專利名稱：：干擾缺損病毒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及病毒學以及動物(包括禽類和人)中病毒感染，特別是甲型流感的預防和/或治療。本發(fā)明還涉及抗病毒治療領域。本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)用作預防和/或治療病毒感染的活性劑的干擾缺損(DI)病毒，即"DI病毒"的過程。"DI病毒"是確定的，通常是克隆的"干擾缺損，，病毒。"干擾病毒，，通常是干擾非缺損病毒的正常復制和感染周期的缺損病毒。(DI流感病毒制劑在本領域已為已知，但是存在遺傳異質性。)
背景技術：
：正黏病毒科(0決ow少;cow^ae)是感染脊推動物的RNA病毒。該科包括引起流感的那些病毒。流感是以發(fā)燒、咳嗽和嚴重的肌肉疼痛為特征的呼吸系統(tǒng)的病毒感染。流感病毒根據(jù)其核蛋白和基質蛋白的抗原差異分為三個屬甲型流感病毒(7^//z^/7z"v/n^y4)、乙型；克感病毒(7〃/7wewzflv/nS)禾口丙型i充感病毒(/"y/wewzaWms1C)。曱型和乙型流感病毒均含有八段單鏈RNA(ssRNA)。所述病毒包含主要外病毒粒子蛋白，血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)，其中有16個H亞型和9個N亞型，它們可能形成所有144種可能的排列。丙型流感病毒含有七段ssRNA,因為該病毒缺乏單獨的神經(jīng)氨酸酶基因(參見Lamb,R.和Krug,R.M.(1996)第45章；歸麵戸v,她e:Thevirusesandtheirreplication(正教病毒牙牛病毒及其復制)-FieldsVirology(費氏病毒學)，第三版，RavenPublishers,Philadelphia)。人流感的主要病原體是甲型病毒。該病毒基因組包含八個反義、單鏈RNA區(qū)段。所述RNA編碼9個結構蛋白和2個非結構蛋白。已知它們編碼下文列出的流感病毒蛋白區(qū)段1編碼聚合酶蛋白PB2區(qū)段2編碼聚合酶蛋白PB1區(qū)段3編碼聚合酶蛋白PA區(qū)段4編碼血凝素蛋白(HA)區(qū)段5編碼神經(jīng)氨酸酶蛋白(NA)區(qū)段6編碼核蛋白(NP)區(qū)段7編碼兩個基質蛋白(Ml和M2)區(qū)段8編碼兩個非結構蛋白(NS1和NS2)曱型和乙型人流感病毒均是造成人季節(jié)病的原因，但是僅有曱型流感病毒引起全球大流行。在人病毒中，已鑒定了三種不同的血凝素(稱為Hl、H2和H3)和兩種不同的神經(jīng)氨酸酶(稱為Nl和N2)。病毒根據(jù)其組成血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白分為亞型。例如，引起1918年的"西班牙，，流感大流行的病毒抹屬于H1N1亞型。H2N2亞型出現(xiàn)于1957年并取代了H1N1;H3N2亞型出現(xiàn)于1968年并取代了H2N2。每次取代事件已知均為抗原性轉變，并且由于整個人群缺乏對新病毒的有效免疫性，均造成了大流行。轉變之后，主要的病毒H和N表面蛋白經(jīng)歷叫做抗原性漂移的持續(xù)和漸進的抗原性變化。漂移病毒引起每年的流感流行。目前H3N2和H1N1(其在1977年重新出現(xiàn))的漂移后代同時存在。乙型流感病毒不會引起大流行流感但是有助于流行。不過，大部分曱型流感病毒存在于各種水禽中，引起亞臨床腸道感染。例如，2003年10月，雞流感流行病開始在環(huán)太平洋的多個國家(越南、泰國、日本、中國、韓國、柬埔寨)蔓延，最近已到達歐洲。此病毒命名為H5N1。H5分子在禽流感病毒中很常見，但是尚未在發(fā)現(xiàn)引起人流行病的流感病毒中發(fā)現(xiàn)。不過，H5N1(具有驚人的致死率)的散發(fā)性人案例一直存在，并且引起了極大關注。10基因組研究暗示人大流行病毒起源于適應人(1918),或與現(xiàn)有人病毒的遺傳相互作用(1957和]968)的禽病毒。因此，隨著禽病毒(如H5N1和H7N7)從其天然宿主轉移至家禽和與人密切接觸，新興的新的大流行病毒備受關注。不過，這些病毒目前均不能在人與人之間有效傳播。高度感染的新的大流行病毒均造成高發(fā)病率和死亡率，估計1918年病毒造成全球5000萬人死亡，1957和1968年病毒為100-500萬。盡管流感感染引起針對引起其的毒林的強烈的免疫反應，但是通過抗原性漂移產(chǎn)生的新毒抹的速度很快使之前感染的個體易受新的感染。流感疫苗可商業(yè)獲得已有多年，并包括滅活疫苗和活疫苗。一些疫苗含有滅活的病毒粒子，或者更常見地僅純化的H和N組分。已證明這些疫苗有助于減小流感流行的范圍和程度。不過，由于抗原性漂移現(xiàn)象，用作現(xiàn)有疫苗的基礎的流感毒抹每年都要由WHO重新評價，可能需要更改。而且，新的大流行病毒需要的任何新疫苗都將花費數(shù)個月的時間才能獲得施用。防御流感的其它方法包括抗病毒藥物。例如，金剛胺和曱金胺抑制使病毒RNA進入胞漿所需的基質蛋白之一的作用。這些藥物有效針對所有甲型流感病毒(但是對乙型病毒無效)，但是已觀察到快速進化的對所述藥物的抗性?？蛇x地，扎那米韋(Zanamivir)(Relenza⑧)和奧斯米韋(Oseltamivir)(Tamiflu⑥)阻止神經(jīng)氨酸酶，從而用以抑制子代病毒粒子從受感染的細胞的釋放和感染的擴散。不過，這些治療的效力有一些局限。治療必須在感染后不久開始，每天兩次，并且僅能將癥狀持續(xù)時間縮短一至三天。已在流感患者中發(fā)現(xiàn)達菲(Tamiflu)抗性病毒。雖然疫苗學和抗病毒藥物已有發(fā)展，但是另一次流感大流行不可避免，預期將造成廣泛的發(fā)病率和全球高達百萬的死亡人數(shù)。亟需對抗流感的新方法。DI病毒有長期的歷史。它們是作為自體干擾組分由vonMagnus在甲型流感病毒制劑中發(fā)現(xiàn)，vonMagnus在20世紀40年代末和20世紀50年代早期對它們進行了研究(例如vonMagnus,P(1947)Ark.Kemi.Mineral.Geol,逃1)。許多年來，這些千擾組分一直以他的名字命名。后來，當人們認識到這些組分發(fā)現(xiàn)于幾乎所有病毒中時，將其稱為DI病毒(參見例如Huang&Baltimore(1970)Nature22^:325-327)。對DT病毒的興趣在20世紀70年代達到高峰，但是然后由于對其在體內的抗病毒活性期望過高而減退。所有甲型流感病毒均顯示具有實現(xiàn)在雙重感染的細胞中交換基因組區(qū)段(重配)的復制裝置，賦予這些病毒巨大的遺傳可塑性。此事件造成了1957年和1968年的大流行病毒。除了正常的復制過程之外，復制中發(fā)生的錯誤產(chǎn)生缺乏80%左右的模板中央序列的400-500nt的小RNA,它們是由于聚合酶復制所述模板的起始部分、退出所述模板和然后重新加入并復制另一端而造成的。這些'J、RNA保留末端復制和包殼(encapsidation)信號，而它們的小尺寸暗示，與全長RNA區(qū)段相比，單位時間內可以產(chǎn)生更多的拷貝?；蚪MRNA的包殼表現(xiàn)為有組織的過程，以便一個病毒粒子僅含有一個拷貝的所述8個區(qū)段的每個區(qū)段。病毒粒子不會辨別缺損和全長RNA，所以當缺損RNA過量時，他們將優(yōu)選被包殼。含有缺失的基因組區(qū)段的粒子無法合成該RNA正常編碼的病毒蛋白，因此是非感染性的，盡管當所述細胞被甲型流感病毒感染時所述粒子可以反式復制。缺損RNA摻入病毒粒子造成生產(chǎn)的感染性病毒的數(shù)量減少。因此，攜帶缺失的基因組的病毒粒子被稱為干擾或缺損-干擾(DI)病毒。由于一個或多個基因組區(qū)段中的內部缺失(75-80%的核苷酸)，因此正黏病毒科的病毒自發(fā)產(chǎn)生缺損RNA區(qū)段。因此，DI病毒基因組是產(chǎn)生其的感染性病毒的基因組缺失的形式；它具有多個將其與其它類型的缺損病毒核酸分子相區(qū)分的特性(參見Dimmock，N.J.(1996)"Antiviralactivityofdefectiveinterferinginfluenzavimsinvivo"(體內干4無缺損力充感病毒的抗病毒;舌寸生)隱Viralandotherinfectionsofthehumanrespiratorytract(人呼吸道的病毒和其它感染)；S.Myint和D.Taylor-Robinson(編)，Chapman&Hall)。與活性即活或感染性病毒相比，DI病毒是非感染性的，并且僅當其基因組存在于已被具有完全基因組的病毒(有時稱為"輔助病毒")感染的細胞時，其才進行復制。DI流感病毒包殼為病毒粒子，該粒子在大小和蛋白組成上與感染性病毒粒子通常無區(qū)別。從頭產(chǎn)生之后，DI基因組按相對所述感染性病毒的基因組的濃度快速擴增，所以在少數(shù)感染周期(或世代)內，群體中的DI病毒即多于感染性病毒。DI病毒具有在細胞內干擾感染性病毒的能力，所以其能夠特異性抑制感染性病毒的增殖。體內動物研究已顯示，足量的自發(fā)產(chǎn)生的DI甲型流感病毒(A/equine/Newmarket/7339/79(H3N8》可以保護小鼠抵抗甲型流感的致死性攻擊(無論是同源病毒(EQV)還是異源亞型A/WSN(H1N1)或A/PR/8/34(HINI))。在這些研究中，所述DI病毒制劑用UV處理以滅活存在的任何活的輔助病毒。單次施用可提供高達約5天的預防。不過，這些DI病毒制劑是異質的，包含多種來自不同的基因組區(qū)段的不明確的缺損RNA序列(參見Noble和Dimmock(1994)J.Gen.Virol.21:3485-3491)。含胚卵(embryonatedeggs)中培養(yǎng)的DI病毒A/WSN(H1N1)保護小鼠抵抗A/WSN(H1N1)致死性攻擊。卵培養(yǎng)DI病毒RNA種類與從存活小鼠肺部提取的DI病毒RNA的比較顯示，有5個推定RNA與小鼠存活有關。所述的五個DI病毒RNA種類均具有內部缺失(參見Noble&Dimmock(1995)Virology21^:9-19)。這些RNA種類中的四個具有完整的3'和5'末端。Duhaut&Dimmock(2000，Virology221:278-285)通過在質粒中將EQV的缺損區(qū)段1RNA置于人RNA聚合酶I啟動子(POLI)的控制之下而對其進行了改良。所述每種質粒編碼約400個核普酸的RNA，但是由于內部缺失的準確位置，將保留不同長度的5'和3'端序列。使用每種質粒和三種不同的輔助病毒亞型(包括親本(H3N8)或H2N2或H1N1亞型)之一轉染Vero細胞。連續(xù)傳代在細胞培養(yǎng)物中執(zhí)行。在每個與使用的特定的輔助病毒一起使用的細胞系中，均發(fā)現(xiàn)所述DI病毒RNA5'端的至少150個核苷酸是體外可靠傳代所必需的。尚無法通過實驗闡明非克隆的DI甲型流感病毒降低感染性病毒生產(chǎn)、抑制病毒誘導的細胞病理學和保護動物免受臨床疾病的過程，因為大多數(shù)DI病毒群體含有許多衍生自不同的基因組區(qū)段并具有多種中央缺失的不同的缺損RNA序列。因此，此類非克隆的缺損病毒群體的RNA組成無法有效復制，從而不能分析RNA序列和抗病毒活性之間的關系。Duhaut&Dimmock(2002，J.Gen.Virol.M:403-411)證明衍生自質粒系統(tǒng)的DI病毒RNA在細胞培養(yǎng)物中顯示出真實的行為。一個質粒(POLI-317)產(chǎn)生存在輔助病毒時在體外穩(wěn)定復制并強烈抑制所述輔助病毒在該系統(tǒng)中的生產(chǎn)的DI病毒RNA。Duhaut&Dimmock(2003,J.Virol.Methods巡75陽82)描述了完全/人用于轉染培養(yǎng)的宿主細胞的質粒產(chǎn)生的確定的(即克隆的)DI甲型流感病毒的制備。所用質粒編碼DIRNA(H3N8或H7N7)和感染性流感病毒(A/WSN，H1N1)。將用這種方法生產(chǎn)的DI病毒在含胚雞卵(embryonatedhenseggs)中傳代一次，然后在存在輔助病毒(H]N1)的情況下施用至小鼠。所述克隆的DI病毒完整傳播至小鼠肺部。還測試了所述克隆的DI病毒(無感染性輔助病毒)對小鼠針對致死(H1N1)的攻擊的任何保護效應。觀察到一些非常微弱和短暫的預防效應，但是這僅延遲了臨床癥狀的發(fā)作和小鼠的死亡。Noble等(2004,Vaccine22:3018-3025)報道了使用天然存在的(即異質和不明確的)DI病毒制劑(EQVH3N8)在小鼠中的體內研究。發(fā)現(xiàn)為小鼠施用此DI病毒制劑產(chǎn)生一段時期的預防保護，同時將其他致死感染轉化為無毒的和免疫性感染。Dimmock&Marriott(2006,J.Gen.Virol.1259-1265)描述了明顯的異常，其中異質的和不明確的DI病毒制劑有力地保護小鼠免受由A/PR/8/34(HINI)和A/WSN/40(H1N1)病毒引起的致死疾病，但是僅勉強預防由A/Japan/305/57(A/JapH2H2)引起的疾病。發(fā)現(xiàn)A/Jap需要比A/PR8多出300倍的感染單位才能在小鼠中引起臨床疾病。改變DI病毒和攻擊病毒的比例并進行測試。得出的結論是所述DI病毒的效力依賴于攻擊病毒的感染劑量而不是其致病劑量。Mann等(2006，Vaccine24,4290-4296)測試了雪貂中已被(A/PR8)拯救的異質的和不明確的DIA/EQVRNA。施用兩個劑量的DI病毒，然后使用感染性A/Sydney5/97(H3N2)進行攻擊。雖然所述感染性攻擊不是致死的，但是與嚴重患病的對照動物相比，DI病毒處理的雪貂僅顯示偶然的、溫和的臨床癥;l犬。US2006/0057116Al(Kawaoka和Neumann)描述了在不存在任何輔助病毒的情況下在體外生產(chǎn)重組甲型流感病毒的轉染和培養(yǎng)細胞的質粒和方法。特異地，可以在轉染細胞系中從其克隆的cDNA完整制備曱型流感病毒?？梢韵蛉魏位騾^(qū)段摻入突變。WO2006/051069(SolvayPharmaceuticals&ErasmusUniversky)乂^開了條件缺損流感病毒粒子和其制備方法。以不能生產(chǎn)大量缺損流感病毒粒子用作疫苗的轉染細胞為起始點，該說明書教導了可選的方法。所述方法包括用流感病毒的7個RNA區(qū)段和缺失了其中的聚合酶編碼序列的第八個區(qū)段轉染的細胞。所述細胞包括攜帶所述缺失的聚合酶的序列的第二個表達質粒。所述轉染細胞表達產(chǎn)生"條件"缺損病毒粒子，該粒子僅在表達所述缺損基因組中不存在的聚合酶的細胞系中復制。所述缺損流感病毒粒子在合適但不互補的宿主動物或細胞中僅能復制一次。所述條件缺損病毒粒子意在用于疫苗用途或基因送遞用途，所以有利地，所述病毒粒子制劑不能在正常細胞中復制并且不含有野生型或輔助病毒。