物(如多肽、抗體、小分子化合物)也可以包括任何修飾的形式。翻譯后修飾的實(shí)例包括但不限于磷酸化、糖基化、羥化、硫酸化、乙?；愇於┗?、脯氨酸異構(gòu)化、亞基二聚化或多聚化，以及與任何其它蛋白或其片段或膜成分或其片段(如從附著了膜脂質(zhì)成分的膜上切割蛋白)交聯(lián)或附著。也包括提供額外的優(yōu)點(diǎn)，如多肽的增加的親和力、降低的解離速度、溶解度、穩(wěn)定性和體內(nèi)或體外循環(huán)時(shí)間，或降J氐的免疫原性，并且包括例如以下這些的修飾乙?；?、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)連接、血紅素部分的共價(jià)連接、核苷酸或核普酸衍生物的共價(jià)連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)連接、磷脂酰肌醇的共價(jià)連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、共價(jià)交聯(lián)物的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、y-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋、硒酰化(selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的氨基酸在蛋白上的添加，如精氨酰化，和遍在蛋白化(參見(jiàn)例如Creighton，"Proteins:StructuresandMolecularProperties,，，2dEd.，W.H.Freeman和Co.，NY.，1992;"PostranslationalCovalentModificationofProteins,"Johnson,ed.,AcademicPress,NewYork,1983;Seifter等，她仇￡"z_ywo/.，182:626-646，1990;Rattan等，AQMc^/.,663:列變體，如相對(duì)于野生型^列包括1、2、3、口4、、5、大于口5或大于10個(gè)氨基酸改變的變體，所述改變?nèi)缛〈?、缺失或插入。此外，本發(fā)明的治療性化合物可以包含一個(gè)或多個(gè)非經(jīng)典氨基酸。非經(jīng)典氨基酸包括但不限于常見(jiàn)氨基酸的D-異構(gòu)體、2,4-二氨基丁酸、cc-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、烏氨基、正亮氨酸、纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、P-丙氨酸、氟代氨基酸、設(shè)計(jì)氨基酸，如P-甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸，和一般而言的氨基酸類似物。此外，氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)。本發(fā)明所包含的其它翻譯后修飾包括例如N-連接的或O-連接的碳水化合物鏈(N-末端或C-末端的加工)、化學(xué)部分連接于氨基酸主鏈、N-連接的或O-連接的碳水化合物鏈的化學(xué)修飾，和N-末端甲硫氨酸殘基的添加或缺失。此外，也包括本文描述的治療性化合物的化學(xué)修飾的衍生物，其可以提供額外的優(yōu)點(diǎn)，如多肽的增加的溶解度、穩(wěn)定性和循環(huán)時(shí)間，或降低的免疫原性(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,179,337)。用于衍生的化學(xué)部分52可以選自水溶性聚合物，如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧曱基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇等。可以在分子內(nèi)的隨機(jī)位置，或在分子內(nèi)的預(yù)定位置修飾化合物，并且可以包括一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)連接的化學(xué)部分。聚合物可以是任何分子量，并且可以是分支的或不分支的。對(duì)于聚乙二醇，優(yōu)選的分子量是約1kDa-約100kDa(術(shù)語(yǔ)"約"表示在聚乙二醇的制劑中，一些分子的分子量將比指出的分子量更高或一定程度更低)，以便易于操作和制造。取決于需要的治療譜(如需要的持續(xù)釋放時(shí)間、對(duì)生物活性的任何影響(如果有)、易于操作、抗原性的程度或缺乏，和聚乙二醇對(duì)治療性蛋白或類似物的其它已知影響)，可以采用其它大小。如上文所指出的，聚乙二醇可以具有分支的結(jié)構(gòu)。分支的聚乙二醇描述于例如美國(guó)專利號(hào)5,643,575;Morpurgo等，」;7/7/.i5wc/zem.5z'o"c/wo/.56:59-72,(1996);Vorobjev等,iVwc/ecw'desM^'/eo〃tfes18:2745-2750,(1999);和Caliceti等，Aoccw/wg.C&w.10:638-646,(1999),上述每篇文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容都在此引入作為參考。也可以采用形成嵌合分子的方式修飾本發(fā)明的任何治療性化合物(如多肽、抗體或小分子化合物)，所迷嵌合分子包含治療性化合物，該化合物融合于另一異源多肽或氨基酸序列，如Fc序列、可檢測(cè)標(biāo)記物，或其它治療性分子。在一個(gè)實(shí)例中，抗可溶內(nèi)皮糖蛋白抗體可以是與Fc融合蛋白融合的肽。對(duì)于本發(fā)明的方法中使用的任何多肽，包括抗體，采用本領(lǐng)域已知和本文描述的用于基因治療的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，編碼所述多肽或抗體或其片段的核酸也可以用于本發(fā)明的方法中?；诙嚯幕螂钠蔚娜S結(jié)構(gòu)的模擬，并且采用合理藥物設(shè)計(jì)，本發(fā)明也包括模擬物，以提供具有特定分子形狀、大小和電荷特征的潛在抑制劑化合物。在鑒定治療性化合物后，本領(lǐng)域已知的合適的模擬技術(shù)可以用于研究功能性相互作用，并且設(shè)計(jì)包含功能性基團(tuán)的模擬化合物，所述功能性基團(tuán)的排列方式使得它們能夠復(fù)制這些相互作用。將模擬物設(shè)計(jì)為已知的藥學(xué)活性化合物是用于基于前導(dǎo)化合物而開(kāi)發(fā)藥物的已知方法。在以下情況下上述方法可能是理想的，即當(dāng)活性化合物難以合成，或合成太昂貴時(shí)，或?qū)τ谔囟ㄊ┯梅椒ú缓线m的時(shí)候，例如，肽不太適合作用口服組合物的活性劑，因?yàn)樗鼈儍A向于被消化道中的蛋白酶迅速降解。模擬物設(shè)計(jì)、合成和測(cè)試可以用于提供對(duì)大量分子的隨機(jī)篩選，以得到靶特性。然后可以篩選模擬物，從而觀察它們是否降低或抑制可溶內(nèi)皮糖蛋白水平或生物活性，并且可以進(jìn)一步優(yōu)化或修飾，以便得到用于體內(nèi)或臨床測(cè)試的一種或多種最終的模擬物近來(lái)的工作表明，將能夠表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞促分裂原(如VEGF)的核酸(DNA或RNA)遞送到血管損傷部位，將誘導(dǎo)受損血管的增殖和重新內(nèi)皮化。雖然本發(fā)明不涉及血管損傷，但這些用于向內(nèi)皮細(xì)胞遞送核酸的普通技術(shù)也可用于本發(fā)明中，以用于遞送編碼可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白(如TGF-P、TGF-{33、激活蛋白-A、BMP2和BMP7)的核酸。該技術(shù)也可以用于遞送編碼蛋白的核酸，如上述的那些，所述蛋白已知抑制參與可溶內(nèi)皮糖蛋白的切割和釋放的任意MMP、組織蛋白酶或彈性蛋白酶的活性，以用于治療或預(yù)防受試者的先兆子癇或子癇。這些普通技術(shù)在美國(guó)專利號(hào)5,830,879和6，258,787中描述，它們引入本文作為參考。在本發(fā)明中，核酸可以是任何核酸(DNA或RNA),包含編碼可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白(如TGF-pi、TGF-(33、激活蛋白-A、BMP2和BMP7)的基因組DNA、cDNA和mRNA。使用本領(lǐng)域的常規(guī)操作，例如，重組DNA、PCR擴(kuò)增，可獲得編碼所需蛋白的核酸。對(duì)于本文所述的任一種核酸應(yīng)用，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的施用核酸的方法。實(shí)例描述于美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20060067937和PCT公開(kāi)號(hào)WO06/034507。奔賴T溶力犮潛奢^^^^治^Vi凝^本發(fā)明還涉及反義核堿基寡聚體在直接下調(diào)可溶內(nèi)皮糖蛋白mRNA的表達(dá)中的用途。通過(guò)結(jié)合互補(bǔ)核酸序列(有義或編碼鏈)，反義核堿基寡聚體能夠抑制蛋白表達(dá)，可能是通過(guò)RNA酶H對(duì)RNA鏈的酶促切割。優(yōu)選地，反義核堿基寡聚體能夠降低表達(dá)提高水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白的細(xì)胞中的可溶內(nèi)皮糖蛋白的蛋白表達(dá)。優(yōu)選地，與用對(duì)照寡核苷酸處理的細(xì)胞相比，可溶內(nèi)皮糖蛋白蛋白表達(dá)降低了至少10%,優(yōu)選地20%或更多，更優(yōu)選地40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。選擇和制備反義核堿基寡聚體的方法是本領(lǐng)域熟知的。使用反義核堿基寡聚體下調(diào)VEGF表達(dá)的實(shí)例，見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6，410，322，其引入本文作為參考。測(cè)定蛋白表達(dá)水平的方法也是本領(lǐng)域熟知的，且包含蛋白印跡、免疫沉淀法和ELISA。本發(fā)明還涉及RNA干擾(RNAi)在抑制可溶內(nèi)皮糖蛋白的表達(dá)中的用途。RNA千擾(RNAi)是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)的機(jī)理，其中與目標(biāo)基因或mRNA相對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA(dsRNA)被引入到生物中，A/v而導(dǎo)致對(duì)應(yīng)mRNA的降解。在RNAi反應(yīng)中，dsRNA分子的有義和反義鏈被加工成長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸(nt)且具有2個(gè)核普酸的3，尾的小RNA片段或區(qū)段?；蛘?，可以合成合成的dsRNA，它們長(zhǎng)21-23nt，且具有2個(gè)核苷酸的3'尾，純化，并用于反應(yīng)中。這些21-23ntdsRNA被稱作"指導(dǎo)RNA"或"短干擾RNA"(siRNA)。然后，siRNA雙鏈體與核酸酶復(fù)合物結(jié)合，該核酸酶復(fù)合物包含耙向且破壞內(nèi)源mRNA的蛋白，所述內(nèi)源mRNA與復(fù)合物內(nèi)的siRNA具有同源性。雖然仍然不清楚復(fù)合物內(nèi)的蛋白的特性，但復(fù)合物的功能是，通過(guò)siRNA鏈中的一條和內(nèi)源mRNA之間的堿基配對(duì)相互作用，靶定同源的mRNA分子。然后，從siRNA的3，末端切割下約12nt的mRNA，并降解。以這種方式，可靶定特定基因并將其降解，由此導(dǎo)致耙定的基因的蛋白表達(dá)的喪失。也可以化學(xué)合成siRNA,或從化學(xué)合成siRNA的7〉司(例如,DharmaconResearchInc.,Pharmacia或ABI)得到。dsRNA的特殊要求和修飾描述于PCT7〉開(kāi)號(hào)WOO1/75164和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20060067937以及PCT公開(kāi)號(hào)WO06/034507，在此引入作為參考。在^f歡:^^f^"^/^^f^T漆力發(fā)^奢冷的治^^化合務(wù)已經(jīng)表明，全長(zhǎng)內(nèi)皮糖蛋白信號(hào)傳遞的抑制增強(qiáng)絨毛外植體培養(yǎng)物中的滋養(yǎng)層侵襲力(CaniggiaI等，￡m/ocn"o/ogy,1997,138:4977-88)。因此，可溶內(nèi)皮糖蛋白可能增強(qiáng)早期妊娠過(guò)程中的滋養(yǎng)層侵襲力。因此，提高不患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥或不具有妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向的婦女在早期妊娠時(shí)的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的組合物，對(duì)于促進(jìn)胎盤形成是有益的。提高可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的組合物的實(shí)例包括純化的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽、可溶內(nèi)皮糖蛋白編碼核酸分子和提高可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平或生物活性的化合物或生長(zhǎng)因子?；蚝偷鞍妆磉_(dá)的測(cè)定下面的方法可以用于評(píng)價(jià)蛋白或基因表達(dá)，并確定任一種上述方法在提高可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白水平、或降低可溶內(nèi)皮糖蛋白蛋白水平中的效力。使用諸如ELISA、蛋白印跡或使用特異性抗體的免疫測(cè)定的方法，測(cè)量受試者血清的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平。也可以測(cè)量受試者血清的TGF-(31、TGF-P3、激活蛋白-A、BMP2、BMP7或已知結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的任意蛋白配體的水平。用于測(cè)量蛋白的血清水平的方法包括ELISA、蛋白印跡或使用特異性抗體的免疫測(cè)定。此外，可以進(jìn)行體外血管發(fā)生測(cè)定，以確定受試者的血液是否已經(jīng)從抗血管發(fā)生狀態(tài)轉(zhuǎn)化成促血管發(fā)生狀態(tài)。這樣的測(cè)定記栽在下文實(shí)施例4中。認(rèn)為診斷先兆子癇或子癇的結(jié)果是可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平提高了至少10%、20%、優(yōu)選地30%、更優(yōu)選地至少40%或50%、且最優(yōu)選地至少60%、70%、80%、90%或更多，表明先兆子癇或子癇改善的結(jié)果是可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平降^f氐了至少10%、20%、優(yōu)選地30%、更優(yōu)選地至少40%或50%、且最優(yōu)選地至少60%、70%、80%、90%或更多?；蛘呋虼送?，認(rèn)為診斷先兆子癇或子癇的結(jié)果是eNOS、PGI2、TGF-P1、TGF-P3、激活蛋白-A、BMP2、BMP7或任何已知與可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合的蛋白配體的水平降低了至少10%、20%、優(yōu)選地30%、更優(yōu)選地至少40%或50%、且最優(yōu)選地至少60%、70%、80%、90%或更多，表明先兆子癇或子癇改善的結(jié)果是eNOS、PGI2、TGF-P1、TGF-P3、激活蛋白-A、BMP2、BMP7或任何已知與可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合的蛋白配體的水平提高了至少10%、20%、優(yōu)選地30%、更優(yōu)選地至少40%或50%、且最優(yōu)選地至少60%、70%、80%、90%或更多。表明先兆子癇或子癇改善的結(jié)果也可以認(rèn)為是采用體外血管發(fā)生測(cè)定測(cè)得，從抗血管發(fā)生狀態(tài)至促血管發(fā)生狀態(tài)轉(zhuǎn)化了至少10%、優(yōu)選地20%、30%、40%、50%、且最優(yōu)選地至少60%、70%、80%、90%或更多。56也可以測(cè)量來(lái)自受試者的血清或尿樣品中的編碼eNOS、TGF-P1、TGF-(33、激活蛋白-A、BMP2、BMP7或可溶內(nèi)皮糖蛋白的核酸或多肽的水平。存在幾種本領(lǐng)域已知的測(cè)定基因表達(dá)的方法。一些實(shí)例包括，從受試者的血液樣品制備RNA，并使用RNA進(jìn)行RNA印跡、基于PCR的擴(kuò)增、或RNA酶保護(hù)測(cè)定。