專利名稱：診斷和治療妊娠并發(fā)癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總體地說，本發(fā)明涉及患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥的受試者的檢測和治療。
背景技術(shù)：
先兆子癇是高血壓、水腫和蛋白尿的綜合征，其影響5-10％的妊娠，并導(dǎo)致相當(dāng)大的產(chǎn)婦和胎兒發(fā)病率及死亡率。先兆子癇造成全世界每年至少200,000名產(chǎn)婦死亡。先兆子癇的癥狀一般地在妊娠第20周后出現(xiàn)，且通常是通過常規(guī)測量婦女的血壓和尿而檢測出來的。然而，這些監(jiān)控方法不能有效診斷早期綜合征，如果采取有效的治療，所述診斷就可減少對受試者或發(fā)育中胎兒的危險(xiǎn)。
目前還沒有已知的先兆子癇療法。先兆子癇的嚴(yán)重程度可從輕度直至威脅生命。輕度形式的先兆子癇可通過臥床休息和經(jīng)常監(jiān)控來治療。對于中度至嚴(yán)重的病例，建議住院并接受血壓藥物治療或抗驚厥劑藥物治療，以防止癲癇發(fā)作。如果狀況威脅到母親或嬰兒的生命，則要終止妊娠并在預(yù)產(chǎn)期前分娩出嬰兒。
胎兒和胎盤的正確發(fā)育是由幾種生長因子或血管生成因子介導(dǎo)的。這些血管生成因子中的一種是內(nèi)皮糖蛋白，其也稱作CD105。內(nèi)皮糖蛋白是一種同源二聚體細(xì)胞膜糖蛋白，其主要在內(nèi)皮細(xì)胞(如合胞體滋養(yǎng)層、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和血管內(nèi)皮細(xì)胞)上表達(dá)。內(nèi)皮糖蛋白與β聚糖，一種轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β受體III型共有序列同一性。已經(jīng)表明，內(nèi)皮糖蛋白是TGF-β受體復(fù)合物的調(diào)節(jié)組分，其調(diào)節(jié)血管生成、增殖、分化和細(xì)胞凋亡。內(nèi)皮糖蛋白也結(jié)合TGF-β超家族的幾種其它成員，包括活化素-A、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2和BMP-7。具體地，內(nèi)皮糖蛋白以高親和力結(jié)合TGF-β1和TGF-β3，并與TGF-β信號傳導(dǎo)受體I和II型形成異源三聚體結(jié)合。內(nèi)皮糖蛋白基因的編碼區(qū)的突變造成出血性毛細(xì)管擴(kuò)張1型(HHT1)，后者是一種顯性遺傳的血管病癥，其特征在于多系統(tǒng)的血管發(fā)育異常和復(fù)發(fā)性出血。還已經(jīng)鑒別出了可溶形式的內(nèi)皮糖蛋白，并發(fā)現(xiàn)其以增高的水平存在于轉(zhuǎn)移性乳腺癌和結(jié)腸直腸癌患者中；但是，尚不清楚可溶內(nèi)皮糖蛋白在癌癥的發(fā)病機(jī)理中的確切功能作用。尚未報(bào)道可溶內(nèi)皮糖蛋白生成與先兆子癇或正常妊娠有關(guān)。
已經(jīng)報(bào)道幾種因子與胎兒和胎盤發(fā)育有關(guān)，且更具體地與先兆子癇有關(guān)。它們包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、可溶的Flt-1受體(sFlt-1)和胎盤生長因子(PlGF)。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞-特異性的促分裂原、血管生成誘導(dǎo)物和血管通透性的介質(zhì)。已經(jīng)表明VEGF對于腎小球毛細(xì)血管修復(fù)是重要的。VEGF作為同源二聚體與兩種同源跨膜酪氨酸激酶受體(fms-樣酪氨酸激酶(Flt-1)和激酶結(jié)構(gòu)域受體(KDR))之一結(jié)合，所述受體在從很多不同組織獲得的內(nèi)皮細(xì)胞中差別表達(dá)。Flt-1(而不是KDR)由促成胎盤形成的滋養(yǎng)層細(xì)胞高度表達(dá)。PlGF是VEGF家族成員，其也參與胎盤發(fā)育。PlGF由細(xì)胞滋養(yǎng)層及合胞體滋養(yǎng)層表達(dá)，且能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及活化。PlGF作為同源二聚體與Flt-1受體結(jié)合，但不與KDR受體結(jié)合。PlGF和VEGF均可對促有絲分裂活性和血管生成作出貢獻(xiàn)，后者對于發(fā)育中的胎盤是至關(guān)重要的。
近來已經(jīng)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中鑒別了sFlt-1，其缺少受體的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，并隨后在胎盤組織中證實(shí)了體內(nèi)表達(dá)。sFlt-1以高親和力與VEGF結(jié)合，但不會刺激內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂發(fā)生。
小心地調(diào)節(jié)血管生成和促有絲分裂信號傳導(dǎo)途徑對于由發(fā)育中的胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞維持適宜的增殖、遷移和血管生成是至關(guān)重要的。
需要準(zhǔn)確診斷有危險(xiǎn)患有或患有先兆子癇或子癇的受試者的方法，特別是在發(fā)作最嚴(yán)重的癥狀之前。還需要進(jìn)行治療。
發(fā)明概述我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了診斷和治療妊娠相關(guān)的高血壓病癥(包括先兆子癇和子癇)的方法。
利用基因表達(dá)分析，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在來自患有與高血壓有關(guān)的妊娠并發(fā)癥(包括先兆子癇)的孕婦的胎盤組織樣品中，可溶內(nèi)皮糖蛋白(sE)的水平顯著提高。內(nèi)皮糖蛋白是TGF-β受體復(fù)合物的部分，后者起調(diào)節(jié)血管生成的作用。內(nèi)皮糖蛋白可以以高親和力結(jié)合TGF-β家族成員，后者是TGF-β受體的配體。在受影響的個(gè)體中，過量的可溶內(nèi)皮糖蛋白可以耗盡胎盤的必需量的必需血管生成和促有絲分裂因子。在本發(fā)明中，使用結(jié)合或中和可溶內(nèi)皮糖蛋白的化合物來減少提高的水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白。另外，還提供了可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體，以及用于降低生物學(xué)活性的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平的RNA干擾和反義核堿基(nucleobase)寡聚體。最后，本發(fā)明提供了可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的測量，作為妊娠相關(guān)的高血壓病癥(包括先兆子癇子癇和子癇或其素因)的早期診斷和控制的檢測工具。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過給受試者施用能結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的化合物來治療或預(yù)防受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的方法，其中施用的時(shí)間和量足以治療或預(yù)防受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥的至少一種癥狀。妊娠相關(guān)的高血壓病癥的非限制性實(shí)例包括先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征和具有小于胎齡兒嬰兒(SGA)的妊娠。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物是特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的純化的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗體或其抗原結(jié)合片段。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物是能特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的生長因子，如TGF-β家族成員(例如，TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)或其片段。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法也包括施用化合物，如純化的sFlt-1抗體，sFlt-1抗原結(jié)合片段，煙堿，茶堿，腺苷，硝苯地平，米諾地爾，硫酸鎂，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，包括所有同工型如VEGF189、VEGF121、VEGF165或其片段，或胎盤生長因子(PlGF)，包括所有同工型和其片段，其中施用的時(shí)間和量足以治療或預(yù)防受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過給受試者施用化合物(例如，化合物、多肽、肽、抗體或其片段)，所述化合物增加能結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的生長因子的水平，來治療或預(yù)防受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的方法。施用化合物的時(shí)間和量足以治療或預(yù)防妊娠相關(guān)的高血壓病癥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物增加TGF-β家族成員(例如，TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)和其片段的水平。這樣的化合物的非限制性實(shí)例包括環(huán)孢菌素、α生育酚、美西麥角、溴隱亭和愛道美。
在另一個(gè)有關(guān)的方面，本發(fā)明涉及通過給受試者施用化合物(例如，化合物、多肽、肽、抗體或其片段)，所述化合物抑制生長因子結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽，來治療或預(yù)防受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥的方法。施用化合物的時(shí)間和量足以治療或預(yù)防妊娠相關(guān)的高血壓病癥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白，并阻止生長因子結(jié)合。這樣的化合物的非限制性實(shí)例包括通過篩選得到的抗體和小分子化合物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過給受試者施用能降低可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)或生物學(xué)活性的化合物，來治療或預(yù)防受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的方法，其中所述施用足以治療或預(yù)防受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物是純化的抗體或其抗原結(jié)合片段或抑制選自下述的蛋白水解酶的酶活性的化合物基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、組織蛋白酶或彈性蛋白酶。MMP包括MMP 1-26中的任一種，優(yōu)選MMP9或膜型MMP1。
合意地，通過它的抑制內(nèi)皮糖蛋白的血管生成活性的能力，如通過血管生成測定所測得的，鑒別能抑制可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物學(xué)活性的化合物。在這樣的測定的一個(gè)實(shí)例中，在matrigel管形成測定中使用先兆子癇患者的血清來誘導(dǎo)抗血管生成狀態(tài)。然后加入化合物，且抗血管生成狀態(tài)減少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，指示著治療上有效的化合物。
能抑制可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物學(xué)活性的化合物，可以是反義核堿基寡聚體，其具有至少一條與可溶內(nèi)皮糖蛋白的序列的至少一部分至少80％、優(yōu)選地85％、90％、95％、99％或100％互補(bǔ)的鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義核堿基寡聚體與可溶內(nèi)皮糖蛋白的至少8、10、優(yōu)選地20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)，且可以減少或抑制可溶內(nèi)皮糖蛋白的表達(dá)或生物學(xué)活性。合意地，反義核堿基寡聚體是8至30個(gè)核苷酸長。
能抑制可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物學(xué)活性的化合物，也可以是雙鏈RNA(dsRNA)分子，其具有至少一條與可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸分子的序列的至少一部分至少80％、優(yōu)選地85％、90％、95％、99％或100％互補(bǔ)的鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈RNA是小干擾RNA(siRNA)，它是19至25個(gè)核苷酸長，且可以減少或抑制可溶內(nèi)皮糖蛋白的表達(dá)或生物學(xué)活性。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，dsRNA與可溶內(nèi)皮糖蛋白分子的核酸序列的至少18、優(yōu)選地19、20、21、22、23、24、25、35、45、50或更多個(gè)連續(xù)核苷酸具有100％核酸同一性。合意地，dsRNA是siRNA。
在任一個(gè)上述方面的各實(shí)施方案中，該方法還包含給受試者施用抗高血壓化合物(例如，腺苷、硝苯地平、米諾地爾和硫酸鎂)的步驟。在上述方面的其它實(shí)施方案中，所述受試者是妊娠的人、產(chǎn)后的人、非妊娠的人、或非人類(例如，牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗或貓)。本發(fā)明的治療方法可以用于治療或預(yù)防妊娠相關(guān)的高血壓病癥，包括先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征和具有SGA嬰兒的妊娠。優(yōu)選的病癥是先兆子癇和子癇。在上述方面的各實(shí)施方案中，該方法可以與下述的本發(fā)明的診斷方法相結(jié)合，以監(jiān)控治療中的受試者或確定有效治療劑量。
本發(fā)明的任一個(gè)治療方面也可以包括，施用一種或多種其它的化合物，如純化的sFlt-1抗體，sFlt-1抗原結(jié)合片段，煙堿，茶堿，腺苷，硝苯地平，米諾地爾，硫酸鎂，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，包括所有同工型如VEGF189、VEGF121或VEGF165或其片段；胎盤生長因子(PlGF)，包括所有同工型和其片段，其中施用的時(shí)間和量足以治療或預(yù)防受試者的先兆子癇或子癇。在美國專利申請公開號20040126828和20050025762和PCT公開號WO 2004/008946中，描述了這樣的化合物的優(yōu)選實(shí)例。合意地，所述化合物是能結(jié)合sFlt-1或降低sFlt-1表達(dá)的化合物。
可以單獨(dú)地或與本發(fā)明的一種或多種其它方法組合地，使用本發(fā)明的任一個(gè)治療方面。在一個(gè)實(shí)例中，可以組合使用MMP抑制劑和抗體，以中和存在的可溶內(nèi)皮糖蛋白，并通過膜結(jié)合形式的切割，阻斷可溶內(nèi)皮糖蛋白的進(jìn)一步生成。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的純化的抗體或其抗原結(jié)合片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體阻止生長因子(例如，TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)與可溶內(nèi)皮糖蛋白的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段是人或人源化抗體。在其它實(shí)施方案中，抗體缺少Fc部分。在其它實(shí)施方案中，抗體是F(ab′)2、Fab或Fv結(jié)構(gòu)。在其它實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段存在于藥學(xué)上可接受的載體中。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了診斷受試者患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)或具有其素因的方法，其包含測量來自受試者的樣品中的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平是游離的、結(jié)合的或總的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平。在有些實(shí)施方案中，可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平是降解或酶切割產(chǎn)生的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平。妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向的診斷，可以源自與正常參照樣品相比可溶內(nèi)皮糖蛋白的相對水平的變化(例如，增加)，或源自超過正常參照值的可溶內(nèi)皮糖蛋白的絕對水平的檢測。例如，通常，在非妊娠狀態(tài)期間，可溶內(nèi)皮糖蛋白的循環(huán)血清或血漿濃度范圍是2-7ng/ml，而在正常妊娠期間，是10-20ng/ml。關(guān)于包含測量可溶內(nèi)皮糖蛋白的絕對水平的實(shí)施方案，認(rèn)為大于15ng/ml、20ng/ml或優(yōu)選地大于25ng/ml的水平，是妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的診斷指標(biāo)。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包括，如美國專利申請公開號20040126828、20050025762和2005017044和PCT公開號WO2004/008946和WO 2005/077007所述，測量sFlt-1、VEGF或PlGF多肽中的至少一種在來自受試者的樣品中的水平。該方法也可以包括，測量sFlt-1、VEGF或PlGF多肽中的至少兩種在來自受試者的樣品中的水平，并使用度量(metric)計(jì)算sFlt-1、VEGF或PlGF的水平之間的關(guān)系，其中受試者樣品相對于參照樣品的變化，可診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法也包括確定體重指數(shù)(BMI)、胎兒的胎齡(GA)或二者，并在度量中包含BMI或GA或二者。在一個(gè)實(shí)施方案中，度量是先兆子癇抗血管生成指數(shù)(PAAI)[sFlt-1/VEGF+PlGF]，其中PAAI用作抗血管生成活性的指標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，大于10、更優(yōu)選地大于20的PAAI，指示著先兆子癇或子癇。在另一實(shí)施方案中，度量是下面的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)(sFlt-1+0.25(可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽))/PlGF?？扇軆?nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)的值的增加，是妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的診斷指標(biāo)。例如，在21-32周期間大于75的值或在＞32周后大于100的值，診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇。用于本發(fā)明的診斷方法中的另一種度量是(可溶內(nèi)皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF。任一種方法也可以包括，確定體重指數(shù)(BMI)、胎兒的胎齡(GA)或二者，并在度量中包含BMI或GA或二者。
在上述方面的各實(shí)施方案中，樣品是體液，如尿、羊水、血液、血清、血漿和腦脊液。合意地，通過免疫學(xué)測定(如ELISA)，確定可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的水平。在另一個(gè)實(shí)例中，單獨(dú)地或與升高的sFlt-1和降低的游離PlGF或VEGF結(jié)合地，使用大于20、優(yōu)選地大于25ng/ml的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平，診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平的增加，是先兆子癇或子癇或發(fā)展先兆子癇或子癇的的傾向的指標(biāo)。在上述方面的優(yōu)選的實(shí)施方案中，測量的sFlt-1多肽的水平是游離的、結(jié)合的或總的sFlt-1多肽的水平。在其它實(shí)施方案中，sFlt-1多肽也可以包含sFlt-1片段、降解產(chǎn)物或酶切割產(chǎn)物。在上述方面的其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，VEGF或PlGF的水平是游離的VEGF或PlGF的水平。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了診斷受試者患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)或具有其素因的方法，其包含測量來自受試者的樣品中的內(nèi)皮糖蛋白核酸分子(例如，mRNA)、優(yōu)選可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸的水平，并將其與參照樣品相對比，其中與參照樣品(例如，正常參照)相比水平的變化(例如，增加)，診斷受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)，或診斷發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的傾向。在其它實(shí)施方案中，該方法還可以包含，測量來自受試者的樣品中的sFlt-1、VEGF或PlGF核酸分子(例如，mRNA)的水平，并將其與參照樣品相對比，其中與正常參照樣品相比水平的變化(例如，VEGF或PlGF水平的降低或sFlt-1水平的增加)，診斷受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)，或診斷發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的傾向。
在上述診斷方面的優(yōu)選的實(shí)施方案中，在兩個(gè)或更多個(gè)場合測量水平，且測量之間的水平的變化是妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的診斷指標(biāo)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用從第一次測量到下一次測量的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平的增加(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)，診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)。在上述診斷方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，將可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平與正常參照樣品相對比，且與正常參照樣品相比可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平的增加(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)是先兆子癇或子癇的指示。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了診斷受試者患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)或具有其素因的方法，其包括確定受試者的內(nèi)皮糖蛋白基因的核酸序列，并將其與參照序列相對比，其中受試者核酸序列的改變受試者中基因產(chǎn)物的水平或生物學(xué)活性的變化，診斷受試者患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥，或有發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向。在一個(gè)實(shí)施方案中，變化是核酸序列的多態(tài)性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，sFlt-1、VEGF或PlGF的核酸序列或其任意組合，也確定基因，并與參照序列相對比。這些序列中的任一個(gè)或多個(gè)改變受試者中基因產(chǎn)物的水平或生物學(xué)活性的變化，診斷患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥的受試者。
在上述方面的各實(shí)施方案中，樣品是受試者的體液(例如，尿、羊水、血液、血清、血漿或腦脊液)，其中可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt-1、VEGF或PlGF通常是可檢測的。在其它實(shí)施方案中，樣品是組織或細(xì)胞(例如，胎盤組織或胎盤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞和單核細(xì)胞)。在上述方面的其它實(shí)施方案中，受試者是非妊娠的人、妊娠的人或產(chǎn)后的人。在上述方面的其它實(shí)施方案中，受試者是非人類(例如，牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗或貓)。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是非妊娠的或妊娠的人，且該方法用于診斷發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向。在其它實(shí)施方案中，也測量BMI或GA或二者。在上述方面的各實(shí)施方案中，可溶內(nèi)皮糖蛋白的核酸或多肽的水平相對于參照的增加是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了診斷受試者患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)或具有其素因的方法，其包括測量可溶內(nèi)皮糖蛋白配體(如TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)在來自受試者的樣品中的水平。
在任一個(gè)上述診斷方面的各實(shí)施方案中，妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征或具有SGA嬰兒的妊娠。在任一個(gè)診斷方面，在兩個(gè)或更多個(gè)場合完成水平的測量，且測量之間的水平的增加是妊娠相關(guān)的高血壓病癥的診斷指標(biāo)。該診斷方法可以合意地用于在發(fā)作癥狀之前(例如，至少4、5、6、7、8、9或10周前)，診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于診斷受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的試劑盒，其包含用于檢測內(nèi)皮糖蛋白核酸或其片段的核酸序列，或其互補(bǔ)序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸序列與編碼可溶內(nèi)皮糖蛋白的核酸或其片段雜交，優(yōu)選地以高嚴(yán)格性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒還包含用于檢測sFlt-1、VEGF或PlGF的核酸序列。
在一個(gè)有關(guān)的方面，本發(fā)明提供了用于診斷受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的試劑盒，其包含可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合分子(例如，特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段)。在一個(gè)實(shí)施方案中，組分是免疫學(xué)測定、酶促測定或比色測定。在上述方面的其它實(shí)施方案中，試劑盒診斷妊娠的或非妊娠的受試者發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向。在上述方面的優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒也包含用于檢測sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的組分。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用試劑盒來檢測可溶內(nèi)皮糖蛋白，并進(jìn)一步檢測VEGF、sFlt-1和PlGF，并確定樣品的診斷比率(例如，PAAI或可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù))。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，診斷試劑盒包含關(guān)于試劑盒組分的預(yù)期用途的標(biāo)簽或說明書。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷試劑盒貼有標(biāo)簽，或包含關(guān)于用于診斷受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)、或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的傾向的說明書。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，診斷試劑盒包含關(guān)于使用試劑盒來確定受試者樣品的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平、并將可溶內(nèi)皮糖蛋白水平與參照值相對比的標(biāo)簽或說明書。應(yīng)當(dāng)理解，參照值將取決于試劑盒的預(yù)期用途。例如，可以將樣品與正?？扇軆?nèi)皮糖蛋白參照值相對比，其中可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的增加是妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的指示。也可以將樣品與參照相對比，所述參照是來自已知患有先兆子癇的受試者的值或樣品，其中可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的降低是妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的指示。
在一個(gè)有關(guān)的方面，本發(fā)明涉及通過提供組分來測量和/或?qū)Ρ瓤扇軆?nèi)皮糖蛋白多肽或核酸的水平和參照樣品，來診斷受試者患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)或具有其素因的裝置，其中與正常參照值相比可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的變化，診斷受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該裝置包含側(cè)向流(lateral flow)或測驗(yàn)片格式的膜，所述膜用于測量和對比尿樣品中的多肽水平。
該裝置也可以包含用于對比在來自受試者的樣品中的可溶內(nèi)皮糖蛋白和至少一種sFlt-1、VEGF和PlGF核酸分子或多肽相對于參照樣品的水平的組分，其中可溶內(nèi)皮糖蛋白和至少一種sFlt-1、VEGF和PlGF核酸分子或多肽的水平的變化，診斷受試者的先兆子癇或子癇或發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該裝置包含用于對比可溶內(nèi)皮糖蛋白和至少一種sFlt-1、VEGF和PlGF多肽的水平的度量組分。