盡管已描述了(參見Duhaut&Dimmock，2003，同上)用于制備克隆的DI曱型流感病毒(已證明其在小鼠中僅有時具微弱保護作用)的原型系統(tǒng)，但是其并未提供制備進一步的實驗室研究需要的必需量的克隆的DI病毒，更不用說執(zhí)行動物和人臨床試驗或提供日常、流行或大流行狀況的預防和/或治療常規(guī)性需要的量的克隆的DI病毒的實踐路徑。vonMagnus,P.(1951a)尸a幼o/緣油o/Scam/28,250-277;窗Magnus,P.(1951b)爿ctoi^/o/綠ra編S簡c/28，278-293;vonMagnus，P.(1951c)Ata尸"f/20/M,craM/Sccf"c/29,157-181;和vonMagnus,P.(1954)59-79均描述了通過用"稀釋10^的尿嚢液"接種含胚雞卵制備的標準(即感染性)A/PR8(H1N1)病毒。在vonMagnus(1951a)的第158頁，不完整病毒(即DI病毒)是通過使用"未稀釋病毒的第l、2、3等代"進行"未稀釋的尿嚢液的連續(xù)傳代"制備的，最多制備了4代。FazekasdeStGroth,S.&Graham,D.M.(1954)."Theproductionof15incompleteinfluenzavirusparticlesamonginfluenzastrains.Experimentsineggs."(流感毒抹缺損流感病毒粒子的生產(chǎn)。卵中的實驗。)SnYJExp尸aA35,60-74。還有，vonMagnus,P.(1965)"The/"ovoproductionofincompletevirusbyB/LeeandA/PR8influenzaviruses"(通過B/Lee和A/PR8流感病毒在卵內生產(chǎn)缺損病毒)，^r/Wra/17,414-423。這些參考文獻描述了不完整(DI)B/Lee病毒在含胚雞卵中的生產(chǎn)。生產(chǎn)通常需要6或更多代的未稀釋病毒。Meier-Ewert，H.&Dimmock,N.J.(1970)."Theroleoftheneuraminidaseoftheinfectingvirusinthegenerationofnoninfectious(vonMagnus)interferingvirus(感染病毒的神經(jīng)氨酸酶在生產(chǎn)非感染性(vonMagnus)干擾病毒中的作用)."794-798。此參考文獻描述了不完整(DI)A/Jap/305/57(H2N2)病毒的生產(chǎn)。表2顯示病毒生產(chǎn)為什么需要3個連續(xù)的未稀釋代。Rott，R.&Schafer,W.(1960)"Untersunchungenuberdiehamaggluttinierenden-nichtinfektiosenTeilchenderInfluenza-Viren.I.DieErzeugungvon'inkomplettenFormen'beimVirusderklassischenGeflugelpest(v.MagnusPhanomen)"Ze/加/孝，Atow/6)rac/wwg16b，310-321;和Carter,M.J.&Mahy，B.W.J.(1982).y4rc/P7ra/71，12-25。這些參考文獻描述了如何通過高多樣性培養(yǎng)液，通常是未稀釋病毒的連續(xù)傳代生產(chǎn)不完整A/雞瘟病毒(H7)。所述細胞培養(yǎng)液獲自雞胚成纖維細胞。Huang,A.S.&Baltimore,D.(1970)"Defectiveviralparticlesandviraldiseaseprocesses(缺損病毒4立子和病毒性疾病過矛呈)"M^/refX6w<i」226，325-327。此綜述文章在第325頁描述了裂谷熱病毒、水泡性口炎病毒、雞瘟病毒、猿猴病毒40、多瘤病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒、仙臺病毒、猿猴病毒5和脊髓灰質炎病毒如何通過具有高多樣性感染的細胞或動物組織(或未稀釋代病毒)合成DI粒子。Holland,J.J.(1990a)"Defectiveviralgenomes(缺損病毒基因組)，，，Kzra/ogy(病毒學)，第二版，第151-165頁.B.N.Fields&D.M.Knipe編，NewYork:RavenPress。此綜述文章在第155頁描述了為什么病毒在細胞培養(yǎng)物(或卵或動物)中的連續(xù)未稀釋傳代仍是選擇用來生產(chǎn)任何病毒的DI粒子的方法。Holland,J.J.(1990b)"Generationandreplicationofdefectiveviralgenomes(缺損病毒基因組的產(chǎn)生和復制)"，Kra/ogy(病毒學)，第二版，第77-99頁.B.N.Fields&D.M.Knipe編，NewYork:RavenPress。參照圖2，此章節(jié)說明了為什么直到笫四(未稀釋病毒)代才顯示DI粒子條帶。綜述文章Nayak，D.P.,Chambers,T.M.&Akkina,R.K.(1985)"Defective-interfering(DI)RNAsofinfluenzaviruses:origin,structure,expressionandinterference(流感病毒的缺損干4尤(DI)RNA:來源、結構、表達和干才尤)"Cwr7bp/csM"/cra力/0//附附w"o/]14,103-151^正明了通過病毒的連續(xù)獨立未稀釋傳代的DI病毒的生產(chǎn)。在細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)克隆的DI甲型流感病毒不能提供足量的克隆的病毒供實際應用。本發(fā)明試圖解決的一個問題就是如何為體內研究和藥物用途生產(chǎn)足量的病毒。發(fā)明人曾試圖通過在含胚雞卵中傳代生產(chǎn)克隆的DI甲型流感病毒，但是得到的DI病毒產(chǎn)量太低。因此，本發(fā)明試圖解決的一個問題就是如何通過在含胚卵中傳代生產(chǎn)足量的克隆的DI甲型流感病毒。
發(fā)明內容因此，本發(fā)明提供生產(chǎn)克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述方法包括(a)使用(i)包含其中含有缺失的甲型流感病毒的RNA區(qū)段的質粒和(ii)聯(lián)合提供感染性甲型流感病毒的RNA區(qū)段1至8的多個質粒轉染細胞；(b)將所述轉染細胞培養(yǎng)一段時間；(c)(i)將一小份(aliquot)低于100^1的轉染細胞培養(yǎng)基質導入含胚卵；或(ii)取一小份所述轉染細胞培養(yǎng)基質，減少該小份中的病毒粒子的數(shù)量或濃度，然后將所述小份的至少一部分導入含胚卵；或(iii)將含有低于4x109個拷貝的RNA缺失區(qū)段的轉染細胞培養(yǎng)基質導入含胚卵；和(d)將所述卵孵育一段時間；和(e)從所述卵中回收病毒材料。本發(fā)明還提供生產(chǎn)克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述方法包括(a)使用(i)包含其中具有缺失的甲型流感病毒的RNA區(qū)段的質粒和(ii)聯(lián)合提供感染性甲型流感病毒的RNA區(qū)段1至8的多個質粒轉染細胞；(b)將所述轉染細胞培養(yǎng)一段時間；(c)取一小份所述轉染細胞培養(yǎng)基質；(d)將所述小份的至少一部分導入含胚卵；(e)將所述卵孵育一段時間；(f)(i)將一小份取自孵育卵的低于100pl的病毒材料導入另一含胚卵；或(ii)從所述孵育卵中回收一小份病毒材料，減少該小份中的病毒粒子的數(shù)量或濃度，將所述小份的至少一部分導入另一含胚卵；或(iii)將取自所述孵育卵的含有低于4x109個拷貝的RNA缺失區(qū)段的病毒材料導入另一含胚卵；(g)將另一卵孵育一段時間；和(h)從所述卵中回收病毒材料。本發(fā)明還提供生產(chǎn)克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述方法包括(a)使用(i)包含其中含有缺失的甲型流感病毒的RNA區(qū)段的質粒和(ii)聯(lián)合提供感染性甲型流感病毒的RNA區(qū)段1至8的多個質粒轉染細胞；(b)將所述轉染細胞培養(yǎng)一段時間；(c)將轉染細胞培養(yǎng)基質的至少一部分導入至少IO個含胚卵；(d)將至少一部分所述卵孵育一段時間；和(f)從至少一個孵育卵中回收病毒材料。本發(fā)明進一步提供生產(chǎn)克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述方法包括(a)使用(i)包含其中具有缺失的甲型流感病毒的RNA區(qū)段的質粒和(ii)聯(lián)合提供感染性曱型流感病毒的RNA區(qū)段1至8的多個質粒轉染細胞；(b)將所述轉染細胞培養(yǎng)一段時間；(c)取一小份所述轉染細胞培養(yǎng)基質；(d)將所述小份的至少一部分導入含胚卵；(e)將所述卵蜉育一段時間；(f)將至少一部分來自孵育卵的病毒材料導入至少IO個另外的含胚卵；(g)將另外的卵孵育一^:時間；和(h)從至少一個卵中回收病毒材料。本發(fā)明進一步提供將克隆的DI曱型流感病毒傳代的方法，所述方法包括(a)將不超過4x109個拷貝的克隆的DI甲型流感基因組導入含胚卵；(b)將所述卵孵育一段時間；和(d)從所述卵中回收病毒材料。對于所有前述的本發(fā)明生產(chǎn)克隆的DI曱型流感病毒或將其傳代的方法，優(yōu)選將至少1x107個拷貝的克隆的DI甲型流感基因組導入含胚卵?？寺〉腄I甲型流感粒子、基因組或缺失的RNA區(qū)段各自的優(yōu)選范圍是1x1()7至4xl09。在其它優(yōu)選的方面，使用不超過3x109、2xl09、lx109、9x108、8x108、7x108、6x108、5x108、4x108、3x108、2x108、lx108、9xl07、8xl07、7xl07、6xl075xl07、4xl07、3x107或2xl(^個粒子、基因組或缺失的區(qū)段。在進一步優(yōu)選的方面，使用至少3x109、2xl09、lx109、9xl08、8x108、7x108、6x108、5x108、4x108、3x108、2x108、1x108、9xl07、8xl07、7xl07、6xl075xl07、4x107、3xl()7或2x107個粒子、基因組或缺失的區(qū)段，遵循上述關于粒子、基因組或缺失的區(qū)段的上限的列表。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)需要向含胚卵接種減少]0倍、優(yōu)選地減少100倍、甚至減少1000倍的病毒材料(與本領域現(xiàn)有的教導相比)以生產(chǎn)實踐量的克隆的DI甲型流感病毒。本發(fā)明還提供將克隆的DI甲型流感病毒傳代的方法，所述方法包括(a)將已知或疑似含有克隆的DI甲型流感病毒粒子的小份導入含胚卵，其中引入的小份的體積低于100^1;(b)將所述卵孵育一段時間；和(c)從所述卵中回收病毒材料。本發(fā)明進一步提供將克隆的DI曱型流感病毒傳代的方法，所述方法包括(a)將已知或疑似含有克隆的DI曱型流感病毒粒子的小份導入至少10個含胚卵；(b)將至少一部分所述卵孵育一段時間；和(c)從至少一個孵育卵中回收病毒材料。本發(fā)明此外還提供將克隆的DI甲型流感病毒傳代的方法，所述方法包括(a)減少已知或疑似含有克隆的DI甲型病毒粒子的小份中的病毒數(shù)量或濃度；(b)將所述小份的至少一部分導入含胚卵；(c)將所述卵孵育一段時間；和(d)從所述卵中回收病毒材料。在上文描述的相關實施方案中，可以使用低于lOOpl的培養(yǎng)基質小份(或從卵中獲得的小份)，優(yōu)選地體積范圍為0.1-100^1。所迷小份體積更優(yōu)選地低于50W、更優(yōu)選地低于10pl。甚至可以使用19低于l^ll或低于0.1pl的更小的小份體積。本發(fā)明包括小份體積在0.05pl-10nl;O.ljiil-lOO^il;10-100pl;O.ljil-l(Hil;0.1^1-2(^1或0.1pl-50nl范圍內。將整個稀釋小份或至少一部分稀釋小份導入含胚卵之前，所述低于lOOpi的培養(yǎng)基質小份(或卵小份)，或如上文進一步確定的小份可進行稀釋。總之，使用低于100pl體積(如上文進一步確定的)的培養(yǎng)基質(或卯)小份得到了所述含胚卵的接種物，其中所述接種物中存在減少數(shù)量或濃度的病毒粒子。"減少"表示相對于本領域通常遇到的在含胚卵中將病毒傳代的接種物的使用體積，例如大于100^1，通常lml-2ml的病毒粒子的數(shù)量和/或濃度減少。驚人的是，本發(fā)明通過使向多個含胚卵中接種轉染細胞培養(yǎng)基質成為可能，提供了生產(chǎn)大量克隆的DI病毒的解決方法。另一方面，本發(fā)明所述方法包含生產(chǎn)克隆的DI流感病毒，所述方法包括(a)使用(i)包含其中含有缺失的甲型流感病毒的RNA區(qū)段的質粒和(ii)聯(lián)合提供感染性曱型流感病毒的RNA區(qū)段1至8的多個質粒轉染細胞；(b)將所述轉染細胞培養(yǎng)一段時間；(c)將轉染細胞培養(yǎng)基質的至少一部分導入至少10個含胚卵，(d)將至少一部分所述卯孵育一段時間；和(f)從至少一個孵育卵中回收病毒材料。所述轉染細胞培養(yǎng)基質通常處于0.1^d-10(Hil范圍。依據(jù)本發(fā)明，這些體積可在多于10個含胚卵中進行分配。在優(yōu)選的實施方案中，所述轉染細胞培養(yǎng)基質在多于10、優(yōu)選地多于25、任選地多于50個卵中進行分配。在一次轉染細胞培養(yǎng)中，可以使用培養(yǎng)基質接種最多100、150、200、250、500、1000、2000、5000或更多個卵。因此，本發(fā)明開拓了為用于研究和藥學/獸醫(yī)應用生產(chǎn)大量克隆的DI甲型流感病毒的領域?？赡苡卸啻渲袕穆阎谢厥誅I病毒材料之后，所述病毒的培養(yǎng)或傳代重復一次或多次。為了產(chǎn)生必需量的克隆的DI病毒，卵中的代數(shù)可為3、4或5。在其中將病毒材料導入卵中之前存在減少病毒粒子的數(shù)量或濃度的步驟的前述方法中，此步驟可在兩個或多個代，任選地在含胚卵的每一代中發(fā)生。除了使用特異性探針和/或引物測量DI甲型流感病毒粒子之外，培養(yǎng)基質中的DI甲型流感病毒材料的量可通過總病毒粒子，即包括存在的任何輔助病毒的數(shù)量或濃度反映。在將病毒在已知含有或疑似含有克隆的DI病毒粒子的小份中進行傳代的方法之前，可預先通過將已知或疑似含有所迷克隆的病毒的起始材料導入含胚卵，然后將所述卵孵育一段時間獲得相關小份。