認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果是可溶內(nèi)皮糖蛋白、TGF-(31、TGF-(33、激活蛋白-A、BMP2、BMP7核酸的水平提高了至少10%、20%、優(yōu)選地30%、更優(yōu)選地至少40%或50%、且最優(yōu)選地至少60%、70%、80%、90%或更多。治療性抗體在從患有先兆子癇的孕婦采集的血清樣品中發(fā)現(xiàn)的提高水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白，表明可溶內(nèi)皮糖蛋白可起"生理學(xué)庫(kù)"的作用，以結(jié)合胎兒或胎盤的正確發(fā)育和血管發(fā)生所需的滋養(yǎng)層細(xì)胞和母體內(nèi)皮細(xì)胞的功能性生長(zhǎng)因子，并將其耗盡。使用化合物(如抗體)來(lái)結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白并中和可溶內(nèi)皮糖蛋白的活性(例如，結(jié)合TGF-pi、TGF-(33、激活蛋白-A、BMP2、BMP7),可以通過(guò)增加游離的TGF-(31、TGF-{33、激活蛋白-A、BMP2和BMP7,幫助預(yù)防或治療先兆子癇或子癇。這種增加將使胎盤發(fā)育和胎兒營(yíng)養(yǎng)所需的滋養(yǎng)層增殖、遷移和血管發(fā)生能夠增加，且使全身的母體內(nèi)皮細(xì)胞健康。本發(fā)明提供了特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體。優(yōu)選地，所述抗體結(jié)合內(nèi)皮糖蛋白的胞外域或配體結(jié)合域。所述抗體用于中和可溶內(nèi)皮糖蛋白的活性，且認(rèn)為最有效的機(jī)理是通過(guò)直接封閉TGF-(31、TGF-P3、激活蛋白-A、BMP2或BMP7的結(jié)合位點(diǎn)，然而，不排除其它機(jī)理。優(yōu)選的抗體可以結(jié)合人內(nèi)皮糖蛋白上的表位(由于線性結(jié)果或三維構(gòu)象的結(jié)果)，所述表位包括圖30B中以粗體和下劃線表示的任何一個(gè)或多個(gè)肽序列(如氨基酸40-86、144-199、206-222、289-304或375-381)或結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的任何優(yōu)選片段(如人內(nèi)皮糖蛋白的氨基酸1-437、4-437、40-406或1-587)。用于治療目的的抗體的制備和使用方法在幾個(gè)專利中描述，包含美國(guó)專利號(hào)6，054，297;5,821,337;6，365，157;和6,165,464,美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2006/0067937;和PCT公開(kāi)號(hào)WO06/034507,且它們引入本文作為參考。抗體可以是多克隆的或單克隆的；優(yōu)選單克隆人源化抗體。本發(fā)明還包括結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體，包括但不限于結(jié)合圖30B中以粗體和下劃線表示的任何一個(gè)或多個(gè)肽或結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的任何優(yōu)選片段(如人內(nèi)皮糖蛋白的氨基酸1-437、4-437、40-406或1-587)的抗體。我沐W治^ff逸當(dāng)體內(nèi)用于治療或預(yù)防先兆子癇或子癇時(shí)，將本發(fā)明的抗體以治療有效量施用給受試者。優(yōu)選地，腸胃外施用所述抗體或通過(guò)連續(xù)輸注靜脈內(nèi)施用所述抗體。給藥和劑量方案取決于疾病的嚴(yán)重程度和受試者的整體健康狀況。施用的抗體的量通常為約0.001-約10mg/kg受試者體重、優(yōu)選0.01-約5mg/kg受試者體重。對(duì)于腸胃外施用，將抗體與藥學(xué)可接受的腸胃外載體一起配制成單位劑量注射形式(溶液、懸浮液、乳狀液)。這種栽體本身是無(wú)毒且無(wú)治療性的。這種載體的實(shí)例是水、鹽水、林格液、葡萄糖溶液以及5%人血清白蛋白。還可使用不含水的載體，如固定的油以及油酸乙酯。可將脂質(zhì)體用作栽體。所述載體可包含少量添加劑，如提高等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，例如緩沖劑及防腐劑。通常以約1mg/ml-10mg/ml的濃度，在這種載體中配制抗體。聯(lián)合療法任選地，治療可與任何其它標(biāo)準(zhǔn)的先兆子癇或子癇療法聯(lián)合施用；這樣的方法是技術(shù)人員已知的，且包括美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20040126828、20050025762、20050170444、20060067937和20070104707和PCT公開(kāi)號(hào)WO2004/008946、WO2005/077007和WO06/034507中所述的方法。理想地，本發(fā)明涉及使用本文描述的任何一種或多種治療劑的組合。由于我們發(fā)現(xiàn)了可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt-l可以協(xié)同作用，以通過(guò)分別干擾TGF-P1和VEGF信號(hào)傳遞途徑，可能趨同作用于NOS信號(hào)傳遞途徑，從而誘導(dǎo)血管損傷和妊娠相關(guān)的高血壓病癥，因此本發(fā)明的理想的治療方法包括聯(lián)合施用降4氐sFlt-l水平或活性，或提高VEGF或P1GF水平或活性的化合物和降低可溶內(nèi)皮糖蛋白水平或活性或提高TGF-P、NOS或PG12水平或活性的化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，任何上述試劑的任何組合都可以用于此目的。例如，可以與VEGF聯(lián)合施用特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體。在另一實(shí)例中，提高TGF-P1活性或水平的化合物可以與提高VEGF或P1GF的化合物聯(lián)合施用，以便靶定內(nèi)皮糖蛋白和VEGF途徑兩者?；蛘撸箍扇軆?nèi)皮糖蛋白和sFlt-l兩者的抗體可以直接使用或用于離體方法中(例如，采用排列了抗可溶內(nèi)皮糖蛋白或sFlt-l的柱，并且使患者的血液經(jīng)該柱循環(huán))。任何上述組合可以進(jìn)一步包括施用提高NOS，優(yōu)選eNOS水平或活性的化合物，以便調(diào)節(jié)各自受體下游的途徑。此外，本發(fā)明提供了任何慢性高血壓藥物與任何本文描述的治療方法聯(lián)合使用的用途。用于在妊娠過(guò)程中治療高血壓的藥物包括甲基多巴、鹽酸肼笨噠。秦或拉貝洛爾。這些藥物中的每一種，施用方式和劑量可以由醫(yī)生和制造商的說(shuō)明書(shū)確定。施用的劑量和方式優(yōu)選地，在妊娠過(guò)程中直接或采用離體方法施用治療，以用于治療或預(yù)防先兆子癇或子癇，或在妊娠后施用治療，以治療產(chǎn)后先兆子癇或子癇。施用技術(shù)和劑量依賴于化合物類型(例如，化合物、純化的蛋白、抗體、反義、RNAi或核酸載體)而變化，且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的或容易確定的。本發(fā)明的治療性化合物可與藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑一起，以單位劑型施用。施用可以是腸胃外、靜脈內(nèi)、皮下、口服或通過(guò)直接注射到羊水中而局部施用。通過(guò)連續(xù)輸注而靜脈內(nèi)遞送，是施用本發(fā)明治療性化合物的優(yōu)選方法。治療性化合物可以是溶液、懸浮液、乳狀液、輸注裝置或用于植入的遞送裝置的形式，或它可以作為干粉存在，用于在使用前用水或其它合適的載體重配。所述組合物的形式可以是口服施用的丸劑、片劑、膠囊、液體或持續(xù)釋放的片劑；或用于靜脈內(nèi)、皮下或腸胃外施用的液體；或用于局部施用的聚合物或其它持續(xù)釋放載體。用于制備制劑的本領(lǐng)域熟知的方法見(jiàn)，例如，"Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy"(20thed.，ed.A.R.GennaroAR.，2000，LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA)。用于腸胃外施用的制劑可包含，例如，賦形劑、無(wú)菌水、鹽水、聚亞烷基二醇如聚乙二醇、植物來(lái)源的油或氫化萘。生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，可用于控制化合物的釋放。納米顆粒(nanoparticulate)制劑(例如，可生物降解的納米顆粒、固體脂類納米顆粒、脂質(zhì)體)可用于控制化合物的生物分布。其它潛在有效的腸胃外遞送系統(tǒng)包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的輸注系統(tǒng)及脂質(zhì)體。制劑中化合物的濃度取決于多種因素，包含所施用藥物的劑量以及施用途徑。所述化合物可任選地作為藥學(xué)可接受的鹽(如制藥工業(yè)通常使用的無(wú)毒酸加成鹽或金屬絡(luò)合物)來(lái)施用。酸加成鹽的實(shí)例包括，有機(jī)酸如乙酸、乳酸、雙羥萘酸(pamoic)、馬來(lái)酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕櫚酸、辛二酸、水楊酸、酒石酸、甲石黃酸、甲苯磺酸、三氟乙酸等；聚合酸如鞣酸、羧甲基纖維素等；和無(wú)機(jī)酸如鹽酸、氬溴酸、疏酸、磷酸等。金屬絡(luò)合物包括鋅、鐵等。用于口服使用的制劑包括，含有與無(wú)毒的藥學(xué)可接受賦形劑相混合的活性成分的片劑。這些賦形劑可以是，例如，惰性稀釋劑或填充物(例如，蔗糖和山梨糖醇)、潤(rùn)滑劑、助流劑和抗結(jié)合劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、二氧化硅、氫化植物油或滑石)?？诜褂玫闹苿┻€可以咀嚼片劑的形式提供，或以硬膠嚢的形式提供，其中將活性成分與惰性固體稀釋劑混合，或以軟膠嚢的形式提供，其中將活性成分與水或油性介質(zhì)混合。施用化合物的劑量和時(shí)間選擇取決于各種臨床因素，包含受試者的整體健康狀況和先兆子癇癥狀的嚴(yán)重程度。一般而言，一旦檢測(cè)出先兆子癇或先兆子癇的傾向，則使用純化蛋白的連續(xù)輸注來(lái)治療或預(yù)防所述狀況的進(jìn)一步發(fā)展。治療可持續(xù)1-100天，更優(yōu)選l-60天，且最優(yōu)選l-20天時(shí)間段，或直到妊娠結(jié)束。劑量可^^據(jù)每種化合物以及狀況的嚴(yán)重程度而變化，并通過(guò)滴定來(lái)獲得穩(wěn)態(tài)的血清濃度，即10-20ng/ml可溶內(nèi)皮糖蛋白；和/或1-500pg/mL游離VEGF或游離P1GF或二者，優(yōu)選地1-100pg/mL，更優(yōu)選地5-50pg/mL、且最優(yōu)選地5-10pg/mLVEGF或P1GF或1-5ngsFlt-l。本文所述的診斷方法可以用于監(jiān)測(cè)在治療過(guò)程中的先兆子癇或子癇，或確定治療性化合物的劑量。在一個(gè)實(shí)例中，在治療過(guò)程中施用治療性化合物，并確定PAAI。如果PAAI小于20、優(yōu)選地小于10，則認(rèn)為治療劑量是有效劑量。在另一個(gè)實(shí)例中，在治療過(guò)程中施用治療性化合物，并確定可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)。如果可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)小于200、優(yōu)選地小于100,則認(rèn)為治療劑量是有效劑量。受試者監(jiān)測(cè)使用本發(fā)明的診斷方法、試劑盒和組合物，可以監(jiān)測(cè)患有先兆子癇、子癇或有這樣的狀況的傾向的受試者的疾病狀況或治療。例如，監(jiān)測(cè)存在于體液(如血液、血清、尿、血漿、羊水或CSF)中的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的表達(dá)?？扇軆?nèi)皮糖蛋白監(jiān)測(cè)可以與監(jiān)測(cè)sFlt-l、VEGF或P1GF、TGF-&或eNOS多肽或核酸或PGI2的表達(dá)的方法相結(jié)合。這種監(jiān)測(cè)可以用于，例如，評(píng)價(jià)特定藥物在受試者中的效力或評(píng)價(jià)疾病進(jìn)展。降低可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸分子或多肽的表達(dá)或生物活性的治療在本發(fā)明中特別有用。篩選測(cè)定如上面所討論的，可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸或多肽的水平在患有先兆子癇、子癇或有這樣狀況的傾向的受試者中提高?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的組合物可用于候選化合物的高通量低成本篩選，以筌別調(diào)節(jié)可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽或核酸分子的表達(dá)的那些，所述表達(dá)在患有先兆子癇或子癇的受試者中發(fā)生變化。許多方法都可用于進(jìn)行篩選測(cè)定，以鑒別改變可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸分子的表達(dá)的新候選化合物。其實(shí)例詳細(xì)描述于美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20060067937和PCT申請(qǐng)?zhí)朩O06/034507。在一個(gè)工作實(shí)施例中，可篩選候選化合物中特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的那些。這種候選化合物的效力取決于它與這類多肽或其功能等價(jià)物相互作用的能力。使用任意數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合技術(shù)和功能測(cè)定，如免疫測(cè)定或基于親和層析的測(cè)定(例如，上面的Ausubel等描述的那些)，可容易地測(cè)定這種相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽是固定的，并且用基于標(biāo)準(zhǔn)親和層析的測(cè)定測(cè)試化合物結(jié)合固定的可溶內(nèi)皮糖蛋白的能力。然后可以洗脫結(jié)合固定的可溶內(nèi)皮糖蛋白的化合物并且純化，并且進(jìn)一步測(cè)試其在體內(nèi)和體外結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋的能力，或其抑制可溶內(nèi)皮糖蛋的生物活性的能力。在另一實(shí)例中，可通過(guò)降低可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽與生長(zhǎng)因子(如TGF-p、TGF-(53、激活蛋白-A、BMP-2和BMP-7)的結(jié)合，測(cè)試候選化合物降低可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的生物活性的能力。這些測(cè)定可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行，并且可以采用本領(lǐng)域已知或本文描述的任何可溶內(nèi)皮糖蛋白的任何活性測(cè)定對(duì)可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的生物活性進(jìn)行測(cè)定。例如，可以將細(xì)胞與Smad2/3依賴性報(bào)道構(gòu)建體一起溫育。如果需要，細(xì)胞也可以在TGF-P存在下溫育，以增強(qiáng)Smad2/3依賴性報(bào)道構(gòu)建體上的信號(hào)。然后可以在可溶內(nèi)皮糖蛋白存在下溫育細(xì)胞，所述可溶內(nèi)皮糖蛋白將減少Smad2/3依賴性報(bào)道構(gòu)建體的TGF-P誘導(dǎo)的激活。可以在細(xì)胞中加入候選化合物，任何導(dǎo)致與未用化合物處理的細(xì)胞相比，可溶內(nèi)皮糖蛋白處理的細(xì)胞中Smad2/3依賴性報(bào)道物的TGF-P誘導(dǎo)的激活增加的化合物被認(rèn)為是可以用于治療先兆子癇或子癇的化合物。在另一實(shí)例中，eNOS的Thr495上的TGF-Pi秀導(dǎo)的去A,酸化也可以用作可溶內(nèi)皮糖蛋白生物活性改變的測(cè)定。在該實(shí)例中，在可溶內(nèi)皮糖蛋白的存在下溫育細(xì)胞，這在下文描述的實(shí)驗(yàn)中顯示，其抑制eNOS的Thr495的TGF-P1去磷酸化。然后在細(xì)胞中加入候選化合物，確定Thr495的磷酸化狀態(tài)。與未用化合物處理的細(xì)胞相比，任何導(dǎo)致可溶內(nèi)皮糖蛋白處理的細(xì)胞中Thr495去磷酸化的TGF-P誘導(dǎo)的激活增加的化合物被認(rèn)為是可以用于治療先兆子癇或子癇的化合物。實(shí)施例下面的實(shí)施例意在解釋本發(fā)明。它們無(wú)意以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1.