本文所述的任一種診斷方法和試劑盒也可以用于監(jiān)控已經(jīng)診斷為患有先兆子癇或子癇或處于患有先兆子癇或子癇的危險(xiǎn)中的受試者，以監(jiān)控治療過程中的受試者或確定有效治療劑量。在一個(gè)實(shí)例中，在治療性監(jiān)控中使用的試劑盒可以具有參照可溶內(nèi)皮糖蛋白值，它是先兆子癇或子癇的指示，其中受試者樣品的可溶內(nèi)皮糖蛋白值相對于參照樣品的降低，可以用于指示治療化合物的治療功效或有效劑量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒貼有標(biāo)簽，或包含關(guān)于用于治療性監(jiān)控或治療劑量確定的說明書，且治療性化合物可以包含在試劑盒中。單獨(dú)地，或與sFlt-1、VEGF或PlGF蛋白或核酸的水平或其任意組合結(jié)合，測量可溶內(nèi)皮糖蛋白蛋白或核酸的水平。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，將可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平與參照樣品相對比，后者是妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的指示，且可溶內(nèi)皮糖蛋白相對于參照樣品的水平的變化(例如，降低)，是治療性化合物的治療功效或有效劑量的指示。在一個(gè)實(shí)例中，在施用治療過程中或之后測得的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽或核酸的水平相對于施用治療之前的值的降低(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)，指示著妊娠相關(guān)的高血壓病癥的改善。在另一個(gè)實(shí)例中，測量血清或血漿中的可溶內(nèi)皮糖蛋白的絕對水平，并用于監(jiān)控化合物的治療功效。例如，優(yōu)選地以使可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平小于25ng/ml、優(yōu)選地小于20ng/ml的劑量，施用治療性化合物。
在包含測量sFlt-1的上述治療性監(jiān)控方面的實(shí)施方案中，sFlt-1多肽或核酸水平的降低，指示著先兆子癇或子癇的改善。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以使sFlt-1多肽的水平小于2ng/ml的劑量，施用治療性化合物。在包含測量VEGF或PlGF的實(shí)施方案中，在施用治療過程中或之后測得的VEGF或PlGF多肽或核酸的水平相對于治療之前的值的增加，指示著先兆子癇或子癇的改善。在除了測量可溶內(nèi)皮糖蛋白以外包含測量sFlt-1、VEGF或PlGF的實(shí)施方案中，該方法可以包含，使用度量計(jì)算sFlt-1、VEGF或PlGF的水平之間的關(guān)系，其中受試者樣品中所述水平之間的關(guān)系相對于參照樣品的變化，是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。這樣的度量的一個(gè)實(shí)例是PAAI。在該實(shí)例中，受試者PAAI值的降低(例如，小于20，優(yōu)選地小于10)指示著先兆子癇或子癇的改善。PAAI的降低(例如，小于20，優(yōu)選地小于10)也可以指示治療性化合物的有效劑量。另一個(gè)實(shí)例是下面的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)，其中該值的增加是妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的診斷指標(biāo)。
在與診斷或監(jiān)控治療性處理有關(guān)的方面的優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用免疫學(xué)測定(如ELISA)或蛋白印跡測量多肽?？扇軆?nèi)皮糖蛋白的水平可以是游離的、結(jié)合的(即，結(jié)合在配體上)或總的(即，游離的+結(jié)合的)可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平，以及由降解或酶切割產(chǎn)生的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平。對于任一種監(jiān)控方法，可以在兩個(gè)或更多個(gè)場合完成水平的測量，且測量之間的水平的變化是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒別改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的化合物的方法，其包含使表達(dá)內(nèi)皮糖蛋白核酸分子的細(xì)胞接觸候選化合物，并對比候選化合物接觸的細(xì)胞中的核酸分子的表達(dá)水平和候選化合物未接觸的對照細(xì)胞中的表達(dá)水平，其中內(nèi)皮糖蛋白核酸分子的表達(dá)的變化，將該候選化合物鑒別為可以用于改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的化合物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒別改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的化合物的方法，其包含使表達(dá)可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的細(xì)胞接觸候選化合物，并對比候選化合物接觸的細(xì)胞中的多肽表達(dá)水平和候選化合物未接觸的對照細(xì)胞中的多肽表達(dá)水平，其中可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的表達(dá)的變化，將該候選化合物鑒別為可以用于改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用免疫學(xué)測定、酶促測定或免疫測定，測定表達(dá)的變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)的變化是可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平的降低。表達(dá)的變化可以源自轉(zhuǎn)錄的變化或翻譯的變化。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒別改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的化合物的方法，其包含使表達(dá)可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的細(xì)胞接觸候選化合物，并對比候選化合物接觸的細(xì)胞中的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的生物學(xué)活性和候選化合物未接觸的對照細(xì)胞中的生物學(xué)活性水平，其中可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的生物學(xué)活性的變化，將該候選化合物鑒別為可以改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，變化是可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物學(xué)活性的降低，如使用血管生成測定、生長因子結(jié)合測定或任一種本文所述的測定所測得的。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒別改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的化合物的方法，其包含檢測可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和候選化合物的結(jié)合，其中結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的化合物可以用于改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒別改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的化合物的方法，其包含檢測在有候選化合物存在下，可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結(jié)合，其中與不存在候選化合物時(shí)可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結(jié)合相比結(jié)合的降低，將該候選化合物鑒別為可以用于改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長因子是TGF-β家族成員。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒別阻止可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結(jié)合的多肽的方法。該方法包含，檢測在有候選多肽存在下，可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結(jié)合，其中與不存在候選多肽時(shí)可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結(jié)合相比結(jié)合的降低，將該候選多肽鑒別為阻止可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結(jié)合的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長因子是TGF-β家族成員。
在一個(gè)有關(guān)的方面，本發(fā)明提供了根據(jù)前述方面鑒別出的化合物，其中該化合物是特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽、并阻止可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽結(jié)合TGF-β家族成員的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多肽是結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體，優(yōu)選地是特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體。
盡管本文所述的方法具體地提及先兆子癇和子癇，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的診斷和監(jiān)控方法也適用于與高血壓有關(guān)的一般妊娠并發(fā)癥，包括但不限于妊娠高血壓、HELLP綜合征和具有小于胎齡兒(SGA)嬰兒的妊娠。
就本發(fā)明的目的而言，在下面定義了下列縮寫和術(shù)語。
“變化”指通過標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域已知的方法，如下面描述的那些，檢測的基因或多肽表達(dá)水平的變化(提高或降低)。如本文所使用的，變化包括表達(dá)水平10％的變化、優(yōu)選表達(dá)水平25％的變化、更優(yōu)選表達(dá)水平40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的變化。“變化”還指本發(fā)明任一多肽(例如，可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF)的生物學(xué)活性的變化(提高或降低)。如本文所使用的，變化包括生物學(xué)活性10％的變化、優(yōu)選生物學(xué)活性25％的變化、更優(yōu)選生物學(xué)活性40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的變化。可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物學(xué)活性的實(shí)例是血管生成測定和使用已知配體(如活化素-A、BMP 2、BMP-7、TGF-β1和TGF-β3)的結(jié)合測定。通過本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的或本文所述的配體結(jié)合測定、免疫測定和血管生成測定，可以測量可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物學(xué)活性。這樣的測定的一個(gè)實(shí)例是，體外matrigel內(nèi)皮管形成測定，其中內(nèi)皮糖蛋白信號傳導(dǎo)的拮抗作用導(dǎo)致毛細(xì)管形成的大量喪失(Li等，F(xiàn)aseb Journal 1455-64(2000))。PlGF或VEGF的生物學(xué)活性的其它實(shí)例包括通過免疫測定、配體結(jié)合測定或斯卡查德圖分析測得的與受體的結(jié)合，以及通過BrdU標(biāo)記、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)、或DNA合成的定量測定(如3H-胸苷摻入)測得的細(xì)胞增殖或遷移的誘導(dǎo)。sFlt-1的生物學(xué)活性的實(shí)例包括通過免疫測定、配體結(jié)合測定或斯卡查德圖分析測得的與PlGF和VEGF的結(jié)合。本文描述了測定每種多肽的生物學(xué)活性的其它實(shí)例。
“反義核堿基寡聚體”指核堿基寡聚體，不管多長，其與內(nèi)皮糖蛋白基因的編碼鏈或mRNA互補(bǔ)。“核堿基寡聚體”指包括至少8個(gè)核堿基、優(yōu)選至少12個(gè)、且最優(yōu)選至少16個(gè)堿基的鏈的化合物，它們通過連接基團(tuán)連接在一起。在此定義中包括天然的和非天然的寡核苷酸，修飾和未修飾的，以及寡核苷酸模擬物，如蛋白核酸、鎖定核酸和阿糖核酸。很多核堿基和連接基團(tuán)都可用于本發(fā)明的核堿基寡聚體中，包括在引入本文作為參考的美國專利公開號20030114412(見例如，公開文本的27-45段)和20030114407(見例如，公開文本的35-52段)中描述的那些。所述核堿基寡聚體還可靶向翻譯起始和終止位點(diǎn)。優(yōu)選地，反義核堿基寡聚體包含約8-30個(gè)核苷酸。反義核堿基寡聚體還可包含至少40、60、85、120或更多個(gè)連續(xù)的核苷酸，它們與內(nèi)皮糖蛋白mRNA或DNA互補(bǔ)，且可像全長mRNA或基因一樣長。
“體重指數(shù)”指使用身高和體重測量產(chǎn)生的數(shù)字，它會給出體重是否屬于健康范圍的一般信息。通常用于確定體重指數(shù)的公式是，以千克計(jì)的人體重除以以米計(jì)的人身高的平方，或體重(kg)/(身高(m))2。
“化合物”指任意的小分子化合物、抗體、核酸分子、或多肽，或其片段。特別用于本發(fā)明的治療方法的化合物可以使可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平或生物學(xué)活性改變(優(yōu)選地降低)至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
“嵌合抗體”指多肽，其至少含有與另一種蛋白的至少部分相連的抗體分子的抗原結(jié)合部分(通常，免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域)。
“雙鏈RNA(dsRNA)”指包含有義和反義鏈的核糖核酸分子。dsRNA通常用于介導(dǎo)RNA干擾。
“內(nèi)皮糖蛋白”也稱作CD 105，指具有內(nèi)皮糖蛋白生物學(xué)活性的哺乳動物生長因子(見Fonsatti等，Oncogene 226557-6563，2003；Fonsatti等，Curr.Cancer Drug Targets 3427-432，2003)，且與下述GenBank編號中的任一個(gè)定義的蛋白同源AAH29080和NP_031958(小鼠)；AAS67893(大鼠)；NP_000109、P17813、VSP_004233和CAA80673(人)；和A49722(豬)，或記載在美國專利號6,562,957中。內(nèi)皮糖蛋白是同源二聚體細(xì)胞膜糖蛋白，其在來自胎盤的增殖中的血管細(xì)胞和合胞體滋養(yǎng)層中高水平地表達(dá)。內(nèi)皮糖蛋白存在兩種不同的同工型，L和S，它們的不同之處是在胞質(zhì)尾的47個(gè)氨基酸。兩種同工型都包含在本文使用的術(shù)語內(nèi)皮糖蛋白中。內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合TGF-β家族成員，且在有TGF-β存在下，內(nèi)皮糖蛋白可以結(jié)合TGF-β信號傳導(dǎo)受體RI和RII，并加強(qiáng)對生長因子的響應(yīng)。內(nèi)皮糖蛋白生物學(xué)活性包含結(jié)合TGF-β家族成員，如活化素-A、BMP 2、BMP-7、TGF-β1和TGF-β3；誘導(dǎo)血管生成，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、附著、遷移、侵入；和激活內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮糖蛋白生物學(xué)活性的測定是本領(lǐng)域已知的，且包括配體結(jié)合測定或斯卡查德圖分析；用于測量細(xì)胞增殖的BrdU標(biāo)記、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)或DNA合成的定量測定(如3H-胸苷摻入)；和血管生成測定，如在本文或在McCarty等，Intl.J.Oncol.215-10，2002；Akhtar等Clin.Chem.4932-40，2003；和Yamashita等，J.Biol.Chem.2691995-2001，1994中所述的那些?！翱扇軆?nèi)皮糖蛋白”指任何循環(huán)的、非膜結(jié)合形式的內(nèi)皮糖蛋白，其至少包括蛋白的胞外部分的部分(見

圖1)?？扇軆?nèi)皮糖蛋白可以源自蛋白水解酶對膜結(jié)合形式的內(nèi)皮糖蛋白的切割。一個(gè)潛在的切割位點(diǎn)是在氨基酸437處，從而產(chǎn)生可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽，其包括內(nèi)皮糖蛋白多肽的氨基酸1-437(見圖2A和2B)。盡管不希望受理論的約束，可溶內(nèi)皮糖蛋白保留的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可能允許它結(jié)合配體如TGF-β1和TGF-β3，從而造成TGF-β的缺乏。另外，由于內(nèi)皮糖蛋白是內(nèi)皮特異性的分子，所以TGF-β缺乏可能在內(nèi)皮細(xì)胞中是最大的?？扇軆?nèi)皮糖蛋白也可以包含循環(huán)降解產(chǎn)物或片段，其源自內(nèi)皮糖蛋白的酶切割，且保持內(nèi)皮糖蛋白生物學(xué)活性?，F(xiàn)在尚不清楚可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物學(xué)功能，但是預(yù)測會造成TGF-β和其它已知配體的缺乏。通過測量游離活化素A或游離TGF-β3的水平，或通過使用本領(lǐng)域已知的或本文所述的血管生成測定，可以測定可溶內(nèi)皮糖蛋白生物學(xué)活性。
“內(nèi)皮糖蛋白核酸”指編碼任一種上述的內(nèi)皮糖蛋白蛋白的核酸。例如，人內(nèi)皮糖蛋白的基因由14個(gè)外顯子組成，其中外顯子1編碼信號肽序列，外顯子2-12編碼胞外結(jié)構(gòu)域，外顯子13編碼跨膜結(jié)構(gòu)域，且外顯子14編碼C-末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(見圖1、2A和2B)。合意地，內(nèi)皮糖蛋白核酸編碼可溶內(nèi)皮糖蛋白(見圖2A)。
“表達(dá)”指通過標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域已知的方法檢測基因或多肽。例如，多肽表達(dá)常常通過蛋白印跡檢測，DNA表達(dá)常常通過DNA印跡或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測，而RNA表達(dá)常常通過RNA印跡、PCR、或RNA酶保護(hù)測定檢測。
“片段”指多肽或核酸分子的部分。優(yōu)選地，該部分含有，參照核酸分子或多肽的整個(gè)長度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個(gè)核苷酸或氨基酸。優(yōu)選地，可溶內(nèi)皮糖蛋白的片段包含4-437個(gè)氨基酸和10-1311個(gè)核苷酸。
“胎齡”指胎兒齡，其從母親的最后月經(jīng)期的第一天開始計(jì)起，通常按周計(jì)。
“妊娠高血壓”指妊娠20周后沒有蛋白尿的高血壓的發(fā)展。
“先兆子癇或子癇的歷史”指以前在受試者自身或相關(guān)家族成員中診斷的先兆子癇或子癇或妊娠誘發(fā)的高血壓。
“同源的”指在比較序列的長度上，與已知基因或蛋白序列具有至少30％同源性、更優(yōu)選40％、50％、60％、70％、80％、且最優(yōu)選90％或更高同源性的任何基因或蛋白序列?！巴吹摹钡鞍走€可具有比較蛋白的至少一種生物學(xué)活性。通常，就蛋白而言，比較序列的長度為至少10個(gè)氨基酸，優(yōu)選地20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400個(gè)或至少437個(gè)氨基酸或更多。就核酸而言，比較序列的長度通常為至少25、50、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200或至少1311個(gè)核苷酸或更多。“同源性”還指用于產(chǎn)生抗體的表位與抗體針對的蛋白或其片段之間的相當(dāng)大相似性。在該情況下，同源性指足以引發(fā)可以特異性地識別討論中的蛋白的抗體產(chǎn)生的相似性。
“人源化抗體”指能夠結(jié)合預(yù)定抗原的免疫球蛋白氨基酸序列變體或其片段。通常，抗體包含輕鏈和重鏈的至少可變結(jié)構(gòu)域?？贵w還可以包含重鏈的CH1、鉸鏈、CH2、CH3或CH4區(qū)。人源化抗體包含主要具有人免疫球蛋白氨基酸序列的構(gòu)架區(qū)(FR)和主要具有非人免疫球蛋白氨基酸序列(“輸入”序列)的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。
通常，人源化抗體具有從非人來源引入其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。通常，人源化抗體基本上包含至少一個(gè)、且通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv)的全部，其中全部或基本上全部CDR區(qū)與非人免疫球蛋白的那些相對應(yīng)，且全部或基本上全部FR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體最優(yōu)地將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少部分，通常是人免疫球蛋白恒定區(qū)的部分?！盎パa(bǔ)性決定區(qū)(CDR)”指在每個(gè)免疫球蛋白輕鏈和重鏈中的可變區(qū)的3個(gè)高變序列。“構(gòu)架區(qū)(FR)”指位于免疫球蛋白輕鏈和重鏈的3個(gè)高變序列(CDR)的任一側(cè)的氨基酸序列。
人源化抗體的FR和CDR區(qū)不需要與親代序列準(zhǔn)確對應(yīng)，例如，輸入CDR或共有FR可以通過置換、插入或缺失至少一個(gè)殘基來誘變，從而使得在該位點(diǎn)的CDR或FR殘基不與共有或輸入抗體相對應(yīng)。然而，這種突變將不是廣泛的。通常，至少75％、優(yōu)選90％、且最優(yōu)選95％的人源化抗體殘基將與親代FR和CDR序列的殘基相對應(yīng)。
“雜交”指在各種嚴(yán)格性條件下，在互補(bǔ)多核苷酸序列或其部分之間配對以形成雙鏈分子(見，例如，Wahl和Berger，MethodsEnzymol.152399，1987；Kimmel，Methods Enzymol.152507，1987)。例如，嚴(yán)格的鹽濃度通常低于約750mM NaCl和75mM檸檬酸三鈉，優(yōu)選低于約500mM NaCl和50mM檸檬酸三鈉，且最優(yōu)選低于約250mM NaCl和25mM檸檬酸三鈉。低嚴(yán)格性雜交可在沒有有機(jī)溶劑(例如甲酰胺)存在的條件下獲得，而高嚴(yán)格性雜交可在有至少約35％甲酰胺、且最優(yōu)選至少約50％甲酰胺存在下獲得。嚴(yán)格的溫度條件通常包括至少約30℃、更優(yōu)選至少約37℃、且最優(yōu)選至少約42℃的溫度。各種其它參數(shù)，如雜交時(shí)間，去污劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)的濃度，以及包含或不包含載體DNA，都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通過根據(jù)需要組合這些不同條件，實(shí)現(xiàn)各種嚴(yán)格性水平。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交在30℃，在750mM NaCl、75mM檸檬酸三鈉和1％SDS中進(jìn)行。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交在37℃，在500mM NaCl、50mM檸檬酸三鈉、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml變性鮭精DNA(ssDNA)中進(jìn)行。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交在42℃，在250mM NaCl、25mM檸檬酸三鈉、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中進(jìn)行。對這些條件的有用變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
對于絕大多數(shù)應(yīng)用而言，雜交之后的洗滌步驟還可在嚴(yán)格性方面有變化。洗滌嚴(yán)格性條件可由鹽濃度和溫度來限定。如上所述，洗滌嚴(yán)格性可通過降低鹽濃度或提高溫度來提高。例如，洗滌步驟的嚴(yán)格鹽濃度優(yōu)選低于約30mM NaCl和3mM檸檬酸三鈉，且最優(yōu)選低于約15mM NaCl和1.5mM檸檬酸三鈉。洗滌步驟的嚴(yán)格溫度條件通常包含至少約25℃、更優(yōu)選至少約42℃、且最優(yōu)選至少約68℃的溫度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌步驟將在25℃，在30mM NaCl、3mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS中進(jìn)行。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌步驟將在42℃，在15mM NaCl、1.5mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS中進(jìn)行。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌步驟將在68℃，15mMNaCl、1.5mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS中進(jìn)行。這些條件的其它變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。雜交技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，且在下面描述，例如Benton和Davis(Science 196180，1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 723961，1975)；Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience，New York，2001)；Berger和Kimmel(Guide to MolecularCloning Techniques，1987，Academic Press，New York)；和Sambrook等，Molecular CloizingA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York。
“子宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)”指導(dǎo)致出生重量比胎兒胎齡的預(yù)測胎兒重量低10％的綜合征。目前世界衛(wèi)生組織(World HealthOrganization)有關(guān)低出生重量的標(biāo)準(zhǔn)是重量低于2,500gm(5 lbs.8oz.)，或根據(jù)美國通過種族、經(jīng)產(chǎn)數(shù)和嬰兒性別得出的胎齡出生重量表，低于胎齡的第10百分位(Zhang和Bowes，Obstet.Gynecol 86200-208，1995)。這些低出生重量的嬰兒還被稱作“小于胎齡兒(SGA)”。已知先兆子癇是與IUGR或SGA有關(guān)的狀況。
“度量”指一種測量。度量可用于，例如，比較目標(biāo)多肽或核酸分子的水平。示例性的度量包含但不限于，數(shù)學(xué)公式或算法，如比率。所用度量是這樣的，其可最好地區(qū)別患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的受試者與正常對照受試者之間的可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF、PlGF的水平，或其任意組合。根據(jù)所用度量，妊娠相關(guān)的高血壓病癥的診斷指標(biāo)可明顯高于或低于參照值(例如，與未患妊娠相關(guān)的高血壓病癥的對照受試者相比)。通過測量游離的、結(jié)合的(即，結(jié)合于生長因子)或總的(即，游離的+結(jié)合的)可溶內(nèi)皮糖蛋白的量，可以確定可溶內(nèi)皮糖蛋白水平。通過測量游離的、結(jié)合的(即，結(jié)合于生長因子)或總的sFlt-1(游離的+結(jié)合的)的量，可以測量sFlt-1水平。通過測量游離PlGF或游離VEGF(即，未結(jié)合于sFlt-1)的量，可以確定VEGF或PlGF水平。一個(gè)示例性的度量是[sFlt-1/(VEGF+PlGF)]，也稱作先兆子癇抗血管生成指數(shù)(PAAI)。另一個(gè)實(shí)例是下面的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)(sFlt-1+0.25(可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽))/PlGF。可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)的值的增加，是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。另一個(gè)示例性的度量如下 (可溶的內(nèi)皮糖蛋白(enodglin)+sFlt-1)/PlGF。本發(fā)明的任一個(gè)度量還可以包含母親的BMI或嬰兒的GA。
“先兆子癇抗血管生成指數(shù)(PAAI)”指用作抗血管生成活性的指標(biāo)的sFlt-1/VEGF+PlGF比率。大于10、更優(yōu)選地大于20的PAAI，是妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或先兆子癇的危險(xiǎn))的指示。
“可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)”指(sFlt-1+0.25可溶內(nèi)皮糖蛋白)/PlGF比率。例如，75或更高、優(yōu)選地100或更高、或更優(yōu)選地200或更高的值，是與高血壓有關(guān)的妊娠并發(fā)癥(如先兆子癇或子癇)的指示。
“可操作地連接的”指在適宜的分子(例如，轉(zhuǎn)錄激活物蛋白)與調(diào)節(jié)序列結(jié)合時(shí)，基因和調(diào)節(jié)序列以允許基因表達(dá)的方式連接。
“藥學(xué)上可接受的載體”指對于所治療的哺乳動物而言生理學(xué)上可接受的且仍然保留與其一起施用的化合物的治療性質(zhì)的載體。一種示例性的藥學(xué)上可接受的載體物質(zhì)是生理鹽水。其它生理學(xué)上可接受的載體和它們的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且在下列文獻(xiàn)中描述，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，(第20版)，ed.A.Gennaro，2000，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA。