因此，在某些實施方案中并不需要驗證樣品實際含有克隆的DI甲型流感病毒；可對起始小份盲目執(zhí)行傳代，結果會確定所述接種物中是否存在克隆的DI甲型流感病毒。上述起始材料優(yōu)選地獲自轉染細胞培養(yǎng)物。所述細胞優(yōu)選地為Vero細胞、更優(yōu)選地HEK293T細胞+MDCK細胞。在上文描述的傳代方法中，可存在一個或多個進一步的代，其中回收的病毒材料-波導入含胚卵，所述卵孵育一段時間，然后從所述卵回收進一步的病毒材料?？蓤?zhí)行一次或多次傳代，其中卵的接種和孵育重復一次或多次。在上文描述的各種方法中，均可通過稀釋降低病毒粒子的濃度。所述稀釋可為至少1/2,優(yōu)選地至少1/10、更優(yōu)選地至少1/100、甚至更優(yōu)選地至少1/1000。其它優(yōu)選的稀釋可包括，例如，1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/20、1/25、1/30、1/35、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/200、1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/2000、1/3000、1/4000、1/5000或1/10,000。可執(zhí)行連續(xù)稀釋，例如在1/2稀釋后進行1/10稀釋。任選地，可以取一小份第一次稀釋液，然后對該小份進行第二次稀釋?？蛇x地，可通過在稀釋(如上文描述的)后取出所得稀釋體積的至少一部分來減少病毒粒子的數(shù)量。然后可將此后一部分或小^分擴大至需要的體積。稀釋步驟可用于實現(xiàn)緩沖液的交換或溶液組分的改變。通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的病毒粒子制劑的感染性按本領域已知的通過使用噬菌斑測定滴定(MDCK細胞，瓊脂，標準程序)確定。本發(fā)明DI甲型流感病毒制劑優(yōu)選地具有低于10"藍斑形成單位/HA單位，并可具有低至105、104、103或1(^噬斑形成單位/HA單位。DI病毒制劑中存在的病毒的總量可附加地或獨立地通過使用雞紅細胞(例如獲自Serotech或其它商業(yè)供應商)進行標準血凝(HA)試驗確定。一小份減少濃度或數(shù)量的本發(fā)明DI病毒粒子可含有不超過約400HA單位、優(yōu)選地不超過約100HA單位、更優(yōu)選地不超過約40HA單位。在其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法中使用的一小份DI甲型流感病毒粒子可具有低于1()2HA單位，包括低于99、98、97、96、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5或1HA單位。低于101、102、103或1(^HA單位的小份也屬于本發(fā)明范圍。所述克隆的DI曱型流感病毒可以是制劑形式，其中所迷制劑的所有病毒粒子中至少75%、優(yōu)選地至少85%、更優(yōu)選地至少90%、甚至更優(yōu)選地至少95%具有遺傳同一性。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)依據(jù)本發(fā)明制備的克隆的DI甲型流感病毒制劑包含最多99.9%的具有缺失的RNA區(qū)段的病毒，剩余的則由天然存在的或野生型(輔助)病毒構成。所述制劑可包含最多99.8%、99.7%、99.6%、99.5%、99.4%、99.3%、99.2%、99.1%、99%、95%、90%、85%或80%的克隆的DI甲型流感病毒(病毒粒子或基因組總計)。在優(yōu)選的實施方案中，所述制劑中的幾乎所有DI甲型流感病毒粒子都具有遺傳同一性、更優(yōu)選地所有DI病毒粒子都具有遺傳同一性。本發(fā)明的克隆的DI流感病毒優(yōu)選地包含8個RNA區(qū)段，其中至少一個所述區(qū)段具有缺失。所述缺失可造成所有編碼表面抗原的基因全部或部分凈皮缺失。在其它方面，聚合酶基因全部或部分被缺失。所述病毒制劑的小份可用紫外線照射以滅活至少一部分該小份中存在的感染性曱型流感病毒(即輔助病毒)。需要的照射量預期與該小份中存在的感染性病毒的量成比例。紫外線針對RNA。一般而言，低劑量的紫外照射即足夠?？尚首贤鉄?，以達到每4秒滅活llogl。流感病毒感染性。因此，在約10厘米的距離和2毫米的樣品深度，使用8瓦燈執(zhí)行5秒至3分鐘、優(yōu)選地10秒至2分鐘、更優(yōu)選地30秒至90秒范圍內的紫外照射(253.7nm)。紫外照射優(yōu)選地將通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的DI甲型流感病毒制劑的感染性降至低于106PFU/HA單位、優(yōu)選地低于105、104、103或102PFU/HA單位的水平。完全滅活包括DI病毒RNA的所有病毒RNA可通過紫外照射約8分鐘、任選地4分鐘實現(xiàn)。本發(fā)明還提供用作藥物的克隆的DI曱型流感病毒。所述藥物優(yōu)選地為抗病毒劑。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)所述克隆的DI曱型流感病毒具有抗病毒劑作用。而且，所述抗病毒作用是普遍針對甲型流感的所有毒抹或亞型。因此，所施用的克隆的DI甲型流感病毒可以是與人員天然采集的曱型流感病毒相同或不同的亞型。因為所述藥物的抗病毒效應不是基于免疫學(盡管發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)次級免疫響應)，所以不需要佐劑。所述抗病毒作用是即時的，對其施用的個體是保護性的。此外也不需要施用輔助病毒。施用的本發(fā)明克隆的DI曱型流感病毒在其施用的受治療者體內具有顯著的半衰期。再施用可在最多一周、兩周、三周或一個月以后進行，以恢復潛在的保護效應(使用相同或不同亞型的天然存在的甲型流感病毒感染個體產(chǎn)生的保護效應)。不希望受任何特定理論的限制，發(fā)明人認為本發(fā)明克隆的DI曱型流感病毒中任何亞型的天然存在的或野生型甲型流感病毒的存在，造成缺損區(qū)段的互補，所以所述DI流感病毒可以利用所述天然或野生型病毒在宿主細胞中復制。結果是所述天然或野生型病毒的毒力降低，允許機體有時間發(fā)動針對所述天然或野生型病毒的有效免疫反應。因此，本發(fā)明克隆的DI曱型流感病毒不是疫苗，而是針對甲型流感各亞型的通用的干擾性抗病毒劑。在另一方面，本發(fā)明包括可通過本發(fā)明所述的任何方法獲得的克隆的DI曱型流感病毒的用途?？寺〉腄I甲型流感病毒用于生產(chǎn)預防或治療個體內相同或不同亞型的甲型流感的抗病毒藥物。在進一步的方面，本發(fā)明包括克隆的DI甲型流感病毒用于生產(chǎn)將個體內的毒性甲型流感病毒感染轉化為無毒感染的藥物的用途。甲型流感的毒性毒株可以是任何類型，無論是人、動物或禽類毒林。本發(fā)明有利地提供克隆的DI甲型流感病毒用于生產(chǎn)在感染或疑似感染甲型流感的個體內提供即時和非免疫保護效應的藥物的用途。因此，發(fā)明人提供基于能夠在任何宿主內抵抗任何甲型流感病毒的天然存在的干擾缺損流感RNA的抗病毒劑。此已知序列的所謂的"保護性RNA"優(yōu)選地包殼為病毒粒子，并且優(yōu)選地通過鼻內施用至呼吸道的細胞，感染性流感病毒天然靶向所述細胞。小劑量的發(fā)明人所謂的"保護性病毒'，(即克隆的DI病毒)在小鼠內表現(xiàn)出針對致死的流感感染的強烈預防保護，并產(chǎn)生治療效益。保護性病毒將為對抗人流感，特別是當病毒毒抹未知或對抗病毒藥物具有抗性時，提供重要選擇。發(fā)明人已制備了含有單個顯性缺損RNA的病毒制劑。這些克隆的DI病毒制劑，也稱為"保護性病毒"制劑以區(qū)分其和培養(yǎng)細胞中的'干擾性病毒，活性，具有保護動物，包括人，免受甲型流感病毒嚴重感染的能力。在一些實施方案中，發(fā)明人制備了在小鼠內針對甲型流感病毒的預防活性比非克隆的DI病毒多約50倍的"保護性病毒"。所述"保護性病毒"制劑提供治療效益。"保護性病毒"RNA序列有利地允許檢查批真實性、測量比活性和確定具體保護性RNA的作用機制。保護性病毒的一個主要優(yōu)勢是其預期可以作用于曱型流感病毒的任何亞型或毒抹。由于活性成分，即保護性RNA,與基因組RNA使用相同的復制機器這一作用機制，因此不可能產(chǎn)生對保護性病毒具有抗性的病毒。24因此，優(yōu)點是可以治療已知或疑似感染甲型流感病毒的個體的感染，即使尚未觀察到感染癥狀，或診斷到感染。懷疑感染時即可盡快向個體施用克隆的DI曱型流感藥物。個體還可以在與已知或疑似感染甲型流感的相同或不同物種的其它個體接觸后很快被感染。有利地，保護被認為不涉及免疫反應，是通過單獨施用所述克隆的DI病毒藥物實現(xiàn)的，而無需施用輔助病毒。因此，所述克隆的DI病毒無需像常規(guī)疫苗(其依賴于免疫反應以產(chǎn)生保護效應)那樣在感染之前施用。本發(fā)明藥物可作為預防施用至個體。例如，醫(yī)務人員和工作中接觸動物或禽類(死亡或存活)的人員和有接觸甲型流感病毒危險的人員。在進一步的方面，本發(fā)明包括克隆的DI曱型流感病毒用于生產(chǎn)對個體進行針對甲型流感的免疫的藥物的用途，其中所述藥物進一步包含至少一個曱型流感的活毒抹并且所述藥物適合將所述DI曱型流感病毒與所述活(輔助)毒株單獨、同時或順序施用。所述輔助毒^i可以是任何類型的曱型流感病毒，無論是來自人、動物或禽類。發(fā)明人公開克隆的DI曱型流感病毒能夠與輔助病毒一起充當針對甲型流感病毒特定毒^f朱的疫苗。同時，施用克隆的DI甲型流感病毒還具有抗病毒效應。因此，本發(fā)明提供對個體進行針對甲型流感病毒毒抹的免疫并同時治療所述個體由甲型流感病毒的任何毒抹引起的感染的方法，所述方法包括施用有效量的克隆的DI病毒和活的曱型流感病毒。而且，本發(fā)明提供克隆的DI甲型流感病毒生產(chǎn)進一步包含活的曱型流感病毒毒株的藥物的用途，其中所述藥物是針對所述流感病毒毒抹的疫苗和針對流感病毒的任何毒4朱的抗病毒劑。在優(yōu)選的實施方案中，所述藥物鼻內施用。其它施用路徑可包括粘膜、肺和口腔。其它路徑包括經(jīng)過口服的胃腸施用?？蔀槠涫┯盟鏊幬锏膫€體可以是動物或人，優(yōu)選地其中所述動物選自豬、馬、狗、貓或禽類(野生或馴化的)。對于禽類(無論是野生或馴化)，所述藥物可經(jīng)過口服(oraltract)方便地施用，例如將所述藥物摻入々欠用水中或食物中。對于禽類物種，優(yōu)選的馴化物種包括，例如，鴨、鵝、火雞或雞，例如肉雞。所述藥物抵抗任何異源甲型流感病毒，而不僅是與所述克隆的DI病毒同源的類型。劑量方案可由單次劑量的藥物組成。有利地，可以安排所述劑量的施用時間，以在可能感染甲型流感病毒之前允許最多約8周的時間。本發(fā)明提供的預防期可在0-6周、0-5周、0-4周、0-3周、0-2周或0-1周范圍內。可延長至高達12周或更長。在其需要同時、單獨或順序施用至少一個甲型流感的活毒林的藥物中，所述毒抹可以是任何天然存在的曱型流感毒抹。例如，甲型流感的活毒抹可選自H1N1、H2N2、H3N2、H3N8或H5N1。所述藥物中克隆的DI甲型流感病毒的量在每劑量0.05-500HAU范圍內，優(yōu)選地選自0.1-100、0.5-50或1-10HAU的范圍內。其它可能的范圍包括0.05-10HAU、0.1-50HAU和1-100HAU。不過，因為存在輔助病毒，所以測量的HAU值表示輔助和克隆的DI病毒二者HA單位的和。所述藥物中克隆的DI甲型流感病毒的量可通過定量RT-PCR測量。使用對所述缺失的RNA區(qū)段特異的探針和/或引物。所述藥物中克隆的DI甲型流感病毒的量可大約是(每劑量)lng-l嗎病毒(根據(jù)總病毒蛋白測量)數(shù)量級。DI病毒的量可在0.05貼-0.5嗎、任選地0.1貼-0.5昭范圍內。優(yōu)選的實施方案包括0.01-0.1嗎或0.01-1貼病毒蛋白、更優(yōu)選地10ng、100ng或1昭病毒蛋白。病毒蛋白的量同時包括輔助病毒和克隆的DI病毒。克隆的DI曱型流感病毒的量(無論是根據(jù)HAU或每劑量的pg病毒蛋白測量)可根據(jù)受治療者而變化。例如，馬可能需要4x人劑量，而禽可能需要1/10的人劑量。與其衍生自的基因組區(qū)段相比，克隆的DI甲型流感病毒中的缺損RNA具有至少一個缺失，盡管區(qū)段l可缺失多個部分。所述缺失可被多個連續(xù)的核苷酸分開。26包括所述缺失的基因組區(qū)段的5'和3'端優(yōu)選地是完整的。在更優(yōu)選的實施方案中，所述區(qū)段是區(qū)段l。缺失的影響是所述病毒粒子RNA區(qū)段的5'端具有至少150、200或220個核苷酸。優(yōu)選地所述區(qū)段的5'端具有的核苷酸的數(shù)量在150-500、更優(yōu)選地150-250或150-220范圍內。至于3'端，剩余(未缺失)部分包含至少20、50、100、200、300、400或500個核苷酸。區(qū)段1的3'端可具有的(未缺失)核苷酸的數(shù)量在20-600、30-550、40-500、50-450、60-400或75-250范圍內。所述區(qū)段缺失可以是至少50%的核苷酸、優(yōu)選地至少75%、更優(yōu)選地至少80%的核苷酸。為了實現(xiàn)所述RNA區(qū)段的有效缺失，可缺失至少一個核苷酸。在更優(yōu)選的實施方案中，所述缺失可由至少3、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、3000或5000個核香酸、優(yōu)選地連續(xù)核苦酸組成。同一RNA區(qū)段內可具有多個缺失。本發(fā)明克隆的DI甲型流感病毒的基因組區(qū)段1的核苷酸序列可包含(a)選自SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的序列，或(b)與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2具有至少75%同一性的核酸序列；(c)在嚴格條件下與上文(a)或(b)雜交的序列的互補序列。優(yōu)選地所述克隆的DI甲型流感病毒基因組區(qū)段1的序列與SEQIDNO:1具有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地99%同一性。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述序列與SEQIDNO:1具有大于96%的同一性?；蚪M區(qū)段1的核苷酸序列可包含在所述核苷酸序列的一個或多個位置處的一個或多個核香酸插入。