專利名稱：治療痛覺過敏的方法與組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及拮抗?fàn)可嬗趥π曰瘜W(xué)感受、溫度感受和機(jī)械感受 中的離子通道的方法和組合物。更具體而言，本發(fā)明涉及特異性抑制由 TRPA1介導(dǎo)的機(jī)械傳導(dǎo)(mechanotransduction)的化合物，以及使用這類化 合物治療 性痛覺過敏的方法。發(fā)明背景背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的感覺神經(jīng)元能夠通過皮膚中的突起而檢測環(huán)境的 變化。傷害性感受是傷害性刺激如熱和觸碰$ 1起皮膚中的感覺神經(jīng)元(傷害 感受器)發(fā)送信號至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過程。 一些這些神經(jīng)元或者是機(jī)械敏感 性的(高或低閾值)，或者是溫度敏感性的(熱、暖或冷響應(yīng)的)。而其他稱之 為多形性傷害感受器的神經(jīng)元不僅感覺傷害性溫度刺激(冷和熱)而且感覺 機(jī)械性刺激。離子通道作為調(diào)節(jié)離子流的跨膜蛋白在神經(jīng)生物學(xué)中發(fā)揮核心作用。 根據(jù)其門控機(jī)制分類，離子通道可通過信號如特異性配體、電壓或機(jī)械力而活化。陽離子通道瞬時(shí)受體電位(TRP)家族中稱之為thermoTRP的亞類 牽涉于溫度感受，例如TRPM8和TRPA1。 TRPM8在25。C被活化。它 也是化合物薄荷醇的受體，為薄荷味為何通常被感覺為清涼提供了分子解 釋。TRPA1也稱為ANKTM1，在17°C被活化。它是表達(dá)于多形性感覺 神經(jīng)元中的離子通道，可被傷害性冷和多種引起灼燒/疼痛感覺的天然刺激 性化合物活化。參見例如Patapoutian等，Nat. Rev. Neurosci. 4:529-539， 2003; Story等，Cell 112: 819-829， 2003;和Bandell等，Neuron. 41:849-57， 2004。機(jī)械感受不可避免地與許多疾病和醫(yī)學(xué)狀況中的疼痛狀態(tài)相聯(lián)系。例 如，機(jī)械傳導(dǎo)是與關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)病性疼痛相關(guān)的疼痛感覺的重要組成部分。 然而，不同于傷害性溫度感受，負(fù)責(zé)感受與疼痛相關(guān)的傷害性機(jī)械力的機(jī) 械傳導(dǎo)通道的分子身份仍是未知的。本發(fā)明解決了該問題以及本領(lǐng)域其他 未能滿足的需求。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了在對象中治療痛覺過敏的方法。該方法包括向 所述對象施用藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的TRPA1拮抗劑， 其通過特異性阻斷TRPA1活化而阻抑或抑制對象的傷害性化學(xué)感受、溫 度感受和機(jī)械感受。在一些方法中，所用TRPA1拮抗劑不阻斷一種或多 種選自TRPV1、 TRPV2、 TRPV3、 TRPV4和TRPM8的其他thermoTRP 的活化。在一些方法中，所用TRPAl拮抗劑是(Z)-4-(4-氯苯基(phynyl))-3-曱基丁-3-烯-2-肟。在一些其他方法中，所用TRPAl拮抗劑是N，N，-雙-(2-羥基芐基)-2，5-二M-2，5-二曱基己烷。 在一些其他方法中，采用TRPA1 拮抗劑抗體。本發(fā)明的一些治療方法涉及治療患有炎癥或神經(jīng)病性疼痛的對象。在 一些方法中，所治療的對象患有機(jī)械或溫度痛覺過敏。在一些方法中，所治療的對象是人。在一些治療方法中，除TRPA1拮抗劑外，向?qū)ο笫┯?第二種疼痛減輕劑。例如，第二種疼痛減輕劑可以是選自對乙酰氛基酚、布洛芬和吲哚美辛和阿片樣物質(zhì)的止痛劑。該第二種疼痛減輕劑也可以是 選自嗎啡和莫索尼啶的止痛劑。另一方面，本發(fā)明提供了鑒別抑制或阻抑傷害性機(jī)械感受的活性劑的 方法。這些方法需要(a)使測試化合物與表達(dá)瞬時(shí)受體電位離子通道TRPAl 的細(xì)胞接觸，和(b)鑒別抑制細(xì)胞中響應(yīng)于機(jī)械性刺激的活化的TRPA1的 信號傳導(dǎo)活性的化合物。在一些這些方法中，進(jìn)一步測試經(jīng)鑒別的化合物對一種或多種選自TRPV1、 TRPV2、 TRPV3、 TRPV4和TRPM8的 thermoTRP的活化或信號傳導(dǎo)活性的作用。在一些方法中，相對于化合物 不存在時(shí)的TRPA1離子通道的信號傳導(dǎo)活性，經(jīng)鑒別的化合物阻抑或降 低活化的TRPA1離子通道的信號傳導(dǎo)活性。在一些方法中，經(jīng)鑒別的化 合物不阻斷一種或多種選自TRPV1、 TRPV2、 TRPV3、 TRPV4和TRPM8 的thermoTRP的活化。在一些這些篩選方法中，TRPA1離子通道被選自肉桂醛、丁子香酚、 姜醇、水楊酸甲酯和蒜素的TRPA1激動劑活化?？捎糜谶@些方法的細(xì)胞 的實(shí)例包括表達(dá)TRPA1的CHO細(xì)胞、表達(dá)TRPA1的非洲爪蟾(Xenopus) 卵母細(xì)胞和培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元。在這些方法中待監(jiān)測的信號傳導(dǎo)活性可 以是例如TRPA1引起的跨細(xì)胞膜電流或鈣細(xì)胞內(nèi)流。篩選中采用的機(jī)械 性刺激可以是例如抽吸壓或高滲應(yīng)激。本發(fā)明進(jìn)一步提供了 TRPA1特異性抑制劑在制備用于在對象中治療 溫度或機(jī)械痛覺過敏的藥物中的用途。所要采用的TRPA1特異性抑制劑 是例如(Z)畫4畫(4-氯苯基)畫3國曱基丁誦3-烯-2-肟或N,N'-雙國(2-羥基節(jié)基)-2，5畫二 M-2，5-二甲基己烷。本發(fā)明也提供了包含這些TRPA1特異性抑制劑的 藥物組合物。通過參考說明書和權(quán)利要求書的剩余部分可以實(shí)現(xiàn)對本發(fā)明本質(zhì)和優(yōu) 點(diǎn)的進(jìn)一步理解。


圖1A-1D顯示TRPA1被機(jī)械性刺激活化。(A)記錄自表達(dá)TRPA1的 細(xì)胞響應(yīng)于冷(右，n=62)、高滲摩爾滲透壓濃度(中，n:)和由記錄吸管施 加的負(fù)壓(左，11=10)的電流；(B)響應(yīng)于活化TRPA1的不同刺激的^表性 電流-電壓關(guān)系。(C)TRPA1細(xì)胞對-卯mmHg或者更高的負(fù)壓顯示出強(qiáng)電 流響應(yīng)。實(shí)心棒上的數(shù)值顯示經(jīng)相關(guān)壓力測試的響應(yīng)者的數(shù)量比所有測試 膜片的數(shù)量。(D)亞閾值冷預(yù)脈沖敏感化TRPA1細(xì)胞對低閾值機(jī)械性刺激 的響應(yīng)(n-5)。圖2A-2D顯示TRPA1的機(jī)械性響應(yīng)被各種已知活性劑所阻斷。(A) Gd3+完全阻斷經(jīng)過高摩爾滲透壓濃度的TRPA1的活化電流(11=5/5細(xì)胞)， 如5fiM釕紅的情形(對于(-)壓力，11=5/5細(xì)胞，對于過高摩爾滲透壓濃度， n=6/6細(xì)胞)。(B)肉桂^t感性DRG神經(jīng)元響應(yīng)于-200mmHg和辣椒素。 顯示了響應(yīng)于負(fù)壓的電流-電壓關(guān)系(自跡線上有星號的位置采集)。(C) 2mM樟腦完全阻斷CHO細(xì)胞中TRPA1對(-)壓力的電流活化(n-5)。(D) 2mM樟腦完全阻斷DRG神經(jīng)元對(-)壓力的電流響應(yīng)(n-15/18細(xì)胞， 以(-)壓力測試)。15個(gè)細(xì)胞中12個(gè)的電流也被500nM肉桂醛活化。圖3A-3D顯示化合物18阻斷TRPA1活化。(A)化合物18(上)和肉桂 醛(下)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。