“胎盤生長因子(PlGF)”指哺乳動物生長因子，它與GenBank編號P49763限定的蛋白同源，且具有PlGF生物學(xué)活性。PlGF是屬于VEGF家族的糖基化同源二聚體，且可通過可變剪接機(jī)理以兩個(gè)不同的同工型發(fā)現(xiàn)。PlGF由胎盤中的細(xì)胞滋養(yǎng)層及合胞體滋養(yǎng)層表達(dá)，且PlGF生物學(xué)活性包含誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞(特別是滋養(yǎng)層細(xì)胞)的增殖、遷移及活化。
“多態(tài)性”指可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF核酸分子中的基因變異、突變、缺失或添加，它是發(fā)展先兆子癇或子癇的素因的指示。這樣的多態(tài)性是熟練的技術(shù)人員已知的，且記載在，例如，Raab等(Biochem.J.339579-588，1999)和Parry等(Eur.JImmunogenet.26321-323，1999)。多態(tài)性可以存在于基因的啟動子序列、可讀框、內(nèi)含子序列或非翻譯3′區(qū)中。內(nèi)皮糖蛋白基因的這樣的多態(tài)性的已知實(shí)例包括內(nèi)含子7中的6堿基GGGGGA插入，在外顯子7的3′末端以外的26個(gè)堿基處(Ann.Neurol.41683-6，1997)。
“妊娠相關(guān)的高血壓病癥”指與血壓升高有關(guān)或特征在于血壓升高的任何狀況或疾病或妊娠。這些狀況中包括先兆子癇(包括過早先兆子癇、重度先兆子癇)、子癇、妊娠高血壓、HELLP綜合征(溶血、升高的肝酶、低血小板)、胎盤分離(abruption placenta)、慢性高血壓、具有子宮內(nèi)發(fā)育限制的妊娠和具有小于胎齡兒(SGA)嬰兒的妊娠。應(yīng)當(dāng)指出，盡管具有SGA嬰兒的妊娠并非經(jīng)常與高血壓有關(guān)，但它也包含在該定義中。
“先兆子癇”指多系統(tǒng)病癥，其特征在于具有蛋白尿或水腫或兩者的高血壓、腎小球功能障礙、腦水腫、肝水腫或凝結(jié)異常，這是由于妊娠或新近妊娠的影響。所有形式的先兆子癇，如過早的、輕度的、中度的和重度先兆子癇，都包含在該定義中。先兆子癇通常發(fā)生在妊娠第20周后。先兆子癇通常被定義為下列癥狀的一些組合(1)妊娠20周后，收縮血壓(BP)＞140mmHg且舒張BP＞90mmHg(通常測量2次，間隔4-168小時(shí))，(2)新發(fā)作的蛋白尿(利用測驗(yàn)片進(jìn)行尿分析為1+，24-小時(shí)尿收集中的蛋白＞300mg，或單次隨機(jī)的尿樣品的蛋白/肌酸酐比＞0.3)，和(3)產(chǎn)后12周高血壓及蛋白尿消除。重度先兆子癇通常被定義為(1)舒張BP＞110mmHg(通常測量2次，間隔4-168小時(shí))或(2)蛋白尿，其特征在于24-小時(shí)尿收集中的蛋白測量值為3.5g或更高，或利用測驗(yàn)片測量，2份隨機(jī)的尿樣品具有至少3+蛋白。在先兆子癇中，高血壓和蛋白尿通常彼此在7天內(nèi)發(fā)生。在重度先兆子癇中，可同時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重高血壓、嚴(yán)重蛋白尿和HELLP綜合征(溶血、升高的肝酶、低血小板)或子癇，或每次僅出現(xiàn)一個(gè)癥狀。HELLP綜合征的特征在于血小板減少癥(＜100000細(xì)胞/μl)、提高的LDH(＞600IU/L)和提高的AST(＞70IU/L)的跡象。有時(shí)候，重度先兆子癇可導(dǎo)致癲癇發(fā)作的發(fā)展。這種嚴(yán)重的綜合征形式被稱作“子癇”。子癇還可包含幾種器官或組織的功能障礙或損害，如肝臟(例如，肝細(xì)胞損害、門管周壞死)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(例如，腦水腫和腦出血)。認(rèn)為癲癇發(fā)作的病因是由腦水腫和腎臟小血管病灶痙攣發(fā)展繼發(fā)的。
“過早先兆子癇”指在＜37周或＜34周發(fā)作癥狀的先兆子癇。
“蛋白”或“多肽”或“多肽片段”指任何多于2個(gè)氨基酸的鏈，不管翻譯后的修飾(例如，糖基化或磷酸化)，其構(gòu)成天然存在的多肽或肽的全部或部分，或構(gòu)成非天然存在的多肽或肽。
“參照樣品”指用于比較目的的任何樣品、標(biāo)準(zhǔn)或水平?！罢５膮⒄諛悠贰笨梢允菑南嗤茉囌卟扇〉脑谙葮悠?，來自不患有任何妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的妊娠受試者的樣品，來自不患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的妊娠受試者的樣品，妊娠且在妊娠早期(例如，在前三個(gè)月或次三個(gè)月，或在檢測到妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)之前)采取樣品的受試者，妊娠且不具有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)歷史的受試者，未妊娠的受試者，在已知正常濃度(即，不指示妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇)的純化參照多肽的樣品?！皡⒄諛?biāo)準(zhǔn)或水平”指源自參照樣品的值或數(shù)字。正常的參照標(biāo)準(zhǔn)或水平可以是源自正常受試者的值或數(shù)字，所述正常受試者與樣品受試者在至少一項(xiàng)下面的標(biāo)準(zhǔn)方面匹配胎兒的胎齡、母親年齡、妊娠之前的母親血壓、妊娠過程中的母親血壓、母親的BMI、胎兒體重、先兆子癇或子癇的以前診斷和先兆子癇或子癇的家族史?！瓣栃詤⒄铡睒悠?、標(biāo)準(zhǔn)或值是源自已知患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的受試者的樣品或值或數(shù)字，所述受試者與樣品受試者在至少一項(xiàng)下面的標(biāo)準(zhǔn)方面匹配胎兒的胎齡、母親年齡、妊娠之前的母親血壓、妊娠過程中的母親血壓、母親的BMI、胎兒體重、妊娠相關(guān)的高血壓病癥的以前診斷和妊娠相關(guān)的高血壓病癥的家族史。
“降低或抑制”指通過前述測定(見“表達(dá)”)檢測的，與未處理的樣品相比，引起蛋白或核酸水平共降低優(yōu)選20％或更多、更優(yōu)選40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的變化的能力。
“樣品”指組織活組織檢查、細(xì)胞、體液(例如，血液、血清、血漿、尿、唾液、羊水或腦脊液)或從受試者得到的其它樣品。合意地，生物樣品包括可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸分子或多肽或二者。
“小干擾RNA(siRNA)”指分離的dsRNA分子，優(yōu)選長度超過10個(gè)核苷酸(nt)，更優(yōu)選長度超過15個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選長度超過19個(gè)核苷酸，其用于鑒別將要降解的靶基因或mRNA。19-25個(gè)核苷酸是siRNA的最優(yōu)選大小。siRNA還可包含短發(fā)夾RNA，其中siRNA雙鏈體的兩個(gè)鏈都包含在單一RNA分子中。siRNA包含任何形式的dsRNA(更大dsRNA的蛋白酶剪切產(chǎn)物、部分純化的RNA、基本純的RNA、合成的RNA、重組產(chǎn)生的RNA)，以及與天然存在的RNA不同之處在于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失、置換和/或變化的改變的RNA。這種改變可包含非-核苷酸物質(zhì)的添加，例如向19、20、21、22、23、24或25nt RNA的末端添加或內(nèi)部添加(在RNA的一個(gè)或多個(gè)核苷酸上)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA分子包含3′羥基。本發(fā)明RNA分子中的核苷酸還可包含非鏈的核苷酸，包括非天然存在的核苷酸或脫氧核糖核苷酸。共同地，將所有這種改變的RNA稱作RNA的類似物。本發(fā)明的siRNA只需與具有介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的能力的天然RNA充分相似。如本文所使用的，RNAi指通過向細(xì)胞或生物中引入小干擾RNA或dsRNA所致的特定mRNA分子的ATP-依賴性的靶向切割和降解。如本文所使用的，“介導(dǎo)RNAi”指區(qū)別或鑒別要降解哪個(gè)RNA的能力。
“可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合分子”指特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的蛋白或小分子化合物?？扇軆?nèi)皮糖蛋白結(jié)合分子可以是，例如，抗體、抗體相關(guān)肽、可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)或可溶內(nèi)皮糖蛋白相互作用蛋白。
“可溶的Flt-1(sFlt-1)”(也稱作sVEGF-R1)指可溶形式的Flt-1受體，其與GenBank編號U01134定義的蛋白同源，且具有sFlt-1生物學(xué)活性。sFlt-1多肽的生物學(xué)活性可使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法測定，例如，通過測定與VEGF結(jié)合的sFlt-1。sFlt-1缺少Flt-1受體的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。sFlt-1可以以高親和力結(jié)合VEGF和PlGF，但不能誘導(dǎo)增殖或血管生成，并因此與Flt-1和KDR受體在功能上有所不同。sFlt-1最初從人臍內(nèi)皮細(xì)胞純化，且隨后表明在體內(nèi)由滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生。如本文所使用的，sFlt-1包含任何sFlt-1家族成員或同工型。sFlt-1也可以指源自Flt-1受體的酶切割且保留sFlt-1生物學(xué)活性的降解產(chǎn)物或片段。在一個(gè)實(shí)例中，從胎盤釋放出的特定金屬蛋白酶可以切割Flt-1受體的胞外結(jié)構(gòu)域，以將Flt-1 N-末端部分釋放到循環(huán)中。
“特異性地結(jié)合”指識別并結(jié)合本發(fā)明的多肽、但基本上不識別并結(jié)合樣品(例如生物學(xué)樣品)中的其它分子的化合物或抗體，其自然包含本發(fā)明的多肽。在一個(gè)實(shí)例中，特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體不結(jié)合膜結(jié)合的內(nèi)皮糖蛋白。在另一個(gè)實(shí)例中，特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體識別內(nèi)皮糖蛋白的氨基酸1-437內(nèi)的區(qū)域，所述區(qū)域是可溶內(nèi)皮糖蛋白獨(dú)有的，而全長內(nèi)皮糖蛋白沒有。
“受試者”指哺乳動物，包括但不限于，人或非人哺乳動物，如牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗或貓。在該定義中包含妊娠的、產(chǎn)后的和未妊娠的哺乳動物。
“基本上相同”指，當(dāng)最佳地比對時(shí)，例如，使用下述的方法，與第二個(gè)核酸或氨基酸序列(例如，內(nèi)皮糖蛋白或可溶內(nèi)皮糖蛋白序列)共有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸或氨基酸序列?！跋喈?dāng)大的同一性”可以用于指各種類型和長度的序列，如全長序列、表位或免疫原性肽、功能結(jié)構(gòu)域、編碼和/或調(diào)節(jié)序列、外顯子、內(nèi)含子、啟動子和基因組序列。通過屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的各種方式，可以確定兩個(gè)多肽或核酸序列之間的百分比同一性，例如，使用可公開得到的計(jì)算機(jī)軟件，如Smith Waterman Alignment(Smith，T.F.和M.S.Waterman(1981)J Mol Biol 147195-7)；包含在GeneMatcher PlusTM中的“BestFit”(Smith和Waterman，Advancesin Applied Mathematics，482-489(1981))，Schwarz和Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequence and Structure，Dayhof，M.O.，Ed pp353-358；BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool；(Altschul，S.F.，W.Gish，等(1990)J Mol Biol 215403-10)，BLAST-2，BLAST-P，BLAST-N，BLAST-X，WU-BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2，CLUSTAL，或Megalign(DNASTAR)軟件。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測量比對的適當(dāng)參數(shù)，包括在對比的序列長度上達(dá)到最大比對所需的任何算法。通常，就蛋白而言，對比序列的長度是至少10個(gè)氨基酸，優(yōu)選地20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400或至少437個(gè)氨基酸或更多。就核酸而言，對比序列的長度通常是至少25、50、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200或至少1311個(gè)核苷酸或更多。應(yīng)當(dāng)理解，為了確定序列同一性的目的，當(dāng)對比DNA序列和RNA序列時(shí)，胸腺嘧啶核苷酸相當(dāng)于尿嘧啶核苷酸。保守置換通常包含下列組內(nèi)的置換甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
“先兆子癇的癥狀”指下列任何一個(gè)(1)妊娠20周后，收縮血壓(BP)＞140mmHg且舒張BP＞90mmHg，(2)新發(fā)作的蛋白尿(利用測驗(yàn)片進(jìn)行尿分析為1+，24小時(shí)尿收集中的蛋白＞300mg，或隨機(jī)尿的蛋白/肌酸酐比＞0.3)，和(3)產(chǎn)后12周高血壓及蛋白尿消除。先兆子癇的癥狀還可包含腎功能障礙和腎小球內(nèi)皮增生或肥大?！白影B的癥狀”指由于妊娠或新近妊娠的影響所致的下列癥狀中任何一個(gè)的發(fā)展癲癇發(fā)作、昏迷、血小板減少癥、肝水腫、肺水腫和腦水腫。
“轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)”指哺乳動物生長因子，其具有TGF-β生物學(xué)活性，且是在脊椎動物中普遍存在的結(jié)構(gòu)上有關(guān)的旁分泌多肽家族的成員，且是后生動物生長、分化和形態(tài)發(fā)生因子大家族的原型(綜述見，Massaque等Ann Rev Cell Biol 6597-641(1990)；Massaque等Trends Cell Biol 4172-178(1994)；Kingsley Gene Dev.8133-146(1994)；和Sporn等J Cell Biol 1191017-1021(1992)。如上面的Kingsley所述，TGF-β超家族具有至少25個(gè)成員，且可以分成具有高度相關(guān)序列的不同亞家族。最明顯的亞家族包含下面的TGF-β亞家族，其包含至少4個(gè)與TGF-β1的相似性比與TGF-β超家族的其它成員更高的基因；活化素亞家族，其包含同源-或異源-二聚體或兩個(gè)亞基抑制素β-A和抑制素β-B。包括哺乳動物因子BMP2和BMP4的decapentaplegic亞家族，當(dāng)植入皮下或肌肉中時(shí)，可以誘導(dǎo)異位骨和軟骨的形成。包括許多哺乳動物同源物成員的60A亞家族具有骨誘導(dǎo)活性，包括BMP5-8。TGF-β超家族的其它成員包括總分化因子1(GDF-1)、GDF-3/VGR-2、背蛋白、結(jié)節(jié)的(nodal)、苗勒氏(mullerian)抑制物質(zhì)(MIS)和神經(jīng)膠質(zhì)衍生的神經(jīng)營養(yǎng)生長因子(GDNF)。應(yīng)當(dāng)指出，DPP和60A亞家族的彼此相關(guān)性比與TGF-β超家族的其它成員的相關(guān)性更緊密，且經(jīng)常一起歸入稱作DVR(dpp和vg1相關(guān)的)的更大分子集合的部分。除非在它使用的上下文中可以看出，在貫穿本說明書中使用的術(shù)語TGF-β應(yīng)當(dāng)理解為，通常指適合的TGF-β超家族的成員(Massague等，Annu.Rev.Biochem.67753-91，1998；Josso等，Curr.Op.Gen.Dev.，7371-377，1997)。TGF-β起調(diào)節(jié)許多細(xì)胞類型的生長、分化、運(yùn)動性、組織重建、神經(jīng)發(fā)生、創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡和血管生成的功能。TGF-β也抑制許多細(xì)胞類型的細(xì)胞增殖，并可以刺激基質(zhì)蛋白的合成。
“治療量”指施用給患有先兆子癇或子癇的患者時(shí)，足以引起本文所述先兆子癇或子癇癥狀的定性或定量減輕的量?！爸委熈俊边€指當(dāng)施用給患有先兆子癇或子癇的患者時(shí)，如通過本文所述的測定測得的，足以引起內(nèi)皮糖蛋白或sFlt-1表達(dá)水平降低、或VEGF或PlGF表達(dá)水平提高的量。
“治療”指為了治療目的，施用化合物或藥物組合物?！爸委熂膊　被蛴糜凇爸委熜蕴幚怼敝附o已經(jīng)患病的受試者施用治療，以改善受試者狀況。優(yōu)選地，基于下述任何一個(gè)特征癥狀的鑒別，或使用本文所述的診斷方法，診斷受試者患有與高血壓有關(guān)的妊娠并發(fā)癥，如先兆子癇或子癇?！邦A(yù)防疾病”指預(yù)防性地處理還沒有發(fā)病，但易感或另外有發(fā)展特定疾病危險(xiǎn)的受試者。優(yōu)選地，使用本文所述的診斷方法，確定受試者有發(fā)展先兆子癇或子癇的危險(xiǎn)。因此，在權(quán)利要求和實(shí)施方案中，治療是為了治療或預(yù)防目的而施用于哺乳動物的。
“滋養(yǎng)層”指覆蓋胚泡的中外胚層細(xì)胞層，其侵蝕子宮粘膜，且胚胎通過它從母體接受營養(yǎng)；該細(xì)胞有助于胎盤的形成。
“血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)”指哺乳動物生長因子，其與美國專利號5,332,671；5,240,848；5,194,596；和Charnock-Jones等(Biol.Reproduction，481120-1128，1993)中定義的生長因子同源，且具有VEGF生物學(xué)活性。VEGF以糖基化同源二聚體的形式存在，且包含至少4種不同的可變剪接的同工型。天然VEGF的生物學(xué)活性包括，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞或臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的選擇性生長，并誘導(dǎo)血管生成。如本文所使用的，VEGF包含任何VEGF家族成員或同工型(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF189、VEGF165或VEGF121)。優(yōu)選地，VEGF是VEGF121或VEGF165同工型(Tischer等，J.Biol.Chem.266，11947-11954，1991；Neufed等，Cancer Metastasis 15153-158，1996)，其在引入本文作為參考的美國專利號6,447,768；5,219,739；和5,194,596中描述。還包含VEGF的突變體形式，如在Gille等(J.Biol.Chem.2763222-3230，2001)中描述的KDR-選擇性VEGF和Flt-選擇性VEGF。如本文所使用的，VEGF也包括任何修飾形式的VEGF，如LeCouter等(Science 299890-893，2003)所述的那些。雖然優(yōu)選人VEGF，但本發(fā)明不限于人形式，且包含VEGF的其它動物形式(例如，小鼠、大鼠、狗或雞)。
“載體”指DNA分子，其通常來源于質(zhì)?；蚴删w，向其中可插入或克隆DNA片段。重組載體將包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的限制位點(diǎn)，且能夠在規(guī)定的宿主或載體生物中自主復(fù)制，從而使得克隆的序列可復(fù)制。載體包含與基因或編碼區(qū)可操作地連接的啟動子，這樣，轉(zhuǎn)染進(jìn)受體細(xì)胞后，可表達(dá)RNA。
從其優(yōu)選實(shí)施方案的下列描述以及權(quán)利要求中，可以明白本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡述本專利或申請文件含有至少一份彩色繪制的附圖。在請求并支付必需的費(fèi)用后，專利局會提供本專利或?qū)＠暾埞_文件的具有彩色附圖的副本。
圖1是顯示內(nèi)皮糖蛋白蛋白的示意圖。SP信號肽，ZP透明帶結(jié)構(gòu)域，CL潛在切割位點(diǎn)(氨基酸437)，以釋放可溶內(nèi)皮糖蛋白，TM跨膜結(jié)構(gòu)域，Cyto胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
圖2A顯示了可溶內(nèi)皮糖蛋白的預(yù)測的cDNA序列(SEQ ID NO1)。圖2B顯示了可溶內(nèi)皮糖蛋白的預(yù)測的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖3是顯示來自正常妊娠的胎盤(N)、來自輕度先兆子癇妊娠的胎盤(p)和來自重度先兆子癇妊娠的胎盤(P)的內(nèi)皮糖蛋白mRNA水平的RNA印跡。
圖4是顯示胎盤中的內(nèi)皮糖蛋白蛋白水平的蛋白印跡。樣品來自兩個(gè)先兆子癇患者p32和p36，其在2003呈遞給Beth Israel DeaconessMedical Center，且產(chǎn)婦血清來自妊娠婦女。使用從Santa CruzBiotechnology，Inc.，(Santa Cruz，CA)得到的N-末端抗體，探測蛋白印跡，其顯示了胎盤中的110kD帶和存在于胎盤和血清樣品中的更小的63kD帶。
圖5中的圖顯示了可溶內(nèi)皮糖蛋白在具有正常妊娠、輕度先兆子癇、重度先兆子癇和并發(fā)早產(chǎn)的無先兆子癇妊娠的婦女中的循環(huán)濃度。在分娩前24小時(shí)內(nèi)，得到所有血液樣品。使用購自R&DSystems，MN(目錄號DNDG00)的ELISA試劑盒，測量可溶內(nèi)皮糖蛋白。這些數(shù)據(jù)表明，在臨床疾病時(shí)，先兆子癇患者中的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平顯著升高。
圖6中的圖顯示了在各個(gè)胎齡組窗口期間，5個(gè)不同研究組的妊娠婦女在整個(gè)妊娠中的平均可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度。
圖7中的圖顯示了在各個(gè)胎齡組窗口期間，5個(gè)不同研究組的妊娠婦女在整個(gè)妊娠中的平均sFlt1濃度。
圖8中的圖顯示了在各個(gè)胎齡組窗口期間，5個(gè)不同研究組的妊娠婦女在整個(gè)妊娠中的平均PlGF濃度。
圖9中的圖顯示了在臨床癥狀之前采取的樣品的先兆子癇抗血管生成的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)值。
圖10中的圖顯示了根據(jù)臨床過早的先兆子癇(PE＜37周)之前的周數(shù)的可溶內(nèi)皮糖蛋白的平均濃度。
圖11中的圖顯示了根據(jù)臨床過早的先兆子癇(PE＜37周)之前的周數(shù)的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)值。
圖12中的圖顯示了對于在癥狀之前和之后的足孕先兆子癇(PE＞37周)，整個(gè)妊娠過程中的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的變化。
圖13中的圖顯示了對于在癥狀之前和之后的足孕先兆子癇(PE＞37周)，整個(gè)妊娠過程中的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)水平的變化。
圖14中的圖顯示了在妊娠高血壓期間和在妊娠高血壓之前(妊娠高血壓前1-5周(在妊娠的33-36周))的婦女和血壓正常對照中測得的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平。
圖15中的圖顯示了在妊娠高血壓期間和在妊娠高血壓之前(妊娠高血壓前1-5周(在妊娠的33-36周))的婦女和血壓正常對照中測得的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)水平。
圖16中的圖顯示了在33-36周妊娠窗口期間，在患有重度SGA、輕度SGA的婦女和血壓正常對照中測得的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平。
圖17中的圖顯示了在33-36周妊娠窗口期間，在患有重度SGA、輕度SGA的婦女和血壓正常對照中測得的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)水平。
圖18中的圖顯示了相同妊娠患者中的sFlt1和可溶內(nèi)皮糖蛋白的濃度的彼此關(guān)系圖。
圖19顯示了在25.2周采取的先兆子癇胎盤的內(nèi)皮糖蛋白(紅色)和平滑肌肌動蛋白(綠色)的雙免疫熒光染色的顯微照片。用于檢測內(nèi)皮糖蛋白的抗體將全長內(nèi)皮糖蛋白和可溶內(nèi)皮糖蛋白都染色。適當(dāng)?shù)娜焉锎翱诘膶φ仗ケP源自早產(chǎn)患者。
圖20顯示了在41.3周采取的先兆子癇胎盤的內(nèi)皮糖蛋白(紅色)和平滑肌肌動蛋白(綠色)的雙免疫熒光染色的顯微照片。用于檢測內(nèi)皮糖蛋白的抗體將全長內(nèi)皮糖蛋白和可溶內(nèi)皮糖蛋白都染色。適當(dāng)?shù)娜焉锎翱诘膶φ仗ケP源自早產(chǎn)患者。
圖21A是使用先兆子癇胎盤和血清兩者進(jìn)行內(nèi)皮糖蛋白的免疫沉淀法和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)得到的放射自顯影圖照片。圖21B是使用先兆子癇胎盤進(jìn)行內(nèi)皮糖蛋白的免疫沉淀法和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)得到的放射自顯影圖照片。3種不同的N和P樣品代表著單個(gè)的患者。就兩幅圖而言，使用商業(yè)上可得到的單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀法，并使用多克隆抗體進(jìn)行蛋白印跡。產(chǎn)生的這兩種抗體都針對內(nèi)皮糖蛋白蛋白的N-末端區(qū)，并檢測全長和截短的可溶內(nèi)皮糖蛋白蛋白兩者。
圖22中的圖顯示了使用在生長因子減少的matrigel中的HUVEC進(jìn)行血管生成測定的結(jié)果。在有可溶內(nèi)皮糖蛋白或sFlt1或二者存在下，進(jìn)行血管生成測定，并定量內(nèi)皮管長度。C-代表對照，E-代表1μg/ml的可溶內(nèi)皮糖蛋白，且S代表1μg/ml的sFlt1。E+S代表1μg/mlE+1μg/ml sFlt1的組合。數(shù)據(jù)代表著3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
圖23中的圖顯示了如材料和方法中所述，使用伊文思藍(lán)(Evansblue)泄漏，在小鼠中評估的幾種器官床中的微血管通透性。C-對照(GFP)，E-可溶內(nèi)皮糖蛋白，S-sFlt1，且S+E-sFlt1+可溶內(nèi)皮糖蛋白。數(shù)據(jù)代表著4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
圖24中的圖顯示了在有劑量范圍為200pg/ml-200ng/ml的TGF-β1(B1)和TGF-β3(B3)存在下，進(jìn)行微血管反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)的大鼠腎微血管直徑的百分比變化。在有1μg/ml可溶內(nèi)皮糖蛋白(E)存在下，重復(fù)這些相同的實(shí)驗(yàn)。顯示的這些數(shù)據(jù)代表著4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
圖25中的圖顯示了在有1ng/ml VEGF(V)、TGF-β1(B1)和組合(V+B1)存在下，腎微血管的血管直徑的百分比變化。還顯示了在有各1μg/ml的sFlt1(S)和可溶內(nèi)皮糖蛋白(E)(V+B1+S+E)存在下，該組合的作用。數(shù)據(jù)代表著4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
圖26A是在處死時(shí)從注射了sFlt1和對照腺病毒(CMV)的組合的妊娠大鼠采取的血液樣品的外周涂片的照片。圖26B是在處死時(shí)從注射了sFlt1和表達(dá)可溶內(nèi)皮糖蛋白的腺病毒的組合的妊娠大鼠采取的血液樣品的外周涂片的照片，并表現(xiàn)出活性溶血，如由裂紅細(xì)胞和升高的網(wǎng)狀細(xì)胞計(jì)數(shù)所證實(shí)的。箭頭代表裂紅細(xì)胞。
圖27A-D的一系列顯微照片顯示了表8所述的各種動物組的腎組織學(xué)(H&E染色)。圖27A顯示了對照組的腎組織學(xué)，沒有腎小球內(nèi)皮增生的跡象。圖27B顯示了可溶內(nèi)皮糖蛋白注射組的腎組織學(xué)，沒有腎小球內(nèi)皮增生的跡象。圖27C顯示了sFlt1注射的大鼠的腎組織學(xué)，顯示出中等內(nèi)皮增生(用箭頭指示)。圖27D顯示了可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt1注射的大鼠的腎組織學(xué)，顯示出非常腫脹的腎小球和嚴(yán)重的腎小球內(nèi)皮增生，在足細(xì)胞內(nèi)存在蛋白再吸收小滴。在60X(原始放大率)拍攝所有光顯微照片。
詳細(xì)描述我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在從患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的婦女采集的血清樣品中，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平提高?？扇軆?nèi)皮糖蛋白可以由蛋白水解酶切割膜結(jié)合形式的胞外部分來形成。過量的可溶內(nèi)皮糖蛋白可以耗盡胎盤的必需量的這些必需的血管生成和促有絲分裂因子。因而，可溶內(nèi)皮糖蛋白是妊娠相關(guān)的高血壓病癥(包括先兆子癇和子癇)的極好的診斷標(biāo)記。此外，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，干擾可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合生長因子的治療劑，降低可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)或生物學(xué)活性的試劑，或提高生長因子的水平的試劑，可以用于治療或預(yù)防受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇。這類試劑包含，但不限于，可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體，降低可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平的反義或RNAi的寡核苷酸，提高生長因子的水平的化合物，阻止膜結(jié)合形式的內(nèi)皮糖蛋白的蛋白酶剪切、從而預(yù)防可溶內(nèi)皮糖蛋白的釋放的化合物，和結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白并封閉生長因子結(jié)合位點(diǎn)的小分子。本發(fā)明也涉及測量可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平的方法，作為妊娠相關(guān)的高血壓病癥(包括先兆子癇和子癇)的早期診斷和控制的檢測工具。
盡管本文提供的詳細(xì)描述具體地涉及可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，該詳述也應(yīng)用于可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的家族成員、同工型和/或變體。
診斷學(xué)本發(fā)明涉及基于檢測可溶內(nèi)皮糖蛋白的測定，以檢測妊娠相關(guān)的高血壓病癥，如先兆子癇、子癇，或發(fā)展這樣狀況的傾向。盡管本文所述的方法具體地涉及先兆子癇和子癇，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的診斷和監(jiān)控方法適用于任何妊娠相關(guān)的高血壓病癥，包括但不限于，妊娠高血壓、具有小于胎齡兒(SGA)嬰兒的妊娠、HELLP、慢性高血壓、先兆子癇(輕度、中度和重度)和子癇。
在受試者樣品中測量內(nèi)皮糖蛋白的水平，無論是游離的、結(jié)合的還是總的水平，并將其用作先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的指標(biāo)。