在優(yōu)選的實施方案中，基因組區(qū)段1的核苷酸序列是SEQIDNO:1。因此，本發(fā)明提供包含如前文所述的克隆的DI甲型流感病毒的藥物組合物。適合施用的本發(fā)明藥物組合物包含無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳液形式的DI甲型流感病毒，任選地輔助病毒。所述組合物可進一步包含本領域已知的助劑或賦形劑，參見，例如Berkow等，TheMerckManual(默克手冊)，第16版，Merck&Co.，Rahman,NJ(1992)，Avery'sDrugTreatment:PrinciplesandPracticeofClinicalPharmacologyandTherapeutics(艾氏藥物治療臨床藥理學和治療原理和實踐)，第三版，ADISPress,Ltd.,Williams和Wilkins,Baltimore,MD(1987)&Osol(編)，Remington'sPharmaceuticalSciences(雷氏藥物科學),MackPublishingCo.,Eastern,PA1324-1341(1980)。本發(fā)明組合物優(yōu)選地呈現(xiàn)為個體劑量(單位劑量)。一般而言，口服施用的液體劑量形式可包含含有所述液體劑量形式的脂質體溶液。懸浮脂質體的合適形式包括含有本領域常用惰性稀釋劑，例如純凈水的乳液、懸浮液、溶液、糖漿和酏劑。除了惰性稀釋劑以外，示例性組合物還可包括佐劑、濕潤劑、乳化和懸浮劑，或增甜、調味或增香劑。當本發(fā)明組合物或藥物用于施用至個體時，其可進一步包含鹽、緩沖液或增強所述組合物效力所需的其它物質。優(yōu)選的組合物或藥物是用于粘膜遞送。在可用的各種粘膜遞送選擇中，鼻內路徑是最實用的，因為其使用已批量生產(chǎn)的相對簡單的設備提供輕松的用藥。因此，本發(fā)明組合物優(yōu)選地適合和/或包裝為鼻內施用，如鼻腔噴霧劑、滴鼻劑、凝膠或粉末(參見Almeida&Alpar(1996)J.Dn/gTarge加g&Agarwal&Mishra(1999)JwAo"丄五乂;.B/o/.37:6-16.)。粘膜遞送的其它可能路徑包括口腔、胃內、肺和腸內。本發(fā)明組合物可適合和/或包裝為粘膜施用(例如參見Walker(1994)12:387-400,Clements(1997)淑匿胸ec//.15:622-623&McGhee等(1992)10:75-88)。對于口服施用，可提供片劑或膠嚢(任選地腸溶包衣的)。任選地，液體、轉基因植物材料、滴劑、吸器、氣霧劑、腸溶劑、栓劑、陰道栓劑等(參見Michetti(1998)/.GaWraeWera/.[SupplX]:66-68和Facdwefifes/grf/e^Z)wmYa"c/a咗wva"f"p/7raac/2(疫苗^殳i十纟且分牙口佐劑方法)的第17章，Powell&Newman編，PlenumPress1995)。無論遞送路徑如何，本發(fā)明組合物或藥物優(yōu)選地是單位劑量形式。可常規(guī)建立有效劑量。例如，所述組合物用于注射或鼻內使用的典型的人劑量的體積為0.1-0.5ml,例如兩次100^噴霧，每個鼻孔一次。本發(fā)明組合物優(yōu)選地是無菌的和優(yōu)選地不是熱原性的。在較高濃度下，DI曱型流感病毒組合物可是熱原性的或顯示出殘留熱原活性。其優(yōu)選地緩沖為，例如在pH6.5和pH8之間，一般而言，pH7左右。WO2006/041819(Medimmune)描述了鼻部施用的有利形式。因此，本發(fā)明包括在受治療者中預防或治療曱型流感的方法，所述方法包括施用有效量的克隆的DI曱型流感病毒粒子。所述克隆的DI甲型流感病毒粒子優(yōu)選地在所述受治療者中具有抗病毒效應。在其它方面，克隆的DI甲型流感病毒的施用優(yōu)選地提供獲得性曱型流感感染的即時保護效應。附加地或可選地，感染所述受治療者的曱型流感病毒與施用的DI曱型流感病毒粒子是相同或不同的亞型。本發(fā)明還包括將感染受治療者的毒性曱型流感病毒轉化為無毒的病毒感染的方法，所述方法包括為所述受治療者施用有效量的克隆的DI曱型流感病毒。本發(fā)明進一步提供對受治療者進行針對甲型流感病毒的免疫的方法，所述方法包括為所述受治療者施用有效量的克隆的DI曱型流感病毒和感染量的至少一個甲型流感毒才朱的活病毒。所述活病毒充當輔助病毒。所述克隆的DI甲型流感病毒粒子和所述活病毒可以單獨、同時或順序施用。本發(fā)明進一步提供將感染受治療者的毒性曱型流感病毒轉化為無毒的病毒感染并對所述受治療者進行針對所述感染病毒的免疫的方法，所述方法包括為所述受治療者施用克隆的DI甲型流感病毒。所述受治療者可感染或可疑似感染甲型流感病毒。在實際或甚至疑似感染的情況下，可在所述個體感染或疑似感染后48小時內，優(yōu)選地24小時內盡快施用克隆的DI病毒。相似地，如果個體很快要接觸甲型流感病毒，無論是感染的人、動物或禽類，他們可施用所述克隆的DI病毒作為預防措施。需要與已知或疑似感染甲型流感的動物或禽類屠體或人尸體接觸的人可施用本發(fā)明克隆的DI病毒。此類人員可在接觸甲型流感病毒風險之前，臨時施用本發(fā)明藥物作為預防。在上文描述的本發(fā)明的每種方法中，施用的克隆的DI病毒是足量的。所述輔助病毒可以是任何甲型流感毒林，無論是來自人或其它動物，包括禽類。在另一方面，本發(fā)明提供包含如下序列的核酸分子(a)SEQIDNO:l或SEQIDNO:2;或(b)與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2具有大于％%的同一性的核香酸序列；或(c)與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2在嚴格條件下雜交的核苷酸序列；或(d)與序列(a)、(b)或(c)中的任一個互補的核普酸序列。所述核苦酸序列可與SEQIDNO:l具有大于96.5、97、97.5、98、98.5、99、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9°/0的同一性。本發(fā)明還包括包含上文所述核酸分子的組合物。所述核酸優(yōu)選地是RNA，盡管在遺傳操作程序中可能會使用DNA。本發(fā)明還提供包含本文所述核酸的載體或質粒。載體可包括可操作連接至本發(fā)明核酸，任選地轉錄終止序列的啟動子。本發(fā)明核酸可位于所述啟動子的正義或反義方向。發(fā)現(xiàn)摻入甲型流感病毒粒子的本發(fā)明核酸有利地顯示出比其它克隆的DI病毒，例如317/Vic或220/PR8,更強的針對曱型流感的保護效應。(參見Duhaut&Dimmock,2003,J.Virol.Methods108:7582)。本發(fā)明優(yōu)選的克隆的DI病毒顯示出至少10倍、更優(yōu)選地至少100倍更強的針對甲型30流感的保護活性。在其它優(yōu)選的實施方案中，所述保護在8至500倍范圍內，更優(yōu)選地50至250倍保護。可使用任何感染性甲型流感病毒致死性攻擊在合適的動物，例如'J、鼠、雪貂體內建立保護效應。當單獨施用(無感染性輔助病毒)或其可包括與輔助病毒(其可以是同源/異源)，也可以是與攻擊病毒相同的毒抹合用時，所述保護效應可以是本發(fā)明克隆的DI病毒的預防效應。本發(fā)明進一步包括包含至少一部分本文所述核酸序列的引物或探針核酸分子。已知的針對流感的免疫方法依賴于刺激機體的免疫系統(tǒng)，以便白細胞產(chǎn)生連接至微生物表面的抗體和啟動殺傷所述微生物的過程。這對許多疾病，如天花、脊髓灰質炎和麻滲作用良好，但是對流感的效杲就差很多，這是因為流感病毒的外殼在持續(xù)變化。針對一個流感毒抹，例如H3N2的免疫對另一毒抹，如H5N1完全無效。這在出現(xiàn)新的大流行毒抹時尤其成為問題，因為所有現(xiàn)有疫苗可能都完全無效。在公共衛(wèi)生和醫(yī)學環(huán)境中，本發(fā)明DI病毒也被稱為"保護性病毒，，。所述保護性病毒保護動物抵抗各種流感毒抹，并提供針對所有曱型流感感染，包括H5N1和感染人的任何新的大流行或流行毒抹的保護作用。所述保護性病毒通過將流感感染速率降低至把有害感染變?yōu)獒槍υ摿鞲行问降囊呙绲某潭?，提供即時的保護和完全阻止流感癥狀的發(fā)展。它還可以對抗實際的感染，和如果在首次感染后達24小時和更長時間內提供時，提供保護作用。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，當施用至人、動物或禽類時，所述病毒的8個RNA鏈之一的RNA的約80%的特異性缺失提供針對所述病毒的保護作用。"保護性病毒"提供即時的流感保護和將流感感染轉化為它們自身的疫苗。缺失使所述保護性病毒變得無害，并阻止其在細胞內通過自身進行復制，以便它不能像正常流感病毒一樣傳播。不過，如果其是由另一流感病毒引入細胞，其保留其無害性質，但是將開始復制，并且其速度遠遠大于所述新的流感病毒。此由所述新的流感感染剌激的快速復制意味著新的侵入流感病毒^C所述"保護性病毒"有效包圍。這4及大地降低了所述新感染的進程，阻止了流感癥狀，并使機體有時間形成針對所述新的有害入侵者的免疫反應。所述保護性病毒有效地將所述毒性病毒轉化為無害的活疫苗。無論何種流感毒抹感染個體，所述"保護性病毒"均具有相同的有益效應。實驗結果證實了這一優(yōu)點。這是因為病毒的外殼與所述保護過程無關，所述效應作用于細胞內部的病毒基因。因此，所述保護性病毒代表了對抗任何新的病毒毒林以及現(xiàn)有毒抹傳播時高度有效的工具。可將其作為預防措施而無需根據(jù)特定流感毒林或突變進行改變。這在處理大流行的突然爆發(fā)時具有顯而易見的效益，因為在部署所述保護性病毒時人們無需知道所迷新毒林的精確組成，使其比僅對特定的現(xiàn)有病毒毒林有效的疫苗有效得多。此外，其保護是即時的，而由常規(guī)的流感疫苗接種產(chǎn)生的保護需要2-3周才能完全有效。實驗顯示單一劑量的保護性病毒可在感染流感病毒前6周給予而有效。相對于抗病毒藥物僅給予低于24小時的保護，這具有明顯的優(yōu)點。另一個優(yōu)點是流感病毒未顯示出對"保護性病毒"產(chǎn)生抗性。在感染后達24小時和更長時給予"保護性病毒"，其也具有保護作用。因此，其能對抗實際的感染。因此，其也可用作對感染個體的家屬或其它直接接觸者的治療。"保護性病毒"易于施用，因為其與任何其它流感病毒耙向相同的細胞和使用相同的方法進入所迷細胞。含有所述保護性病毒的生理鹽水滴可筒單地噴入鼻中。已用于一些疫苗的氣霧劑施用提供了另一種簡單的施用路徑。所述保護性病毒為馴化動物提供有用的治療。鴨具有腸道感染，雞有聯(lián)合的腸道和呼吸感染?？赏ㄟ^將所述保護性病毒加入它們的飲用水中而簡單地遞送至它們。一次劑量可為雞提供，例如，至少一周的保護。流感是賽馬產(chǎn)業(yè)和家馬的大問題。其最近也已成為美國家犬的問題，家貓易感染H5N1病毒。在小鼠和雪貂才莫型中，鼻內施用克隆的DI流感病毒(即"保護性病毒")具有針對強烈的感染性病毒攻擊的優(yōu)良的預防活性，雪貂模型接近地模擬人疾病。目前為止，最佳的DI病毒(244/PR8)的活性是任何非克隆的DI病毒的約50倍(Noble等，2004Vacane22:3018-3025)，并且其保護小鼠的時間遠遠長于非克隆的DI病毒。此外，僅有克隆的和因此的DI病毒具有治療活性，很可能是其具有較高的總體活性作用的結果。當歸一化為總HAU時，不同的克隆的DI病毒的抗病毒活性強度有很大差異。天然不復制的或紫外照射的感染性病毒中存在的缺損RNA或HA基因持續(xù)存在于培養(yǎng)細胞中(Cane等1987，Virology159:259-264;Cane&Dimmock，1990Virology175:385-390),但是克隆的DI"保護"RNA在體內的持續(xù)是未預料到的。一般而言，不認為甲型流感病毒RNA持續(xù)存在于免疫活性動物中。因為非克隆的DI病毒群體含有各種各樣的缺損RNA,所以尚無法確定作用的分子模式。不希望受任何特定理論的束縛，發(fā)明人認為一個可能是RNA基因組的復制與其大小成比例，所以小5倍的保護性RNA的復制速度快5倍。因此，從細胞中有相等數(shù)量的缺損和感染性基因組開始，經(jīng)4和6輪復制之后，將分別有90和99%的基因組是缺損的。在這些情況下，假定流感RNA包裝是有組織的過程，并且所述缺損RNA和其全長對等物以相同的效率包裝，大部分子代粒子將含有缺損RNA和是非感染性的。除了此感染性子代的減少之外，缺損病毒粒子將把保護性RNA傳播至相鄰細胞和使它們抗感染。缺損RNA還可與其非缺損對等物竟爭有限量的病毒或細胞組分，誘導a/p干擾素，或從缺損RNA形成siRNA-盡管已知后者僅在植物系統(tǒng)中發(fā)生。所述機制確實可能具有一致作用。保護濃度的克隆的和非克隆的保護性病毒在小鼠和雪貂中削弱毒性病毒感染。不會產(chǎn)生臨床疾病，但是產(chǎn)生足量的毒性病毒抗原以刺激獲得性免疫應答，獲得性免疫應答使這些動物對同源病毒的再感染免疫。與直覺相反，使用最高濃度的保護性病毒治療后的免疫性最弱，推測是因為抗原形成被抑制到近似亞免疫原水平?？寺〉腄I"保護性"病毒潛在地在對抗大流行流感方面提供多個相對于疫苗或現(xiàn)有藥物的優(yōu)點。流感疫苗的問題在于其對流行的病毒毒林精細的特異性。當出現(xiàn)新病毒時，選擇新毒抹、生產(chǎn)和測試疫苗和將其分配和施用至大量人群可耗費數(shù)個月至一年的時間。完全的疫苗誘導的免疫性需要約3周的成熟時間，而老年人可能無法啟動有效的免疫反應。與此相反，保護性病毒即時發(fā)揮其完全效應，而且應對甲型流感的任何毒林都有活性。其活性存在于病毒基因組而不是宿主的基因組中，所以對老年人也有有效的保護。抗病毒藥物的一個主要限制是抗性產(chǎn)生的速度，已分離到對達菲抗性的人流感。不過，保護性RNA依賴于正常病毒的高度保守的復制機器，所以不可能產(chǎn)生抗性。可使用抗原不同的輔助病毒給予后續(xù)劑量的保護性RNA。還必須選擇大多數(shù)人群體沒有免疫性和無毒的輔助病毒，如發(fā)明人使用的A/PR8(H1N1)病毒。下面將參考具體實施例和附圖對本發(fā)明進行詳細描述，其中圖1顯示本發(fā)明DI甲型流感病毒實例244/151PR8的核苷酸序列(SEQIDNO:l)。所述序列是所述病毒粒子正義RNA的序列。圖2顯示本發(fā)明優(yōu)選的DI曱型流感病毒實例244/151PR8的核苷酸序列(SEQIDNO:2)。所述序列是所述病毒粒子正義RNA的序列。圖3顯示使用244保護性流感RNA表達質粒和表達感染性A/WSN的多個質粒轉染293T細胞是如何抑制A/WSN病毒生產(chǎn)的。圖4顯示保護性病毒244/PR8在小鼠中介導的針對感染性A/WSN的預防活性，通過臨床疾病和體重變化監(jiān)控。