專利名稱：：Aha基因的RNAi調(diào)控及其治療性應(yīng)用的制作方法Aha基因的RNAi調(diào)控及其治療性應(yīng)用發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及利用熱休克蛋白90ATP酶激活因子(Aha)基因的調(diào)節(jié)劑的治療方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)施用下調(diào)Aha表達(dá)的小干擾RNA治療與不良Aha活性相關(guān)的病癥的方法，以及用于所述方法的試劑。
背景技術(shù)：
：熱休克蛋白90ATP酶1激活因子(本文表示為Ahal)是Hsp90ATP酶活性的激活因子，并且能夠使酵母Hsp90的固有活性提高12倍并使人Hsp90的固有活性提高50倍(Panaretou,B.,etal.,Mol.Cell2002,10:1307-1318)。生物化學(xué)研究己經(jīng)證明Ahal與Hsp90的中間區(qū)域結(jié)合(Panaretouetal.,2002,supra,Lotz,G.P.，etal.,J.Biol.Chem.2003,278:17228-17235)，并且最近關(guān)于Ahal-Hsp90核心復(fù)合體的結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明共伴侶分子(co-chaperone)促進(jìn)Hsp90中段催化環(huán)(370-390)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從而釋放催化性Arg380并促進(jìn)其與ATP在N末端核苷酸結(jié)合域內(nèi)的相互作用(Meyer,P.,etal.，EMBOJ.2004,23:511-519)。分子伴侶熱休克蛋白90(Hsp90)負(fù)責(zé)特定客戶蛋白(clientprotein)的體內(nèi)激活或成熟(Picard，D.,CellMol.LifeSci.2002,59:1640-1648;Pearl,L.H.,andProdromou,C.,Adv.ProteinChem.2002,59:157-185;Pratt,W.B.,andToft,D.O.,Exp.Biol.Med.2003,228:111-133;Prodromou,C.,和Pearl,L.H.,Curr.CancerDrugTargets2003,3:301-323)。對(duì)此類激活作用至關(guān)重要的是Hsp90的基本ATP酶活性(Panaretou，B.,etal.，EMBOJ.1998,17:4829-4836)，該活性驅(qū)動(dòng)一個(gè)包括Hsp90二聚體內(nèi)的N-末端核苷酸結(jié)合域的瞬時(shí)結(jié)合的構(gòu)象循環(huán)(Prodromou,C.，etal.,EMBOJ.2000，19:4383-4392)。作為分子伴侶，HSP90促進(jìn)大量構(gòu)象易變的客戶蛋白的成熟并保持其穩(wěn)定性，其中大多數(shù)所述客戶蛋白參與例如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期進(jìn)程和凋亡的生物過(guò)程，而在腫瘤細(xì)胞中這些生物過(guò)程通常受到擾亂。因此，與其它分子靶向性治療不同，HSP90抑制劑通過(guò)在癌細(xì)胞中同時(shí)破壞多種致癌底物而有希望具有抗癌活性(WhitesellL，和DaiC.，F(xiàn)utureOncol.2005;1:529-540;WO03/067262)。另夕卜，HSP90還參與囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)的降解。作為HSP90ATP酶活性的結(jié)果，CFTR基因突變導(dǎo)致其蛋白質(zhì)的折疊缺陷和泛素化。泛素化之后，CFTR在達(dá)到其活性位點(diǎn)前被降解。然后，活性CFTR的缺乏導(dǎo)致帶有此類突變的人類受試者發(fā)生囊性纖維化。因此，HSP90活性的抑制可有益于患有癌癥或囊性纖維化的受試者。Hsp90構(gòu)成約1-2%的細(xì)胞總蛋白質(zhì)(Pratt,W.B.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.1997,37:297-326)，并且通過(guò)拮抗劑或抑制劑的方式抑制如此大量的蛋白質(zhì)可能需要向細(xì)胞總引入過(guò)量的抑制劑或拮抗劑。另一種方法是抑制存在量較少的HSP90ATP酶活性激活因子，如Ahal。通過(guò)下調(diào)細(xì)胞中Ahal的存在量，可明顯降低HSP90的活性。在人類(//o膨，NM—012111.1)、小鼠(Mws應(yīng)scw/ws，NM—146036.1)和黑猩猩(尸aw^rag/o辦te，XM—510094.1)的Ahal之間存在顯著的序列同源性。尚未鑒定出明確的Ahal的褐家鼠(^m^"orv^/cw)同系物，但是有一個(gè)褐家鼠基因(XM—223680.3)，由于其與酵母Ahsa2的序列同源性而被命名為熱休克蛋白ATP酶同系物2的激活因子(Ahsa2)。所述基因的序列與小鼠RIKENcDNA1110064P04基因(NM—172391.3)同源，而后者的序列則與除N末端截尾之外的AusmusculusAhal相似。目前人類Ahsa2(NM—152392.1)也得到預(yù)測(cè)，但是其序列同系物有限。所述后三個(gè)基因的功能還沒(méi)有被充分闡明。然而，在以上所述的所有序列中都存在一個(gè)相同區(qū)域，并且該區(qū)域可以用作RNAi試劑的靶標(biāo)。這可能有利于抑制不只一個(gè)Aha基因的活性。最近，己發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA分子(dsRNA)通過(guò)被稱為RNA干擾(RNAi)的高度保守的調(diào)控機(jī)制來(lái)阻斷基因表達(dá)。WO99/32619(Fireetal.)公開(kāi)了長(zhǎng)度為至少25個(gè)核苷酸的dsRNA在抑制線蟲(chóng)(Ce/ga"s)基因表達(dá)中的用途。還發(fā)現(xiàn)dsRNA在其它生物體中降解靶RNA，其中所述生物體包括植物(參見(jiàn)，例如WO99/53050,Waterhouseetal.和WO99/61631,Heifetzetal.)、果蠅(參見(jiàn)，例如Yang，D.,etal.,Curr.Biol.(2000)10:1191-1200)和哺乳動(dòng)物(參見(jiàn)WO00/44895,Limmer和DE10100586.5,Kreutzeretal.)。這種天然機(jī)制15現(xiàn)己成為治療因基因異常或有害調(diào)控而引發(fā)的病癥的新型藥物的研發(fā)熱點(diǎn)。除了RNAi領(lǐng)域的顯著進(jìn)展以及對(duì)由HSP90介導(dǎo)的病理過(guò)程治療的進(jìn)展之外，人們還需要能夠利用細(xì)胞自身的RNAi機(jī)制來(lái)選擇性且高效地降低HSP90ATP酶活性的試劑。此類試劑將同時(shí)具有高生物活性和體內(nèi)穩(wěn)定性，并將有效抑制靶標(biāo)Aha基因(例如Ahal)的表達(dá)，用于治療由Aha表達(dá)(例如Ahal表達(dá))直接或間接介導(dǎo)的病理過(guò)程。發(fā)明概述本發(fā)明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)以及使用此類dsRNA抑制細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中Aha基因表達(dá)的組合物和方法。本發(fā)明還提供了用于治療由Aha基因表達(dá)介導(dǎo)的病理狀態(tài)或疾病(例如癌癥或囊性纖維化)的組合物和方法。本發(fā)明的dsRNA包含長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸且通常長(zhǎng)度為19-24個(gè)核苷酸的區(qū)域的RNA鏈(反義鏈)，并且所述區(qū)域與Aha基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的至少一部分基本互補(bǔ)。一方面，本發(fā)明提供了抑制Aha基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子。所述dsRNA包含至少兩個(gè)彼此互補(bǔ)的序列。所述dsRNA包含具有第一序列的正義鏈和具有第二序列的反義鏈。所述反義鏈包含與編碼Aha基因的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的核苷酸序列，并且所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸且通常為19-24個(gè)核苷酸。所述dsRNA影響第二dsRNA靶序列內(nèi)編碼Aha基因的mRNA的剪切，所述第二dsRNA具有選自下組的正義鏈SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、SEQIDNO:149、SEQIDNO:151、SEQIDNO:153、SEQIDNO:155、SEQIDNO:157、SEQIDNO:159、SEQIDNO:163、SEQIDNO:165、SEQIDNO:167、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171、SEQIDNO:173、SEQIDNO:175、SEQIDNO:177、SEQIDNO:179、SEQIDNO:181和SEQIDNO:183，以及與該正義鏈互補(bǔ)且選自于下組的反義鏈SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、SEQIDNO:150、SEQIDNO:152、SEQIDNO:154、SEQIDNO:156、SEQIDNO:158、SEQIDNO:160、SEQIDNO:164、SEQIDNO:166、SEQIDNO:168、SEQIDNO:170、SEQIDNO:172、SEQIDNO:174、SEQIDNO:176、SEQIDNO:178、SEQIDNO:180、SEQIDNO:182和SEQIDNO:184(參見(jiàn)表1和表2)。所述Aha基因優(yōu)選為Ahal基因，更優(yōu)選為人類Mal基因。所述dsRNA與表達(dá)所述Aha基因的細(xì)胞(例如HeLa細(xì)胞禾[l/或MLE12細(xì)胞)接觸，則可以將所述細(xì)胞中所述Aha基因的表達(dá)抑制至少20°/。，或至少25°/。、30°/。、35°/。、40%、45%、50%、55°/。、60%、65%、70%、85%、90%或95%。所述dsRNA可區(qū)別于所述第二dsRNA，但是在每條鏈上可以具有與上述給出核苷酸序列之一相同的至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少18個(gè)或至少20個(gè)連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，所述第二dsRNA選自下組AL-DP-7301、AL-DP-7308、AL-DP-7318、AL-DP畫(huà)7320、AL-DP-7322、AL-DP-7324、AL-DP-7325、、AL-DP-7329、、AL-DP國(guó)7303、和AL-DP-7337-、AL-DP扁7306、、AL-DP隱7335、、AL-DP隱7328、、AL-DP-9251、、AL-DP-9256、、AL-DP國(guó)9261、、AL國(guó)DP國(guó)9266、、AL-DP-9271、、AL隱DP-9276、、AL-DP-9282、AL陽(yáng)DP-9285、AL畫(huà)DP-9286、AL匿DP-9287、AL-DP-9288和AL畫(huà)DP隱9289(參見(jiàn)表1和表2)?；蛘?，所述dsRNA本身可選自下組AL-DP-7318、AL-DP-7320、AL-DP-7322、AL-DP-7326、AL-DP-7327、AL隱DP隱7329、AL-DP-7340、AL-DP-7342、AL-DP-7303、AL畫(huà)DP畫(huà)7309、AL-DP-7316和AL-DP-7337、AL國(guó)DP-7304、AL-DP-7312、AL-DP-7339、AL-DP-7344、AL-DP-7306、AL畫(huà)DP畫(huà)7317、AL-DP-7346、AL-DP-7310、AL-DP-7323、AL-DP-7335、AL國(guó)DP國(guó)7338、AL-DP-7341、AL-DP-7326AL-DP-7340AL-DP-7309AL-DP-7339AL-DP-7310AL-DP-7302AL-DP-7345AL-DP-9254AL-DP-9259AL-DP-9264AL-DP-9269AL-DP-9274AL-DP-9280AL-DP-7327AL-DP-7342AL-DP-7316AL-DP-7344AL-DP-7323AL匿DP畫(huà)7315AL畫(huà)DP畫(huà)9250AL-DP-9255AL-DP-9260AL-DP-9265AL畫(huà)DP國(guó)9270AL-DP-9275AL-DP-9281AL-DP畫(huà)7331、AL-DP-7305、AL-DP-7304、AL-DP-7317、AL-DP-7338、AL-DP-7330、AL-DP-9252、AL-DP-9257、AL-DP-9262、AL-DP-9267、AL-DP-9272、AL畫(huà)DP國(guó)9277、AL-DP-9283、AL-DP-7333、AL-DP-7307、AL-DP-7312、AL-DP-7346、AL-DP-7341、AL-DP-7336、AL-DP-9253、AL-DP-9258、AL-DP-9263、AL-DP-9268、AL-DP-9273、AL隱DP畫(huà)9279、AL-DP-9284、AL-DP-7301AL-DP-7324-AL-DP-7331-AL-DP-7305-AL-DP-7308、AL-DP-7325、AL-DP-7333、AL-DP-7307、18AL-DP畫(huà)7315AL-DP-9250AL-DP-9255AL-DP-9260AL-DP-9265AL-DP-9270AL-DP-9275AL-DP-9281AL-DP-7328AL-DP-9251AL-DP-9256AL-DP-9261AL畫(huà)DP畫(huà)9266AL畫(huà)DP國(guó)9271AL-DP-9276AL-DP-9282AL-DP-7330AL-DP-9252AL-DP-9257AL畫(huà)DP畫(huà)9262AL-DP-9267AL-DP-9272AL-DP-9277AL曙DP-9283AL-DP-7336、AL-DP-9253、AL-DP-9258、AL-DP-9263、AL-DP-9268、AL-DP-9273、AL-DP-9279、AL誦DP國(guó)9284、AL-DP-7302、AL-DP-7345、AL-DP-9254、AL-DP-9259、AL-DP-9264、AL-DP-9269、AL-DP-9274、AL-DP-9280、AL畫(huà)DP畫(huà)9285、AL-DP-9286、AL-DP-9287、AL-DP-9288和AL誦DP畫(huà)9289(參見(jiàn)表1和表2)。所述dsRNA可包含至少一個(gè)修飾核苷酸。所述修飾核苷酸選自下組2'-0-甲基修飾核苷酸、包含5，-硫代磷酸酯基團(tuán)的核苷酸以及與膽固醇衍生物或十二酸雙癸酰胺基團(tuán)連接的末端核苷酸。所述修飾核苷酸也可選自下組2'-脫氧-2'-氟代修飾核苷酸、2'-脫氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸(lockednucleotide)、無(wú)堿基核苷酸(abasicnucleotide)、2，-氨基-修飾核苷酸、2，-烷基-修飾核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然堿基的核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明dsRNAs之一的分離細(xì)胞。所述細(xì)胞通常為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人類細(xì)胞。上述本發(fā)明的其它方面提供了包含本發(fā)明dsRNA的細(xì)胞的其它實(shí)施方案。另一方面，本發(fā)明提供了抑制生物體內(nèi)Aha基因表達(dá)的藥物組合物，其包含dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述dsRNA包含至少兩個(gè)彼此互補(bǔ)的序列，并且其中正義鏈包含第一序列，且反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含與編碼Aha基因的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，且其中所述dsRNA影響第二dsRNA耙序列內(nèi)編碼Aha基因的mRNA的剪切，所述第二dsRNA具有選自下組的正義鏈SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、SEQIDNO:149、SEQIDNO:151、SEQIDNO:153、SEQIDNO:155、SEQIDNO:157、SEQIDNO:159、SEQIDNO:163、SEQIDNO:165、SEQIDNO:167、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171、SEQIDNO:173、SEQIDNO:175、SEQIDNO:177、SEQIDNO:179、SEQIDNO:181和SEQIDNO:183，以及與該正義鏈互補(bǔ)且選自下組的反義鏈SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、20SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、SEQIDNO:150、SEQIDNO:152、SEQIDNO:154、SEQIDNO:156、SEQIDNO:158、SEQIDNO:160、SEQIDNO:164、SEQIDNO:166、SEQIDNO:168、SEQIDNO:170、SEQIDNO:172、SEQIDNO:174、SEQIDNO:176、SEQIDNO:178、SEQIDNO:180、SEQIDNO:182和SEQIDNO:184(參見(jiàn)表1和表2)。其中，Aha基因可以為Ahal基因，且優(yōu)選為人類Ahal基因。包含在所述藥物組合物中的所述dsRNA與表達(dá)所述Aha基因的細(xì)胞(例如HeLa細(xì)胞和/或MLE12細(xì)胞)接觸，則可以將所述細(xì)胞中所述Aha基因的表達(dá)抑制至少20y。，或至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、85%、90°/。或95%。所述dsRNA可區(qū)別于所述第二dsRNA，但是在每條鏈上可以具有與以上給出的核苷酸序列之一相同的至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少18個(gè)或至少20個(gè)連續(xù)核苷酸。所述第二dsRNA優(yōu)選地選自于下組AL-DP-7318AL-DP-7326AL-DP-7340AL-DP-7309、AL國(guó)DP隱7339AL-DP-7310AL-DP-7302AL-DP-7345AL-DP-9254AL-DP-9259AL-DP-9264AL-DP-9269AL-DP-9274AL-DP-9280AL畫(huà)DP匪9285'AL國(guó)DP-7320、AL-DP-7322、AL-DP-7327、AL-DP-7329、AL-DP-7342、AL-DP-7303、AL-DP-7316禾卩AL-DP-7337AL-DP-7344、ADP國(guó)7306、AL-DP-7335、AL國(guó)DP誦7328、AL畫(huà)DP國(guó)9251、AL陽(yáng)DP國(guó)9256、AL-DP-9261、AL-DP-9266、AL-DP-9271、AL國(guó)DP畫(huà)9276、AL-DP-9282、AL-DP-7323AL-DP-7315AL-DP-9250AL-DP-9255AL-DP-9260AL-DP-9265AL-DP-9270AL-DP-9275AL-DP-9281AL-DP-9286、AL-DP-7301、AL-DP-7324、AL-DP-7331、AL-DP-7305、AL誦DP國(guó)7304AL-DP-7317、AL-DP-7338、AL-DP-7330、AL-DP-9252、AL-DP-9257、AL畫(huà)DP畫(huà)9262、AL-DP-9267、AL-DP-9272、AL-DP-9277、AL-DP-9283、AL-DP-7308、AL-DP-7325、AL畫(huà)DP國(guó)7333、AL-DP-7307、AL-DP-7312、AL畫(huà)DP誦7346、AL-DP-7341、AL-DP-7336、AL-DP-9253、AL-DP-9258、AL-DP-9263、AL-DP-9268、AL-DP-9273、AL-DP-9279、AL-DP-9284、AL畫(huà)DP國(guó)9287、AL-DP-9288和AL-DP-9289(見(jiàn)表1和表2)?；蛘?，包含在所述藥物組合物中的所述dsRNA本身可選自于下組AL-DP.AL-DP-AL-DP-AL-DP-AL-DP-AL-DP-AL-DP-AL-DP-AL-DP-AL-DP-AL-DP-AL國(guó)DP-AL-DP-AL-DP-AL-DP-AL-DP-7301、AL-DP-7308、AL-DP-7318.7324、AL-DP-7325、AL-DP-73267331、AL-DP曙7333、AL-DP-73407305、AL畫(huà)DP-7307、AL-DP-7309、7304、AL-DP-7312、AL-DP-73397317、AL-DP-7346、AL-DP-7310.7338、AL-DP-7341、AL-DP-7302■7330、AL誦DP畫(huà)7336、AL-DP-7345■9252、AL-DP-9253、AL-DP-92549257、AL誦DP畫(huà)9258、AL-DP-92599262、AL-DP-9263、AL-DP-92649267、AL-DP-9268、AL-DP-92699272、AL畫(huà)DP國(guó)9273、AL-DP-9274.9277、AL-DP-9279、AL-DP-92809283、AL-DP-9284、AL-DP-9285,AL-DP-7320、AL-DP-7322、,AL-DP-7327、AL-DP-7329、,AL畫(huà)DP畫(huà)7342、AL-DP-7303、AL-DP-7316和AL-DP-7337、.AL-DP畫(huà)7344、AL-DP-7306、AL-DP-7323AL-DP畫(huà)7315AL-DP-9250AL-DP-9255AL-DP-9260AL-DP-9265AL-DP-9270AL-DP-9275AL-DP-9281AL-DP-92869288和AL-DP-9289(參見(jiàn)表1和表2)。AL-DP-7335、AL-DP-7328、AL-DP-9251、AL-DP-9256、AL-DP-9261、AL-DP-9266、AL-DP-9271、AL-DP-9276、AL-DP-9282、AL-DP-9287、包含在所述藥物組合物中的所述dsRNA可包含至少一個(gè)修飾核苷酸。優(yōu)選地，所述修飾核苷酸選自下組2'-0-甲基修飾核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團(tuán)的核苷酸以及與膽固醇衍生物或十二酸雙癸酰胺基團(tuán)連接的末端核苷酸。所述修飾核苷酸也可選自下組2，-脫氧-2'-氟代修飾核苷酸、2'-脫氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸、無(wú)堿基核苷酸、2'-氨基-修飾核苷酸、2'-烷基-修飾核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯和含非天然堿基的核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞內(nèi)Aha基因表達(dá)的方法，所述方法包括(a)向所述細(xì)胞引入雙鏈核苷酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少兩條彼此互補(bǔ)的序列，并且其中正義鏈包含第一序列，并且反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含與編碼Ahal的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，且其中所述dsRNA影響第二dsRNA耙序列內(nèi)編碼Aha基因的mRNA的剪切，所述第二dsRNA具有選自下組的正義鏈SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、SEQIDNO:149、SEQIDNO:151、SEQIDNO:153、SEQIDNO:155、SEQIDNO:157、SEQIDNO:159、SEQIDNO:163、SEQIDNO:165、SEQIDNO:167、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171、SEQIDNO:173、SEQIDNO:175、SEQIDNO:177、SEQIDNO:179、SEQIDNO:181和SEQIDNO:183，以及與該正義鏈互補(bǔ)且選自于下組的反義鏈SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、SEQIDNO:150、SEQIDNO:152、SEQIDNO:154、SEQIDNO:156、SEQIDNO:158、SEQIDNO:160、SEQIDNO:164、SEQIDNO:166、SEQIDNO:168、SEQIDNO:170、SEQIDNO:172、SEQIDNO:174、SEQIDNO:176、SEQIDNO:178、SEQIDNO:180、SEQIDNO:182和SEQIDNO:184;和(b)將步驟(a)得到的細(xì)胞維持足夠長(zhǎng)的時(shí)間以降解Aha基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本，從而抑制所述細(xì)胞中Aha基因的表達(dá)。Aha基因優(yōu)選為Ahal基因，更優(yōu)選為人類Ahal基因。所述dsRNA可區(qū)別于所述第二dsRNA，但是在每條鏈上可以具有與以上給出的核苷酸序列之一相同的至少至少15個(gè)、至少18個(gè)或至少20個(gè)連續(xù)核苷酸。至少10所述第AL-DP-7318AL-DP-7326AL-DP-7340AL-DP-7309AL-DP-7339AL-DP-7310AL-DP-7302AL-DP-7345AL-DP-9254AL-DP-9259AL-DP-9264AL-DP-9269AL-DP-9274AL-DP-9280AL-DP-9285二dsRNA優(yōu)選選自于下組、AL-DP-7320、AL-DP-7322、、AL-DP-7327、AL-DP-7329、、AL-DP-7342、AL-DP-7303、、AL誦DP畫(huà)7316和AL-DP-7337、AL-DP-7344、AL-DP-7306、AL-DP-7323AL-DP-7315AL-DP-9250AL-DP-9255AL-DP-9260AL-DP-9265AL-DP-9270AL-DP-9275AL-DP-9281AL-DP-9286、AL-DP-7335AL-DP-7328AL-DP-9251AL-DP-9256AL-DP-9261AL-DP-9266AL-DP-9271AL-DP-9276AL-DP-9282AL-DP-7301、AL-DP-7324、AL-DP-7331、AL-DP-7305、AL-DP畫(huà)7304、AL-DP-7317、AL-DP-7338、AL-DP-7330、AL-DP-9252、AL-DP-9257、AL-DP-9262、AL-DP-9267、AL-DP-9272、AL-DP-9277、AL-DP-9283、AL-DP-7308、AL-DP-7325、AL-DP-7333、AL-DP-7307、AL-DP畫(huà)7312、AL-DP-7346、AL-DP-7341、AL-DP-7336、AL-DP-9253、AL-DP-9258、AL-DP-9263、AL-DP-9268、AL-DP-9273、AL-DP-9279、AL-DP-9284、AL-DP-9287、AL-DP-9288和AL-DP-9289(參24見(jiàn)表1和表2)。所述dsRNA本身也可選自于下組AL-DP-7318、AL-DP-7320、AL-DP-7322、AL-DP-7327、AL-DP-7329、AL-DP-7342、AL扁DP國(guó)7303、AL-DP-7316禾QAL-DP-7337AL-DP-7344、AL-DP-7306、AL-DP-7326AL-DP-7340AL-DP-7309AL-DP-7339AL-DP-7310AL-DP-7302AL-DP-7345AL-DP-9254AL-DP-9259AL-DP-9264AL-DP-9269AL-DP-9274AL-DP-9280AL-DP-9285AL-DP-7323AL-DP-7315AL-DP-9250AL-DP-9255AL-DP-9260AL-DP-9265AL-DP-9270AL-DP-9275AL-DP-9281AL-DP國(guó)9286、AL-DP-7335AL-DP-7328AL-DP-9251AL-DP-9256AL-DP-9261AL-DP-9266AL-DP-9271AL-DP-9276AL畫(huà)DP畫(huà)7301、AL-DP-7324、AL-DP-7331、AL-DP-7305、AL-DP-7304、AL-DP誦7317、AL-DP-7338、AL-DP-7330、AL-DP-9252、AL-DP-9257、AL-DP-9262、AL-DP-9267、AL-DP-9272、AL-DP-9277、AL-DP-9283、AL-DP-7308、AL-DP-7325、AL-DP-7333、AL畫(huà)DP隱7307、AL國(guó)DP-7312、AL畫(huà)DP-7346、AL-DP-7341、AL國(guó)DP誦7336、AL-DP-9253、AL-DP-9258、AL-DP-9263、AL-DP-9268、AL-DP-9273、AL-DP-9279、AL-DP-9284、AL-DP-9282AL-DP-9287、AL-DP-9288和AL-DP-9289。所述方法優(yōu)選在體外進(jìn)行。