先兆子癇孕婦中提高水平的內(nèi)皮糖蛋白mRNA和蛋白在鑒別在先兆子癇中起病理學(xué)作用的新的分泌因子的嘗試中，我們使用AffymetnxU95A微陣列芯片進(jìn)行了患有先兆子癇的17位孕婦和13位正常孕婦的胎盤組織的基因表達(dá)諳分析。我們發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮糖蛋白的基因在患有先兆子癇的婦女中被上調(diào)。為了證實(shí)內(nèi)皮糖蛋白在先兆子癇中的上調(diào)，我們進(jìn)行RNA印跡以分析與血壓正常的孕婦相比的先兆子癇孕婦中的胎盤內(nèi)皮糖蛋白mRNA水平(圖3)，并進(jìn)行蛋白印跡以測(cè)量與血壓正常的孕婦相比的先兆子癇孕婦中的內(nèi)皮糖蛋白的血白蛋白水平(圖4)。先兆子癇被定義為(1)妊娠20周后，收縮壓(BP)〉140mmHg且舒張壓〉90mmHg,(2)新發(fā)作的蛋白尿(利用浸漬片進(jìn)行尿分析為l+,24小時(shí)尿收集中的蛋白〉300mg，或隨機(jī)尿蛋白/肌酸酐比>0.3，和(3)到產(chǎn)后12周，高血壓及蛋白尿消除。排除患基礎(chǔ)高血壓、蛋白尿或腎病的患者。基于是否存在腎炎范圍的蛋白尿(24小時(shí)尿收集中的蛋白>3g或尿蛋白/肌酸酐比大于3.0)，將患者分成輕度先兆子癇和重度先兆子癇。輕度先兆子癇組中的平均尿蛋白/肌酸酐比為0.94+/-0.2，而重度先兆子癇組為7.8+/-2.1。各組的平均胎齡如下正常38.8+/-0.2周、輕度先兆子癇34+/-1.2周、重度先兆子癇31.3+/-0.6周和早產(chǎn)的29.5+/-2.0周。分娩后立即獲得胎盤樣品。從每個(gè)胎盤隨機(jī)采集4份樣品，放在RNAlater穩(wěn)定溶液(Ambion，Austin,TX)中，并在-70。C保存。使用QiagenRNAeasyMaxi試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)進(jìn)行RNA分離。用對(duì)應(yīng)N-末端區(qū)(Genebank存BC014271)的內(nèi)皮糖蛋白編碼區(qū)中的400堿基對(duì)探針(UnigeneHs.76753)和作為標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照的18S探針探測(cè)的RNA印跡顯示了胎盤內(nèi)皮糖蛋白mRNA的增加(參見(jiàn)Knebelmann等，C""cw/仏58:226-231(1998))。用內(nèi)皮糖蛋白氨基末端的抗體探測(cè)的蛋白印跡顯示了與血壓正常的孕婦相比，先兆子癇孕婦中內(nèi)皮糖蛋白的胎盤和母體血清水平兩者的增加。實(shí)施例2.證實(shí)先兆子癇患者的胎盤和血清中的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽用于測(cè)量先兆子癇婦女的胎盤和血清中的內(nèi)皮糖蛋白水平的蛋白印跡分析提示了更小的蛋白(約63-65kDa)的存在，它存在于先兆子癇孕婦的胎盤和血清中(圖4和30A)。我們已經(jīng)證實(shí)，該更小的片段是內(nèi)皮糖蛋白的胞外域。該截短形式可能是從胎盤合胞滋養(yǎng)層和內(nèi)皮細(xì)胞脫落的，并在先兆子癇患者中過(guò)量地循環(huán)。該可溶形式的內(nèi)皮糖蛋白可以通過(guò)結(jié)合正常血管健康必需的循環(huán)配體，起抗血管發(fā)生劑的作用。可溶形式的蛋白的預(yù)測(cè)長(zhǎng)度是大約437個(gè)氨基酸(包括肽前導(dǎo)序列，沒(méi)有前導(dǎo)序列是412個(gè)氨基酸)。從先兆子癇患者的血清純化sEng。從44G4-IgG(抗-Eng)瓊脂糖凝膠洗脫級(jí)分4和5,在還原條件下在SDS-PAGE上電泳，并且采用Eng的多克隆抗體通過(guò)蛋白印跡進(jìn)行測(cè)試。對(duì)洗脫的級(jí)分進(jìn)行質(zhì)譜分析(3次運(yùn)行)，并且示出了鑒定的肽(圖30B)。通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行的純化和分析發(fā)現(xiàn)從Gly40到Arg406的一些Eng特異性肽，表明了對(duì)應(yīng)在人內(nèi)皮糖蛋白的序列上以粗體表示的全長(zhǎng)蛋白的N末端區(qū)域的可溶形式(可溶內(nèi)皮糖蛋白)。實(shí)施例3.具有正常妊娠的婦女與先兆子癇妊娠的婦女中的可溶內(nèi)皮糖蛋白的循環(huán)濃度為了對(duì)比正常的、輕度先兆子癇或重度先兆子癇婦女的血清中的循環(huán)的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平，我們對(duì)取自這些婦女的血樣進(jìn)行了ELISA分析。該研究中的所有患者都在獲得合適的IRB批準(zhǔn)的同意書(shū)后在貝絲以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心招募。先兆子癇被定義為(l)妊娠20周后，在以前正常血壓的患者中收縮壓〉140且舒張壓>90,(2)新發(fā)作的蛋白尿(利用浸漬片進(jìn)行尿分析為l+,或24小時(shí)尿收集中的蛋白〉300mg,或隨機(jī)尿蛋白/肌酸酐比〉0.3),和(3)到產(chǎn)后12周，高血壓及蛋白尿消除。排除患基礎(chǔ)高血壓、蛋白尿或腎病的患者。為此研究的目的，基于是否存在腎炎范圍的蛋白尿(24小時(shí)尿收集中的蛋白〉3g或尿蛋白/肌酸酐比大于3.0)，將患者分成輕度先兆子癇和重度先兆子癇。HELLP綜合征定義為患者出現(xiàn)血小;板減少癥(<100000細(xì)月包/fxl)、提高的LDH(〉600IU/L)和提高的AST(〉70IU/L)的跡象。引入健康孕婦作為對(duì)照。將8個(gè)由于其它醫(yī)學(xué)原因而早產(chǎn)的患者引入作為額外的對(duì)照。分娩后立即獲得胎盤樣品。在獲得知情同意書(shū)后，在分娩時(shí)(在胎盤分娩前0-12小時(shí))從孕婦收集血清。這些實(shí)驗(yàn)獲得貝絲以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心的制度評(píng)審委員會(huì)的批準(zhǔn)。采用來(lái)自表1描述的患者血清標(biāo)本，我們測(cè)量了各組先兆子癇患者和對(duì)照妊娠患者的可溶內(nèi)皮糖蛋白循環(huán)濃度。當(dāng)先兆子癇患者進(jìn)一步細(xì)分為具有和不具有HELLP的患者時(shí)，與胎齡匹配的早產(chǎn)對(duì)照相比，輕度、重度和HELLP綜合征先兆子癇中的sEng濃度分別高3、5和10倍(圖28)。妊娠患者中sEng的濃度與sFltl的濃度相關(guān)(R2=0.56)，除了在HELLP組中，sEng比sFltl高。在患者的一個(gè)亞組中，在胎盤分娩后48小時(shí)獲得的血樣顯示先兆子癇和正常妊娠患者中平均sEng循環(huán)水平減少70%(圖29)。表l:各個(gè)患者組的臨床特征和循環(huán)可溶內(nèi)皮糖蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>叩<0.05，*叩<0.005在輕度先兆子癇中，可溶內(nèi)皮糖蛋白的平均血清濃度至少高2倍，而在重度先兆子癇患者中高3-4倍。在并發(fā)HELLP綜合征的先兆子癇患者中，可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度比胎齡匹配的對(duì)照標(biāo)本高至少5-10倍。另外，妊娠患者中的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平與sFltl水平相關(guān)聯(lián)(圖18)。關(guān)聯(lián)的R2值是0.6。(應(yīng)當(dāng)指出，這里報(bào)道的sFlt-l循環(huán)濃度比以前公布的至少高4-5倍(Maynard等，同上)。這是由于來(lái)自R&Dsystems的新ELISA試劑盒的靈敏度的差異，其在測(cè)定稀釋液中缺少尿素，因此總是產(chǎn)生比以前公布的更高的值)。換而言之，具有最高水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白的患者也具有最高循環(huán)水平的sFltl?？扇軆?nèi)皮糖蛋白的起源最可能是胎盤的合胞滋養(yǎng)層，如在我們的胎盤免疫組織化學(xué)上看到的增強(qiáng)染色所證實(shí)的(圖19和20)。這些圖表明，內(nèi)皮糖蛋白蛋白由合胞滋養(yǎng)層表達(dá)，并在先兆子癇中極大地上調(diào)。我們的蛋白印跡數(shù)據(jù)(圖21A和21B)和缺乏通過(guò)RNA印跡可檢測(cè)的可變剪接變體支持以下概念可溶內(nèi)皮糖蛋白可能是膜內(nèi)皮糖蛋白的胞外域的脫落形式。其大小約65kDA，在先兆子癇胎盤中以提高的水平產(chǎn)生，且它在先兆子癇血清中以更高的量循環(huán)。該蛋白在正常孕婦的血清中以低得多的水平存在，并且在非孕婦中幾乎不能檢測(cè)到。先兆子癇胎盤中的可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)比正常妊娠中高4倍"=1-/組，P<0.01)。這些實(shí)驗(yàn)中sEng/Eng的定量顯示正常(0.43)和先兆子癇(0.56)胎盤之間沒(méi)有顯著差異("=10/組，尸=O.力，表明sEng來(lái)源于全長(zhǎng)蛋白，并且在先兆子癇中Eng和sEng類似地增加。以下方法用于本實(shí)施例中描述的一些實(shí)驗(yàn)。免疫組織化學(xué)按照(Leach等，丄"膨/360:1215-1219(2002))的報(bào)道進(jìn)行內(nèi)皮糖蛋白和cx-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)的胎盤樣品的免疫組織化學(xué)。簡(jiǎn)言之，室溫下將從無(wú)先兆子癇的患者(n=10)和患有先兆子癇的患者(n=10)獲得的冷凍胎盤切片載玻片與不含血清的蛋白封閉溶液(DAKO)一起溫育30分鐘，然后在室溫下與第一抗體(小鼠單克隆抗內(nèi)皮糖蛋白1:50稀釋；DAK0)2小時(shí)。然后用磷酸緩沖液洗滌載玻片10分鐘。應(yīng)用第二抗體，即羅丹明綴合的綿羊抗小鼠IgG，1:200稀釋(Biomeda)l小時(shí)。用磷酸緩沖液再次洗涂切片，隨后室溫下與FITC綴合的小鼠抗人SMA(Dako)的1:400稀釋液一起溫育30分鐘。由不知道臨床診斷的病理學(xué)家采用SPOT高級(jí)成像系統(tǒng)(RTSLIDERDiagnosticInstruments,Inc)評(píng)j介內(nèi)皮糖蛋白的免疫反應(yīng)性。ELISA和蛋白印跡用從R&DSystems,MN商購(gòu)的ELISA試劑盒(例如目錄號(hào)DNDG00)并且按照以前的描述(Maynard等，C7z"./"veW.Ill:649-658,2003進(jìn)行ELISA)?；景凑找郧暗拿枋鲞M(jìn)行蛋白印跡(Maynard等，/^7丄，和Kuo等尸rac.^c"d98:4605-4610(2001)))。免疫沉淀(IP)實(shí)驗(yàn)將隨后為蛋白印跡的IP用于鑒別和表征先兆子癇患者的胎盤組織和血清標(biāo)本中的可溶內(nèi)皮糖蛋白。用冷PBS洗滌人胎盤組織，并在勻漿緩沖液[lOmMTris-HCl,pH7.4;15mMNaCl;60mMKC1;1mMEDTA;0.1mMEGTA;0.5%NonidetP-40;5%蔗糖；購(gòu)自Roche(Indianapolis,IN)的蛋白酶混合物]中裂解10分鐘。然后，用抗人單克隆小鼠內(nèi)皮糖蛋白抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc.，SantaCruz，CA),對(duì)胎盤裂解物進(jìn)行免疫沉淀。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，使用免疫純的IgG定向試劑盒(PierceChemicalCo.，Rockford，Illinois,美國(guó))，通過(guò)定向偶聯(lián)3-5mg純化的抗體到2mlA蛋白-瓊脂糖凝膠上，制備免疫親和柱。然后，用含有蛋白酶混合物的RIPA緩沖液充分洗滌柱，并用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液pH2.8洗脫結(jié)合的蛋白。將洗脫液收集在含有1mol/LTris-HCl緩沖液的0.5-ml級(jí)分中。合并含有蛋白的級(jí)分，并用CENTRICON離心濃縮器(MilliporeCorp.,Bedford,Massachusetts,美國(guó))濃縮9至10倍。在4-12%梯度凝膠(Invitrogen)上分離免疫沉淀的樣品，并將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏l,l-二氟乙烯(PVDF)膜上。使用多克隆抗人兔內(nèi)皮糖蛋白第一抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc.,SantaCruz,CA)，通過(guò)蛋白印跡檢測(cè)內(nèi)皮糖蛋白蛋白。銷必T溶^發(fā)潛f白并j2遽《Iz#》^f將來(lái)自先兆子癇患者的血清(10ml)依次加入CMAffi-凝膠藍(lán)和蛋白A瓊脂糖凝膠(Bio-Rad)柱上，以分別除去白蛋白和免疫球蛋白。將流通液緩慢加入綴合于瓊脂糖凝膠的人Eng的mAb44G4IgG的2.5ml柱(Gougos等，/"t/mmw"o.4:83-92，(1992))。用0.02M二乙胺pHn.4洗脫結(jié)合的級(jí)分，立即用1MTrispH7.8中和。合并280nm處的吸光度增加的級(jí)分4和5，57°C下用10mMDTT還原1小時(shí)，并且用0.055M碘乙酰胺烷基化。然后用胰蛋白酶(1:100)完全消化樣品。將凍干的樣品重懸于0.1%三氟乙酸中，注入CapLC(Waters)儀器中。用75pmNanoSeries柱(LCPackings)分離肽，并且用QstarXLMS/MS系統(tǒng)分析。用Mascot檢索引擎(MatnxScience)對(duì)人蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)NCBInr進(jìn)行數(shù)椐檢索。實(shí)施例4.血管發(fā)生的模型測(cè)定內(nèi)皮管測(cè)定可以用作血管發(fā)生的體外模型。將生長(zhǎng)因子減少的Matrigel(7mg/mL,CollaborativeBiomedicalProducts,Bedford,MA)放在預(yù)冷的48孔細(xì)胞培養(yǎng)平板的孔(100pl/孔)中，并在37°C溫育25-30分鐘，以允許聚合。用10。/?；颊哐逄幚淼?-5代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(30,000+在300pi沒(méi)有血清的內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，Clonetics,Walkersville,MD)，鋪板到Matrigel包被的孔上，并在37。C溫育12-16小時(shí)。然后通過(guò)4X倒置相差顯微鏡(NikonCorporation,Tokyo,日本)評(píng)價(jià)管形成，并使用SimplePCI成像分析軟件進(jìn)行分析(管面積和總長(zhǎng)度)。實(shí)施例5.作為婦女的先兆子癇和子癇的診斷指標(biāo)的可溶內(nèi)皮糖蛋白蛋白水平(Romero研究)該研究設(shè)計(jì)用于評(píng)價(jià)在臨床先兆子癇的過(guò)程中是否改變可溶內(nèi)皮糖蛋白和它是否可以用于預(yù)測(cè)婦女的先兆子癇和子癇。在Wayne州立大學(xué)/NICHD圍產(chǎn)期學(xué)部門，底特律，MI的RobertoRomero博士的妨、助下，完成了該研究。如Chaiworapongsa等(TheJournalofMaternal-FetalandNeonatalMedicine,January2005,17(1):3-18)以前所迷，使用庫(kù)存的生物學(xué)樣品數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行了回顧性縱向病例對(duì)照研究。所有婦女都在SoterodelRio醫(yī)院，圣地亞哥，智利登記產(chǎn)前臨床，并直到分娩。在妊娠的前三個(gè)月和次三個(gè)月中，以4周時(shí)間間隔安排產(chǎn)前診斷，且在第三個(gè)三個(gè)月直至分娩，每2周安排產(chǎn)前診斷。對(duì)于下面的6個(gè)時(shí)間間隔中的每一個(gè)，只選擇每位患者的血漿樣品一次妊娠的(1)7-16周，(2)16-24周，(3)24-28周，(4)28-32周，(5)32-37周，和(6)>37周。對(duì)于每個(gè)先兆子癇病例，通過(guò)在臨床診斷先兆子癇時(shí)的胎齡(+/-2周)匹配，選擇一個(gè)對(duì)照。診斷先兆子癇的臨床標(biāo)準(zhǔn)與上面的Chaiworapongsa等以前所述的相同。血漿內(nèi)皮糖蛋白水平的測(cè)量將保存在-70°C的血漿樣品解凍，并使用從R&Dsystems,Minneapolis,MN.(目錄號(hào)DNDG00)商業(yè)上得到的ELISA試劑盒，測(cè)量一批血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用協(xié)方差分析來(lái)評(píng)價(jià)在調(diào)整血液取樣的胎齡和樣品保存時(shí)間間隔后，必然發(fā)展先兆子癇的患者和正常妊娠之間的可溶內(nèi)皮糖蛋白的血漿濃度差異。