專利名稱：疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗及其制備和施用方法，且特別涉及用于水生動物的納米化 疫苗、其制備方法及施用方法。
背景技術(shù)：
病毒性神經(jīng)壞死癥(Viral nervous necrosis disease, VNN disease)是近年來普 遍發(fā)生在海水養(yǎng)殖魚類的病毒性疾病，首次發(fā)生在日本，隨后發(fā)生在世界各地， 除了非洲之外，其他各洲都有案例，是一種全球性的魚類病毒性疾病，造成此 疾病的病毒稱為神經(jīng)壞死癥病毒(N ervous necrosis virus, NNV),或稱為魚類結(jié)病 毒(Fish nodavims or Beta-nodavirus)。
神經(jīng)壞死癥病毒為單股RNA病毒，不具外套膜、外型為二十面體、直徑約 25~34nm的病毒顆粒。罹病初期的魚苗會有突發(fā)性的游動，體色變黑，失去平 衡能力，及回旋打轉(zhuǎn)、螺旋游泳等不正常游泳行為，部分魚只有身體側(cè)彎、體 色變黑，有時(shí)會側(cè)躺漂浮在水面，虛弱的魚苗先是浮在水面，最后沈入池底死 亡；在出現(xiàn)病癥后的一周內(nèi)即會發(fā)生大量死亡的情形(Yoshikoshi, Inoue, 1990; Glazeb訓(xùn)k et al" 1990; Bloch et al., 1991; Renault et al" 1991)。
隨著養(yǎng)殖技術(shù)的進(jìn)步，傳統(tǒng)粗放式養(yǎng)殖逐漸轉(zhuǎn)型發(fā)展到今日高密度集約式 養(yǎng)殖。目前世界上從事水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的國家大多采取高密度集約式養(yǎng)殖，此方式 雖能大幅度提高單位面積的生產(chǎn)能力，但也造成了許多問題，特別是養(yǎng)殖過程 中因管理不當(dāng)而引起的疾病爆發(fā)。
現(xiàn)今的防治方法主要為藥物處理，例如，以氯、碘、銨或臭氧對用具、魚 卵、水及何料進(jìn)行消毒，但在解決魚類病毒性疾病中，除了環(huán)境的消毒及增加 魚體免疫力外，疫苗的開發(fā)也非常重要，且臺灣及許多魚苗養(yǎng)殖國家每年都有 病毒性神經(jīng)壞死癥(VNN)爆發(fā)，造成經(jīng)濟(jì)嚴(yán)重?fù)p失，因此發(fā)展有效的神經(jīng)壞死病 毒疫苗成為防疫工作的首要項(xiàng)目。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種疫苗的制備方法及施用方法。本發(fā)明的疫苗制備 方法可制備出顆粒大小在20至500 nm之間的納米化疫苗，保護(hù)效果在60%相 7十存活率(relative percentage survival, RPS)以上的疫苗。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括
一種制備疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)利用細(xì)胞林培養(yǎng) 病毒，以獲得含有所述的病毒的上清液；(b)將所述的上清液以去活化藥劑處 理，得到去活化疫苗；以及(c)將所述的去活化疫苗經(jīng)納米化包埋程序，形成 納米化包埋的去活化疫苗。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的納米化去活化疫苗的大小在20至500nm之間。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞林為所有對NNV具感受性的魚類細(xì)胞才朱。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞林是GF-1、 SSN-1、 E-ll、 GB3、 GF、 GL、 SISE、 GS、 SAF1或GL-av。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的病毒是自所有罹患神經(jīng)壞死癥魚體分離出來的 NNV分離抹的任意一種。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的病毒是RGNNV、 SJNNV、 TPNNV、 BFNNV、 FEV、 DG麗V、 GGNNV、 G9410YA、 G9508KS或HGOOGD。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的去活化藥劑是0.1-0.2%體積比的曱醛水溶液或 2-澳乙胺(binary ethyleneimine)。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的納米去活化疫苗的病毒濃度在105TCID50/ml 以上。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的納米去活化疫苗的保護(hù)效果(relative percentage survival, RPS)為60%以上。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的納米去活化疫苗為浸泡式疫苗，以浸泡的方式 進(jìn)行免疫。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的浸泡的時(shí)間為30至60分鐘之間。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的納米去活化疫苗用于免疫水生動物。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的水生動物是魚類、壞類或蟹類。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的魚類是金目逢盧(barramundi， Lates Calcarifer)、海
逢盧(seabass, Dicentrarchus labrax)、 鮮魚(turbot, Scophthalmus maximus)、 紅點(diǎn)石