上述本發(fā)明的其它方面提供了抑制細(xì)胞內(nèi)Aha基因表達(dá)的方法的其它實(shí)施方案。另一方面，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防或控制由Aha表達(dá)介導(dǎo)的病理過(guò)程的方法，所述方法包括向需要此類治療、預(yù)防或控制的患者施用治療有效量或預(yù)防有效量的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少兩個(gè)彼此互補(bǔ)的序列，并且其中正義鏈包含第一序列，反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含與編碼Ahal的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，且其中所述dsRNA影響第二dsRNA靶序列內(nèi)編碼Aha基因的mRNA的剪切，所述第二dsRNA具有選自下組的正義鏈SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、25SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、SEQIDNO:149、SEQIDNO:151、SEQIDNO:153、SEQIDNO:155、SEQIDNO:157、SEQIDNO:159、SEQIDNO:163、SEQIDNO:165、SEQIDNO:167、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171、SEQIDNO:173、SEQIDNO:175、SEQIDNO:177、SEQIDNO:179、SEQIDNO:181、和SEQIDNO:183，以及與該正義鏈互補(bǔ)且選自于下組的反義鏈SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、SEQIDNO:150、SEQIDNO:152、SEQIDNO:154、SEQIDNO:156、SEQIDNO:158、SEQIDNO:160、SEQIDNO:164、SEQIDNO:166、SEQIDNO:168、SEQIDNO:170、SEQIDNO:172、SEQIDNO:174、SEQIDNO:176、SEQIDNO:178、SEQIDNO:180、SEQIDNO:182、和SEQIDNO:184。所述dsRNA可區(qū)別于所述第二dsRNA，但是在每條鏈上可以具有與以上給出的核苷酸序列之一相同的至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少18個(gè)或至少20個(gè)連續(xù)核苷酸。所述第二dsRNA優(yōu)選選自下組AL-DP-7318、AL隱DP畫(huà)7320、AL-DP-7322AL-DPAL-DPAL隱DP陽(yáng)AL畫(huà)DP-AL-DP-AL-DPAL-DPAL-DPAL-DPAL-DPAL-DPAL-DPAL-DPAL-DP732673407309、73397310730273459254925992649269927492809285、AL-DP-7327、AL-DP-7329、AL-DP-7342、AL-DP-7303、AL-DP-7316和AL-DP-7337AL-DP-7344、AL-DP-7306、AL-DP-7335、AL-DP-7328、AL-DP-9251、AL-DP-9256、AL-DP-9261、AL-DP-9266、AL-DP-9271、AL-DP-9276、AL國(guó)DP誦9282、AL-DP-7301AL-DP-7324AL-DP-7331AL-DP-7305AL-DP-7308、AL-DP-7325、AL-DP-7333、AL-DP-7307、AL-DP-7304、AL-DP-7312、AL-DP-7317、AL-DP-7346、AL-DP-7323AL-DP-7315AL-DP-9250AL-DP-9255AL-DP-9260AL-DP-9265AL-DP-9270AL-DP-9275AL-DP-9281AL-DP-9286、AL-DP-7338AL-DP-7330AL-DP-9252AL-DP-9257AL-DP-9262AL-DP-9267AL-DP-9272AL-DP-9277AL-DP-9283見(jiàn)表1和表2)。所述dsRNA本身也AL-DP-7318、AL-DP-7320AL-DP-7326、AL-DP-7327AL-DP-7340、AL-DP-7342AL-DP-9287、AL-DP-9288和可選自下組AL-DP-7301-、AL-DP-7322、AL-DP-7324、AL-DP-7329、AL-DP-7331、AL-DP-7303、AL-DP-7305、AL-DP-7341、、AL畫(huà)DP畫(huà)7336、、AL-DP-9253、、AL-DP-9258、、AL-DP-9263、、AL-DP-9268、、AL-DP-9273、、AL畫(huà)DP-9279、、AL-DP-9284、AL-DP-9289(參>AL-DP-7308、、AL-DP-7325、、AL-DP-7333、、AL-DP-7307、AL-DP-7309、AL-DP-7316和AL-DP-7337、AL畫(huà)DP國(guó)7304、AL-DP-7312、AL-DP-7339AL-DP-7310AL-DP-7302AL-DP-7345AL-DP-9254AL-DP-9259AL-DP-9264AL-DP-9269AL-DP-9274AL-DP-9280AL-DP-9285AL-DP-7344AL-DP-7323AL-DP-7315AL-DP-9250AL-DP-9255AL-DP-9260AL-DP-9265AL-DP-9270AL-DP-9275AL-DP-9281AL-DP-7306AL-DP-7335AL-DP-7328AL-DP-9251AL-DP-9256AL-DP-9261AL-DP-9266AL-DP-9271AL-DP-9276AL-DP-7317AL-DP-7338AL-DP-7330AL-DP-9252AL-DP-9257AL-DP-9262AL-DP-9267AL-DP-9272AL-DP-9277AL-DP-9283AL-DP-7346、AL-DP-7341、AL-DP-7336、AL-DP-9253、AL-DP-9258、AL-DP-9263、AL-DP-9268、AL-DP-9273、AL-DP-9279、AL-DP-9284、AL-DP-9282AL-DP-9286、AL-DP-9287、AL畫(huà)DP畫(huà)9288禾QAL-DP-9289。上述本發(fā)明的其它方面提供了包括施用本發(fā)明dsRNA的所述方法的其它實(shí)施方案。另一方面，本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞內(nèi)Aha基因表達(dá)的載體，其中所述載體包含可操作性連接于編碼dsRNA中至少一條鏈的核苷酸序列的調(diào)控序列，其中所述dsRNA的一條鏈與編碼Ahal的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)，并且其中所述dsRNA的長(zhǎng)度小于30個(gè)堿基對(duì)，且其中所述dsRNA影響第二dsRNA耙序列內(nèi)編碼Aha基因的mRNA的剪切，所述第二dsRNA具有選自下組的正義鏈SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:28117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、SEQIDNO:149、SEQIDNO:151、SEQIDNO:153、SEQIDNO:155、SEQIDNO:157、SEQIDNO:159、SEQIDNO:163、SEQIDNO:165、SEQIDNO:167、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171、SEQIDNO:173、SEQIDNO:175、SEQIDNO:177、SEQIDNO:179、SEQIDNO:181和SEQIDNO:183，以及與該正義鏈互補(bǔ)且選自于下組的反義鏈SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、SEQIDNO:150、SEQIDNO:152、SEQIDNO:154、SEQIDNO:156、SEQIDNO:158、SEQIDNO:160、SEQIDNO:164、SEQIDNO:166、SEQIDNO:168、SEQIDNO:170、SEQIDNO:172、SEQIDNO:174、SEQIDNO:176、SEQIDNO:178、SEQIDNO:180、SEQIDNO:182和SEQIDNO:184。所述dsRNA可不同于所述第二dsRNA，但是在每條鏈上可以具有與以上給出的核苷酸序列之一相同的至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少18個(gè)或至少20個(gè)連續(xù)核苷酸。所述第二dsRNA優(yōu)選選自下組AL-DP-7318、AL-DP-7320、AL-DP-7322、AL-DP-7327、AL-DP-7329、AL-DP-7342、AL-DP-7303、AL-DP-7316和AL-DP-7337-AL-DP-7344、AL-DP-7306、AL-DP-7326、AL-DP-7340、AL-DP-7309、AL-DP-7339、AL-DP-7310、AL-DP-7302、AL-DP-7345、AL-DP-9254、AL-DP-9259、AL-DP-9264、AL-DP-9269、AL-DP-9274、AL畫(huà)DP畫(huà)9280、AL畫(huà)DP畫(huà)9285、AL-DP-7323AL-DP-7315AL-DP-9250AL-DP-9255AL-DP-9260AL-DP-9265AL-DP-9270AL-DP-9275AL-DP-9281AL-DP-9286、AL-DP-7335AL-DP-7328AL-DP-9251AL-DP-9256AL-DP-9261AL-DP-9266AL-DP-9271AL-DP-9276AL-DP-9282AL-DP-7301、AL-DP-7324、AL-DP-7331、AL畫(huà)DP畫(huà)7305、AL國(guó)DP國(guó)7304、AL國(guó)DP國(guó)7317、AL-DP-7338、AL-DP-7330、AL-DP-9252、AL-DP-9257、AL-DP-9262、AL-DP-9267、AL-DP-9272、AL-DP-9277、AL-DP-9283、AL-DP-7308、AL-DP-7325、AL-DP-7333、AL-DP-7307、AL-DP-7312、AL-DP-7346、AL-DP-7341、AL-DP-7336、AL-DP-9253、AL-DP-9258、AL-DP-9263、AL-DP-9268、AL-DP-9273、AL誦DP國(guó)9279、AL-DP-9284、AL-DP-9287、AL-DP-9288和AL-DP-9289(參見(jiàn)表1和表2)。上述本發(fā)明的其它方面提供了本發(fā)明所述載體的其它實(shí)施方另一方面，本發(fā)明提供了包含上述載體的分離細(xì)胞。上述本發(fā)明的其它方面提供了包含本發(fā)明載體的所述細(xì)胞的其它實(shí)施方案。表1:下調(diào)人類(NM_012111.1)、小鼠(NM_146036.1)和黑猩猩(XM—510094.1)Ahal，并且在大鼠細(xì)胞中具有最小脫靶相互作用的RNAi試劑；AL-DP-7561、AL-DP-7562、AL-DP-7563和AL-DP-7564還與小鼠(NM_172391.3)和褐家鼠(XM—223680.3)Aha2發(fā)生交叉反應(yīng)。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>AL畫(huà)DP畫(huà)7331gagccuugccaaagaugagTT65cucaucuuuggcaaggcucTT66AL-DP-7332ugacacaaaucucguggccTT67ggccacgagauuugugucaTT68AL-DP-7333ggagcucuauagaguguuuTT69aaacacucuauagagcuccTT70AL-DP-7334cccacgcuggaucguggagTT71cuccacgauccagcgugggTT72AL-DP-7335gauccccaauuugucugauTT73aucagacaaauuggggaucTT74AL-DP-7336gagauccccaauuugucugTT75cagacaaauuggggaucucTT76AL-DP-7337agccugacacaaaucucguTT77acgagauuugugucaggcuTT78AL-DP-7338agauccccaauuugucugaTT79ucagacaaauuggggaucuTT80AL-DP-7339agggagacccacgcuggauTT81auccagcgugggucucccuTT82AL國(guó)DP畫(huà)7340gagggagacccacgcuggaTT83uccagcgugggucucccucTT84AL-DP-7341gccaaguggggugagggagTT85cucccucaccccacuuggcTT86AL-DP-7342uggcagcgguacuacuuugTT87caaaguaguaccgcugccaTT88AL-DP-7343ugagggagacccacgcuggTT89ccagcgugggucucccucaTT卯AL-DP-7344aguggaga麗gugugagcTT91gcucacacuaaucuccacuTT92AL匿DP畫(huà)7345aggagcucuauagaguguuTT93aacacucuauagagcuccuTT94AL-DP-7346agcgguacuacuuugagggTT95cccuc犯agu3guaccgcuTT96AL-DP-7561cgcuggaucguggaggagcTT97gcuccuccacgauccagcgTT98AL-DP-7562gcuggaucguggaggagcgTT99cgcuccuccacgsuccagcTT100AL畫(huà)DP-7563cuggaucguggaggagcggTT101ccgcuccuccacgauccagTT102AL-DP-7564uggaucguggaggagcgggTT103cccgcuccuccacgauccaTT1041大寫(xiě)字母=脫氧核糖核苷酸；小寫(xiě)字母=核糖核苷酸表2:下調(diào)人類(NM—012111.1)、小鼠(NM—146036.1)和黑猩猩(XM一510094.1)Ahal，并且在人類細(xì)胞中具有最小脫靶相互作用的RNAi試劑序序雙鏈名稱正義鏈序列1列反義鏈序列1列號(hào)號(hào)AL-DP-9250gccugacacaaaucucgugTT105cacgagauuugugucaggcTT106AL-DP-9251ccugacacaaaucucguggTT107ccacgagauuugugucaggTT10832AL-DP-9252acgcc3cc3acguca3caaTT109uuguugacguugguggcguTT110AL-DP-9253agcucuauagaguguuuacTT111guaaacacucuauagagcuTT112AL-DP-9254gggcuggcagcgguac腦TT113guagimccgcugccagcccTT114AL-DP-9255cuggcagcgguacuacuuuTT115aaaguaguaccgcugccagTT116AL-DP-9256ggaugaaguggagauuaguTT117acuaaucuccacuucauccTT118AL-DP-9257accagaggagcucuauagaTT119ucuauagagcuccucugguTT120AL-DP-9258aaguggagauuagugugagTT121cuc3cacu3aucuccacuuTT122AL-DP-9259gaggagcucuauagaguguTT123acacucuauagagcuccucTT124AL-DP-9260gggagacccacgcuggaucTT125gauccagcgugggucucccTT126AL-DP-9261ugagccugacacaaaucucTT127gagauuugugucaggcucaTT128AL-DP-9262gcggacgccaccaacgucaTT129ugacguugguggcguccgcTT130AL-DP-9263cggacgccaccaacgucaaTT131uugacguugguggcguccgTT132AL-DP-9264gaaguggaga腿gugugaTT133ucacacuaaucuccacuucTT134AL-DP曙9265cucguggccuuaaugaaggTT135ccuucauuaaggccacgagTT136AL-DP-9266ucguggccuuaaugaaggaTT137uccuucauuaaggccacgaTT138AL-DP-9267aaugggaauuuacaucagcTT139gcugauguaaauucccauuTT140AL-DP-9268ggaauuuacaucagcacccTT141gggugcugauguaaauuccTT142AL-DP-9269ggagauuagugugagccuuTT143aaggcucacacuaaucuccTT144AL-DP-9270cacaaaucucguggccuuaTT145uaaggccacgagauuugugTT146AL-DP-9271acaaaucucguggccuuaaTT147uuaaggccacgagauuuguTT148AL-DP-9272ggagacccacgcuggaucgTT149cgauccagcgugggucuccTT150AL-DP-9273gg3cgcc3ccaacguca3cTT151guugacguugguggcguccTT152AL-DP-9274gaugaaguggagauuagugTT153c3c1maucuccacuucaucTT154AL-DP-9275gugagccuugccaaagaugTT155caucuuuggcaaggcucacTT156AL-DP-9276caaugaauggagagucaguTT157acugacucuccauucauugTT158AL-DP-9277auuagugugagccuugccaTT159uggcaaggcucacacuaauTT160AL-DP-9278agaugagccugacacaaauTT161auuugugucaggcucaucuTT162AL-DP-9279uagugugagccuugccaaaTT163uuuggcaaggcucacacuaTT164AL-DP-9280uuugccaccaucaccuugaTT165ucaaggugaugguggcaaaTT166AL-DP-9281acggagagagaugcuucaaTT167uugaagcaucucucuccguTT16833<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>大寫(xiě)字母=脫氧核糖核苷酸；小寫(xiě)字母=核糖核苷酸無(wú)附圖。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)以及以及使用所述dsRNA抑制細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中Aha基因表達(dá)的組合物和方法。本發(fā)明還提供了利用dsRNA治療哺乳動(dòng)物中由Aha基因表達(dá)引起的病理狀態(tài)和疾病的組合物和方法。dsRNA通過(guò)被稱為RNA干擾(RNAi)的過(guò)程指導(dǎo)mRNA的序列特異性降解。本發(fā)明的dsRNA包含具有長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸且通常長(zhǎng)度為19-24個(gè)核苷酸的區(qū)域的RNA鏈(反義鏈)，其中所述區(qū)域與Aha基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的至少一部分基本互補(bǔ)。使用這些dsRNA能夠耙向降解參與哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞增殖和/或保持和/或囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)降解的基因的mRNA。使用基于細(xì)胞的試驗(yàn)和以及動(dòng)物試驗(yàn)，本發(fā)明人已證明極低劑量的這些dsRNA可特異性地且高效地介導(dǎo)RNAi，造成對(duì)Aha基因表達(dá)的顯著抑制。因此，本發(fā)明中包含這些dsRNA的方法和組合物可通過(guò)靶向參于蛋白質(zhì)降解的基因而用于治療由Aha表達(dá)介導(dǎo)的病理過(guò)程，例如，癌癥和/或囊性纖維化。下文的詳細(xì)說(shuō)明公開(kāi)了如何制備并使用所述dsRNA和包含dsRNA的組合物以抑制Aha基因的表達(dá)，以及治療由Aha基因表達(dá)引起的疾病和病癥(例如癌癥和/或囊性纖維化)的組合物和方法。本發(fā)明的藥物組合物包含dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述dsRNA具有長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸且通常長(zhǎng)度為19-24個(gè)核苷酸的互補(bǔ)區(qū)域的反義鏈，其中所述互補(bǔ)區(qū)域與Aha基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的至少一部分互補(bǔ)。因此，本發(fā)明的某些方面提供了包含本發(fā)明的dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，使用所述組合物抑制Aha基因表達(dá)的方法以及使用所述藥物組合物治療由Aha表達(dá)引起的疾病的方法。定義為了方便起見(jiàn)，下文提供了本說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例和權(quán)利要求書(shū)中使用的特定術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)的含義。如果某術(shù)語(yǔ)在本說(shuō)明書(shū)其它部分中的用法與本節(jié)中提供的其定義之間有明顯差異，應(yīng)以本節(jié)中的定義為準(zhǔn)。"G"、"C"、"A""T"和"U"(不論寫(xiě)為大寫(xiě)字母還是小寫(xiě)字母)通常分別代表包含鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作為堿基的核苷酸。然而，應(yīng)理解的是術(shù)語(yǔ)"核糖核苷酸"或"核苷酸"也可指如下文詳述的修飾核苷酸，或代用替換部分(surrogatereplacementmoiety)。技術(shù)人員熟知可將鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶替換成其它部分而基本不改變包含帶有此類替換部分的核苷酸的寡核苷酸堿基配對(duì)性質(zhì)。例如但不限于包含次黃嘌呤作為其堿基的核苷酸可與包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸進(jìn)行堿基配對(duì)。因此，本發(fā)明的核苷酸序列中包含尿嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可被替換成包含如次黃嘌呤的核苷酸。包含此類替換部分的序列是本發(fā)明的實(shí)施方案。本文所使用的"Aha基因"是指熱休克蛋白90ATP酶激活因子基因。"Ahal"指熱休克蛋白90ATP酶激活因子1基因，可在Genbank登錄號(hào)麗-012111.1(人類)、雨—146036.1(小鼠)和XM—510094.1(黑猩猩)中找到其非窮舉性實(shí)例。"Aha2"是指推定的熱休克蛋白90ATP酶激活因子2基因(也稱為Ahsa2)，可在Genbank登錄號(hào)NM—172391.3(小鼠)和XM—223680.3(褐家鼠)中找到其非窮舉性實(shí)例。本文所使用的"靶序列"是指Aha基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中形成的mRNA分子的連續(xù)核苷酸序列片段，包括作為初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA加工產(chǎn)物的mRNA。任意給定的本發(fā)明RNAi試劑的靶序列是指X個(gè)核苷酸的mRNA序列，其中所述RNAi試劑憑借其反義鏈和所述mRNA序列的互補(bǔ)性而耙向此mRNA序列，并且在所述RNAi試劑與所述mRNA接觸時(shí)，其反義鏈可以與所述mRNA雜交，其中X是反義鏈的核苷酸數(shù)量加上正義鏈的單鏈懸端(如果存在)的核苷酸數(shù)量所得的核苷酸數(shù)量。本文所用術(shù)語(yǔ)"包含序列的鏈"是指包含核苷酸鏈的寡核苷酸，該寡核苷酸鏈通過(guò)利用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸命名法表示的序列進(jìn)行闡述。除非另有說(shuō)明，否則在用于描述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的關(guān)系時(shí)，本文所用術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)"是指包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下與包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交并形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的能力，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解這一點(diǎn)。例如，此類條件可以是嚴(yán)格條件，其中所述嚴(yán)格條件可包括400mMNaCl、40mMPIPESpH6.4、lmMEDTA，在50。C或70。C下持續(xù)12-16小時(shí)，隨后進(jìn)行清洗。也可應(yīng)用其它條件，例如可能在生物體內(nèi)遇到的生理相關(guān)條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)雜交核苷酸的最終應(yīng)用決定最適合于兩序列互補(bǔ)試驗(yàn)的系列條件。這包括包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)的堿基配對(duì)。本文中這些序列被稱為彼此"完全互補(bǔ)"。然而，在本文中當(dāng)提到所述第一序列與所述第二序列"基本互補(bǔ)"時(shí)，所述兩個(gè)序列可完全互補(bǔ)或在雜交時(shí)形成一個(gè)或多個(gè)，但通常不超過(guò)4個(gè)、3個(gè)或2個(gè)錯(cuò)配堿基對(duì)，同時(shí)保留與其最終應(yīng)用最相關(guān)的條件下的雜交能力。但是，當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸經(jīng)設(shè)計(jì)以雜交形成一個(gè)或多個(gè)單鏈懸端時(shí)，考慮到互補(bǔ)的定義這種懸端不應(yīng)該被認(rèn)做是錯(cuò)配。例如，在包含一條長(zhǎng)度為21個(gè)核苷酸的寡核苷酸和另一條長(zhǎng)度為23個(gè)核苷酸的寡核苷酸的dsRNA中，較長(zhǎng)寡核苷酸包含與較短寡核苷酸完全互補(bǔ)的21個(gè)核苷酸的序列，在本發(fā)明的目的下，這種情況也屬于"完全互補(bǔ)"。只要其雜交能力能夠滿足上述需求，本文所用"互補(bǔ)"序列也可以包含或完全由非Watson-Crick堿基對(duì)形成和/或由非天然和修飾核苷酸形成的堿基對(duì)形成。本文中對(duì)于dsRNA的正義鏈與反義鏈間堿基配對(duì)，或dsRNA的反義鏈與靶序列間堿基配對(duì)可使用術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)"、"完全互補(bǔ)"和"基本互補(bǔ)"，所述36術(shù)語(yǔ)可根據(jù)其所處上下文進(jìn)行理解。本文所用的與信使RNA(mRNA)的"至少一部分基本互補(bǔ)"的多核苷酸是指于與目標(biāo)mRNA(例如，編碼Ahal的mRNA)的連續(xù)片段基本互補(bǔ)的多核苷酸。例如，如果多核苷酸的序列與編碼Ahal的mRNA中的非中斷片段基本互補(bǔ)，那么所述多核苷酸與AhalmRNA的至少一部分互補(bǔ)。本文所用術(shù)語(yǔ)"雙鏈RNA"或"dsRNA"是指核糖核酸分子的復(fù)合體，所述復(fù)合體具有雙鏈結(jié)構(gòu)并包含兩條反平行且如上所述的基本互補(bǔ)的核酸鏈。形成所述雙鏈結(jié)構(gòu)的兩條鏈可以是同一條較大RNA分子的不同部分，或者是單獨(dú)的RNA分子。如果所述兩條鏈為一個(gè)較大分子的部分并且，通過(guò)形成雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈3'-末端與另一條鏈5'-末端之間的非中斷核苷酸鏈相連接，那么所述相連的RNA鏈被稱為"發(fā)夾環(huán)"。如果所述兩條鏈通過(guò)形成雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈3，-末端及另一條鏈5'-末端之間的非中斷鏈之外的方式共價(jià)連接，那么所述連接結(jié)構(gòu)被稱為"接頭(linker)"。所述RNA鏈可具有相同或不同數(shù)量的核苷酸。堿基對(duì)的最大值是dsRNA中的最短鏈減去雙鏈中存在的任何懸端后的核苷酸數(shù)目。除雙鏈結(jié)構(gòu)之外，dsRNA可包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸懸端。本文所用"核苷酸懸端"是指當(dāng)dsRNA的一條鏈的3'末端超過(guò)另一條鏈的5'末端或反之時(shí)，從dsRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)突出的一個(gè)或多個(gè)未配對(duì)核苷酸。"平端"或"平末端"是指在dsRNA的末端沒(méi)有未配對(duì)的核苷酸，即沒(méi)有核苷酸懸端。"平末端化的"dsRNA是指其任一個(gè)末端均沒(méi)有核苷酸懸^山乂而。術(shù)語(yǔ)"反義鏈"是指dsRNA中的一條鏈，其包含與靶序列基本互補(bǔ)的區(qū)域。