(B)化合物18阻斷由50jiM肉桂醛引起的鉤內(nèi)流入表達(dá) 小鼠和人TRPA1的CHO細(xì)胞的劑量-響應(yīng)關(guān)系(左圖)。鈣內(nèi)流用標(biāo)準(zhǔn) FLIPR試驗(yàn)測定，數(shù)據(jù)點(diǎn)是四孔的平均值( 8,000個(gè)細(xì)胞/孔)，誤差棒顯示 標(biāo)準(zhǔn)誤差。數(shù)值歸一化至(在沒有化合物18時(shí)觀測的)最大響應(yīng)。對人和小 鼠的ICso值分別是3.1nM和4.5nM?；衔?8以濃度依賴性方式將肉桂 醛對小鼠TRPA1的ECso值向右移動(右圖)。采用FLIPR鈣內(nèi)流試驗(yàn)生成 數(shù)據(jù)，11=3孔(~8，000個(gè)細(xì)胞/孑匕)且歸一化至最大響應(yīng)。各棒顯示標(biāo)準(zhǔn)誤差， 實(shí)線是hill方程擬合曲線，從中衍生ECso值。肉桂醛的ECso值是50jiM (對 照)、llljiM (IOjiM化合物18)和220pM (25nM化合物18)。在所有情況下， 最大響應(yīng)具有相似量級。(C)TRPA1的電流-電壓關(guān)系。由肉桂醛在表達(dá) TRPA1的非洲爪蟾卵母細(xì)胞的內(nèi)面向外式大膜片中引起的外向整流電流(左圖)被同時(shí)應(yīng)用化合物18抑制(右圖)。(D)化合物18抑制經(jīng)肉桂醛而非 辣椒素的急性感受傷害行為。記錄5分鐘內(nèi)舔和輕擊注射肉桂醛(16.4mM) 或辣椒素(0.328mM)的后足所消耗的時(shí)間，并與后足同時(shí)注射化合物 18(lmM)的另外的動物比較。每一試驗(yàn)的例數(shù)從左開始分別是8、 8、 6和 6(***p<0.001， *p<0.05， X5LC學(xué)生氏T檢驗(yàn))。圖4A-4D顯示在炎癥下TRPA1介導(dǎo)枳堿性和冷超，敏性(A-B)。 一種新 的TRPA1阻斷劑即化合物18逆轉(zhuǎn)CFA(n-8)或BK誘導(dǎo)的(n-12)小鼠機(jī)械 性傷害感受行為，但對溫度(熱)傷害感受行為沒有影響(11=8,分別對CFA 和BK)。紅色標(biāo)記代表來自注射CFA(A)或注射BK(B)的后足的響應(yīng)，而 藍(lán)色標(biāo)記代表來自相同動物其他沒有注射的后足的響應(yīng)。圓圏代表化合物 18處理后的響應(yīng)，而三角代表介質(zhì)處理后的響應(yīng)(A-C)。測定VonFrey閾 值并計(jì)算其平均值。(***p<0.001， *p<0.05，雙尾學(xué)生氏T檢驗(yàn))。(C)化合 物18逆轉(zhuǎn)注射CFA大鼠對冷的行為。紅色標(biāo)記代表來自注射CFA后足 的響應(yīng)，而藍(lán)色標(biāo)記代表同樣動物其他沒有注射的后足的響應(yīng)。計(jì)數(shù)每一 時(shí)間點(diǎn)IO分鐘內(nèi)輕擊、舔、抬爪次數(shù)并求其平均值(11=8, *p<0.05,雙尾 學(xué)生氏T檢驗(yàn))。(D)lnM BK預(yù)脈沖敏感化共表達(dá)B2受體的CHO細(xì)胞 TRPA1對低閾值機(jī)械性刺激的響應(yīng)。在BK脈沖期間用2mM樟腦孵育， 以保護(hù)由BK引起的TRPA1的輕微活化和隨后的脫敏。結(jié)果表明細(xì)胞的 機(jī)械性閾值低移至-60mmHg。詳細(xì)i兌明I.綜述本發(fā)明部分是基于本發(fā)明人的如下發(fā)現(xiàn)，即TRPA1除了是對傷害性 低溫發(fā)出信號的疼痛感覺的重要組成部分外，還是傷害性機(jī)械性刺激的感 受器。本發(fā)明人還鑒別了特異性抑制TRPA1的活化但并不抑制Trp家族 其他離子通道的化合物。正如下文實(shí)施例所詳述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)TRPA1 被傷害性機(jī)械力活化，且這種活化在炎癥狀況下被促進(jìn)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) TRPA1的小分子抑制劑在小鼠中能夠明顯降低響應(yīng)于肉桂醛而非辣椒素的感受傷害行為。此外，抑制劑阻斷機(jī)械痛覺過敏和冷痛覺過敏，而不阻 斷熱痛覺過敏。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了篩選可用于阻抑或抑制傷害性 感受的治療劑的方法。本發(fā)明還提供了應(yīng)用TRPA1特異性抑制劑減輕在多種 疾病和病癥中與傷害性機(jī)械性刺激相關(guān)的疼痛的方法。以下各部分提供了 制備和應(yīng)用本發(fā)明的組合物以及實(shí)施本發(fā)明方法的指導(dǎo)。 II.除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng) 域普通技術(shù)人員所常規(guī)了解的相同含義。以下參考文獻(xiàn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員 提供了本發(fā)明所用眾多術(shù)語的常規(guī)定義Singleton等，微生物學(xué)和分子生 物學(xué)詞典(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)(第二版，1994);劍橋科學(xué)與技術(shù)詞典(THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY)(Walker編輯， 1988);與Hale&Marham, THE HARPER COLLINS生物學(xué)詞典(l991)。 另外，提供了以下定義以幫助讀者實(shí)施本發(fā)明。術(shù)語"活性劑"或"測試劑"包括任何物質(zhì)、分子、元素、化合物、 實(shí)體或其組合。它包括但不限于如蛋白質(zhì)、多肽、有機(jī)小分子、多糖、多 核苷酸等。它可以是天然產(chǎn)物、合成化合物或化學(xué)化合物或兩種或更多種 物質(zhì)的組合。除非另外指明，術(shù)語"活性劑"、"物質(zhì)"和"化合物，，在 本文可互換^f吏用。本文所用術(shù)語"類似物"是指與結(jié)構(gòu)上類似于參比分子但通過用替換 取代基替代參比分子中特定取代基而以靶向和受控方式經(jīng)修飾的分子。相 比于參比分子，本領(lǐng)域技術(shù)人員將預(yù)期類似物顯示出相同、相似或改進(jìn)的 效果。合成并篩選類似物以鑒別具有改進(jìn)特性(如對目標(biāo)分子的較高親和性) 的已知化合物的變體是藥物化學(xué)中熟知的方法。本文所用的"接觸"具有其常規(guī)的含義，是指合并兩種或多種活性劑(如 多肽或小分子化合物)或合并活性劑和細(xì)胞。接觸可以在體外發(fā)生，例如在 試管或其他容器中合并兩種或多種活性劑或合并測試劑與細(xì)胞或細(xì)胞裂解物。接觸也可以在細(xì)胞中或原位發(fā)生，例如通過在細(xì)胞中共表達(dá)編碼兩種 多肽的重組多核苷酸而使兩種多肽在細(xì)胞中或在細(xì)胞裂解物中接觸。本文所用的"痛覺過敏"或"痛覺過敏狀態(tài)"是指溫血?jiǎng)游飳o此狀 況將無痛的機(jī)械、化學(xué)或溫度刺激極其敏感的狀況。已知痛覺過敏伴隨對 身體的某些物理損傷，如不可避免地由外科手術(shù)引起的損傷。已知痛覺過 敏也伴隨于人的某些炎癥狀況，如關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性疾病。因此，痛覺過敏 是指輕度至中度疼痛至嚴(yán)重疼痛，如與炎癥狀況(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān) 節(jié)炎)相關(guān)但不限于炎癥狀況的疼痛、術(shù)后疼痛、產(chǎn)后疼痛、與牙病(如齲 齒和牙齦炎)相關(guān)的疼痛、與灼傷、包括但不限于曬傷、擦傷、挫傷等相關(guān) 的疼痛、與運(yùn)動傷害和扭傷相關(guān)的疼痛、皮膚炎癥狀況、包括但不限于poison ivy與過敏性皮滲和皮炎，以及增加對輕微刺激如傷害性寒冷的敏感 性的其他疼痛。就參考蛋白質(zhì)(例如TRPA1)而言的術(shù)語"調(diào)節(jié)"是指抑制或活化該參 考蛋白質(zhì)的生物活性(例如TRPA1的與疼痛信號傳導(dǎo)相關(guān)的活性)。