斑(red-spotted grouper， Epinephelus akaara)條纟文錄(striped jack, Pseudocaranxdentex)、大西洋t匕目魚(Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus)、虎;可魚屯(tiger puffer, Takifugu mbripes)、 日本鰈魚(Japanese flounder, Opegnathus fasciatus Temminck and Schlegel)、 條斑星鰈(barfin flounder, Versaper moseri)、 紅甘錄 (purplish amberjack， Seriola dumerili)、 七帶石斑(sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus)或曰本真多盧(Japanese sea bass, Lateolabrax japonicus)。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的魚類的魚齡小于或等于1個(gè)月。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案還包括
一種疫苗，其是由權(quán)利要求1所述的方法制備得到，其特征在于所述的 疫苗的顆4立大小在20至500 nm之間，且其寸呆護(hù)凌丈果(relative percentage survival, RPS)在600/。以上。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的制備疫苗用的病毒來自罹患神經(jīng)壞死癥魚體分 離出來的NNV分離才朱。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的NNV分離抹是RGNNV 、 SJNNV 、 TPNNV 、 BFNNV、 FEV、 DGNNV、 GGNNV、 G9410YA、 G9508KS或HG00GD。 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的疫苗的病毒濃度在105 TCID50/ml以上。 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的疫苗為浸泡式疫苗，以浸泡的方式進(jìn)行免疫。 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的浸泡的時(shí)間在30 ~ 60分鐘之間。 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的疫苗用于免疫水生動物。 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的水生動物是魚類、蚱類或蟹類。 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的魚類是金目多盧(barramundi， Lates Calcarifer)、海 多盧(sea bass, Dicentrarchus labrax)、 鲆魚(turbot， Scophthalmus maximus)、 紅點(diǎn)石 斑(red-spotted grouper, Epinephelus akaara)條纟丈錄(striped jack, Pseudocaranx dentex)、大西洋比目魚(Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus)、虎河魚屯(tiger puffer, Takifugu rubripes)、 日本蝶魚(Japanese flounder, Opegnathus fasciatus Temminck and Schlegel)、 條斑星蝶(barfin flounder, Versaper moseri)、 紅甘錄 (purplish amberjack, Seriola dumerili)、 七帶石斑(sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus)或曰本真多盧(Japanese sea bass， Lateolabrax japonicus)等。 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的魚類的魚齡小于或等于1個(gè)月。 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有的有益效果是本發(fā)明的納米包埋的去活 化疫苗的大小在20至500 nm之間，病毒濃度在105 TCID50/ml以上，且其相對
存活率(Relative percentage survival, RPS)在60%以上。


圖1A顯示當(dāng)NNV病毒濃度為106 TCID50/ml時(shí)，無納米包埋組及納米包 埋組魚苗的累積死亡率的比較；
圖1B顯示含高濃度NNV病毒(1(^TCID50/ml)的無納米包埋疫苗組及低濃 度NNV病毒(105 TCID50/ml)的納米包埋疫苗組魚苗累積死亡率的比較。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是提供一種制備疫苗的方法，包括以下步驟
(a) 利用細(xì)胞抹培養(yǎng)病毒，以獲得含有病毒的上清液；
(b) 將上清液以去活化藥劑處理，得到去活化疫苗；以及
(c) 將去活化疫苗經(jīng)納米化包埋程序后，形成納米去活化疫苗。 在本發(fā)明的一實(shí)施例中，利用細(xì)胞抹增殖病毒，以獲得含有病毒的細(xì)胞上
清液，其中細(xì)胞林包括所有對NNV具有良好感受性的魚類細(xì)胞4朱，例如GF-1(美
國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection, ATCC)寄存編號
PTA-859;美國專利號US6，436，702)、 GF (Biochem. Biophys. Res. Comim. 2006
Oct 19)、 GL (Biochem. Biophys. Res. Comun. 2006 Oct 19)、 GB3 (Biochem.