本文所用術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)區(qū)"是指反義鏈上與本文所定義的序列(例如靶序列)基本互補(bǔ)的區(qū)域。如果互補(bǔ)區(qū)與靶序列不完全互補(bǔ)，則最能容許錯(cuò)配發(fā)生在末端區(qū)域，并且如果存在錯(cuò)配，則通常位于末端區(qū)域，或者例如5'和/或3'末端的6、5、4、3或2個(gè)核苷酸之內(nèi)。所述錯(cuò)配最優(yōu)選位于反義鏈5'末端和/或正義鏈3，末端的6、5、4、3或2個(gè)核苷酸之內(nèi)。本文所用術(shù)語(yǔ)"正義鏈"是指dsRNA中的一條鏈，其包含與所述反義鏈區(qū)域基本互補(bǔ)的區(qū)域。如本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，所述"引入到細(xì)胞中(或向細(xì)胞引入)"在用37于dsRNA時(shí)，是指便于攝取或吸收進(jìn)入細(xì)胞。dsRNA的吸收或攝取可通過(guò)非輔助性擴(kuò)散或主動(dòng)的細(xì)胞過(guò)程發(fā)生，或者通過(guò)輔助試劑或設(shè)備發(fā)生。此術(shù)語(yǔ)的內(nèi)涵不限定于體外細(xì)胞；也可以將dsRNA"引入到細(xì)胞中(或向細(xì)胞引入)"，而其中所述細(xì)胞是活生物體一部分。在此情況下，引入到細(xì)胞中將包括向生物體的遞送。例如，在體內(nèi)遞送中，可將dsRNA注射到組織位點(diǎn)或進(jìn)行全身施用。向體外細(xì)胞的引入包括本領(lǐng)域己知的方法，例如電穿孔法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(lipofection)。當(dāng)術(shù)語(yǔ)"沉默"和"抑制表達(dá)"是針對(duì)Aha基因(例如Ahal基因)時(shí)，它們?cè)诒疚闹钢辽俨糠忠种艫ha基因(例如Ahal基因)的表達(dá)，通過(guò)與第二細(xì)胞或細(xì)胞群相比可以從第一細(xì)胞或細(xì)胞群中分離的轉(zhuǎn)錄自Aha基因的mRNA數(shù)量的減少來(lái)表示，其中所述第一細(xì)胞或細(xì)胞群中Aha基因被轉(zhuǎn)錄且其已經(jīng)被處理以使Aha基因的表達(dá)被抑制，所述第二細(xì)胞或細(xì)胞群與所述第一細(xì)胞或細(xì)胞群基本相當(dāng)?shù)錄](méi)有作此處理(對(duì)照細(xì)胞)。所述細(xì)胞優(yōu)選HeLa細(xì)胞或MLE12細(xì)胞。抑制度通常用以下方式表示對(duì)照細(xì)胞的mRNA-處理細(xì)胞的mRNA對(duì)照細(xì)胞的mRNAXlQ()%或者，將抑制度表示為與Aha基因轉(zhuǎn)錄在功能上相關(guān)的參數(shù)的減小，例如由細(xì)胞分泌的或者此類細(xì)胞裂解后發(fā)現(xiàn)于溶液中的Aha基因編碼蛋白質(zhì)的量，或顯示特定表型(例如凋亡或細(xì)胞表面CFTR)的細(xì)胞數(shù)量。理論上講，可以組成型地或通過(guò)基因工程方法或任意合適的試驗(yàn)在任意表達(dá)所述靶標(biāo)的細(xì)胞中測(cè)定Aha基因的沉默。然而，當(dāng)需要參考以測(cè)定給定dsRNA是否在特定程度上抑制Aha基因的表達(dá)并因此屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)時(shí)，以下實(shí)施例中提供的試驗(yàn)可作為此類參考。例如，在某些情況下，通過(guò)施用本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸將Aha基因(例如Ahal基因)的表達(dá)抑制至少約20%、25%、35%或50%。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)施用本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸將Aha基因(例如Ahal基因)抑制至少約60%、70%或80%。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)施用本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸將Aha基因(例如Ahal基因)抑制至少約85%、90%或95%。表6提供了在體外試驗(yàn)中使用本發(fā)明的多種dsRNA分子所獲得Aha基因表達(dá)抑制值。38本文在Aha表達(dá)(例如Ahal表達(dá))的上下文中所使用的術(shù)語(yǔ)"治療"("treat"，"treatment")等是指Aha基因表達(dá)介導(dǎo)的病理過(guò)程的緩解或減輕。在本發(fā)明的上下文中只要涉及下文陳述的其它任意病癥(除可通過(guò)Aha表達(dá)介導(dǎo)的病理過(guò)程之外)，術(shù)語(yǔ)"治療"等表示緩解或減輕至少一種與所述病癥相關(guān)的癥狀，或者減緩或逆轉(zhuǎn)所述病癥的進(jìn)程。本文所用短語(yǔ)"治療有效量"和"預(yù)防有效量"是指在Aha表達(dá)介導(dǎo)的病理過(guò)程或在Aha表達(dá)介導(dǎo)的病理過(guò)程的一個(gè)明顯癥狀的治療、預(yù)防或控制中產(chǎn)生治療效益的量。治療有效的特定量可簡(jiǎn)單地由普通醫(yī)務(wù)工作者來(lái)確定，并可根據(jù)本領(lǐng)域已知的因素進(jìn)行改變，例如可通過(guò)Aha表達(dá)介導(dǎo)的病理過(guò)程的類型，患者的病史和年齡，由Aha表達(dá)介導(dǎo)的病理過(guò)程的階段，以及對(duì)由Aha表達(dá)介導(dǎo)的其它病理過(guò)程的抗性試劑的施用。本文所用"藥物組合物"包含藥理學(xué)有效量的dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體。本文所用"藥理學(xué)有效量"、"治療有效量"或"有效量"是指有效產(chǎn)生所需藥理學(xué)、治療性或預(yù)防性結(jié)果的RNA量。例如，如果認(rèn)為使疾病或病癥相關(guān)的可測(cè)量參數(shù)下降至少25%的給定臨床治療為有效治療，那么用于治療所述疾病或病癥的藥物的治療有效量是將所述參數(shù)減少至少25%時(shí)所必需的量。術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的載體"是指施用治療劑所用的載體。此類載體包括但不限于鹽溶液、緩沖鹽溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合物。所述術(shù)語(yǔ)明確地排除了細(xì)胞培養(yǎng)基。對(duì)于口服藥物而言，藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于藥學(xué)上可接受的賦形劑，例如惰性稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑、芳香劑、著色劑和防腐劑。合適的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和磷酸鈣以及乳糖，而玉米淀粉和褐藻酸是合適的崩解劑。粘合劑可以包括淀粉和明膠，而如果存在潤(rùn)滑劑則通常為硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。如果需要，片劑可以用如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的物質(zhì)進(jìn)行包被以延遲在胃腸道中的吸收。本文所用"轉(zhuǎn)化細(xì)胞"是指向其引入載體的細(xì)胞，其中所述載體可表達(dá)dsRNA分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中Aha基因39(例如Ahal基因)表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含具有互補(bǔ)區(qū)的反義鏈，所述互補(bǔ)區(qū)與Aha基因(例如Ahal基因)表達(dá)中形成的mRNA的至少一部分互補(bǔ)，并且所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸且通常為19-24個(gè)核苷酸。所述dsRNA可與表1和表2中dsRNA之一相同，或者影響在表1和表2中dsRNA之一的耙序列內(nèi)編碼Aha基因的mRNA的剪切。所述dsRNA優(yōu)選每條鏈具有與表1和表2中dsRNA之一的至少一條鏈(但優(yōu)選為兩條鏈)相同的至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少18個(gè)或至少20個(gè)連續(xù)核苷酸。利用靶序列和Ahal側(cè)翼序列可以容易地確定其他dsRNA，這些其他dsRNA耙向于表1和表2所示dsRNA之一的耙序列中的其它位置。所述dsRNA包含兩條充分互補(bǔ)以雜交從而形成雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA鏈。所述dsRNA中的一條鏈(反義鏈)包含與衍生自Aha基因表達(dá)過(guò)程中形成的mRNA序列的靶基因基本互補(bǔ)或通常為完全互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，而另一條鏈(正義鏈)包含與所述反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，這樣在合適的條件下混合時(shí)，所述兩條鏈就會(huì)雜交并形成雙鏈結(jié)構(gòu)。通常，所述雙鏈結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度為15-30個(gè)堿基對(duì)，更常見(jiàn)18-25個(gè)、還更常見(jiàn)19-24個(gè)、最常見(jiàn)為19-21個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度。類似地，與靶序列互補(bǔ)的區(qū)域的長(zhǎng)度為15-30個(gè)堿基對(duì)，更常見(jiàn)18-25個(gè)、還更常見(jiàn)19-24個(gè)、最常見(jiàn)為19-21個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度。本發(fā)明的dsRNA還可以包含一個(gè)或多個(gè)單鏈核苷酸懸端。可通過(guò)下文進(jìn)一步討論的本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成所述dsRNA，例如使用自動(dòng)DNA合成儀(例如，可商購(gòu)自Biosearch,AppliedBiosystems,Inc.)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Aha基因是人類Ahal基因。在具體實(shí)施方案中，所述dsRNA的第一鏈包括所述RNAi試劑AL-DP-7301至AL-DP-7346和AL-DP-7561至AL-DP-7564(表1)以及AL-DP-9250至AL-DP-9289(表2)的正義序列，第二序列選自于下組的反義序列AL-DP-7301至AL-DP-7346和AL-DP-7561至AL-DP-7564(表1)以及AL-DP-9250至AL-DP-9289(表2)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述dsRNA包含至少一條選自于由以上RNAi試劑AL-DP-7301至AL-DP-7346和AL-DP-7561至AL-DP-7564(表1)以及AL-DP-9250至AL-DP-9289(表2)所示序列組成的組的核苷酸序列。在其它實(shí)施方案中，所述dsRNA包含至少兩條選自所述組的序列，其中所述至少兩條序列中的一條與所述至少兩條序列中的另一條互補(bǔ)，并且所述至少兩條序列中的一條與在Aha基因(例如Ahal基因)表達(dá)過(guò)程中產(chǎn)生的mRNA序列基本互補(bǔ)。通常，所述dsRNA包含兩條寡核苷酸，其中可將一條寡核苷酸描述為如RNAi試劑AL-DP-7301至AL-DP-7346禾tJAL-DP-7561至AL-DP-7564(表1)以及AL-DP-9250至AL-DP-9289(表2)之一的正義鏈，而可將第二寡核苷酸描述為RNAi試劑AL-DP-7301至AL-DP-7346和AL-DP-7561至AL-DP-7564(表1)以及AL-DP-9250至AL-DP-9289(表2)之一的反義鏈。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地知道，目前廣泛認(rèn)為包含20-23個(gè)，特別是21個(gè)堿基對(duì)的雙鏈結(jié)構(gòu)的dsRNA可特別有效地誘導(dǎo)RNA干擾(Elbashiretal.,EMBO2001,20:6877-6888)。然而，也發(fā)現(xiàn)較短或較長(zhǎng)的dsRNAs也可同樣有效。在一個(gè)上述實(shí)施方案中，借助于為RNAi試劑AL-DP-7301至AL-DP-7346和AL-DP-7561至AL-DP-7564(表1)以及AL-DP-9250至AL-DP-9289(表2)提供的寡核苷酸的特質(zhì)，本發(fā)明的dsRNA可包含至少一條最短長(zhǎng)度為21nt的鏈?？梢院侠淼仄谕?，相對(duì)于本文為RNAi試劑AL-DP-7301至AL-DP-7346和AL-DP-7561至AL-DP-7564(表1)以及AL-DP-9250至AL-DP-9289(表2)提供的序列之一，僅在其一個(gè)端或兩個(gè)末端缺失若干個(gè)核苷酸的較短dsRNA可具有與上述dsRNA相類似的功效。因此，本發(fā)明也關(guān)注以下所描述的dsRNA:其包含來(lái)自RNAi試劑AL-DP-7301至AL-DP-7346和AL-DP-7561至AL-DP-7564(表1)以及AL-DP-9250至AL-DP-9289(表2)序列之一的部分序列(至少15、16、17、18、19、20或更多個(gè)連續(xù)核苷酸)，且在下文中所述的FACS試驗(yàn)中，其抑制Aha基因(Ahal基因)表達(dá)能力的區(qū)別在于其抑制能力不超過(guò)包含全長(zhǎng)序列dsRNA的抑制能力的5、10、15、20、25或30%。利用Ahal基因序列和相應(yīng)的耙序列可以容易地制備在RNAi試劑AL-DP-7301至AL-DP-7346和AL-DP-7561至AL-DP-7564(表1)以及AL-DP-9250至AL-DP-9289(表2)的耙序列內(nèi)進(jìn)行剪切的其它dsRNA。表1和表2提供的RNAi試劑可鑒定AhalmRNA內(nèi)對(duì)基于RNAi的切割敏感的位點(diǎn)。因此，本發(fā)明還包括耙向被本發(fā)明一種試劑靶向的序列之內(nèi)的RNAi試劑。如本文所使用的，如果dsRNA在與第二dsRNA反義鏈互補(bǔ)的mRNA中任意位點(diǎn)進(jìn)行切割，則所述dsRNA可被稱為耙向所述第二dsRNA的序列之內(nèi)的RNAi試劑。此類dsRNA可通常具有來(lái)自表1和表2提供的一條序列的至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少18個(gè)或至少20個(gè)連續(xù)核苷酸，并連接有來(lái)自編碼Aha基因的mRNA中選定序列的相鄰區(qū)域的其它核苷酸序列。例如，使靶序列AL-DP-7301的3'最末端15個(gè)核苷酸之后連接來(lái)自靶基因Ahal的6個(gè)核苷酸，可產(chǎn)生基于表1和表2所提供序列之一的21個(gè)核苷酸的單鏈試劑。優(yōu)選地，所述第二dsRNA選自于在適當(dāng)檢測(cè)中(如本文所闡述的檢測(cè))具有抑制Aha基因表達(dá)的活性的dsRNA組。因此，在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第二dsRNA選自于下組AL-DP-7301、AL-DP-7308、AL-DP-7318、AL-DP-7320、AL-DP-7322、AL-DP-7324、AL-DP-7325、AL-DP-7326、AL-DP-7331、AL-DP-7305、AL-DP-7304-AL-DP-7317、AL-DP-7338、AL-DP-7330、AL-DP-9252、AL-DP-9257、AL-DP-9262、AL-DP-9267、AL-DP-9272、AL-DP-9277、AL-DP-9283、AL-DP曙9288和AL-DP-9289。本發(fā)明的dsRNA可以包含與靶序列的一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的dsRNA包含不超過(guò)3個(gè)錯(cuò)配。如果所述dsRNA的反義鏈包含與靶序列的錯(cuò)配，則優(yōu)選所述錯(cuò)配區(qū)域不位于互補(bǔ)區(qū)的中心。如果所述dsRNA的反義鏈包含與耙序列的錯(cuò)配，則優(yōu)選所述錯(cuò)配區(qū)域被限制為任一末端的5個(gè)核苷酸之內(nèi)，例如互補(bǔ)區(qū)5'-或3'-末端(優(yōu)選5'-末端)的5、4、3、AL-DP-7327AL-DP-7342AL-DP-7316AL-DP-7344AL-DP-7323AL-DP-7315AL-DP-9250AL-DP-9255AL-DP-9260AL-DP-9265AL-DP-9270AL-DP-9275AL畫(huà)DP曙9281AL-DP-9286、AL國(guó)DP-7329、、AL-DP-7303、和AL-DP-7337、AL-DP-7306、、AL-DP-7335、、AL-DP-7328、、AL-DP-9251、、AL-DP-9256、、AL-DP-9261、、AL-DP-9266、、AL-DP-9271、、AL醒DP醒9276、、AL國(guó)DP畫(huà)9282、,AL-DP國(guó)9287、AL-DP-7333、AL國(guó)DP畫(huà)7307、AL-DP誦7312、AL-DP-7346、AL畫(huà)DP國(guó)7341、AL-DP-7336、AL-DP-9253、AL-DP-9258、AL-DP-9263、AL-DP-9268、AL-DP-9273、AL-DP-9279、AL-DP-9284、AL-DP-7340、AL-DP-7309、AL-DP-7339、AL-DP-7310、AL-DP-7302、AL-DP-7345、AL-DP-9254、AL-DP-9259、AL-DP-9264、AL-DP-9269、AL-DP-9274、AL-DP-9280、AL-DP-9285、422或1個(gè)核苷酸。例如，對(duì)于與Aha基因中一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的23個(gè)核苷酸的dsRNA鏈而言，所述dsRNA通常在其中心的13個(gè)核苷酸內(nèi)不包含任何錯(cuò)配。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述dsRNA的反義鏈在該反義鏈(從5'-3，計(jì)算)從第1或第2位至第9或第10位的區(qū)域內(nèi)不包含任何錯(cuò)配。本文所述的方法可用于檢測(cè)包含與靶序列錯(cuò)配的dsRNA是否能有效抑制Aha基因的表達(dá)。考慮帶有錯(cuò)配的dsRNA在抑制Aha基因表達(dá)中的效力非常重要，特別是已知Aha基因中的特定互補(bǔ)區(qū)在群體中具有多態(tài)性序列變異的情況下。在一個(gè)實(shí)施方案中，dsRNA的至少一個(gè)末端具有1-4個(gè)，通常1或2個(gè)核苷酸的單鏈核苷酸懸端。與其平端對(duì)應(yīng)物相比，具有至少一個(gè)核苷酸懸端的dsRNA具有意想不到的較高的抑制特性。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)僅一個(gè)核苷酸懸端的存在可增強(qiáng)dsRNA的干擾活性，而不影響其整體穩(wěn)定性。已證明僅具有一個(gè)懸端的dsRNA在體內(nèi)以及多種細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基、血液和血清中尤其穩(wěn)定和有效。通常，單鏈懸端位于反義鏈的3'-末端，或者正義鏈的3'-末端。所述dsRNA也可以具有平端，通常位于反義鏈的5'-末端。此類dsRNA具有改進(jìn)的穩(wěn)定性和抑制活性，因此能夠以低劑量施用，即每天施用小于5mg/kg受試者體重。通常，所述dsRNA的反義鏈在3'-末端具有核苷酸懸端，而5'-末端為平端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，懸端中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸被替代為核苷硫代磷酸酯。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)所述dsRNA進(jìn)行化學(xué)修飾以增強(qiáng)穩(wěn)定性。可通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)方法合成和/或修飾本發(fā)明的核酸，例如那些描述于"Cmrentprotocolsinnucleicacidchemistry",Beaucage,S丄.etal.(Edrs.)，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,NY,USA中的方法，以上文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文?？捎糜诒景l(fā)明的優(yōu)選dsRNA化合物的特定實(shí)例包括含修飾骨架的或非天然核苷間連接的dsRNA。如在本說(shuō)明書(shū)中的定義，具有修飾骨架的dsRNA包括那些保留骨架中磷原子的dsRNA和未保留骨架中磷原子的dsRNA。出于本說(shuō)明書(shū)的目的，并且如有時(shí)在本領(lǐng)域中所指，在其核苷間骨架中不含磷原子的修飾dsRNA也能被認(rèn)為是寡核苷。優(yōu)選的修飾dsRNA骨架包括，例如具有正常3'-5'連接的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3，-亞垸基膦酸酯和手性膦酸酯)、亞膦酸酯、氨基磷酸43酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫酰基氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫?；榛⑺狨?、硫?；榛姿崛ズ团鹜榱姿狨?boranophosphate)以及它們2，-5，連接的類似物，以及具有反極性的那些類似物(其中相鄰核苷單位對(duì)的連接由3'-5'變成5'-3'或由2'-5'變成5'-2')。還包括各種鹽、混合的鹽和游離酸的形式。教導(dǎo)以上含磷連接的制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利第3,687,808號(hào)、第4,469,863號(hào)、第4,476,301號(hào)、第5,023,243號(hào)、第5,177,195號(hào)、第5,188,897號(hào)、第5,264,423號(hào)、第5,276,019號(hào)、第5,278,302號(hào)、第5,286,717號(hào)、第5,321,131號(hào)、第5,399,676號(hào)、第5,405,939號(hào)、第5,453,496號(hào)、第5,455,233號(hào)、第5,466,677號(hào)、第5,476,925號(hào)、第5,519,126號(hào)、第5，536,821號(hào)、第5,541,316號(hào)、第5,550,111號(hào)、第5,563,253號(hào)、第5,571,799號(hào)、第5,587,361號(hào)和第5,625,050號(hào)，所述各專利均通過(guò)引用方式并入本文。其中不包含磷原子的優(yōu)選的修飾dsRNA骨架具有通過(guò)短鏈垸基或環(huán)烷基核苷酸間連接、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷酸間連接，或者一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間連接形成的骨架。這些包括那些具有嗎啉基連接鍵(部分由核苷的糖部分形成)的那些骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜禾口諷骨架；formacetyl禾口thioformacetyl骨架；methyleneformacetyl禾口thioformacetyl骨架；含有烯烴的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞胺和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其它具有混合的N、O、S和CH2組分部分的骨架。教導(dǎo)制備上述寡聚核苷的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利第5,034,506號(hào)、第5,166,315號(hào)、第5,185,444號(hào)、第5,214,134號(hào)、第5,216,141號(hào)、第5,235,033號(hào)、第5,264,562號(hào)、第5,264,564號(hào)、第5,405,938號(hào)、第5,434,257號(hào)、第5,466,677號(hào)、第5,470,967號(hào)、第5,489,677號(hào)、第5,541,307號(hào)、第5,561,225號(hào)、第5,596,086號(hào)、第5,602,240號(hào)、第5,610,289號(hào)、第5,602,240號(hào)、第5,608,046號(hào)、第5,610,289號(hào)、第5，618，704號(hào)、第5,623,070號(hào)、第5,663,312號(hào)、第5,633,360號(hào)、第5,677,437號(hào)和第5,677,439號(hào)，所述各專利均通過(guò)引用方式并入本文。在另一個(gè)優(yōu)選的dsRNA模擬物中，糖和核苷間連接，即核苷酸單元的骨架被新基團(tuán)取代。保持堿基單元以與適當(dāng)?shù)暮怂岚袠?biāo)化合物進(jìn)行雜交。一種此類寡聚化合物，即已經(jīng)顯示具有優(yōu)異的雜交特性的dsRNA模擬物，被稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，dsRNA的糖骨架被含酰胺的骨架，特別是氨乙基甘氨酸骨架取代。核酸堿基得到保留并直接或間接地結(jié)合所述骨架酰胺部分的氮雜氮原子。教導(dǎo)制備所述PNA化合物的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利第5,539,082號(hào)、第5,714,331號(hào)和第5,719,262號(hào)，所述各專利均通過(guò)引用方式并入本文。關(guān)于PNA化合物的其他學(xué)說(shuō)可參見(jiàn)Nielsenetal.,Science,1991,254,1497-1500。本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案為具有硫代磷酸酯骨架的dsRNA和具有雜原子骨架的寡核苷，特別是上述參考美國(guó)專利第5,489,677號(hào)的-012-腿-012-、-CH2-N(CH3)-OCH2-[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI骨架]、-CHrO-N(CH3)-CH2-、畫(huà)CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2國(guó)和-N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然的磷酸二酯骨架表示為-0-P-0-CH2-]，以及上述參考美國(guó)專利第5,602,240號(hào)的酰胺骨架。還優(yōu)選上述參考美國(guó)專利第5,034,506號(hào)的具有嗎啉基骨架結(jié)構(gòu)的dsRNA。修飾的dsRNA還可以含一個(gè)或多個(gè)取代的糖部分。優(yōu)選的dsRNA在2'位置包含下述之一OH;F;O-、S-或N-垸基；O-、S-或N-鏈烯基；O-、S-或N-炔基或O-垸基-O-垸基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或非取代的Ct至do烷基或C2至d。烯基和炔基。特別優(yōu)選的是0[(CH2)nO]mCH3、0(CH2)nOCH3、0(CH2)nNH2、0(CH2)nCH3、0(CH2)nONH2和0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m為1至約10。其它優(yōu)選的dsRNA在2'位置包含下述之一d至Cu)低級(jí)垸基、取代的低級(jí)垸基、烷芳基、芳垸基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、S02CH3、ON02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)垸芳基、氨基烷基氨基、多聚垸基氨基、取代的甲硅垸基、RNA剪切基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)、嵌入劑、提高dsRNA藥代動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)或提高dsRNA藥效學(xué)特性的基團(tuán)、以及其它具有類似特性的取代基。優(yōu)選的修飾包括2，-甲氧基乙氧基(2,-0-CH2CH2OCH3，也稱為2,-0-(2-甲氧基乙基)或2，-MOE)(Martinetal，Helv.Chim.Acta,1995,78，486-504)，即烷氧基-烷氧基基團(tuán)。另一個(gè)優(yōu)選的修飾包括如下文實(shí)施例中闡述的2，-二甲基氨基氧基乙氧基，即0(CH2)20N(CH3)2基團(tuán)，也稱為2，-DMAOE，以及如下文實(shí)施例中闡述的2，-45二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本領(lǐng)域中也稱為2，-0-二甲基氨基乙氧基乙基或2，-DMAEOE)，即2，-0-CH2-0-CH2-N(CH2)2。