患有先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的受試者，會表現(xiàn)出可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的表達(dá)的增加?？扇軆?nèi)皮糖蛋白多肽可包含全長可溶內(nèi)皮糖蛋白、降解產(chǎn)物、可溶內(nèi)皮糖蛋白的可變剪接的同工型、可溶內(nèi)皮糖蛋白的酶切割產(chǎn)物等。特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的抗體，可以用于診斷先兆子癇或子癇，或鑒別處于發(fā)展這樣狀況的危險(xiǎn)中的受試者。在本發(fā)明的方法中有用的抗體的一個(gè)實(shí)例是針對內(nèi)皮糖蛋白的N-末端區(qū)的單克隆抗體，其在商業(yè)上可從Santa CruzBiotechnology，Inc.(目錄號sc-20072)得到。已知許多種測量這樣的多肽的表達(dá)中的變化的規(guī)程，包括免疫學(xué)方法(如ELISA和RIA)，且其提供診斷先兆子癇或子癇或發(fā)展這樣狀況的危險(xiǎn)的基礎(chǔ)。另外，可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽水平的提高，可診斷患有先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的受試者。
升高水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白是先兆子癇或子癇的陽性指標(biāo)。例如，如果可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平相對于參照升高(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)，則認(rèn)為這是先兆子癇或子癇的陽性指標(biāo)。另外，可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的水平相對于正常水平的任何可檢測的變化，是子癇、先兆子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的指示。通常，在非妊娠狀態(tài)期間，可溶內(nèi)皮糖蛋白的循環(huán)血清濃度范圍是2-7ng/ml，而在正常妊娠期間，是10-20ng/ml。認(rèn)為升高的可溶內(nèi)皮糖蛋白的血清水平(大于15ng/ml、優(yōu)選地大于20ng/ml、且最優(yōu)選地大于25ng/ml或更高)，是先兆子癇的陽性指標(biāo)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，與sFlt-1、VEGF或PlGF多肽或核酸的水平、或其任意組合結(jié)合，測量可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平。測量sFlt-1、VEGF和PlGF的方法，記載在這里整體引作參考的PCT公開號WO2004/008946和美國公開號20040126828中。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，還測量體重指數(shù)(BMI)和胎兒的胎齡，并包括診斷度量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用包含可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF、或其中的任意組合的度量，來確定至少兩種蛋白的水平之間的關(guān)系是否可指示先兆子癇或子癇。在一個(gè)實(shí)例中，度量是PAAI(sFlt-1/VEGF+PlGF)，其與可溶內(nèi)皮糖蛋白測量結(jié)合，用作抗血管生成指數(shù)，后者可診斷先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向。如果可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平相對于參照樣品升高(例如，1.5倍、2倍、3倍、4倍或甚至高達(dá)10倍或更高)，且PAAI大于10、更優(yōu)選地大于20，則認(rèn)為受試者患有先兆子癇、子癇，或處于發(fā)展它們的迫切危險(xiǎn)中。PAAI(sFlt-1/VEGF+PlGF)比率僅僅是可以用作診斷指標(biāo)的有用度量的一個(gè)實(shí)例。它無意限制本發(fā)明。實(shí)際上，可以檢測受試者中相對于正常對照的可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF的水平的變化或其任意組合的任何度量，都可以用作診斷指標(biāo)。另一個(gè)實(shí)例是下面的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)(sFlt-1+0.25(可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽))/PlGF?？扇軆?nèi)皮糖蛋白度量的該值的增加，是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。超過100、優(yōu)選地超過200的可溶內(nèi)皮糖蛋白指數(shù)是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。另一個(gè)實(shí)例是下面的指數(shù)(可溶內(nèi)皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF。該指數(shù)還可以包含母親的BMI或嬰兒的GA。
標(biāo)準(zhǔn)方法可用于測量任何體液(包含但不限于，尿、血清、血漿、唾液、羊水或腦脊液)中的可溶內(nèi)皮糖蛋白、VEGF、PlGF或sFlt-1多肽的水平。這類方法包含免疫測定，ELISA，使用針對可溶內(nèi)皮糖蛋白、VEGF、PlGF或sFlt-1的抗體的蛋白印跡，以及定量酶免疫測定技術(shù)，如Ong等(Obstet.Gynecol.98608-611，2001)和Su等(Obstet.Gynecol.，97898-904，2001)描述的那些。ELISA測定是測量可溶內(nèi)皮糖蛋白、VEGF、PlGF或sFlt-1的水平的優(yōu)選方法。優(yōu)選地，測量可溶內(nèi)皮糖蛋白。
源自內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF核酸序列的寡核苷酸或更長的片段，可以用作探針，來不僅監(jiān)控表達(dá)，而且鑒別具有內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF核酸分子的遺傳性變異、突變或多態(tài)性的受試者，這些是發(fā)展先兆子癇或子癇的素因的指示。這些多態(tài)性可以影響核酸或多肽表達(dá)水平或生物學(xué)活性。這樣的多態(tài)性是熟練的技術(shù)人員已知的且記載在，例如，上面的Raab等和Parry等(Eur.JImmunogenet.26321-3，1999)。例如，已經(jīng)描述了內(nèi)皮糖蛋白基因的多態(tài)性，且其中的許多與稱作遺傳性出血性毛細(xì)管擴(kuò)張(telengiectasia)I型(HHT1)的顯性血管病癥有關(guān)。這些突變中的許多會導(dǎo)致不穩(wěn)定的可溶形式的內(nèi)皮糖蛋白的生成，從而導(dǎo)致在HHT患者的內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮糖蛋白降低的表達(dá)(Raab等，同上)。在另一個(gè)實(shí)例中，GenBank數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)的調(diào)查揭示了該基因和Flt-1/sFlt-1的啟動子區(qū)的至少330種已知多態(tài)性。相對于正常參照樣品的遺傳性變異、突變或多態(tài)性的檢測，可以用作先兆子癇、子癇或發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向的診斷指標(biāo)。
這種基因變化可存在于基因的啟動子序列、可讀框、內(nèi)含子序列或非翻譯3’區(qū)中。有關(guān)基因變化的信息，可用于診斷受試者患有先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向。如全文所述，可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的水平或生物學(xué)活性的特定變化，或其任意組合，可以與先兆子癇或子癇或它們的素因的可能性相關(guān)聯(lián)。結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員在檢測了給定突變后，可以測定蛋白的一種或多種生物學(xué)活性，以確定該突變是否會引起或增加先兆子癇或子癇的可能性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，患有先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的受試者將表現(xiàn)出編碼內(nèi)皮糖蛋白(優(yōu)選地可溶內(nèi)皮糖蛋白)或sFlt-1的核酸的表達(dá)的增加，或PlGF或VEGF水平的變化。用于檢測這種變化的方法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，且由上面的Ausubel等描述。在一個(gè)實(shí)例中，使用RNA印跡或?qū)崟r(shí)PCR檢測內(nèi)皮糖蛋白(優(yōu)選地可溶內(nèi)皮糖蛋白)、sFlt-1、PlGF或VEGF mRNA水平。
與能夠檢測內(nèi)皮糖蛋白或可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸分子的PCR探針(包含基因組序列或緊密相關(guān)分子)雜交，可用于和源自患有先兆子癇或子癇或處于發(fā)展這樣狀況的危險(xiǎn)中的受試者的核酸序列雜交。探針的特異性，不論其是從高特異性區(qū)(例如5’調(diào)節(jié)區(qū))還是從低特異性區(qū)(例如，保守基序)制造的，以及雜交或擴(kuò)增的嚴(yán)格性(最高、高、中等或低)，都可確定探針是否與天然存在的序列、等位基因變體或其它相關(guān)序列雜交。雜交技術(shù)可用于鑒別可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸分子中指示先兆子癇或子癇的突變，或可用于監(jiān)控編碼可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的基因的表達(dá)水平(例如，通過RNA印跡，Ausubel等，同上)。
在另一實(shí)施方案中，通過直接分析內(nèi)皮糖蛋白或可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸分子的序列，可診斷受試者發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向。
本文所述的任一種核酸或多肽的測量，可以發(fā)生在至少兩個(gè)不同的場合，并將與正常參照水平相比隨時(shí)間推移產(chǎn)生的水平的變化，用作先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的指標(biāo)。
存在于患有先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的受試者的體液中的任一種可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽或核酸的水平，與正常對照受試者的水平相比，或與以前從相同受試者的相同體液得到的采樣相比，可以增加少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。從一次測量至下一次測量，存在于患有先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的受試者的體液中的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽或核酸的水平，可以隨時(shí)間推移改變少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％。
與患有先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的受試者的體液中的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平結(jié)合測量的sFlt-1、VEGF或PlGF的水平，與正常對照中的sFlt-1、VEGF或PlGF的水平相比，可以改變少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。從一次測量至下一次測量，與患有先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的受試者的體液中的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平結(jié)合測量的sFlt-1、VEGF或PlGF的水平，可以隨時(shí)間推移改變少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在發(fā)作先兆子癇癥狀前的妊娠早期，收集受試者的體液樣品(例如，尿、血漿、血清、羊水或腦脊液)。在另一實(shí)例中，樣品可以是在發(fā)作先兆子癇癥狀前的妊娠早期收集的組織或細(xì)胞。組織和細(xì)胞的非限制性實(shí)例包含胎盤組織、胎盤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞如單核細(xì)胞。在人類中，例如，在妊娠的前三個(gè)月、次三個(gè)月或第三個(gè)三個(gè)月期間，收集孕婦肘前靜脈的產(chǎn)婦血清樣品。優(yōu)選地，在前三個(gè)月(例如在4、6、8、10或12周)期間，或其中的任何時(shí)間間隔進(jìn)行測定，或在次三個(gè)月(例如在14、16、18、20、22或24周)期間，或其中的任何時(shí)間間隔進(jìn)行測定。這樣的測定還可在次三個(gè)月結(jié)束時(shí)或第三個(gè)三個(gè)月時(shí)進(jìn)行，例如，在26、28、30、32、34、36或38周，或其中的任何時(shí)間間隔。優(yōu)選地，在該時(shí)間段內(nèi)，將可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平測量兩次。就產(chǎn)后先兆子癇或子癇的診斷而言，可溶內(nèi)皮糖蛋白的測定可在產(chǎn)后進(jìn)行。就發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向的診斷而言，在發(fā)作妊娠之前進(jìn)行測定。在一個(gè)實(shí)例中，就治療的監(jiān)控和控制而言，在診斷先兆子癇后、在妊娠過程中進(jìn)行測定。
在一個(gè)特定的實(shí)例中，可在妊娠過程中收集系列血液樣品，并通過ELISA測定可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平。在另一個(gè)實(shí)例中，在次三個(gè)月期間和第三個(gè)三個(gè)月的早期收集樣品，且從第一次取樣到下一次取樣的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平的增加，是先兆子癇或子癇或發(fā)展任一種的傾向的指示。
本發(fā)明也包含測量受試者體液(優(yōu)選地尿)中的可溶內(nèi)皮糖蛋白(例如，TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)配體的任一種配體，且可溶內(nèi)皮糖蛋白配體水平的變化(例如，增加或減少)是先兆子癇或子癇的指示。
在獸醫(yī)實(shí)踐中，可在妊娠過程中的任何時(shí)間進(jìn)行測定，但優(yōu)選地在妊娠早期、發(fā)作先兆子癇癥狀前進(jìn)行。已知妊娠期限在物種之間廣泛變化，測定時(shí)間選擇將由獸醫(yī)決定，但通常與人類妊娠過程的測定時(shí)間選擇相對應(yīng)。
可以單獨(dú)地，或與本文所述的任何其它診斷方法結(jié)合地，使用本文所述的診斷方法，以更準(zhǔn)確地診斷先兆子癇或子癇的存在、嚴(yán)重程度或估計(jì)的發(fā)作時(shí)間。此外，本文所述的診斷方法可與用于準(zhǔn)確診斷先兆子癇或子癇的存在、嚴(yán)重程度或估計(jì)的發(fā)作時(shí)間的任何其它診斷方法結(jié)合使用。
本文所述診斷方法還可用于監(jiān)控并控制受試者的先兆子癇或子癇。在一個(gè)實(shí)例中，施用治療，直到血液、血漿或血清可溶內(nèi)皮糖蛋白水平小于25ng/ml。在另一個(gè)實(shí)例中，如果測得受試者具有比正常對照升高水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白，則可以施用治療，直到血清PlGF水平升高到約400pg/mL。在該實(shí)施方案中，重復(fù)測量可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF和VEGF的水平，或它們中的任一種或全部，作為不僅診斷疾病，而且監(jiān)控先兆子癇和子癇的治療和控制的方法。
診斷試劑盒本發(fā)明還提供診斷試驗(yàn)試劑盒。例如，診斷試驗(yàn)試劑盒可包含可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體，和用于檢測、且更優(yōu)選用于評價(jià)抗體與可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽之間的結(jié)合的工具。對于檢測，標(biāo)記抗體或可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽，且抗體或可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽是基質(zhì)-結(jié)合的，這樣在抗體與可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽之間結(jié)合后，通過測定附著到基質(zhì)上的標(biāo)記的量，就可以確定可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽-抗體的相互作用。常規(guī)的ELISA是本領(lǐng)域已知的檢測抗體-基質(zhì)相互作用的常見方法，且可以與本發(fā)明的試劑盒一起提供。實(shí)際上，可在任何體液(包含但不限于尿、血清、血漿、唾液、羊水或腦脊液)中檢測可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽。本發(fā)明也提供了包含可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸的診斷試驗(yàn)試劑盒，所述可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸可以用于檢測和確定可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸的水平。測定可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平相對于參照(如存在于正常對照中的水平)的變化的試劑盒，可用作本發(fā)明方法中的診斷試劑盒。
本發(fā)明的診斷試劑盒可以包含用于檢測美國專利申請公開號20040126828、20050025762和2005017044和PCT公開號WO2004/008946和WO 2005/077007所述的sFlt-1、VEGF或PlGF多肽或核酸的抗體或核酸。
合意地，試劑盒包含進(jìn)行上述的任一種診斷方法必需的所有組分。例如，試劑盒合意地包含膜，其中在該膜上固定化了可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合試劑或結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合試劑的試劑。該膜可以支持在測驗(yàn)片結(jié)構(gòu)上，在那里通過將測驗(yàn)片結(jié)構(gòu)置于樣品中，將樣品沉積于膜上，或該膜可以支持在側(cè)向流盒中，在那里通過盒子中的開口，將樣品沉積于膜上。
診斷試劑盒通常還包含關(guān)于試劑盒組分的預(yù)期用途的標(biāo)簽或說明書，和用于確立標(biāo)準(zhǔn)曲線的參照樣品或純化的蛋白。在一個(gè)實(shí)例中，試劑盒含有關(guān)于使用試劑盒來診斷先兆子癇、子癇或發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向的說明書。在另一個(gè)實(shí)例中，試劑盒含有關(guān)于使用試劑盒來監(jiān)控治療先兆子癇或子癇的治療性處理或劑量方案的說明書。診斷試劑盒也可以包含關(guān)于使用試劑盒來確定受試者樣品的PAAI或可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)、并將PAAI或可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)與參照樣品值相對比的標(biāo)簽或說明書。應(yīng)當(dāng)理解，參照樣品值將取決于試劑盒的預(yù)期用途。例如，可以將樣品與正常參照值相對比，其中PAAI或可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)或可溶內(nèi)皮糖蛋白值的增加，是先兆子癇或子癇或發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向的指示。在另一個(gè)實(shí)例中，用于治療性監(jiān)控的試劑盒可以具有參照PAAI或可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)值或可溶內(nèi)皮糖蛋白值，它是先兆子癇或子癇的指示，其中與參照樣品相比受試者樣品的PAAI或可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)值的降低或可溶內(nèi)皮糖蛋白值的降低，可以用于指示治療性化合物的治療功效或有效劑量。
篩選測定如上面所討論的，可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸或多肽的水平在患有先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣狀況的傾向的受試者中升高?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的組合物可用于候選化合物的高通量低成本篩選，以鑒別調(diào)節(jié)可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽或核酸分子的表達(dá)的那些，所述表達(dá)在患有先兆子癇或子癇的受試者中發(fā)生變化。
許多方法都可用于進(jìn)行篩選測定，以鑒別改變可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸分子的表達(dá)的新候選化合物。在一個(gè)工作實(shí)施例中，將各種濃度的候選化合物加入到表達(dá)可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸序列的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中。示例性的細(xì)胞培養(yǎng)物包含滋養(yǎng)層(例如，BEWO、JAR和JEG細(xì)胞)和HUVEC?？梢杂玫鞍酌?例如，基質(zhì)金屬蛋白酶)處理表達(dá)高水平的膜結(jié)合形式的內(nèi)皮糖蛋白的細(xì)胞，所述蛋白酶切割內(nèi)皮糖蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域以形成可溶內(nèi)皮糖蛋白。然后，這些細(xì)胞可以用于篩選新候選化合物。然后測量基因表達(dá)，例如，通過微陣列分析、RNA印跡分析(Ausubel等，同上)或RT-PCR，其中使用從核酸分子制備的任何適宜片段作為雜交探針。將在有候選化合物存在下的基因表達(dá)水平與在缺少候選化合物的對照培養(yǎng)基中測量的水平相比較。促進(jìn)可溶內(nèi)皮糖蛋白基因、核酸分子或多肽、或其功能等價(jià)物的表達(dá)的降低的化合物，被認(rèn)為可用于本發(fā)明中；可使用這類分子，例如，作為治療受試者的先兆子癇或子癇的治療劑。
在另一個(gè)工作實(shí)施例中，可使用相同的一般方法和標(biāo)準(zhǔn)的免疫學(xué)技術(shù)，如使用對可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽特異性的抗體進(jìn)行的蛋白印跡或免疫沉淀法，在多肽產(chǎn)生水平測量候選化合物的作用。例如，免疫測定可用于檢測或監(jiān)控本發(fā)明至少一種多肽在生物中的表達(dá)。能夠結(jié)合這種多肽的多克隆或單克隆抗體(如上所述產(chǎn)生的)，可用于任何標(biāo)準(zhǔn)免疫測定形式(例如，ELISA、蛋白印跡或RIA測定)中，以測量所述多肽的水平。在某些實(shí)施方案中，促進(jìn)可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽表達(dá)或生物學(xué)活性的降低的化合物，被認(rèn)為是特別有用的。同樣，可使用這類分子，例如，作為延遲、改善或治療受試者的先兆子癇或子癇、或先兆子癇或子癇癥狀的治療劑。
在另一個(gè)工作實(shí)施例中，可篩選候選化合物中特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的那些。這種候選化合物的功效取決于它與這類多肽或其功能等價(jià)物相互作用的能力。使用任意數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合技術(shù)和功能測定(例如，上面的Ausubel等描述的那些)，可容易地測定這種相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，可體外測試候選化合物的特異性地結(jié)合本發(fā)明多肽的能力。在另一實(shí)施方案中，可通過降低可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和生長因子(如TGF-β、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)的結(jié)合，測試候選化合物降低可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的生物學(xué)活性的能力。
在另一個(gè)工作實(shí)施例中，將可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸表達(dá)成具有可檢測的報(bào)道分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯融合體，并在異源啟動子(如誘導(dǎo)型啟動子)的控制下，在分離的細(xì)胞(例如，哺乳動物或昆蟲細(xì)胞)中表達(dá)。然后，使表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞與候選化合物接觸，并將可檢測的報(bào)道分子在該細(xì)胞中的表達(dá)與可檢測的報(bào)道分子在未處理的對照細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行比較。降低可溶內(nèi)皮糖蛋白可檢測的報(bào)道分子的表達(dá)的候選化合物，是可用于治療先兆子癇或子癇的化合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，候選化合物改變與核酸融合的報(bào)道基因或核酸的表達(dá)。
在一個(gè)特定的工作實(shí)施例中，使用基于層析的技術(shù)，可以鑒別結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的候選化合物。例如，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以從被工程改造以表達(dá)多肽(例如，上述那些)的細(xì)胞，純化本發(fā)明的重組多肽，且可將其固定化在柱上。然后，使候選化合物的溶液通過柱，且基于結(jié)合多肽并固定化在柱上的能力，鑒別對可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽特異性的化合物。為了分離化合物，洗滌柱，以除去非-特異性結(jié)合的分子，然后使目標(biāo)化合物從柱上釋放，并收集。類似的方法可用于分離與多肽微陣列結(jié)合的化合物。如果需要，可以進(jìn)一步純化(例如，通過高效液相層析)通過該方法(或任何其它適宜方法)分離的化合物。此外，還可測試這些候選化合物的降低可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的活性的能力。也可以使用通過該方法分離的化合物，例如，作為治療人受試者的先兆子癇或子癇的治療劑。認(rèn)為鑒定為以小于或等于10mM的親和常數(shù)結(jié)合本發(fā)明多肽的化合物，特別適用于本發(fā)明?；蛘?，任何體內(nèi)蛋白相互作用檢測系統(tǒng)，例如，任何雙雜交測定，均可用于鑒別結(jié)合本發(fā)明多肽的化合物或蛋白。
潛在的拮抗劑包含結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸序列或可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的有機(jī)分子、肽、肽模擬物、多肽、核酸以及抗體。
可溶內(nèi)皮糖蛋白DNA序列還可用于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)治療先兆子癇或子癇的治療性化合物。編碼的蛋白在表達(dá)后，可用作藥物篩選的靶。此外，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Ausubel等，同上)，可分離編碼所編碼蛋白的氨基末端區(qū)的DNA序列、或Shine-Delgarno序列、或其它翻譯促進(jìn)序列。
任選地，在上述任何測定的任一個(gè)中鑒別的化合物，被證實(shí)可以用于測定降低可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物學(xué)活性的化合物。
本發(fā)明的小分子優(yōu)選地具有低于2,000道爾頓、更優(yōu)選300-1,000道爾頓、且最優(yōu)選400-700道爾頓的分子量。優(yōu)選地，這些小分子是有機(jī)分子。
試驗(yàn)化合物和提取物通常，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，從天然產(chǎn)物或合成的(或半-合成的)提取物的大文庫或化學(xué)文庫或多肽或核酸文庫中，鑒別能夠降低可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的活性的化合物。藥物發(fā)現(xiàn)與開發(fā)領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，試驗(yàn)提取物或化合物的準(zhǔn)確來源對于本發(fā)明的篩選程序并不特別重要。用于篩選的化合物可包含已知化合物(例如，用于其它疾病或病癥的已知治療劑)?；蛘?，事實(shí)上，使用本文所述方法，可篩選任意數(shù)目的未知的化學(xué)提取物或化合物。這種提取物或化合物的實(shí)例包含但不限于，基于植物、真菌、原核生物或動物的提取物、發(fā)酵液體培養(yǎng)基、和合成化合物，以及現(xiàn)有化合物的修飾。還有很多方法也可用于隨機(jī)地生成或定向地合成(例如，半合成或全合成)任意數(shù)目的化合物，包含但不限于，基于糖、脂類、肽、及核酸的化合物。合成化合物文庫在商業(yè)上可從Brandon Associates(Merrimack，NH)和Aldrich Chemical(Milwaukee，WI)得到?；蛘?，細(xì)菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫，在商業(yè)上可從很多來源得到，包含Biotics(Sussex，UK)、Xenova(Slough，UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft.Pierce，F(xiàn)L)和PharmaMar，U.S.A.(Cambridge，MA)。此外，如果需要，按照本領(lǐng)域已知的方法，例如，通過標(biāo)準(zhǔn)的提取和分級分離方法，可以產(chǎn)生天然的及合成產(chǎn)生的文庫。此外，如果需要，使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)、物理或生物化學(xué)的方法，可以很容易地修飾任何文庫或化合物。
此外，藥物發(fā)現(xiàn)與開發(fā)領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地理解，不論何時(shí)，都應(yīng)該應(yīng)用反篩選(dereplication)(例如，分類反篩選、生物學(xué)反篩選和化學(xué)反篩選、或其任意組合)或除去已知脫換物(molt)-破壞活性的材料的復(fù)制或重復(fù)的方法。