Biophys. Res. Comun. 2006 Oct 19)、 SISE (J. Virol. Methods. 2006 Nov;
137(2):309陽16)、 GS(J. Virol. Methods. 2006 Jan;131(l):58-64)、 SAFl(Fish
Shellfish Immunol. 2004 Jan;16(1):11-24)、 SSN-l(Dis. Aquat. Organ. 1999 Dec
22; 39(l):37-47)、GL-av (Dis. Aquat. Organ. 2000 Nov 14; 43(2):81-9)或E-ll(Dis.
Aquat. Organ. 2000 Nov 14; 43(2):81-9)等，較佳為GF陽l。
病毒包括自所有罹患神經(jīng)壞死癥魚體分離出來的NNV分離林，例如
RGNNV(J. Gen. Virol. 1995; 76 (7): 1563-1569)、 SJNNV (J. Gen. Virol. 1995; 76
(7): 1563-1569)、 TPNNV (J. Gen. Virol. 1995; 76 (7): 1563-1569)、 BFNNV(J. Gen.
Virol. 1995; 76 (7): 1563-1569)、 FEV、 DGNNV (Virology 2001; 290 (1): 50-58)、
GGNNV、 G9410YA(Dis. Aquat. Org. 2003;55 (3): 221-228)、 G9508KS(Dis.
Aquat. Org. 2003; 55 (3): 221-228)或HGOOGD(Dis. Aquat. Org. 2003; 55(3):
221-228)等，上述NNV分離抹包括許多品系(strain),例如SJNNV(D30814)、
TPNNV(D38637)、 BFNNV (D38635)、 RGNNV(D38636)、 MGNNV(AF245003)、
DGNNV(AF245004)、 B00GD(AY140794)、 G9508KS(AY140798)、
HG00GD(AY 140799)、 YP99PD(AY140800)、 G9410YA(AY140801)等，上述品系的核酸序列在美囯國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的基因庫(Genbank)中都有記載。
取得含有病毒的上清液后，以0.1-0.2%的甲醛水溶液或4mM的2-溴乙胺 (binary ethyleneimine, BEI)去活化，形成去活化疫苗，再將去活化疫苗經(jīng)納米化 包埋程序，形成本發(fā)明的納米化去活化疫苗。
本發(fā)明的去活化程序可為曱醛水溶液去活化或2-溴乙胺(binary ethyleneimine, BEI)去活化。在曱醛水溶液去活化程序中，可以0.1-0.2%的曱醛 水溶液溶液，在24。C至30。C下處理3至7天，再以磷酸緩沖液(PBS)透析24 小時(shí)，形成可使用的去活化疫苗。而在BEI去活化程序中，將2g的2-溴乙胺加 入100 ml的0.175 N的氫氧化鈉中，在30。C至37°C下加熱1-2小時(shí)，即形成 BEI去活化藥劑。以3-4 mM的BEI藥劑，在23-27。C下處理3至5天，并以磷 酸緩沖液(PBS)透析24小時(shí)，形成可使用的去活化疫苗。
本發(fā)明的納米化包埋程序包括使用重量百分比為30-99.9%的基質(zhì)與重量百 分比為0.1-70%的去活化疫苗，較佳為0.1%的去活化疫苗(有關(guān)納米化包埋的程 序請參照臺灣專利公開號TW200409656)。上述基質(zhì)可為氫化植物油、氫化動物 油或C8-64飽和脂肪酸及其衍生物所組成的非水溶性基質(zhì)。基質(zhì)也可為二價(jià)離 子成膠類及其衍生物或隨溫度變化成膠類及其衍生物的水溶性基質(zhì)。而被包埋 物為上述的去活化疫苗。
本發(fā)明的納米包埋去活化疫苗的大小為約20至500 nm之間，較佳為約50 至100nm,最佳為約80nm。病毒濃度在105 TCID50/ml以上，較佳為約105至 107 TCID50/ml之間，最佳為約108 TCID50/ml。相對存活率在60%以上，較佳 在80%至90%之間。此外，與 一般的去活化疫苗相比，本發(fā)明的納米包埋去活 化疫苗可以較少的量達(dá)到相同的保護(hù)效果，至少可節(jié)省病毒用量IOO倍，且納 米包埋可增加疫苗保存時(shí)間，例如，可在4°C下存》t 1年以上。
本發(fā)明的去活化及納米包埋去活化疫苗的施用方式可為注射法(如皮下注 射、肌肉注射)、口服法或浸泡法，較佳為浸泡法。本發(fā)明的浸泡方法適用于無 法以注射免疫的魚苗，通常為魚齡在1個(gè)月以內(nèi)的魚苗。浸泡方法為以105至 107 TCID50/ml的去活化疫苗或納米去活化疫苗浸泡魚苗，浸泡溫度約20至25°C 之間，浸泡時(shí)間約30至60分鐘之間。