其它優(yōu)選的修飾包括2，-甲氧基(2，-OCH3)、2，-氨基丙氧基(2，-OCH2CH2CH2NH2)和2，-氟(2，-F)。類似的修飾也可以在dsRNA的其它位置完成，特別是3'末端核苷酸中或2'-5'連接的dsRNA中糖的3'位以及5'末端核苷酸的5'位。dsRNA還可以具有糖模擬物，例如替代呋喃戊糖的環(huán)丁基部分。教導(dǎo)這種修飾糖結(jié)構(gòu)的制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利第4,981,957號(hào)、第5,118,800號(hào)、第5,319,080號(hào)、第5,359,044號(hào)、第5,393,878號(hào)、第5,446,137號(hào)、第5,466,786號(hào)、第5,514,785號(hào)、第5,519,134號(hào)、第5,567,811號(hào)、第5,576,427號(hào)、第5,591,722號(hào)、第5,597,909號(hào)、第5,610,300號(hào)、第5,627,053號(hào)、第5,639,873號(hào)、第5,646,265號(hào)、第5,658,873號(hào)、第5,670,633號(hào)和第5,700,920號(hào)，其中某些專利與本申請(qǐng)具有共同申請(qǐng)人，并且各專利的全文均通過(guò)引用方式并入本文。dsRNA還可以包括核酸堿基(在本領(lǐng)域中通常簡(jiǎn)稱為"堿基")修飾或取代。本文所使用的"非修飾"或"天然"的核酸堿基包括嘌呤堿基(腺嘌呤(A)和鳥(niǎo)嘌呤(G))，以及嘧啶堿基(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。修飾核酸堿基包括其它合成的和天然的核酸堿基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的2-丙基和其它'烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-鹵代、8-氨基、8-硫羥、8-硫垸基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤，5-鹵代，特別是5-溴代、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥(niǎo)嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤和8-氮雜腺嘌呤，7-脫氮雜鳥(niǎo)嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤以及3-脫氮雜鳥(niǎo)嘌呤和3-脫氮雜腺嘌呤。其它核酸堿基包括公開(kāi)于以下文獻(xiàn)中的核酸堿基美國(guó)專利第3,687,808號(hào)；TheConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering,858-859頁(yè)，Kroschwitz,J.L,ed.JohnWiley&Sons,1990;Englischetal.,AngewandteChemie,InternationalEdition,1991，30，613;禾口Sanghvi,YS.，15章，DsRNAResearchandApplications,289-302頁(yè)，Crooke,S.T.和Lebleu,B.,Ed.,CRCPress,1993。這些核酸堿基中的一些對(duì)提高本發(fā)明寡聚化合物的結(jié)合親和力特別有用。這些核酸堿基包括5-取代的嘧啶，6-氮雜嘧啶和N-2、N-6以及0-6取代的嘌呤，例如2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已經(jīng)表明5-甲基胞嘧啶取代將核酸雙鏈的穩(wěn)定性提高0,6-1.2°C(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.禾ULebleu,B.,Eds"DsRNAResearchandApplications,CRCPress,BocaRaton,1993，276-278頁(yè))，并且是目前的優(yōu)選堿基取代，特別當(dāng)與2，-0-甲氧基乙基糖修飾物組合時(shí)則更加優(yōu)選。教導(dǎo)以上所提到的某些修飾核酸堿基和其它修飾核酸堿基的制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于以上提到的美國(guó)專利第3,687,808號(hào)，還有美國(guó)專利第4,845,205號(hào)、第5,130,30號(hào)、第5,134,066號(hào)、第5,175,273號(hào)、第5,367，066號(hào)、第5，432，272號(hào)、第5，457，187號(hào)、第5,459,255號(hào)、第5,484,908號(hào)、第5,502,177號(hào)、第5,525,711號(hào)、第5,552,540號(hào)、第5,587,469號(hào)、第5,594,121號(hào)、第5,596,091號(hào)、第5,614,617號(hào)和第5,681,941號(hào)，所述各專利均通過(guò)引用方式并入本文，以及美國(guó)專利第5,750,692號(hào)，也通過(guò)引用方式并入本文。本發(fā)明的dsRNA的另一種修飾包括化學(xué)連接至dsRNA的一個(gè)或多個(gè)部分或偶聯(lián)物以增強(qiáng)dsRNA的活性、細(xì)胞分布和細(xì)胞攝取。這種部分包括但不限于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分(Letsingeretal,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,199，86,6553-6556)，膽酸(Manoharanetal,Biorg.Med.Chem.Let.,199441053-1060)，硫醚，例如beryl-S-三苯甲基硫醇(Manoharanetal,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306-309;Manoharanetal，Biorg.Med.Chem.Let"1993,3,2765-2770)，硫代膽固醇(Oberhauseretal，Nucl.AcidsRes"1992,20,533-538)，和脂肪鏈，例如十二烷基二醇或十一垸基殘基(Saison-Behmoarasetal,EMBOJ,1991,10，1111-1118;Kabanovetal，F(xiàn)EBSLett.,1990，259,327-330;Svinarchuketal,Biochimie，1993，75,49-54)，磷月旨，例如二沖六烷基-外消旋-甘油或三乙基-銨1,2-二-0沖六烷基-外消旋-甘油畫(huà)3-H-磷酸酯(Manoharanetal,TetrahedronLett"1995，36，3651-3654;SheaetaLNucl.AcidsRes.,1990,18，3777-3783)，聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharanetal,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)或金剛烷乙酸(Manoharanetal，TetrahedronLett.,1995,36,3651-3654)，棕櫚酰部分(Mishraetal,Biochim.47Biophys.Acta,1995,1264,229-237)，或十八胺或己胺-羰基氧基膽固醇部分(Crookeetal,J.Pharmacol.Exp.Ther"1996,277,923-937)。教導(dǎo)這種dsRNA偶聯(lián)物的制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利第4,828,979號(hào)、第4,948,882號(hào)、第5,218,105號(hào)、第5,525,465號(hào)、第5,541,313號(hào)、第5,545,730號(hào)、第5,552,538號(hào)、5,578,717號(hào)、第5,580,731號(hào)、第5,591,584號(hào)、第5,109,124號(hào)、第5,118,802號(hào)、第5,138,045號(hào)、第5,414,077號(hào)、第5,486,603號(hào)、第5,512,439號(hào)、第5,578,718號(hào)、第5,608,046號(hào)、第4,587,044號(hào)、第4，605，735號(hào)、第4,667,025號(hào)、第4,762,779號(hào)、第4,789,737號(hào)、第4,824,941號(hào)、第4,835,263號(hào)、第4,876,335號(hào)、第4,904,582號(hào)、第4,958,013號(hào)、第5,082,830號(hào)、第5,112,963號(hào)、第5,214,136號(hào)、第5,082,830號(hào)、第5,112,963號(hào)、第5,214,136號(hào)、第5,245,022號(hào)、第5,254,469號(hào)、第5,258,506號(hào)、第5,262,536號(hào)、第5,272,250號(hào)、第5,292,873號(hào)、第5,317,098號(hào)、第5,371,241號(hào)、第5,391,723號(hào)、第5,416,203號(hào)、第5,451,463號(hào)、第5,510,475號(hào)、第5,512,667號(hào)、第5,514,785號(hào)、第5,565,552號(hào)、第5,567,810號(hào)、第5,574,142號(hào)、第5,585,481號(hào)、第5,587,371號(hào)、第5,595,726號(hào)、第5,597,696號(hào)、第5,599,923號(hào)、第5,599,928號(hào)和第5,688,941，所述各專利均通過(guò)引用方式并入本文。沒(méi)有必要對(duì)給定化合物中的所有位置統(tǒng)一進(jìn)行修飾，并且事實(shí)上可以向單個(gè)化合物中乃至向dsRNA內(nèi)的單個(gè)核苷上引入不止一個(gè)前述修飾。本發(fā)明還包括是嵌合化合物的dsRNA化合物。在本發(fā)明文中，"嵌合的"dsRNA化合物或"嵌合體"為dsRNA化合物，特別是包含兩個(gè)或多個(gè)化學(xué)分離區(qū)的dsRNA，每一個(gè)所述化學(xué)分離區(qū)由至少一個(gè)單體單元(在dsRNA化合物的情況下，所述單體單元為核苷酸)構(gòu)成。通常這些dsRNA包含至少一個(gè)對(duì)所述dsRNA進(jìn)行修飾進(jìn)行修飾的區(qū)域，以便賦予所述dsRNA提高的抗核酸酶降解性、提高的細(xì)胞攝取、和/或提高的與靶核酸的結(jié)合親和力。dsRNA的一個(gè)附加區(qū)域可以作為能夠剪切RNA:DNA或RNA:RNA雜合體的酶的底物。例如，RNaseH是細(xì)胞中一種能剪切RNA:DNA雙鏈中的RNA鏈的核酸內(nèi)切酶。因此，RNaseH的激活引起對(duì)RNA靶標(biāo)的剪切，由此極大地增強(qiáng)dsRNA對(duì)基因表達(dá)的抑制效率。因此，與雜交至同一靶標(biāo)區(qū)域的硫代磷酸酯脫氧dsRNA相比，在使用嵌合dsRNA時(shí)，通常由較短的dsRNA就能夠獲得相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。可以通過(guò)常規(guī)的凝膠電泳檢測(cè)靶RNA的剪切，而且如果需要也可結(jié)合本領(lǐng)域已知的相關(guān)核酸雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。在某些情況下，可通過(guò)非配體基團(tuán)修飾dsRNA?，F(xiàn)已將多種非配體分子與dsRNA結(jié)合以改善所述dsRNA的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取，而且可從科技文獻(xiàn)中獲得進(jìn)行此類結(jié)合的方法。這些非配體部分包括脂質(zhì)部分，例如膽固醇(Letsingeretal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6553)，膽酸(Manoharanetal.,Bioorg.Med.Chem.Lett,1994,4:1053)，硫醚，例如己基畫(huà)S隱三苯甲基硫醇(Manoharanetal,Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660:306;Manoharanetal,Bioorg.Med.Chem.Let,1993，3:2765)，硫代膽固醇(Oberhauseretal,Nucl.AcidsRes.，1992,20:533)，脂肪鏈，例如十二烷基二醇或H^—烷基殘基(Saison-Behmoarasetal,EMBOJ.，1991，10:111;Kabanovetal,FEBSLett.,1990,259:327;Svinarchuketal,Biochimie,1993,75:49)，磷脂，例如二沖六烷基-外消旋-甘油或三乙基-銨1，2-二-0-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(Manoharanetal，TetrahedronLett.,1995,36:3651;Sheaetal,Nucl.AcidsRes"1990，18:3777)，聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharanetal,Nucleosides&Nucleotides,1995，14:969)，或金剛烷乙酸(Manoharanetal,TetrahedronLett.,1995,36:3651)，棕櫚酰部分(Mishraetal,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229)，或十八胺或己胺-羰基氧基膽固醇部分(Crookeetal，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996,277:923)。上文已經(jīng)列出了教導(dǎo)制備此類dsRNA結(jié)合物的代表性美國(guó)專利。典型的結(jié)合方法包含合成在序列中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)具有氨基接頭的dsRNA。隨后，使用合適的偶聯(lián)或活化試劑使氨基基團(tuán)與將要被結(jié)合的分子反應(yīng)。所述結(jié)合反應(yīng)可在dsRNA仍結(jié)合在固體支持物時(shí)進(jìn)行，或者在dsRNA被切割至溶液相后進(jìn)行。通常通過(guò)HPLC純化dsRNA偶聯(lián)物以獲得純的偶聯(lián)物。編碼RNAi試劑的載體本發(fā)明的dsRNA也可以由重組病毒載體在體內(nèi)細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明的重組病毒載體包含編碼本發(fā)明dsRNA的序列以及任意適合于表達(dá)所述dsRNA序列的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子包括，例如，U6或HlRNApoim啟動(dòng)子序列和巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。對(duì)其它合適啟動(dòng)子的選擇屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范圍。本發(fā)明的重組病毒載體也可包含可誘導(dǎo)的或可調(diào)控的啟動(dòng)子，以在特定組織或49特定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中表達(dá)dsRNA。下文中更詳細(xì)地討論了重組病毒載體在將本發(fā)明dsRNA遞送至體內(nèi)細(xì)胞中的用途。本發(fā)明的dsRNA可以由重組病毒載體表達(dá)為兩個(gè)分離的互補(bǔ)RNA分子或由具有兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)域的單個(gè)RNA分子?？梢允褂媚軌蚪邮軐⒁磉_(dá)的dsRNA分子的編碼序列的任何病毒載體，例如衍生自腺病毒(AV)、腺相關(guān)病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(如慢病毒(LV)、棒狀病毒、鼠白血病病毒)、皰疹病毒等的載體?？蛇m當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)使用來(lái)自其它病毒的包膜蛋白或其它表面抗原對(duì)病毒載體進(jìn)行假型化，或通過(guò)取代不同的病毒衣殼蛋白來(lái)改變所述病毒載體的親嗜性。例如，可使用來(lái)自于皰疹性口腔炎病毒(VSV)、狂犬病毒、埃博拉病毒、莫科拉病毒(Mokola)等的表面蛋白對(duì)本發(fā)明的慢病毒載體進(jìn)行假型化?？赏ㄟ^(guò)對(duì)載體進(jìn)行基因改造以表達(dá)不同的衣殼蛋白血清型而使本發(fā)明的AAV載體耙向不同的細(xì)胞。例如，表達(dá)2型血清型基因組上的2型血清型衣殼蛋白的AAV載體被稱為AAV2/2。可以由5型血清型的衣殼蛋白基因取代AAV2/2載體中的此類2型血清型衣殼蛋白基因以產(chǎn)生AAV2/5載體。構(gòu)建表達(dá)不同衣殼蛋白血清型的技術(shù)屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范圍；參見(jiàn)，例如RabinowitzJEetal.(2002),JVirol76:791-801，其公開(kāi)的全文通過(guò)引用方式并入本文。適合本發(fā)明使用的重組病毒載體的選擇、將表達(dá)dsRNA的核酸序列插入載體內(nèi)的方法和將病毒載體遞送至目標(biāo)細(xì)胞的方法都屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范圍。參見(jiàn)，例如DornburgR(1995),GeneTherap.2:301-310;EglitisMA(1988),Biotechniques6:608-614;MillerAD(1990),HumGeneTherap.1:5-14;AndersonWF(1998)，Nature392:25-30;禾口RubinsonDAetal.，Nat.Genet.33:401-406，其公開(kāi)的全文通過(guò)引用方式并入本文。優(yōu)選的病毒載體是那些衍生自AV和AAV的載體。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的dsRNA可以由重組AAV載體表達(dá)為兩個(gè)分離且互補(bǔ)的單鏈RNA分子，其中所述重組AAV載體包含例如U6或H1RNA啟動(dòng)子，或巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。適合于表達(dá)本發(fā)明dsRNA的AV載體、構(gòu)建重組AV載體的方法和將所述載體遞送至靶標(biāo)細(xì)胞的方法描述于XiaHetal.(2002),Nat.Biotech.20:1006-1010。適合于表達(dá)本發(fā)明dsRNA的AAV載體、構(gòu)建重組AV載體的方法和將所述載體遞送至靶標(biāo)細(xì)胞的方法描述于SamulskiRetal.(1987),J.Virol.61:3096-3101;FisherKJetal.(1996),J.Virol,70:520-532;SamulskiRetal.(1989),J.Virol.63:3822-3826;美國(guó)專利第5,252,479號(hào)；美國(guó)專利第5，139，941號(hào)；國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/13788和國(guó)際專利申請(qǐng)WO93/24641中，其公開(kāi)的全文通過(guò)引用方式并入本文。包含dsRNA的藥物組合物在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含如本文所述的dsRNA和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。所述包含dsRNA的藥物組合物可用于治療與Aha基因表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或病癥，例如，治療由Ahal表達(dá)介導(dǎo)的病理過(guò)程。此類藥物組合物根據(jù)其給藥方式進(jìn)行配制。一個(gè)實(shí)例是配制經(jīng)非腸道會(huì)合藥向全身施用的組合物。以足夠抑制Aha基因表達(dá)的劑量施用本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槠湫ЯΦ玫教岣?，包含本發(fā)明dsRNA的組合物能夠以意想不到的低劑量施用。每天5mgdsRNA/kg受試者體重的最大劑量足以抑制或完全抑制Aha基因的表達(dá)。通常，dsRNA的合適劑量是每天0.01至5.0mg/kg受試者體重，通常為每天l嗎至lmg/kg體重。藥物組合物可以每天施用一次，或者可以在一天內(nèi)以適當(dāng)?shù)拈g隔分兩個(gè)、三個(gè)或多個(gè)亞劑量施用dsRNA，乃至使用連續(xù)輸注或通過(guò)控釋制劑給藥。在這種情況下，每個(gè)亞劑量中所包含的dsRNA必須相對(duì)較少以達(dá)到每天的總劑量。也可將劑量單位組合以用于數(shù)天的給藥，例如使用常規(guī)緩釋制劑以在數(shù)天內(nèi)提供緩釋的dsRNA。緩釋制劑是本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)，并通常用于試劑的陰道內(nèi)遞送，以此可以與本發(fā)明的試劑一起使用。在本實(shí)施方案中，劑量單位包含相應(yīng)的多個(gè)日劑量。技術(shù)人員可以理解，特定因素可能影響有效治療受試者所需要的劑量和時(shí)間，所述因素包括但不限于疾病或病癥的嚴(yán)重程度、先期治療、受試者的綜合健康度和/或年齡以及存在的其它疾病。此外，使用治療有效量的組合物對(duì)受試者進(jìn)行的治療可以包括單次治療或一系列治療。如本文其它部分所述，可以使用常規(guī)方法學(xué)或者使用合適的動(dòng)物模型在體內(nèi)檢測(cè)的基礎(chǔ)上評(píng)估本發(fā)51明所涵蓋的單個(gè)dsRNA的有效量和體內(nèi)半衰期。隨著小鼠遺傳學(xué)的進(jìn)展，已經(jīng)產(chǎn)生了用于研究多種人類疾病(例如，由Aha基因表達(dá)介導(dǎo)的病理過(guò)程)的多種小鼠模型。此類模型可用于dsRNA的體內(nèi)檢測(cè)以及確定治療有效劑量。本發(fā)明還包括包含本發(fā)明dsRNA化合物的藥物組合物和制劑。取決于是否需要局部或全身治療和需要治療的區(qū)域，可以以多種方式施用本發(fā)明的藥物組合物?？梢跃植渴┯?、經(jīng)肺部施用，例如通過(guò)吸入或吹入粉末或氣溶膠(包括通過(guò)噴霧器)；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和透皮，口服或非腸道施用。非腸道施用包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注，或者顱內(nèi)，例如鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用。用于局部施用的藥物組合物和制劑可以包括透皮貼劑、軟膏、洗液、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧、液體和粉末。也有必要或需要使用常規(guī)藥物載體、水、粉末或油基料、增稠劑等。還可以使用有涂層的避孕套、手套等。優(yōu)選的局部用制劑包括將本發(fā)明的dsRNA與局部遞送試劑(例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑)混合的那些制劑。優(yōu)選的脂質(zhì)和脂質(zhì)體包括中性(例如二油酰磷脂酰乙醇胺=DOPE、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿=DMPC、二硬脂酰磷脂酰膽堿)、陰離子性(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油=DMPG)和陽(yáng)離子性(例如,二油酰四甲基氨基丙烷=DOTAP和二油酰基磷脂?；掖及范﨑OTMA)?？梢詫⒈景l(fā)明的dsRNA封裝在脂質(zhì)體內(nèi)或者與其(特別是與陽(yáng)離子脂質(zhì)體)形成復(fù)合物。或者，dsRNA可以與脂質(zhì)復(fù)合，特別是與陽(yáng)離子脂質(zhì)。優(yōu)選的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸酯、月桂酸二甘油酯、甘油l-單癸酸酯、l-十二烷基氮雜環(huán)庚垸-2-酮、?；舛緣A、?；憠A、或Cwo垸基酯(例如肉豆蔻酸異丙酯IPM)、甘油單酯、甘油二酯或其藥學(xué)上可接受的鹽。局部制劑在1999年5月20日遞交的美國(guó)專利申請(qǐng)第09/315，298號(hào)中得到了詳細(xì)闡述，此文獻(xiàn)全文通過(guò)引用方式并入本文。用于口服給藥的組合物和制劑包括粉末或顆粒、微顆粒、納米顆粒、在水或非水溶劑的懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、藥袋(sachets)、片劑或微片劑?？赡苄枰龀韯?、芳香劑、稀釋液、乳化劑、分散劑或粘合劑。優(yōu)選的口服制劑是將本發(fā)明的dsRNA與一個(gè)或多個(gè)滲透增強(qiáng)劑、表面活性劑和螯合劑一起施用的制劑。優(yōu)選的表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽酸和/或其鹽。優(yōu)選的膽酸/鹽包括鵝脫氧膽酸(CDCA)和熊脫氧膽酸(ursodeoxychenodeoxycholicacid，UDCA)、膽酸、脫氫膽酸、月兌氧膽酸、葡糖膽酸、甘油膽酸、甘油脫氧膽酸、牛磺膽酸、?；敲撗跄懰?、牛磺-24,25-二氫-夫西地酸鈉和甘油二氫夫西地酸鈉。優(yōu)選的脂肪酸包括花生四烯酸、十一垸酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酯、三癸酯、單油酸酯、月桂酸二甘油酯、甘油l-單癸酸酯、l-十二垸基氮雜環(huán)庚烷-2-酮、?；舛緣A、?；憠A、或甘油單酯、甘油二酯或其藥學(xué)上可接受的鹽(例如，鈉鹽)。優(yōu)選的還有滲透增強(qiáng)劑的組合，例如脂肪酸/鹽與膽酸/鹽的組合。特別優(yōu)選的組合是月桂酸、辛酸和UDCA的鈉鹽。其它滲透增強(qiáng)劑包括聚氧乙烯-9-月桂醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚。本發(fā)明的dsRNA可以以粒狀形式(包括噴霧干燥顆粒或聚合形成的微顆?；蚣{米顆粒)口服遞送。dsRNA復(fù)合劑(complexingagent)包括聚氨基酸，聚亞胺，聚丙烯酸酯，聚烷基丙烯酸酯、聚氧乙垸、聚垸基氰基丙烯酸酯，陽(yáng)離子化的明膠、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉，聚烷基氰基丙烯酸酯，DEAE衍生化的聚亞胺、短梗霉多糖(pollulans)、纖維素和淀粉。特別優(yōu)選的復(fù)合劑包括殼聚糖、N-三甲基殼聚糖、聚L-賴氨酸、聚組氨酸、聚鳥(niǎo)氨酸、聚精胺、魚(yú)精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如，對(duì)氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D，L-乳酸)、聚D,L-乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)、藻酸鹽和聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服制劑及其制備詳細(xì)描述于美國(guó)申請(qǐng)第08/886,829號(hào)(遞交于1997年7月1日)、09/108,673(遞交于1998年7月1日)、第09/256,515號(hào)(遞交于1999年2月23日)、09/082,624(遞交于1998年5月21日)和第09/315,298號(hào)(遞交于1999年5月20日)，以上文獻(xiàn)均通過(guò)引用方式并入本文。用于非腸道、鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用的組合物和制劑可以包括無(wú)菌水溶液，所述水溶液還可以包含緩沖劑、稀釋劑和其它合適的添加劑，例如但不限于滲透增強(qiáng)劑、載體化合物和其它藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳劑和包含脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可以從多種組分生成，所述組分包括但不限于預(yù)制的液體、自乳化的固體和自乳化的半固體。本發(fā)明的藥物制劑可以便捷地以單位劑量的形式存在，其可以根據(jù)制藥業(yè)中熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行制備。這種技術(shù)包括使活性成分與藥物載體或賦形劑相結(jié)合的步驟。通常，通過(guò)均勻地且緊密地將活性成分與液體載體或精細(xì)研磨的固體載體或與以上兩者組合來(lái)制備所述制劑，然后(如果需要)將產(chǎn)品制成型。本發(fā)明的組合物可以配制成任意多個(gè)可能的劑型，例如但不限于片劑、膠囊、凝膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可以制成水懸浮液、非水或混合溶劑的懸浮液。水懸浮液還可以包含提高懸浮液粘性的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素碳酸鈉、山梨醇和/或葡聚糖。