當(dāng)發(fā)現(xiàn)粗提取物可降低可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽活性、或結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽時(shí)，進(jìn)一步分級分離陽性的先導(dǎo)提取物，是分離負(fù)責(zé)所觀察到的作用的化學(xué)組分所必需的。因此，提取、分級分離和純化方法的目的是，認(rèn)真表征和鑒別粗提取物內(nèi)的降低可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的活性的化學(xué)實(shí)體。這種異質(zhì)提取物的分級分離和純化方法是本領(lǐng)域已知的。如需要，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法，化學(xué)地修飾可用作治療人先兆子癇或子癇的治療劑的化合物。
治療本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防受試者的先兆子癇或子癇的方法和組合物。假設(shè)患有先兆子癇、子癇或具有這樣狀況的素因的受試者中的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平升高，則降低可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽或核酸分子的表達(dá)水平和/或生物學(xué)活性的任何試劑，都可以用于本發(fā)明的方法中。這樣的試劑包含化合物如TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2或BMP7，其可以破壞可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合配體；特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的純化的抗體或抗原結(jié)合片段；反義核堿基寡聚體；和用于介導(dǎo)RNA干擾的dsRNA。其它有用的化合物包括可以改變可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物學(xué)活性的任意化合物，例如，如通過血管生成測定所測得的。下面詳細(xì)描述了示例性的治療方法。這些方法也可以與如PCT公開號WO 2004/008946和美國專利公開號20040126828所述的降低sFlt-1水平、或升高VEGF或PlGF水平、或降低sFlt-1水平的方法相組合。
靶向TGF-β信號傳導(dǎo)途徑的治療劑TGF-β是至少25種生長因子的家族的原型，所述生長因子在許多細(xì)胞類型中調(diào)節(jié)生長、分化、運(yùn)動性、組織重建、神經(jīng)發(fā)生、創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡和血管生成。TGF-β也抑制許多細(xì)胞類型的細(xì)胞增殖，并可以刺激基質(zhì)蛋白的合成。除了在它使用的上下文中可以看出以外，在貫穿本說明書中使用的術(shù)語TGF-β應(yīng)當(dāng)理解為，通常指適合的TGF-β超家族的任一個(gè)或所有成員?？扇軆?nèi)皮糖蛋白結(jié)合TGF-β家族的幾個(gè)特定成員，包括TGF-β1、TGF-β3、活化素、BMP-2和BMP-7，且可以用于耗盡發(fā)育中的胎兒或胎盤的必需的促有絲分裂因子和血管生成因子。本發(fā)明涉及提高這些配體的水平來結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白和中和可溶內(nèi)皮糖蛋白的作用的方法。
純化的蛋白在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，給受試者施用純化形式的任何可溶內(nèi)皮糖蛋白配體，如TGF-β家族蛋白，包含但不限于TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7，以治療或預(yù)防先兆子癇或子癇。
純化的TGF-β家族蛋白包含任何下述的蛋白其氨基酸序列與TGF-β1或TGF-β3或任何已知TGF-β家族成員的氨基酸序列同源，更合意地基本相同，其可誘導(dǎo)血管生成。非限制性實(shí)例包含來自R&D Systems，MN的人TGF-β1(Cat#240-B-002)和人TGF-β3(Cat#243-B3-002)。
抑制內(nèi)皮糖蛋白(endgolin)的蛋白酶剪切的治療性化合物我們已經(jīng)鑒別了內(nèi)皮糖蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域中的潛在切割位點(diǎn)，蛋白水解酶會在這里切割膜結(jié)合形式的內(nèi)皮糖蛋白，從而釋放出可溶形式的胞外結(jié)構(gòu)域。我們的切割位點(diǎn)的序列比對表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)負(fù)責(zé)切割和釋放可溶內(nèi)皮糖蛋白?；蛘?，組織蛋白酶或彈性蛋白酶也可以參與切割事件。MMP也稱作膠原酶、明膠酶和溶基質(zhì)素，且存在26個(gè)已知的家族成員(綜述見Whittaker和Ayscough，Cell Transmissions 171(2001))。優(yōu)選的MMP是MMP9，已知它在先兆子癇患者的胎盤中受到上調(diào)(Lim等，Am.J.Pathol.1511809-1818，1997)。通過酶原的激活和內(nèi)源抑制劑(如金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPS))的抑制，控制MMP的活性。MMP的抑制劑是鋅結(jié)合蛋白。存在4種已知的內(nèi)源抑制劑(TIMP 1-4)，其綜述見上面的Whittaker等。一種優(yōu)選的MMP抑制劑是膜型-MMP1的抑制劑，已經(jīng)表明它會切割β聚糖，即與內(nèi)皮糖蛋白(enodglin)共有相似性的一種分子(Velasco-Loyden等，J.Biol.Chem.2797721-7733(2004))。此外，已經(jīng)鑒別出了許多種天然存在的和合成的MMP抑制劑，且其綜述也見上面的Whittaker等。實(shí)例包含針對MMP的抗體，和各種化合物，包括馬馬司他、巴馬司他、CT1746、BAY 12-9566、普馬司他(prinomastat)、CGS-27023A、D9120、BMS275291(BristolMyers Squibb)和trocade，其中的一些現(xiàn)在處于臨床試驗(yàn)中。已知MMP、組織蛋白酶或彈性蛋白酶在釋放和上調(diào)可溶內(nèi)皮糖蛋白水平中的潛在作用，本發(fā)明也提供了已知抑制參與可溶內(nèi)皮糖蛋白的切割和釋放的任意MMP、組織蛋白酶或彈性蛋白酶的活性的任意化合物(如上述的那些)在治療或預(yù)防受試者的先兆子癇或子癇中的用途。
增加可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白的治療性化合物本發(fā)明提供了已知刺激或升高可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白(包含但不限于TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7)的血清水平的任意化合物在治療或預(yù)防受試者的先兆子癇中的用途。可以單獨(dú)地，或與上述純化的蛋白或用于提高本文所述的TGF-β家族蛋白蛋白水平的任何其它方法組合地，使用這些化合物。在一個(gè)實(shí)例中，在每天兩次100-200mg的劑量，使用環(huán)孢菌素來刺激TGF-β1生產(chǎn)。
除了可以提高可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白的血清水平的化合物的用途以外，本發(fā)明提供了與本文所述的任一種治療方法結(jié)合使用的任意慢性高血壓藥物治療的用途。用于治療妊娠過程中的高血壓的藥物治療包含甲基多巴、鹽酸肼苯噠嗪或拉貝洛爾。對于這些藥物治療中的每一種而言，施用方式和劑量可由醫(yī)師或按照制造商的說明書確定。
改變可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗血管生成活性的治療性化合物使用血管生成測定，可以鑒別其它治療性化合物。例如，將具有升高水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白的先兆子癇血清加入matrigel管形成測定中，將誘導(dǎo)抗血管生成狀態(tài)。然后，可以將測試化合物加入測定中，且抗血管生成狀態(tài)逆轉(zhuǎn)10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，表明該化合物可以降低可溶內(nèi)皮糖蛋白的生物學(xué)活性，且可用作治療性化合物。
治療性核酸近來的工作表明，將能夠表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞促分裂原(如VEGF)的核酸(DNA或RNA)遞送到血管損傷部位，將誘導(dǎo)受損血管的增殖和再次內(nèi)皮化(reendothelialization)。雖然本發(fā)明不涉及血管損傷，但這些用于向內(nèi)皮細(xì)胞遞送核酸的普通技術(shù)也可用于本發(fā)明中，以用于遞送編碼可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白(如TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7)的核酸。該技術(shù)也可以用于遞送編碼蛋白的核酸，所述蛋白已知已知抑制參與可溶內(nèi)皮糖蛋白的切割和釋放的任意MMP、組織蛋白酶或彈性蛋白酶的活性，如上述的那些，以用于治療或預(yù)防受試者的先兆子癇或子癇。這些普通技術(shù)在美國專利號5,830,879和6,258,787中描述，它們引入本文作為參考。
在本發(fā)明中，核酸可以是任何核酸(DNA或RNA)，包含編碼可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白(如TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7)的基因組DNA、cDNA和mRNA。使用本領(lǐng)域的常規(guī)操作，例如，重組DNA、PCR擴(kuò)增，可獲得編碼所需蛋白的核酸。
遞送核酸的方式對于本文所述的任一種核酸應(yīng)用，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的施用核酸的方法。例如，為了簡化編碼可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白的核酸的操作和處理，優(yōu)選地將核酸插入到與啟動子可操作地連接的盒中。啟動子必須能夠驅(qū)動可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白在所需靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)。適宜啟動子的選擇可很容易實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，人們可使用高表達(dá)啟動子。適宜啟動子的實(shí)例是763-堿基對巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子。還可使用勞斯肉瘤病毒(RSV)(Davis等，Hum.Gene Ther.4151-159，1993)和小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子。某些蛋白可使用它們的天然啟動子表達(dá)。還可包含可增強(qiáng)表達(dá)的其它元件(例如，產(chǎn)生高水平表達(dá)的增強(qiáng)子或系統(tǒng)，如tat基因和tar元件)。重組載體可以是質(zhì)粒載體，如pUC118、pBR322或其它已知的質(zhì)粒載體，它包含，例如，大腸桿菌(E.coli)復(fù)制起點(diǎn)(見，Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratorypress，1989)。質(zhì)粒載體還可包含選擇標(biāo)記，如氨芐青霉素抗性的β內(nèi)酰胺酶基因，前提是，標(biāo)記多肽不會不利地影響所治療生物的代謝。所述盒還可結(jié)合合成遞送系統(tǒng)(如PCT公開號WO95/22618中公開的系統(tǒng))中的核酸結(jié)合部分。
可通過適合所用載體的任何方法，將核酸引入到細(xì)胞中。許多這類方法都是本領(lǐng)域熟知的(Sambrook等，同上和Watson等，“Recombinant DNA”，Chapter 12，第2版，Scientific AmericanBooks，1992)。通過如磷酸鈣沉淀、電穿孔、脂質(zhì)體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、基因槍、顯微注射、病毒殼體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、聚凝胺-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移或原生質(zhì)體融合等方法，可以轉(zhuǎn)移重組載體。關(guān)于脂質(zhì)體制備、內(nèi)含物的靶向和遞送的程序的綜述，見Mannino和Gould-Fogerite(BioTechniques，6682-690，1988)，F(xiàn)elgner和Holm(Bethesda Res.Lab.Focus，1121，1989)以及Maurer(Bethesda Res.Lab.Focus，1125，1989)。
重組載體(質(zhì)粒載體或病毒載體)的轉(zhuǎn)移，可通過直接注射到羊水中或通過靜脈內(nèi)遞送來完成。
還可使用利用腺病毒載體或腺伴隨載體(AAV)進(jìn)行的基因遞送。腺病毒存在于許多動物物種中，致病性并不高，且可在分裂中的和休眠的細(xì)胞中同等復(fù)制。作為一般規(guī)律，基因遞送所用的腺病毒缺少病毒復(fù)制所需的一個(gè)或多個(gè)基因。用于遞送可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白的復(fù)制-缺陷型重組腺病毒載體，可根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)生產(chǎn)(見，Quantin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，892581-2584，1992；Stratford-Perricadet等，J Clin.Invest.，90626-630，1992；和Rosenfeld等，Cell，68143-155，1992)?；虔煼ㄔ谧訉m內(nèi)使用的實(shí)例，見美國專利號6,399,585。
一旦轉(zhuǎn)染，核酸就由損傷部位的細(xì)胞表達(dá)一段時(shí)間，這段時(shí)間足以提高可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白的血清水平。因?yàn)楹泻怂岬妮d體通常沒有被摻入到細(xì)胞基因組中，所以目標(biāo)蛋白的表達(dá)只進(jìn)行有限的時(shí)間。通常，在治療水平表達(dá)蛋白約2天到幾周，優(yōu)選約1-2周。DNA的再次應(yīng)用，可用于提供治療性蛋白表達(dá)的額外時(shí)間段。
抑制可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)的治療性核酸本發(fā)明還涉及反義核堿基寡聚體在直接下調(diào)可溶內(nèi)皮糖蛋白mRNA的表達(dá)中的用途。通過結(jié)合互補(bǔ)核酸序列(有義或編碼鏈)，反義核堿基寡聚體能夠抑制蛋白表達(dá)，可能是通過RNA酶H對RNA鏈的酶促切割。優(yōu)選地，反義核堿基寡聚體能夠降低表達(dá)升高水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白的細(xì)胞中的可溶內(nèi)皮糖蛋白蛋白表達(dá)。優(yōu)選地，與用對照寡核苷酸處理的細(xì)胞相比，可溶內(nèi)皮糖蛋白蛋白表達(dá)降低了至少10％，優(yōu)選地20％或更大，更優(yōu)選地40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。選擇和制備反義核堿基寡聚體的方法是本領(lǐng)域熟知的。使用反義核堿基寡聚體下調(diào)VEGF表達(dá)的實(shí)例，見美國專利號6,410,322，其引入本文作為參考。測定蛋白表達(dá)水平的方法也是本領(lǐng)域熟知的，且包含蛋白印跡、免疫沉淀法和ELISA。
本發(fā)明還涉及RNA干擾(RNAi)在抑制可溶內(nèi)皮糖蛋白的表達(dá)中的用途。RNA干擾(RNAi)是近來發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)的機(jī)理，其中與目標(biāo)基因或mRNA相對應(yīng)的雙鏈RNA(dsRNA)被引入到生物中，從而導(dǎo)致對應(yīng)mRNA的降解。在RNAi反應(yīng)中，dsRNA分子的有義和反義鏈被加工成長度為21-23個(gè)核苷酸(nt)且具有2-核苷酸3’尾的小RNA片段或區(qū)段?；蛘?，可以合成合成的dsRNA，它們長21-23nt，且具有2-核苷酸3’尾，純化，并用于反應(yīng)中。這些21-23nt dsRNA被稱作“指導(dǎo)RNA”或“短干擾RNA”(siRNA)。
然后，siRNA雙鏈體與核酸酶復(fù)合物結(jié)合，該核酸酶復(fù)合物由靶向且破壞內(nèi)源mRNA的蛋白構(gòu)成，所述內(nèi)源mRNA與復(fù)合物內(nèi)的siRNA具有同源性。雖然仍然不清楚復(fù)合物內(nèi)的蛋白的特性，但復(fù)合物的功能是，通過siRNA鏈中的一條和內(nèi)源mRNA之間的堿基配對相互作用，靶向同源的mRNA分子。然后，從siRNA的3’末端切割下約12nt的mRNA，并降解。以這種方式，可靶向特定基因并將其降解，由此導(dǎo)致靶定的基因的蛋白表達(dá)的喪失。也可以化學(xué)地合成siRNA，或從化學(xué)地合成siRNA的公司(例如，Dharmacon ResearchInc.，Pharmacia或ABI)得到。
dsRNA的特殊要求和修飾在PCT公開號WO01/75164(引入本文作為參考)中描述。盡管dsRNA分子的長度可發(fā)生變化，但最優(yōu)選地，使用siRNA分子，它是21-23核苷酸dsRNA，具有特征性的2-3-核苷酸3’突出端，通常為(2’脫氧)胸苷或尿嘧啶。siRNA通常包含3’羥基。還可使用單鏈的siRNA以及平端形式的dsRNA。為了進(jìn)一步提高RNA的穩(wěn)定性，可使3’突出端穩(wěn)定化以防降解。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，通過包含嘌呤核苷酸(如腺苷或鳥苷)，穩(wěn)定化RNA。或者，用修飾的類似物置換嘧啶核苷酸，例如，用(2’-脫氧)胸苷置換尿苷2-核苷酸突出端是可耐受的，且不會影響RNAi的功效。2’羥基的不存在顯著提高組織培養(yǎng)基中突出端的核酸酶抗性。
或者，可以使用PCT公開號WO01/75164(引入本文作為參考)中提出的方法中的任一種，或使用RNA體外轉(zhuǎn)錄的標(biāo)準(zhǔn)程序和Elbashir等(Genes&Dev.，15188-200，2001)描述的dsRNA退火程序，制備siRNA。還可按照上面Elbashir等所述，獲得siRNA，即在加工dsRNA以產(chǎn)生約21-約23個(gè)核苷酸的siRNA的條件下，在合胞體囊胚層果蠅(Drosophila)胚胎的無細(xì)胞的果蠅裂解物中溫育與靶基因序列相對應(yīng)的dsRNA，然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)分離。例如，凝膠電泳可用于分離21-23nt RNA，然后可以從凝膠切片洗脫。此外，層析(例如，大小排阻層析)、甘油梯度離心及用抗體進(jìn)行的親和純化，都可用于分離21-23nt RNA。
許多種方法可以用于將dsRNA或寡核苷酸轉(zhuǎn)染或?qū)脒M(jìn)哺乳動物細(xì)胞。例如，存在幾種商業(yè)上可得到的轉(zhuǎn)染試劑，包括但不限于TransIT-TKOTM(Mirus，目錄號MIR 2150)、TransmessengerTM(Qiagen，目錄號301525)和OligofectamineTM(Invitrogen，目錄號MIR 12252-011)。每種轉(zhuǎn)染試劑的規(guī)程都可從生產(chǎn)商得到。
在本發(fā)明中，dsRNA或siRNA與可溶內(nèi)皮糖蛋白mRNA的mRNA序列互補(bǔ)，且可降低或抑制可溶內(nèi)皮糖蛋白的表達(dá)。優(yōu)選地，與用對照dsRNA或siRNA處理的細(xì)胞相比，可溶內(nèi)皮糖蛋白蛋白的表達(dá)降低了至少10％，更優(yōu)選地25％，且最優(yōu)選地至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。測定蛋白表達(dá)水平的方法也是本領(lǐng)域熟知的，且包含蛋白印跡、免疫沉淀法和ELISA。
在本發(fā)明中，所用核酸包含以任何方式提高核酸穩(wěn)定性或功能的任何修飾。實(shí)例包含對磷酸主鏈、核苷酸間的連接或糖部分的修飾。
在早期妊娠中有用的基于可溶內(nèi)皮糖蛋白的治療性化合物已經(jīng)表明，全長內(nèi)皮糖蛋白信號傳導(dǎo)的抑制增強(qiáng)絨毛外植塊培養(yǎng)物中的滋養(yǎng)層侵襲力(Caniggia I等，Endocrinology，1997，1384977-88)。因此，可溶內(nèi)皮糖蛋白可能增強(qiáng)早期妊娠過程中的滋養(yǎng)層侵襲力。因此，提高不患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向的婦女在早期妊娠時(shí)的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的組合物，對于促進(jìn)胎盤形成是有益的。提高可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的組合物的實(shí)例包括純化的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽、可溶內(nèi)皮糖蛋白編碼核酸分子和提高可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平或生物學(xué)活性的化合物或生長因子。
基因和蛋白表達(dá)的測定下面的方法可以用于評價(jià)蛋白或基因表達(dá)，并確定任一種上述方法在提高可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合蛋白水平、或降低可溶內(nèi)皮糖蛋白蛋白水平中的功效。
使用諸如ELISA、蛋白印跡或使用特異性抗體的免疫測定的方法，測量受試者血清的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平。也可以測量受試者血清的TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7或已知結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的任意蛋白配體的水平。用于測量蛋白的血清水平的方法包括ELISA、蛋白印跡或使用特異性抗體的免疫測定。此外，可以進(jìn)行體外血管生成測定，以確定受試者的血液是否已經(jīng)從抗血管生成狀態(tài)轉(zhuǎn)化成促血管生成狀態(tài)。這樣的測定記載在實(shí)施例4中。認(rèn)為陽性結(jié)果是可溶內(nèi)皮糖蛋白、TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7或已知結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的任意蛋白配體的水平增加了至少10％、20％、優(yōu)選地30％、更優(yōu)選地至少40％或50％、且最優(yōu)選地至少60％、70％、80％、90％或更多。也可以將陽性結(jié)果視作，使用體外血管生成測定測得，從抗血管生成狀態(tài)至促血管生成狀態(tài)轉(zhuǎn)化了至少10％、優(yōu)選地20％、30％、40％、50％、且最優(yōu)選地至少60％、70％、80％、90％或更多。
也可以測量來自受試者的血清或尿樣品中的編碼TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7或可溶內(nèi)皮糖蛋白的核酸或多肽的水平。存在幾種本領(lǐng)域已知的測定基因表達(dá)的方法。一些實(shí)例包括，從受試者的血液樣品制備RNA，并使用RNA進(jìn)行RNA印跡、基于PCR的擴(kuò)增、或RNA酶保護(hù)測定。認(rèn)為陽性結(jié)果是可溶內(nèi)皮糖蛋白、TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7核酸的水平增加了至少10％、20％、優(yōu)選地30％、更優(yōu)選地至少40％或50％、且最優(yōu)選地至少60％、70％、80％、90％或更多。
使用抗體進(jìn)行治療性處理在從患有先兆子癇的孕婦采集的血清樣品中發(fā)現(xiàn)的提高水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白，表明可溶內(nèi)皮糖蛋白可起“生理學(xué)庫”的作用，以結(jié)合胎兒或胎盤的正確發(fā)育和血管生成所需的滋養(yǎng)層細(xì)胞和母體內(nèi)皮細(xì)胞的功能性生長因子，并將其耗盡。使用化合物(如抗體)來結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白并中和可溶內(nèi)皮糖蛋白的活性(例如，結(jié)合TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7)，可以通過增加游離的TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7，幫助預(yù)防或治療先兆子癇或子癇。這種增加將使胎盤發(fā)育和胎兒營養(yǎng)所需的滋養(yǎng)層增殖、遷移和血管生成能夠增加，且使全身的母體內(nèi)皮細(xì)胞健康。
本發(fā)明提供了特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體。所述抗體用于中和可溶內(nèi)皮糖蛋白的活性，且認(rèn)為最有效的機(jī)理是通過直接封閉TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2或BMP7的結(jié)合位點(diǎn)，然而，不排除其它機(jī)理。用于治療目的的抗體的制備和使用方法在幾個(gè)專利中描述，包含美國專利號6,054,297；5,821,337；6,365,157；和6,165,464，且它們引入本文作為參考?？贵w可以是多克隆的或單克隆的；優(yōu)選單克隆抗體。
單克隆抗體，特別是源自嚙齒類動物(包含小鼠)的那些已經(jīng)用于治療各種疾病；然而，它們的用途有限制，包括誘導(dǎo)引起治療功效的快速清除和降低的人抗-小鼠免疫球蛋白反應(yīng)。例如，嚙齒類動物單克隆抗體在臨床使用中的主要限制是，在治療過程中的抗-球蛋白反應(yīng)(Miller等，Blood，62988-995 1983；Schroff等，Cancer Res.，45879-885，1985)。
本領(lǐng)域已經(jīng)嘗試通過構(gòu)建“嵌合”抗體來克服這個(gè)問題，其中動物抗原-結(jié)合可變結(jié)構(gòu)域與人恒定結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)(美國專利號4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855，1984；Boulianne等，Nature，312643-646，1984；Neuberger等，Nature，314268-270，1985)。這種嵌合抗體的生產(chǎn)和使用在下面描述。
結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的配體的競爭性抑制，可用于預(yù)防或治療先兆子癇或子癇。這種提高可拯救內(nèi)皮功能障礙，并使促血管生成/抗血管生成因子的平衡向著血管生成的方向移動。
本發(fā)明單克隆抗體的混合物可用作先兆子癇或子癇的有效治療。該混合物可包含少至2、3或4種不同抗體，或多至6、8或10種不同抗體。此外，本發(fā)明抗體可與抗-高血壓藥物(例如，甲基多巴、鹽酸肼苯噠嗪、或拉貝洛爾)或用于治療先兆子癇、子癇或與先兆子癇或子癇有關(guān)的癥狀的任何其它藥物治療結(jié)合使用。
抗體的制備特異性地結(jié)合sFlt-1受體的單克隆抗體可通過本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)。這些方法包括由Kohler和Milstein(Nature，256495-497，1975)和Campbell(“Monoclonal Antibody Technology，TheProduction and Characterization of Rodent and HumanHybridomas”，Burdon等，Eds.，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Volume 13，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，1985)描述的免疫學(xué)方法，以及由Huse等(Science，246，1275-1281，1989)描述的重組DNA方法。
單克隆抗體可從培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞的上清液制備，或從通過將雜交瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)地接種到小鼠中誘導(dǎo)的腹水制備。最初由Kohler和Milstein(Eur.J.Immunol，6，511-519，1976)描述的雜交瘤技術(shù)已經(jīng)廣泛用于生產(chǎn)雜交細(xì)胞系，其分泌高水平的抗許多特定抗原的單克隆抗體。
免疫接種宿主動物或從其培養(yǎng)的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞的途徑和程序，通常與用于抗體刺激和產(chǎn)生的確定的且常規(guī)的技術(shù)一致。通常，將小鼠用作試驗(yàn)?zāi)Ｐ停欢?，任何哺乳動物受試?包含人受試者)或源自它的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞，都可按照本發(fā)明方法進(jìn)行操作，以作為產(chǎn)生哺乳動物(包含人)雜交細(xì)胞系的基礎(chǔ)。
免疫接種之后，免疫淋巴樣細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以產(chǎn)生雜交細(xì)胞系，它們可被無限培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，以產(chǎn)生大量單克隆抗體。就本發(fā)明的目的而言，為融合選擇的免疫淋巴樣細(xì)胞是淋巴細(xì)胞和它們的正常分化的后代，采集自免疫的動物的淋巴結(jié)組織或脾組織。優(yōu)選使用脾細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兛商峁╆P(guān)于小鼠系統(tǒng)更濃且更方便的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞來源。骨髓瘤細(xì)胞提供融合的雜合體連續(xù)繁殖的基礎(chǔ)。骨髓瘤細(xì)胞是源自漿細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞。鼠骨髓瘤細(xì)胞系可從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)獲得。還描述過人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系(Kozbor等，J.Immunol.，1333001-3005，1984；Brodeur等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，pp.51-63，1987)。
雜交細(xì)胞系可在細(xì)胞培養(yǎng)基中體外維持。一旦確立了雜交瘤細(xì)胞系，就可在多種營養(yǎng)足夠的培養(yǎng)基(如次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培養(yǎng)基)中維持。此外，雜交細(xì)胞系可以以許多常規(guī)方式貯藏并保存，包含冷凍和在液氮下貯藏?？墒估鋬龅募?xì)胞系復(fù)蘇，并無限培養(yǎng)，重新開始合成和分泌單克隆抗體。通過常規(guī)方法，如沉淀、離子交換層析、親和層析等，回收組織培養(yǎng)上清液中分泌的抗體。
抗體可在任何哺乳動物中制備，包含小鼠、大鼠、兔、山羊和人?？贵w可以是下列免疫球蛋白種類之一的成員IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亞類，且優(yōu)選是IgG抗體。