圖5顯示244/PR8保護性病毒的預防活性的持續(xù)時間。圖6顯示不存在感染性病毒時，保護性RNA244(395nt)在小鼠肺部的壽命，如使用引物RNA1F和RNA1R的RT-PCR所示。具體實施例方式大多數(shù)DI曱型流感病毒具有一個內部缺失。關于命名，本文描述的克隆的DI病毒RNA的實例是RNA1—244/151/395A/PR/8/34(H1N1)xA/PR/8/34(H1N1)。因此(a)首個術語指其衍生自A/PR8/34(H1N1)病毒的RNA區(qū)段1的事實。(b)下一個術語表示其包含來自在所述病毒粒子中發(fā)現(xiàn)的RNA1的5'端的244nt和3'端的151nt，它們連接在一起形成395nt的連續(xù)的新RNA分子。(c)末端術語指輔助病毒，A/PR8/34病毒。(d)其縮寫名稱為244/151PR8。對于對具有本領域平均水平的讀者不明顯的地方，下文描述的實驗的具體實施例采用下列方法和程序克隆的DI病毒的制備具體實施例中使用的方法在下文描述并接受變化，還參見上述Duhaut&Dimmock(2003)中描述的材料和方法。用制備感染性A/PR8/34病毒(H1N1)必需的質粒組通過已知方法轉染HEK293T細胞。然后將所述轉染細胞與MDCK細胞共培養(yǎng)以擴增感染性病毒。收集含有所述感染性病毒和存在的任何DI病毒的組織培養(yǎng)液，低速離心除去碎片，然后儲存于-7(TC。病毒的存在通過雞紅細胞的凝集顯示(參見下文)。病毒的滴度記錄為每毫升病毒的血凝單位(HAU)。然后將組織培養(yǎng)液(500pl)注射入lO日齡含胚雞卵的尿嚢腔，以加強感染性病毒的濃度并推斷存在的DI病毒。卵在33。C孵育一天，然后在4°c冷藏過夜以殺死胚。然后通過標準方法從卵中收集尿嚢液。通過血凝確定病毒的量。含有病毒的尿囊液通過低速離心進行澄清和純化(參見下文)。將病毒分成小份，按2xl()SHAU/ml的濃度儲存于液氮中或-70。C。初步測試(參見下文)顯示此制劑保護小鼠免受A/WSN流感病毒的致死的鼻內攻擊，從而產(chǎn)生DIRNA。使用區(qū)段1特異性引物(參見下文)的RT-PCR顯示A/PR8/34的RNA1產(chǎn)生截短的RNA。隨后的測序顯示存在395核苷酸的主要的截短的RNA種類，并且其與A/PR8/34的RNA1同源。此RNA命名為244/151PR8。通過使用病毒和缺損RNA質粒共轉染293T細胞并與MDCK細胞培育，生成了含有克隆的區(qū)段1缺損的RNA220(H3N8)和317(H7N7)的病毒(Duhaut,S.D.&Dimmock，N.丄1998，PWogy248:241-253)。區(qū)段1的第三個確定的缺損RNA(244)是在A/PR8病毒質粒轉染后自發(fā)形成的(參見下面的表la)。下面的表la顯示保護性流感RNA和其輔助病毒的衍生和命名。表la<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>a220,保護性RNA;PR8,輔助病毒。b從左至右表示缺損病毒RNA的來源區(qū)段、反義RNA中的斷點殘基、核脊酸總數(shù)、病毒的來源。所述DI病毒制劑中輔助病毒感染性的去除通過定義，DI病毒貯液含有感染性輔助病毒。在接種要保護的動物之前，必須除去所述感染性。因此，將病毒置于塑料皿中，使其形成約l-2mm的層，在室溫下用臨界劑量(20秒)的紫外線照射。紫外照射靶向核酸(與大小成比例)，快速滅活輔助病毒的感染性。DI病毒RNA(395nt)及其活性未受到顯著影響，因為其紫外靶向大小比所述感染性基因組(13,600nt)的小34倍。需要的紫外劑量通過在相同條件下測量A/PR8/34病毒的感染性的滅活速率確定。紫外滅活輔助病毒之后，接種MDCK細胞，含胚卵和小鼠(鼻內，然后在含胚卵中培養(yǎng)肺部勻漿)顯示無殘留感染性(數(shù)據(jù)未顯示)。延長紫外照射破壞缺損病毒的小鼠保護活性(參見下文)。DI病毒的純化通過低速離心除去尿嚢液中存在的碎片。然后將上清液置于約25毫米10%蔗糖分隔層之上進行高速離心。低密度雜質富集于蔗糖上，而病毒沉淀至離心管底部。將所述沉淀軟化過夜后，將病毒按2x105HAU/ml重懸于PBS或含有0.1。/。w/v牛血清白蛋白的PBS。然后將其分成小份，凍存于液氮中或-70。C。所有程序均在4。C執(zhí)行。傳代的缺損病毒的真實性預期的缺損RNA在最終的純化病毒貯液(經(jīng)過1次細胞和2次卵傳代)中的存在通過使用末端引物和發(fā)生中央缺失后形成的獨特連接序列的特異性引物的RT-PCR確定。最后通過測序鑒定RNA。使用區(qū)段特異性引物對244/PR8缺損病毒進行進一步分析，顯示244是存在的主要RNA。流感病毒的血凝分析此分析基于如下事實病毒表面存在的主要蛋白血凝素與雞紅細胞的病毒受體結合，而許多病毒可以將所述細胞連接在一起，造成它們的凝集。此分析與感染性無關，同時測量感染性和非感染性流感病毒。在塑料檢測盤的孔中用生理鹽水稀釋劑對病毒進行連續(xù)2倍稀釋，然后加入第10次稀釋的雞紅細胞。完全混合后讓紅細胞沉淀。如果不存在病毒，紅細胞沉淀在孔的底部形成小點；當存在病毒時，紅細胞凝集并在孔的底部形成一薄層。病毒的滴度通過產(chǎn)生50%凝集的稀釋液的內插確定。該分析的優(yōu)點是其速度，紅細胞在約45分鐘內沉淀。該分析通常在室溫下執(zhí)行。使用DIRNA保護小鼠免受流感小鼠(C3H/He-mg:H-2k沖朱系)鼻內接種DI病毒，所迷DI病毒已用紫外照射20秒以除去感染性輔助病毒的感染性。當所述DI病毒制劑單獨接種于含胚雞卵時，其不具感染性，并且對小鼠無可觀察到的效應。小鼠為4至5周齡，體重16-20g。兩種性別均使用，但是分開居住。對照組的性別相應匹配。使用醚輕度麻醉小鼠，和40^1DI病毒分用至兩個鼻孔。使用接受8分鐘的延長紫外照射的DI病毒作為對照，研究所述DI病毒的任何刺激免疫系統(tǒng)或阻斷受體的效應。這會滅活DI活性，但是不影響病毒表面存在的血凝素或神經(jīng)氨酸酶蛋白的活性。使用了兩種感染性攻擊病毒。將它們滴定至小鼠以確定引起相當?shù)募膊〉母髯詣┝?。小鼠接種物通常包含(a)活性、非感染性Dl病毒，有時含有確定劑量的感染性攻擊流感病毒。(b)含有相同劑量感染性流感病毒的紫外殺傷的DI病毒。(c)單獨的活性DI病毒(d)稀釋劑。發(fā)病率根據(jù)體重的減輕和通過臨床標準評估。體重減輕可以是嚴重的，超過初始體重的25%。疾病進程定義為(a)健康小鼠(b)不適，包括輕微豎毛、步態(tài)輕微改變和走動增加的臨床跡象(c)強烈豎毛、腹部收縮、步態(tài)改變、周期性靜止、呼吸頻率增加和有時羅音的臨床跡象(d)上述臨床跡象，但是加強；同時顯示幾乎不活動，呈垂死狀。當此類小鼠明確不能存活時，將其處死(e)死亡。測試的所有病毒引起相似的臨床疾病。此外，尸體解剖顯示，所有病毒引起相似的肺實變。雖然任何一項所述臨床跡象的檢測是客觀的觀察，但是其表達的程度是主觀的。不過根據(jù)經(jīng)驗，即使是輕微患病的小鼠也容易認出。流感致死的時間范圍依賴于病毒劑量，但是典型的臨床跡象在3-5天內開始，在另外2-4天內發(fā)展至死亡。非致死疾病的臨床過程將更長。流感病毒毒抹之間的毒力(即引起疾病需要的感染性病毒的量)存在差異，但是它們均產(chǎn)生相似的臨床表現(xiàn)。自交小鼠毒林的易感性(即引起疾病需要的感染性病毒的量)存在差異，但是根據(jù)有限的數(shù)據(jù)，其疾病模式是相似的。C3H/He-mg小鼠是優(yōu)選的易感毒抹，其在大多數(shù)接種的動物中產(chǎn)生可重復的疾病。作為疾病的客觀測量，也對小鼠進行稱重。使用體重仍在增加的4-5周齡(16-20g)的小鼠。小鼠體重增加約500mg/天。隨著感染的發(fā)展，小鼠體重停止增加，然后開始減輕。這發(fā)生于它們顯示疾病跡象(如上文的lb)之前約一天。小鼠成組稱重，所述組通常包含5只小鼠或更多。因此，減輕2g(400mg/小鼠)左右很容易檢測。小鼠在死亡/淘汰之前可失去總重量的最多25%,即20g小鼠將失去5g。RT-PCR方案使用Trizol試劑(Invitrogen)從病毒中提取RNA并溶解于100^水?？蛇x地，RNA是通過將一只小鼠的兩個肺與無菌沙在4mlTrizol中研磨提取的。小份5^總RNA(或200pl病毒的RNA)在20pl反應中42°C反轉錄1小時，使用與所述vRNA的3'末端互補的通用的甲型流感RNA1特異性引物(RNA1F:5'AGCGAAAGCAGGTCAAATATA3')。RNA1編碼病毒復制酶的PB2蛋白組分。然后通過PCR擴增所述反轉錄反應小份(1.5所述PCR使用r叫DNA聚合酶(MBIFermentas或NewEnglandBiolabs)和與所述cRNA的3'末端互補的通用的特異性針對甲型流感病毒的RNA39異性針對244iRNA中的連接序列的引物244J(5'ATCCCCTCAGTCTTCTCCTG3')在25pl反應體積進行。RNA1F與公布的PR8序列存在一個錯配，而RNA1R與公布的PR8序列相同。PCR由30個循環(huán)(94。C，20s;50°C，30s和72。C，30s)組成。10pl小份通過瓊脂糖凝月交電泳進行分析。驗證小鼠保護活性存在于RNA244中因為存在痕量其它缺損RNA,所以驗證244/PR8在小鼠中的抗病毒活性存在于RNA244，而不是244和另一缺損RNA聯(lián)合作用非常重要。為此目的，將克隆的244RNA轉染至表達質粒和編碼感染性A/WSN的質粒。在平行滴定中，得到的缺損244/WSN病毒具有與244/PR8相同的保護活性(完全的保護為每只小鼠100ng,比其它缺損病毒高至少IO倍，參見下文的表15),證實RNA244負責預防(數(shù)據(jù)未顯示)。這也證明了缺損RNA可以很容易地轉移到輔助病毒。確定的缺損病毒對小鼠具有針對感染性流感病毒的預防保護小鼠鼻內接種缺損病毒或已用紫外照射毀壞其潛在保護活性的缺損病毒。后者保留完全的H和N活性，并充當免疫原性和細胞受體阻斷的對照。在第一組實驗中，小鼠同時接種了單一劑量的保護性病毒(400HAU)和小鼠致病性感染性A/WSN。圖4顯示小鼠中由保護性病毒244/PR8介導的針對感染性A/WSN的預防活性，如通過臨床疾病和體重變化所監(jiān)控。小鼠同時接受400(a、b、c)、40(d、e、f)和4HAU(g、h、i)的244/PR8保護性病毒和10LD5。A/WSN。該圖顯示臨床評分(a、d、g)和體重變化(b、e、h)。括號內為存活百分比。符號指示窗格a、d、g中給出的接種物■，滅活的保護性病毒+10LD50A/WSN;▲，保護性病毒+10LD5QA/WSN;，稀釋劑。窗格c、f、i顯示使用10,000LD5qA/WSN，在所述第一次感染3周后進行攻擊的存活者。因為最高劑量的保護性病毒針對此高劑量A/WSN不產(chǎn)生保護作用(未顯示)，這測試了獲得性免疫的形成。接受紫外滅活的保護性病毒加A/WSN的小鼠經(jīng)受體重減輕和臨床疾病，并全部死亡(圖4a、b)。這與單獨接受感染性病毒的小鼠中的疾病一致(數(shù)據(jù)未顯示)。相比之下，接受保護性病毒加A/WSN的小鼠像;溪擬感染的對照動物一樣體重繼續(xù)增加，并且未顯示疾病跡象(圖4a、b)。10倍稀釋的保護性病毒(至40HAU/小鼠)保持主要的臨床疾病和死亡困境，盡管存在輕微的、短暫的體重減輕和一些不適，其在第IO天得到解決(圖4d、e)。最終，每只小鼠4HAU的保護性病毒減緩了臨床跡象和體重減輕的發(fā)作，將存活率從0增加至60%(圖4g、h)。相同最小劑量(40HAU/小鼠)的244/PR8對4個獨立制劑的感染性病毒攻擊產(chǎn)生實質性保護，證明了保護性病毒生產(chǎn)和作用的可重復性。這相當于每只小鼠100ng病毒蛋白或400x106個病毒粒子。所有制劑還對10ng保護性病毒產(chǎn)生顯著的保護。按完全相同的方法生產(chǎn)、HAU歸一化和測試含有2個不同的確定的區(qū)段1保護性RNA中的一個或另一個的三種其它的保護性病毒，其活性比244/PR8低10至100倍(參見下文的表15)。它們具有相對一致的抵抗A/PR8的能力，表明所述差異不是攻擊病毒特異性的(數(shù)據(jù)未顯示)。需要對每個制劑中的保護性RNA分子的數(shù)量進行RT-PCR定量，以確定保護性RNA的內在活性是否確實存在差異或其被特定輔助病毒復制或包裝的效率。對于A/PR8或A/Vic輔助病毒，RNA220的保護活性存在10倍差異可能指示此相互作用的重要性(參見下文的表15)。最后，最高劑量的244/PR8完全預防了10倍A/WSN攻擊劑量(10011)50)引起的臨床疾病，并將1000LD5QA/WSN轉化為具有溫和臨床跡象的短暫疾病(數(shù)據(jù)未顯示)。保護性病毒發(fā)揮的預防保護的持續(xù)時間圖5顯示244/PR8保護性病毒預防活性的持續(xù)時間。在感染前42天(6周)鼻內施用單一劑量的保護性病毒(a、b)或滅活的保護性病毒(c、d)(4000HAU/10ng):■，滅活的保護性病毒；▲,保護性病毒。使用10LD50A/WSN在第0天(箭頭)攻擊小鼠。監(jiān)控小鼠的體重變化(a、c)和總的臨床評分(b、d)。單一劑量的保護性病毒或滅活的保護性病毒(4000HAU)不具有害效應，動物保持完全健康，體重增加與模擬接種的對照非常相象(圖5a、c)。接受保護性病毒后1至42天(6周)，使用感染性病毒通過鼻內攻擊小鼠。圖5顯示6周組的數(shù)據(jù)。接受保護性病毒的小鼠得到完全保護(圖5c、d),而接受滅活的保護性病毒的小鼠則感染而死(圖5a、b)。所述滅活的保護性病毒未能預防疾病，顯示小鼠未啟動針對流感病毒抗原的獲得性免疫應答，并暗示所述保護性RNA續(xù)存于鼠呼吸道中。使用從僅接種了保護性病毒的小鼠肺部提取的RNA通過RT-PCR對此進行了測試。圖6顯示不存在感染性病毒時，保護性RNA244(395nt)在小鼠肺部的壽命，如使用引物RNA1F和RNA1R的RT-PCR所示。泳道1，DNA大小標志物(bp);泳道2-6,小鼠肺部的擴增子。泳道2-5的RNA分別是在接種4000HAU保護性病毒后1天、9天、21天和42天提取的；泳道6，模擬接種。RT-PCR顯示保護性RNA不能持續(xù)，并隨時間而顯示出下降(圖6)。檢測了接種后達21天，暗示保護性RNA是使小鼠抗臨床流感的原因。接受10倍稀釋的保護性病毒(400HAU)的小鼠在受攻擊7天后受到完全保護，但是14天后則不行(數(shù)據(jù)未顯示)。預防擴展至甲型流感病毒的不同亞型對抗流感中的問題之一就是可存在144種不同的甲型病毒亞型，以及它們全部在人中經(jīng)歷的漸進性漂移變異，每種亞型和顯著的漂移變異體都需要其自身的疫苗。