所述懸浮液還可以包含穩(wěn)定劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的藥物組合物配制成泡沫劑并作為泡沫劑使用。藥物泡沬劑包括制劑，例如但不限于乳劑、微乳劑、膏劑、凝膠劑和脂質(zhì)體。雖然這些制劑本質(zhì)基本相同，但是其成分和終產(chǎn)品的粘性并不相同。此類組合物和試劑的制備法通常為藥學(xué)和制劑學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員通常所熟知，并且可應(yīng)用于本發(fā)明組合物的配制。乳劑本發(fā)明的制劑和組合物可以制備并配制成乳劑。乳劑通常是以直徑通常超過(guò)O.lpm的微滴形式將一種液體分散在另一種液體中的異源體系(Idson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，RiegerandBanker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"volume1,p.199;Rosoff,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBanker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"Volume1,p.245;BlockinPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBanker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"volume2,p.335;Higuchietal"inRemington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.,Easton,Pa.，1985,p.301)。乳劑常是包含彼此充分混合并分散的兩個(gè)不混溶液相的雙相系統(tǒng)。通常，乳劑可以為油包水(W/0)或水包油(0/W)的形式。當(dāng)水相分離為微小液滴并分散到大量的油相中時(shí)，所產(chǎn)生的組合物被稱為油包水(W/0)乳劑。或者，當(dāng)油相分離為微小液滴細(xì)碎并分散到大量的水相中時(shí)，所產(chǎn)生的組合物被稱為水包油(O/W)乳劑。除了分散相和活性藥物外，乳劑還可以含其它組分，所述活性藥物可以作為水相、油相溶液，或者其自身作為獨(dú)立相存在。根據(jù)需要，乳劑中也可以存在藥物賦形劑，例如乳化劑、穩(wěn)定劑、染料和抗氧化劑。藥物乳劑也可以是由兩個(gè)以上的相組成的多重乳劑，例如油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳劑的情況。這種復(fù)合制劑通常具有簡(jiǎn)單的二相乳劑所不具有的特定優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)多重乳劑中的o/w乳劑的各油滴還包有小水滴時(shí)，該多重乳劑形成w/o/w乳劑。同樣地，在油連續(xù)相中穩(wěn)定化的水滴中包封油滴的系統(tǒng)構(gòu)成o/w/o乳劑。乳劑具有較小或沒(méi)有熱力學(xué)穩(wěn)定性的特點(diǎn)。通常，乳劑的分散相或不連續(xù)相很好地分散在外相或連續(xù)相中，并通過(guò)乳化劑或制劑的粘性保持這種形式。如在乳劑狀軟膏基料或膏劑的情況下，乳劑的每個(gè)相都可以為半固體或固體。其它穩(wěn)定乳劑的方式需要使用乳化劑，所述乳化劑可被并入到乳劑的任一相中。乳化劑可以寬泛地分成四種類型合成的表面活性劑、天然存在的乳化劑、吸收基料和細(xì)分散的固體(Idson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBanker(Eds),1988，MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"volume1,p.199)。合成的表面活性齊U(surfactants或?qū)憺閟urfaceactiveagents)已廣泛應(yīng)用于乳劑的配制，并且已經(jīng)在文獻(xiàn)中進(jìn)行了綜述(Rieger，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBanker(Eds.),1988，MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"volume1,p.285;Idson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBanker(Eds.),MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"1988，volume1,p.199)。表面活性劑通常是兩性分子，包含親水部分和疏水部分。表面活性劑的親水性和疏水性的比值被定義為親水性/疏水性平衡值(HLB)，這是制劑制備過(guò)程中分類和選擇表面活性劑的有力工具?？梢愿鶕?jù)親水基團(tuán)的性質(zhì)將表面活性劑分成不同的類型非離子型、陰離子型、陽(yáng)離子型和兩性型(Rieger,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBanker55(Eds.)，1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"volume1，p.285)。乳劑配制中使用的天然存在的乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂、卵磷脂和阿拉伯樹(shù)膠。吸收基料具有親水特性，所以能夠吸收水，形成w/o乳劑并仍然保持其半固體稠度，例如無(wú)水羊毛脂和親水凡士林。微細(xì)固體也已經(jīng)被用做優(yōu)良的乳化劑，特別是與表面活性劑組合使用和在粘性制品中使用。這些微細(xì)固體包括極性無(wú)機(jī)固體，例如重金屬氫氧化物；非溶脹性粘土，例如膨潤(rùn)土、綠坡縷石、鋰蒙脫石、高嶺土、蒙脫石、膠狀硅酸鋁和膠狀硅酸鎂鋁；色素和非極性固體，例如碳或三硬脂酸甘油酯。在乳劑制劑中還包含有利于乳劑性質(zhì)的多種非乳化物。這些非乳化物包括脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、濕潤(rùn)劑、親水膠體、防腐劑和抗氧化劑(Block,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman，RiegerandBanker(Eds.),1988,MarcelDekker，Inc.,NewYork,N.Y"volume1，p.335;Idson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBanker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"volume1，p.199)。親水膠體或水狀膠體包括天然存在的樹(shù)膠和合成的聚合物，例如多糖(如阿拉伯樹(shù)膠、瓊脂、藻酸、角叉菜膠、瓜耳膠、刺梧桐樹(shù)膠和黃芪膠)，纖維素衍生物(例如，羧甲基纖維素和羧丙基纖維素)和合成的聚合物(例如，碳聚物、纖維素醚和羰基乙烯基聚合物)。這些物質(zhì)在水中分散或膨脹形成的膠狀溶液可通過(guò)在分散相小滴的周圍形成強(qiáng)界面膜并通過(guò)增強(qiáng)外相的粘性來(lái)穩(wěn)定乳劑。由于乳劑通常包含大量可以有利于微生物生長(zhǎng)的成份，例如碳水化合物、蛋白質(zhì)、固醇類和磷脂，所以這些制劑通常含有防腐劑。乳劑制劑中通常使用的防腐劑包括對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、季銨鹽、苯扎氯銨、對(duì)羥基苯甲酸酯和硼酸。通常也將抗氧劑加入到乳劑制劑中以預(yù)防制劑變質(zhì)。所使用的抗氧化劑可以為自由基清除劑，例如生育酚、沒(méi)食子酸垸基酯、丁基化羥基茴香醚，丁基化羥基甲苯，或還原劑，例如抗壞血酸和偏亞硫酸氫鈉，以及抗氧化劑增效劑，例如檸檬酸、酒石酸和卵磷脂?，F(xiàn)有文獻(xiàn)已對(duì)乳劑制劑經(jīng)皮膚、口服和非腸道途徑的應(yīng)用及其生產(chǎn)方法作出了綜述(Idson，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,Rieger禾口Banker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"volume1,p.199)。因?yàn)榕渲坪?jiǎn)單并且在吸收和生物利用率方面的高效性，口服遞送的乳劑制劑已經(jīng)得至ll廣泛使用(Rosoff,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBanker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"volume1,p.245;Idson，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBanker(Eds.)，1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"volumel，p.l99)。基于礦物油的輕瀉劑、油溶性維生素和高脂肪營(yíng)養(yǎng)制品屬于經(jīng)常作為oAv乳劑口服的物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將dsRNA與核酸的組合物配制成微乳劑。微乳劑可以定義為水、油和兩親性物質(zhì)的體系，是具有單一的光學(xué)同向性和熱力學(xué)禾急定的液體溶、液(Rosoff,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBanker(Eds.),1988，MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"volume1,p.245)。通常，微乳劑是通過(guò)如下方法制備的系統(tǒng)首先將油分散到表面活性劑水溶液中，然后加入足量的第四組分(通常為中等鏈長(zhǎng)度的醇)以形成透明體系。因此，微乳劑也被描述成被表面活性分子的界面膜穩(wěn)定的兩種不可混溶液體的熱力學(xué)穩(wěn)定且各向同性的澄清分散系(LeungandShah，in:ControlledReleaseofDrugs:PolymersandAggregateSystems,Rosoff,M.,Ed.，1989,VCHPublishers,NewYork,pages185-215)。通常通過(guò)組合包括油、水、表面活性劑、輔助表面活性劑和電解液的3至5種成分來(lái)制備微乳劑。微乳劑是油包水(w/o)還是水包油(o/w)類型依賴于所使用的油和表面活性劑的性質(zhì)以及表面活性劑分子的極性頭部和烴基尾部的結(jié)構(gòu)和幾何包裝(geometricpacking)(Schott,Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.,Easton,Pa.，1985,p.271)?，F(xiàn)已對(duì)利用相圖的現(xiàn)象學(xué)方法進(jìn)行了深入研究，并且已經(jīng)向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了如何制備微乳劑的全面理論(Rosoff，inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,Rieger禾口Banker(Eds.)，1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"volume1,p.245;Block,inPharmaceuticalDosageForms,LiebermanRieger禾口Banker(Eds.)，1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"volumel，p.335)。與常規(guī)乳劑相比，微乳劑的優(yōu)點(diǎn)是能夠使水溶性藥物溶解于自發(fā)形成的熱力學(xué)穩(wěn)定的液滴制劑中。微乳劑制備中所使用的表面活性劑包括但不限于單獨(dú)使用或與輔助表面活性劑組合使用的離子表面活性劑、非離子表面活性劑、Brij96、聚氧乙烯油基醚、聚脂肪酸甘油酯、單月桂酸四甘油酯(ML310)、單油酸四甘油酯(MO310)、單油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、單癸酸十甘油酯(MCA750)、單油酸十甘油酯(MO750)、倍半油酸十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DA0750)。所述輔助表面活性劑通常是短鏈醇，例如乙醇、1-丙醇和l-丁醇，其作用是通過(guò)滲透到表面活性劑膜中并隨后由表面活性劑分子間產(chǎn)生的空余空間而產(chǎn)生無(wú)序膜，從而提高界面流動(dòng)性。然而，也可以不使用輔助表面活性劑制備微乳劑，并且無(wú)醇的自乳化微乳劑體系是本領(lǐng)域已知的。通常，水相可以是但不限于水、藥物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇，以及乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于如Captex300，Captex500,CapmulMCM，脂肪酸酯，中等鏈(Q-d2)的單、二和三甘油酯，聚氧乙基化甘油脂肪酸酯、脂肪醇，聚乙二醇化甘油酯，飽和聚乙二醇化的CVCK)甘油酯、植物油和硅油。從藥物溶解和增強(qiáng)藥物吸收的方面來(lái)看，微乳劑特別令人感興趣。已經(jīng)提議使用基于脂質(zhì)的微乳劑(Q/w和w/o兩者)以增強(qiáng)藥物(包括肽)的口月艮生物利用度(Constantinidesetal，PharmaceuticalResearch,1994,11，1385-13卯；Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol"1993，13,205)。微乳劑具有以下優(yōu)勢(shì)提高藥物溶解度、保護(hù)藥物免受酶的水解、由于表面活性劑導(dǎo)致膜流動(dòng)性和滲透性的改變可能增強(qiáng)藥物的吸收、制備簡(jiǎn)單、易于以固體劑型口服、提高臨床效能和降低毒性(Constantinidesetal.,PharmaceuticalResearch,1994,11,1385;Hoetal,J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。通常，將微乳劑的成份在環(huán)境溫度下混合時(shí)可以自發(fā)形成微乳劑。這可能特別有益于制備熱不穩(wěn)定的藥物、肽或dsRNA。在化妝品和藥物應(yīng)用領(lǐng)域，微乳劑還可有效地透皮遞送活性組分。我們期望本發(fā)明的微乳劑組合物和制劑將會(huì)有利于提高由胃腸道系統(tǒng)性地吸收dsRNA和核酸，并提高dsRNA和核酸在胃腸道、鞘、口腔和施用的其它區(qū)域內(nèi)的局部細(xì)胞攝取。本發(fā)明的微乳劑還可以包含其它成份和添加劑，例如山梨醇單硬脂酸酯(Grill3)、Labmsol和滲透增強(qiáng)劑以增強(qiáng)所述制劑的性質(zhì)并提高本發(fā)明dsRNA和核酸的吸收。本發(fā)明的微乳劑中使用的滲透增強(qiáng)劑可以屬于五個(gè)類型中的一種表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和沒(méi)有螯合的非表面活性齊U(Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991，p.92)。每個(gè)類型都已經(jīng)在以上文中進(jìn)行了討論。脂質(zhì)體除了微乳劑以外，還有許多經(jīng)過(guò)研究并用于藥物制劑的有序表面活性劑結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)包括單分子層、膠束、雙分子層和囊泡。由于其特異性和在藥物遞送方面所提供作用的持久性，囊泡(如脂質(zhì)體)已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"脂質(zhì)體"是指由排列成一個(gè)或多個(gè)球形雙分子層的兩性脂質(zhì)組成的囊泡。脂質(zhì)體是單層或多層囊泡，其具有由親脂性物質(zhì)形成的膜和水性內(nèi)部。水性部分包含待遞送的組合物。陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有能夠與細(xì)胞壁融合的優(yōu)點(diǎn)。非陽(yáng)離子脂質(zhì)體雖然不能與細(xì)胞壁進(jìn)行如此有效地融合，但在體內(nèi)可通過(guò)巨噬細(xì)胞被攝取。為了穿越完整的哺乳動(dòng)物皮膚，脂質(zhì)囊泡必須在合適的透皮梯度的影響下穿過(guò)一系列的每個(gè)直徑小于50nm的小孔。因此，期望使用高度可變性的并能夠穿過(guò)此類小孔的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的其它優(yōu)勢(shì)包括由天然磷脂形成的脂質(zhì)體具有生物相容性和生物可降解性；脂質(zhì)體可以與很大范圍的水溶性和脂溶性藥物結(jié)合；脂質(zhì)體能夠防止包裹在其內(nèi)腔中的藥物被代謝和降解(Rosoff,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBanker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.245)。在脂質(zhì)體制劑制備中需要考慮的重點(diǎn)是脂表面電荷、囊泡大小和脂質(zhì)體中的水體積。脂質(zhì)體可用于將活性成份轉(zhuǎn)移和遞送至作用位點(diǎn)。因?yàn)橹|(zhì)體膜與生物膜在結(jié)構(gòu)上相似，當(dāng)將脂質(zhì)體應(yīng)用于組織時(shí)，脂質(zhì)體就會(huì)開(kāi)始和細(xì)胞膜融合并且隨著脂質(zhì)體與細(xì)胞融合的進(jìn)行，脂質(zhì)體的內(nèi)容物被完全轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞中，在此活性物質(zhì)可以發(fā)揮作用。脂質(zhì)體制劑作為多種藥物遞送的模式是很多研究的焦點(diǎn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明對(duì)于局部施藥，脂質(zhì)體具有優(yōu)于其它制劑的很多優(yōu)勢(shì)。此類優(yōu)勢(shì)包括降低與所施用藥物的高度全身吸收相關(guān)的副作用，提高所施用的藥物在預(yù)期靶標(biāo)處的積累，以及具有向皮膚施用多種親水性和疏水性藥物的能力。已有多個(gè)報(bào)告詳細(xì)敘述了脂質(zhì)體向皮膚遞送包括大分子量DNA在內(nèi)的試劑的能力。已經(jīng)將包括止痛劑、抗體、激素和大分子量DNA在內(nèi)的化合59物施用于皮膚。大多數(shù)應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致對(duì)上層表皮的靶向。脂質(zhì)體分成兩大類。陽(yáng)離子脂質(zhì)體是帶正電荷的脂質(zhì)體，其與帶負(fù)電的DNA分子相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物。帶正電荷的DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物能結(jié)合至帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面，并被內(nèi)化到內(nèi)體中。由于內(nèi)體中的酸性pH，脂質(zhì)體破裂，將其內(nèi)容物釋放至細(xì)胞質(zhì)中(Wangetal,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987，147，980-985)。pH敏感的或帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體捕獲DNA，而不是與其復(fù)合。由于DNA和脂質(zhì)都帶有類似的電荷，它們發(fā)生排斥而不是形成復(fù)合物。因而，一些DNA被這些脂質(zhì)體的水性內(nèi)部捕獲。已經(jīng)將pH敏感性脂質(zhì)體用于向培養(yǎng)物中的細(xì)胞單層中遞送編碼胸苷激酶基因的DNA。在靶細(xì)胞中檢測(cè)到外源基因的表達(dá)(Zhouetal，JournalofControlledRelease,1992，19，269-274)。脂質(zhì)體組合物的一個(gè)重要類型包括磷脂，而非天然來(lái)源的磷脂酰膽堿。例如，中性脂質(zhì)體組合物可以由二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)或二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)形成。陰離子脂質(zhì)體組合物通常由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而陰離子融合脂質(zhì)體則由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一種類型的脂質(zhì)體組合物是由磷脂酰膽堿(PC)形成，例如大豆PC、和卵PC。另一類是由磷脂和/或磷脂酰膽堿和/或膽固醇的混合物形成。有一些研究評(píng)價(jià)了脂質(zhì)體藥物制劑向皮膚的局部遞送。在豚鼠皮膚上應(yīng)用包含干擾素的脂質(zhì)體可減輕皮膚皰疹潰瘍，然而通過(guò)其它方式(例如作為溶液或乳劑)遞送干擾素則是無(wú)效的(Weineretal，JournalofDrugTargeting,1992,2,405-410)。另外，另一項(xiàng)研究檢驗(yàn)了作為脂質(zhì)體制劑的一部分施用干擾素相對(duì)于利用水性系統(tǒng)施用干擾素的效率，并得出結(jié)論脂質(zhì)體制劑優(yōu)于水性施用(duPlessisetal，AntiviralResearch,1992，18,259-265)。還檢驗(yàn)了非離子脂質(zhì)體系統(tǒng)，特別是包含非離子表面活性劑和膽固醇的系統(tǒng)，以確定其在向皮膚遞送藥物中的功用。使用包含Novasome.TM.I(二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)和Novasome.TM.II(二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非離子脂質(zhì)體制劑向小鼠真皮內(nèi)遞送環(huán)孢素A。結(jié)果表明，此類非離子脂質(zhì)體系統(tǒng)可有效促進(jìn)環(huán)孢素A向不同皮膚層中的沉積(Huetal，S.T.RPharma.Sci.,1994,4,6,466)。脂質(zhì)體還包括"空間穩(wěn)定的"脂質(zhì)體，本文使用此術(shù)語(yǔ)是指包含一個(gè)或60多個(gè)特殊化脂質(zhì)的脂質(zhì)體，相對(duì)于不含此類特殊化脂質(zhì)的脂質(zhì)體相比，所述特殊化脂質(zhì)混入脂質(zhì)體中時(shí)會(huì)導(dǎo)致循環(huán)壽命的提高。在空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體的實(shí)例中，脂質(zhì)體中形成囊泡的脂質(zhì)部分的一部分(A)包含一種或多種糖脂例如單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂Gml，或(B)由一種或多種親水聚合物，例如聚乙二醇(PEG)部分進(jìn)行衍生化。盡管不希望受到任何具體理論的限制，在本領(lǐng)域中認(rèn)為至少對(duì)于包含神經(jīng)節(jié)苷脂、鞘磷脂或由PEG衍生化脂質(zhì)的空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體來(lái)說(shuō)，這些空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體的循環(huán)半衰期的增加是由于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)細(xì)胞對(duì)其攝取的下降(Allenetal,FEBSLetters,1987，223,42;Wuetal.,CancerResearch,1993,53,3765)。包含一種或多種糖脂的各種脂質(zhì)體是本領(lǐng)域已知的。Papahadjopoulos等人報(bào)告了單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂Gml、半乳糖腦苷脂硫酸酯和磷脂酰肌醇提高脂質(zhì)體血液半衰期的能力(Ann.N.Y.Acad.Sci.,1987,507,64)。Gabizon等人對(duì)這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85,6949)。Allen等人的美國(guó)專利第4,837,028號(hào)和WO88/04924中公開(kāi)了包含(1)鞘磷脂和(2)神經(jīng)節(jié)苷脂Gml或半乳糖腦苷脂硫酸酯的脂質(zhì)體。美國(guó)專利第5,543,152號(hào)(Webbetal)公開(kāi)了包含鞘磷脂的脂質(zhì)體。WO97/13499(Limetal)中公開(kāi)了包含1,2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿的脂質(zhì)體。本領(lǐng)域內(nèi)已知包含由一種或多種親水聚合物衍生化的脂質(zhì)的多種脂質(zhì)體及其制備方法。Sunamoto等人闡述了包含非離子去垢劑2C1215G(包含PEG部分)的脂質(zhì)體(Bull.Chem.Soc.Jpn.,1980,53,2778)。Ilium等人指出包含聚乙二醇的聚苯乙烯顆粒的親水涂層可使其血液半衰期的顯著增長(zhǎng)(FEBSLett"1984，167,79)。Sears(美國(guó)專利第4,426,330號(hào)和第4,534,899號(hào))闡述了通過(guò)結(jié)合聚亞垸基二醇(例如，PEG)的羧基基團(tuán)進(jìn)行修飾的合成磷脂。Klibanov等人描述的試驗(yàn)表明包含由PEG或PEG硬脂酸酯衍生化的磷脂酰乙醇胺(PE)的脂質(zhì)體在血液循環(huán)中具有顯著提高的半衰期(FEBSLett.,1990,268,235)。Blume等人將此類發(fā)現(xiàn)延伸至其它PEG衍生化的磷脂，例如由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG組合形成的DSPE-PEG(BiochimicaetBiophysicaActa,1990,1029,91)。在Fisher的歐洲專利EP0445131Bl和WO90/04384中闡述了在其外表面具有共價(jià)結(jié)合的PEG部分的脂質(zhì)體。Woodle(美國(guó)專利第5,013,556號(hào)和第5,356,633號(hào))和Martin等人(美國(guó)專利號(hào)第5,213,804號(hào)和歐洲專利EP0496813Bl)闡述了包含1-20摩爾百分比PEG衍生化PE的脂質(zhì)體組合物以及其用途。在Martin等人的WO91/05545和美國(guó)專利第5,225,212號(hào)以及Zalipsky等人的WO94/20073中闡述了包含其它一些脂質(zhì)聚合物偶聯(lián)物的脂質(zhì)體。在WO96/10391(Choietal)中闡述了包含經(jīng)PEG修飾的神經(jīng)酰胺脂的脂質(zhì)體。美國(guó)專利第5,540,935號(hào)(Miyazakietal)和美國(guó)專利第5,556,948號(hào)(Tagawaetal)闡述了可進(jìn)一歩使用官能團(tuán)部分對(duì)其表面進(jìn)行衍生化的包含PEG的脂質(zhì)體。本領(lǐng)域已知的包含核酸的脂質(zhì)體的數(shù)量有限。Thierry等人的WO96/40062公開(kāi)了將高分子量核酸封裝到脂質(zhì)體中的方法。Tagawa等人的美國(guó)專利第5,264,221號(hào)公開(kāi)了結(jié)合蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體，并聲稱此類脂質(zhì)體的內(nèi)容物可以包括dsRNA。Rahman等人的美國(guó)專利第5,665,710闡述了將寡聚脫氧核苷酸封裝到脂質(zhì)體中的特定方法。Love等人的WO97/04787公開(kāi)了包含耙向raf基因的dsRNA的脂質(zhì)體。傳遞體(transfersome)是另一種類型的脂質(zhì)體，是具有高度可變性的脂質(zhì)聚合體，并且是藥物遞送載體(vehicle)的有力候選物。傳遞體可以被描述成脂質(zhì)液滴，所述脂質(zhì)液滴具有高度的變形性以使其容易地通過(guò)比自身還要小的小孔。傳遞體可以適應(yīng)其應(yīng)用環(huán)境，例如傳遞體自優(yōu)化(適應(yīng)皮膚中小孔的形狀)，自修復(fù)，通常不需要片段化即可到達(dá)其靶標(biāo)，并且通?？梢赃M(jìn)行自動(dòng)負(fù)載。為了制備傳遞體，可以在標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)體組合物中加入表面邊界活化劑，通常為表面活性劑。已經(jīng)將傳遞體用于向皮膚遞送血清白蛋白。已經(jīng)顯示傳遞體介導(dǎo)的血清白蛋白遞送與皮下注射包含血清白蛋白的溶液同樣有效。表面活性劑在制劑中，例如乳劑(包括微乳劑)和脂質(zhì)體中有廣泛應(yīng)用。對(duì)這些不同類型的表面活性劑(包括合成的和天然的)的特性進(jìn)行分類和分級(jí)的最常見(jiàn)方式是使用親水性/親脂性平衡值(HLB)。親水基團(tuán)(也稱為"頭部")的性質(zhì)提供了對(duì)用于制劑的不同表面活性劑進(jìn)行分類的最有用的方式(Rieger，inPharmaceuticalDosageForms,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"1988,p.285)。