調(diào)節(jié)可 以是向上調(diào)節(jié)(例如活化或刺激)或者是向下調(diào)節(jié)(例如抑制或阻抑)。作用的 方式可以是直接的，例如通過以配體結(jié)合于參考蛋白質(zhì)。調(diào)節(jié)也可以是間 接的，例如通過結(jié)合于和/或修飾結(jié)合或調(diào)節(jié)參考蛋白質(zhì)的另外的分子。"神經(jīng)病性疼痛"包括由導(dǎo)致神經(jīng)損傷的狀況或事件引起的疼痛。"神 經(jīng)病"是指導(dǎo)致神經(jīng)損傷的疾病過程。"灼痛"是指在神經(jīng)損傷或引起所 述疼痛的狀況或事件如心肌梗死后的慢性疼痛的狀態(tài)。"異常性疼痛，，包 括人對正常無痛性刺激如輕觸感受到疼痛的狀況。"止痛劑"是引起疼痛 減輕的分子或分子組合。當(dāng)止痛劑的作用機(jī)制不涉及直接(通過靜電相互作 用或化學(xué)相互作用)結(jié)合并降低TRPA1的功能時(shí)，止痛劑采用的作用機(jī)制 就并非抑制TRPA1。"多核苷酸"或"核酸序列"是指核苷酸的聚合形式(多核糖核苷酸或 多脫氧核糖核苷酸)。在一些實(shí)例中，多核苷酸是指這樣一種序列，其并不 緊密毗連于在其所來自的天然存在的有機(jī)體基因組中其緊密毗連的任一編 碼序列(一個(gè)在5'端， 一個(gè)在3'端)。因此，該術(shù)語包括例如被摻入栽體中、自主復(fù)制質(zhì)?；虿《局?、或原核生物或真核生物基因組DNA中、或以獨(dú) 立于其他序列的單獨(dú)分子(如cDNA)存在的重組DNA。多核苷酸可以是核 糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或任一核苷酸的被修飾形式。多肽或蛋白質(zhì)(例如TRPA1)是指其中單體是通過酰胺鍵相互連接的氨 基酸殘基的多聚體。當(dāng)M酸是a-^酸時(shí)，L-旋光異構(gòu)體或者D-旋光異 構(gòu)體均可使用，典型的是L-異構(gòu)體。(例如TRPA1的)多肽或蛋白質(zhì)片段 可以具有與天然存在的蛋白質(zhì)相同或基本一致的氨基酸序列。具有基本一 致的序列的多肽或蛋白質(zhì)是指氨基酸序列很大程度上但不完全相同但卻保 留了其相關(guān)序列的功能活性。由于保守性置換，多肽可以是實(shí)質(zhì)上相關(guān)的，如TRPA1和包含這類 置換的TRPA1變體。保守性變化表示氨基酸殘基被另外的生物學(xué)上相似 的殘基替換。保守性變化的實(shí)例包括用一種疏水性殘基如異亮氨酸、纈氨 酸、亮氨酸或甲硫氨酸彼此置換，或用極性殘基彼此置換，如用精氨酸置 換賴氨酸、用谷氨酸置換天冬氨酸或用谷氨酰胺置換天冬酰胺等。保守性 置換的其他說明性實(shí)例包括改變丙氨酸為絲氨酸；改變精氨酸為賴氨酸； 改變天冬酰胺為谷氨酰胺或組氨酸；改變天冬氨酸為谷氨酸；改變半胱氨 酸為絲氨酸；改變谷氨酰胺為天冬酰胺；改變谷氨酸為天冬氨酸；改變甘 氨酸為脯氨酸；改變組氨酸為天冬酰胺或谷氨酰胺；改變異亮氨酸為亮氨 酸或纈氨酸；改變亮氨酸為纈氨酸或異亮氨酸；改變賴氨酸為精氨酸、谷 氨酰胺或谷氨酸；改變甲硫氨酸為亮氨酸或異亮氨酸；改變苯丙氨酸為酪 氨酸、亮氨酸或曱硫氨酸；改變絲氨酸為蘇氨酸；改變蘇氨酸為絲氨酸； 改變色氨酸為酪氨酸；改變酪氨酸為色氨酸或苯丙氨酸；改變纈氨酸為異 亮氨酸或亮氨酸。術(shù)語"對象"包括哺乳動物，尤其是人，以及其他非人動物，如馬、狗和貓o參考分子的"變體"(如TRPA1多肽或TRPA1調(diào)節(jié)劑)是指在結(jié)構(gòu)和 生物活性上與整個(gè)參比分子或其片段基本上相似的分子。因此，如果兩個(gè)分子具有相似的活性，則它們被視為變體，如本文所-使用的術(shù)語，即使分子的組成或二級、三級或四級結(jié)構(gòu)與另一分子所見不一致或即使氨基酸殘 基的序列不一致。III. TRPA1特異性抑制劑由于TRPA1是傷害性化學(xué)、溫度和枳械性刺激的感受器，TRPA1拮 抗劑化合物可用于減輕與軀體感受(somatosensation)、包括機(jī)械感受相關(guān) 的疼痛，如機(jī)械痛覺過敏和異常性疼痛。特異性抑制或阻抑由TRPA1介 導(dǎo)的機(jī)械感受的化合物可具有多種治療或預(yù)防(如抗感受傷害)應(yīng)用。抑制 TRPA1離子通道的任何分子均可能能夠減輕由傷害性刺激介導(dǎo)的疼痛如 機(jī)械感受。然而，能夠抑制除TRPA1外的其他thermoTRP(例如TRPV1 、 TRPV2、 TRPV3和TRPM8)的分子可干擾這些分子執(zhí)行的多種功能。這 類TRPA1的非選擇性抑制劑雖然能夠減輕疼痛，但可能具有許多不期望 的副作用。因此，選擇性抑制TRPA1離子通道的分子在這類治療應(yīng)用中 是優(yōu)選的。通過特異性抑制TRPA1介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)而不影響其他 thermoTRP的信號傳導(dǎo)，患有機(jī)械性感覺過敏的對象的癥狀可被減輕或抑 制?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的TRPA1抑制劑包括干擾TRPA1表達(dá)、修飾、調(diào) 節(jié)或活化的化合物，或者下調(diào)TRPA1(例如其離子通道)的一種或多種正常 生物學(xué)活性的化合物。TRPA1的選擇性抑制劑以一定濃度顯著阻斷 TRPA1的活化或抑制TRPA1的信號傳導(dǎo)活性，在所述濃度下其他 thermalTRP(例如TRPVl、 TRPV2、 TRPV3、 TRPV4和/或TRPM8)的活 化或信號傳導(dǎo)活性不凈皮顯著影響。多種TRPA1特異性拮抗劑可用于本發(fā) 明。 一些這些TRPA1特異性抑制劑由本發(fā)明人鑒別，如以下實(shí)施例所述。 這些化合物商購可得或如本領(lǐng)域所述以其他方式獲得。 一種這類化合物是 化合物18，即(Z)-4-(4-氯苯基)-3-曱基丁-3-烯-2-肟。該化合物可從 Maybridge (Cornwall, UK)商購得到。另一實(shí)例是化合物40，即N，N'-雙 -(2-羥基爺基)-2，5-二氨基-2，5-二甲基己烷，其已描述在美國專利 No.4，129，556中。如以下實(shí)施例所示，這兩種化合物能夠特異性抑制TRPA1 的活化或功能，并因此阻抑TRPA1介導(dǎo)的機(jī)械性傷害感受。它們對其他thermTRP如TRPVl、 TRPV2、 TRPV3、 TRPV4或TRPM8的活化或活 性有很小的影響或沒有影響。因此，這兩種化合物能夠方便地用于治療或 減輕機(jī)械痛覺過敏，如下文更詳細(xì)所述。除了這些經(jīng)實(shí)施的TRPA1特異性拮抗劑外，采用本文描述的方法或 本領(lǐng)域已經(jīng)描述的方法，可方便的鑒別另外的TRPA1特異性抑制劑。可受機(jī)械性刺激中的活性的小分子有機(jī)化合物和拮抗劑抗體。TRPA1的拮抗 劑抗體、優(yōu)選單克隆抗體可以采用本領(lǐng)域熟知的方法制備。例如，非人單 克隆抗體如小鼠或大鼠單克隆抗體的制備可以通過例如用TRPA1多肽或 其片段免疫動物而完成(參見Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,紐約，1988)。該免疫原可 由天然來源、通過肽合成或通過重組表達(dá)獲得。新的小分子TRPAl抑制劑可通過篩選測試化合物抑制TRPAl離子通 道活性的能力來鑒別。為了篩選拮抗TRPAl信號傳導(dǎo)活性的化合物，必 須先活化TRPA1。實(shí)現(xiàn)其的一種方法是應(yīng)用冷。然而，該方法在高通量篩 選模式中不實(shí)用。在PCT申請WO05/089206描述的方法中，使用TRPAl 激動劑化合物如緩激肽、丁子香酚、姜醇、水楊酸甲酯、蒜素和肉桂醛活 化TRPA1。然后，可以篩選測試化合物阻斷任意這些TRPAl激動劑所致 TRPAl活化或抑制活化的TRPAl離子通道的信號傳導(dǎo)活性的能力。例如，本發(fā)明的篩選方法通常包括使表達(dá)TRPAl的細(xì)胞與測試化合 物相接觸，并鑒別阻抑或抑制細(xì)胞中響應(yīng)于機(jī)械性刺激的活化的TRPAl 的生物學(xué)或信號傳導(dǎo)活性的化合物。