使用卡方或Fisher準(zhǔn)確檢驗(yàn)來(lái)比較比例。使用的統(tǒng)計(jì)軟件包是SPSSV.12(SPSSInc.,Chicago,IL)。假定的顯著性為p值小于0.05。結(jié)果在表2中描述了研究群體的臨床特征?；加邢日鬃影B的組包括比對(duì)照組更多的未經(jīng)產(chǎn)的婦女，且比對(duì)照組更早分娩。重要的是，先兆子癇組的胎兒出生重量更小，且存在更高比例的攜帶小于胎齡(SGA)嬰兒的婦女。表2.研究群體的臨床特征<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>將值表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差或數(shù)字(％)GA:胎齡在表3中描述了患有先兆子癇的患者的臨床特征。32位(72%)患者患有重度先兆子癇，而IO位患者患有嚴(yán)重的早發(fā)先兆子癇，確定其發(fā)作<34周。表3.患有先兆子癇的患者的臨床特征血壓(mmHg)收縮壓155±15舒張壓100±8平均動(dòng)脈壓118±9蛋白尿(浸漬片)3±0.8天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶a(SGOT)(U/L)29±31血小板計(jì)數(shù)e(xl03)Oi/L)206±59重度先兆子癇32(72.7%)診斷先兆子癇時(shí)的胎齡￡34周10(22.7%)診斷先兆子癇時(shí)的胎齡^37_27(61.4%)將值表達(dá)為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差或數(shù)字(％)"(n=26);e(n=42)在表4中顯示了在6個(gè)胎齡窗中測(cè)量的對(duì)照和先兆子癇婦女的血清可溶內(nèi)皮糖蛋白水平。在先兆子癇中，將她們的樣品分成2組臨床先兆子癇(在先兆子癇癥狀時(shí)采取的樣品)和臨床前先兆子癇(在臨床癥狀之前采取的樣品)。數(shù)據(jù)表明，在中期妊娠(妊娠的24-28周)時(shí)，必然發(fā)展先兆子癇的婦女中的血清可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度開(kāi)始提高，并且到妊娠28-32周變得比對(duì)照高至少3倍。當(dāng)與胎齡匹配的對(duì)照相比較時(shí)，從患有臨床先兆子癇的婦女采取的血液樣品顯示出非常急劇的(幾乎10-15倍)提高。表4.正常妊娠和先兆子癇的血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度正常妊娠P臨床前樣品先兆子癇P臨床樣品先兆子癇P11第l次血液取樣(7.1-16周)3,89±.9280.93.9"1.28可溶內(nèi)皮糖蛋白(ng/ml)12.3±2.20.2ll.(5±2.4胎齡(周)8.4-15.97.7—15.1范圍n一37n=34第2次血液取樣(16.l-24周)3.36±1.110.13.79±1.37可溶內(nèi)皮糖蛋白(ng/ml)19.4±1,70.020.2±2,1胎齡(周)16.3-23.4616.7-24.0范圍n=44n-36第3次血液取樣(24.l-28周)3."±.7290.05.27±4.12可溶內(nèi)皮糖蛋白(ng/ral)25.9±1.309*26.4±1.1胎齡(周)24.1-28.00.22"-28.0范閨n=38n=29第4次血液取樣(28.l-32周)3.7±1.1<0.10.2±9.80.0"96.1±25.70.05可溶內(nèi)皮糖蛋白(ng/ml)29.9±1.100130.2±1.01.030.4±1.41.0胎齡(周)28.3-32.028,7-32.029.4-31.4范圍n=421.0n=33第5次血液取樣(32.卜36.9周)5.79±2.420.010.51±6,59<0.001*43.14±25,6<0.00可溶內(nèi)皮糖蛋白(ng/ml)34,7±1.303*34.8±1.51.034.5±1.2胎齡(周)32.4-36,61.032.6-36.732.6-36.61,0范閨n=37n=20n=13第6次血液取樣(>=37周)8.9±4.5—15.23±0.006可溶內(nèi)皮糖蛋白(ng/ml)39.4±1.010.61胎齡(周)37.0-40,738,8±1.10,05范圍n=2737.6-41.4n=27PP:在先兆子癇的臨床表現(xiàn)時(shí)和正常，的樣品之間比較將值表達(dá)為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差52位先兆子癇患者在臨床表現(xiàn)時(shí)不能獲得血液樣品為了檢查血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度和臨床診斷先兆子癇的時(shí)間間隔之間的關(guān)系，根據(jù)從血液采樣到臨床診斷的時(shí)間間隔，將處于不同胎齡的先兆子癇患者的血漿樣品分成5組(1)在臨床診斷時(shí)，(2)臨床表現(xiàn)前2-5.9周，(3)臨床表現(xiàn)前6-10.9周，(4)臨床表現(xiàn)前11-15.9周，和(5)臨床表現(xiàn)前16-25周。表5中的數(shù)椐證實(shí)，在必然發(fā)展先兆子癇的婦女中，在發(fā)作先兆子癇癥狀之前6-10.9周，血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白水平開(kāi)始提高，且在出現(xiàn)癥狀之前2-5.9周，至少高3倍。表5.正常和先兆子癇孕婦中的血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度血液取樣正常妊娠先兆子癇P左臨M現(xiàn)時(shí)可溶內(nèi)皮糖蛋白(ng/ml)7,63±4.2227.72±26.20<0細(xì)*胎齡(周)37.2±3.037.1±2.70.9范圍28.9-40.7n=4229.4—41.4n=42s臨床表現(xiàn)前2-5,9周4.67±23215.07±10,15<0細(xì)*可溶內(nèi)皮糖蛋白(ng/ml)31.6±3.832.8±2,80,2胎齡(周)24.1-36.327.1-36.7范圍n=27n=273.8±1.1臨床表現(xiàn)前的時(shí)間間隔(周)臨慶裊現(xiàn)前6-10.9周3.61士1,055,89±3.07<0細(xì)*可溶內(nèi)皮糖蛋白(ng/ml)28.5±2.928.5±2.90.9胎齡(周)19,7-32.619.6-34.4范圍n=37n=378.3±1.4臨床表現(xiàn)前的時(shí)間間隔(周)臨慶裊現(xiàn)前11-15.9周3.35±0.773.57±0.920.5可溶內(nèi)皮糖蛋白(tig/tnl)24,5±3.124,2±3.30.8胎齡(周)17.6-27.917.7-28.0范圍n=19n=1913.2±1.3臨床表現(xiàn)前的時(shí)間間隔(周)臨慶表現(xiàn)前16-25周3.44±1.073.69±1,180,3內(nèi)皮糖蛋白(ng/ml)17.6±3.516,5±4.50.2胎齡(周)9.1—23.48.0-22.7范圍n=42n=42臨床表現(xiàn)前的時(shí)間間隔20.6±3.6(周)將值表達(dá)為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差62位先兆子癇患者在臨床表現(xiàn)時(shí)不能獲得血液樣品為了檢查血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度以鑒別必然發(fā)展先兆子癇的患者的診斷潛力，將患者分成早發(fā)先兆子癇(PE<34周)和晚發(fā)先兆子癇(PE〉34周)。對(duì)于患有早發(fā)先兆子癇的患者，從妊娠的約16-24周開(kāi)始，先兆子癇(臨床診斷前)的平均血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白水平顯著高于正常妊娠(表6),其中在24-28周和28-32周妊娠窗口中具有非常大的不同。相反地，對(duì)于患有晚發(fā)先兆子癇的患者，僅僅在28-32周，臨床前先兆子癇的血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度顯著高于正常妊娠，其中在妊娠的32-36周具有非常大的不同(表7)。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>總結(jié)這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，當(dāng)與胎齡匹配的對(duì)照相比較時(shí)，患有臨床先兆子癇的婦女具有非常高水平的循環(huán)可溶內(nèi)皮糖蛋白。結(jié)果還證實(shí)，必然發(fā)展先兆子癇(臨床前先兆子癇)的婦女具有比預(yù)測(cè)正常妊娠的婦女更高的血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白水平。在發(fā)作臨床癥狀前至少6-10周，可以檢測(cè)到可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的增加。最后，這些結(jié)果證實(shí)，早發(fā)和晚發(fā)先兆子癇都具有提高的循環(huán)可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度，但是該變化在早發(fā)先兆子癇中更顯著。實(shí)施例6.作為婦女的先兆子癇和子癇的診斷指標(biāo)的可溶內(nèi)皮糖蛋白蛋白水平(CPEP研究)如上所述，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在先兆子癇胎盤中，上調(diào)可溶內(nèi)皮糖蛋白，即一種促血管發(fā)生蛋白TGF-P的細(xì)胞表面受體，并在內(nèi)皮和合胞滋養(yǎng)層上表達(dá)。在上述實(shí)驗(yàn)中，我們已經(jīng)表明，在先兆子癇中，過(guò)量的可溶內(nèi)皮糖蛋白通過(guò)胞外域的脫落，從胎盤釋放進(jìn)循環(huán)中；可溶內(nèi)皮糖蛋白然后可以與sFltl(—種結(jié)合胎盤生長(zhǎng)因子(PGF)和VEGF的抗血管發(fā)生因子)協(xié)同作用，以造成內(nèi)皮功能障礙。為了檢驗(yàn)該假說(shuō)，我們將發(fā)展先兆子癇的婦女和患有其它妊娠并發(fā)癥(如妊娠高血壓(GH)和并發(fā)小于胎齡(SGA)嬰兒的妊娠)的那些婦女在整個(gè)妊娠過(guò)程中的可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFltl和游離P1GF的血清濃度，與具有血壓正常的對(duì)照妊娠的婦女的所述濃度進(jìn)行了對(duì)比。在NIH的RichardLevme博士的協(xié)助下完成了該研究。該研究有兩個(gè)基本目的。第一個(gè)目的是，確定與血壓正常的對(duì)照相比，在發(fā)作先兆子癇和其它妊娠病癥(如妊娠高血壓或并發(fā)小于胎齡(SGA)嬰兒的妊娠)之前，是否可以檢測(cè)到提高的可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFltl的血清濃度，和降低的P1GF水平。第二個(gè)目的是，在患有先兆子癇、妊娠高血壓或SGA的婦女中，其中分別檢查在發(fā)作臨床癥狀之前和之后得到的樣品，和在血壓正常對(duì)照中，描述可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-l和游離PIGF的產(chǎn)婦血清濃度相對(duì)于胎齡的時(shí)間進(jìn)程。方法臨床信息該研究是4,589位參與鈣預(yù)防先兆子癇試驗(yàn)(CalciumforPre-eclampsiaPreventiontrial)(CPEP)的健康未經(jīng)產(chǎn)婦女群體(cohort)中嵌套(nested)的妊娠并發(fā)癥(過(guò)早的先兆子癇、足月先兆子癇、妊娠高血壓、具有SGA嬰兒的妊娠、血壓正常的對(duì)照妊娠)的病例對(duì)照研究。從每個(gè)研究組中，選擇120個(gè)隨機(jī)病例。研究方法與最近進(jìn)行的先兆子癇的嵌套病例對(duì)照研究相同(Levine等，N.Eng.J.Med.2004,350:672-83)。從每個(gè)婦女得到研究登記之前(13-21周)、在26-29周、在36周和在懷疑高血壓或蛋白尿時(shí)的血液樣品。在生產(chǎn)和分娩開(kāi)始之前的妊娠過(guò)程中的任何時(shí)間收集的所有血清樣品都適合用于研究。病例包括120位婦女，其發(fā)展足月先兆子癇、妊娠高血壓或SGA，且其分娩活產(chǎn)或死產(chǎn)男嬰(無(wú)已知的結(jié)構(gòu)或染色體異常)，且從她們得到基線血清樣品。對(duì)于過(guò)早的先兆子癇，研究了來(lái)自CPEP群體的定義為(PE〈37周)的所有72位患者。在上面的Levine等(2004)中，描述了診斷先兆子癇的臨床標(biāo)準(zhǔn)。在從發(fā)作妊娠高血壓前1天至隨后7天的時(shí)間間隔中，要求所有妊娠高血壓病例都具有正常的尿蛋白測(cè)量。使用Zhang&Bowes的胎齡出生重量表，它是種族、未經(jīng)產(chǎn)和嬰兒性別特異性的，將SGA定義為〈第10和<第5(嚴(yán)重SGA)百分位。從分娩活產(chǎn)或死產(chǎn)嬰兒(無(wú)已知的主要的結(jié)構(gòu)畸形或染色體異常)的沒(méi)有先兆子癇或妊娠高血壓或SGA的婦女，隨機(jī)地選擇對(duì)照，并一個(gè)對(duì)照對(duì)應(yīng)一個(gè)病例地匹配臨床中心、在收集第一個(gè)血清樣品時(shí)的胎齡(±1周)、冷凍貯藏時(shí)間(±1年)和凍融次數(shù)。共研究了1674個(gè)血清樣品。進(jìn)行胎齡的匹配，以控制sFlt-l、VEGF和P1GF水平的胎齡-相關(guān)的差異。進(jìn)行冷凍貯藏時(shí)間的匹配，以使由冷凍貯藏過(guò)程中可能的降解引起的差異最小化。進(jìn)行臨床中心的匹配，以控制先兆子癇比值在不同中心之間顯著不同的事實(shí)，這可能是由于疾病的病理生理學(xué)的差異。此外，中心可能使用略有不同的收集、制備和保存樣品的方法。還進(jìn)行融化次數(shù)的匹配，以確保病例和對(duì)照已經(jīng)同等地進(jìn)行凍融降解。ELISA測(cè)量由不知道臨床結(jié)果的單個(gè)研究助理，在Karumanchi實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行各種血管發(fā)生標(biāo)記的ELISA。從R&Dsystems(Minneapolis,MN)得到可溶內(nèi)皮糖蛋白77(DNDG00)、sFltl(DVR100)、P1GF(DPG00)的商業(yè)上可得到的ELISA試劑盒。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用T-檢驗(yàn)來(lái)對(duì)比對(duì)數(shù)變換后的各種測(cè)量值，以確定顯著性。認(rèn)為PO.05是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。結(jié)果在圖6-8中，顯示了在如該方法中所述的各個(gè)胎齡組窗口期間，5個(gè)不同研究組的妊娠婦女在整個(gè)妊娠中的平均可溶內(nèi)皮糖蛋白(圖6)、sFltl(圖7)和P1GF(圖8)濃度。對(duì)于先兆子癇組和妊娠高血壓組，在這里未顯示在發(fā)作臨床癥狀后采取的樣品。與胎齡-匹配的對(duì)照樣品相比，從過(guò)早的先兆子癇前9-11周開(kāi)始，可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFltl提高，且游離P1GF降低，在先兆子癇發(fā)作后，分別達(dá)到高5倍(46.4vs9.8ng/ml，P<.0001)、3倍(6356vs2316pg/ml，P<.0001)和低4倍(144vs546pg/ml,P〈0001)的水平。對(duì)于足月先兆子癇，可溶內(nèi)皮糖蛋白從12-14周開(kāi)始提高，游離P1GF從9-11周開(kāi)始降低，且sFltl在先兆子癇發(fā)作前<5周提高。在妊娠10-42周，sFltl和游離P1GF的血清濃度在具有SGA或平均胎齡兒/大于胎齡兒(AGA/LGA)嬰兒的妊娠之間沒(méi)有顯著差異。從17-20周開(kāi)始，SGA妊娠的血清可溶內(nèi)皮糖蛋白適度增力口(7.2vs5.8ng/ml，P=03)，與AGA/LGA妊娠中的12.9ng/ml相比，在輕度和嚴(yán)重SGA的37-42周，分別達(dá)到15.7和43.7ng/ml的濃度(嚴(yán)重SGAvsAGA/LGA，P=002)。在妊娠高血壓研究中，與GA-匹配的對(duì)照樣品相比，在妊娠高血壓前<1-5周，可溶內(nèi)皮糖蛋白的適度增加是顯而易見(jiàn)的，在發(fā)作妊娠高血壓后，對(duì)于可溶內(nèi)皮糖蛋白，達(dá)到高2倍的水平(29.7vs12.5ng/ml，P=.002)。在21-32周得到的樣品的調(diào)整的隨后早產(chǎn)PE的優(yōu)勢(shì)比(oddsratio),與所有其它四分位相比，是對(duì)照可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度的最高四分位(〉7.2ng/ml)，為9.8(95%CI4.5-21.5)。將先兆子癇的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)定義為(sFltl+0.25可溶內(nèi)皮糖蛋白)/P1GF。