如果表面活性劑分子不是離子化的，則將其歸類為非離子表面活性劑。非離子表面活性劑在藥物和化妝產(chǎn)品中有廣泛的應(yīng)用，并可以在寬范圍的pH值內(nèi)使用。通常，取決于其結(jié)構(gòu)，其HLB值在2至約18間變化。非離子表面活性劑包括非離子酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、山梨聚糖酯、蔗糖酯和乙氧基酯。非離子的烷醇酰胺和醚，例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物也包括在這一類中。聚氧乙烯表面活性劑是非離子表面活性劑類中最常用的成員。如果表面活性劑分子在溶于水或分散于水中時(shí)帶有負(fù)電荷，所述表面活性劑被歸類為陰離子表面活性劑。陰離子表面活性劑包括羧酸酯，例如脂肪酸酯、?；轷ｕァ被岬孽；被衔?，硫酸酯，例如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯，磺酸酯，例如烷基苯磺酸酯、?；u乙基磺酸酯、酰基?；撬狨ズ突腔晁狨ヒ约傲姿狨?。陰離子表面活性劑的最重要的成員為垸基硫酸酯和脂肪酸酯。如果表面活性劑分子在溶于水或分散于水中時(shí)帶有正電荷，所述表面活性劑被歸類為陽(yáng)離子表面活性劑。陽(yáng)離子表面活性劑包括季銨鹽和乙氧化胺。季銨鹽是這個(gè)類別中最常使用的成員。如果表面活性劑分子能夠帶有正電荷或者負(fù)電荷，所述表面活性劑被歸類為兩性表面活性劑。兩性表面活性劑包括丙烯酸衍生物、取代的垸基氨基化合物、N-烷基甜菜堿和磷脂。己有關(guān)于表面活性劑在藥物產(chǎn)品、制劑中和乳劑中應(yīng)用的綜述(Rieger，inPharmaceuticalDosageForms,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y"1988,p.285)。滲透增強(qiáng)劑在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用了各種滲透增強(qiáng)劑以實(shí)現(xiàn)核酸(特別是dsRNA)向動(dòng)物皮膚的有效遞送。多數(shù)藥物以離子化和非離子化的形式存在于溶液中。然而，通常只有脂溶的或親脂的藥物可容易地穿過(guò)細(xì)胞膜。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用滲透增強(qiáng)劑處理要穿過(guò)的膜后，甚至連非親脂藥物也可以穿過(guò)所述細(xì)胞膜。除了幫助非親脂藥物擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜外，滲透增強(qiáng)劑還能增強(qiáng)親脂藥物的滲透性。滲透增強(qiáng)劑可以歸類為5大類之一，即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合的非表面活性劑(Leeetal，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,p.92)。在下面詳細(xì)闡述了各類上述滲透增強(qiáng)劑。表面活性劑在本發(fā)明的文中，表面活性劑(或"表面活性試劑")為溶解到水溶液中后能降低溶液的表面張力或者降低水溶液和另一個(gè)脂質(zhì)之間界面間張力的化學(xué)物質(zhì)，其結(jié)果可使dsRNA通過(guò)粘膜的吸收得到增強(qiáng)。除了膽汁鹽和脂肪酸之外，這些滲透增強(qiáng)劑還包括，例如月桂基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚(Leeetal,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,p.92)，以及全氟化合物乳劑，例如FC-43(Takahashietal,J.Pharm.Pharmacol"1988,40，252)。脂肪酸作為滲透增強(qiáng)劑的各種脂肪酸及其衍生物包括，例如油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸酯(l-單油酰-rac-甘油,)、月桂酸二甘油酯、辛酸、花生四烯酸、甘油l-單癸酸酯、l-十二垸基氮雜環(huán)庚烷-2-酮、酰基肉毒堿、?；憠A，其Cw。烷基酯(如甲基、異丙基和叔丁基)及其甘油單酯和甘油二酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞油酸酉旨等)(Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarryierSystems,1991,p.92;Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1990,7,1-33;ElHaririetal，J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。膽汁鹽膽汁的生理作用包括促進(jìn)脂質(zhì)和脂溶性維生素的分散和吸收(Brunton,Chapter38in:Goodman&Gilman，sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,9thEd,HardmanetalEds"McGraw-Hill,NewYork,1996,pp.934-935)。各種天然膽汁鹽及其合成衍生物作為滲透增強(qiáng)劑起作用。因此術(shù)語(yǔ)"膽汁鹽"包括膽汁中天然存在的任何成分及任何其合成的衍生物。本發(fā)明的膽汁鹽包括，例如膽酸(或其藥學(xué)上可接受的鈉鹽，膽酸鈉)、脫氫膽酸(脫氫膽酸鈉)、脫氧膽酸(脫氧膽酸鈉)、葡糖膽酸(葡糖膽酸鈉)、甘油膽酸(甘油膽酸鈉)、甘油脫氧膽酸(甘油脫氧膽酸鈉)、?；悄懰?牛磺膽酸鈉)、牛磺脫氧膽酸(?；敲撗跄懰徕c)、鵝脫氧膽酸(鵝脫氧膽酸鈉)、熊脫氧膽酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氫-夫西地酸鈉(STDHF)、甘油二氫夫西地酸鈉和聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(Leeetal，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,p.92;Swinyard,Chapter39in:Remington'sPharmaceuticalSciences,18thEd，Gennaro,ed.,MackCo.,Easton，Pa.Press,1990:pages782-783;Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,641990,7，1-33;Yamamotoetal,J.Pharm.Exp.Ther"1992,263,25;Yamashitaetal,J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。螯合劑所使用的與本發(fā)明有關(guān)的螯合劑可以定義為通過(guò)與金屬離子形成復(fù)合物將其從溶液中除去的化合物，其結(jié)果可加強(qiáng)通過(guò)粘膜的dsRNA的吸收。關(guān)于其在本發(fā)明中作為滲透增強(qiáng)劑的應(yīng)用，因?yàn)槎鄶?shù)經(jīng)表征的DNA核酸酶需要用于催化二價(jià)金屬離子，從而可以被螯合試劑抑制，所以螯合試劑還具有作為DNase抑制劑的附加優(yōu)勢(shì)(Jarrett,J.Chromatogr.，1993,618，315-339)。本發(fā)明的螯合試劑包括但不限于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(例如水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸酯和高香蘭酸酯(homovanilate))、膠原質(zhì)的N-酰基衍生物、聚氧乙烯-9-月桂基醚和(3-二酮的N-氨基?；苌?烯胺)(Leeetal,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,p.92;Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1990,7,1-33;Buuretal,J.ControlRel"1990,14,43-51)。非螯合的非表面活性劑本文所使用的非螯合的非表面活性的滲透增強(qiáng)化合物可以定義為不具有顯著螯合劑或表面活性劑活性，但仍可增強(qiáng)dsRNA穿過(guò)消化道粘膜的吸收(Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1990,7,1-33)。這類的滲透增強(qiáng)劑包括，例如不飽和環(huán)脲、1-烷基-氮雜環(huán)-垸酮衍生物和l-鏈烯基氮雜環(huán)-垸酮衍生物(Leeetal,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,p.92)，以及非甾體類抗炎劑，例如雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和苯基丁氮酮(Yamashitetal,J.Pharm.Pharmacol"1987,39,621-626)。在細(xì)胞水平上增強(qiáng)dsRNA攝取的試劑也可以加入到本發(fā)明的藥物組合物和其它組合物中。例如，已知陽(yáng)離子脂質(zhì)，例如Lipofectin(Junichietal，美國(guó)專利第5,705,188號(hào))、陽(yáng)離子甘油衍生物和聚陽(yáng)離子分子，例如聚賴氨酸(Lollo等人PCT申請(qǐng)WO97/30731)能增強(qiáng)dsRNA的細(xì)胞攝取。也可使用其它試劑增強(qiáng)所施用核酸的滲透，所述試劑包括二元醇，例如乙二醇和丙二醇；吡咯，例如2-吡咯；氮酮(azones)和萜類，例如檸檬烯和薄荷酮。載體本發(fā)明的某些組合物還在制劑中引入了載體化合物。本文所使用"載體化合物"或"載體"可以指惰性的(即本身不具有生物活性)但可被體內(nèi)過(guò)程認(rèn)為是核酸的核酸或其類似物，例如，所述體內(nèi)過(guò)程能夠通過(guò)降解具有生物活性的核酸或促進(jìn)其從循環(huán)系統(tǒng)中的消除來(lái)降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和載體化合物的共同施用(通常是后一種物質(zhì)過(guò)量)，能夠是由肝、腎或其它循環(huán)外臟器中回收的核酸的量大幅度減少，這可能是由于載體化合物和核酸對(duì)共有受體的競(jìng)爭(zhēng)造成的。例如，當(dāng)與聚次黃嘌呤核苷酸、葡聚糖硫酸酯、聚胞嘧啶核苷酸或4-乙酰胺基-4，異氰硫基-芪-2,2，-二磺酸共同施用時(shí)，可以減少部分硫代磷酸酯dsRNA在肝組織中的回收(Miyaoetal,AntisenseRes.Dev.,1995，5,115-121;Takakuraetal,Antisense&Nucl.AcidDrugDev.,1996，6，177-183)。賦形劑與載體化合物相比，"藥用載體"或"賦形劑"是向動(dòng)物遞送一種或多種核酸的藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑或其它任何藥學(xué)上惰性的溶劑(vehicle)。所述賦形劑可以是液體或固體，當(dāng)與核酸和特定藥物組合物的其它成分組合時(shí)，可參考預(yù)期的給藥途徑選擇賦形劑以提供所需的體積、稠度等。典型的藥用載體包括但不限于粘合劑(例如，預(yù)膠凝的玉米淀粉、聚乙烯吡咯垸酮或羥基丙烷基甲基纖維素等)，填料(例如，乳糖和其它糖、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)，潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石、二氧化硅、膠狀二氧化硅、硬脂酸、金屬的硬脂酸鹽、氫化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉等)，崩解劑(例如，淀粉、淀粉乙醇酸鈉等)，和濕潤(rùn)劑(例如，月桂基硫酸鈉等)。適合于非腸道施用的、不與核酸發(fā)生有害反應(yīng)的、藥學(xué)上可接受的有機(jī)或無(wú)機(jī)賦形劑也可以用來(lái)制備本發(fā)明的組合物。合適的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯垸酮等。用于局部施用核酸制劑可以包括無(wú)菌或非無(wú)菌的水溶液、常見(jiàn)溶劑(例如醇)的非水溶液，或在液體或固體油基質(zhì)中的核酸溶液。所述溶液還可包含緩沖液、稀釋液和其它合適的添加劑。可以使用適合于非腸道外施用的、且不與核酸發(fā)生有害反應(yīng)的、藥學(xué)上可接受的有機(jī)或無(wú)機(jī)賦形劑。合適的藥學(xué)上可接受的賦形劑包括但不限于水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。向呼吸道遞送的藥物組合物本發(fā)明的另一方面提供了向呼吸道遞送的iRNA試劑，特別用于治療囊性纖維化的iRNA試劑的遞送。呼吸道依次包括上呼吸道、下呼吸道，其中上呼吸道包括口咽部和喉部，下呼吸道依次包括氣管及支氣管和細(xì)支氣管分支。上呼吸道和下呼吸道被稱為導(dǎo)氣管。末端細(xì)支氣管進(jìn)一步分支為通向最終呼吸區(qū)(肺泡或深層肺)的呼吸細(xì)支氣管。深層肺或肺泡是用于iRNA試劑全身遞送的治療性吸入氣溶膠的主要靶標(biāo)?？梢酝ㄟ^(guò)使患者吸入懸浮物遞送經(jīng)肺遞送的組合物，由此將使噴散物中的所述組合物(優(yōu)選iRNA試劑)到達(dá)肺部，例如，容易地通過(guò)肺泡區(qū)域被直接吸收而進(jìn)入血液循環(huán)。肺部遞送對(duì)于治療肺部疾病的全身遞送和局部遞送都是有效的?？梢酝ㄟ^(guò)不同的方法實(shí)現(xiàn)肺部遞送，包括使用基于噴霧、氣溶膠、微囊和干粉的制劑，通過(guò)吸入的施用可以是經(jīng)口腔和/或經(jīng)鼻腔吸入。可以利用液體噴霧器、基于氣溶膠的吸入器和干粉噴散設(shè)備實(shí)現(xiàn)遞送。優(yōu)選使用定量設(shè)備。利用噴霧器或吸入器的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，由于該設(shè)備是自攜式(selfcontained)所以可將污染的可能性減至最小。例如，干粉噴散設(shè)備可遞送簡(jiǎn)單配制成干粉的藥物?？梢砸云渥陨韮龈煞刍蜃陨韲婌F干燥粉末的形式或與合適的粉末載體組合的形式穩(wěn)定地貯存iRNA組合物。可以通過(guò)定量定時(shí)元件(包括計(jì)時(shí)器、計(jì)量器、時(shí)間測(cè)量設(shè)備或時(shí)間指示器)進(jìn)行吸入組合物的遞送，所述元件可裝入所述設(shè)備中，從而在氣溶膠藥物的施用過(guò)程中實(shí)現(xiàn)劑量跟蹤、依從性監(jiān)測(cè)和/或患者劑量的控制。用于氣溶膠遞送的藥物設(shè)備的實(shí)例包括定量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)和空氣噴射(air-jet)噴霧器。例如，美國(guó)專利第5,756,353號(hào)、第5,858,784號(hào)和PCT申請(qǐng)W098/31346、WO98/10796、WO00/27359、WO01/54664、WO02/060412中闡述了經(jīng)簡(jiǎn)單改造后適合通過(guò)吸入向遞送受試者iRNA試劑的示例性遞送系統(tǒng)。美國(guó)專利第6,294,153號(hào)、第6,344,194號(hào)、第6,071,497號(hào)和PCT申請(qǐng)WO02/066078、WO02/053190、WO01/60420、WO00/66206中闡述了可用于iRNA試劑遞送的其它氣溶膠制劑。另外，可67以將通過(guò)吸入遞送其它寡核苷酸(例如反義寡核苷酸)的方法，例如Templinetal.，AntisenseNucleicAcidDrugDev，2000,10:359-68;Sandrasagraetal.,ExpertOpinBiolTher，2001,1:979-83;Sandrasagraetal.,AntisenseNucleicAddDrugDev,2002,12:177-81闡述的方法，改造成用于iRNA遞送的方法。本發(fā)明試劑的遞送還可以包括施用所謂"前藥"，前藥是治療性物質(zhì)的制劑或化學(xué)修飾物，其需要通過(guò)受試生物體先天性系統(tǒng)的某種形式處理或運(yùn)送以釋放治療性物質(zhì)(優(yōu)選在所需作用位點(diǎn))；后一種實(shí)施方案可以與呼吸道遞送結(jié)合使用，但也可以與本發(fā)明的其它實(shí)施方案結(jié)合使用。例如，人肺部可在數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)移或快速水解可剪切的沉積氣溶膠。在上呼吸道中，纖毛上皮的"粘膜纖毛刷(mucociliaryexcalator)"將氣管中的顆粒物清掃至口部(Pavia，D.,"LungMucociliaryClearance,"inAerosolsandtheLung:ClinicalandExperimentalAspects,Clarke,S.W.andPavia,D.,Eds"Butterworths,London,1984)。在深層肺中，顆粒物一經(jīng)沉積即可被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬(Warheitetal.MicroscopyRes.Tech"26:412-422(1993);和Brain,J.D.，"PhysiologyandPathophysiologyofPulmonaryMacrophages,"inTheReticuloendothelialSystem,S.M.ReichardandJ.Filkins,Eds"Plenum,New.York.,pp.315-327,1985)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，特別是需要對(duì)iRNA進(jìn)行全身給藥時(shí)，可將氣溶膠化的iRNA試劑配制成微顆粒。直徑為0.5微米至10微米的微顆?？梢源┻^(guò)大多數(shù)天然屏障從而滲入肺中。直徑需要小于IO微米是為了通過(guò)喉嚨，直徑需要0.5微米或更大是防止被呼出。其它成份本發(fā)明的組合物還可以包含在本領(lǐng)域常規(guī)用量的、常用于藥物組合物中的其它附加組分。因此，例如組合物可以包含具有相容性和藥學(xué)活性的其它物質(zhì)，例如止癢劑、止血?jiǎng)?、局部麻醉劑或抗炎劑，或者可以包含有利于本發(fā)明組合物的各種劑型的物理配制的其它物質(zhì)，例如染料、調(diào)味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而，當(dāng)加入時(shí)，此類物質(zhì)不應(yīng)當(dāng)過(guò)度干擾本發(fā)明組合物中成份的生物活性?？梢詫?duì)所述制劑進(jìn)行滅菌，并且如果需要的話，可將所述制劑和不與制劑中的核酸發(fā)生有害相互作用的助劑進(jìn)行混合，例如與潤(rùn)滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、緩沖液、著色劑、調(diào)味劑和/或芳香劑等混合。水懸浮液可以包含提高懸浮液粘性的物質(zhì)，包括如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。所述懸浮液還可以包含穩(wěn)定劑。本發(fā)明的特定實(shí)施方案提供了包含(a)—種或多種dsRNA試劑和(b)通過(guò)非RNA干擾機(jī)制發(fā)揮作用的一種或多種其它化療劑的藥物組合物。此類化療劑的實(shí)例包括但不限于道諾紅菌素(daimorubicin)、道諾霉素(daunomycin)、更生毒素(dactinomycin)、阿霄素、表N"毒素(epirubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、依索比星(esorubicin)、博來(lái)霉素、馬磷酰胺(mafosfamide)、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、雙氯乙基亞硝基脲(bis-chloroethylnitrosurea)、白消安、絲裂霉素C、放射菌素D、光神霉素、潑尼松(prednisone)、羥基孕酮、睪酮、它莫西芬、達(dá)卡巴嗪、甲基芐肼(procarbazine)、六甲基三聚氰胺、五甲基三聚氰胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝基脲(methylcyclohexylnitrosurea)、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-巰基鳥(niǎo)嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、羥基脲、脫氧助間型霉素(deoxycoformycin)、4-羥基過(guò)氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙堿、紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、依托泊甙(VP-16)、三甲曲沙(trimetrexate,)、依立替康(irinotecan)、拓?fù)涮婵?topotecan)、吉西^[也濱、替尼泊苷(teniposide)、順鉑和二乙基乙烯雌酚(DES)。通常參見(jiàn)TheMerckManualofDiagnosisandTherapy,15thEd.1987,pp.1206-1228,Berkowetal,eds.，Rahway,N丄。當(dāng)與本發(fā)明的化合物一起使用時(shí)，這種化療劑可以單獨(dú)使用(例如，5-FU和寡核苷酸)、依次使用(例如，使用5-FU和寡核苷酸一段時(shí)間后，再使用MTX和寡核苷酸)，或者與一種或多種其它此類化療試劑(例如，5-FU、MTX和寡核苷酸或者5-FU、放療劑和寡核苷酸)聯(lián)合使用。也可以本發(fā)明的組合物中組合使用抗炎藥物(包括但不限于非甾類抗炎藥物和皮質(zhì)甾類藥物)和抗病毒藥物(包括但不限于利巴韋林(ribivirin)、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋)。通常分別參見(jiàn)TheMerckManualofDiagnosisandTherapy,15thEd和Berkowetal，eds"1987,Rahway,N丄,pages2499-2506and46-49。其它非dsRNA化療試劑也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?？梢砸黄鹗褂没蛞来问褂脙煞N或多種組合的化合物。69可以在細(xì)胞培養(yǎng)或試驗(yàn)動(dòng)物中由標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)過(guò)程測(cè)定此類化合物的毒性和治療功效，例如測(cè)定LD50(半數(shù)致死劑量)和ED50(半數(shù)治療有效劑量)。毒性效果和治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)，并可以表示為L(zhǎng)D50/ED50比。優(yōu)選具有高治療指數(shù)的化合物。由細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動(dòng)物研究獲取的數(shù)據(jù)可以用于配制用于人的一定范圍的劑量。本發(fā)明組合物的劑量通常在包括低毒或無(wú)毒ED50的循環(huán)濃度范圍之內(nèi)。根據(jù)所采用的劑型和所使用的給藥途徑，劑量可以在此范圍之內(nèi)變化。對(duì)于本發(fā)明的方法中所使用的任意化合物，都可以首先根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)估算治療有效量。可以向動(dòng)物模型施用可達(dá)到化合物的循環(huán)血漿濃度范圍的劑量，或在適當(dāng)時(shí)施用可達(dá)到靶標(biāo)序列多肽產(chǎn)物的循環(huán)血漿濃度范圍(例如，達(dá)到降低的多肽濃度)的劑量，其中所述濃度范圍包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中所確定的IC50(即達(dá)到癥狀的半最大抑制時(shí)試驗(yàn)化合物的濃度)。此類信息可以用于更準(zhǔn)確地確定在人體中的有用劑量?？梢酝ㄟ^(guò)例如高效液相層析法測(cè)定血漿中的濃度。如上所討論的，除了單獨(dú)施用或多個(gè)一起施用，本發(fā)明的dsRNA還可以與其它已知的對(duì)治療由Aha表達(dá)介導(dǎo)的病理過(guò)程有效的試劑聯(lián)合施用。無(wú)論如何，施藥醫(yī)師可以使用本領(lǐng)域已知的或本文所闡述的常規(guī)效力測(cè)量方法，根據(jù)所觀察的結(jié)果調(diào)整dsRNA的施用量和施用時(shí)間。治療由Aha基因表達(dá)引起的疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明尤其涉及dsRNA或由其制備的藥物組合物在治療囊性纖維化中的應(yīng)用。由于具有抑制Ahal表達(dá)的作用，本發(fā)明的dsRNA或由其制備的藥物組合物可以提高囊性纖維化患者的生存質(zhì)量。另外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的dsRNA或藥物組合物在治療癌癥(例如，抑制腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤轉(zhuǎn)移)中的應(yīng)用。例如，所述dsRNA或由其制備的藥物組合物用于治療實(shí)體瘤，如乳癌、肺癌、頭頸癌、腦癌、腹癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、食道癌、胃腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、舌癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、威爾姆氏腫瘤(Wilm'stumor)、多發(fā)性骨髓瘤，以及用于治療皮膚癌，如黑色素瘤，用于治療淋巴瘤和血癌。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的dsRNA或由其制備的藥物組合物在抑制Ahal表達(dá)和/或用于抑制不同類型癌癥中腹水液和胸腔積液聚積中的應(yīng)用，所述癌癥如乳癌、肺癌、頭部癌、頸部癌、腦癌、腹癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、食道癌、胃腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、舌癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、威爾姆氏腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、皮膚癌、黑色素瘤、淋巴瘤和血癌。由于具有對(duì)Ahal表達(dá)的抑制作用，本發(fā)明的dsRNA或由其制備的藥物組合物可以提高癌癥患者的生存質(zhì)量。本發(fā)明還涉及dsRNA或其藥物組合物與其它藥物和/或其它治療方法(例如，與已知的藥物和/或已知的治療方法，如那些目前用于治療囊性纖維化或癌癥和/或用于抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移的藥物和/或方法)的聯(lián)合應(yīng)用，用于例如治療囊性纖維化或癌癥和/或抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。當(dāng)所述藥物組合物旨在治療囊性纖維化時(shí)，優(yōu)選與以下組合日常胸部物理治療、口服胰腺酶、抵抗肺感染的日?？诜蛭胧娇股亍⑽胧娇瓜委?、皮質(zhì)甾類片劑、膳食性維生素補(bǔ)充劑(特別是維生素A和D)、PulmozymeTM吸入劑、減輕便秘或提高酶補(bǔ)充劑活性的藥物、用于CF相關(guān)糖尿病的胰島素、用于CF相關(guān)肝病的藥物以及幫助呼吸的氧。當(dāng)所述藥物組合物旨在治療癌癥和/或預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)，優(yōu)選其與放療和化療試劑(例如，順鉑、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、道諾紅菌素或它莫西芬)聯(lián)合使用。本發(fā)明還可以通過(guò)包括特異性RNAi試劑與另一個(gè)抗腫瘤化療試劑(如任意常規(guī)化療試劑)組合來(lái)實(shí)現(xiàn)。特異結(jié)合試劑與此類其它試劑的組合可以增強(qiáng)化學(xué)治療方案。在考慮引入到本發(fā)明的方法時(shí)，熟練的操作者可以想到多個(gè)化學(xué)治療方案?？梢允褂萌我饣焺ㄍ榛噭?、抗代謝物、激素和拮抗劑、放射性同位素和天然產(chǎn)物。例如，本發(fā)明的化合物可以與抗生素(例如阿霉素和其它蒽環(huán)類似物)、氮芥類(例如環(huán)磷酰胺)，嘧啶類似物(例如5-氟尿嘧啶)、順鉑、羥基脲、紫杉醇以及其天然和合成衍生物等一起施用。在另一個(gè)實(shí)例中，在包括促性腺素依賴性細(xì)胞和促性腺素非依賴性細(xì)胞的混合腫瘤(例如，乳房腺癌)情況下，所述化合物可以與亮丙瑞林(leuprolide)或戈舍瑞林(goserelin，LH-RH的合成肽類似物)組合施用。其它抗腫瘤方案包括使用四環(huán)素化合物與另一種治療手段(例如手術(shù)、放射等)一起使用，在本文也被稱為"聯(lián)合抗腫瘤方式"。因此，本發(fā)明的方法可以與此類常規(guī)療法一起應(yīng)用，從而具有降低副作用并增強(qiáng)功效的效果。抑制Aha基因表達(dá)的方法在另一方面，本發(fā)明提供了抑制哺乳動(dòng)物中Aha基因表達(dá)的方法。