不過，鼻內施用的244/PR8保護性病毒保護小鼠免受由人毒抹H3N2(A/England/939/69xA/PR/8/34)、H2N2(A/Jap/305/57)和抗原不同的H1N1病毒(A/PR/8/34和A/WS/33(N》和馬毒抹H3N8(A/Newmarket/7339〃9)引起的臨床疾病(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，保護性病毒提供不受H和N表面抗原限制的廣泛的保護作用。保護性病毒具有治療效益關于非克隆的干擾性病毒的先前工作未顯示出治療效應，但是由于確定的保護性病毒強烈的預防作用，對此實驗進行了修正。和從前一樣，用10LD5G的A/WSN感染小鼠，然后在24和48小時后使用單一劑量的保護性病毒或滅活的保護性病毒(4000HAU)對照進行鼻內治療。所有對照小鼠均死亡，在24小時使用保護性病毒治療完全防止了臨床疾病、體重減輕和死亡；在48小時的所有小鼠均患病，但是疾病被延遲，并且33%得到恢復(下文的表lb)。增加感染劑量降低了治療效力。表lb顯示保護性病毒在小鼠中的治療效益a表lb<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>a使用10LDsoA/WSN進行感染，并在所示時間使用滅活的保護性病毒或保護性病毒(4000HAU/10嗎病毒蛋白)進行感染后治療(p.i.)。所有接種均是淺麻醉在鼻內進行。使用每組5-7只小鼠；此實驗代表3次獨立的實驗。下面的實施例提供了包括本發(fā)明克隆的DI病毒的更具體的實驗細節(jié)。實施例1-克隆的DI病毒220/PR8的生產(chǎn)本領域已知的先前工作教導DI病毒的生產(chǎn)在用大量接種物(例如高達每卵2ml)接種含胚雞卵時是最佳的。給出的解釋是非感染性DI病毒居留的細胞也需要接受感染性(輔助)病毒，以便前者可以復制。此外，當傳代重復兩次或三次時，存在的DI病毒正常地增加。最終，產(chǎn)生的DI病毒的量超過存在的感染性病毒的量，由于缺乏輔助病毒功能，總的病毒生產(chǎn)下降。出乎意料的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用日常、即標準量的克隆的DI曱型流感病毒接種含胚雞卵未能產(chǎn)生預期量的DI病毒材料；差距之大，以致影響進一步的實驗室研究，包括體內動物研究；更不用說臨床試驗或生產(chǎn)用于生產(chǎn)藥學可接受組合物或疫苗的DI病毒制劑。驚人的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)IOOpl克隆的DI病毒的接種物在含胚雞卵中33°C即使單次傳代48小時卻得到了相當高的DI病毒產(chǎn)量。特別地，DI病毒244/151PR8在使用僅100^1接種物時得到了非常高的病毒產(chǎn)量(如血凝所示)。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過將所述接種物稀釋1/10,僅將ioow此接種物在10日齡含胚雞卯尿嚢腔中傳代一次即使總病毒增加了約10倍(如血凝所示)。通過在含胚雞卵中傳代之前稀釋所述病毒制劑實現(xiàn)的保護性病毒產(chǎn)量的增加是完全出乎意料的。此外，當對從稀釋接種物中高產(chǎn)量獲得的傳代病毒進行純化和濃縮后，發(fā)現(xiàn)此病毒制劑保護小鼠免受A/WSN流感病毒的致死的鼻內攻擊。這證明所述傳代的病毒制劑含有DIRNA。因此，發(fā)明人確定的一個問題就是如何增加潛在的克隆的DI病毒而保持高(充足的)病毒產(chǎn)量。使用的程序如下1.將生產(chǎn)感染性輔助流感病毒所需的質粒和編碼RNA220(62.5ng)的質粒轉染至HEK293T細胞。而HEK293T細胞雖然在轉染中有用，但是它們在擴大克隆的病毒的量方面并不那么有用。2.然后將轉染的293T細胞與Madin-Derby犬腎(MDCK)細胞共培養(yǎng)。孵育2天后取組織培養(yǎng)液，測試其病毒血凝活性，然后于-70。C冷凍。雖然MDCK細胞難以轉染，但是它們是非常適合培養(yǎng)流感病毒。3.將來自MDCK細胞(500pl/卵)的組織培養(yǎng)液注射入可育雞卵的尿嚢腔以增強病毒滴度(0代(P))。將卵在33。C孵育24小時，然后4。C冷藏以殺死胚。然后從所述卵中取出尿嚢液(其含有病毒)和測試HA活性。4.將病毒在卵中連續(xù)傳代(Pl-3)，使用200pl接種物，孵育24小時。下文表lc將克隆的DI病毒220/PR8的產(chǎn)量表示為傳代次數(shù)的函數(shù)表lc44實驗編號宿主和接種物接種物病毒產(chǎn)量代(P)編號(實驗編號)體積(W)(HAU/ml)774H(i)293T細質粒不適用32胞(轉染)77卿i)卯-PO774H(i)5009600*778卯—Pl774柳)2008000779卵—P2778200800788印一P27782001600780印一P3779200400HAU,血凝單位。*野生型PR8產(chǎn)量>19200HAU/ml。注意，HA滴度不是同時測量的，可以根據(jù)紅細胞的年齡而產(chǎn)生滴度的小變化。在卵中使用高病毒滴度/大體積接種物進行了約3次傳代。(參見表la的P1至P3)在P1獲得的滴度與野生型病毒相當(實際約低2.4倍)。在P2(兩次實驗)和P3獲得的滴度比野生型病毒低12至50倍，即沒有足量的可用的病毒。下文表2顯示作為接種物體積的函數(shù)的克隆的DI病毒220/PR8的產(chǎn)量。表2實驗編號宿主和代(P)編號接種物(實驗編號)接種物體積(pl)病毒產(chǎn)量歸/邁l)Dl活性'778774H(ii)2008000未執(zhí)行794卵一P1774H(ii)104800十+++802卵一P1774H(ii)14800未執(zhí)行咖卵一P1774H(ii)0.15000未執(zhí)行*在使用A/WSN進行致死攻擊的小鼠中。減少接種物體積對總病毒產(chǎn)量幾乎沒有影響，但是IO接種物經(jīng)濟可行。圖3顯示其中各種量的244質粒與恒量的編碼感染性A/WSN的質粒一起轉染293T細胞的實驗結果。一天后，將它們與MDCK細胞共培養(yǎng)7天。測量培養(yǎng)液中的病毒產(chǎn)量(HAU)。已證明病毒產(chǎn)量對轉染的表達缺損RNA的質粒的量和在含胚雞卵中進行傳代的病毒的量敏感(數(shù)據(jù)未顯示)。通過接種更少缺損RNA質?；蛟诤呗阎袀鬟f更少量的病毒獲得了更好的病毒產(chǎn)量。連續(xù)的卵代分別產(chǎn)生種子病毒和最終的病毒貯液。經(jīng)差速離心純化后，缺損病毒歸一化為2x105血凝單位(HAU)/ml。實施例2-保護性病毒244/PR8的生產(chǎn)使用的主要保護性RNA(區(qū)段1;RNA244)是在編碼感染性A/PR/8/34的質粒的轉染/共培養(yǎng)過程中自發(fā)產(chǎn)生的(Subbarao,K.等2003Virology305:192-200)。轉染293T細胞的DNA混合物含有0.5昭各種的8個A/PR8基因區(qū)段(在Poll啟動子控制下)、0.5jig各種PB1和PB2表達質粒、0.1貼PA表達質粒和1嗎NP表達質粒和Fugene(Roche)。為了優(yōu)化所述244iRNA質粒的轉染，將244RNA克隆至Poll表達質粒pPOLI-SapIT(Subbarao(2003)同上)，以便表達vRNA正義轉錄本。將不同量的244質粒(0-0.5pg)轉染293T細胞，如上文所述。24小時之后，293T細胞用胰酶消化，與MDCK細胞混合并重新涂板。7天后收集培養(yǎng)上清液，病毒產(chǎn)量通過HA分析確定。在另一實驗中，使用了編碼A/WSN的質粒(Neumann，G.等1999Proc.Natl.Acad.Sci.2^:9345-9350)。24小時之后，293T細胞用胰酶消化，與MDCK細胞混合，重新涂板，7天后收集培養(yǎng)上清液。病毒的生長通過HA分析確定。其在含胚雞卵中進行兩次傳代，以制備種子貯液和用于小鼠研究的工作貯液。通過蔗糖差速離心純化病毒。貯液重懸于含有0.1%w/v牛血清白蛋白的PBS中、通過HA滴定進行歸一化，儲存于液氮中。對從純化的病毒中提取的RNA的RT-PCR和測序顯示244RNA是通過區(qū)段1的單個約80%的中央缺失產(chǎn)生的。該RNA具有395nt，包含nt1-244和1891-2041(反義RNA)。因此，其保留了精確末端和含有復制和包殼信號的末端序列。使用每個基因組區(qū)段特異性的引物的分析顯示，所迷244RNA是存在的唯一的主要缺損RNA。244RNA在傳代時保留其序列，并且不會被大量的其它缺損RNA替換或增加。含有RNA220或317的保護性病毒A/PR8或A/Victoria/3/75(A/Vic;H3N2)(Duhaut，S.D.&Dimmock,N.J.2003,JournalofVirologicalMethods108:75-82)是用相同方法生產(chǎn)的。需要優(yōu)化轉染過程中缺損RNA質粒的量(參見下文)和卵接種物的量，以避免保護性病毒產(chǎn)量低。其它甲型流感病毒的感染性病毒貯液是通過低多樣性感染(約1(^EID5Q)生產(chǎn)的。實施例3-克隆的DI病毒244/151PR8的生產(chǎn)將尿嚢液(10pl/卵)注入可育雞卵的尿嚢腔以制備DI病毒的貯液。將卵在33°C孵育48小時，然后在4。C冷藏以殺死胚。然后取出尿嚢液并測試HA活性。病毒通過在4。C差速離心進行純化。通過"低速"離心(3000rpm,10min,BeckmanGS-6R離心機，水平轉頭)除去大的碎片。然后在BeckmanSW28轉頭中5ml蔗糖墊層(10%w/vTris緩沖生理鹽水，pH7.4)，26000rpmg離心2小時沉淀病毒，以將病毒與較小的污染物分開。含有低密度脂的材料(例如卵黃)保留在蔗糖上。然后滴定病毒的HA，并調節(jié)至2x105HAU/ml。以小份儲存于液氮中或-70。C。下面的表3顯示克隆的DI病毒244/151PR8的生產(chǎn)結果表3<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>P0,零代。*在A/WSN致死攻擊的小鼠中；二者在1/100時均具有+++保護性。因此，在卵代中生產(chǎn)的DI活性是可重復的。實施例4-小鼠244/151PR8DI活性的滴定在細胞培養(yǎng)物、卵和小鼠中的滴定需要確定傳染性滴度。通過標準程序在瓊脂下對MDCK細胞中的病毒進行噬菌斑測定。使用限制稀釋的病毒接種卵，然后孵育3天。通過尿嚢液HA鑒定病毒陽性卵。按下文所述接種小鼠，3天后處死小鼠，將研磨的個體小鼠的肺接種至卵，然后通過HA確定病毒的存在?？蛇x地，使用同源病毒在3周后鼻內攻擊小鼠，以確定亞臨床感染是否刺激保護性免疫。卵和小鼠終點感染性滴度根據(jù)Spearman曙Karber(Karber，G.，7fec^)ooA:o/F/>o/ogy(病毒學教科書)(Rhodes，A.J.&vanRooyen,C.E.編)118(Williams和WilkinsCo.，Baltimore,1968》計算。按先前描述的方法(Noble等，2004Vaccine21:3018-3025)將40jil接種物在輕度醚麻醉的情況下鼻內接種至成年C3H/He-mg(H-2"小鼠(4周齡；16-20g),所述40^il接種物在兩個鼻孔之間進行分配。由于紫外靶標大小的差異-13,600nt的感染性RNA和395nt的保護性RNA，可通過短暫的(20s)253.7nm下突然紫外照射消除輔助病毒感染性而不降低保護。通過滅活A/PR8感染性對燈進行校準。更長的紫外照射(8分鐘)滅活保護，而提供用作任何刺激免疫系統(tǒng)或阻斷受體效應的對照的制劑。照射不影響H或N活性。小鼠接受非感染性保護性病毒、滅活的保護性病毒、感染性攻擊病毒或稀釋劑的各種組合。在小鼠中滴定感染性攻擊病毒以確定引起相當?shù)暮粑膊〉母髯詣┝?。使用免疫確定的10LD5()(100ID5C0AAVSN通過鼻內路徑感染小鼠。小鼠的健康狀況通過體重損失和先前描述的臨床標準(Noble，S.&Dimmock，N.J.,1994JournalofGeneralVirology75:3485-3491)評估。小鼠成組進行體重測量。臨床標準的評分如下每個健康小鼠l分；顯示不適跡象，包括一些豎毛、輕微的步態(tài)改變和走動增加的小鼠2分；顯示強烈豎毛、腹部收縮、步態(tài)改變、周期性靜止、呼吸頻率增加和有時羅音的小鼠3分；顯示增強的上述組特性，但是幾乎不活動，呈垂死狀的小鼠4分；當此類小鼠明確不能存活時，將其處死；和死亡小鼠5分。為了進行比較，用總臨床評分除以實驗組中的小鼠數(shù)量。所有病毒引起相似的臨床疾病，包括肺實變。實驗遵循英國癌癥研究協(xié)調委員會(UKCoordinatingCommitteeforCancerResearch)的原貝寸。實-驗1-400HAU的DI病毒保護小鼠j氐抗致死的A/WSN下面的表4顯示小鼠鼻內接種^0HAU(約1貼病毒蛋白)紫外滅活的DI病毒與攻擊性A/WSN病毒的混合物或DI病毒與攻擊性A/WSN病毒的混合物的結果。小鼠還接種了單獨的DI病毒。小鼠在輕度醚麻醉后接種。表4天數(shù)iDIV+病毒aDlV+病毒aDIV單獨b體重患病死亡體重患病死亡體重患病死亡01070011500490011080011600520021090011700480031100011900500041063011900500051025012100510069450124005300786141220052008171125005300917112700540010171129005500iDIV=紫外滅活的DI病毒;DIV二DI病毒。&5只小鼠/組；4只小鼠/組接受滅活的DI病毒加攻擊病毒的所有小鼠體重減輕并患病；80%死亡。接受DI病毒加攻擊病毒的所有小鼠保持臨床正常。除第7天外，它們體重每天均增加。實驗2-接種后3周時使用高劑量A/WSN(約1000LD^)攻擊所有存活小鼠下面的表5顯示取上文實驗1的3周存活小鼠并使用高劑量A/WSN攻擊它們的結果。表549<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>iDIV=紫外滅活的DI病毒DIV=DI病毒25只小鼠/組；5只小鼠/組先前接受單獨的DI病毒的小鼠體重減輕，在第6天死亡。這暗示DI病毒已不再存在或不能抵擋高劑量的攻擊病毒。先前接受DI病毒加攻擊病毒的小鼠體重增加，保持良好，暗示它們具有對A/WSN的獲得性免疫。實驗3-40HAUDI病毒保護小鼠抵抗致死的A/WSN表6顯示鼠鼻內接種40HAU(約100ng病毒蛋白)紫外滅活的DI病毒與攻擊性A/WSN病毒的混合物或DI病毒與攻擊性A/WSN病毒的混合物的結果。小鼠也接受單獨的DI病毒(2只/組)。小鼠在輕度醚麻醉后接種。