在貫穿5個(gè)不同研究組的各個(gè)胎齡組中，計(jì)算該指數(shù)。在圖9中顯示了在臨床癥狀之前采取的樣品的先兆子癇抗血管發(fā)生的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)。早在妊娠17-20周時(shí)，觀察到提高的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)值，并似乎隨著妊娠向嚴(yán)重過(guò)早的先兆子癇的發(fā)展，變得更急劇。在足月先兆子癇、SGA和GH中，當(dāng)與對(duì)照婦女相比較時(shí)，在妊娠末期(33-36周)存在適度提高。圖10和11描述了根據(jù)臨床過(guò)早的先兆子癇(PE<37周)之前的周數(shù)，可溶內(nèi)皮糖蛋白的平均濃度(圖10)和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)(圖ll)。甚至早在發(fā)作過(guò)早的先兆子癇之前的9-11周，必然發(fā)展先兆子癇的婦女的可溶內(nèi)皮糖蛋白和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)提高2-3倍，其中在臨床癥狀之前的l-5周急劇提高(>5倍)。圖12和13顯示了在癥狀之前和之后，在貫穿足月先兆子癇(PE〉37周)的妊娠中，可溶內(nèi)皮糖蛋白(圖12)和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)(圖13)的變化。從妊娠33-36周開(kāi)始，觀察到可溶內(nèi)皮糖蛋白和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)的提高，在臨床先兆子癇時(shí)達(dá)到平均高2倍的水平。圖14和15顯示了當(dāng)與血壓正常的對(duì)照相比較時(shí)，在妊娠高血壓期間、在妊娠高血壓之前l(fā)-5周(在妊娠的33-36周期間)的婦女中測(cè)得的可溶內(nèi)皮糖蛋白(圖14)和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)(圖15)的適度提高。圖16和17顯示了當(dāng)與對(duì)照妊娠相比4支時(shí)，在33-36周妊娠窗口期間，在患有嚴(yán)重SGA的婦女且不是所有患有SGA的婦女中測(cè)得的可溶內(nèi)皮糖蛋白(圖16)和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)(圖17)的適度提高?？偨Y(jié)該研究的結(jié)果表明，當(dāng)與正常對(duì)照妊娠相比較時(shí)，在妊娠33周之前測(cè)量時(shí)，在必然發(fā)展過(guò)早的先兆子癇的婦女和患有臨床過(guò)早的先兆子癇(PE<37周)的婦女中的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)水平急劇提高。因此可溶內(nèi)皮糖蛋白水平和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)水平(在33周之前)不僅可以用于診斷過(guò)早的先兆子癇，而且可以用于預(yù)測(cè)先兆子癇。似乎早在先兆子癇癥狀之前10-12周，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)水平就開(kāi)始提高。79當(dāng)在妊娠晚期(33-36周妊娠窗)測(cè)量時(shí)，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)水平在足月先兆子癇(PE>37周)中也顯著提高，并在妊娠高血壓和嚴(yán)重SGA中適度提高。因此，當(dāng)在妊娠33周之后測(cè)量時(shí)，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管發(fā)生指數(shù)水平也可以用于鑒別其它妊娠并發(fā)癥，如SGA和妊娠高血壓。實(shí)施例7.可溶內(nèi)皮糖蛋白參與先兆子癇的發(fā)病機(jī)理我們已經(jīng)表明，在先兆子癇胎盤中，上調(diào)可溶內(nèi)皮糖蛋白，即一種促血管發(fā)生蛋白TGF-P的細(xì)胞表面受體，并在內(nèi)皮和合胞滋養(yǎng)層上表達(dá)。我們還已經(jīng)表明，在先兆子癇中，過(guò)量的可溶內(nèi)皮糖蛋白通過(guò)胞外域的脫落，從胎盤釋放進(jìn)循環(huán)中。下面所述的實(shí)驗(yàn)用于檢驗(yàn)下述假說(shuō)，即可溶內(nèi)皮糖蛋白可以與sFltl(—種結(jié)合胎盤生長(zhǎng)因子(P1GF)和VEGF的抗血管發(fā)生因子)協(xié)同作用，以造成內(nèi)皮功能障礙。才才泮十和方法試劑從R&Dsystems(Minneapolis,MN)得到重組人內(nèi)皮沖唐蛋白、人sFltl、小鼠內(nèi)皮糖蛋白、小鼠sFltl、人TGF-pl、人TGF-(33、小鼠VEGF。乂人SantaCruzBiotechnology,Inc.得到針對(duì)人內(nèi)皮糖蛋白N-末端區(qū)的小鼠單克隆抗體(目錄號(hào)sc20072)和多克隆抗體(sc20632)。從R&Dsystems,MN得到人sFltl、小鼠sFltl和人可溶內(nèi)皮糖蛋白的ELISA試劑盒。腺病毒的產(chǎn)生以前已經(jīng)描述了針對(duì)sFltl的腺病毒和對(duì)照腺病毒(CMV)(Maynard等,J.Clin.Invest.111:649:658(2003)),并在RichardMulligan博士的協(xié)助下，在HarvardMedicalCorefacility產(chǎn)生。為了產(chǎn)生可溶內(nèi)皮糖蛋白腺病毒，我們^f吏用了Adeasy試劑盒(Stratagene)。簡(jiǎn)而言之，使用人cDNA全長(zhǎng)內(nèi)皮糖蛋白克隆(Invitrogen,CA)作為模板，并使用下面的寡核苷酸作為引物，PCR擴(kuò)增了人可溶內(nèi)皮糖蛋白(編碼內(nèi)皮糖蛋白的整個(gè)胞外區(qū))正向5'-ACGAAGCTTGAAACAGTCCATTGTGACCTT-3'(SEQIDNO:3),和反向5'TTAGATATCTGGCCTTTGCTTGTGCAACC-3'(SEQIDNO:4)。將擴(kuò)增的PCR片段首先亞克隆進(jìn)pSecTag2-B(Invitrogen，CA)，并確認(rèn)DNA序列。使用pSecTag2B-可溶內(nèi)皮糖蛋白作為模板，PCR擴(kuò)增編碼His-標(biāo)記的人可溶內(nèi)皮糖蛋白的哺乳動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體，并亞克隆進(jìn)pShuttle-CMV栽體(Stratagene;Kpnl和Seal位點(diǎn))，即一種腺病毒轉(zhuǎn)移載體，以用于進(jìn)行腺病毒產(chǎn)生。然后，使用根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，產(chǎn)生表達(dá)可溶內(nèi)皮糖蛋白(sE)的腺病毒，并通過(guò)蛋白印跡確認(rèn)表達(dá)。然后，如以前所述的(Kuo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:4605-4610(2001))，在293細(xì)胞上擴(kuò)增證實(shí)的克隆，并在CsC12密度梯度上進(jìn)行純化。通過(guò)光學(xué)吸光度方法(Sweeney等，Virology,2002,295:284-288),滴定最終產(chǎn)物。以從以前使用基于標(biāo)準(zhǔn)噬斑稀釋的滴定測(cè)定試劑盒(BDBiosciencesClontech,PaloAlto,CA,Cat.No.Kl653-1)和光學(xué)吸光度方法滴定的病毒制備物(prep)衍生的公式為基礎(chǔ)，將滴度表達(dá)為噬斑形成單位(pfu)/mL。蛋白印跡如別處所述(Maynard等，同上)，使用蛋白印跡來(lái)檢查大鼠血漿中腺病毒感染的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。免疫沉淀(IP)實(shí)驗(yàn)將隨后為蛋白印跡的IP用于鑒別和表征先兆子癇患者的胎盤組織和血清樣品中的可溶內(nèi)皮糖蛋白。用冷PBS洗滌人胎盤組織，并在勻漿緩沖液[10mMTris-HCl，pH7.4;15mMNaCl;60mMKC1;1mMEDTA;0.1mMEGTA;0.5%NonidetP-40;5%蔗糖；購(gòu)自Roche(Indianapolis,IN)的蛋白酶混合物]中裂解10分鐘。然后，用抗人單克隆小鼠內(nèi)皮糖蛋白抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc.,SantaCruz，CA)，對(duì)胎盤裂解物進(jìn)行免疫沉淀。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，使用免疫純的IgG定向試劑盒(PierceChemicalCo.,Rockford,Illinois,美國(guó))，通過(guò)定向偶聯(lián)3-5mg純化的抗體到2mlA蛋白-瓊脂糖上，制備免疫親和柱。然后，用含有蛋白酶混合物的RIPA緩沖液充分洗滌柱，并用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液pH2.8洗脫結(jié)合的蛋白。將洗脫液收集在含有1mol/LTris-HCl緩沖液的0.5-ml級(jí)分中。合并含有蛋白的級(jí)分，并用CENTRICON離心濃縮器(MilliporeCorp.，Bedford,Massachusetts,美國(guó))濃縮9至10倍。在4-12%梯度凝膠(Invitrogen)上分離免疫沉淀的樣品，并將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏l,l-二氟乙烯(PVDF)膜上。使用抗人內(nèi)皮糖蛋白的兔多克隆抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc.,SantaCruz，CA)，通過(guò)蛋白印跡^r測(cè)內(nèi)皮糖蛋白。內(nèi)皮管測(cè)定將生長(zhǎng)因子減少的matrigel(7mg/mL,CollaborativeBiomedicalProducts,Bedford,MA)放在預(yù)冷的48孔細(xì)胞培養(yǎng)平板的孔(1001/孔)中，并在37。C溫育30分鐘，以允許聚合。用重組蛋白的各種組合(可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFltl或二者)處理HUVEC細(xì)月包(30,000+在300jal沒(méi)有血清的內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，Clonetics，Walkersville，MD)，鋪平板到Matrigel包被的孔上，并在37°C溫育12-16小時(shí)。然后通過(guò)4X倒置相差顯微鏡(NikonCorporation,東京，日本)評(píng)價(jià)管形成，并使用簡(jiǎn)單PCI成像分析軟件進(jìn)行定量分析(管面積和總長(zhǎng)度)。微血管通透性實(shí)驗(yàn)經(jīng)眶后靜脈叢，給Balb-C小鼠注射1x108pfu表達(dá)GFP或可溶內(nèi)皮糖蛋白或sFltl或其組合的腺病毒，并在48小時(shí)后進(jìn)行樣t血管通透性測(cè)定。通過(guò)腹膜內(nèi)(IP)注射0.5ml阿佛丁，麻醉小鼠。將100ml1%伊文思藍(lán)染料(溶于PBS中)注射進(jìn)尾靜脈。40分鐘后，通過(guò)心臟穿刺，給小鼠灌注含有2mMEDTA的PBS20分鐘。收獲器官(腦、肺、肝、腎)，并在甲酰胺中溫育3天，以洗脫伊文思藍(lán)染料。使用620nm波長(zhǎng)，測(cè)量曱酰胺溶液的OD。腎微血管反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)使用大鼠腎微血管(70-170pm內(nèi)徑)，如以前所述(Maynard等，同上)，進(jìn)行微血管反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)。在所有實(shí)驗(yàn)組中，在用U4M19(血栓烷激動(dòng)劑)預(yù)收縮微血管至在40mmHg擴(kuò)張壓下的基線直徑的40-60%后，檢查腎微血管的松弛反應(yīng)。一旦達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)張力，就以標(biāo)準(zhǔn)化的次序，檢查對(duì)各種試劑(如TGF-pi或TGF-(33或VEGF)的反應(yīng)。所有藥物都是腔外施用的。動(dòng)物模型通過(guò)尾靜脈注射，給妊娠的和非妊娠的Sprague-Dawley大鼠注射2x109pfu腺病毒(AdCMV或AdsFltl或AdsE或AdsFltl+AdsE)。在妊娠的第8-9天(次三個(gè)月早期)注射妊娠的大鼠，并在妊娠的第16-17天(第三個(gè)三個(gè)月早期)測(cè)量血壓。用戊巴比妥鈉(60mg/kg，腹膜內(nèi)地(i.p.))麻醉之后，測(cè)量大鼠的血壓。分離頸動(dòng)脈，并插入與壓力轉(zhuǎn)換器(MillarInstruments,Houston,TX)相連的3-Fr高保真度微尖(microtip)導(dǎo)管。記錄血壓，并求10分鐘時(shí)間段內(nèi)的平均值。在安死術(shù)之前得到血液、組織和尿樣品。在測(cè)量血壓的當(dāng)天(注射腺病毒后第8天)，測(cè)量血漿水平，從而認(rèn)識(shí)到腺病毒注射后7-10天與這些蛋白的表達(dá)的峰水平相對(duì)應(yīng)。通過(guò)蛋白印跡，初步證實(shí)了循環(huán)sFlt-1和可溶內(nèi)皮糖蛋白水平，然后使用商業(yè)上可得到的鼠ELISA試劑盒(R&DSystems,Minneapolis,MN)進(jìn)行定量。通過(guò)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)浸漬片，測(cè)量?jī)煞N尿白蛋白，并使用商業(yè)上可得到的大鼠白蛋白ELISAi式劑盒(Nephrat試劑盒，ExocellInc，Philadelphia,PA)，通過(guò)竟?fàn)幮悦嘎?lián)免疫測(cè)定進(jìn)4亍定量。使用苦味酸比色方法試劑盒(Metra肌酸酐測(cè)定試劑盒，QmdelCorp,SanDiego，CA),測(cè)量尿肌酸酐。使用商業(yè)上可得到的試劑盒(ThermoElectron,Louisville,CO),測(cè)量AST和LDH。使用自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Hemavet850,DrewScientificInc，Oxford,CT)，測(cè)量來(lái)自大鼠血液的血小板計(jì)數(shù)。對(duì)血液外周涂片進(jìn)行瑞特染色，以檢測(cè)循環(huán)血液中的裂紅細(xì)胞。測(cè)量血壓和收集樣品后，處死大鼠，并收獲器官用于組織學(xué)。計(jì)數(shù)產(chǎn)仔數(shù)，并稱量單個(gè)胎盤和胎兒的重量。將收獲的腎置于布安氏液中，用石蠟包埋，切片，并用H&E、PAS或Masson氏三色染料染色。統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比將結(jié)果表達(dá)為平均值士平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)，并通過(guò)使用ANOVA分析方差，進(jìn)行多個(gè)組之間的對(duì)比。當(dāng)p<0.05時(shí)，報(bào)告顯著差異。結(jié)果可溶內(nèi)皮糖蛋白是抗血管發(fā)生分子，并誘導(dǎo)血管功能障礙我們使用血管發(fā)生的體外模型來(lái)理解可溶內(nèi)皮糖蛋白的功能?？扇軆?nèi)皮糖蛋白適當(dāng)?shù)匾种苾?nèi)皮管形成，sFltl的存在會(huì)進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行強(qiáng)化(圖22和圖3)。在先兆子癇中，已經(jīng)報(bào)道除了內(nèi)皮功能障礙外，還存在增強(qiáng)的微血管通透性，如由水腫和增強(qiáng)的依文斯藍(lán)結(jié)合的白蛋白胞外滲漏所證實(shí)的。為了觀察可溶內(nèi)皮糖蛋白是否誘導(dǎo)微血管滲漏，我們使用用可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt腺病毒處理了48小時(shí)的小鼠?？扇軆?nèi)皮糖蛋白和sFltl的組合，誘發(fā)肺、肝和腎中白蛋白滲漏的急劇增加，和腦中的適度滲漏，如使用伊文思藍(lán)測(cè)定所證實(shí)的(圖23)。單獨(dú)的可溶內(nèi)皮糖蛋白誘發(fā)肝中的適度滲漏。重要的是，可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt-l的組合顯示在肝中的疊加作用，表明這些可溶受體可以協(xié)同作用，用于破壞內(nèi)皮完整性，并且誘導(dǎo)顯著的血管損傷和滲漏。這些數(shù)據(jù)表明，可溶內(nèi)皮糖蛋白和SFltl組合是有效的抗血管發(fā)生分子，且可以誘發(fā)顯著的血管滲漏。