該方法包括向哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的組合物，從而沉默靶標(biāo)Aha基因(例如Ahal)的表達(dá)。由于其高度的特異性，本發(fā)明的dsRNA特異地靶向Aha靶基因的RNA(原始的或加工后的RNA)。可以根據(jù)本文其它部分的闡述，實(shí)施利用dsRNA抑制這些Aha基因表達(dá)的組合物和方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括施用包含dsRNA的組合物，其中所述dsRNA包含與待治療哺乳動(dòng)物的Aha基因(例如Ahal)的RNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列。當(dāng)待治療的生物體為哺乳動(dòng)物(例如，人類)時(shí)，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意方式施用所述組合物，包括但不限于口服或非腸道途徑，包括靜脈、肌內(nèi)、皮下、透皮、經(jīng)氣管(氣溶膠)、鼻、直腸、陰道和局部(包括口含和舌下)施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)靜脈輸注或注射施用所述組合物。除非另有定義，否則本文所使用的所有科技術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常所理解的意思相同。雖然在本發(fā)明的實(shí)施或檢驗(yàn)中可以使用與本文所述的類似或等價(jià)的方法和材料，但下文中闡述了合適的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)，包括定義均以其全文均通過(guò)引用方式并入本文。在有沖突的情況下，以包括定義的本說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。另外，所述材料、方法和實(shí)施例的目的僅在于進(jìn)行說(shuō)明而不具有限定性。實(shí)施例Aha基因的基因步移(genewalking)進(jìn)行siRNA設(shè)計(jì)以鑒定耙向Ahal的siRNA。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析檢測(cè)人類(NM—012111.1)、小鼠(NM—146036.1)和黑猩猩(XM—510094.1)的Ahal以鑒定出19或21個(gè)核苷酸同源序列，從而產(chǎn)生在以上三個(gè)種屬間具有交叉反應(yīng)的RNAi試劑。在這些鑒定出的序列中，選出48個(gè)在大鼠中具有最小脫靶相互作用的序列(與大鼠基因組中其它任意基因至少有3個(gè)錯(cuò)配，或者與72大鼠基因組中其它任意基因至少有2個(gè)錯(cuò)配，其中所述的至少有2個(gè)錯(cuò)配中的1個(gè)錯(cuò)配位于與相應(yīng)RNAi試劑反義鏈(從5'數(shù)到3')的第9或第10位點(diǎn)互補(bǔ)的位置)，并且合成相應(yīng)的dsRNA以進(jìn)行篩選(AL-DP-7301至AL-DP-7346，見(jiàn)表1)。還合成并篩選也與小鼠(NM—146036.1)和褐家鼠(XM—223680.3)Aha2發(fā)生交叉反應(yīng)的AL-DP-7561、AL-DP-7562、AL-DP-7563和AL-DP-7564。另外，還選出40個(gè)預(yù)期在人類中具有最小脫耙相互作用的序列(與人類基因組中其它任意基因至少有3個(gè)錯(cuò)配，或者與人類基因組中其它任意基因至少有2個(gè)錯(cuò)配，其中所述的至少有2個(gè)錯(cuò)配中的1個(gè)錯(cuò)配位于與相應(yīng)RNAi試劑反義鏈(從5'數(shù)到3')的第9或第10位點(diǎn)互補(bǔ)的位置)，并且合成相應(yīng)的dsRNA以進(jìn)行篩選(AL-DP-9250至AL-DP-9289,見(jiàn)表2)。鑒定出17個(gè)序列同時(shí)屬于上述兩組(AL-DP-7301、AL-DP-7304、AL國(guó)DP畫(huà)7305、AL-DP-7307、AL-DP-7310、AL畫(huà)DP-7312、AL-DP-7315、AL-DP-7316、AL-DP隱7317、AL-DP-7323、AL-DP-7324、AL畫(huà)DP畫(huà)7332、AL國(guó)DP-7336、AL-DP畫(huà)7337、AL畫(huà)DP畫(huà)7338、AL畫(huà)DP國(guó)7342和AL-DP誦7344)。dsRNA合成試劑來(lái)源在本文中未明確指出試劑來(lái)源時(shí)，可以從任意分子生物學(xué)試劑供貨商處獲得符合分子生物學(xué)應(yīng)用的質(zhì)量/純度標(biāo)準(zhǔn)的所述試劑。siRNA合成使用Expedite8909合成儀(AppliedBiosystems,AppleraDeutschlandGmbH,Darmstadt,Germany)并使用可控孔度玻璃(CPQ500A,ProligoBiochemieGmbH,Hamburg,Germany)作為固相支持物，通過(guò)lii摩爾規(guī)模的固相合成產(chǎn)生單鏈RNA。分別使用相應(yīng)的亞磷酰胺和2'-0-甲基亞磷酰胺(ProligoBiochemieGmbH,Hamburg,Germany)通過(guò)固相合成產(chǎn)生RNA和含2'-(9-甲基核苷酸的RNA。利用標(biāo)準(zhǔn)的核苷亞磷酰胺化學(xué)法(例如，Currentprotocolsinnucleicacidchemistry,Beaucage,S丄.etal.(Edrs.)，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,NY,USA所述)，將這些構(gòu)件單元引入寡核苷酸鏈序列中的選定位點(diǎn)。將碘氧化劑溶液替換成Beaucage試劑(ChruachemLtd,Glasgow,UK)的乙73腈溶液(1%)以引入硫代磷酸酯鍵。其它助劑可由MallinckrodtBaker(Griesheim，Germany)獲得。根據(jù)常規(guī)方法，通過(guò)陰離子交換HPLC進(jìn)行寡核苷酸粗品的脫保護(hù)和純化。利用分光光度計(jì)(DU640B,BeckmanCoulterGmbH,Unterschleil3heim，Germany)通過(guò)在260nm波長(zhǎng)下各RNA溶液的UV吸收測(cè)定收率和濃度。通過(guò)在退火緩沖液(20mM磷酸鈉，pH6.8;100mM氯化鈉)中混合等摩爾互補(bǔ)鏈，在85-9(TC的水浴中加熱3分鐘并在3-4小時(shí)內(nèi)冷卻至室溫，生成雙鏈RNA。退火的RNA溶液在-2(TC儲(chǔ)存直至使用。為了合成3'-偶聯(lián)膽固醇的siRNA(本文中稱為-Chol-3')，在RNA合成中使用適當(dāng)修飾的固體支持物。通過(guò)以下方法制備所述修飾的固體支持物2-氮雜丁烷-l,4-二羧酸二乙酯AA將4.7M的氫氧化鈉水溶液(50mL)加入到經(jīng)攪拌、冰冷卻的甘氨酸乙酯鹽酸鹽(32.19g,0.23摩爾)的水溶液(50mL)中。隨后，加入丙烯酸乙酯(23.1g,0.23摩爾)并在室溫下攪拌混合物直至通過(guò)TLC確認(rèn)反應(yīng)完成。19小時(shí)后，使用二氯甲烷(3X100mL)使溶液分層。使用無(wú)水硫酸鈉干燥有機(jī)層、過(guò)濾并蒸除溶劑。蒸餾殘留物以獲得AA(28.8g,6m)。3-{乙氧基羰甲基-[6-(附-芴-9-基-甲氧基羰基-氨基)-己酰基]-氨基}-丙酸乙酯AB<formula>formulaseeoriginaldocumentpage74</formula>將Fmoc-6-氨基-己酸(9.12g,25.83mmol)溶解于二氯甲烷(50mL)中，并用冰冷卻。在0。C下，向所得溶液巾加入二異丙基碳二亞胺(3.25g,3.99mL，25.83mmol)。隨后，加入氮雜丁烷-1,4-二羧酸乙酯(5g,24.6mmol)和二甲基氨基吡啶(0.305g,2.5mmol)。使所得溶液達(dá)到室溫，并進(jìn)一步攪拌6小時(shí)。通過(guò)TLC確定反應(yīng)完成。真空濃縮反應(yīng)混合物并加入乙酸乙酯以沉淀二異丙基脲。過(guò)濾懸浮液。使用5%鹽酸水溶液、5%碳酸氫鈉和水清洗濾液。使用硫酸鈉干燥合并的有機(jī)層并將其濃縮，得到粗產(chǎn)物，通過(guò)柱層析(50%EtOAC/己烷)純化粗產(chǎn)物獲得U.87gAB(88%)。3-[(6-氨基-己酰萄-乙氧基羰甲基-氨蜀-丙酸乙酯AQ在(TC下，將3-{乙氧基羰甲基-[6-(姐-芴-9-基甲氧基羰基-氨基)-己?；鵠-氨基}-丙酸乙酯AB(11.5g，21.3mmol)溶解于含20%哌啶的二甲基甲酰胺溶液中。將溶液持續(xù)攪拌l小時(shí)。真空濃縮反應(yīng)混合物，向殘留物中添加水并使用乙酸乙酯萃取所得產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成其鹽酸鹽而進(jìn)行純化。3-({6-[17-(1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2，3，4,7，8，9,10，11，12,13，14，15，16，17-十四氫-lH-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基-氧基羰基氨基]-己酰基}乙氧基羰甲基-氨基)-丙酸乙酯AH75AD將3-[(6-氨基-己?；?-乙氧基羰甲基-氨基]-丙酸乙酯AC的鹽酸鹽(4.7g，14.8mmol)加入二氯甲垸中。將懸浮液在冰上冷卻至0°C。向懸浮液中添加二異丙基乙胺(3.87g,5.2mL,30mmol)。向所得溶液中添加氯甲酸膽固醇酯(6.675g,14.8mmo1)。將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜。使用二氯甲烷稀釋反應(yīng)混合物并使用10%鹽酸洗漆。通過(guò)快速層析純化產(chǎn)物(10.3g，92。/。)。1-{6-[17-(1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4，7,8，9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-lH-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基-氧基羰基氨萄-己?；鶀-4-氧代-吡咯垸-3-羧酸乙酯AE在30mL干甲苯中使叔丁醇鉀(l.lg，9.8mmol)成漿狀。將所得混合物在冰上冷卻至0。C，并在攪拌下于20分鐘內(nèi)加入5g(6.6mmol)AD二酯。在添加過(guò)程中將溫度保持在5"C以下。在(TC下持續(xù)攪拌30分鐘，并加入lmL冰醋酸，隨后立即加入含4gNaH2P(VH2O的40mL水。將所得混合物由二氯甲烷萃取兩次(每次100mL)，使用磷酸鹽緩沖液將合并的有機(jī)萃取物洗滌兩次(每次10mL)，干燥并蒸發(fā)至干。將殘留物溶解于60mL甲苯中，冷卻至0。C并由三份50mLpH9.5的冷碳酸鹽緩沖液進(jìn)行萃取。使用磷酸將水性萃取物調(diào)整至pH3，并使用5份40mL氯仿進(jìn)行萃取，將萃取液合并、干燥并蒸發(fā)至干。使用25。/。乙酸乙酯/己烷通過(guò)柱層析純化得到1.9gb-酮酯(39%)。-氨基甲酸17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7,8,9,10，11,12，13,14，15，16,17-十四氫-111-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基酯MAF在1小時(shí)內(nèi)將甲醇(2mL)滴加到含b-酮酯AE(1.5g,2.2mmol)和硼氫化鈉(0.226g,6mmol)的四氫呋喃(10mL)回流混合物中。在回流溫度下持續(xù)攪拌1小時(shí)。冷卻至室溫后，加入lNHCl(12.5mL)，用乙酸乙酯(3X40mL)萃取所得混合物。使用無(wú)水硫酸鈉干燥合并的乙酸乙酯層，真空濃縮，柱層析(10%MeOH/CHCl3)純化，得到產(chǎn)物(89°/。)。(6_{3-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲萄-4-羥基,咯垸-1-基}-6-氧代-己基)-氨基甲酸17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2,3,4，7,8，9，10，11,12,13,14,15,16，17-十四氫-111-環(huán)戊二'烯并[a]菲-3-基酯AS77AG在真空下與吡啶(2X5mL)—起蒸發(fā)從而干燥AF二醇(1.25gm1.994mmol)。在攪拌下加入無(wú)水吡啶(IOmL)和4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(0.724g,2.13mmol)。在室溫下反應(yīng)過(guò)夜。通過(guò)加入甲醇終止反應(yīng)。真空濃縮反應(yīng)混合物，并向殘留物加入二氯甲垸(50mL)。用1M碳酸氫鈉水溶液洗滌有機(jī)層。使用無(wú)水硫酸鈉干燥有機(jī)層、過(guò)濾并濃縮。通過(guò)與甲苯進(jìn)行蒸發(fā)除去殘留的吡啶。通過(guò)柱層析(2。/。MeOH/氯仿，在5。/。MeOH/CHCl3中，1^=0.5)純化粗產(chǎn)物(1.75g，95%)。琥珀酸單-(4-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-1-{6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7，8，9,10,ll,12,13，14,15,16，17-十四氫-lH-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基-氧基羰基氨基]-己?；?-吡咯烷-3-基)酯AHAH將化合物AG(1.0g,1.05mmol)與琥珀酸酐(0.150g,1.5mmol)和DMAP(0.073g，0.6mmol)混合并在40。C下真空干燥過(guò)夜。將所得混合物溶解于無(wú)水78二氯乙烷(3mL)中，加入三乙胺(0.318g，0.440mL，3.15mmol)，并在室溫和氬氣氣氛中將所得溶液攪拌16小時(shí)。隨后，使用二氯甲垸(40mL)稀釋，并使用冰冷的檸檬酸水溶液(5wt%，30mL)和水(2X20mL)洗滌。使用無(wú)水硫酸鈉干燥有機(jī)相，并濃縮至干。將所得殘留物直接用于下一個(gè)步驟。膽固醇衍生的CPGAIAI將琥珀酸酯AH(0.254g,0.242mmol)溶解于二氯甲烷/乙腈的混合物(3:2，3mL)中。向所得溶液中連續(xù)加入DMAP(0.0296g，0.242mmol)的乙腈溶液(1.25mL)、2,2'-二硫代-雙(5-硝基吡啶)(0.075g，0.242mmol)的乙腈/二氯乙垸(3:1,1.25mL)溶液。向所得溶液中加入三苯基膦(0.064g，0.242mmol)的乙腈溶液(0.6ml)。反應(yīng)混合物的顏色變?yōu)榱脸壬?。使用手?dòng)震蕩器短暫地?cái)嚢枞芤?5分鐘)。加入長(zhǎng)鏈烷基胺-CPG(LCAA-CPG)(1.5g,61mM)。將懸浮液攪拌2小時(shí)。通過(guò)燒結(jié)漏斗過(guò)濾CPG，并依次使用乙腈、二氯甲烷和乙醚洗滌。利用乙酸酐/吡啶掩蔽未反應(yīng)的氨基基團(tuán)。采用UV測(cè)量法計(jì)算所獲取的CPG的載量(37mM/g)。根據(jù)WO2004/065601中的描述合成具有5'-12-月桂酸雙癸酰胺基團(tuán)(本文稱為"5'-C32-")或5'-膽固醇基衍生基團(tuán)(本文稱為"5'-Chol-")的siRNA，不同的是，對(duì)于膽固醇基衍生物，使用Beaucage試劑進(jìn)行氧化步驟以在核酸寡聚物的5'末端引入硫代磷酸酯鍵。使用標(biāo)準(zhǔn)命名法，特別是表2的縮寫(xiě)來(lái)表示以下核酸序列。表3:在核酸序列表示法中所使用的核苷酸單體的縮寫(xiě)?？梢岳斫膺@些單體存在于寡核苷酸中時(shí)通過(guò)5，-3，-磷酸二酯鍵相互連接?？s寫(xiě)a核苷酸A,a2'-脫氧-腺苷-5'-磷酸酯，腺苷-5'-磷酸酯C,c2'-脫氧-胞苷-5'-磷酸酯，胞苷-5'-磷酸酯Gg2'-脫氧-鳥(niǎo)苷-5'-磷酸酯，鳥(niǎo)苷-5'-磷酸酯T,t2'-脫氧-胸苷-5'-磷酸酯，胸苷-5'-磷酸酯U,u2'-脫氧-尿苷-5'-磷酸酯，尿苷-5'-磷酸酯N,n任意2'-脫氧-核苷酸/核苷酸(QA，C或T,g,a，c或u)Am2'-0-甲基腺苷-5'-磷酸酯Cm2'-0-甲基胞苷-5'-磷酸酯Gm2'-0-甲基鳥(niǎo)苷-5'-磷酸酯Tmr-0-甲基-胸苷-5，-磷酸酯Um2'-0-甲基尿苷-5'-磷酸酯Af2'-氟-2'-脫氧-腺苷-5'-磷酸酯Cf2'-氟-2'-脫氧-胞苷-5'-磷酸酯Gf2'-氟-2'-脫氧-鳥(niǎo)苷-5'-磷酸酯Tf2'-氟-2'-脫氧-胸苷-5'-磷酸酯Uf2'-氟-2'-脫氧-尿苷-5'-磷酸酯A，C,G,T，U，a,c，g，t，下劃線核苷-5'-硫代磷酸酯am,cm,gm,tm,um下劃線2-6)-甲基-核苷-5'-硫代磷酸酯大寫(xiě)字母表示2'-脫氧核糖核酸(DNA)，小寫(xiě)字母表示核糖核酸(RNA)dsRNA表達(dá)載體在本發(fā)明的另一方面，由插入到DNA或RNA載體的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)調(diào)節(jié)Ahal基因表達(dá)活性的Ahal特異性dsRNA分子(參見(jiàn)，例如Couture,A,etal.,77G(1996),12:5-10;Skillem，A.，etal.，國(guó)際PCT公開(kāi)號(hào)WO00/22113;Conrad,國(guó)際PCT公開(kāi)號(hào)WO00/22114和Conrad，美國(guó)專利第6,054,299號(hào))。可將這些轉(zhuǎn)基因作為線性構(gòu)建物、環(huán)狀質(zhì)粒或病毒載體引入，并可以作為整合到宿主基因組的轉(zhuǎn)基因使其并入基因中進(jìn)行遺傳。也可構(gòu)建所述轉(zhuǎn)基因使其作為染色體外質(zhì)粒進(jìn)行遺傳(Gassmann,etal.,iVoc.A^/.Jcad80(1995)92:1292)?？赏ㄟ^(guò)位于共轉(zhuǎn)染到同一耙細(xì)胞的兩個(gè)單獨(dú)表達(dá)載體上的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄dsRNA的兩條單鏈?；蛘撸ㄟ^(guò)位于同一表達(dá)質(zhì)粒的兩個(gè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄dsRNA的各條單鏈。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將dsRNA表達(dá)為通過(guò)多核苷酸序列接頭連接的反向重復(fù)，從而使所述dsRNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。重組dsRNA表達(dá)載體通常為DNA質(zhì)?；虿《据d體。表達(dá)dsRNA的病毒載體可以基于但不限于腺相關(guān)病毒(綜述可參見(jiàn)Muzyczka,etal.,7bp/csM/cra./www"o/.(1992)158:97-129))、腺病毒(參見(jiàn)，例如Berkner,etal.,BioTechniques(1998)6:616);Rosenfeldetal.(1991,Science252:431-434),andRosenfeldetal.(1992),Ce〃68:143-155))或甲病毒以及其它本領(lǐng)域已知的病毒進(jìn)行構(gòu)建?，F(xiàn)已使用逆轉(zhuǎn)錄病毒將多種基因引入到包括上皮細(xì)胞在內(nèi)的體外和/或體內(nèi)的多種不同細(xì)胞類型中(參見(jiàn)，例如Eglitis,etal.,5We"ce(1985)230:1395-1398;DanosandMulligan,iVa"Jcad5W.(1998)85:6460-6464;Wilsonetal.,1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:3014-3018;A畫(huà)ntanoetal.，1990,Proc.Natl,Acad.Sci.USA87:61416145;Huberetal"1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8039-8043;Ferryetal.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8377-8381;Chowdhuryetal.,1991,Science254:1802-1805;vanBeusechem.etal.，1992,Proc.Nad.Acad.Sci.USA89:7640-19;Kayetal"1992,HumanGeneTherapy3:641-647;Daietal.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10892-10895;Hwuetal.，1993,J.Immunol.150:4104-4115;美國(guó)專利第4,868,116號(hào)；美國(guó)專利第4,980,286號(hào)；PCT申請(qǐng)WO89/07136;PCT申請(qǐng)WO89/02468;PCT申請(qǐng)WO89/05345;和PCT申請(qǐng)WO92/07573)?？梢酝ㄟ^(guò)將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組轉(zhuǎn)染到合適的包裝細(xì)胞系(例如，A317和Psi-CRIP)中從而產(chǎn)生能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)并表達(dá)插入到細(xì)胞基因組中基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Cometteetal.，1991,HumanGeneTherapy2:5-10;Coneetal.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6349)。重組腺病毒載體可以用于感染易感宿主(例如，大鼠、倉(cāng)鼠、狗和黑猩猩)中的多種細(xì)胞和組織(Hsuetal.,1992，J.InfectiousDisease,166:769)，并且具有不需要用于感染的有絲分裂活性細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明DNA質(zhì)粒或病毒載體中驅(qū)動(dòng)dsRNA表達(dá)的啟動(dòng)子可以是真核81RNA聚合酶I(例如，核糖體RNA啟動(dòng)子)、RNA聚合酶II(例如，CMV早期啟動(dòng)子或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或UlsnRNA啟動(dòng)子)，或通常為RNA聚合酶m啟動(dòng)子(例如，U6snRNA或7SKRNA啟動(dòng)子)或者原核啟動(dòng)子(例如，T7啟動(dòng)子)，前提是該表達(dá)質(zhì)粒還編碼T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄所需的T7RNA聚合酶。所述啟動(dòng)子還可以引導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在胰腺的表達(dá)(參見(jiàn)，例如胰腺的胰島素調(diào)控序列，(Bucchinietal.,1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:2511-2515))。另外，可以通過(guò)利用如可誘導(dǎo)的調(diào)控序列和表達(dá)系統(tǒng)精確調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，例如通過(guò)使用對(duì)特定生理調(diào)節(jié)劑(例如，循環(huán)系統(tǒng)葡萄糖濃度或激素)敏感的調(diào)控序列進(jìn)行調(diào)控(Dochertyetal.，1994,FASEBJ.8:20-24)。適合在細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)包括通過(guò)蛻皮激素、雌激素、孕酮、四環(huán)素、二聚作用的化學(xué)誘導(dǎo)劑和異丙基-卩-Dl-硫代半乳糖吡喃糖苷(EPTG)進(jìn)行的調(diào)控。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠根據(jù)dsRNA轉(zhuǎn)基因的期望用途選擇適當(dāng)?shù)恼{(diào)控/啟動(dòng)子序列。通常，如下文所述將表達(dá)dsRNA分子的重組載體遞送到并保留在靶細(xì)胞中?；蛘?，可使用提供dsRNA分子瞬時(shí)表達(dá)的病毒載體。如果需要，可以重復(fù)施用此類載體。所述dsRNA—經(jīng)表達(dá)即與靶標(biāo)RNA結(jié)合并調(diào)節(jié)其功能或表達(dá)?？梢匀硇缘剡f送表達(dá)dsRNA的載體，例如通過(guò)靜脈或肌肉內(nèi)施用，通過(guò)施用于來(lái)自患者的外植耙細(xì)胞隨后將其重新引入到患者體內(nèi)，或可將其引入到所需靶細(xì)胞的任意其它方式進(jìn)行遞送。通常將表達(dá)dsRNA的DNA質(zhì)粒與陽(yáng)離子脂質(zhì)載體(例如，Oligofectamine)或基于脂質(zhì)的非陽(yáng)離子載體(例如，Transit-TKOTM)—起作為復(fù)合體轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞中。預(yù)期本發(fā)明的多重脂質(zhì)轉(zhuǎn)染可在一周或更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)對(duì)單個(gè)Ahal基因的不同區(qū)域或多個(gè)Ahal基因進(jìn)行dsRNA介導(dǎo)的靶向敲除。可使用多種已知方法監(jiān)測(cè)本發(fā)明載體向宿主細(xì)胞的成功引入。例如，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中，可使用報(bào)告子，例如熒光標(biāo)記(例如，綠色熒光蛋白(GFP))發(fā)出信號(hào)?？墒褂孟蜣D(zhuǎn)染細(xì)胞提供對(duì)特定環(huán)境因子(例如，抗生素和藥物)抗性，例如，潮霉素B抗性的標(biāo)記，從而確保離體細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。也可將Ahal特異性dsRNA分子插入到載體中并作為基因治療載體用于人類患者。例如，可以通過(guò)靜脈注射、局部施用(參見(jiàn)美國(guó)專利第5,328,470號(hào))，或者通過(guò)立體定位注射(參見(jiàn)，例如Chenetal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054-3057)將基因治療載體遞送至受試者中。基因治療載體的藥物制劑可以包括基因治療載體的可接受稀釋液溶液，或者可以包含包埋有基因遞送載體的慢釋(slowrelease)基質(zhì)。在可以完整地從重組細(xì)胞中產(chǎn)生完全基因遞送載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)時(shí)，所述藥物制劑也可以包含一種或多種產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞。AhalsiRNA體外篩選在HeLa細(xì)胞和MLE12細(xì)胞中的單劑量篩選從美國(guó)典型菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)獲取HeLa細(xì)胞(Rockville,MD，cat.No.HB-8065)，并且在37。C、5%0)2氣氛的條件下，將其培養(yǎng)在加濕培養(yǎng)箱(HeraeusHERAcell,KendroLaboratoryProducts,Langenselbold,Germany)中的補(bǔ)充有10%胎牛血清(FCS)(BiochromBerlin,Germany,cat.No.S0115)、100U/ml青霉素、100pg/ml鏈霉素(BiochromAGBerlin,Germany,cat.No.A2213)的Ham'sF12(BiochromAG,Berlin,Germany,cat.No.FG0815)中。從美國(guó)典型菌種保藏中心獲取MLE12細(xì)胞(Rockville，MD，cat.No.CRL-2110),并且在37°C、5。/。C02氣氛的條件下，將其培養(yǎng)在加濕培養(yǎng)箱(HeraeusHERAcell，KendroLaboratoryProducts,Langenselbold,Germany)中的補(bǔ)充有2%胎牛血清(FCS)(BiochromBerlin,Germany,cat.No.S0115)、100U/ml青霉素、100pg/ml鏈霉素(BiochromBerlin,Germany,cat.No.A2213)、4mML-谷氨酰胺(BiochromBerlin,Germany,cat.No:K0282)、lx胰島素/運(yùn)鐵蛋白/亞硒酸鈉(Na-Selenit)(Gibco:51500-056)、10nM皮質(zhì)醇(SigmaMunich,Germany,cat.No:H6909)、10nMfi-雌二醇(SigmaMunich,Germany,cat.No:E2257)和10mMHEPES(USBEuropeGmBH,Staufen,GermanycatNo.:16926)的HITES培養(yǎng)基(以1:1混合的Dulbecco，sMEM(BiochromAQBerlin,Germany,cat.No:F0435)+Ham'sF12(BiochromAQBerlin,Germany,cat.No:FG0815))中。轉(zhuǎn)染和mRNA的定量為了進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，將HeLa細(xì)胞和MLE12細(xì)胞以2.