細(xì)胞中的TRPAl可以通過在使細(xì)胞 與測試化合物接觸前、接觸的同時(shí)或接觸后加入上文提及的TRPAl激動 劑化合物之一而活化?？梢院Y選化合物調(diào)節(jié)表達(dá)TRPAl的細(xì)胞或培養(yǎng)的 DRG神經(jīng)元響應(yīng)于;W^性刺激的鈣內(nèi)流或細(xì)胞內(nèi)游離4丐水平的能力。如本 文實(shí)施例所述，可以通過FLIPR測定法、采用響應(yīng)于機(jī)械壓力(如抽吸)或 高滲應(yīng)激的表達(dá)TRPA1的CHO細(xì)胞或培養(yǎng)的大鼠DRG，測定測試化合 物對TRPA1介導(dǎo)的機(jī)械感受的調(diào)節(jié)作用。也可以測定它們調(diào)節(jié)表達(dá)TRPA1的細(xì)胞的全細(xì)胞膜電流的活性，例如通過記錄非洲爪蟾卵母細(xì)胞離 體膜片中肉桂醛誘導(dǎo)的TRPA1電流。優(yōu)選地，這些篩選方法以高通量模 式進(jìn)行。例如，可以使每種測試化合物與表達(dá)TRPA1的細(xì)胞在微量滴定 板的不同孔中接觸。TRPA1激動劑存在于每個(gè)孔中以活化TRPA1。如果測試化合物阻抑或抑制活化的TRPA1的活性(例如離子通道活 性)，則候選的TRPA1拮抗劑或抑制劑被鑒別。作為對照，還測定候選 TRPA1拮抗劑對一種或多種其他thermoTRP通道的信號傳導(dǎo)或離子通道 活性的任何作用，如以下實(shí)施例所示。這樣可以鑒別不影響其他 thermoTRP通道正常功能的TRPA1特異性抑制劑。在一些實(shí)施方案中， 經(jīng)鑒別的TRPA1特異性拮抗劑可在適合的動物模型中于體內(nèi)進(jìn)一步測試， 例如通過如以下實(shí)施例所公開的大鼠或小鼠行為學(xué)試驗(yàn)法(縮足試驗(yàn)法)。 對進(jìn)行痛覺過敏試驗(yàn)的另外指導(dǎo)已在文獻(xiàn)中描述，例如Morqrich等, Science 307:1468, 2005和Caterina等，Science 288:306， 2000。作為對照， 也可以使用類似的動物模型確定候選TRPA1特異性拮抗劑在體內(nèi)對其他 thermoTRP沒有4壬何顯著的作用?？捎糜诤Y選新的TRPA1調(diào)節(jié)劑(例如抑制劑)的測試化合物包括多肽、 ^轉(zhuǎn)角才莫擬物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、甾類、芳香族化合物、雜 環(huán)化合物、苯并二氮萆類、寡聚N-取代甘氨酸類、寡聚氨基甲酸酯類、多 核苦酸(例如抑制性核酸如siRNA)、多肽、糖類、脂肪酸、甾類、噤呤類、 嘧啶類、其衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合。 一些測試劑是合成分子，其他是 天然分子。在一些優(yōu)選的方法中，測試劑是小分子有機(jī)化合物(分子量不超 過約500或l，OOO的分子)。優(yōu)選地，高通量試驗(yàn)法被適應(yīng)性修改并用于篩 選這類小分子。在一些方法中，小分子測試劑的組合庫可方便地應(yīng)用于篩 選TRPA1的小分子調(diào)節(jié)劑。本領(lǐng)域中已知的眾多試驗(yàn)法可方便地改良或 者改變以用于實(shí)施本發(fā)明的篩選方法，例如如Schultz等，Bioorg Med Chem Lett 8: 2409-2414， 1998; Weller等，Mol Divers. 3: 61-70， 1997; Fernandes等，Curr Opin Chem Biol 2: 597-603， 1998和Sittampalam等， Curr Opin Chem Biol 1: 384-91， 1997中所述。IV.用TRPA1特異性抑制劑治療機(jī)械痛覺過敏本發(fā)明提供了減輕生理和病理生理狀況下的痛覺的方法(如異常性疼 痛和痛覺過敏)，尤其與經(jīng)TRPA1的機(jī)械感受相關(guān)或由其介導(dǎo)的疼痛感受。 例如，機(jī)械痛覺過敏存在于許多醫(yī)學(xué)障礙中。例如，炎癥能導(dǎo)致痛覺過敏。 炎癥狀況的實(shí)例包括骨關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、心炎、皮炎、肌炎、神經(jīng)炎、膠 原血管病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和狼瘡。具有任何這些狀況的對象通常經(jīng)歷增 強(qiáng)的、其中機(jī)械痛覺過敏是其組成部分的疼痛感受。其他可能引起過度疼 痛的醫(yī)學(xué)狀況或過程包括創(chuàng)傷、外科手術(shù)、切斷術(shù)、膿胂、灼痛、脫髓鞘 疾病、三叉神經(jīng)痛、慢性酒精中毒、中風(fēng)、丘腦疼痛綜合征、糖尿病、癌 癥、病毒性感染和化療。機(jī)械感受在任何這些狀況的痛覺中可起到重要的 作用。通常，所述方法涉及向需要治療的對象施用含有本發(fā)明的TRPA1特 異性抑制劑的藥物組合物。TRPA1特異性抑制劑可以單獨(dú)使用或者與其他 已知的止痛劑聯(lián)合使用，以減輕對象的疼痛。這類已知止痛劑的實(shí)例包括 嗎啡和莫索尼咬(美國專利No. 6,117,879)。適合用本發(fā)明方法治療的對象 是患有機(jī)械感覺過敏(尤其是痛覺過敏)或患有其中傷害性機(jī)械感受起作用 的醫(yī)學(xué)狀況或障礙的那些。它們包括表達(dá)TRPA1的人類對象、非人類哺 乳動物和其他對象或有機(jī)體。對象可能具有當(dāng)前正引起疼痛且可能繼續(xù)引 起疼痛的進(jìn)行中的狀況。它們也可能已經(jīng)或?qū)⒁淌芡ǔ＞哂刑弁春蠊?過程或事件。例如，對象可能具有慢性疼痛狀況如糖尿病性神經(jīng)病性痛覺 過敏或膠原血管病。對象也可能具有炎癥、神經(jīng)損傷或毒素暴露(包括暴露 于化療治療劑)。治療或干預(yù)旨在減少或減輕對象的疼痛，從而使對象所感 受的疼痛水平相對于沒有治療時(shí)對象將感受的疼痛水平降低。通常，治療應(yīng)4吏對象、組織或細(xì)胞獲得所需的藥理學(xué)和/或生理學(xué)作用。 就完全或部分防止疾病或其跡象或癥狀而言，所述作用可以是預(yù)防性的。 就部分或完全治愈痛覺過敏和感受傷害疼痛相關(guān)障礙和/或可歸因于該障 礙的不良反應(yīng)(例如疼痛)而言，所述作用也可以是治療性的。當(dāng)對象是人 時(shí)，人所感受的疼痛水平可以通過要求他或她描述疼痛或者與其他疼痛經(jīng)歷比較來評估?；蛘撸弁此娇赏ㄟ^測量對象對疼痛的身體響應(yīng)如應(yīng)激相關(guān)因子的釋，放或外周神經(jīng)系統(tǒng)或CNS的疼痛傳導(dǎo)神經(jīng)的活性來評定。也 可以通過測量對人而言報(bào)告沒有疼痛或?qū)ο蠖酝Ｖ钩霈F(xiàn)疼痛癥狀所需 要的充分特征性止痛劑的量來評定疼痛的水平。優(yōu)選地，所述方法旨在減輕具有機(jī)械痛覺過敏組分的急性或'隄性疼痛。 "急性"和"慢性"疼痛的區(qū)別是時(shí)間急性疼痛在導(dǎo)致該疼痛的事件(如 炎癥或神經(jīng)損傷)出現(xiàn)后不久即被經(jīng)歷(優(yōu)選在約48小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選在約24 小時(shí)內(nèi)，最優(yōu)選在約12小時(shí)內(nèi))。與之對比，在慢性疼痛經(jīng)歷和導(dǎo)致該疼 痛的事件出現(xiàn)之間存在明顯的時(shí)間延遲。該時(shí)間延遲在該事件后至少約48 小時(shí)，優(yōu)選在該事件后至少約96小時(shí)，更優(yōu)選在該事件后至少約l周。在 本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，TRPA1特異性抑制劑用于治療患有炎性疼痛的 對象。這類炎性疼痛可以是急性或慢性的且可由任何數(shù)量具有炎癥特點(diǎn)的 狀況所致，包括但不限于曬傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、心 炎、皮炎、肌炎、神經(jīng)炎和膠原血管病。