本發(fā)明的去活化及納米去活化疫苗適用于一般的水生(海水及淡水)動物，例 如魚類、奸類或蟹類，特別是對NNV具感受性的魚類，例如，金目妒(barramundi，Lates Calcarifer)、海多盧(sea bass, Dicentrarchus labrax)、鲆魚(turbot， Scophthalmus maximus)、紅點(diǎn)石斑(red陽spotted grouper, Epinephelus akaara)、條紋鰺(striped jack, Pseudocaranx dentex)、大西洋比目魚(Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus)、 虎河魚屯(tiger puffer, Takifugu rubripes)、 曰本鰈魚(Japanese flounder, Opegnathus fasciatus Temminck and Schlegel)、條斑星鰈(barfin flounder, Versaper moseri)、紅 甘鰺(purplish amberjack, Seriola dumerili)、 七帶石斑(sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus)及日本真多盧(Japanese sea bass, Lateolabrax japonicus) 等。
實(shí)施例 病毒的增殖
將神經(jīng)壞死病毒(NNV)接種在GF-1細(xì)胞，培養(yǎng)在含2%胎牛血清的L-15培 養(yǎng)液中，在28。C下4天，取含有病毒的細(xì)胞上清液。
以曱醛水溶液制備神經(jīng)壞死病毒去活化疫苗
以0.2%的曱^水溶液(Formalin)進(jìn)行神經(jīng)壞死病毒(NNV)去活化處理，以去 活化的神經(jīng)壞死病毒(NNV)作為疫苗的抗原。處理?xiàng)l件為取適當(dāng)體積的37% 曱醛水溶液加入病毒液中，4吏曱醛水溶液的最終濃度為0.2%;例如耳又0.54ml的 37%甲醛水溶液加入99.46ml的病毒液中；將加入曱醛水溶液的病毒液置于 30°C, 3天后，以磷酸緩沖液(PBS)透析24小時(shí)，再以GF-1細(xì)胞測定各樣品的 病毒力價(jià)。
以2-溴乙胺(binary ethyleneimine)制備神經(jīng)壞死病毒去活化疫苗 以4 mM 2-溴乙胺(BEI)進(jìn)行神經(jīng)壞死病毒(NNV)去活化處理，以去活化的神 經(jīng)壞死病毒(NNV)作為疫苗的抗原。處理?xiàng)l件為取2.1 g 2-溴乙胺(binary ethyleneimine)加入100 ml 0.175 N的NaOH中，再以37。C水浴槽加熱2小時(shí)， 加熱完畢后即為BEI;將配置好的BEI加入病毒液，使BEI的最終濃度為4mM， 置于25°C, 3天，取去活化病毒液以4°C磷酸緩沖液(PBS)透析24小時(shí)后備用。
納米包埋程序 配方基質(zhì)60%重量百分比的氫化-更棕油及30%重量百分比的椰子油
被包埋物10%重量百分比的被包埋物，被包埋物為本發(fā)明的去活化疫苗的 抗原以磷酸緩沖液(PBS)稀釋100倍的稀釋液
因此，納米包埋疫苗中，去活化疫苗的抗原在納米包埋后的濃度為包埋前 濃度的0.1%重量百分比。
條件
傳輸管管徑20 mm 流速150升/小時(shí) 噴嘴口徑0.8 mm
將氫化硬棕油、椰子油及本發(fā)明的去活化疫苗在55°C下充分?jǐn)嚢杈鶆?，?用泵傳輸，注入38°C水溶液中造粒，再以冷凍干燥機(jī)干燥。 結(jié)果
顆粒粒徑在80 nm左右，顆粒集結(jié)比重小于水，可懸浮在水中，溶點(diǎn)為43°C。 免疫方法
實(shí)驗(yàn)魚苗為點(diǎn)帶石斑(Epinephelus coioides ) 8分苗，體長平均為2.4cm, 重約0.22g,無NNV帶原，蓄養(yǎng)在純海水中，并以人工飼料馴斜。以浸泡方式 免疫，疫苗免疫條件分為4種(l)NNV濃度為106TCID50/ml的無納米包埋疫 苗，(2)NNV濃度為106 TCID50/ml的納米包埋疫苗，(3) NNV濃度為107 TCID50/ml的無納米包埋疫苗，(4)NNV濃度為105 TCID50/ml納米包埋疫苗。 浸泡免疫溫度為25° C,浸泡時(shí)間30-60分鐘，浸泡后將魚只撈出置入新缸。 空白對照組則以磷酸緩沖液(PBS)代替疫苗。
活體攻毒試驗(yàn)
魚苗免疫一個(gè)月后以浸泡方式攻毒，攻毒劑量為1.6xl06TCID50/ml的 NNV,浸泡溫度為25° C,每組40尾苗。疫苗的保護(hù)效果以免疫魚的相對存活 率(Relative Percent Survival, RPS)來計(jì)算，RPS= l-(免疫組魚累積死亡率/對照組 魚累積死亡率)x 100%。參照圖1A，圖1A顯示當(dāng)NNV病毒濃度為106 TCID50/ml 時(shí)，無納米包埋組及納米包埋組魚苗的累積死亡率。^為PBS空白對照組，■ 為無納米包埋的疫苗組，口為有納米包埋的疫苗組。當(dāng)病毒濃度都為106 TCID50/ml時(shí)，納米包埋組魚苗的累積死亡率最^f氐，經(jīng)納米包埋組疫苗免疫的魚苗的RPS值為61%,經(jīng)無納米包埋組疫苗免疫的魚苗的RPS值為32%。參照 圖IB,圖IB顯示含高濃度NNV病毒(1(^TCID50/ml)的無納米包埋疫苗組及 低濃度NNV病毒。經(jīng)低病毒濃度的納米包埋組(105 TCID50/ml)疫苗免疫的魚苗 的累積死亡率最低，RPS值為85。/。，經(jīng)高病毒濃度的無納米包埋組(107 TCID50/ml)疫苗免疫的魚苗的RPS值為43%。