為了評(píng)價(jià)可溶內(nèi)皮糖蛋白的血流動(dòng)力學(xué)作用，在大鼠腎微血管中進(jìn)行了一系列微血管反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)。我們首先研究了TGF-(31和TGF-p3(內(nèi)皮糖蛋白的兩種已知的配體)的作用。TGF-卩1和TGF-(33都讒發(fā)血管直徑的劑量依賴性的增加。TGF-P1和P3都誘導(dǎo)動(dòng)脈直徑的劑量依賴性增加，而不作為內(nèi)皮糖蛋白配體的TGF-P2未能產(chǎn)生任何顯著的血管舒張(在0.1和1Mg/ml<2%)。重要的是，在過(guò)量可溶內(nèi)皮糖蛋白存在下，兩種TGF-p的作用都顯著減弱(圖24)。在腸系膜血管中也觀察到了TGF-P1和TGF-P3同工型對(duì)血管張力的這種急性影響(圖32)。最后，VEGF和TGF-pl的組合誘發(fā)血管舒張，后者受到過(guò)量可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFltl的阻斷(圖25)。這表明，sFlt和可溶內(nèi)皮糖蛋白可以對(duì)抗血管發(fā)生生長(zhǎng)因子(如VEGF和丁GF-pi)誘發(fā)的生理性血管舒張，并謙發(fā)高血壓?？扇軆?nèi)皮糖蛋白和sFltl的體內(nèi)作用為了評(píng)價(jià)可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFltl對(duì)血管的作用，我們借助于妊娠大鼠中的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)。在妊娠的第8天，通過(guò)尾靜脈將編碼對(duì)照基因(CMV)或可溶內(nèi)皮糖蛋白或sFltl或sFltl+可溶內(nèi)皮糖蛋白的腺病毒注射進(jìn)Sprague-Dawley大鼠。在第17天，才僉查動(dòng)物的先兆子癇表型。表8包括血流動(dòng)力學(xué)和生物化學(xué)數(shù)據(jù)。表8.腺病毒處理的大鼠動(dòng)物模型的血流動(dòng)力學(xué)和生物化學(xué)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>數(shù)據(jù)表示為平均值土s.e.m。MAP-平均動(dòng)脈壓(舒張壓+1/3脈壓)；胎兒重量是以克表示的每組的同窩動(dòng)物的平均重量；尿Alb/肌酸-白蛋白/肌酸酐比值；LDH-乳酸脫氫酶；AST-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶*與對(duì)照組相比P<0.05。首先通過(guò)蛋白印跡證實(shí)了大鼠血漿中sFltl和sEng的表達(dá)(圖36),并且用商購(gòu)ELISA試劑盒對(duì)循環(huán)濃度進(jìn)行定量。對(duì)照、sEng、51"和51{1+sEng組中的sFltl的平均血漿濃度分別是0.64ng/ml，0.66ng/ml，249ng/ml和204ng/ml。這四個(gè)組中的sEng濃度分別是0.39ng/ml，129ng/ml,0.37ng/ml和123ng/ml。單獨(dú)的可溶內(nèi)皮糖蛋白誘發(fā)輕度高血壓。sFltl誘發(fā)高血壓和蛋白尿兩者，如以前所報(bào)道的。在sFltl+sEng組出生的同窩動(dòng)物中觀察到了胎兒生長(zhǎng)受限，可能與胎盤血管缺血和損傷有關(guān)。重要的是，sFltl和可溶內(nèi)皮糖蛋白的組合誘發(fā)嚴(yán)重的高血壓、腎病范圍的蛋白尿、胎兒的生長(zhǎng)限制和發(fā)展HELLP綜合征的生物化學(xué)跡象(提高的LDH、提高的AST和減少血小板計(jì)數(shù))(表8)。通過(guò)揭示裂紅細(xì)胞和網(wǎng)織細(xì)胞增多的外周涂片，證實(shí)了可溶內(nèi)皮糖蛋白+sFltl組中的溶血跡象(圖26A-B)。最后，腎組織學(xué)也證實(shí)了可溶內(nèi)皮糖蛋白組的局灶內(nèi)皮增生和可溶內(nèi)皮糖蛋白+sFlt1組的嚴(yán)重的腎小球內(nèi)皮增生(圖27A-D和33)。注意在圖33中，對(duì)照組在正常限度內(nèi)。注意具有有孔內(nèi)皮的開(kāi)放毛細(xì)血管環(huán)?？扇軆?nèi)皮糖蛋白組顯示內(nèi)皮腫脹，伴隨孔的喪失和部分腔阻塞。注意紅細(xì)胞經(jīng)受損的腔擠壓。盡管可溶內(nèi)皮糖蛋白處理的大鼠的腎的光學(xué)顯微術(shù)沒(méi)有顯示顯著內(nèi)皮增生，但電子顯微術(shù)顯示局灶內(nèi)皮增生。重要的是，接受可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt-l這兩者的動(dòng)物具有嚴(yán)重的腎小球內(nèi)皮增生。聯(lián)合治療組(下圖)顯示大量具有腫脹的內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)血管內(nèi)阻塞。注意盡管有嚴(yán)重的蛋白尿，但相對(duì)保留了足細(xì)胞足突(以箭頭顯示)。在Fltl+sEng組中觀察到了母體-胎兒連接處的胎盤的廣泛血管損傷，包括梗塞，但在對(duì)照大鼠中或用任一單獨(dú)試劑處理的大鼠中沒(méi)有觀察到(圖34A-H)。在Fltl和sEng組中注意到了巨細(xì)胞層(相應(yīng)于人侵入性滋養(yǎng)層)的彌漫性炎癥，并且比聯(lián)合治療組高。肝組織學(xué)顯示了sFltl+sEng組中的局部缺血的體征和壞死區(qū)，類似于具有HELLP綜合征的患者中見(jiàn)到的那些(圖34A-H)。當(dāng)將sFltl+sEng注射到非妊娠大鼠中時(shí)也見(jiàn)到了嚴(yán)重母體血管損傷的體征，表明在妊娠大鼠中觀察到的表型是由于對(duì)母體血管的直接影響，并且不需要胎盤。3々士w-口這些結(jié)果證實(shí)，可溶內(nèi)皮糖蛋白在先兆子癇胎盤中受到上調(diào)，且在先兆子癇患者中以非常高的水平存在。最高水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白存在于患有HELLP綜合征的患者中，該HELLP綜合征是先兆子癇的最嚴(yán)重形式之一。這些結(jié)果還證實(shí)，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平與妊娠患者中提高的sFltl相關(guān)聯(lián)，且在存在更高的循環(huán)sFltl水平的那些患者中更高。此外，這些結(jié)果證實(shí)，可溶內(nèi)皮糖蛋白是抗血管發(fā)生分子，并在許多內(nèi)皮測(cè)定(如血管發(fā)生測(cè)定、4效血管通透性測(cè)定和擺t血管反應(yīng)性實(shí)驗(yàn))中破壞內(nèi)皮功能。重要的是，可溶內(nèi)皮糖蛋白可以放大sFltl在這些體外內(nèi)皮測(cè)定中的毒性結(jié)果。而且，在體內(nèi)測(cè)定中，可溶內(nèi)皮糖蛋白的腺病毒表達(dá)誘發(fā)輕度高血壓，而沒(méi)有任何顯著的蛋白尿。但是，在有sFltl存在下，可溶內(nèi)皮糖蛋白誘發(fā)顯著的血管損傷，如由嚴(yán)重高血壓、蛋白尿、腎小球內(nèi)皮增生、HELLP綜合征的發(fā)展和胎兒生長(zhǎng)限制的存在所證實(shí)的。可溶內(nèi)皮糖蛋白釋放的機(jī)理可能是內(nèi)皮糖蛋白分子的胞外區(qū)的蛋白酶切割。在先兆子癇組織中受到上調(diào)的特定蛋白酶可以作為候選分子。一個(gè)實(shí)例是膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MT1-MMP),已經(jīng)表明它切割(3聚糖，即與內(nèi)皮糖蛋白共有相似性的一種分子(Velasco-Loyden等，J.Biol.Chem.279:7721-33(2004))。因此，這些蛋白酶的抑制劑可以作為治療先兆子癇的有價(jià)值的靶。實(shí)施例8.可溶內(nèi)皮糖蛋白抑制TGF-P1和TGF-P3介導(dǎo)的NOS依賴性血管舒張eNOS是一種Ca^M丐調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的一氧化氮(NO)合酶，其可以由流體剪切應(yīng)力和神經(jīng)體液刺激激活。內(nèi)皮來(lái)源的NOS是一種非常有效的血管松弛劑，導(dǎo)致系統(tǒng)血壓調(diào)節(jié)、血管通透性和血管發(fā)生。實(shí)際上，VEGF對(duì)血管發(fā)生和血管張力的作用部分由eNOS的激活介導(dǎo)，這是通過(guò)增加的eNOS/Hsp90締合和Serl177上的Akt依賴性eNOS磷酸化。我們最近證明了先兆子癇患者血清中胎盤來(lái)源的sF111的增加是抗血管發(fā)生的，并且誘導(dǎo)高血壓，這可能實(shí)際上反映了VEGF依賴性eNOS激活的受損(Maynard等，同上)。最近，已經(jīng)顯示eNOSThr495的去磷酸化在Sedl77磷酸化之前，并且這些協(xié)調(diào)的事件決定了內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS活性(Flemmg等，O.to.88:E68-75(2001))?？紤]到VEGF對(duì)降低經(jīng)eNOS激活的血管反應(yīng)性的作用和最近證明了內(nèi)皮糖蛋白調(diào)節(jié)eNOS依賴性血管舒縮活性(Toporsian等，Oc.W化96:684-692(2005)),我們?cè)u(píng)估了TGF-P同工型的血液動(dòng)力學(xué)作用和可溶內(nèi)皮糖蛋白在分離的大鼠腎微血管中的作用。如實(shí)施例7和圖24和25中的描述，TGF-P1和-P3都誘導(dǎo)動(dòng)脈直徑的劑量依賴性增加，這由可溶內(nèi)皮糖蛋白顯著減弱。以前沒(méi)有認(rèn)識(shí)到TGF-P1和-P3同工型對(duì)血管張力的急性作用，并且在腸系膜血管中也觀察到了這種作用(圖32)。在先兆子癇患者中，VEGF和TGF-P1對(duì)血管舒張具有疊加作用，這被指出濃度的sEng+sFltl阻斷(圖25和35A)。L-NAME阻斷TGF-P1和VEGF介導(dǎo)的血管舒張，表明NOS依賴性反應(yīng)(圖35A)。這些數(shù)據(jù)表明循環(huán)sFltl和sEng可以對(duì)抗由這些血管發(fā)生生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的生理性NO依賴性血管舒張，導(dǎo)致見(jiàn)于先兆子癇中的高血壓的發(fā)展。實(shí)施例9.可溶內(nèi)皮糖蛋白抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的TGF-P1結(jié)合和信號(hào)傳遞考慮到內(nèi)皮糖蛋白是TGF-P1和-P3同工型的共同受體，我們假定可溶內(nèi)皮糖蛋白通過(guò)干擾細(xì)胞表面受體結(jié)合而起作用。用重組可溶內(nèi)皮糖蛋白預(yù)先溫育放射性標(biāo)記的TGF-P，在50和100pM都顯著減少了其與II型TGF-P受體(TPRII)的結(jié)合(圖35B)。因此，可溶內(nèi)皮糖蛋白與TGF-P1竟?fàn)幗Y(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞上的其受體。為了測(cè)試這是否導(dǎo)致信號(hào)傳遞受損，在人內(nèi)皮細(xì)胞中評(píng)估了CAGA-Luc報(bào)道構(gòu)建體的活性。TGF-p1誘導(dǎo)Smad2/3依賴性CAGA-Luc報(bào)道物的激活，并且，用可溶內(nèi)皮糖蛋白處理消除了該反應(yīng)(圖35C)。實(shí)施例10.可溶內(nèi)皮糖蛋白阻斷TGF-(31介導(dǎo)的eNOS激活考慮到我們的發(fā)現(xiàn)，即TGF-P1誘導(dǎo)腎和腸系膜抗性血管中的NOS依賴性血管舒張，我們研究了它對(duì)eNOS激活的直接作用。盡管TGF-P1對(duì)eNOSSerl177磷酸化沒(méi)有作用，它誘導(dǎo)Thr495上的顯著去磷酸化(圖35D),表明TGF-P調(diào)節(jié)eNOS激活中的關(guān)鍵殘基的磷酸化狀態(tài)。這種作用由可溶內(nèi)皮糖蛋白顯著減弱(圖35D)。綜上所述，實(shí)施例8-10的結(jié)果證明了可溶內(nèi)皮糖蛋白干擾內(nèi)皮細(xì)胞中的TGF-P受體結(jié)合和下游信號(hào)傳遞，并且減弱eNOS激活?？扇軆?nèi)皮糖蛋白和sFlt-l可以協(xié)同作用，從而抑制VEGF和TGF-P信號(hào)傳遞途徑導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞依賴性NO激活和血管舒縮作用。實(shí)施例11.血管發(fā)生因子的順序改變可以鑒定有先兆子癇或子癇風(fēng)險(xiǎn)的女性在上文描述的實(shí)施例中，我們顯示了sFltl和可溶內(nèi)皮糖蛋白(sEng)都與先兆子癇的致病密切相關(guān)。在下文描述的實(shí)施例中，我們測(cè)量了在妊娠期間前瞻性隨訪的女性的妊娠前三個(gè)月和次三個(gè)月采集的配對(duì)血清標(biāo)本中sFltl和sEng的濃度，詳細(xì)鑒定了其妊娠結(jié)局，以確定妊娠前三個(gè)月和次三個(gè)月之間這些標(biāo)記物的順序改變是否與先兆子癇的發(fā)展相關(guān)。材料和方法研究群體我們進(jìn)行了在馬薩諸塞普通醫(yī)院產(chǎn)科孕婦研究(MOMS)中注冊(cè)的女性的前瞻性、嵌套的病例-對(duì)照研究，這些方法以前已經(jīng)有描述(Thadhani等，0&,".Gy"eco/.97:515-20(2001)和Wolf等，OZ)We/.G少"eco/.98:757-62(2001))。簡(jiǎn)言之，在1998年建立MOMS隊(duì)列，用于妊娠早期危險(xiǎn)因子的前瞻性研究，所述危險(xiǎn)因子是針對(duì)妊娠晚期的不良結(jié)局。接受馬薩諸塞普通醫(yī)院和附屬健康中心的產(chǎn)前護(hù)理的女性符合選入隊(duì)列的條件。對(duì)于本研究，在妊娠的第12周或之前入選MOMS隊(duì)列，并且在20周后分娩的、在2001年6月1日-2003年5月1日之間具有單一妊娠的連續(xù)女性符合入選標(biāo)準(zhǔn)。病例(n^39)定義為在妊娠的前三個(gè)月和次三個(gè)月采血，隨后發(fā)展先兆子癇的女性，對(duì)照(nH47)是入選相同隊(duì)列、足月分娩(〉37周)并且在妊娠過(guò)程中保持正常血壓、正常血糖并且沒(méi)有出現(xiàn)蛋白尿跡象的連續(xù)同時(shí)期女性。病例和對(duì)照是年齡(土歲)和體重指數(shù)(土1kg/m"匹配的，考慮被這些暴露因素混淆的可能性(Thadhani等，G^""'o/.94:543-50(1999))。所有受試者提供了書(shū)面知情同意書(shū)，并且該研究得到馬薩諸塞普通醫(yī)院研究評(píng)審委員會(huì)的批準(zhǔn)。主要暴露在所有女性中，第一次產(chǎn)前隨訪時(shí)(11-13周)采集血樣，在妊娠的次三個(gè)月時(shí)(17-20周)再次采集血樣。采集后，將樣品保存在-80C下用于以后的分析。主要暴露是用商購(gòu)ELISA試劑盒(R&Dsystems,Minneapolis,MN)測(cè)量的血清sFltl和sEng(Maynard等，珂上和Venkatesha等，淑A^/.12:642-9(2006))。sFltl和sEng的測(cè)定內(nèi)精確變異系數(shù)分別是3.5和3.2%。sFltl和內(nèi)皮糖蛋白的測(cè)定間精確變異系數(shù)分別是8.1和9.5%。以雙份測(cè)定所有樣品，并且如果雙份之間存在超過(guò)10%的變異，則重復(fù)測(cè)定，并且報(bào)告平均值。由對(duì)病例狀況不了解的人進(jìn)行所有測(cè)定。對(duì)樣品隨機(jī)排序，用于分析。協(xié)變量和混淆因素電子醫(yī)學(xué)記錄(EMR),即在馬薩諸塞普通醫(yī)院使用的醫(yī)學(xué)記錄，提供了前瞻性詳細(xì)描述妊娠到產(chǎn)后早期階段的事件的臨床和人口統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。在基線(第一次產(chǎn)前隨訪)和所有后續(xù)產(chǎn)前隨訪采集的獲自EMR的特定信息包括年齡、種族、身高、體重、吸煙狀況、從末次月經(jīng)估計(jì)并且通過(guò)超聲波證實(shí)的胎齡、血壓以及尿分析和胎兒胎齡估計(jì)結(jié)果。所有妊娠結(jié)果信息也進(jìn)入EMR中，包括葡萄糖耐受測(cè)試的結(jié)果和其它常規(guī)測(cè)量的實(shí)驗(yàn)室值，以及分娩特征，如出生體重、分娩途徑和先兆子癇的診斷。主要結(jié)果通過(guò)詳細(xì)檢查醫(yī)學(xué)記錄而證實(shí)所有妊娠結(jié)果，包括產(chǎn)前流程表和實(shí)驗(yàn)室測(cè)量值。在每次產(chǎn)前隨訪時(shí)，用標(biāo)準(zhǔn)血壓計(jì)從右臂獲得血壓，其中女性在靜息3-5分鐘后以坐位測(cè)量。對(duì)于每個(gè)患者，基于右中臂圍，選擇合適的袖帶大小。記錄與第一次(收縮)和第5次(舒張)Korotkoff音的時(shí)間符合的血壓測(cè)量值。該研究的所有受試者都沒(méi)有以前存在的高血壓或糖尿病的病史，在MOMS網(wǎng)絡(luò)內(nèi)開(kāi)始和完成她們的產(chǎn)前護(hù)理和妊娠，產(chǎn)下活嬰兒，并且在分娩后6周沒(méi)有高血壓的跡象。