盡管用于產(chǎn)生單克隆抗體的優(yōu)選動物是小鼠，但本發(fā)明不限于此；事實(shí)上，可使用人抗體，并證實(shí)是優(yōu)選的。這類抗體可使用人雜交瘤獲得(Cole等，“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”，Alan R.Liss Inc.，p.77-96，1985)。在本發(fā)明中，可以使用通過剪接具有適宜抗原特異性的小鼠抗體分子的基因和人抗體分子的基因而生產(chǎn)嵌合抗體的技術(shù)(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81，6851-6855，1984；Neuberger等，Nature 312，604-608，1984；Takeda等，Nature 314，452-454，1985)；這類抗體包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)并在下面描述。
作為細(xì)胞融合技術(shù)的另一選擇，EB病毒(EBV)無限增殖化B細(xì)胞可用于生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體(Crawford等，J Gen.Virol.，64697-700，1983；Kozbor和Roder，J.Immunol.，41275-1280，1981；Kozbor等，Methods Enzymol.，121120-140，1986)。通常，該程序由從適宜來源(通常是感染的細(xì)胞系)分離EB病毒，并使靶抗體分泌細(xì)胞暴露于含病毒的上清液組成。洗滌細(xì)胞，并在適宜的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。隨后，可通過EB病毒核抗原的存在，鑒別存在于細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，且可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，鑒別轉(zhuǎn)化的抗體分泌細(xì)胞。產(chǎn)生單克隆抗體(如重組DNA)的其它方法，也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可溶內(nèi)皮糖蛋白免疫原的制備可溶內(nèi)皮糖蛋白本身可作為免疫原使用，或可與載體蛋白或其它物體(如瓊脂糖珠)結(jié)合使用?？扇軆?nèi)皮糖蛋白可從已知表達(dá)內(nèi)源性蛋白的細(xì)胞(如人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)純化(滋養(yǎng)層或HUVEC；Burrows等，Clin.Cancer Res.11623-1634，1995；Fonsatti等，Clin.CancerRes.62037-2043，2000)?？梢杂玫鞍姿饷?例如，基質(zhì)金屬蛋白酶)處理表達(dá)膜結(jié)合的內(nèi)皮糖蛋白的細(xì)胞，以切割胞外結(jié)構(gòu)域，從而產(chǎn)生可溶形式。此外，使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)，可以將編碼可溶內(nèi)皮糖蛋白的核酸分子或其部分插入到已知載體中，以用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)。適合可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞包括桿狀病毒細(xì)胞(例如，Sf9細(xì)胞)、細(xì)菌細(xì)胞(例如，大腸桿菌)和哺乳動物細(xì)胞(例如，NIH3T3細(xì)胞)。
此外，可合成肽，并將其用作免疫原。制備肽抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的，且通常需要將肽與適宜的載體分子(如血清清蛋白)偶聯(lián)。肽包含與GenBank編號AAH29080和NP_031958(小鼠)、AAS67893(大鼠)、NP_000109，P17813、VSP_004233和CAA80673(人)、和A49722(豬)相對應(yīng)的可溶內(nèi)皮糖蛋白氨基酸序列的任一部分基本相同的任何氨基酸序列。肽可以是任何長度，優(yōu)選10個(gè)氨基酸或更長，更優(yōu)選25個(gè)氨基酸或更長，且最優(yōu)選地40、50、60、70、80、100、200、300、400、437個(gè)氨基酸或更長。優(yōu)選地，所述氨基酸序列與任意人內(nèi)皮糖蛋白序列的序列至少60％、更優(yōu)選85％、且最優(yōu)選90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致。肽可以是商業(yè)獲得的，或使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備的，如，例如Merrifield固相方法(Science，232341-347，1985)。所述程序可使用商業(yè)得到的合成儀，如Biosearth 9500自動化肽機(jī)器，使用氟化氫實(shí)現(xiàn)阻斷氨基酸的切割，且使用Waters Delta Prep 3000儀器，在15-20μm VydacC4 PrepPAK柱上，通過制備型HPLC純化肽。
抗體的功能等價(jià)物本發(fā)明還包含本說明書中描述的抗體的功能等價(jià)物。功能等價(jià)物包括所具有的氨基酸序列與本發(fā)明抗體可變區(qū)或高變區(qū)的氨基酸序列基本上相同的多肽。功能等價(jià)物具有可與所述抗體的結(jié)合特性相比較的結(jié)合特性，且包括，例如，嵌合的、人源化的和單鏈抗體及其片段。生產(chǎn)這種功能等價(jià)物的方法記載在，例如，PCT公開號WO93/21319；歐洲專利申請?zhí)?39,400；PCT公開號WO 89/09622；歐洲專利申請?zhí)?38,745；歐洲專利申請?zhí)?32424；以及美國專利號4,816,567中；每篇均引入本文作為參考。
嵌合抗體優(yōu)選地具有基本上或排它地源自人抗體恒定區(qū)的恒定區(qū)、以及基本上或排它地源自除人以外的哺乳動物可變區(qū)序列的可變區(qū)。這類人源化抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其它抗原-結(jié)合子序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。使非人抗體人源化的方法是本領(lǐng)域熟知的(綜述見Vaswani和Hamilton，Ann Allergy AsthmaImmunol.，81105-119，1998和Carter，Nature Reviews Cancer，1118-129，2001)。通常，人源化抗體具有從非人來源引入其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常被稱作輸入殘基，它們通常是從輸入可變結(jié)構(gòu)域得到的。可以基本上按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行人源化(Jones等，Nature，321522-525，1986；Riechmann等，Nature，332323-329，1988；和Verhoeyen等，Science，2391534-1536，1988)，其中用嚙齒類動物的CDR或其它CDR序列置換人抗體的相應(yīng)序列。因此，這種人源化抗體是嵌合抗體，其中基本上小于完整的人可變結(jié)構(gòu)域的序列已經(jīng)被來自非人的相應(yīng)序列置換(見，例如，美國專利號4,816,567)。實(shí)際上，人源化抗體通常是人抗體，其中有些CDR殘基(且很可能有些FR殘基)被來自嚙齒類動物類似位點(diǎn)的殘基置換(Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596，1992)。
制備人源化抗體的其它方法描述在美國專利號5,821,337和6,054,297以及Carter(同上)中，它們?nèi)恳氡疚淖鳛閰⒖肌Ｈ嗽椿贵w選自任一免疫球蛋白種類，包含IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同種型，包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。當(dāng)不需要細(xì)胞毒性活性時(shí)，如在本發(fā)明中，恒定結(jié)構(gòu)域優(yōu)選為IgG2類。人源化抗體可包含來自超過一個(gè)種類或同種型的序列，且選擇特定的恒定結(jié)構(gòu)域來最優(yōu)化所需的效應(yīng)子功能，在本領(lǐng)域普通技術(shù)范圍之內(nèi)。
人抗體還可使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)產(chǎn)生，包含噬菌體展示文庫(Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597，1991和Winter等，Annu.Rev.Immunol.，12433-455，1994)。Cole等和Boerner等的技術(shù)還可用于制備人單克隆抗體(Cole等，同上；Boerner等，J.Immunol.，14786-95，1991)。
除人以外的適宜的哺乳動物包括可從其制備單克隆抗體的任何哺乳動物。除人以外的哺乳動物的實(shí)例包括，例如，兔、大鼠、小鼠、馬、山羊或靈長類動物；優(yōu)選小鼠。
抗體的功能等價(jià)物還包括單鏈抗體片段，也稱作單鏈抗體(scFv)。單鏈抗體片段是重組多肽，其通常結(jié)合抗原或受體；這些片段包含與抗體可變輕鏈序列(VL)的至少一個(gè)片段連接的抗體可變重鏈氨基酸序列(VH)的至少一個(gè)片段，其中具有或沒有一個(gè)或多個(gè)相互連接的接頭。這種接頭可以是短的、柔性的肽，選擇它們來確保VL和VH結(jié)構(gòu)域一旦連接即發(fā)生正確的三維折疊，以便維持單鏈抗體片段所來源的完整抗體的靶分子結(jié)合特異性。通常，VL或VH序列的羧基末端通過這種肽接頭與互補(bǔ)的VL和VH序列的氨基酸末端共價(jià)連接。單鏈抗體片段可通過分子克隆、抗體噬菌體展示文庫或類似技術(shù)產(chǎn)生。這些蛋白可在真核生物細(xì)胞或原核生物細(xì)胞(包含細(xì)菌)中產(chǎn)生。
單鏈抗體片段包含這樣的氨基酸序列，其具有在本說明書中描述的完整抗體的至少一個(gè)可變區(qū)或CDR，但缺少那些抗體的恒定結(jié)構(gòu)域的一些或全部。這些恒定結(jié)構(gòu)域不是抗原結(jié)合所必需的，但構(gòu)成完整抗體結(jié)構(gòu)的主要部分。單鏈抗體片段可因此克服與使用含恒定結(jié)構(gòu)域的部分或全部的抗體有關(guān)的某些問題。例如，單鏈抗體片段傾向于無生物學(xué)分子與重鏈恒定區(qū)之間的不需要的相互作用，或其它不需要的生物學(xué)活性。此外，單鏈抗體片段明顯小于完整抗體，且因此比完整抗體具有更大的毛細(xì)管通透性，從而允許單鏈抗體片段局部化，并更有效地結(jié)合靶抗原結(jié)合部位。另外，抗體片段可在原核細(xì)胞中相對大規(guī)模地產(chǎn)生，由此促進(jìn)它們的產(chǎn)生。此外，相對較小的單鏈抗體片段使它們與完整抗體相比不太可能誘導(dǎo)受體的免疫反應(yīng)。
功能等價(jià)物還包括具有與完整抗體的結(jié)合特性相同或可比較的結(jié)合特性的抗體片段。這種片段可包含一個(gè)或兩個(gè)Fab片段或F(ab′)2片段。優(yōu)選地，抗體片段包含完整抗體的全部6個(gè)CDR，雖然含有少于所有這樣的區(qū)域(如3、4或5個(gè)CDR)的片段也是功能性的。
此外，功能等價(jià)物可以是下列免疫球蛋白種類之一的成員，或可組合所述成員IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，及其亞類。
抗體功能等價(jià)物的制備抗體等價(jià)物是通過本領(lǐng)域已知方法制備的。例如，可從完整抗體酶促地制備抗體片段。優(yōu)選地，抗體等價(jià)物是從編碼這種等價(jià)物的DNA制備的。通過使編碼全長抗體所需的DNA部分以外全部缺失，可以制備編碼抗體片段的DNA。
通過重組基本上或排它地編碼人恒定區(qū)的DNA和編碼基本上或排它地源自除人以外的哺乳動物的可變區(qū)序列的可變區(qū)的DNA，可以制備編碼嵌合抗體的DNA。通過重組編碼除了基本上或排它地源自相應(yīng)人抗體區(qū)的CDR之外的恒定區(qū)和可變區(qū)的DNA和編碼基本上或排它地源自除人以外的哺乳動物的CDR的DNA，可以制備編碼人源化抗體的DNA。
編碼抗體片段的DNA分子的適宜來源包括表達(dá)全長抗體的細(xì)胞，如雜交瘤。所述片段本身可作為抗體等價(jià)物使用，或可如上所述重組成等價(jià)物。
本部分所述的DNA缺失和重組可通過已知方法進(jìn)行，如在上列公開的專利申請中描述的那些。
抗體篩選和選擇使用標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域已知的方法分離并純化單克隆抗體。例如，可使用標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域已知的方法，如針對可溶內(nèi)皮糖蛋白肽抗原的ELISA或蛋白印跡分析，篩選抗體。這種技術(shù)的非限制性實(shí)例描述在美國專利號6,365,157的實(shí)施例II和III中，其引入本文作為參考。
抗體的治療用途當(dāng)體內(nèi)用于治療或預(yù)防先兆子癇或子癇時(shí)，將本發(fā)明抗體以治療有效量施用給受試者。優(yōu)選地，腸胃外施用所述抗體或通過連續(xù)輸注靜脈內(nèi)施用所述抗體。給藥和劑量方案取決于疾病的嚴(yán)重程度和受試者的整體健康狀況。施用的抗體的量通常為約0.001-約10mg/kg受試者體重、優(yōu)選0.01-約5mg/kg受試者體重。
對于腸胃外施用，將抗體與藥學(xué)上可接受的腸胃外載體一起配制成單位劑量注射形式(溶液、懸浮液、乳狀液)。這種載體本身是無毒且無治療性的。這種載體的實(shí)例是水、鹽水、林格液、葡萄糖溶液以及5％人血清清蛋白。還可使用不含水的載體，如固定油以及油酸乙酯?？蓪⒅|(zhì)體用作載體。所述載體可包含少量添加劑，如提高等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，例如緩沖劑及防腐劑。通常以約1mg/ml-10mg/ml的濃度，在這種載體中配制抗體。
聯(lián)合療法任選地，先兆子癇或子癇治療可與任何其它標(biāo)準(zhǔn)的先兆子癇或子癇療法聯(lián)合施用；這樣的方法是熟練的技術(shù)人員已知的，且包括美國專利申請公開號20040126828、20050025762和2005017044和PCT公開號WO 2004/008946和WO 2005/077007中所述的方法。
施用的劑量和方式優(yōu)選地，在妊娠過程中施用治療，以用于治療或預(yù)防先兆子癇或子癇，或在妊娠后施用治療，以治療產(chǎn)后先兆子癇或子癇。施用技術(shù)和劑量依賴于化合物類型(例如，化合物、純化的蛋白、抗體、反義、RNAi或核酸載體)而變化，且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的或容易確定的。
本發(fā)明的治療性化合物可與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑一起，以單位劑量形式施用。施用可以是腸胃外、靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)口或局部直接注射到羊水中。通過連續(xù)輸注而靜脈內(nèi)遞送，是施用本發(fā)明治療性化合物的優(yōu)選方法。
所述組合物的形式可以是經(jīng)口施用的丸劑、片劑、膠囊、液體或持續(xù)釋放的片劑；或用于靜脈內(nèi)、皮下或腸胃外施用的液體；或用于局部施用的聚合物或其它持續(xù)釋放載體。
用于制備制劑的本領(lǐng)域熟知的方法見，例如，“RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy”(20th ed.，ed.A.R.GennaroAR.，2000，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA)。用于腸胃外施用的制劑可包含，例如，賦形劑、無菌水、鹽水、聚(亞烷基)二醇如聚乙二醇、植物來源的油或氫化萘。生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，可用于控制化合物的釋放。納米顆粒(nanoparticulate)制劑(例如，可生物降解的納米顆粒、固體脂類納米顆粒、脂質(zhì)體)可用于控制化合物的生物分布。其它潛在有效的腸胃外遞送系統(tǒng)包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的輸注系統(tǒng)及脂質(zhì)體。制劑中化合物的濃度取決于多種因素，包含所施用藥物的劑量以及施用途徑。
所述化合物可任選地作為藥學(xué)上可接受的鹽(如制藥工業(yè)通常使用的無毒酸加成鹽或金屬絡(luò)合物)來施用。酸加成鹽的實(shí)例包括，有機(jī)酸如乙酸、乳酸、雙羥萘酸(pamoic)、馬來酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕櫚酸、辛二酸、水楊酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸等；聚合酸如鞣酸、羧甲基纖維素等；和無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸等。金屬絡(luò)合物包括鋅、鐵等。
用于經(jīng)口使用的制劑包括，含有與無毒的藥學(xué)可接受賦形劑相混合的活性成分的片劑。這些賦形劑可以是，例如，惰性稀釋劑或填充物(例如，蔗糖和山梨糖醇)、潤滑劑、助流劑和抗結(jié)合劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、二氧化硅、氫化植物油或滑石)。
經(jīng)口使用的制劑還可以咀嚼片劑的形式提供，或以硬膠囊的形式提供，其中將活性成分與惰性固體稀釋劑混合，或以軟膠囊的形式提供，其中將活性成分與水或油性介質(zhì)混合。
施用化合物的劑量和時(shí)間選擇取決于各種臨床因素，包含受試者的整體健康狀況和先兆子癇癥狀的嚴(yán)重程度。一般而言，一旦檢測出先兆子癇或發(fā)展先兆子癇的傾向，則使用純化蛋白的連續(xù)輸注來治療或預(yù)防所述狀況的進(jìn)一步發(fā)展。治療可持續(xù)1-100天，更優(yōu)選1-60天，且最優(yōu)選1-20天時(shí)間段，或直到妊娠結(jié)束。劑量可根據(jù)每種化合物以及狀況的嚴(yán)重程度而變化，并通過滴定來獲得穩(wěn)態(tài)的血清濃度，即10-20ng/ml可溶內(nèi)皮糖蛋白；和/或1-500pg/mL游離VEGF或游離PlGF或二者，優(yōu)選地1-100pg/mL，更優(yōu)選地5-50pg/mL、且最優(yōu)選地5-10pg/mL VEGF或PlGF或1-5ng sFlt-1。
本文所述的診斷方法可以用于監(jiān)控在治療過程中的先兆子癇或子癇，或確定治療性化合物的劑量。在一個(gè)實(shí)例中，在治療過程中施用治療性化合物，并確定PAAI。如果PAAI小于20、優(yōu)選地小于10，則認(rèn)為治療劑量是有效劑量。在另一個(gè)實(shí)例中，在治療過程中施用治療性化合物，并確定可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)。如果可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)小于200、優(yōu)選地小于100，則認(rèn)為治療劑量是有效劑量。
受試者監(jiān)控使用本發(fā)明的方法和組合物，可以監(jiān)控患有先兆子癇、子癇或發(fā)展這樣的狀況的傾向的受試者的疾病狀況或治療。例如，監(jiān)控存在于體液(如尿、血漿、羊水或CSF)中的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的表達(dá)。可溶內(nèi)皮糖蛋白監(jiān)控可以與監(jiān)控sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的表達(dá)的方法相結(jié)合。這種監(jiān)控可以用于，例如，評價(jià)特定藥物在受試者中的功效或評價(jià)疾病發(fā)展。降低可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸分子或多肽的表達(dá)的治療在本發(fā)明中特別有用。
實(shí)施例下面的實(shí)施例意在解釋本發(fā)明。它們無意以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1.先兆子癇孕婦中提高水平的內(nèi)皮糖蛋白mRNA和蛋白在鑒別在先兆子癇中起病理學(xué)作用的新的分泌因子的嘗試中，我們使用Affymetrix U95A微陣列芯片進(jìn)行了患有先兆子癇的17位孕婦和13位正常孕婦的胎盤組織的基因表達(dá)譜分析。我們發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮糖蛋白的基因在患有先兆子癇的婦女中被上調(diào)。
為了證實(shí)內(nèi)皮糖蛋白在先兆子癇中的上調(diào)，我們進(jìn)行RNA印跡以分析與血壓正常的孕婦相比的先兆子癇孕婦中的胎盤內(nèi)皮糖蛋白mRNA水平(圖3)，并進(jìn)行蛋白印跡以測量與血壓正常的孕婦相比的先兆子癇孕婦中的內(nèi)皮糖蛋白的血清蛋白水平(圖4)。先兆子癇被定義為(1)妊娠20周后，收縮血壓(BP)＞140mmHg且舒張BP＞90mmHg，(2)新發(fā)作的蛋白尿(利用測驗(yàn)片進(jìn)行尿分析為1+，24小時(shí)尿收集中的蛋白＞300mg，或隨機(jī)的尿蛋白/肌酸酐比＞0.3，和(3)產(chǎn)后12周，高血壓及蛋白尿消除。排除患潛在的高血壓、蛋白尿或腎病的患者。基于是否存在腎炎范圍的蛋白尿(24小時(shí)尿收集中的蛋白＞3g或尿蛋白/肌酸酐比大于3.0)，將患者分成輕度先兆子癇和重度先兆子癇。輕度先兆子癇組中的平均尿蛋白/肌酸酐比為0.94+/-0.2，而重度先兆子癇組為7.8+/-2.1。各組的平均胎齡如下正常38.8+/-0.2周、輕度先兆子癇34+/-1.2周、重度先兆子癇31.3+/-0.6周和早產(chǎn)的29.5+/-2.0周。分娩后立即獲得胎盤樣品。從每個(gè)胎盤隨機(jī)采集4份樣品，放在RNA later穩(wěn)定溶液(Ambion，Austin，TX)中，并在-70℃貯藏。使用Qiagen RNAeasy Maxi試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)進(jìn)行RNA分離。
用內(nèi)皮糖蛋白的編碼區(qū)中的400堿基對探針(UnigeneHs.76753)和作為標(biāo)準(zhǔn)化對照的GAPDH探針探測的RNA印跡顯示了胎盤內(nèi)皮糖蛋白mRNA的增加。用內(nèi)皮糖蛋白氨基末端的抗體探測的蛋白印跡顯示了與血壓正常的孕婦相比，先兆子癇孕婦中內(nèi)皮糖蛋白蛋白的胎盤和產(chǎn)婦血清水平兩者的增加。
實(shí)施例2.證實(shí)先兆子癇患者的胎盤和血清中的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽用于測量先兆子癇婦女的胎盤和血清中的內(nèi)皮糖蛋白蛋白水平的蛋白印跡分析提示了更小的蛋白(63kDa)的存在，它存在于先兆子癇孕婦的胎盤和血清中。我們已經(jīng)證實(shí)，該更小的片段是內(nèi)皮糖蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。該截短形式可能是從胎盤合胞體滋養(yǎng)層(syncitiotrophoblast)和內(nèi)皮細(xì)胞流出的，并在先兆子癇患者中過量地循環(huán)。該可溶形式的內(nèi)皮糖蛋白可以通過結(jié)合正常血管健康必需的循環(huán)配體，起抗血管生成劑的作用。
實(shí)施例3.具有正常妊娠的婦女對先兆子癇妊娠的婦女中的可溶內(nèi)皮糖蛋白的循環(huán)濃度為了對比正常的、輕度先兆子癇或重度先兆子癇婦女的血清中的循環(huán)的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平，我們對取自這些婦女的血液樣品進(jìn)行了ELISA分析。以是否存在腎炎范圍的蛋白尿(24小時(shí)尿收集中的蛋白＞3g或尿蛋白/肌酸酐比大于3.0)為基礎(chǔ)，將患者分成輕度和重度先兆子癇。輕度先兆子癇組中的平均尿蛋白/肌酸酐比是0.94+/-0.2，而重度先兆子癇組是7.8+/-2.1(圖5)。如前所述(Maynard等，J.Clin.Invest.111649-658，2003)，使用從R&D Systems，MN(目錄號DNDG00)商業(yè)上得到的ELISA試劑盒，進(jìn)行ELISA。
實(shí)施例4.血管生成的模型測定內(nèi)皮管測定可以用作血管生成的體外模型。將生長因子減少的Matrigel(7mg/mL，Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)放在預(yù)冷的48孔細(xì)胞培養(yǎng)平板的孔(100μl/孔)中，并在37℃溫育25-30分鐘，以允許聚合。用10％患者血清處理第3-5代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(30,000+在300μl沒有血清的內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，Clonetics，Walkersville，MD)，鋪平板到Matrigel包被的孔上，并在37℃溫育12-16小時(shí)。然后通過4X倒置相差顯微鏡(NikonCorporation，Tokyo，日本)評價(jià)管形成，并使用Simple PCI成像分析軟件進(jìn)行分析(管面積和總長度)。
實(shí)施例5.作為婦女的先兆子癇和子癇的診斷指標(biāo)的可溶內(nèi)皮糖蛋白蛋白水平(Romero研究)該研究設(shè)計(jì)用于評價(jià)在臨床先兆子癇的過程中是否改變可溶內(nèi)皮糖蛋白和它是否可以用于預(yù)測婦女的先兆子癇和子癇。
在Wayne State University/NICHD Perinatology Branch，Detroit，MI的Roberto Romero博士的協(xié)助下，完成了該研究。如Chaiworapongsa等(The Journal of Maternal-Fetal and NeonatalMedicine，January 2005，17(1)3-18)以前所述，使用庫存的生物學(xué)樣品數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行了回顧縱向案例對照研究。所有婦女都在Sotero del Rio Hospital，Santiago，智利登記產(chǎn)前臨床，并直到分娩。在前和次三個(gè)月中，以4-周時(shí)間間隔安排產(chǎn)前診斷，且在第三個(gè)三個(gè)月直至分娩，每2周安排產(chǎn)前診斷。對于下面的6個(gè)時(shí)間間隔中的每一個(gè)，只選擇每位患者的血漿樣品一次妊娠的(1)7-16周，(2)16-24周，(3)24-28周，(4)28-32周，(5)32-37周，和(6)＞37周。對于每個(gè)先兆子癇病例，通過在臨床診斷先兆子癇時(shí)的胎齡(+/-2周)匹配，選擇一個(gè)對照。診斷先兆子癇的臨床標(biāo)準(zhǔn)與上面的Chaiworapongsa等以前所述的相同。
血漿內(nèi)皮糖蛋白水平的測量將保藏在-70℃的血漿樣品解凍，并使用從R&D systems，Minneapolis，MN.(目錄號DNDG00)商業(yè)上得到的ELISA試劑盒，測量一批血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白水平。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用協(xié)方差分析來評價(jià)在調(diào)整血液取樣的胎齡和樣品保藏時(shí)間間隔后，注定發(fā)展先兆子癇的患者和正常妊娠之間的可溶內(nèi)皮糖蛋白的血漿濃度差異。使用卡方或Fisher準(zhǔn)確檢驗(yàn)來對比比例。使用的統(tǒng)計(jì)包是SPSS V.12(SPSS Inc.，Chicago，IL)。假定的顯著性為p值小于0.05。
結(jié)果在表1中描述了研究群體的臨床特征?；加邢日鬃影B的組包括比對照組更多的未經(jīng)產(chǎn)的婦女，且比對照組更早分娩。重要的是，先兆子癇組的胎兒出生重量更小，且存在更高比例的攜帶小于胎齡兒(SGA)嬰兒的婦女。
表1.研究群體的臨床特征
將值表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差或數(shù)字(％)GA胎齡在表2中描述了患有先兆子癇的患者的臨床特征。32位(72％)患者患有重度先兆子癇，而10位患者患有嚴(yán)重的早發(fā)先兆子癇，確定其發(fā)作＜34周。
表2.患有先兆子癇的患者的臨床特征
將值表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差或數(shù)字(％)α(n＝26)；β(n＝42)在表3中顯示了在6胎齡窗口中測量的對照和先兆子癇婦女的血清可溶內(nèi)皮糖蛋白水平。在先兆子癇中，將它們的樣品分成2組臨床先兆子癇(在先兆子癇癥狀時(shí)采取的樣品)和臨床前先兆子癇(在臨床癥狀之前采取的樣品)。數(shù)據(jù)表明，在中期妊娠(妊娠的24-28周)時(shí)，注定發(fā)展先兆子癇的婦女中的血清可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度開始升高，并在妊娠28-32周變成對照的至少3倍。當(dāng)與胎齡匹配的對照相比較時(shí)，從患有臨床先兆子癇的婦女采取的血液樣品顯示出非常急劇的(幾乎10-15倍)升高。
表3.正常妊娠和先兆子癇的血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度
pβ在先兆子癇的臨床表現(xiàn)時(shí)和正常妊娠的樣品之間比較將值表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差δ2位先兆子癇患者在臨床表現(xiàn)時(shí)不能獲得血液樣品為了檢查血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度和臨床診斷先兆子癇的時(shí)間間隔之間的關(guān)系，根據(jù)從血液采樣到臨床診斷的時(shí)間間隔，將處于不同胎齡的先兆子癇患者的血漿樣品分成5組(1)在臨床診斷時(shí)，(2)臨床表現(xiàn)前2-5.9周，(3)臨床表現(xiàn)前6-10.9周，(4)臨床表現(xiàn)前11-15.9周，和(5)臨床表現(xiàn)前16-25周。表4中的數(shù)據(jù)證實(shí)，在注定發(fā)展先兆子癇的婦女中，在發(fā)作先兆子癇癥狀之前6-10.9周，血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白水平開始升高，且在出現(xiàn)癥狀之前2-5.9周，是至少3倍。
表4.正常和先兆子癇孕婦中的血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度
將值表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差δ2位先兆子癇患者在臨床表現(xiàn)時(shí)不能獲得血液樣品為了檢查血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度鑒別注定發(fā)展先兆子癇的患者的診斷潛力，將患者分成早發(fā)先兆子癇(PE＜34周)和晚發(fā)先兆子癇(PE＞34周)。對于患有早發(fā)先兆子癇的患者，從妊娠的約16-24周開始，先兆子癇(臨床診斷前)的平均血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白水平顯著高于正常妊娠(表5)，其中在24-28周和28-32周妊娠窗口中具有非常大的不同。相反地，對于患有晚發(fā)先兆子癇的患者，僅僅在28-32周，臨床前先兆子癇的血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度顯著高于正常妊娠，其中在妊娠的32-36周具有非常大的不同(表6)。
表5.正常孕婦和在妊娠34周或更早發(fā)展臨床先兆子癇的患者中的血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度
pβ在先兆子癇的臨床表現(xiàn)時(shí)和正常妊娠的樣品之間比較將值表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差δ2位先兆子癇患者在臨床表現(xiàn)時(shí)不能獲得血液樣品表6.正常孕婦和先兆子癇患者(妊娠34周)中的血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度
pβ在先兆子癇的臨床表現(xiàn)時(shí)和正常妊娠的樣品之間比較將值表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差總結(jié)這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，當(dāng)與胎齡匹配的對照相比較時(shí)，患有臨床先兆子癇的婦女具有非常高水平的循環(huán)可溶內(nèi)皮糖蛋白。結(jié)果還證實(shí)，注定發(fā)展先兆子癇(臨床前先兆子癇)的婦女具有比預(yù)測正常妊娠的婦女更高的血漿可溶內(nèi)皮糖蛋白水平。在發(fā)作臨床癥狀前至少6-10周，可以檢測到可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的增加。最后，這些結(jié)果證實(shí)，早發(fā)和晚發(fā)先兆子癇都具有升高的循環(huán)可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度，但是該變化在早發(fā)先兆子癇中更顯著。