在一些其他實(shí)施方案中，目標(biāo)是治療具有神經(jīng)病性疼痛的對象。這些 對象可具有分類為神經(jīng)根病、單神經(jīng)病、多發(fā)性單神經(jīng)病、多神經(jīng)病或神 經(jīng)叢病的神經(jīng)病。這些種類的疾病可由多種神經(jīng)損傷狀況或過程引起，包 括但不限于創(chuàng)傷、中風(fēng)、脫髓鞘疾病、膿腫、外科手術(shù)、切斷術(shù)、神經(jīng)的 炎性疾病、灼痛、糖尿病、膠原血管病、三叉神經(jīng)痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 毒素、癌癥(其可導(dǎo)致直接或遠(yuǎn)程(如腫瘤形成征兆的)神經(jīng)損傷)、慢性酒精 中毒、皰疹感染、AIDS和化療。引起痛覺過敏的神經(jīng)損傷可以在外周或 CNS神經(jīng)。本發(fā)明的該實(shí)施方案是基于顯示施用TRPA1抑制劑顯著降低 由糖尿病、化療或神經(jīng)創(chuàng)傷所致痛覺過敏的試驗(yàn)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，對需要治療或緩解機(jī)械痛覺過敏的對象 施用合并TRPA1抑制劑和一種或多種另外的疼痛減輕劑的藥物組合物。 這是因?yàn)閱为?dú)的疼痛治療藥物通常僅提供部分有效的疼痛緩解作用，因?yàn)?其僅千涉多種疼痛傳導(dǎo)通路中的一種。但是，與疾病或醫(yī)學(xué)狀況相關(guān)的疼 痛通常涉及多種傷害感受器和不同的信號傳導(dǎo)通路，例如不僅機(jī)械感受而且溫度感受。因此，通常需要多于一種疼痛減輕劑來緩解這些情況下的傷害感受。在一些其他應(yīng)用中，TRPA1抑制劑可與作用于疼痛感受過禾呈中不 同點(diǎn)的止痛劑聯(lián)合施用。例如， 一類止痛劑如NSAID(例如對乙酰氛基酚、 布洛芬和吲哚美辛)下調(diào)傷害感受器所檢測的刺激化學(xué)信使。另一類藥物如 阿片樣物質(zhì)改變CNS中感受傷害信息的處理。其他止痛劑如局部麻醉劑、 包括抗驚厥藥和抗抑郁藥也可包括在內(nèi)。除TRPA1抑制劑外還施用一種 或多種藥物可以提供對疼痛更有效的改善。 V.藥物組合物與施用需要治療或緩解由傷害性機(jī)械感受介導(dǎo)的疼痛的對象可施用單獨(dú)的 TRPA1特異性抑制化合物。然而，更優(yōu)選施用包含TRPA1特異性抑制劑 的藥物組合物。可用于藥物組合物的TRPA1特異性抑制劑的實(shí)例包括以 下實(shí)施例中所述的化合物18和化合物40。也可以使用可根據(jù)本發(fā)明的篩 選方法鑒別的新的TRPA1抑制劑。本發(fā)明也提供了藥物組合，例如試劑 盒。該類藥物組合可包含游離形式或組合物形式的、為本文所公開TRPA1 抑制性化合物的活性劑、至少一種活性助劑以及施用活性劑的說明書。包含TRPA1抑制性化合物的藥物組合物可以制備成多種形式。適合 的固體或液體藥物制劑形式是例如顆粒劑、散劑、片劑、包衣片劑、(微) 膠囊劑、栓劑、糖漿劑、乳劑、混懸劑、霜?jiǎng)忪F劑、滴劑或安瓿形式的可注射溶液以; _遲釋放活性化合物的制劑。它們可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備，例如"Remington:藥學(xué)科學(xué)和實(shí)踐"，Gennaro編輯， Lippincott Williams & Wilkins (第20版，2003)。藥物組合物通常包含有 效量的TRPAl抑制性化合物，其足以減輕或改善與TRPAl相關(guān)或由其介 導(dǎo)的疼痛。除TRPAl抑制性化合物外，藥物組合物還可含有某些載體， 其增強(qiáng)或穩(wěn)定組合物或便于組合物的制備。例如，TRPAl抑制性化合物在 其施用前與栽體蛋白如卵清蛋白或血清清蛋白復(fù)合，以增強(qiáng)穩(wěn)定性或藥理 學(xué)特性。各種形式的藥物組合物也可含有賦形劑和添加劑和/或助劑，如崩 解劑、粘合劑、包衣劑、膨脹劑、潤滑劑、調(diào)味劑、餘朱劑和包含通常用 于本領(lǐng)域的惰性稀釋劑如純凈水的酏劑。具體方法來確定。在與其他成分相容和對對象無害的意義上，它們也應(yīng)該 在藥學(xué)上和生理學(xué)上均是可接受的。取決于施用所需制劑的形式，例如口 服、舌下、直腸、鼻、靜脈內(nèi)或胃腸外，栽體可以呈多種形式。例如，非 水性溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射有機(jī)酯如 油酸乙酯。用于封閉輔料的載體可用于增加皮膚滲透性和增強(qiáng)抗原的吸收。 口月良施用的液體劑型通?？砂性撘后w劑型的脂質(zhì)體溶液。包含TRPA1抑制性化合物的藥物組合物可以以治療有效量或劑量局 部或全身施用。它們可以通過胃腸外、腸內(nèi)、注射、快速輸注、鼻咽吸收、 皮膚吸收、直腸和口服施用。有效量是指足以降低或抑制對象的傷害性疼 痛或感受傷害響應(yīng)的量。這類有效量將因?qū)ο蠖?，取決于對象對疼痛的 正常敏感度、其身高、體重、年齡和健康狀況、疼痛來源、TRPA1抑制劑 的施用方式、施用的具體抑制劑以及其他因素。因此，才艮據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定具體 環(huán)境中具體對象的有效量是可取的。對于給定的TRPA1抑制劑化合物，本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過釆用常規(guī) 實(shí)踐的藥學(xué)方法可以容易地確定調(diào)節(jié)感受傷害響應(yīng)的活性劑的有效量。通 常，用于體外的劑量可以對可用于原位施用藥物組合物的量提供有益的指 導(dǎo)，且動物模型可用于確定治療具體障礙的有效劑量。更通常地，適當(dāng)?shù)?治療劑量可通過臨床研究來確定，對哺乳動物種類的臨床研究確定最大耐 受劑量，對正常人類對象的臨床研究確定安全劑量。除了可能需要較高劑 量的某些情況，優(yōu)選的TRPA1特異性抑制劑的劑量通常位于每日約0.001 至約1000mg、更通常約0.01至約500mg的范圍內(nèi)。作為常規(guī)，所施用的 TRPA1特異性抑制劑的量是有效且可靠地預(yù)防或最小化對象病癥的最小 劑量。因此，上述劑量范圍旨在提供一般性指導(dǎo)和對本文教導(dǎo)的支持，而 不意欲限制本發(fā)明的范圍。對本發(fā)明藥物組合物的制備和施用的其他指導(dǎo) 也已在本領(lǐng)域中描述，參見例如"Goodman & Gilman的治療藥物的藥理 學(xué)^5出，，，Hardman等編輯，McGraw-Hill Professional (第10版，2001); "Remington:藥學(xué)科學(xué)和實(shí)踐，，，Gennaro編輯，Lippincott Williams &Wilkins (第20版，2003)和"藥物劑型和藥物遞送系統(tǒng)"，Ansel等(編輯)， Lippincott Williams & Wilkins (第7版，1999)。實(shí)施例提供以下實(shí)施例以說明而非限制本發(fā)明。 實(shí)施例1. TRPA1是傷害性機(jī)械和溫度刺激的多形性感受器我們測試了 TRPA1是否凈皮機(jī)械力活化。通過采用記錄吸管和改變外 部摩爾滲透壓濃度、以兩種不同的機(jī)械應(yīng)激-壓力應(yīng)用試驗(yàn)法，研究了表達(dá) thermoTRP的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的電生理學(xué)行為。在全細(xì)胞記錄 中，表達(dá)TRPA1的細(xì)胞對引起細(xì)胞收縮[或者-100mmHg的抽吸(n-10)或 者應(yīng)用450mOsm高滲溶液(11=8)(圖1A)但不引起細(xì)胞膨脹[或者通過 +100mmHg (11=11)或者220mOsm (n-8)]的刺激顯示強(qiáng)勁的電流響應(yīng)。由壓 力、高滲或冷(11=62)引起的電流顯示相似的脫敏現(xiàn)象，且具有相似的逆轉(zhuǎn) 電位和整流特性，說明這些4幾械敏感電流由TRPA1活化所致(圖1B)。