表6天數(shù)iDIV+病毒aDlV+病毒bDIV單獨c體重'患死亡體重患病死亡體重患病死亡0640078004200166008000430026700830044003670086004700466008700460056310880047006574085004700754408240490085130852050009393185205000101512880051001114189005200iDIV=紫外滅活的DI病毒DIV:DI病毒。M只小鼠/組;b5只小鼠/組;。2只小鼠/組接受滅活的DI病毒加攻擊病毒的所有小鼠都體重減輕，患病和死亡。接受DI病毒加攻擊病毒的小鼠發(fā)展了延遲和輕度的臨床疾病(第7-9天)，所述臨床疾病快速消退。它們有輕微的臨時性體重損失(第6和7天)。實驗4-4HAUDI病毒保護小鼠抵抗致死的A/WSN下面的表7顯示小鼠鼻內接種4HAU(約10ng病毒蛋白)紫外滅活的DI病毒與攻擊性A/WSN病毒的混合物或DI病毒與攻擊性A/WSN病毒的混合物的結果。小鼠接受單獨的DI病毒(2只/組)。小鼠在輕度醚麻醉后接種。表751<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>iDIV=紫外滅活的DI病毒DIV=DI病毒a40HAU/小鼠；5只小鼠/組b4HAU/小鼠；5只小鼠/組接受滅活的DI病毒加攻擊病毒的所有小鼠都體重減輕，患病和死亡。接受4HAUDI病毒加攻擊病毒的所有小鼠發(fā)展臨床疾病，并有體重損失。3/5的小鼠(60%)在11天后存活，表明此低劑量的DI病毒具有微弱的保護作用。但是1只小鼠患病，并在第16天死亡。實驗5-使用高劑量A/WSN攻擊接種后3周存活的所有小鼠下面的表8顯示使用上文實驗3和4的存活小鼠的實驗的結果。使用約1000LD5GA/WSN攻擊這些存活小鼠。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>iDIV=紫外滅活的DI病毒DIV二DI病毒。"只小鼠/組b2只小鼠/組在接受滅活的DI病毒6周后攻擊的小鼠體重減輕、患病和死亡。在接受DI病毒6周后攻擊的小鼠體重繼續(xù)增加(除了第4和第5天輕微減輕之外)，并且未顯示臨床疾病。下面的表ll顯示使用高劑量(約1000LD5。)A/WSN單獨攻擊未患臨床疾病(并且其總體上體重增加)的小鼠(上文)的結果。從第9周開始，監(jiān)控小鼠的免疫狀態(tài)10天。表11天數(shù)iDIV之后病毒aDIV之后病毒a單,蟲的病毒b體重患病死亡體重患病死亡體重患病死亡0由于仍患病而未執(zhí);亍147005500114900540021490053203148004720415000452051510042116153001817153008156009155001015700iDIV=紫外滅活的DI病毒；DIV-DI病毒。"只小鼠/組。b2只小鼠/組；攻擊病毒的對照；之前未接種與對照(未進行DIV治療)相比，之前進行DIV處理的小鼠抵抗住了高劑量的致死攻擊，表明它們已具有對A/WSN的獲得性免疫。55實施例6-在感染21小時后給予244/151PR8具有微弱的治療效果下面的表12顯示使用A/WSN感染小鼠后再在21小時或48小時(未顯示)后施用244/151PR8的結果。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>iDIV=紫外滅活的DI病毒DIV-DI病毒。"只小鼠/組。b2只小鼠/組。在A/WSN感染21小時后使用DI病毒進行治療將小鼠的體重減輕和臨床疾病延遲了2天。2/7的小鼠(29%)得到恢復，對比接受滅活的DI病毒的小鼠為0/7。不過，這是異常強烈的攻擊，至第3天100%小鼠患病。在感染48小時后給予DI病毒無保護作用。實施例7-高劑量244/151PR8阻止A/WSN引起的原發(fā)感染、疾病和死亡。下文的表13顯示其中高劑量244/151PR8阻止了A/WSN引起的原發(fā)感染、疾病和死亡，但是與施用更加稀釋的DI病毒得到的免疫性相比，針對高劑量A/WSN攻擊產(chǎn)生較差的常規(guī)免疫性的結果。4妄種時間線第0天使用DI病毒十A/WSN(原發(fā)感染)的混合物接種小鼠。除一些(3/5)接受4HAU(第3歹'J)的小鼠外，所有小鼠均得到保護。第21天使用高劑量(約1000LD5q)A/WSN攻擊病毒攻擊小鼠。數(shù)據(jù)顯示于下面的表n(第5-7列)。表13DI病毒劑量(腿)批號實驗編號初始感染高劑量攻擊死亡數(shù)/感染數(shù)體重損失患病數(shù)/攻擊數(shù)死亡數(shù)/攻擊數(shù)400079334770/7是5/7(71%)*4/7(57%)79335280/4是4/4(100%)2/4(50%)79735630/4是4/4(100%)3/4(75%)40079334870/4否0/479735630/4否0/44079334980/5否0/579335630/4否0/479735120/4否0/4479335122/5否0/2'平均值=87%(患病)和60%(死亡)。最高濃度的DI病毒(4000HAU/小鼠或1/1稀釋)保護動物抵抗A/WSN,但是并不賦予它們對后續(xù)攻擊的免疫性；但是較低量的DI病毒對原發(fā)感染產(chǎn)生約50%的保護，存活小鼠對攻擊具有免疫性。不希望受任何特定理論的束縛，可能是最高濃度的DI病毒p條低了原發(fā)感染中A/WSN的增殖，以致其不能進行免疫。所述實驗證明了DI病毒的效力，并表明需要調節(jié)DI病毒的劑量以允許形成免疫性。過多的DI病毒可能對在個體中形成免疫性具有相反的效果。實施例8-di病毒在小鼠中針對AAVSN攻擊病毒的相對活性純化DI病毒并根據(jù)其血凝活性(所述血凝活性與存在的病毒粒子的數(shù)57量直接成比例)進行歸一化。使用攻擊性A/WSN病毒，在小鼠中執(zhí)行了1000倍劑量范圍的DI病毒活性的滴定。小鼠同時接種分級劑量的DI病毒+A/WSN或UV-滅活的DI病毒+A/WSN(數(shù)據(jù)未顯示)，并監(jiān)控其體重和臨床狀態(tài)。接受滅活的DI病毒+A/WSN的大多數(shù)小鼠具有》20%的體重損失、嚴重的臨床疾病并死亡。下面的表14顯示保護的小鼠(++++)與模擬接種的對照無實質區(qū)別。表14HAU/小鼠244/I51PR8"220/Vic220/PR8317/Vic7937977927987947964000++++/3477++++/3563++++/3415++++/3588++++/3511++++/3517++++/3528++++/3S27+++/3554400+++4V3487++++/3563++++/349S+++/3588+/3511+++/35740+十++/3498++十/3563-/3588+/3511-/35"+++/35124+/3512aDI病毒，下面是其批號；注意793和797是從同一來源制備的獨立制劑。b保護范圍從無體重損失或臨床疾病(++++),經(jīng)不同程度的體重損失和臨床疾病(+++至+),至與接受滅活的DI病毒+A/WSN的對照小鼠無差別的體重損失和臨床疾病(-)。'3477'等是實驗編號。PR8(A/PuertoRico/8/34(HlNl))和Vic(A/Victoria/3/75(ICN2))是輔助病毒。活性最高的DI病毒是244/151PR8，其在低至每只小鼠40HAU(100ng病毒蛋白)時幾乎完全保護小鼠。244/151PR8的2個獨立制劑重復了此結果。所述DI病毒的活性從小于220/Vic的10倍至小于220/PR8的100倍不等。保護作用的順序如下244/151PR8>220/Vic>317/Vic>220/PR8。雖然并不影響結果和得出的結論，但是HAU僅給出大致測量的DI病毒的量，例如其同時測量DI和輔助病毒。下面的表15顯示2-4個獨立實驗的總結，其比較了小鼠中由各種確定的保護性病毒介導的針對感染性流感病毒的預防活性。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>感染天數(shù)感染后24小時病毒+iDI病毒11感染后24小時病毒+DI病毒11感染后24小時DI病毒b體重患病死亡體重患病死亡體重患病死亡011400114003500111400116003600211200112003500310660m00350041026011600380059551116003700674331170036007312119003700811571037009116710380010117003800n1!7720370012118"037001311800370014121003900iPV，紫外滅活的保護性病毒；DI，干擾缺損病毒；體重單位為克；顯示了每組每天發(fā)生的患病/死亡小鼠數(shù)。()指小鼠可能已患病，但是并未確定患病。36只小鼠/組；b2只小鼠/組)。使用對照滅活的DI病毒治療的所有感染小鼠均體重減輕，并在感染3天后患病。至第7天，所有小鼠均死亡。使用DI病毒治療的感染小鼠體重略有減輕和/或體重停止增加，但是在對照組逐漸死亡的時間內仍保持臨床正常?？赡茉诘?、9、11和12天出現(xiàn)輕度疾病，但這是短暫的。所有小鼠(100%)在實驗終止時均處于健康狀態(tài)。感染3周后，使用強致死劑量的A/WSN鼻內攻擊已受DI病毒保護的小鼠(上文表16第2列)。體重和臨床跡象表明小鼠完全不受影響，而之前未經(jīng)歷任何流感病毒的對照小鼠全部死亡。使用的病毒劑量過大，以致DI60病毒不能提供保護作用，因此這些數(shù)據(jù)暗示盡管在第一次感染過程中小鼠并未明確患病，但是它們已形成了對A/WSN的獲得性免疫。下面的表17顯示接受中間劑量(約5MLDso)感染性A/WSN病毒、然后在24小時后施用DI病毒(對照施用滅活的DI病毒，二者均為4000HAU，約合10昭病毒蛋白)的小鼠的結果。使用了進一步的未感染小鼠的對照，其中施用單獨的DI病毒。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>iDI,紫外滅活的干擾缺損病毒；DI,干擾缺損。36只小鼠/組;b2只小鼠/組。使用對照滅活的DI病毒治療的所有感染小鼠均體重減輕，并在至第5天時患病。至第6天，大多數(shù)(83%)小鼠死亡(或被淘汰)。至第8天，所有小鼠均死亡。使用DI病毒治療的感染小鼠體重減輕，并與對照感染組同時患有一些臨床疾病。不過所述臨床疾病程度更輕、在時間更長內發(fā)生，并且有兩個發(fā)作期，峰值在第4和第8天。兩只小鼠死亡(在第9和10天)，其余(4/6或67%)則恢復。接種單獨的PV的小鼠中有一只患病并死亡，這是非常罕見的事情-數(shù)年工作中發(fā)生的唯一的一次。下面的表18顯示接受更高劑量(約10MLDsq)感染性A/WSN病毒、然后在24小時后施用DI病毒(對照施用滅活的DI病毒，二者均為4000HAU，約合10嗎病毒蛋白)的小鼠的結果。使用了進一步的未感染小鼠的對照，其中施用單獨的DI病毒。表18感染天數(shù)感牽后24小時病毒+iDI病毒a感染后24小時病毒+DI病毒a感染后24小時DI病毒b體重患病死亡體重患病死亡體重患病死亡01120011S004600111000115004600210800113004600399401060045004945011000470058833m10480064412105404900713110031500088430510098140510010803153001168205300126920520013701053001470105400157110550016751056001775105700iDI,紫外滅活的干擾缺損病毒；DI病毒，干擾缺損病毒。a6只'J、鼠/組；b2只小鼠/組。使用對照DI病毒治療的所有感染小鼠均體重減輕，大多數(shù)至第4天患病。所有小鼠均死亡或在至第7天淘汰。使用DI病毒治療的感染小鼠體重減輕，并患有一些延遲的臨床疾病，所述臨床疾病在更長的時間內發(fā)生。兩只小鼠死亡(第7和第10天)，其余(67%)恢復/正在恢復。實施例10-在感染48小時后使用244/PR8DI病毒治療小鼠如實施例8所述，但是感染小鼠在感染48小時后接受一個劑量的DI63病毒。下面的表19顯示接受中間劑量(約5MLDso)感染性A/WSN病毒然后在48小時后施用DI病毒(對照施用滅活的DI病毒，二者均為4000HAU,約合10昭病毒蛋白)的小鼠的結果。表19<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>iDI病毒，紫外滅活的干擾缺損病毒；DI病毒，干擾缺損病毒；g,以克計的體重；顯示了每組每天發(fā)生的患病/死亡小鼠數(shù)。()指小鼠可能已患病，但是并未明確患病。a5只小鼠/組；b6只小鼠/組；e2只小鼠/組。使用對照滅活的DI病毒治療的所有感染小鼠均體重減輕，并在至感染后第5天時患病。至第7天，所有小鼠均死亡。感染48小時后使用DI病毒治療的感染小鼠體重減輕，但是患病被延遲，至第6天才見患病。至第7、9和10天才發(fā)生死亡(4/6)。6只小鼠中有兩只(33%)完全恢復。實施例11-244iRNA降4氐病毒產(chǎn)量將244iRNA克隆至Poll表達質粒pPOLI-SapIT,以便該載體表達vRNA的正義轉錄本。將其與產(chǎn)生感染性WSN病毒所需的12個質粒一起轉染293T細胞。所述DNA混合物含有不同量的244質粒(0-0.5pg)、和0.5jig的各個WSN基因區(qū)段(在PolI啟動子控制下)、各0.5昭的PB1和PB2表達質粒、0.1貼PA表達質粒和1昭NP表達質粒。24小時之后，所述293T細胞用胰酶消化，與MDCK細胞混合并重新涂板。再過7天后，收集培養(yǎng)物上清液，通過HA分析確定病毒產(chǎn)量。表20<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表20顯示隨著244質粒的量的增加，通過HA確定的病毒總產(chǎn)量下降了98.4%。接種物中過多的iRNA將病毒產(chǎn)量降低至無法使用的程度。實施例12-保護性病毒阻止臨床疾病，但是允許形成適合針對攻擊病毒的免疫性小鼠具有10LD50A/WSN保護三周之后，使用顯著更高劑量的A/WSN(10,000LDso)對其進行再次攻擊。使用此劑量是因為其能擊潰甚至極佳的保護性病毒(數(shù)據(jù)未顯示)，因而允許評估A/WSN特異性B和T細胞免疫反應。圖3(c、f、i)顯示所有存活小鼠組均對所述再次攻擊完全免疫。由于接受400或40HAU保護性病毒的動物在初次攻擊中未顯示疾病跡象，其在第二次高病毒攻擊中存活顯示所述小鼠形成了保護性免疫，因此保護性病毒將初始致死劑量的毒性病毒有效轉化為亞臨床活疫苗。下面的表21顯示保護性病毒僅提供微弱疫苗作用的最高劑量。