(^104細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中，并進(jìn)行直接轉(zhuǎn)染。根據(jù)制造商的描述使用83lipofectamine2000(InvitrogenGmbH,Karlsruhe,Germany,cat.No.11668-019)進(jìn)行siRNAGOnM)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，裂解細(xì)胞，并根據(jù)制造商的方案使用QuantigeneExplore試齊!]盒(Genosprectra,DumbartonCircleFremont,USA,cat.No.QG-000-02)對(duì)AhalmRNA水平進(jìn)行定量。相對(duì)于GAP-DHmRNA的水平對(duì)AhalmRNA水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。獲取每條siRNA的讀取數(shù)據(jù)(一式四份)。使用與Ahal基因無(wú)關(guān)的siRNA雙鏈作為對(duì)照。給定Ahal特異性siRNA雙鏈的活性表示為經(jīng)處理細(xì)胞中的AhalmRNA濃度相對(duì)于使用對(duì)照siRNA雙鏈處理的細(xì)胞中的AhalmRNA濃度的百分比。表4:在定量人類(hs)Ahal的過(guò)程中與QuantigeneExplore試劑盒(Genospectra)—起使用的探針序列__<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>表5:在定量小鼠(mm)Ahal的過(guò)程中與QuantigeneExplore試劑盒(Genospectra)一起使用的探針序列<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>HeLa細(xì)胞的劑量響應(yīng)曲線轉(zhuǎn)染和mRNA定量為了進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，將HeLa細(xì)胞以2.(^104細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中，并進(jìn)行直接轉(zhuǎn)染。根據(jù)制造商的描述使用lipofectamine2000(InvitrogenGmbH,Karlsruhe,Germany,cat.No.11668-019)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。使用三倍稀釋法將siRNA從30nM濃縮至14pM。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，裂解細(xì)胞，并根據(jù)制造商的方案使用QuantigeneExplore試劑盒(Genosprectra,DumbartonCircleFremont,USA,cat.No.QG-000-02)對(duì)AhalmRNA水平進(jìn)行定量。相對(duì)于GAP-DHmRNA的水平對(duì)AhalmRNA水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(歸一化)。針對(duì)每條siRNA，收集4個(gè)單獨(dú)的數(shù)據(jù)點(diǎn)。使用與Ahal基因無(wú)關(guān)的siRNA雙鏈作為對(duì)照。將給定Ahal特異性siRNA雙鏈的活性表示為經(jīng)處理細(xì)胞中的AhalmRNA濃度相對(duì)于使用對(duì)照siRNA雙鏈處理的細(xì)胞中的AhalmRNA濃度的百分比。使用XL-fit計(jì)算IC5G值。表6提供本發(fā)明的各dsRNA分子對(duì)Ahal表達(dá)的抑制值。表6:經(jīng)Ahal特異性RNAi試劑的30nM溶液處理后HeLa和MLE12細(xì)胞中殘留AhalmRNA的百分比(與對(duì)照之比)，以及在HeLa細(xì)胞中測(cè)定的所選RNAi試劑的IC50雙鏈名稱HeLa細(xì)胞中殘留的mRNA[%]HeLa細(xì)胞中的IC50[nM]MLE12細(xì)胞中殘留的mRNA[%]AL-DP-729919士3105土17AL-DP-73007±294±13AL-DP-73013±10.03514±3AL-DP-730217±561±16AL-DP-73035±223±5AL-DP-73047±330±7AL-DP-73056士226±6AL-DP-730627±845±11AL-DP-730716±61.127±8AL-DP-730813±50.2120±7AL-DP-730910±30.3622±8AL-DP-731051±1359±13AL-DP-73114±30.0716±4AL-DP-731214±340±8AL-DP-731363±1480±10AL-DP-731497±2188±10AL-DP-731576±2477±10AL-DP-73167士20,3423±6AL-DP-731711±344±12AL-DP-73184±20.2916±386<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>AL-DP-925219±2AL-DP-925311±1AL-DP-92547±1AL-DP-92555±0AL-DP-92565±0AL-DP-92577±0AL-DP-92589±1AL-DP-92597±1AL-DP-926015±3AL-DP-926121±2AL-DP-926224±4AL-DP-926325±6AL-DP-92647±2AL-DP-92658±1AL-DP-926611±2AL-DP-926745±4AL-DP-92689±1AL-DP-92695±1AL-DP-92706±1AL-DP-92716士2AL-DP-927226±8AL-DP-927311±1AL-DP-92747±1AL-DP-92758±1AL-DP-92764±1AL-DP-927710±1AL-DP-92782±0AL-DP-92793±0AL-DP-928012±1AL-DP-92818±288<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>總之，AL-DP-7301、AL-DP-7308、AL-DP-7318、AL-DP-7320、AL-DP-7322、AL-DP-7324、AL-DP-7325、AL-DP-7326、AL-DP-7327、AL-DP-7329、AL-DP-7331、AL-DP-7333、AL-DP-7340和AL-DP-7342對(duì)HeLa細(xì)胞和MLE12細(xì)胞中的Ahal表達(dá)至少抑制80%;AL-DP-7303、AL-DP-7305、AL-DP-7307、AL-DP-7309、AL-DP-7316和AL-DP-7337對(duì)HeLa細(xì)胞中的Ahal表達(dá)至少抑制80%，對(duì)MLE12細(xì)胞中的Ahal表達(dá)至少抑制70%;AL-DP-7304、AL-DP-7312、AL-DP-7339和AL-DP-7344對(duì)HeLa細(xì)胞中的Ahal表達(dá)至少抑制80%，對(duì)MLE12細(xì)胞中的Ahal表達(dá)至少抑制60%;AL-DP-7306、AL-DP-7317和AL-DP-7346對(duì)HeLa細(xì)胞中的Ahal表達(dá)至少抑制70%,對(duì)MLE12細(xì)胞中的Ahal表達(dá)至少抑制50%;AL-DP-7310、AL-DP-7323、AL-DP-7335、AL-DP-7338和AL-DP-7341對(duì)HeLa細(xì)胞和MLE12細(xì)胞中的Ahal表達(dá)至少抑制40%;AL-DP-7302、AL-DP-7315、AL-DP-7328、AL-DP-7330、AL-DP-7336和AL-DP-7345對(duì)HeLa細(xì)胞和MLE12細(xì)胞中的Ahal表達(dá)抑制至少20%。<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>AL-DP-9262、AL-DP-9263、AL-DP-9272和AL-DP-9288對(duì)HeLa細(xì)胞中的Ahal表達(dá)至少抑制70%;AL-DP-9263對(duì)HeLa細(xì)胞中的Ahal表達(dá)至少抑制60%;AL-DP-9267對(duì)HeLa細(xì)胞中的Ahal表達(dá)至少抑制50%;AL-DP-9251對(duì)HeLa細(xì)胞中的Ahal表達(dá)至少抑制40%;AL-DP-9286對(duì)HeLa細(xì)胞中的Ahal表達(dá)至少抑制30%。權(quán)利要求1.一種抑制細(xì)胞內(nèi)人Aha基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少兩個(gè)彼此互補(bǔ)的序列，并且其中正義鏈包含第一序列，反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含與編碼Aha基因的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，且其中所述dsRNA影響第二dsRNA的靶序列內(nèi)編碼Aha基因的mRNA的剪切，所述第二dsRNA具有選自下組的正義鏈SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49、SEQIDNO51、SEQIDNO53、SEQIDNO55、SEQIDNO57、SEQIDNO59、SEQIDNO61、SEQIDNO63、SEQIDNO65、SEQIDNO67、SEQIDNO69、SEQIDNO71、SEQIDNO73、SEQIDNO75、SEQIDNO77、SEQIDNO79、SEQIDNO81、SEQIDNO83、SEQIDNO85、SEQIDNO87、SEQIDNO89、SEQIDNO91、SEQIDNO93、SEQIDNO95、SEQIDNO97、SEQIDNO99、SEQIDNO101、SEQIDNO103、SEQIDNO105、SEQIDNO107、SEQIDNO109、SEQIDNO111、SEQIDNO113、SEQIDNO115、SEQIDNO117、SEQIDNO119、SEQIDNO121、SEQIDNO123、SEQIDNO125、SEQIDNO127、SEQIDNO129、SEQIDNO131、SEQIDNO133、SEQIDNO135、SEQIDNO137、SEQIDNO139、SEQIDNO141、SEQIDNO143、SEQIDNO145、SEQIDNO147、SEQIDNO149、SEQIDNO151、SEQIDNO153、SEQIDNO155、SEQIDNO157、SEQIDNO159、SEQIDNO163、SEQIDNO165、SEQIDNO167、SEQIDNO169、SEQIDNO171、SEQIDNO173、SEQIDNO175、SEQIDNO177、SEQIDNO179、SEQIDNO181和SEQIDNO183，以及與該正義鏈互補(bǔ)且選自下組的反義鏈SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50、SEQIDNO52、SEQIDNO54、SEQIDNO56、SEQIDNO58、SEQIDNO60、SEQIDNO62、SEQIDNO64、SEQIDNO66、SEQIDNO68、SEQIDNO70、SEQIDNO72、SEQIDNO74、SEQIDNO76、SEQIDNO78、SEQIDNO80、SEQIDNO82、SEQIDNO84、SEQIDNO86、SEQIDNO88、SEQIDNO90、SEQIDNO92、SEQIDNO94、SEQIDNO96、SEQIDNO98、SEQIDNO100、SEQIDNO102、SEQIDNO104、SEQIDNO106、SEQIDNO108、SEQIDNO110、SEQIDNO112、SEQIDNO114、SEQIDNO116、SEQIDNO118、SEQIDNO120、SEQIDNO122、SEQIDNO124、SEQIDNO126、SEQIDNO128、SEQIDNO130、SEQIDNO132、SEQIDNO134、SEQIDNO136、SEQIDNO138、SEQIDNO140、SEQIDNO142、SEQIDNO144、SEQIDNO146、SEQIDNO148、SEQIDNO150、SEQIDNO152、SEQIDNO154、SEQIDNO156、SEQIDNO158、SEQIDNO160、SEQIDNO164、SEQIDNO166、SEQIDNO168、SEQIDNO170、SEQIDNO172、SEQIDNO174、SEQIDNO176、SEQIDNO178、SEQIDNO180、SEQIDNO182和SEQIDNO184。2.如權(quán)利要求1所述的dsRNA，其中所述Aha基因?yàn)锳hal基因，優(yōu)選為人類Ahal基因。3.如權(quán)利要求1或2所述的dsRNA，其中所述dsRNA與表達(dá)Aha基因的細(xì)胞接觸，則使所述細(xì)胞內(nèi)所述Aha基因的表達(dá)至少抑制20%。4.如權(quán)利要求3所述的dsRNA，其中在HeLa細(xì)胞和/或MLE12細(xì)胞中獲得對(duì)Aha基因表達(dá)的至少20%的抑制。5.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的dsRNA，其中所述dsRNA選自下組AL-DP-7301、AL-DP-7308、AL-DP-7318、AL-DP-7320、AL畫(huà)DP醫(yī)7322、AL-DP-7324、AL-DP-7325、AL-DP-7326、AL-DP-7327、AL-DP-7329、AL匿DP-7331、AL畫(huà)DP畫(huà)7333、AL-DP-7340、AL-DP-7342、AL-DP-7303、AL-DP-7305、AL-DP-7307、AL-DP-7309、AL-DP-7316和AL-DP-7337、AL-DP-7304、AL-DP-7312、AL-DP-7339、AL-DP-7344、AL-DP-7306、AL-DP-7317、AL-DP-7346、AL-DP-7310、AL-DP-7323、AL-DP-7335、AL誦DP國(guó)7338、AL-DP-7341、AL-DP-7302、AL-DP-7315、AL-DP-7328、AL-DP-7330AL-DP-9252AL-DP-9257AL-DP-9262AL-DP-9267AL-DP-9272AL-DP-9277AL-DP-9283AL-DP-7336AL-DP-9253AL-DP-9258AL-DP-9263AL-DP-9268AL-DP-9273AL-DP-9279AL-DP-9284AL-DP-9250AL-DP-9255AL-DP-9260AL-DP-9265AL-DP-9270AL-DP-9275AL-DP-9281AL-DP-9286AL-DP-9251、AL-DP-9256、AL-DP-9261、AL-DP-9266、AL-DP-9271、AL-DP-9276、AL-DP-9282、AL-DP-9287、>AL-DP-7345AL-DP-9254、AL-DP-9259、AL-DP-9264、AL-DP-9269、AL-DP-9274、AL-DP-9280、AL-DP-9285AL-DP-9288和AL-DP-9289。6.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一個(gè)修飾核苷酸。7.如權(quán)利要求6所述的dsRNA，其中所述修飾核苷酸選自下組2'-0-甲基修飾核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團(tuán)的核苷酸以及與膽固醇衍生物或十二酸雙癸酰胺基團(tuán)連接的末端核苷酸。8.如權(quán)利要求6所述的dsRNA，其中所述修飾核苷酸選自下組2'-脫氧-2'-氟代修飾核苷酸、2'-脫氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸、無(wú)堿基核苷酸、2'-氨基-修飾核苷酸、2，-烷基-修飾核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然堿基的核苷酸。9.包含如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的dsRNA的細(xì)胞。10.抑制生物體內(nèi)Aha基因表達(dá)的藥物組合物，其包含dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述dsRNA包含至少兩條彼此互補(bǔ)的序列，并且其中正義鏈包含第一序列，反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含與編碼Aha基因的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，且其中所述dsRNA影響第二dsRNA的靶序列內(nèi)編碼Aha基因的mRNA的剪切，所述第二dsRNA具有選自下組的正義鏈SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、SEQIDNO:149、SEQIDNO:151、SEQIDNO:153、SEQIDNO:155、SEQIDNO:157、SEQIDNO:159、SEQIDNO:163、SEQIDNO:165、SEQIDNO:167、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171、SEQIDNO:173、SEQIDNO:175、SEQIDNO:177、SEQIDNO:179、SEQIDNO:181和SEQIDNO:183，以及與該正義鏈互補(bǔ)且選自下組的反義鏈SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、SEQIDNO:150、SEQIDNO:152、SEQIDNO:154、SEQIDNO:156、SEQIDNO:158、SEQIDNO:160、SEQIDNO:164、SEQIDNO:166、SEQIDNO:168、SEQIDNO:170、SEQIDNO:172、SEQIDNO:174、SEQIDNO:176、SEQIDNO:178、SEQIDNO:180、SEQIDNO:182和SEQIDNO:184。11.如權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中所述Aha基因?yàn)锳hal基因，優(yōu)選為人類Ahal基因。12.如權(quán)利要求10或11所述的藥物組合物，其中所述dsRNA與表達(dá)Aha基因的細(xì)胞接觸，則使細(xì)胞內(nèi)所述Aha基因的表達(dá)至少抑制20%。13.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中在HeLa細(xì)胞和/或MLE12細(xì)胞中獲得對(duì)Aha基因表達(dá)的至少20n/。的抑制。14.如權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述dsRNA選自下組AL-DP-7301、AL畫(huà)DP畫(huà)7308、AL-DP-7318、AL隱DP誦7320、AL-DP-7322、AL-DP-7324、AL-DP-7325、AL-DP-7326、AL-DP-7327、AL-DP-7329、AL畫(huà)DP-7331、AL-DP-7333、AL-DP-7340、AL-DP-7342、AL-DP-7303、AL-DP-7305、AL-DP-7307、AL-DP-7309、AL-DP-7316和AL畫(huà)DP-7337、AL-DP-7304、AL-DP-■7312、AL國(guó)DP-■7339、AL畫(huà)DP-7344、AL畫(huà)DP-7306、AL畫(huà)DP-7317、AL-DP-■7346、AL國(guó)DP-.7310、AL畫(huà)DP國(guó)7323、AL-DP-7335、AL-DP-7338、AL-DP--7341、AL畫(huà)DP-■7302、AL畫(huà)DP-7315、AL畫(huà)DP畫(huà)7328、AL-DP-7330、AL-DP-■7336、AL-DP-■7345、AL-DP誦9250、AL-DP-9251、AL-DP-9252、AL-DP-■9253、AL畫(huà)DP--9254、AL國(guó)DP-9255、AL-DP-9256、AL-DP-9257、AL隱DP--9258、AL-DP-■9259、AL-DP國(guó)9260、AL-DP-9261、AL畫(huà)DP畫(huà)9262、AL畫(huà)DP--9263、AL畫(huà)DP.-9264、AL-DP-9265、AL-DP-9266、AL-DP-9267、AL-DP--9268、AL-DP--9269、AL畫(huà)DP畫(huà)9270、AL-DP-9271、AL-DP-9272、AL-DP--9273、AL畫(huà)DP-■9274、AL-DP-9275、AL-DP-9276、AL-DP-9277、AL國(guó)DP--9279、AL-DP-9280、AL-DP-9281、AL-DP-9282、AL-DP-9283、AL畫(huà)DP--9284、AL-DP--9285、AL-DP畫(huà)9286、AL-DP-9287、AL-DP-9288和AL-DP畫(huà)9289。15.如權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述dsRNA包含至少一個(gè)修飾核苷酸。16.如權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其中所述修飾核苷酸選自下組2'-0-甲基修飾核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團(tuán)的核苷酸以及與膽固醇衍生物或十二酸雙癸酰胺基團(tuán)連接的末端核苷酸。17.如權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其中所述修飾核苷酸選自下組2'-脫氧-2'-氟代修飾核苷酸、2'-脫氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸、無(wú)堿基核苷酸、2，-氨基-修飾核苷酸、2，-烷基-修飾核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然堿基的核苷酸。18.抑制細(xì)胞內(nèi)Aha基因表達(dá)的方法，所述方法包括(a)向所述細(xì)胞引入雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少兩個(gè)彼此互補(bǔ)的序列，并且其中正義鏈包含第一序列，反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含與編碼Ahal的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，且其中所述dsRNA影響第二dsRNA的耙序列內(nèi)編碼Aha基因的mRNA的剪切，所述第二dsRNA具有選自下組的正義鏈SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、SEQIDNO:149、SEQIDNO:151、SEQIDNO:153、SEQIDNO:155、SEQIDNO:157、SEQIDNO:(159、SEQIDNO:163、SEQIDNO:165、SEQIDNO:167、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171、SEQIDNO:173、SEQIDNO:175、SEQIDNO:177、SEQIDNO:179、SEQIDNO:181和SEQIDNO:183，以及與該正義鏈互補(bǔ)且選自下組的反義鏈SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:卯、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、SEQIDNO:150、SEQIDNO:152、SEQIDNO:154、SEQIDNO:156、SEQIDNO:158、SEQIDNO:160、SEQIDNO:164、SEQIDNO:166、SEQIDNO:168、SEQIDNO:170、SEQIDNO:172、SEQIDNO:174、SEQIDNO:176、SEQIDNO:178、SEQIDNO:180、SEQIDNO:182和SEQIDNO:184;和(b)將步驟(a)得到的細(xì)胞維持足夠長(zhǎng)的時(shí)間以降解Aha基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本，從而抑制所述細(xì)胞內(nèi)Aha基因的表達(dá)。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述基因?yàn)锳hal基因，優(yōu)選為人類Ahal基因。20.如權(quán)利要求18或19所述的方法，其中所述dsRNA選自下組AL-DP-7301、AL-DP-7308、AL-DP-7318、AL-DP-7320、AL-DP-7322、AL-DP-7324、AL-DP-7325、AL-DP-7326、AL-DP-7327、AL-DP-7329、21.如權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法在體外進(jìn)行。22.—種治療、預(yù)防或控制由Aha表達(dá)介導(dǎo)的病理過(guò)程的方法，其包括給所需患者施用治療有效量或預(yù)防有效量的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少兩個(gè)彼此互補(bǔ)的序列，并且其中正義鏈包含第一序列，反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含與編碼Ahal的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，且其中所述dsRNA影響第二dsRNA的靶序列內(nèi)編碼Aha基因的mRNA的剪切，所述第二dsRNA具有選自下組的正義鏈SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述dsRNA選自下組:AL--DP--7301、AL-DP-7308、AL-DP-7318、AL-DP-7320、AL-DP-7322、AL-DP--7324、AL-DP-7325、AL-DP-7326、AL-DP-7327、AL-DP-7329、AL-DP-■7331、AL畫(huà)DP畫(huà)7333、AL-DP-7340、AL-DP-7342、AL-DP-7303、AL-DP-■7305、AL-DP-7307、AL-DP-7309、AL-DP-7316和AL-DP-7337、AL.-DP--7304、AL-DP-7312、AL-DP-7339、AL-DP-7344、AL-DP-7306、AL--DP--7317、AL-DP-7346、AL-DP-7310、AL-DP-7323、AL-DP-7335、AL--DP--7338、AL-DP-7341、AL-DP-7302、AL-DP-7315、AL-DP-7328、AL--DP--7330、AL-DP-7336、AL-DP-7345、AL-DP-9250、AL-DP-9251、AL--DP-■9252、AL-DP-9253、AL-DP-9254、AL-DP-9255、AL-DP-9256、AL--DP--9257、AL-DP-9258、AL-DP-9259、AL-DP-9260、AL-DP-9261、AL-DP-.9262、AL-DP-9263、AL-DP-9264、AL-DP-9265、AL-DP-9266、AL-DP-9267、AL-DP-9268、AL-DP-9269、AL-DP-9270、AL-DP-9271、AL--DP--9272、AL-DP-9273、AL-DP-9274、AL-DP-9275、AL-DP-9276、AL--DP-■9277、AL-DP-9279、AL-DP-9280、AL-DP-9281、AL-DP-9282、AL-DP--9283、AL-DP-9284、AL-DP-9285、AL-DP-9286、AL-DP-9287、AL--DP--9288和AL-DP-9289。24.抑制細(xì)胞內(nèi)Aha基因表達(dá)的載體，其中所述載體包含可操作地連接于編碼dsRNA中至少一條鏈的核苷酸序列的調(diào)控序列，其中所述dsRNA的一條鏈與編碼Ahal的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)，并且其中所述dsRNA的長(zhǎng)度小于30個(gè)堿基對(duì)，且其中所述dsRNA影響第二dsRNA的靶序列內(nèi)編碼Aha基因的mRNA的剪切，所述第二dsRNA具有選自下組的正義鏈SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、li<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>IDNO:166、SEQIDNO:168、SEQIDNO:170、SEQIDNO:172、SEQIDNO:174、SEQIDNO:176、SEQIDNO:178、SEQIDNO:180、SEQIDNO:182和SEQIDNO:184。25.包含如權(quán)利要求24所述載體的細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及抑制Aha基因(Aha1基因)表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其包含具有小于30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度且通常為19-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸序列的反義鏈，并與Aha基因的至少一部分基本互補(bǔ)。本發(fā)明還涉及包含所述dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物；利用所述藥物組合物治療由Aha1表達(dá)和Aha基因的表達(dá)引起的疾病的方法；以及抑制細(xì)胞中Aha基因表達(dá)的方法。文檔編號(hào)A61K31/70GK101489566SQ200780025941公開(kāi)日2009年7月22日申請(qǐng)日期2007年5月18日優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日發(fā)明者威廉·鮑爾奇,帕梅拉·譚,比吉特·布拉姆利奇,漢斯-彼得·沃爾洛赫爾,賴納·康斯蒂恩申請(qǐng)人:阿爾尼拉姆醫(yī)藥品有限公司;斯克里普斯研究學(xué)院