保護(hù)期限試驗(yàn)
含107 TCID50/ml病毒濃度的BEI去活化神經(jīng)壞死病(NNV)疫苗，浸泡免疫 石斑八分魚苗，分批在免疫2周、1個(gè)月、3個(gè)月后，以1.6x106 TCID50/ml的 神經(jīng)壞死病(NNV)浸泡攻毒。結(jié)果顯示免疫2周后魚苗的RPS值為30%,免疫 1個(gè)月后魚苗的RPS值高達(dá)87.5。/。，而免疫3個(gè)月后魚苗的RPS值仍高達(dá)82。/。。 由此可知，疫苗的保護(hù)效果在免疫后一個(gè)月達(dá)到高峰，且至少維持至免疫后三 個(gè)月。
以上說明對本發(fā)明而言只是說明性的，而非限制性的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員理解，在不脫離權(quán)利要求所限定的精神和范圍的情況下，可作出許多修改、 變化或等效，但都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求可限定的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種制備疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)利用細(xì)胞株培養(yǎng)病毒，以獲得含有所述病毒的上清液；(b)將所述的上清液以去活化藥劑處理，得到去活化疫苗；以及(c)將所述的去活化疫苗經(jīng)納米化包埋程序，形成納米化包埋的去活化疫苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備疫苗的方法，其特征在于所述的納米化去 活化疫苗的顆粒大小在20至500 nm之間。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備疫苗的方法，其特征在于所述的細(xì)胞林為 所有對NNV具感受性的魚類細(xì)胞林。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備疫苗的方法，其特征在于所述的細(xì)胞林是 GF-1、 SSN-1、 E-ll、 GB3、 GF、 GL、 SISE、 GS、 SAF1或GL-av。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備疫苗的方法，其特征在于所述的病毒是自 所有罹患神經(jīng)壞死癥魚體分離出來的NNV分離林的任意一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備疫苗的方法，其特征在于所述的病毒是 RGNNV、 SJNNV、 TPNNV、 BFNNV、 FEV、 DGNNV、 GGNNV、 G9410YA、 G9508KS或HG00GD。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備疫苗的方法，其特征在于所述的去活化藥 劑是曱醛水溶液或2-溴乙胺(binary ethyleneimine)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備疫苗的方法，其特征在于所述的納米化去 活化疫苗的病毒濃度在105 TCID50/ml以上。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備疫苗的方法，其特征在于所述的納米化去 活化疫苗為浸泡式疫苗，以浸泡的方式進(jìn)行免疫。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備疫苗的方法，其特征在于所述的浸泡的時(shí) 間為30至60分鐘之間。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備疫苗的方法，其特征在于所述的納米去活 化疫苗用于免疫水生動物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備疫苗的方法，其特征在于所述的水生動 物是魚類或、蝦類或蟹類。