與直覺相反，接受最高劑量的保護性病毒(4000HAU)的小鼠對第二次攻擊的保護作用較差，暗示此情形下病毒復制和抗原生產(chǎn)受到嚴重抑制，以致于所得感染僅具微弱免疫原性。表21第一次攻擊第二次攻i保護性病毒的劑量(HAU)死亡數(shù)/感染數(shù)體重損失患病數(shù)/攻擊數(shù)死亡數(shù)/攻擊數(shù)40000/7是5/7(71%)b4〃(57%)c0/4是4/4(100%)2/4(50%)0/4是4/4(100%)3/4(75%)4000/4否0/4na0/4否0/4ixa400/5否0/5n30/4否0/4na0/4否0/442/5否0/2n30。5/5Naa小鼠鼻內接種保護性病毒+10LD5q攻擊病毒A/WSN的混合物(第一次攻擊第1和第2列)；然后在3周后接種單獨的10,000LD5oA/WSN(第二次攻擊)。后一實驗測試獲得性免疫，而不是殘留的保護性病毒活性，因為當同時給與(未顯示)時，此更高劑量的A/WSN完全戰(zhàn)勝了保護性病毒。顯示了3個單獨實驗的數(shù)據(jù)。b平均值=87%患病。。平均值=60%死亡。d給與4000HAU滅活的保護性病毒。Na,不適用。權利要求1.一種生產(chǎn)克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述方法包括(a)使用(i)包含其中含有缺失的甲型流感病毒的RNA區(qū)段的質粒和(ii)聯(lián)合提供感染性甲型流感病毒的RNA區(qū)段1至8的多個質粒轉染細胞；(b)將所述轉染細胞培養(yǎng)一段時間；(c)(i)將一小份低于100μl的所述轉染細胞培養(yǎng)基質導入含胚卵；或(ii)取一小份所述轉染細胞培養(yǎng)基質，減少該小份中的病毒粒子的數(shù)量或濃度，然后將所述小份的至少一部分導入含胚卵；或(iii)將含有低于4x109個拷貝的RNA缺失區(qū)段的轉染細胞培養(yǎng)基質導入含胚卵；和(d)將所述卵孵育一段時間；和(e)從所述卵中回收病毒材料。2.—種生產(chǎn)克隆的DI曱型流感病毒的方法，所述方法包括(a)使用(i)包含其中具有缺失的甲型流感病毒的RNA區(qū)段的質粒和(ii)聯(lián)合提供感染性曱型流感病毒的RNA區(qū)段1至8的多個質粒轉染細胞；(b)將所述轉染細胞培養(yǎng)一段時間；(c)取一小份所述轉染細胞培養(yǎng)基質；(d)將所述小份的至少一部分導入含胚卵；(e)將所述卵孵育一段時間；(f)(i)將一小份取自孵育卵的低于lOOpl的病毒材料導入另一含胚卵；或(ii)從所述孵育卵中回收一小份病毒材料，減少該小份中的病毒粒子的數(shù)量或濃度，并將所述小-除的至少一部分導入另一含胚卵；或(iii)將取自所述孵育卵的含有低于4x1(^個拷貝的RNA缺失區(qū)段的病毒材料導入另一含胚卵；(g)將另一卵孵育一段時間；和(h)從所述卵中回收病毒材料。3.—種生產(chǎn)克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述方法包括(a)使用(i)包含其中含有缺失的甲型流感病毒的RNA區(qū)段的質粒和(ii)聯(lián)合提供感染性甲型流感病毒的RNA區(qū)段1至8的多個質粒轉染細胞；(b)將所迷轉染細胞培養(yǎng)一段時間；(c)將轉染細胞培養(yǎng)基質的至少一部分導入至少10個含胚卵；(d)將至少一部分所述卵孵育一段時間；和(f)從至少一個孵育卵中回收病毒材料。4.一種生產(chǎn)克隆的DI曱型流感病毒的方法，所述方法包括(a)使用(i)包含其中具有缺失的甲型流感病毒的RNA區(qū)段的質粒和(ii)聯(lián)合提供感染性曱型流感病毒的RNA區(qū)段1至8的多個質粒轉染細胞；(b)將所述轉染細胞培養(yǎng)一段時間；(c)取一小份所述轉染細胞培養(yǎng)基質；(d)將所述小份的至少一部分導入含胚卵；(e)將所述卵蜉育一段時間；(f)將至少一部分來自孵育卵的病毒材料導入至少IO個另外的含胚卵；(g)將另外的卵孵育一段時間；和(h)從至少一個卵中回收病毒材料。5.—種將克隆的DI甲型流感病毒傳代的方法，所述方法包括(a)將已知或疑似含有克隆的DI甲型流感病毒粒子的小份導入含胚卵，其中導入的小份的體積低于lOOW;(b)將所述卵孵育一段時間；和(c)從所述卵中回收病毒材料。6.—種將克隆的D1甲型流感病毒傳代的方法，所述方法包括(a)將已知或疑似含有克隆的DI曱型流感病毒粒子的小份導入至少10個含胚卯；(b)將至少一部分所述卵孵育一段時間；和(c)從至少一個孵育卯中回收病毒材料。7.—種將克隆的DI甲型流感病毒傳代的方法，所述方法包括(a)減少已知或疑似含有克隆的DI甲型病毒粒子的小份中的病毒數(shù)量或濃度；(b)將所述小^除的至少一部分導入含胚卵；(c)將所述卵孵育一段時間；和(d)從所述卵中回收病毒材料。8.—種將克隆的DI甲型流感病毒傳代的方法，所述方法包括(a)將不超過4xl(^個拷貝的克隆的DI甲型流感基因組導入含胚卵；(b)將所述卵孵育一段時間；和(d)從所述卵中回收病毒材料。9.如權利要求8所述的方法，其中將至少1x107個拷貝的克隆的DI甲型流感基因組導入所述含胚卵。10.如權利要求5至7的任一項所述的方法，其中所述已知或疑似含有克隆的DI病毒粒子的小份是預先通過將已知或疑似含有所述克隆的病毒的起始材料導入含胚卵，然后將所述卵孵育一段時間獲得的。11.如權利要求10所述的方法，其中所述起始材料獲自轉染細胞培養(yǎng)物。12.如權利要求1至11的任一項所述的方法，其中將回收的病毒材料導入另一含胚卵，將所述卵孵育一^a時間，然后A/v所述卵中回收進一步的病毒材料。13.如權利要求12所述的方法，其中權利要求12中確定的步驟被重復一次或多次。14.如權利要求1至7或10至13的任一項所述的方法，其中(a)病毒粒子的濃度是通過稀釋降低的，或(b)病毒粒子的數(shù)量是通過稀釋然后取所得稀釋體積的至少一部分減少的。15.如權利要求14所述的方法，其中所述稀釋是至少1/2，優(yōu)選地至少1/10,更優(yōu)選地至少1/100，甚至更優(yōu)選地至少1/1000。16.如前述權利要求任一項所述的方法，其中要導入含胚卵的包含克隆的DI甲型流感病毒的小份含有不超過約10"藍斑形成單位每HA單位，優(yōu)選地低至105、104、103或102噬斑形成單位每HA單位，更優(yōu)選地不超過約104噬斑形成單位每HA單位。17.如前述權利要求任一項所述的方法，其中要導入含胚卵的包含克隆的DI甲型流感病毒的小份含有不超過約400HA單位，優(yōu)選地不超過約40HA單位，更優(yōu)選地不超過約4HA單位。18.如前述權利要求任一項所述的方法，其中所述克隆的DI甲型流感病毒是制劑形式，其中所述制劑中所有病毒粒子的至少75%,優(yōu)選地至少85%,更優(yōu)選地至少90%，甚至更優(yōu)選地至少95%具有遺傳同一性。19.如前述權利要求任一項所述的方法，其中所述制劑中幾乎所有粒子具有遺傳同一性，優(yōu)選地所有粒子具有遺傳同一性。20.如前述權利要求任一項所述的方法，所述方法進一步包括用紫外線照射小份以滅活小份中存在的至少一部分感染性甲型流感病毒的步驟。21.克隆的DI曱型流感病毒用作藥物。22.如權利要求21所述的用途，其中所述藥物是抗病毒劑。23.克隆的DI曱型流感病毒用于生產(chǎn)在個體中預防或治療相同或不同亞型的甲型流感的抗病毒藥物的用途。24.克隆的DI甲型流感病毒用于生產(chǎn)將個體內的毒性甲型流感病毒感染轉化為無毒感染的藥物的用途。25.克隆的DI甲型流感病毒用于生產(chǎn)在感染或疑似感染曱型流感的個體內提供即時和非免疫保護效應的藥物的用途。26.克隆的DI甲型流感病毒用于生產(chǎn)對個體進行針對甲型流感的免疫的藥物的用途，其中所述藥物進一步包含至少一個甲型流感的活毒林，并且所述藥物適合將DI甲型流感病毒與所述活毒^f朱單獨、同時或順序施用。27.如權利要求21至26的任一項所述的用途，其中所述藥物通過鼻內施用。28.如權利要求23至26的任一項所述的用途，其中所述個體是動物或人，優(yōu)選地其中所述動物選自豬、馬、狗、貓或禽類。29.如權利要求21至26的任一項所述的用途，其中所述藥物經(jīng)口施用。30.如權利要求29所述的用途，其中所述個體是禽類物種，優(yōu)選地馴化物種例如鴨、鵝、火雞或雞，例如肉雞。31.如權利要求21至31的任一項所述的用途，其中施用單一劑量的藥物。32.如權利要求26至31的任一項所述的用途，其中所述至少一個甲型流感的活毒抹是天然存在的甲型流感毒林。33.如權利要求32所述的用途，其中所述甲型流感的活毒抹選自H1N1、H2N2、H3N2、H3N8或H5N1。34.如權利要求21至33的任一項所述的用途，其中所述藥物中克隆的DI曱型流感病毒的量在0.1-100HA單位，優(yōu)選地0.5-50HA單位范圍內。35.如權利要求21至33的任一項所述的用途，其中所述藥物中克隆的DI甲型流感病毒的量在0.01嗎-0.1昭，優(yōu)選地0.01貼-1叱病毒蛋白范圍內。36.如權利要求21至35的任一項所述的用途，其中所迷克隆的DI甲型流感病毒在RNA區(qū)段中具有至少一個缺失。37.如權利要求36所述的用途，其中缺失的區(qū)段的5'和3'端是完整的。38.如權利要求36或權利要求37所述的用途，其中區(qū)段缺失至少50%的核苷酸，優(yōu)選地至少75%的核苦酸，更優(yōu)選地至少80%的核香酸。39.如權利要求36至38的任一項所述的用途，其中所述至少一個缺失位于RNA區(qū)段l。40.如權利要求21至39的任一項所述的用途，其中所述克隆的DI甲型流感病毒的RNA區(qū)段1的核苷酸序列包含(a)選自SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的序列；或(b)與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2具有至少75。/。同一性的核酸序列；或(c)在嚴格條件下與上文(a)或(b)雜交的序列的互補序列。41.如權利要求40所迷的用途，其中所述克隆的DI甲型流感病毒的基因組區(qū)段1的核酸序列與SEQIDNO:l具有至少80%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地95%,甚至更優(yōu)選地99%同一性。42.如權利要求40或權利要求41所述的用途，其中基因組區(qū)段l的核苷酸序列包含在所述核苷酸序列的一個或多個位置處的一個或多個核苷酸插入。43.如權利要求40或權利要求41所述的用途，其中基因組區(qū)段l的核苷酸序列是SEQIDNO:1。44.一種藥物組合物，其包含克隆的DI甲型流感病毒。45.—種預防或治療受治療者的甲型流感的方法，所迷方法包括施用有效量的克隆的DI甲型流感病毒粒子。46.如權利要求45所述的方法，其中所述克隆的DI甲型流感病毒粒子在所述受治療者中具有抗病毒效應。47.如權利要求45或權利要求46所述的方法，其中克隆的DI甲型流感病毒的施用提供針對獲得性甲型流感感染的即時保護效應。48.如權利要求45至47的任一項所述的方法，其中所述受治療者中的甲型流感與所施用的DI甲型流感病毒粒子是相同或不同的亞型。49.如權利要求45至48的任一項所述的方法，其中個體感染或疑似感染曱型流感病毒。50.如權利要求45或權利要求49所述的方法，其中克隆的DI病毒在所述個體感染或疑似感染48小時內，優(yōu)選地24小時內施用。51.—種將感染受治療者的毒性甲型流感病毒轉化為無毒的病毒感染的方法，所述方法包括為所述受治療者施用有效量的克隆的DI甲型流感病毒粒子。52.如權利要求51所述的方法，其中所述克隆的DI甲型流感病毒粒子與所迷毒性甲型流感病毒是不同的亞型。53.—種對受治療者進行針對甲型流感病毒的免疫的方法，所述方法包括為所述受治療者施用有效量的克隆的DI甲型流感病毒粒子和感染量的至少一個曱型流感毒林的活病毒。54.如權利要求49所述的方法，其中所迷克隆的DI甲型流感病毒粒子和所述活病毒是單獨、同時或順序施用。55.—種將感染受治療者的毒性甲型流感病毒轉化為無毒的病毒感染并對所述受治療者進行針對感染病毒的免疫的方法，所述方法包括為所述受治療者施用克隆的DI甲型流感病毒。56.如權利要求55所述的方法，其中所述克隆的DI流感病毒與所述毒性甲型流感病毒是不同的亞型。57.—種分離的核酸分子，其包含(a)SEQIDNO:1或SEQIDNO:2;(b)與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2具有大于96%同一性的核苷酸序列；(c)在嚴格條件下與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2雜交的核苷酸序列；(d)與序列(a)、(b)或(c)中的任一個互補的核苷酸序列。58.—種組合物，其包含權利要求57所迷的分離的核酸分子。59.如權利要求57所述的核酸分子，其為RNA。60.—種載體或質粒，其包含權利要求57或權利要求58所迷核酸。61.—種引物或探針核酸分子，其包含權利要求57至59任一項所述的核酸序列的至少一部分。62.—種克隆的DI甲型流感病毒，其通過權利要求1至20任一項所述的方法獲得或可通過所述方法獲得。63.—種對個體進行針對甲型流感病毒毒抹免疫并同時治療所述個體由甲型流感病毒的任何毒林或亞型引起的感染的方法，所述方法包括施用有效量的克隆的DI病毒和活的曱型流感病毒。64.克隆的DI甲型流感病毒用于生產(chǎn)進一步包含活的甲型流感病毒毒#朱的藥物的用途，其中所迷藥物是針對所迷流感病毒毒^朱的疫苗和針對甲型流感病毒的任何毒抹或亞型的抗病毒劑。全文摘要使用產(chǎn)生大量DI病毒材料的方法在含胚雞卵中生產(chǎn)克隆的，即確定的干擾缺損(DI)甲型流感病毒。然后使用克隆的DI病毒對受到野生型甲型流感病毒致死性攻擊的小鼠和雪貂進行測試。當克隆的DI甲型流感病毒與致死劑量的毒性甲型流感病毒合用時，與滅活的克隆的DI甲型流感病毒對照相比，小鼠受到保護。在施用克隆的DI甲型流感病毒和感染性攻擊的病毒后存活的小鼠三周后仍能抵抗感染性病毒致死性攻擊。僅接受克隆的DI甲型流感病毒而未受致死性攻擊的對照小鼠三周后不能抵抗感染性病毒致死性攻擊。發(fā)現(xiàn)當在使用感染性病毒攻擊后48小時內施用克隆的DI甲型流感病毒時，所述施用具有治療效益。發(fā)現(xiàn)克隆的DI甲型流感病毒的一個亞型在體內是針對相同或任何其它亞型的甲型流感病毒的有效抗病毒劑。已發(fā)現(xiàn)所述抗病毒效應對人、哺乳動物和禽類中的甲型流感感染兼有治療和預防應用。文檔編號A61K39/145GK101454023SQ200780018910公開日2009年6月10日申請日期2007年5月24日優(yōu)先權日2006年5月24日發(fā)明者奈杰爾·迪默克申請人:沃里克大學