還 觀察到非轉(zhuǎn)染的對照CHO細(xì)胞和CHO細(xì)胞中表達(dá)的其他 thermoTRP(TRPVl、 TRPV2、 TRPV3、 TRPM8)對機(jī)械性刺激沒有響應(yīng)(未 給出數(shù)據(jù))，證實(shí)TRPA1的響應(yīng)是特異性的。已知TRPV4和其他果蠅(Z)ro^p/^7fl)TRPV家族成員響應(yīng)于低滲溶液， 且TRPV4敲除研究顯示該通道是正常的壓尾反應(yīng)所需要的。機(jī)械感受神 經(jīng)元常被分為高或低閾值，分別表征對疼痛和接觸的響應(yīng)。通過應(yīng)用寬范 圍的負(fù)吸管壓力，我們測試了 TRPA1的機(jī)械性闊值(圖1C)。表達(dá)TRPA1 的CHO細(xì)胞在-90mmHg或更高的負(fù)壓時(shí)活化，與參與感受疼痛的天然的 高閾值機(jī)械感受器一致(Cho等，J Neurosci 22:1238， 2002)。有趣的是，20°C 的冷預(yù)脈沖敏感化TRPA1對-30mmHg (n-5)的低機(jī)械性閾值的響應(yīng)，證明 TRPA1的活化閾值可以被調(diào)節(jié)(圖1D)。我們觀察到5jiM已知的TRPA1 阻斷劑釕紅完全阻斷了機(jī)械敏感性電流(對-100mmHg, n=8;對450mOsm， n=5，未給出數(shù)據(jù))，與源于TRPA1的機(jī)械性響應(yīng)一致。釓(Gd")被認(rèn)為是 動物組織中天然機(jī)械門控離子通道的阻斷劑(Martinac等，Physiol Rev81:685, 2001)。我們發(fā)現(xiàn)浴槽應(yīng)用10jiM Gd3+完全且可逆地阻斷了 TRPA1 響應(yīng)于450mOsm (n=5)(圖2A)或-100mmHg (n-6)的2分4中刺激的電流。 FM1-43是一種苯乙烯基染料，其通過進(jìn)入開放的傳導(dǎo)通道而特異性標(biāo)記 感覺細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)FMl-43處理標(biāo)記了用TRPA1轉(zhuǎn)染且用肉桂醛處理 的CHO細(xì)胞。相比之下，未被肉桂醛活化的表達(dá)TRPA1的細(xì)胞不吸收該 染料(未給出數(shù)據(jù))。此外，觀察到10fiM FM1-43能夠阻斷表達(dá)TRPA1的 CHO細(xì)胞中肉桂醛誘導(dǎo)的電流(11=8)。這些結(jié)果與TRPA1是感覺傳導(dǎo)通道 的觀點(diǎn)相一致。為確保我們觀察的機(jī)械性響應(yīng)不是異源表達(dá)系統(tǒng)的贗象，我們測試了 表達(dá)TRPA1的天然神經(jīng)元是否也響應(yīng)于這類刺激。5/6肉桂醛敏感性(推定 的表達(dá)TRPA1的)DRG神經(jīng)元響應(yīng)于-200mmHg抽吸，而0/21肉桂醛不 敏感性神經(jīng)元有響應(yīng)(21中的M個(gè)是辣椒素敏感性的)(圖犯)。近期報(bào)道 毫摩爾的樟腦抑制TRPA1的冷或激動劑活化與基礎(chǔ)電流。我們發(fā)現(xiàn)2mM 樟腦也能夠完全阻斷CHO細(xì)胞中TRPA1對-100mmHg的機(jī)械性響應(yīng) (n=5，圖2C)。相一致的是，DRG神經(jīng)元響應(yīng)于-150mmHg的電流完全被 應(yīng)用同樣濃度的樟腦所抑制(圖2D) (11=15，15個(gè)中的12個(gè)是肉桂,感性 的)。該數(shù)據(jù)強(qiáng)有力地支持了表達(dá)TRPA1的天然DRG神經(jīng)元是機(jī)械敏感 性的，顯示了與CHO細(xì)胞中TRPA1的機(jī)械敏感性的可比較的特性。實(shí)施例2. TRPA1在體內(nèi)機(jī)械性疼痛感受中發(fā)揮必M用我們接下來測試是否急性阻斷TRPA1對疼痛感受具有任何生理學(xué)后 果。RR、 GcP或樟腦不是特異性化合物，不能用于體內(nèi)。采用FLIPR釣 內(nèi)流試驗(yàn)法，我們篩選了 43,648個(gè)小分子阻斷CHO細(xì)胞系中人TRPA1 的肉桂醛-活化的能力。幾個(gè)命中的分子顯示其是肉桂醛的結(jié)構(gòu)類似物。我 們對這些類似物之一化合物18進(jìn)行了深入分析，即(Z)-4-(4-氯苯基)-3-曱 基丁-3-烯-2-肝(Maybridge， Cornwall, UK)。在CHO細(xì)胞FLIPR試驗(yàn)中， 化合物18阻斷了由50nM肉桂醢引起的TRPA1活化，其對人和小鼠克隆 的ICso值分別是3.1nM和4.5nM(圖3B)。相反，化合物18在50jiM不阻斷TRPV1、 TRPV3、 TRPV4和TRPM8(未給出數(shù)據(jù))?；衔?8以濃度 依賴方式將肉桂醛的ECso值從50fiM (對照)移位至220pM(化合物18在 25nM),說明兩種結(jié)構(gòu)類似物竟?fàn)幭嗤慕Y(jié)合位點(diǎn)，但是對通道活性具有 相反的影響(圖3B)?；衔?8阻斷了非洲爪蟾卵母細(xì)胞離體膜片中肉桂醛 誘導(dǎo)的TRPA1電流(圖3C)以及CHO細(xì)胞中冷或壓力資導(dǎo)的TRPA1響應(yīng) (未給出數(shù)據(jù))。為測試化合物18在體內(nèi)的功效和特異性，我們同時(shí)注射肉 桂醛和化合物18于小鼠的后足中。l-10mM化合物18沒有引起任何行為 響應(yīng)(未給出數(shù)據(jù))。但是，化合物18顯著地阻斷了肉桂醛誘導(dǎo)而非辣椒素 誘導(dǎo)的傷害感受事件，說明了該化合物阻斷傷害感受的功效和特異性(圖 3D)。增強(qiáng)的反應(yīng)。我們觀察到對足的急性熱和壓力的感受傷害響應(yīng)沒有受到 化合物18的影響(未給出數(shù)據(jù))。然而，當(dāng)在對后足注射完全弗氏佐劑 (CFA)24h后注射化合物18時(shí)，其減輕了由CFA注射引起的機(jī)械痛覺過敏 (圖4A)。用短期痛覺過敏模型(注射緩激肽)觀察到了相似的機(jī)械性感受傷 害行為減少(圖4B)。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)化合物18沒有阻斷CFA或緩 激肽(BK)引起的熱痛覺過敏(未給出數(shù)據(jù))，這為該化合物的特異性提供了 另外的證據(jù)。用結(jié)構(gòu)不相關(guān)的阻斷TRPA1的化合物[化合物40，N，N'-X3U(2-羥基芐基)-2，5-二氨基-2，5-二曱基己烷也進(jìn)行了本文描述的這些行為學(xué)試 驗(yàn)法，結(jié)果非常相似?？傊@些體內(nèi)數(shù)據(jù)表明阻斷TRPA1減輕機(jī)械 痛覺過敏而非熱痛覺過敏。實(shí)施例3. TRPA1在機(jī)械和冷痛覺過敏中的功能的進(jìn)一步證據(jù)據(jù)我們所知，不可能試驗(yàn)小鼠的傷害性冷響應(yīng)。例如，小鼠對低至0。C 的低溫不顯示感受傷害響應(yīng)，且沒有響應(yīng)于CFA的冷異常性疼痛。對 TRPA1的冷活化存在爭議，但是近期已提出其在大鼠冷痛覺過敏中的體內(nèi) 作用(Jordt等，Nature 427:260， 2004和Obata等，J Clin Invest 115:2393， 2005)。我們因此采用大鼠、使用化合物18來探討TRPA1的作用。我們發(fā)現(xiàn)大鼠TRPA1也被化合物18阻斷，類似于人和小鼠TRPA1(未給出數(shù) 據(jù))。我們觀察到在5。C的盤中，CFA誘導(dǎo)的大鼠冷痛覺過敏被化合物 18有力地阻斷(圖4C)。總之，這些數(shù)據(jù)表明TRPA1在體內(nèi)既作為冷感 受器也作為機(jī)械感受器，但僅在用炎癥或損傷信號敏感化之后。 一致的是， 發(fā)現(xiàn)TRPV1缺失小鼠顯示強(qiáng)的溫度痛覺過#型，但它們顯示沒有或輕 微的急性溫度感受表型(Davis等，Nature 405: 183， 2000和Caterina等， Science 288:306， 2000)。如果TRPA1響應(yīng)于炎癥而敏感化以響應(yīng)于較低的 機(jī)械性閾值，則可以解釋TRPA1在機(jī)械痛覺過敏中的作用。這類似于 TRPV1的熱敏感性調(diào)節(jié)。