實(shí)施例6.作為婦女的先兆子癇和子癇的診斷指標(biāo)的可溶內(nèi)皮糖蛋白蛋白水平(CPEP研究)如上所述，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在先兆子癇胎盤中，上調(diào)可溶內(nèi)皮糖蛋白，即一種促血管生成蛋白TGF-β的細(xì)胞表面受體，并在內(nèi)皮和合胞體滋養(yǎng)層上表達(dá)。在上述實(shí)驗(yàn)中，我們已經(jīng)表明，在先兆子癇中，過量的可溶內(nèi)皮糖蛋白通過胞外結(jié)構(gòu)域的脫落，從胎盤釋放進(jìn)循環(huán)中；可溶內(nèi)皮糖蛋白然后可以與sFlt1(一種結(jié)合胎盤生長因子(PlGF)和VEGF的抗血管生成因子)協(xié)同作用，以造成內(nèi)皮功能障礙。為了檢驗(yàn)該假說，我們將發(fā)展先兆子癇的婦女和患有其它妊娠并發(fā)癥(如妊娠高血壓(GH)和并發(fā)小于胎齡兒(SGA)嬰兒的妊娠)的那些婦女在整個(gè)妊娠過程中的可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt1和游離PlGF的血清濃度，與具有血壓正常的對照妊娠的婦女的所述濃度進(jìn)行了對比。在NIH的Richard Levine博士的協(xié)助下完成了該研究。
該研究有兩個(gè)基本目的。第一個(gè)目的是，確定與血壓正常的對照相比，在發(fā)作先兆子癇和其它妊娠病癥(如妊娠高血壓或并發(fā)小于胎齡兒(SGA)嬰兒的妊娠)之前，是否可以檢測到升高的可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt1的血清濃度，和降低的PlGF水平。第二個(gè)目的是，在患有先兆子癇、妊娠高血壓或SGA的婦女中，其中分別檢查在發(fā)作臨床癥狀之前和之后得到的樣品，和在血壓正常對照中，描述可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1和游離PlGF的產(chǎn)婦血清濃度相對于胎齡的時(shí)間進(jìn)程。
方法臨床信息該研究是4,589位參與鈣預(yù)防先兆子癇試驗(yàn)(Calcium for Pre-eclampsia Prevention trial)(CPEP)的健康未經(jīng)產(chǎn)婦女群體(cohort)中嵌套(nested)的妊娠并發(fā)癥(過早的先兆子癇、足孕先兆子癇、妊娠高血壓、具有SGA嬰兒的妊娠、血壓正常的對照妊娠)的病例對照研究。從每個(gè)研究組中，選擇120個(gè)隨機(jī)病例。研究方法與最近進(jìn)行的先兆子癇的嵌套病例對照研究相同(Levine等，N.Eng.J.Med.2004，350672-83)。從每個(gè)婦女得到研究登記之前(13-21周)、在26-29周、在36周和在懷疑高血壓或蛋白尿時(shí)的血液樣品。在生產(chǎn)和分娩開始之前的妊娠過程中的任何時(shí)間收集的所有血清樣品都適合用于研究。病例包括120位婦女，其發(fā)展足孕先兆子癇、妊娠高血壓或SGA，且其分娩活產(chǎn)或死產(chǎn)男嬰(無已知的結(jié)構(gòu)或染色體異常)，且從她們得到基線血清樣品。對于過早的先兆子癇，研究了來自CPEP群體的定義為(PE＜37周)的所有72位患者。在上面的Levine等(2004)中，描述了診斷先兆子癇的臨床標(biāo)準(zhǔn)。在從發(fā)作妊娠高血壓前1天至隨后7天的時(shí)間間隔中，要求所有妊娠高血壓病例都具有正常的尿蛋白測量。使用Zhang&Bowes的胎齡出生重量表，它是種族、未經(jīng)產(chǎn)和嬰兒性別特異性的，將SGA定義為＜第10和＜第5(嚴(yán)重SGA)百分位。從分娩活產(chǎn)或死產(chǎn)嬰兒(無已知的主要的結(jié)構(gòu)畸形或染色體異常)的沒有先兆子癇或妊娠高血壓或SGA的婦女，隨機(jī)地選擇對照，并一個(gè)對照對應(yīng)一個(gè)病例地匹配臨床中心、在收集第一個(gè)血清樣品時(shí)的胎齡(±1周)、冷凍貯藏時(shí)間(±1年)和凍融次數(shù)。共研究了1674個(gè)血清樣品。進(jìn)行胎齡的匹配，以控制sFlt-1、VEGF和PlGF水平的胎齡-相關(guān)的差異。進(jìn)行冷凍貯藏時(shí)間的匹配，以使由冷凍貯藏過程中可能的降解引起的差異最小化。進(jìn)行臨床中心的匹配，以控制先兆子癇比率在不同中心之間顯著不同的事實(shí)，這可能是由于疾病的病理生理學(xué)的差異。此外，中心可能使用略有不同的收集、制備和保藏樣品的方法。還進(jìn)行融化次數(shù)的匹配，以確保病例和對照已經(jīng)同等地進(jìn)行凍融降解。
ELISA測量由不知道臨床結(jié)果的單個(gè)研究助理，在Karumanchi實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行各種血管生成標(biāo)記的ELISA。
從R&D systems(Minneapolis，MN)得到可溶內(nèi)皮糖蛋白(DNDG00)、sFlt1(DVR100)、PlGF(DPG00)的商業(yè)上可得到的ELISA試劑盒。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用T-檢驗(yàn)來對比對數(shù)變換后的各種測量值，以確定顯著性。認(rèn)為P＜0.05是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。
結(jié)果在圖6-8中，顯示了在如該方法中所述的各個(gè)胎齡組窗口期間，5個(gè)不同研究組的妊娠婦女在整個(gè)妊娠中的平均可溶內(nèi)皮糖蛋白(圖6)、sFlt1(圖7)和PlGF(圖8)濃度。對于先兆子癇組和妊娠高血壓組，在這里未顯示在發(fā)作臨床癥狀后采取的樣品。與胎齡-匹配的對照樣品相比，從過早的先兆子癇前9-11周開始，可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt1升高，且游離PlGF降低，在先兆子癇發(fā)作后，分別達(dá)到5倍(46.4vs9.8ng/ml，P＜.0001)、3倍(6356vs2316pg/ml，P＜.0001)和1/4(144vs546pg/ml，P＜.0001)的水平。對于足孕先兆子癇，可溶內(nèi)皮糖蛋白從12-14周開始升高，游離PlGF從9-11周開始降低，且sFlt1在先兆子癇發(fā)作前＜5周升高。在妊娠10-42周，sFlt1和游離PlGF的血清濃度在具有SGA或平均胎齡兒/大于胎齡兒(AGA/LGA)嬰兒的妊娠之間沒有顯著差異。從17-20周開始，SGA妊娠的血清可溶內(nèi)皮糖蛋白適度增加(7.2vs5.8ng/ml，P＝.03)，與AGA/LGA妊娠中的12.9ng/ml相比，在輕度和嚴(yán)重SGA的37-42周，分別達(dá)到15.7和43.7ng/ml的濃度(嚴(yán)重SGA vs AGA/LGA，P＝.002)。在妊娠高血壓研究中，與GA-匹配的對照樣品相比，在妊娠高血壓前＜1-5周，可溶內(nèi)皮糖蛋白的適度增加是顯而易見的，在發(fā)作妊娠高血壓后，達(dá)到可溶內(nèi)皮糖蛋白的2倍的水平(29.7vs12.5ng/ml，P＝.002)。在21-32周得到的樣品的調(diào)整的隨后早產(chǎn)PE的優(yōu)勢比(odds ratio)，與所有其它四分位相比，是對照可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度的最高四分位(＞7.2ng/ml)，為9.8(95％CI 4.5-21.5)。
將先兆子癇的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)定義為(sFlt1+0.25可溶內(nèi)皮糖蛋白)/PlGF。在貫穿5個(gè)不同研究組的各個(gè)胎齡組中，計(jì)算該指數(shù)。在圖9中顯示了在臨床癥狀之前采取的樣品的先兆子癇抗血管生成的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)。早在妊娠17-20周時(shí)，觀察到升高的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)值，并似乎隨著妊娠向嚴(yán)重過早的先兆子癇的發(fā)展，變得更急劇。在足孕先兆子癇、SGA和GH中，當(dāng)與對照婦女相比較時(shí)，在妊娠末期(33-36周)存在適度升高。
圖10和11描述了根據(jù)臨床過早的先兆子癇(PE＜37周)之前的周數(shù)，可溶內(nèi)皮糖蛋白的平均濃度(圖10)和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)(圖11)。甚至早在發(fā)作過早的先兆子癇之前的9-11周，注定發(fā)展先兆子癇的婦女的可溶內(nèi)皮糖蛋白和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)升高2-3倍，其中在臨床癥狀之前的1-5周急劇升高(＞5倍)。
圖12和13顯示了在癥狀之前和之后，在貫穿足孕先兆子癇(PE＞37周)的妊娠中，可溶內(nèi)皮糖蛋白(圖12)和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)(圖13)的變化。從妊娠33-36周開始，觀察到可溶內(nèi)皮糖蛋白和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)的升高，在臨床先兆子癇時(shí)達(dá)到平均2倍的水平。
圖14和15顯示了當(dāng)與血壓正常的對照相比較時(shí)，在妊娠高血壓期間、在妊娠高血壓之前1-5周(在妊娠的33-36周期間)的婦女中測得的可溶內(nèi)皮糖蛋白(圖14)和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)(圖15)的適度升高。
圖16和17顯示了當(dāng)與對照妊娠相比較時(shí)，在33-36周妊娠窗口期間，在患有嚴(yán)重SGA的婦女且不是所有患有SGA的婦女中測得的可溶內(nèi)皮糖蛋白(圖16)和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)(圖17)的適度升高。
總結(jié)該研究的結(jié)果表明，當(dāng)與正常對照妊娠相比較時(shí)，在妊娠33周之前測量時(shí)，在注定發(fā)展過早的先兆子癇的婦女和患有臨床過早的先兆子癇(PE＜37周)的婦女中的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)水平急劇升高。因此可溶內(nèi)皮糖蛋白水平和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)水平(在33周之前)不僅可以用于診斷過早的先兆子癇，而且可以用于預(yù)測先兆子癇。似乎早在先兆子癇癥狀之前10-12周，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)水平就開始升高。
當(dāng)在妊娠晚期(33-36周妊娠窗口)測量時(shí)，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)水平在足孕先兆子癇(PE＞37周)中也顯著升高，并在妊娠高血壓和嚴(yán)重SGA中適度升高。因此，當(dāng)在妊娠33周之后測量時(shí)，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平和可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)水平也可以用于鑒別其它妊娠并發(fā)癥，如SGA和妊娠高血壓。
實(shí)施例7.可溶內(nèi)皮糖蛋白參與先兆子癇的發(fā)病機(jī)理我們已經(jīng)表明，在先兆子癇胎盤中，上調(diào)可溶內(nèi)皮糖蛋白，即一種促血管生成蛋白TGF-β的細(xì)胞表面受體，并在內(nèi)皮和合胞體滋養(yǎng)層上表達(dá)。我們還已經(jīng)表明，在先兆子癇中，過量的可溶內(nèi)皮糖蛋白通過胞外結(jié)構(gòu)域的脫落，從胎盤釋放進(jìn)循環(huán)中。下面所述的實(shí)驗(yàn)用于檢驗(yàn)下述假說，即可溶內(nèi)皮糖蛋白可以與sFlt1(一種結(jié)合胎盤生長因子(PlGF)和VEGF的抗血管生成因子)協(xié)同作用，以造成內(nèi)皮功能障礙。
材料和方法試劑從R&D systems(Minneapolis，MN)得到重組人內(nèi)皮糖蛋白、人sFlt1、小鼠內(nèi)皮糖蛋白、小鼠sFlt1、人TGF-β1、人TGF-β3、小鼠VEGF。從Santa Cruz Biotechnology，Inc.得到針對人內(nèi)皮糖蛋白N-末端區(qū)的小鼠單克隆抗體(目錄號sc 20072)和多克隆抗體(sc20632)。從R&D systems，MN得到人sFlt1、小鼠sFlt1和人可溶內(nèi)皮糖蛋白的ELISA試劑盒。
腺病毒的產(chǎn)生以前已經(jīng)描述了針對sFlt1的腺病毒和對照腺病毒(CMV)(Maynard等，J.Clin.Invest.111649658(2003))，并在RichardMulligan博士的協(xié)助下，在Harvard Medical Core facility產(chǎn)生。為了產(chǎn)生可溶內(nèi)皮糖蛋白腺病毒，我們使用了Adeasy試劑盒(Stratagene)。簡而言之，使用人cDNA全長內(nèi)皮糖蛋白克隆(Invitrogen，CA)作為模板，并使用下面的寡核苷酸作為引物，PCR擴(kuò)增了人可溶內(nèi)皮糖蛋白(Thr 27-Leu 586)正向5′-ACG AAG CTTGAA ACA GTC CAT TGT GAC CTT-3′(SEQ ID NO3)，和反向5′TTA GAT ATC TGG CCT TTG CTT GTG CAA CC-3′(SEQ ID NO4)。將擴(kuò)增的PCR片段首先亞克隆進(jìn)pSecTag2-B(Invitrogen，CA)，并確認(rèn)DNA序列。使用pSecTag2 B-可溶內(nèi)皮糖蛋白作為模板，PCR擴(kuò)增編碼His-標(biāo)記的人可溶內(nèi)皮糖蛋白的哺乳動物表達(dá)構(gòu)建體，并亞克隆進(jìn)pShuttle-CMV載體(Stratagene；Kpn1和Sca1位點(diǎn))，即一種腺病毒轉(zhuǎn)移載體，以用于進(jìn)行腺病毒產(chǎn)生。然后，使用根據(jù)生產(chǎn)商說明書的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，產(chǎn)生表達(dá)可溶內(nèi)皮糖蛋白(sE)的腺病毒，并通過蛋白印跡確認(rèn)表達(dá)。然后，如以前所述的(Kuo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 984605-4610(2001))，在293細(xì)胞上擴(kuò)增證實(shí)的克隆，并在CsCl2密度梯度上進(jìn)行純化。通過光學(xué)吸光度方法(Sweeney等，Virology，2002，295284-288)，滴定最終產(chǎn)物。以從以前使用基于標(biāo)準(zhǔn)噬斑稀釋的滴定測定試劑盒(BD Biosciences Clontech，PaloAlto，CA，Cat.No.Kl 653-1)和光學(xué)吸光度方法滴定的病毒制備物(prep)衍生的公式為基礎(chǔ)，將效價(jià)表達(dá)為噬斑形成單位(pfu)/mL。
患者在得到適當(dāng)?shù)腎RB-批準(zhǔn)的同意后，在Beth Israel DeaconessMedical Center招募該研究的所有患者。將先兆子癇定義為(1)以前血壓正常的患者在妊娠20周后，收縮BP＞140且舒張BP＞90，(2)新發(fā)作的蛋白尿(利用測驗(yàn)片進(jìn)行尿分析為1+，或24-小時(shí)尿收集中的蛋白＞300mg，或隨機(jī)的尿蛋白/肌酸酐比＞0.3)，和(3)產(chǎn)后12周高血壓及蛋白尿消除。排除患有基線高血壓、蛋白尿或腎病的患者。為了該研究的目的，以是否存在腎病范圍的蛋白尿(24小時(shí)尿收集中的蛋白＞3g或尿蛋白/肌酸酐比大于3.0)為基礎(chǔ)，將患者分成輕度和重度先兆子癇。當(dāng)患者具有血小板減少癥(＜100000細(xì)胞/μl)、升高的LDH(＞600IU/L)和升高的AST(＞70IU/L)的跡象時(shí)，定義為HELLP綜合征。包含健康的孕婦作為對照。包含8位因?yàn)槠渌t(yī)學(xué)原因早產(chǎn)的患者作為另外的對照。在分娩后立即得到胎盤樣品。在征得知情的同意后，在分娩時(shí)(分娩胎盤之前0-12小時(shí))，從妊娠患者收集血清。這些實(shí)驗(yàn)得到了Beth Israel Deaconess Medical Center的Institutional Review Board的批準(zhǔn)。
ELISA和蛋白印跡使用來自R&D systems，MN的商業(yè)試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，進(jìn)行各種蛋白(sFlt1，可溶內(nèi)皮糖蛋白)的ELISA。如別處所述(Maynard等，同上)，使用蛋白印跡和ELISA來檢查大鼠血漿中腺病毒感染的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
免疫沉淀(IP)實(shí)驗(yàn)將隨后為蛋白印跡的IP用于鑒別和表征先兆子癇患者的胎盤組織和血清樣品中的可溶內(nèi)皮糖蛋白。用冷PBS洗滌人胎盤組織，并在勻漿緩沖液[10mM Tris-HCl，pH 7.4；15mM NaCl；60mM KCl；1mM EDTA；0.1mM EGTA；0.5％NonidetP-40；5％蔗糖；購自Roche(Indianapolis，IN)的蛋白酶混合物]中裂解10分鐘。然后，用抗人單克隆小鼠內(nèi)皮糖蛋白抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，SantaCruz，CA)，對胎盤裂解物進(jìn)行免疫沉淀。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用免疫純的IgG定向試劑盒(Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，美國)，通過定向偶聯(lián)3-5mg純化的抗體到2ml A蛋白-瓊脂糖上，制備免疫親和柱。然后，用含有蛋白酶混合物的RIPA緩沖液充分洗滌柱，并用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液pH 2.8洗脫結(jié)合的蛋白。將洗脫液收集在含有1mol/L Tris-HCl緩沖液的0.5-ml級分中。合并含有蛋白的級分，并用CENTRICON離心濃縮器(MilliporeCorp.，Bedford，Massachusetts，美國)濃縮9至10倍。在4-12％梯度凝膠(Invitrogen)上分離免疫沉淀的樣品，并將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)膜上。使用多克隆抗人兔內(nèi)皮糖蛋白第一抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)，通過蛋白印跡檢測內(nèi)皮糖蛋白蛋白。
內(nèi)皮管測定將生長因子減少的matrigel(7mg/mL，Collaborative BiomedicalProducts，Bedford，MA)放在預(yù)冷的48孔細(xì)胞培養(yǎng)平板的孔(100l/孔)中，并在37℃溫育30分鐘，以允許聚合。用重組蛋白的各種組合(可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt1或二者)處理HUVEC細(xì)胞(30,000+在300μl沒有血清的內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，Clonetics，Walkersville，MD)，鋪平板到Matrigel包被的孔上，并在37℃溫育12-16小時(shí)。然后通過4X倒置相差顯微鏡(Nikon Corporation，Tokyo，日本)評價(jià)管形成，并使用Simple PCI成像分析軟件進(jìn)行定量分析(管面積和總長度)。
微血管通透性實(shí)驗(yàn)經(jīng)眶后靜脈叢，給Balb-C小鼠注射1×108pfu表達(dá)GFP或可溶內(nèi)皮糖蛋白或sFlt1或其組合的腺病毒，并在48小時(shí)后進(jìn)行微血管通透性測定。通過腹膜內(nèi)(IP)注射0.5ml阿佛丁，麻醉小鼠。將100ml 1％伊文思藍(lán)染料(溶于PBS中)注射進(jìn)尾靜脈。40分鐘后，通過心臟穿刺，給小鼠灌注含有2mM EDTA的PBS 20分鐘。收獲器官(腦、肺、肝、腎)，并在甲酰胺中溫育3天，以洗脫伊文思藍(lán)染料。使用620nm波長，測量甲酰胺溶液的OD。
腎微血管反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)使用大鼠腎微血管(70-170μm內(nèi)徑)，如以前所述(Maynard等，同上)，進(jìn)行微血管反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)。在所有實(shí)驗(yàn)組中，在用U46619(血栓烷激動劑)預(yù)收縮微血管至在40mmHg擴(kuò)張壓下的基線直徑的40-60％后，檢查腎微血管的松弛反應(yīng)。一旦達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)張力，就以標(biāo)準(zhǔn)化的次序，檢查對各種試劑(如TGF-β1或TGF-β3或VEGF)的反應(yīng)。所有藥物都是腔外地(extraluminally)施用的。
動物模型通過尾靜脈注射，給妊娠的和非妊娠的Sprague-Dawley大鼠注射2×109pfu腺病毒(Ad CMV或Ad sFlt1或Ad sE或Ad sFlt1+AdsE)。在妊娠的第8-9天(次三個(gè)月早期)注射妊娠的大鼠，并在妊娠的第16-17天(第三個(gè)三個(gè)月早期)測量血壓。用戊巴比妥鈉(60mg/kg，腹膜內(nèi)地(i.p.))麻醉之后，測量大鼠的血壓。分離頸動脈，并插入與壓力轉(zhuǎn)換器(Millar Instruments，Houston，TX)相連的3-Fr高保真度微尖(microtip)導(dǎo)管。記錄血壓，并求10分鐘時(shí)間段內(nèi)的平均值。在安死術(shù)之前得到血液、組織和尿樣品。在測量血壓的當(dāng)天(注射腺病毒后第8天)，測量血漿水平，從而認(rèn)識到腺病毒注射后7-10天與這些蛋白的表達(dá)的峰水平相對應(yīng)。通過蛋白印跡，初步證實(shí)了循環(huán)sFlt-1和可溶內(nèi)皮糖蛋白水平，然后使用商業(yè)上可得到的鼠ELISA試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)進(jìn)行定量。通過兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測驗(yàn)片，測量兩種尿清蛋白，并使用商業(yè)上可得到的大鼠清蛋白ELISA試劑盒(Nephrat試劑盒，Exocell Inc，Philadelphia，PA)，通過競爭性酶聯(lián)免疫測定進(jìn)行定量。使用苦味酸比色方法試劑盒(Metra肌酸酐測定試劑盒，Quidel Corp，SanDiego，CA)，測量尿肌酸酐。使用商業(yè)上可得到的試劑盒(ThermoElectron，Louisville，CO)，測量AST和LDH。使用自動血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Hemavet 850，Drew Scientific Inc，Oxford，CT)，測量來自大鼠血液的血小板計(jì)數(shù)。對血液外周涂片進(jìn)行瑞特染色，以檢測循環(huán)血液中的裂紅細(xì)胞。測量血壓和收集樣品后，處死大鼠，并收獲器官用于組織學(xué)。計(jì)數(shù)產(chǎn)仔數(shù)，并稱量單個(gè)胎盤和胎兒的重量。將收獲的腎置于布安氏液中，用石蠟包埋，切片，并用H&E、PAS或Masson氏三色染料染色。
統(tǒng)計(jì)學(xué)對比將結(jié)果表達(dá)為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)，并通過使用ANOVA分析方差，進(jìn)行多個(gè)組之間的對比。當(dāng)p＜0.05時(shí)，報(bào)告顯著差異。
結(jié)果先兆子癇患者中升高的可溶內(nèi)皮糖蛋白使用表7所述患者的血清樣品，我們測量了各個(gè)組的先兆子癇患者和對照妊娠患者中的可溶內(nèi)皮糖蛋白的循環(huán)濃度。
表7各個(gè)患者組的臨床特征和循環(huán)可溶內(nèi)皮糖蛋白
*P＜0.05，**P＜0.005在輕度先兆子癇中，可溶內(nèi)皮糖蛋白的平均血清濃度至少高2倍，而在重度先兆子癇患者中高3-4倍。在并發(fā)HELLP綜合征的先兆子癇患者中，可溶內(nèi)皮糖蛋白濃度為胎齡匹配的對照樣品的至少5-10倍。另外，妊娠患者中的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平與sFlt1水平相關(guān)聯(lián)(圖18)。關(guān)聯(lián)的R2值是0.6。(應(yīng)當(dāng)指出，這里報(bào)道的sFlt-1循環(huán)濃度是以前公布的至少4-5倍(Maynard等，同上)。這是由于來自R&D systems的新ELISA試劑盒的靈敏度的差異，其在測定稀釋液中缺少尿素，因此總是產(chǎn)生比以前公布的更高的值)。換而言之，具有最高水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白的患者也具有最高循環(huán)水平的sFlt1?？扇軆?nèi)皮糖蛋白的起源最可能是胎盤的合胞體滋養(yǎng)層，如在我們的胎盤免疫組織化學(xué)上看到的增強(qiáng)染色所證實(shí)的(圖19和20)。這些圖表明，內(nèi)皮糖蛋白蛋白由合胞體滋養(yǎng)層表達(dá)，并在先兆子癇中極大地上調(diào)。我們的蛋白印跡數(shù)據(jù)(圖21A和21B)和RNA印跡還證實(shí)，可溶內(nèi)皮糖蛋白是內(nèi)皮糖蛋白蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的脫落形式，其大小約65kDA，在先兆子癇胎盤中過量地表達(dá)，且它在先兆子癇胎盤中過量地循環(huán)。該蛋白的預(yù)測長度是約437個(gè)氨基酸。
可溶內(nèi)皮糖蛋白是抗血管生成分子，并誘導(dǎo)血管功能障礙我們使用血管生成的體外模型來理解可溶內(nèi)皮糖蛋白的功能?？扇軆?nèi)皮糖蛋白適當(dāng)?shù)匾种苾?nèi)皮管形成，sFlt1的存在會進(jìn)一步對其進(jìn)行強(qiáng)化(圖22)。在先兆子癇中，已經(jīng)報(bào)道除了內(nèi)皮功能障礙外，還存在增強(qiáng)的微血管通透性，如由水腫和增強(qiáng)的依文斯藍(lán)結(jié)合的清蛋白胞外泄漏所證實(shí)的。為了觀察可溶內(nèi)皮糖蛋白是否誘導(dǎo)微血管泄漏，我們使用用可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt處理了48小時(shí)的小鼠。可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt1的組合，誘發(fā)肺、肝和腎中清蛋白泄漏的急劇增加，和腦中的適度泄漏，如使用伊文思藍(lán)測定所證實(shí)的(圖23)。單獨(dú)的可溶內(nèi)皮糖蛋白誘發(fā)肝中的適度泄漏。這些數(shù)據(jù)表明，可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt1組合是有效的抗血管生成分子，且可以誘發(fā)顯著的血管泄漏。
為了評價(jià)可溶內(nèi)皮糖蛋白的血流動力學(xué)作用，在大鼠腎微血管中進(jìn)行了一系列微血管反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)。我們首先研究了TGF-β1和TGF-β3(內(nèi)皮糖蛋白的兩種已知的配體)的作用。TGF-β1和TGF-β3都誘發(fā)血管直徑的劑量依賴性的增加。重要的是，在過量可溶內(nèi)皮糖蛋白存在下，兩種TGF的作用都顯著減弱(圖24)。最后，VEGF和TGF-β1的組合誘發(fā)血管舒張，后者受到過量可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt1的阻斷(圖25)。這表明，sFlt1和可溶內(nèi)皮糖蛋白可以對抗血管生成生長因子(如VEGF和TGF-β1)誘發(fā)的生理性血管舒張，并誘發(fā)高血壓。
可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt1的體內(nèi)作用為了評價(jià)可溶內(nèi)皮糖蛋白和sFlt1對血管的作用，我們借助于妊娠大鼠中的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)。在妊娠的第8天，通過尾靜脈將編碼對照基因(CMV)或可溶內(nèi)皮糖蛋白或sFlt1或sFlt1+可溶內(nèi)皮糖蛋白的腺病毒注射進(jìn)Sprague-Dawley大鼠。在第17天，檢查動物的先兆子癇表型。表8包括血流動力學(xué)和生物化學(xué)數(shù)據(jù)。
表8.腺病毒處理的大鼠動物模型的血流動力學(xué)和生物化學(xué)數(shù)據(jù)
MAP-平均動脈壓(舒張壓+1/3脈壓)；Alb/Creat-清蛋白/肌酸酐比；LDH-乳酸脫氫酶；AST-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。
*當(dāng)與對照組相比較時(shí)，P＜0.05胎兒體重是每組隨機(jī)選擇的4個(gè)胎兒的總和。
sFlt1的平均循環(huán)濃度，在sFlt1組中是410ng/ml，且在sFlt1+sE組中是430ng/ml。sE的平均循環(huán)濃度，在sE組中是318ng/ml，且在sFlt1+sE組中是319ng/ml。
單獨(dú)的可溶內(nèi)皮糖蛋白誘發(fā)輕度高血壓。sFlt1誘發(fā)高血壓和蛋白尿兩者，如以前所報(bào)道的。重要的是，sFlt1和可溶內(nèi)皮糖蛋白的組合誘發(fā)嚴(yán)重的高血壓、腎病范圍的蛋白尿、胎兒的生長限制和發(fā)展HELLP綜合征的生物化學(xué)跡象(升高的LDH、升高的AST和減少血小板計(jì)數(shù))(表8)。通過揭示裂紅細(xì)胞和網(wǎng)織細(xì)胞增多的外周涂片，證實(shí)了可溶內(nèi)皮糖蛋白+sFlt1組中的溶血跡象(圖26A-B)。最后，腎組織學(xué)也證實(shí)了可溶內(nèi)皮糖蛋白+sFlt1組的嚴(yán)重的腎小球內(nèi)皮增生(圖27A-27D)。
總結(jié)這些結(jié)果證實(shí)，可溶內(nèi)皮糖蛋白在先兆子癇胎盤中受到上調(diào)，且在先兆子癇患者中以非常高的水平存在。最高水平的可溶內(nèi)皮糖蛋白存在于患有HELLP綜合征的患者中，該HELLP綜合征是先兆子癇的最嚴(yán)重形式之一。這些結(jié)果還證實(shí)，可溶內(nèi)皮糖蛋白水平與妊娠患者中升高的sFlt1相關(guān)聯(lián)，且在存在更高的循環(huán)sFlt1水平的那些患者中更高。此外，這些結(jié)果證實(shí)，可溶內(nèi)皮糖蛋白是抗血管生成分子，并在許多內(nèi)皮測定(如血管生成測定、微血管通透性測定和微血管反應(yīng)性實(shí)驗(yàn))中破壞內(nèi)皮功能。重要的是，可溶內(nèi)皮糖蛋白可以放大sFlt1在這些體外內(nèi)皮測定中的毒性結(jié)果。而且，在體內(nèi)測定中，可溶內(nèi)皮糖蛋白的腺病毒表達(dá)誘發(fā)輕度高血壓，而沒有任何顯著的蛋白尿。但是，在有sFlt1存在下，可溶內(nèi)皮糖蛋白誘發(fā)顯著的血管損傷，如由嚴(yán)重高血壓、蛋白尿、腎小球內(nèi)皮增生、HELLP綜合征的發(fā)展和胎兒生長限制的存在所證實(shí)的。這些數(shù)據(jù)表明，可溶內(nèi)皮糖蛋白在產(chǎn)婦先兆子癇綜合征的病因中起重要作用，并強(qiáng)調(diào)了對中和可溶內(nèi)皮糖蛋白以用于治療先兆子癇的試劑的需要。
可溶內(nèi)皮糖蛋白釋放的機(jī)理可能是內(nèi)皮糖蛋白分子的胞外區(qū)的蛋白酶剪切。在先兆子癇組織中受到上調(diào)的特定蛋白酶可以作為候選分子。一個(gè)實(shí)例是膜類型的基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MT1-MMP)，已經(jīng)表明它切割β聚糖，即與內(nèi)皮糖蛋白共有相似性的一種分子(Velasco-Loyden等，J.Biol.Chem.2797721-33(2004))。因此，這些蛋白酶的抑制劑可以作為治療先兆子癇的有價(jià)值的靶。
其它實(shí)施方案為了解釋的目的，提供了本發(fā)明的具體的實(shí)施方案的描述。它們不意欲是窮盡性的，也無意將本發(fā)明的范圍限制為本文所述的具體形式。盡管已經(jīng)參照幾個(gè)實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離如權(quán)利要求書所述的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行各種修改。本文中提到的所有專利、專利申請和出版物均引作參考。
其它實(shí)施方案在權(quán)利要求書中。
序列表序列表<110>Beth Israel Deaconess Medical Center et al.