先兆子癇定義為妊娠20周后收縮壓升高到至少140mmHg或舒張壓升高到至少90mmHg，伴有蛋白尿，即通過(guò)浸漬片測(cè)量2+或更高，或不存在尿路感染的情況下至少300mg/24h(ACOGCommitteeonPracticeBulletins—Obstetrics.ACOGpracticebulletin,diagnosisandmanagementofpreeclampsiaandeclampsia.33號(hào)，2002年1月.(9Z)欲fQy"eco/.99:159-67)。先兆子癇分析為足月先兆子癇(^37周)和早產(chǎn)先兆子癇(<37周)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析適當(dāng)用卡方檢驗(yàn)或斯氏t檢驗(yàn)比較人口統(tǒng)計(jì)和臨床特征?？紤]到它們的傾斜分布，需要對(duì)主要暴露進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換(Levine等，(2004),J:,Levine等，ME"g/.J.M^/.355:992-1005(2006))。主要暴露作為連續(xù)變量檢驗(yàn)，并且具有基于對(duì)照的天然分布的切割點(diǎn)和三級(jí)(tertile)分析，并且為臨床解釋而進(jìn)行簡(jiǎn)化。用對(duì)數(shù)回歸技術(shù)進(jìn)行多次回歸分析。所有P值都是雙尾的，并且P值〈0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。CPEP研究中血管發(fā)生標(biāo)記物的二級(jí)分析在來(lái)自上文描述的CPEP隊(duì)列內(nèi)的最近公開(kāi)的嵌套病例對(duì)照研究的早期妊娠期間，我們也進(jìn)行了血管發(fā)生因子改變的二級(jí)分析。我們以三個(gè)不同的時(shí)間間隔，即10-12周、13-16周和17-20周，分析了來(lái)自正常血壓的女性、在37周前發(fā)展先兆子癇的女性和在37周后發(fā)展先兆子癇的女性的樣品。結(jié)果人口統(tǒng)計(jì)和臨床特征MOMS研究群體的基線和分娩特征展示于表9。兩組之間的年齡和體重指數(shù)沒(méi)有顯著差異。隨后發(fā)展先兆子癇的女性在第一次產(chǎn)前隨訪時(shí)具有更高的收縮壓和舒張壓。在表現(xiàn)先兆子癇時(shí)，如預(yù)期的，收縮壓和舒張壓在先兆子癇組中更高。表9.人口統(tǒng)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>BMI=體重指數(shù)；DBP-舒張壓；SBP=收縮壓UTP=以mg/L表示的尿總蛋白；SPOT=尿蛋白/肌酸酐比值值是平均值±S.D.正常和先兆子癇妊娠中sFltl和sEng在妊娠的前三個(gè)月和次三個(gè)月中的水平在妊娠的前三個(gè)月，與具有正常妊娠的女性相比，患有先兆子癇的女性中sFltl的平均血清水平更高，分別是3.49土0.35ng/ml與3.03±0.13ng/ml(P=NS)。在妊娠的次三個(gè)月中，與正常組的3.10土0.15ng/ml相比，先兆子癇組中的sFltl的平均血清水平顯著更高，平均值是4.12土0.5ng/ml(P<0.01)(表10)。與正常女性相比，在患有先兆子癇的女性中，認(rèn)為在妊娠的前三個(gè)月沒(méi)有顯著差異的平均血清sEng水平在次三個(gè)月中顯著改變，分別是在前三個(gè)月中是6.9土0.32ng/ml與6.57±0.17ng/ml(P-NS),和在次三個(gè)月中是6.37土0.38ng/ml與5.23±0.12ng/ml(P=0.004)(表10)。表10.sFlt和sEng的血清水平<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>圖37圖示了在正常、所有先兆子癇女性和具有少于37周的先兆子癇的女性中的5或d(妊娠的前三個(gè)月和次三個(gè)月的sFltl和sEng值之間的差異)。在正常妊娠中，妊娠的前三個(gè)月和次三個(gè)月之間sFltl的改變非常小(dsFltl咱.05±0.15ng/ml)。dsFltl在發(fā)展先兆子癇的女性中比正常女性中相對(duì)更高，分別是0.713±0.47ng/ml與0.0497±0.15ng/ml(P=0.08)。類似地，在具有少于37周的先兆子癇的女性中，dsFltl更高，是0.634±0.91ng/ml。在正常妊娠中，妊娠的前三個(gè)月和次三個(gè)月之間sEng水平有下降(-1.322±0.18ng/ml)。該下降在患有先兆子癇的患者中減少，dsEng是-0.441±0.42ng/ml(P=0.04)。在具有少于37周的先兆子癇的女性中，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的下降減少，并且似乎是相反方向的趨勢(shì)(0.732土0.77ng/ml,與對(duì)照相比P<0.01)。預(yù)測(cè)性算法為了觀察這些改變是否可以用作重度早發(fā)先兆子癇的預(yù)測(cè)性測(cè)試，我們觀察了正常血壓女性和發(fā)展先兆子癇，特別是早產(chǎn)先兆子癇的女性的乘積(sFltlxsEng的值)，作為乘積-1(在妊娠的前三個(gè)月)和乘積-2(在妊娠的次三個(gè)月)。乘積-1和乘積-2在先兆子癇患者中都顯著升高，并且重要的是與正常對(duì)照中的負(fù)值不同，5乘積(d乘積)是顯著正的(圖38)。此外，與正常對(duì)照相比，患有早產(chǎn)先兆子癇的患者中d乘積顯著增大(P^.004)。為了評(píng)估血管發(fā)生因子的水平改變與早產(chǎn)先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，我們?cè)卺槍?duì)種族/種族劃分、體重指數(shù)和采集標(biāo)本時(shí)的胎齡進(jìn)行校正后，在d乘積濃度分布的最高類別針對(duì)較低的兩個(gè)類別計(jì)算了早產(chǎn)先兆子癇的校正的讓步比(aOR)和95。/。置信區(qū)間(95Q/。CI)(圖39)。與5乘積小于-1的女性相比，在5乘積水平高于+l[aOR5.5，95%CI1.4-22.4]的組中觀察到了早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的顯著增加。CPEP嵌套病例對(duì)照研究的二級(jí)分析在CPEP試驗(yàn)的女性亞組中，在保持正常血壓的女性隊(duì)列中，在10-12周和13-16周之間sFltl的平均值從3.68ng/ml增加到4.92ng/ml,并且在17-20周減少到4.29ng/ml,而在具有早產(chǎn)先兆子癇的女性中，在妊娠的10-12、13-16和17-20周，sFltl的平均值從3.44ng/ml增加到4.22ng/ml,并且進(jìn)一步增加到5.39ng/ml。在具有足月先兆子癇的女性中該模式不明顯(表ll)。表11.CPEP試驗(yàn)中的sFlt和sEng血清水平<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>在sEng的水平方面觀察到了相似結(jié)果。在正常血壓的女性中，在10-12周和13-16周sEng的水平從6.8ng/ml增力。到7.07ng/ml,并且隨后在17-20周減少到5.78ng/ml，而在具有早產(chǎn)先兆子癇的女性中，在0-12、13-16和17-20周，內(nèi)皮糖蛋白的水平從7.15ng/ml增加到7.95ng/ml，并且進(jìn)一步增加到10.19ng/ml。在具有足月先兆子癇的女性中注意到了相同趨勢(shì)，其中在10-12、13-16和17-20周，sEng的平均水平從7.41ng/ml增加到7.80ng/ml再增加到8.34ng/ml。總結(jié)sFlt1和sEng在必然發(fā)展先兆子癇的患者的妊娠的次三個(gè)月期間都升高。正常妊娠的特征在于從妊娠的前三個(gè)月到次三個(gè)月sEng降低，而sFltl沒(méi)有顯著改變。但是，在發(fā)展先兆子癇，特別是早產(chǎn)先兆子癇的患者中，sFltl和sEng都繼續(xù)從前三個(gè)月到次三個(gè)月增加。妊娠的前三個(gè)月和次三個(gè)月中sFltl和sEng的改變都可以用于篩選對(duì)于隨后發(fā)展早產(chǎn)先兆子癇具有高風(fēng)險(xiǎn)的患者。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于預(yù)測(cè)早產(chǎn)先兆子癇具有重要意義。尋求安全、可靠的先兆子癇測(cè)試是研究者多年來(lái)的目標(biāo)。以前的努力集中在檢測(cè)疾病的早期表現(xiàn)，如微白蛋白尿、體重增加和血漿體積改變。在一個(gè)大的中間分析中，Conde-AgudeloA等分析了7,191篇潛在相關(guān)的文章中的87篇(211,369名女性)，以評(píng)估臨床、生物物理和生化測(cè)試在預(yù)測(cè)先兆子癇中的有用性。他們得出結(jié)論，從2004年開(kāi)始，沒(méi)有用于預(yù)測(cè)先兆子癇發(fā)展的臨床上有用的篩選測(cè)試(12)。在本研究中，我們證明了sFltl和sEng的水平在必然發(fā)展先兆子癇的女性中，在她們的妊娠的前三個(gè)月和次三個(gè)月中，在臨床發(fā)病前數(shù)周到數(shù)月升高(通過(guò)作為個(gè)體患者中的S測(cè)量)。這些改變?cè)诎l(fā)展早產(chǎn)先兆子癇的女性中更顯著。、、，、、、、，--,^、，'己兆子癇胎盤的特征在于植入淺和異常血管重塑，包括受損的假血管發(fā)生(Fisher等，5"e麵C'e〃腸/.4:183-8(1993))。認(rèn)為這些胎盤改變發(fā)生在妊娠的12-18周，并且對(duì)于大多數(shù)重度早發(fā)先兆子癇的致病是重要的。認(rèn)為這些胎盤形成異常導(dǎo)致誘導(dǎo)母體先兆子癇綜合征的系統(tǒng)因素的確立。如本文和PCT申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO2004/008946,WO2005/077007和WO2006/034507中的描述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)sFltl和sEng這兩種抗血管發(fā)生蛋白都在先兆子癇中升高，不僅在臨床疾病期間，而且在癥狀發(fā)作前幾周就升高(Levme等，(2006),同上)。重要的是，這兩種因子都參與誘導(dǎo)大鼠中的先兆子癇樣綜合征(Maynard等，/^J:,Venkatesha等，^/2)。但是，由于血管發(fā)生因子在母體循環(huán)中的濃度的改變發(fā)生在妊娠相對(duì)晚期，這些抗血管發(fā)生因子的產(chǎn)生增加，可能是反應(yīng)于異常胎盤形成而發(fā)生的繼發(fā)現(xiàn)象。采用胎盤絨毛外植體的體外數(shù)據(jù)和原代細(xì)胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)研究提示除了在誘導(dǎo)母體內(nèi)皮功能障礙中的作用，抗血管發(fā)生因子可以參與細(xì)胞滋養(yǎng)層遷移和分化。我們發(fā)現(xiàn)正常妊娠中抗血管發(fā)生因子的水平從妊娠的前三個(gè)月到次三個(gè)月降低，但在后來(lái)發(fā)展早產(chǎn)先兆子癇的妊娠中不降低，這表明循環(huán)血管發(fā)生因子的異常與胎盤分化異常同時(shí)發(fā)生。先兆子癇患者中循環(huán)sFlt1和sEng的濃度增加的病因?qū)W是未知的。認(rèn)為缺氧、基因或免疫因素起作用。值得注意的是sFltl和sEng的表達(dá)在體內(nèi)和體外胎盤缺氧模型中都反應(yīng)于缺氧而增加，其中HIF-1介導(dǎo)表達(dá)的增力口(Nevo等，/4wJ尸/z乂s7C)//egw//"fegrCom/尸/^s7'o/.291:R1085-93(2006))。此外，認(rèn)為在正常妊娠期間，胎盤在妊娠早期缺氧，這種缺氧隨著妊娠的次三個(gè)月期間向胎盤的血流增加而消失。盡管在先兆子癇妊娠中從未正式記載缺氧，但認(rèn)為缺氧對(duì)于大多數(shù)先兆子癇妊娠具有關(guān)鍵作用，這是基于增加的缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和到達(dá)胎盤的多普勒血流受阻的替代證據(jù)。我們的發(fā)現(xiàn)，即sFltl和sEng相對(duì)于正常妊娠(其中妊娠的前三個(gè)月和次三個(gè)月之間降低)在重度先兆子癇患者中都保持升高，提示胎盤局部缺血可能實(shí)際上在先兆子癇患者中這些抗血管發(fā)生蛋白的產(chǎn)生增加中起作用。概括起來(lái)，sFlt和sEng的順序改變看起來(lái)能夠鑒定必然發(fā)展先兆子癇的女性，特別是隨后發(fā)展早產(chǎn)先兆子癇的女性。我們的發(fā)現(xiàn)在具有更大樣本大小的代表性研究中得到再現(xiàn)(表ll)。實(shí)施例12.內(nèi)皮糖蛋白是TGF-P1誘導(dǎo)的eNOSThr495去磷酸化必須的鼠內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源于￡^+/+和E"g:小鼠胚胎(E8.5),并且如Balconi等(」勿譜c/e廣77z麵6.化vc.20:1443-51(2000))中的描述生長(zhǎng)。使匯合的單層血清饑餓2小時(shí)，并且在有或無(wú)TGF-P1(U5和250pM)的條件下刺激15分鐘。立即在含10mMTris-HCl的1%TritonX-100中制備細(xì)胞提取物，并且補(bǔ)充蛋白酶和磷酸酶抑制劑。對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量，并且采用eNOS的Thr495的磷酸特異性pAbs(CellSignaling)和總eNOS的mAb(BDBiosciences)通過(guò)蛋白印跡進(jìn)4亍分析。圖40A所示的代表性蛋白印跡和圖40B所示的相關(guān)圖(n4次實(shí)驗(yàn)的平均值)證明小鼠Eng崇內(nèi)皮細(xì)胞而不是E"gi細(xì)胞中的TGF-P1誘導(dǎo)的(**與基線相比PO.Ol)eNOSThr495去磷酸化。該結(jié)果提示了內(nèi)皮糖蛋白在將TGF-P1信號(hào)傳遞連接于eNOSThr495去磷酸化和激活中的關(guān)鍵作用。此外，考慮到該過(guò)程是內(nèi)皮糖蛋白依賴性的，可以用可溶內(nèi)皮糖蛋白抑制該過(guò)程，推定是通過(guò)結(jié)合并且抑制TGF-P1。其它實(shí)施方案為了解釋的目的，提供了本發(fā)明的具體的實(shí)施方案的描述。它們不意欲是窮盡性的，也無(wú)意將本發(fā)明的范圍限制為本文所述的具體形式。盡管已經(jīng)參照幾個(gè)實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離如權(quán)利要求書(shū)所述的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行各種修改。本文中提到的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物均引作參考，包括PCT申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO2004/008946，WO2005/077007和WO2006/034507;美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20060067937和20070104707;以及美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/852,761。其它實(shí)施方案在權(quán)利要求書(shū)中。權(quán)利要求1.治療或預(yù)防受試者中的妊娠相關(guān)高血壓病癥的方法，所述方法包括給所述受試者施用能夠提高NOS的表達(dá)水平或生物活性的化合物的步驟，其中所述施用的時(shí)間和量足以治療或預(yù)防所述受試者中的所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述NOS是eNOS。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述化合物增加eNOS的Ser1177的磷酸化。_4.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是VEGF或其生物活性片段。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述VEGF是VEGF121、VEGF165或VEGF的修飾形式，或其生物活性片段。6.權(quán)利要求25的方法，其中所述化合物是P1GF或其生物活性片段。7.權(quán)利要求2的方法，其中所述化合物增加eNOS的Thr495的去磷酸化。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述化合物選自TGF-P1、TGF-P3、激活蛋白A、BMP-2、BMP-7及其生物活性片段。9.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括給所述受試者施用能夠降低可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)或可溶內(nèi)皮糖蛋白生物活性的化合物，其中所述施用足以治療或預(yù)防所述受試者中的所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述化合物是特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的純化抗體或可溶內(nèi)皮糖蛋白抗原結(jié)合片段。