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備疫苗的方法，其特征在于所述的魚類是金目多盧(barramundi, Lates Calcarifer)、 海多盧(sea bass, Dicentrarchus labrax)、 鲆魚 (turbot, Scophthalmus maximus)、紅點(diǎn)石斑(red-spotted grouper, Epinephelus akaara) 條纟丈鯪(striped jack, Pseudocaranx dentex)、 大西洋比目魚(Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus)、 虎河魚屯(tiger puffer, Takifugu rubripes)、 日本鰈魚 (Japanese flounder, Opegnathus fasciatus Temminck and Schlegel)、條斑星鰈(barfin flounder, Versaper moseri)、 紅甘鰺(purplish amberjack, Seriola dumerili)、 七帶石 斑(sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus)或曰本真多盧(Japanese sea bass, Lateolabrax j aponicus)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備疫苗的方法，其特征在于所述的魚類的 魚齡小于或等于1個(gè)月。
15. —種疫苗，其是由權(quán)利要求1所述的方法制備得到，其特征在于所述 的疫苗的顆粒大小在20至500 nm之間。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗，其特征在于所述的制備疫苗用的病毒 來自罹患神經(jīng)壞死癥魚體分離出來的NNV分離^f朱。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗，其特征在于所述的NNV分離抹是 RGNNV、 SJNNV、 TPNNV、 BFNNV、 FEV、 DGNNV、 GGNNV、 G9410YA、 G950汰S或HG00GD。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗，其特征在于所述的疫苗的病毒濃度在 105 TCID50/ml以上。
19. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗，其特征在于所述的疫苗為浸泡式疫苗， 以浸泡的方式進(jìn)行免疫。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的疫苗，其特征在于所述的浸泡的時(shí)間在30-60分鐘之間。
21. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗，其特征在于所述的疫苗用于免疫水生動物。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的疫苗，其特征在于所述的水生動物是魚類、 蝦類或蟹類。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，其特征在于所述的魚類是金目鱸 (barramundi, Lates Calcarifer)、 海逢盧(sea bass， Dicentrarchus labrax)、 鲆魚(turbot， Scophthalmus maximus)、 紅點(diǎn)石斑(red-spotted grouper, Epinephelus akaara)條纟丈 鯪(striped jack, Pseudocaranx dentex)、 大西洋比目魚(Atlantic halibut,Hippoglossus hippoglossus)、 虎河魚屯(tiger puffer, Takifugu rubripes)、 日本鰈魚 (Japanese flounder, Opegnathus fasciatus Temminck and Schlegel)、條斑星鰈(barfin flounder, Versaper moseri)、 紅甘錢(purplish amberjack, Seriola dumerili)、 七帶石 斑(sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus)或曰本真纟盧(Japanese sea bass, Lateolabrax japonicus)等。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，其特征在于所述的魚類的魚齡小于或 等于1個(gè)月。
全文摘要
本發(fā)明是提供一種疫苗及其制造方法。此方法包括(a)利用細(xì)胞株培養(yǎng)病毒，以獲得含有病毒的上清液，(b)將病毒去活化，以形成去活化疫苗，(c)將去活化疫苗進(jìn)行納米化處理。本發(fā)明的納米包埋的去活化疫苗的顆粒大小在20至500nm之間，病毒濃度在10⁵TCID50/ml以上，且其用于水生動物的相對存活率(Relative percentage survival，RPS)在60％以上。
文檔編號A61K39/12GK101461941SQ20071030222
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者齊肖琪 申請人:施懷哲股份有限公司