<120>診斷和治療妊娠并發(fā)癥的方法<130>01948/106W02<150>60/613,170<151>2004-09-24<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1311<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atggaccgcg gcacgctccc tctggctgtt gccctgctgc tggccagctg cagcctcagc60cccacaagtc ttgcagaaac agtccattgt gaccttcagc ctgtgggccc cgagagggac120gaggtgacat ataccactag ccaggtctcg aagggctgcg tggctcaggc ccccaatgcc180atccttgaag tccatgtcct cttcctggag ttcccaacgg gcccgtcaca gctggagctg240actctccagg catccaagca aaatggcacc tggccccgag aggtgcttct ggtcctcagt300gtaaacagca gtgtcttcct gcatctccag gccctgggaa tcccactgca cttggcctac360aattccagcc tggtcacctt ccaagagccc ccgggggtca acaccacaga gctgccatcc420ttccccaaga cccagatcct tgagtgggca gctgagaggg gccccatcac ctctgctgct480gagctgaatg acccccagag catcctcctc cgactgggcc aagcccaggg gtcactgtcc540ttctgcatgc tggaagccag ccaggacatg ggccgcacgc tcgagtggcg gccgcgtact600ccagccttgg tccggggctg ccacttggaa ggcgtggccg gccacaagga ggcgcacatc660ctgagggtcc tgccgggcca ctcggccggg ccccggacgg tgacggtgaa ggtggaactg720
agctgcgcac ccggggatct cgatgccgtc ctcatcctgc agggtccccc ctacgtgtcc780tggctcatcg acgccaacca caacatgcag atctggacca ctggagaata ctccttcaag840atctttccag agaaaaacat tcgtggcttc aagctcccag acacacctca aggcctcctg900ggggaggccc ggatgctcaa tgccagcatt gtggcatcct tcgtggagct accgctggcc960agcattgtct cacttcatgc ctccagctgc ggtggtaggc tgcagacctc acccgcaccg1020atccagacca ctcctcccaa ggacacttgt agcccggagc tgctcatgtc cttgatccag1080acaaagtgtg ccgacgacgc catgaccctg gtactaaaga aagagcttgt tgcgcatttg1140aagtgcacca tcacgggcct gaccttctgg gaccccagct gtgaggcaga ggacaggggt1200gacaagtttg tcttgcgcag tgcttactcc agctgtggca tgcaggtgtc agcaagtatg1260atcagcaatg aggcggtggt caatatcctg tcgagctcat caccacagcg g 1311<210>2<211>437<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Asp Arg Gly Thr Leu Pro Leu Ala Val Ala Leu Leu Leu Ala Ser1 5 10 15Cys Ser Leu Ser Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu20 25 30Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln35 40 45Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val50 55 60
His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu65 70 75 80Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu85 90 95Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu100 105 110Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln115 120 125Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr130 135 140Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala145 150 155 160Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln165 170 175Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg180 185 190Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His195 200 205Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu210 215 220Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu225 230 235 240
Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro245 250 255Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp260 265 270Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg275 280 285Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg290 295 300Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala305 310 315 320Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr325 330 335Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro340 345 350Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met355 360 365Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile370 375 380Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly385 390 395 400Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val405 410 415
Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser420 425 430Ser Ser Pro Gln Arg435<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3acgaagcttg aaacagtcca ttgtgacctt 30<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4ttagatatct ggcctttgct tgtgcaacc 29
權(quán)利要求
1.治療或預(yù)防受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥的方法，所述方法包含給所述受試者施用能特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的化合物的步驟，其中所述施用的時(shí)間和量足以治療或預(yù)防所述受試者的所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥選自先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征和具有小于胎齡兒(SGA)嬰兒的妊娠。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇或子癇。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是純化的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗體或可溶內(nèi)皮糖蛋白抗原結(jié)合片段。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是生長因子。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述生長因子選自轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1或TGF-β3、活化素A、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2或BMP-7。
7.權(quán)利要求1的方法，還包含施用選自下述的化合物純化的sFlt-1抗體、sFlt抗原結(jié)合片段、煙堿、茶堿、腺苷、硝苯地平、米諾地爾、硫酸鎂、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和胎盤生長因子(PlGF)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述VEGF是VEGF121或VEGF165。
9.權(quán)利要求1的方法，還包含給受試者施用抗高血壓化合物的步驟。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者是妊娠的人。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者是產(chǎn)后的人。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者是非人類。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述受試者選自牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗和貓。
14.治療或預(yù)防受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥的方法，所述方法包含給所述受試者施用增加能結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的生長因子的水平的化合物的步驟，其中所述施用的量和時(shí)間足以治療或預(yù)防所述受試者的所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述生長因子選自TGF-β1、TGF-3β、活化素A、BMP-2和BMP-7。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物選自環(huán)孢菌素、α生育酚、美西麥角、溴隱亭和愛道美。
17.治療或預(yù)防受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥的方法，所述方法包含給所述受試者施用抑制生長因子結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的化合物，其中所述施用足以治療或預(yù)防所述受試者的所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述化合物結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白，并阻斷生長因子結(jié)合。
19.治療或預(yù)防受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥的方法，所述方法包含給所述受試者施用能降低可溶內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)或生物學(xué)活性的化合物，其中所述施用足以治療或預(yù)防所述受試者的所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述化合物是抑制選自基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、組織蛋白酶和彈性蛋白酶的蛋白水解酶的化合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述MMP是MMP9。
22.權(quán)利要求20的方法，其中MMP是膜類型基質(zhì)金屬蛋白酶-1。
23.權(quán)利要求19的方法，其中所述化合物包含與內(nèi)皮糖蛋白核酸序列的至少部分至少95％互補(bǔ)的反義核堿基寡聚體，其中所述施用足以治療或預(yù)防所述受試者的所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述反義核堿基寡聚體是8-30個(gè)核苷酸長。
25.權(quán)利要求19的方法，其中所述化合物包含雙鏈RNA分子，其具有一條與內(nèi)皮糖蛋白核酸序列的至少部分至少95％互補(bǔ)的鏈，其中所述施用足以治療或預(yù)防所述受試者的所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述雙鏈RNA是19-25個(gè)核苷酸長的小干擾RNA(siRNA)。
27.權(quán)利要求19的方法，所述化合物包含特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的純化的抗體或抗原結(jié)合片段。
28.權(quán)利要求14、17或19的方法，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥選自先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征和具有小于胎齡兒(SGA)嬰兒的妊娠。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇或子癇。
30.權(quán)利要求1或19的方法，其中所述方法還包含監(jiān)控所述受試者的所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥，其中所述監(jiān)控包括測量來自所述受試者的樣品中的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述樣品是血清或血漿，且小于25ng/ml的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽水平指示著所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥的改善。
32.權(quán)利要求30的方法，其中在兩個(gè)或更多個(gè)場合進(jìn)行所述的水平測量，且測量之間的所述水平的降低指示著所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥的改善。
33.權(quán)利要求30的方法，其中將所述水平的測量與陽性參照樣品相比較，且可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平相對于所述陽性參照樣品的降低，指示著所述受試者的所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥的改善。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述監(jiān)控用于確定化合物的治療劑量。
35.權(quán)利要求30的方法，其中使用免疫學(xué)測定進(jìn)行所述測量。
36.權(quán)利要求30的方法，其中所述可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平是游離的、結(jié)合的或總的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平。
37.權(quán)利要求30的方法，其中所述可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平是由降解或酶切割產(chǎn)生的內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平。
38.權(quán)利要求30的方法，其中所述監(jiān)控包含測量sFlt-1、VEGF或PlGF多肽中的至少一種在來自所述受試者的樣品中的水平。
39.權(quán)利要求38的方法，還包含使用度量計(jì)算所述可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的水平之間的關(guān)系，其中受試者樣品相對于參照樣品的所述水平之間的關(guān)系的變化，是所述受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥的診斷指標(biāo)。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述度量是先兆子癇抗血管生成指數(shù)(PAAI)[sFlt-1/VEGF+PlGF]。
41.權(quán)利要求40的方法，其中小于20的PAAI值指示著所述先兆子癇或子癇的改善。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述度量是可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)[(sFlt-1+0.25可溶內(nèi)皮糖蛋白)/PlGF]或[(可溶內(nèi)皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF]。
43.權(quán)利要求39的方法，其中所述度量用于確定治療性化合物的劑量。
44.權(quán)利要求43的方法，其中以使PAAI小于20的劑量施用所述治療性化合物。
45.權(quán)利要求1或19的方法，其中所述方法還包含監(jiān)控所述受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥，其中所述監(jiān)控包含測量內(nèi)皮糖蛋白核酸分子在來自所述受試者的樣品中的水平。
46.權(quán)利要求45的方法，其中將所述內(nèi)皮糖蛋白核酸的水平與參照樣品相比較，且受試者樣品中所述水平相對于所述參照的變化，是所述受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥的診斷指標(biāo)。
47.特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段。
48.權(quán)利要求47的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段阻止生長因子與可溶內(nèi)皮糖蛋白的結(jié)合。
49.權(quán)利要求48的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述生長因子選自TGF-β1、TGF-β3、活化素A、BMP-2和BMP-7。
50.權(quán)利要求47的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是單克隆抗體。
51.權(quán)利要求47的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段是人或人源化抗體。
52.權(quán)利要求47的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體缺少Fc部分。
53.權(quán)利要求47的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是F(ab′)2、Fab或Fv結(jié)構(gòu)。
54.權(quán)利要求47的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段存在于藥學(xué)上可接受的載體中。
55.診斷受試者患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥或具有其素因的方法，所述方法包含測量來自受試者的樣品中的可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的水平。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征和具有SGA嬰兒的妊娠。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇或子癇。
58.權(quán)利要求55的方法，其中所述可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平是游離的、結(jié)合的或總的可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平。
59.權(quán)利要求55的方法，其中大于20ng/ml的可溶內(nèi)皮糖蛋白水平是妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向的診斷指標(biāo)。
60.權(quán)利要求55的方法，其中使用免疫學(xué)測定進(jìn)行所述測量。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述免疫學(xué)測定是ELISA。
62.權(quán)利要求55的方法，其中所述可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽水平相對于正常參照的增加是妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向的診斷指標(biāo)。
63.權(quán)利要求55的方法，其中在兩個(gè)或更多個(gè)場合進(jìn)行所述水平測量，且測量之間的所述水平的變化是妊娠相關(guān)的高血壓病癥的診斷指標(biāo)。
64.權(quán)利要求55的方法，其中所述監(jiān)控還包含測量sFlt-l、VEGF或PlGF多肽中的至少一種在來自所述受試者的樣品中的水平。
65.權(quán)利要求64的方法，還包含使用度量計(jì)算可溶內(nèi)皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的所述水平之間的關(guān)系，其中受試者樣品相對于參照樣品的所述水平之間的關(guān)系的變化，是所述受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥的診斷指標(biāo)。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述度量是先兆子癇抗血管生成指數(shù)(PAAI)[sFlt-1/VEGF+PlGF]。
67.權(quán)利要求66的方法，其中大于10的PAAI值是所述受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥的診斷指標(biāo)。
68.權(quán)利要求65的方法，其中所述度量是可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)[(sFlt-1+0.25可溶內(nèi)皮糖蛋白)/PlGF]。
69.權(quán)利要求68的方法，其中大于100的可溶內(nèi)皮糖蛋白抗血管生成指數(shù)值是所述受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥的診斷指標(biāo)。
70.權(quán)利要求65的方法，其中所述度量是[(可溶內(nèi)皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF]。
71.權(quán)利要求66、68或70的方法，其中所述度量還包含母親的體重指數(shù)或胎兒的胎齡。
72.診斷受試者患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥或具有其素因的方法，所述方法包含測量內(nèi)皮糖蛋白核酸分子在來自所述受試者的樣品中的水平，并將它與參照相比較，其中所述水平相對于參照的變化，診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向。
73.權(quán)利要求72的方法，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、HELLP綜合征、慢性高血壓或具有小于胎齡兒嬰兒的妊娠。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇或子癇。
75.權(quán)利要求72的方法，其中所述水平的變化是增加。
76.權(quán)利要求72的方法，其中所述內(nèi)皮糖蛋白核酸是可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸。
77.權(quán)利要求72的方法，還包含測量sFlt-1、VEGF或PlGF核酸分子中的至少一種在來自所述受試者的樣品中的水平，并將其與參照樣品相對比，其中所述水平的變化診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向。
78.診斷受試者患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥或具有其素因的方法，所述方法包含確定來自所述受試者的樣品中的內(nèi)皮糖蛋白基因的核酸序列，并將其與參照序列相對比，其中受試者核酸序列的改變所述受試者中基因產(chǎn)物的表達(dá)水平的變化，診斷受試者患有妊娠相關(guān)的高血壓病癥或有發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、HELLP綜合征、慢性高血壓或具有小于胎齡兒嬰兒的妊娠。
80.權(quán)利要求79的方法，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇或子癇。
81.權(quán)利要求55、72或78的方法，其中所述樣品是所述受試者的體液，其中所述可溶內(nèi)皮糖蛋白通常是可檢測到的。
82.權(quán)利要求81的方法，其中所述體液選自尿、羊水、血液、血清、血漿和腦脊液。
83.權(quán)利要求55、72或78的方法，其中所述樣品是細(xì)胞或組織。
84.權(quán)利要求83的方法，其中所述細(xì)胞選自內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、單核細(xì)胞或源自胎盤的細(xì)胞。
85.權(quán)利要求83的方法，其中所述組織是胎盤組織。
86.權(quán)利要求55、72或78的方法，其中所述受試者是未妊娠的人、妊娠的人、產(chǎn)后的人或非人類，且所述方法診斷發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向。
87.權(quán)利要求86的方法，其中所述非人類選自牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗或貓。
88.權(quán)利要求72的方法，其中在兩個(gè)或更多個(gè)場合進(jìn)行所述水平測量，且測量之間的所述水平的變化是所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥的診斷指標(biāo)。
89.權(quán)利要求55、72或78的方法，其中所述方法用于在發(fā)作癥狀前至少4周診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向。
90.試劑盒，其用于診斷受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向，其包含具有內(nèi)皮糖蛋白核酸序列的核酸分子或其互補(bǔ)序列或其任意組合，和將所述核酸分子用于妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向的說明書。
91.權(quán)利要求90的試劑盒，其中所述試劑盒還包含VEGF、sFlt-1或PlGF的核酸序列，或其互補(bǔ)序列，或其任意組合。
92.權(quán)利要求90的試劑盒，其中所述內(nèi)皮糖蛋白核酸是可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸。
93.試劑盒，其用于診斷受試者的妊娠相關(guān)的高血壓病癥，其包含可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合分子，和使用所述可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合分子來診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向的說明書。
94.權(quán)利要求93的試劑盒，其中所述可溶內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合分子是特異性地結(jié)合可溶內(nèi)皮糖蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段。
95.權(quán)利要求93的試劑盒，其中所述試劑盒還包含VEGF、sFlt-1或PlGF結(jié)合分子。
96.權(quán)利要求90或93的試劑盒，其中所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥是先兆子癇、子癇、慢性高血壓、HELLP綜合征、妊娠高血壓或具有SGA嬰兒的妊娠。
97.鑒別改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物的方法，所述方法包含使表達(dá)內(nèi)皮糖蛋白核酸分子的細(xì)胞接觸候選化合物，并對比所述候選化合物接觸的所述細(xì)胞中的所述內(nèi)皮糖蛋白核酸分子的表達(dá)水平和所述候選化合物未接觸的對照細(xì)胞中的表達(dá)水平，其中所述內(nèi)皮糖蛋白核酸分子的表達(dá)的變化，將所述候選化合物鑒別為改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物。
98.權(quán)利要求97的方法，其中所述變化是所述可溶內(nèi)皮糖蛋白核酸分子的水平的降低。
99.鑒別改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物的方法，所述方法包含使表達(dá)可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的細(xì)胞接觸候選化合物，并對比所述候選化合物接觸的所述細(xì)胞中的所述可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的表達(dá)水平和所述候選化合物未接觸的對照細(xì)胞中的多肽表達(dá)水平，其中所述內(nèi)皮糖蛋白多肽的表達(dá)的變化，將所述候選化合物鑒別為改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物。
100.權(quán)利要求99的方法，其中使用免疫學(xué)測定、酶法測定或免疫測定來測量所述表達(dá)的變化。
101.權(quán)利要求99的方法，其中所述表達(dá)的變化是可溶內(nèi)皮糖蛋白水平的降低。
102.權(quán)利要求99的方法，其中所述表達(dá)的變化是轉(zhuǎn)錄或翻譯的變化。
103.鑒別改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物的方法，所述方法包含使表達(dá)可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的細(xì)胞接觸候選化合物，并對比所述候選化合物接觸的所述細(xì)胞中的所述多肽的生物學(xué)活性和所述候選化合物未接觸的對照細(xì)胞中的生物學(xué)活性水平，其中所述內(nèi)皮糖蛋白多肽的生物學(xué)活性的變化，將所述候選化合物鑒別為改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物。
104.鑒別改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物的方法，所述方法包含檢測在有候選化合物存在下，可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結(jié)合，其中與沒有所述候選化合物存在時(shí)所述可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和所述生長因子之間的結(jié)合相比所述結(jié)合的降低，將所述候選化合物鑒別為改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物。
105.鑒別阻止可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結(jié)合的多肽或其片段的方法，所述方法包含檢測在有所述候選多肽存在下，可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結(jié)合，其中與沒有所述候選多肽存在時(shí)所述可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和所述生長因子之間的結(jié)合相比所述結(jié)合的降低，將所述候選多肽鑒別為阻止可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結(jié)合的多肽。
106.鑒別改善妊娠相關(guān)的高血壓病癥的化合物的方法，所述方法包含檢測可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽和候選化合物之間的結(jié)合，其中結(jié)合所述可溶內(nèi)皮糖蛋白多肽的化合物改善所述妊娠相關(guān)的高血壓病癥。
全文摘要
本文公開了通過測量可溶內(nèi)皮糖蛋白的水平或生物學(xué)活性，診斷妊娠相關(guān)的高血壓病癥或發(fā)展妊娠相關(guān)的高血壓病癥的傾向的方法。本文還公開了使用改變可溶內(nèi)皮糖蛋白水平或生物學(xué)活性的化合物來治療妊娠相關(guān)的高血壓病癥(如先兆子癇和子癇)的方法。
文檔編號A61K39/395GK101065667SQ200580040164
公開日2007年10月31日 申請日期2005年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月24日
發(fā)明者S·A·卡魯曼基, V·舒克哈特姆 申請人:貝絲以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心