通常，TRPV1的活化閾值在43。C，但是多種炎 癥信號使TRPV1敏感化而在較低的溫度活化。為測試這種可能性，我們試驗(yàn)了 BK信號傳導(dǎo)是否能降低TRPA1的 機(jī)械性閾值。用lnM BK預(yù)處理3分鐘后，用緩激肽B2受體和TRPA1 共轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞顯示對-60mmHg壓力刺激的機(jī)械性響應(yīng)(圖4D)。該 TRPA1的敏感化響應(yīng)為TRPA1在機(jī)械痛覺過敏中的生理學(xué)作用提供了可 能的分子機(jī)制。在CHO細(xì)胞中，TRPA1對壓力的響應(yīng)并不是即時(shí)的(其發(fā) 作時(shí)間在秒量級內(nèi)變化)，其表明TRPA1不直接被牽張活化，可能是通過 第二信使活化。有趣的是，應(yīng)用BK降低了活化閾值并縮短了延遲。實(shí)施例4. 一般材料和方法哺乳動物細(xì)胞電生理學(xué)如Story等，Cell 112:819， 2003和Bandell等, Neuron 41:849， 2004中所述制備表達(dá)ThermoTRP的CHO細(xì)胞(大鼠 TRPV1、大鼠TRPV2、小鼠TRPV3、大鼠TRPV4、小鼠TRPM8和小鼠 TRPA1)、對照CHO細(xì)胞和培養(yǎng)的大鼠DRG神經(jīng)元。電生理學(xué)記錄如 Bandell等，Neuron 41:849， 2004所述進(jìn)行。簡言之，將CHO細(xì)胞在-60mV 鉗制，并且每4秒運(yùn)^f亍一次從-80mV至+80mV的0.8秒掃描電壓(ramps)。 在-60mV記錄DRG神經(jīng)元的電流并用于其電流-電壓曲線，在800ms從 -80mV至+80mV的電壓掃描前40ms，應(yīng)用以+20mV計(jì)的300ms階躍電壓， 以最小化電壓門控的Na+或Ca^電流的污染。溫度和高滲試驗(yàn)用的吸管溶液(pipette solution)由(以mM計(jì))140 CsC1、5 EGTA、10 HEPES、2 MgATP、 0.2 NaGTP組成，用CsOH滴定至pH 7.4。這些試驗(yàn)所用的外部基液由(以 mM計(jì))140NaCl、 5 KC1、 IOHEPES、 2 CaCl2、 1MgCl2組成，用NaOH 滴定至pH 7.4。使用甘露醇調(diào)節(jié)高滲溶液的摩爾滲透壓濃度。對于小鼠 TRPV3和大鼠TRPV2，外部的鈣用5mM EGTA替換。在(+)壓力和低滲 試驗(yàn)中，用葡萄糖酸鹽代替氯化物，以消除內(nèi)源性腫脹活化的氯化物電流 的可能性。對于這些試驗(yàn)，吸管溶液(295mOsm)的組成如下(以mM計(jì)) 125葡萄糖酸Cs鹽、15 CsCI、5 EGTA、10 HEPES、2 MgATP、0.2 NaGTP， 用CsOH滴定至pH 7.4。外部溶液的組成如下(以mM計(jì))90葡萄糖酸 Na鹽、10 NaCl、 5葡萄糖酸K鹽、10 HEPES、 2 CaCl2、 1 MgCl2，用 NaOH滴定至pH 7.4。摩爾滲透壓濃度用甘露醇調(diào)節(jié)至220mOsm(低滲) 或298mOsm 15(等滲)。(士)-壓力采用注射泵、通過記錄吸管以流體靜力學(xué) 方式遞送(Hamill等，Annu Rev Physiol 59:621， 1997)，并通過壓力監(jiān)測器監(jiān) 測(World Precision Instruments)。使用Warner溫度控制器(TC-324B和 CL-100)加熱或冷卻灌注的浴槽溶液。棄去其中接點(diǎn)電位/阻抗顯著變化或 沒有任何刺激而在-60mV形成超過-100pA基流的試驗(yàn)。所測試的除TRPA1 外的所有thermoTRP對機(jī)械性刺激不響應(yīng)。用-lOOmmHg至-300mmHg、 ~+100mmHg、 450mOsm和220mOsm測試的每種細(xì)胞類型的細(xì)胞數(shù)目(n) 分別是CHO細(xì)胞，n=7、 14、 5、 12; TRPV1， n=6、 5、 7、 5; TRPV2， n=4、 5、 3、 5; TRPV3, n=3、 2、 3、 0; TRPM8， n=12、 4、 10、 0。已 知TRPV3和TRPM8對低滲溶液不響應(yīng)。FM1-43試驗(yàn)mTRPAl轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的FM1-43標(biāo)記如文獻(xiàn)所 述進(jìn)行(Meyers等，J Neurosci 23:4054， 2003)。簡言之，采用Fugene (Roche) 以mTRPAl-pCDNA5轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。對于模擬轉(zhuǎn)染，用Fugene處理 CHO細(xì)胞，但不用任何質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將細(xì)胞與200nM肉 桂醛的生理緩沖液由(以mM計(jì))130NaCl、 3 KC1、 2 MgCl2、 2 CaCl2、 10 HEPES、 10葡萄糖組成]在室溫孵育5分鐘，隨后與lOjiM FM1-43醉 育3分鐘。然后將細(xì)胞徹底清洗并顯像。表達(dá)mTRPAl和hTRPAl的CHO細(xì)胞用全細(xì)胞膜片鉗才支術(shù)、采用PatchXpress(Axon Instruments)測試 FM1-43染料對TRPAl活化的影響。測試的前一天鋪板細(xì)胞并用0.5ng/mL 四環(huán)素誘導(dǎo)，如Story等，Cell 112:819， 2003先前所述。臨測試前，將細(xì)胞 用胰蛋白酶消化并重懸于無鈣DMEM介質(zhì)(Invitrogen)中。在包含(以mM 計(jì))2.67KC1、 1.47KH2P04、 0.5MgCl2、 138NaCl、 8Na2HP04、 5.6葡萄 糖的細(xì)胞外液中進(jìn)行記錄。細(xì)胞內(nèi)溶液包含(以mM計(jì))140 KCl、 10 HEPES、 20葡萄糖、IOHEDTA和lnM緩沖的游離鈣。使用在-80mV下 的維持電流進(jìn)行定量分析TRPAl活化和抑制。試驗(yàn)包括初始應(yīng)用100nM 肉桂醛以引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的電流，隨后第二次加入肉桂醛和10nMFMl-43。在 7/8表達(dá)mTRPAl的細(xì)胞和3/4表達(dá)hTRPAl的細(xì)胞中觀察到電流抑制。 平均而言，觀察到50。/。的電流阻斷。FLIPR篩選將表itATRPAl的CHO細(xì)胞以~8，000個(gè)細(xì)胞/孔的濃 度鋪至384孔板中。試驗(yàn)前l(fā)小時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至磷酸緩沖鹽水(PBS)中， 并采用FLIPR Calcium 3分析試劑盒(Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 負(fù)栽以4丐敏感染料FLUO-4。采用FLIPR2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)進(jìn)行試驗(yàn)。將所有化合物從高濃度、基于DMSO的儲備溶液稀釋到 PBS中，并在數(shù)據(jù)采集期間用FLIPR2的內(nèi)吸頭加入。最終的DMSO濃度 不超過0.5%。非洲爪蟾卵母細(xì)胞離體膜片將人TRPAl克隆到pOX表達(dá)載體(Jegla 等，J Neurosci 17:32， 1997)中，4吏用T3 mMessage Machine試劑盒(Ambion， TX)制備cRNA轉(zhuǎn)錄物。對成熟的17個(gè)去濾泡膜非洲爪蟾卵母細(xì)胞注射以 lfig/jiL的50nL人TRPAl cRNA。將卵母細(xì)胞在ND96 (96mM NaCl、2mM KC1、 ImM MgCl2， 1.8mM CaCl2、 5mMHEPES、 pH7.4，補(bǔ)充以丙酮酸 Na鹽(2.5mM)、青霉素(100u/mL)和鏈霉素(100照/mL))中孵育3-5天，以 保證表達(dá)。