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽或其片段，所述多肽或其片段包含選自圖30B所示人內(nèi)皮糖蛋白序列的氨基酸26-437、40-406或26-587的氨基酸序列。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白上的表位，所述表位包含圖30B所示人內(nèi)皮糖蛋白序列的氨基酸40-86、144-199、206-222、289-304或375-381。13.權(quán)利要求9的方法，其中所述化合物是抑制選自基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、組織蛋白酶和彈性蛋白酶的蛋白水解酶的化合物。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥的特征在于與正常參照相比提高的sFlt-l水平。15.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括給所述受試者施用能夠降低sFlt-l表達(dá)水平或sFlt-l生物活性的化合物，其中所述施用足以治療或預(yù)防所述受試者中的所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述化合物是結(jié)合sFlt-l的純化的生長(zhǎng)因子或抗體或抗原結(jié)合片段。17.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者是妊娠的人、分娩后的人或妊娠的非人類。18.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括監(jiān)測(cè)所述受試者中的所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥，其中所述監(jiān)測(cè)包括測(cè)量來(lái)自所迷受試者的血清或血漿樣品中可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平，其中低于25ng/ml的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平表明所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥的改善。19.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括監(jiān)測(cè)所述受試者中的所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥，其中所述監(jiān)測(cè)包括測(cè)量來(lái)自所述受試者的樣品中可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平，其中測(cè)量所述水平是在兩種或多種場(chǎng)合下完成，并且測(cè)量之間所述可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的降低是所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥改善的指標(biāo)。20.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括監(jiān)測(cè)所述受試者中的所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥，其中所述監(jiān)測(cè)包括測(cè)量來(lái)自所迷受試者的樣品中可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平并且將所述水平與陽(yáng)性參照樣品比較，其中可溶內(nèi)皮糖蛋白水平相對(duì)于所述陽(yáng)性參照樣品的降低，表明所述受試者中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥的改善。21.權(quán)利要求18-20的任一項(xiàng)的方法，其中用所述監(jiān)測(cè)來(lái)確定化合物的治療劑量。22.權(quán)利要求18-20的任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)量包括采用免疫學(xué)測(cè)定。23.權(quán)利要求18-20的任一項(xiàng)的方法，其中可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平是游離的、結(jié)合的或總的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平或降解或酶切得到的內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平。24.權(quán)利要求18-20的任一項(xiàng)的方法，其中所述監(jiān)測(cè)進(jìn)一步包括測(cè)量來(lái)自所述受試者的樣品中sFlt-l、VEGF或P1GF多肽中至少一種多肽的水平。25.權(quán)利要求24的方法，進(jìn)一步包括用度量標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算所述可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-l、VEGF或P1GF的水平之間的關(guān)系，其中受試者樣品中所述水平之間的關(guān)系相對(duì)于參照樣品的改變，表明所述受試者中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥的改善。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述度量標(biāo)準(zhǔn)選自[(sFlt-l+0.25可溶內(nèi)皮糖蛋白)/PlGF]、[(可溶內(nèi)皮糖蛋白+sFlt-l)/PlGF]和[sFlt-lx可溶內(nèi)皮糖蛋白]。27.權(quán)利要求25的方法，其中所述度量標(biāo)準(zhǔn)是[d乘積=妊娠的次三個(gè)月中的(sFltlxsEng)-妊娠的前三個(gè)月中的(sFltlxsEng)]，其中大于0的d乘積值，表明所述受試者中的妊娠相關(guān)的高血壓病癥，并且，與陽(yáng)性參照樣品相比，所述d乘積值的減少表明所述受試者中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥的改善。28.特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體結(jié)合表位，所述表位包含圖30B所示人內(nèi)皮糖蛋白序列的氨基酸40-86、144-199、206-222、289-304或375-381。29.權(quán)利要求28的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段防止生長(zhǎng)因子與可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合。30.權(quán)利要求29的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所迷生長(zhǎng)因子選自TGF-P1、TGF-P3、激活蛋白A、BMP-2和BMP-7。31.權(quán)利要求28的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。32.權(quán)利要求28的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體缺乏Fc部分，是F(ab')2、Fab或Fv結(jié)構(gòu)。33.權(quán)利要求28的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段存在于藥學(xué)可接受的載體中。34.診斷患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥或具有患所述病癥的傾向的受試者的方法，所述方法包括測(cè)量來(lái)自所述受試者的樣品中可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和至少一種另外的多肽的水平，所述至少一種另外的多肽選自TGF-P1、TGF-P3、激活蛋白A、BMP2、BMP7、eNOS和PGI2,其中與正常參照樣品、標(biāo)準(zhǔn)或水平相比，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的提高和所述至少一種另外的多肽的水平的降低，是妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向的診斷指標(biāo)。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述測(cè)量包括采用免疫學(xué)測(cè)定。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述免疫學(xué)測(cè)定是ELISA。37.權(quán)利要求34的方法，其中所述正常參照樣品是來(lái)自所述受試者的先前的樣品。38.診斷患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥或具有患所述病癥的傾向的受試者的方法，所述方法包括測(cè)量來(lái)自所迷受試者的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和sFlt-l多肽的水平，并且用[可溶內(nèi)皮糖蛋白xsFlt-l]度量標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt-l水平之間的關(guān)系，其中相對(duì)于正常參照樣品，受試者樣品中該度量標(biāo)準(zhǔn)的增加是所述受試者中妊娠相關(guān)的高血壓病癥的診斷指標(biāo)。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步包含母親的體重指數(shù)和胎兒的胎齡。40.診斷患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥或具有患所述病癥的傾向的受試者的方法，所述方法包括測(cè)量所述受試者妊娠的前三個(gè)月和妊娠的次三個(gè)月中可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和sFlt-l多肽的水平，并且用以下度量標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算所述可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFh-l水平之間的關(guān)系[d乘積=妊娠的次三個(gè)月中的(sFltlxsEng)-妊娠的前三個(gè)月中的(sFltlxsEng)]，其中大于0的d乘積值，是所迷受試者中妊娠相關(guān)的高血壓病癥的i貪斷指標(biāo)。41.權(quán)利要求40的方法，其中大于1的d乘積值是所述受試者中妊娠相關(guān)的高血壓病癥的診斷指標(biāo)。42.權(quán)利要求41的方法，其中大于1的d乘積值是早產(chǎn)先兆子癇的診斷指標(biāo)。43.權(quán)利要求34、38或40的方法，其中所述樣品是所述試者的體液、細(xì)胞或組織，其中所述可溶內(nèi)皮糖蛋白通常是可檢測(cè)的。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述體液選自尿、羊水、血液、血清和血漿。45.權(quán)利要求43的方法，其中所述細(xì)胞選自內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、單核細(xì)胞和來(lái)源于胎盤的細(xì)胞。46.權(quán)利要求43的方法，其中所述組織是胎盤組織。47.權(quán)利要求34、38或40的方法，其中所迷受試者是非妊娠的人、妊娠的人、產(chǎn)后的人，或非人類，并且所述方法診斷發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向。48.權(quán)利要求47的方法，其中所述非人類選自牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗或貓。49.權(quán)利要求34、38或40的方法，其中所述方法用于在癥狀發(fā)作前至少4周診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向。50.權(quán)利要求l、34、38或40的方法，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征，和具有SGA嬰兒的妊娠。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇或子癇。52.用于診斷受試者中的妊娠相關(guān)的高血壓病癥的試劑盒，該試劑盒包含(i)可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合劑，和(ii)至少一種另外的結(jié)合劑，其結(jié)合選自TGF-(31、TGF-卩3、激活蛋白A、BMP2、BMP7、eNOS和PGI2的多肽；和(iii)使用(i)的結(jié)合劑和(ii)的至少一種結(jié)合劑來(lái)診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向的說(shuō)明書(shū)。53.權(quán)利要求52的試劑盒，其中(i)的所述結(jié)合劑是特異性結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段，并且(ii)的至少一種結(jié)合劑是特異性結(jié)合TGF-pl、TGF-P3、激活蛋白A、BMP2、BMP7、eNOS或PGl2的抗體或其抗原結(jié)合片段。54.權(quán)利要求52的試劑盒，其中所述試劑盒進(jìn)一步包含VEGF、sFlt-l或P1GF結(jié)合分子。55.權(quán)利要求52的方法，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合4正，和具有SGA嬰兒的妊娠。56.鑒定改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物的方法，該方法包括以下步驟(a)使細(xì)胞與可溶內(nèi)皮糖蛋白化合物接觸；(b)確定步驟(a)的所述細(xì)胞中eNOS的Thr495的磷酸化狀態(tài)；(c)使所述細(xì)胞與候選化合物接觸；(d)確定步驟(c)的所述細(xì)胞中eNOS的Thr495的磷酸化狀態(tài)；和(e)比較步驟(b)和步驟(d)中確定的磷酸化狀態(tài)，其中與步驟(b)相比，步驟(d)中eNOS的Thr495的去磷酸化的增加，鑒定所述候選化合物為改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物。57.鑒定改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物的方法，該方法包括以下步驟(a)使細(xì)胞與Smad2/3依賴性報(bào)道構(gòu)建體和可溶內(nèi)皮糖蛋白化合物接觸；(b)確定步驟(a)的細(xì)胞中Smad2/3報(bào)道構(gòu)建體的激活水平；(c)使步驟(a)的細(xì)胞與候選化合物接觸；(d)確定步驟(c)的細(xì)胞中Smad2/3報(bào)道構(gòu)建體的激活水平；和(e)比較步驟(b)和步驟(d)中確定的Smad2/3報(bào)道構(gòu)建體的激活水平，其中與步驟(b)相比，步驟(d)中Smad2/3報(bào)道構(gòu)建體的激活水平的增加，鑒定候選化合物為改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物。全文摘要本文公開(kāi)了采用改變可溶內(nèi)皮糖蛋白、內(nèi)皮一氧化氮合酶、PGI₂、TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白A、BMP2、BMP7和sFlt-1表達(dá)水平或生物活性的化合物的組合治療妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇和子癇的方法。也公開(kāi)了診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇和子癇的方法，該方法包括測(cè)量以下任意一種或多種可溶內(nèi)皮糖蛋白、內(nèi)皮一氧化氮合酶、PGI₂、TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白A、BMP2、BMP7和sFlt-1表達(dá)水平或生物活性。文檔編號(hào)A61K38/00GK101517078SQ200780026858公開(kāi)日2009年8月26日申請(qǐng)日期2007年5月31日優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日發(fā)明者M(jìn)·V·萊塔特,M·托波賢,S·A·卡魯曼基,V·P·蘇克哈特姆申請(qǐng)人:貝絲以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心;兒童病患醫(yī)院