記錄前以積堿方式除去卵黃外膜。在室溫用l-L5MQ吸管對內(nèi) 面向外式離體膜片進(jìn)行電壓鉗記錄。浴槽底部用瓊脂橋隔離。補(bǔ)償電容和 串聯(lián)電阻，并使用消除天然鈣活化的氯化物點(diǎn)流的溶液(膜片電極(以mM 計(jì))140NaMES、 4 NaCl、 1 EGTA、 10HEPES, pH7.2;浴槽溶液140KMES、 4KC1、 1EGTA、 10HEPES, pH 7.2)。將化合物加至浴槽溶液。 使用Multiclamp 700B放大器和pCLAMP數(shù)據(jù)采集軟件記錄電流。行為學(xué)試驗(yàn)8-10周齡小鼠(C57816小家鼠(Af"s附"sc"/"s))和 150-250gSpragueDawley大鼠用于所有行為學(xué)試驗(yàn)。在所有試驗(yàn)前，使動 物適應(yīng)它們的測試環(huán)境20-60min。學(xué)生氏T檢驗(yàn)用于所有統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。所 有誤差棒代表均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。熱感應(yīng)盤、Hargreaves方法(Plantar Analgesia meter)和Von Frey儀器(Dynamic Plantar Aesthesiometer)來自 UGO Basile和Columbus儀器。機(jī)械或溫度痛覺過敏試驗(yàn)如Morqrich等， Science 307:1468， 2005和Caterina等，Science 288:306， 2000所述進(jìn)行。簡言之，在所有試驗(yàn)前，使小鼠對其測試環(huán)境適應(yīng)60min。首先測定 基線響應(yīng)，然后將10nM BK注射至左后足的皮膚。在注射后5、 15和30min 測定Von Frey閾值或縮足潛伏期。有時(shí)將ImM化合物18共同注射至左 后足以測試其止痛作用。對于CFA誘導(dǎo)的痛覺過敏試驗(yàn)，5jig CFA以IOjiL 注射至小鼠(Caterina等，Science 288:306， 2000和Cao等,Nature 392:390， 1998)， 50jig CFA以100jiL(l:l礦物油和鹽水的乳液；Obata等，J Clin Invest 115:2393， 2005)注射至大鼠，并在24小時(shí)后進(jìn)行測定。在測定前， 4吏動物重新適應(yīng)環(huán)境20-60min。對于用CFA注射動物的試驗(yàn)采用不同的 時(shí)間點(diǎn)(化合物18注射后30min、 1、 lV2、 2和4小時(shí))。化合物除非另有說明，所有化學(xué)品均購于Sigma-Aldrich。辣椒素購 于Fluka。釕紅(10mM)或氯化釓(100mM)儲備液用水配制，使用前用測試 溶液稀釋。應(yīng)了解本文所述實(shí)施例和實(shí)施方案僅為說明性目的，鑒于此的各種 修飾和變化將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉，且應(yīng)包括在本申請的精神和范圍 與附加權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。盡管任何相似或相當(dāng)于本發(fā)明所述的方法和 材料可用于實(shí)踐或試驗(yàn)本發(fā)明，但還是描述了優(yōu)選的方法和材料。本文引用的所有出版物、GenBank序列、ATCC保存物、專利和專利 申請明確地以其全部并為所有目的引用在此作為參考，如同其各自被單獨(dú) 引用。
權(quán)利要求
1.在對象中治療痛覺過敏的方法，包括向所述對象施用包含有效量的TRPA1拮抗劑的藥物組合物，其中TRPA1拮抗劑特異性阻斷TRPA1活化，從而阻抑或抑制對象的傷害性化學(xué)感受、溫度感受和機(jī)械感受。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中TRPA1拮抗劑不阻斷選自TRPV1、 TRPV2、 TRPV3、 TRPV4和TRPM8的一種或多種其他thermoTRP的活化。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中TRPAl拮抗劑是(Z)-4-(4-氯苯基)-3-甲基 丁_3-烯-2-將。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中11 ^1拮抗劑是]\[，]^-雙-(2-羥基節(jié)基)-2，5-二絲-2，5-二甲基己烷。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中TRPA1拮抗劑是TRPA1拮抗劑抗體。
6. 權(quán)利要求l的方法，其中的對象患有炎性病癥或神經(jīng)病性疼痛。
7. 權(quán)利要求l的方法，其中的對象患有機(jī)械或溫度痛覺過敏。
8. 壽又利要求l的方法，其中的對象是人。
9. 權(quán)利要求l的方法，進(jìn)一步包括向?qū)ο笫┯玫诙N疼痛減輕劑。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中第二種疼痛減輕劑是選自對乙酰氨基酚、 布洛芬和丐l咮美辛和阿片樣物質(zhì)的止痛劑。
11. 權(quán)利要求9的方法，其中第二種疼痛減輕劑是選自嗎啡和莫索尼 咬的止痛劑。
12. 鑒別抑制或阻抑傷害性機(jī)械感受的活性劑的方法，包括(a)使測試 化合物與表達(dá)瞬時(shí)受體電位離子通道TRPA1的細(xì)胞接觸，和(b)鑒別抑制 細(xì)胞中響應(yīng)于機(jī)械刺激的活化的TRPA1的信號傳導(dǎo)活性的化合物；從而 鑒別抑制或阻抑傷害性機(jī)械感受的活性劑。
13. 權(quán)利要求12的方法，進(jìn)一步包括測試所鑒別的化合物對選自 TRPV1、 TRPV2、 TRPV3、 TRPV4和TRPM8的一種或多種thermoTRP 的活化或信號傳導(dǎo)活性的作用。
14. 權(quán)利要求12的方法，其中相對于該化合物不存在時(shí)的TRPA1離 子通道的信號傳導(dǎo)活性，所鑒別的化合物阻抑或降低活化的TRPA1離子 通道的信號傳導(dǎo)活性。
15. 權(quán)利要求12的方法，其中所鑒別的化合物不阻斷選自TRPV1、 TRPV2、 TRPV3、 TRPV4和TRPM8的一種或多種thermoTRP的活化。
16. 權(quán)利要求12的方法，其中活化的TRPA1離子通道被選自肉桂醛、 丁子香酚、姜醇、7jC楊酸甲酯和蒜素的TRPAl激動劑活化。
17. 權(quán)利要求12的方法，其中的細(xì)胞是表達(dá)TRPA1的CHO細(xì)胞、 表達(dá)TRPA1的非洲爪蟾卵母細(xì)胞，或培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元。
18. 權(quán)利要求12的方法，其中信號傳導(dǎo)活性是TRPA1引起的跨細(xì)胞 膜電流或釣細(xì)胞內(nèi)流。
19. 權(quán)利要求12的方法，其中機(jī)械刺激是抽吸壓或高滲應(yīng)激。
20. TRPA1特異性抑制劑在制備用于在對象中治療溫度或機(jī)械痛覺過 敏的藥物中的用途，其中TRPA1特異性抑制劑是(Z)-4-(4-氯苯基)-3-甲基 丁一3-烯-2-肟或N，N，-雙-(2-羥基節(jié)基)-2，5-二氨基-2，5-二甲基己烷。
全文摘要
本發(fā)明提供了特異性抑制TRPA1而不抑制thermoTRP離子通道家族其他成員的化合物。本發(fā)明還提供了使用TRPA1特異性抑制劑治療或緩解由傷害性機(jī)械感受介導(dǎo)的疼痛的方法。
文檔編號A61K31/185GK101404991SQ200780009931
公開日2009年4月8日 申請日期2007年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月21日
發(fā)明者A·帕塔普蒂安, T·J·熱格拉 申請人:Irm責(zé)任有限公司;斯克里普斯研究所