專利名稱：淫羊藿苷在制備治療老年癡呆的藥物中的應(yīng)用及產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及淫羊藿苷在制備治療老年癡呆的藥物中的應(yīng)用及產(chǎn)品，屬于中藥制藥的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
老年癡呆又名阿茲海默氏癥。目前我國已進(jìn)入了老齡化社會(huì)，每年新增600萬老年人口。隨著老年人口的數(shù)量和比例的不斷提高，老年癡呆的發(fā)病率也在逐年增高。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，65歲以上人群中患重度老年癡呆的比率達(dá)5％以上，而到80歲，此比率就上升到15～20％。而老年癡呆病人的平均生存期為5.5年，使該病成為現(xiàn)代社會(huì)老年人的主要致死疾病之一。隨著人類壽命的延長和社會(huì)老齡化問題的日益突出，老年癡呆患者的數(shù)量和比例還將持續(xù)增加。由于老年癡呆的病因及發(fā)病機(jī)制仍不明確，尚無有效的治療方法，目前國內(nèi)外的治療手段仍以藥物為主，但由于缺乏有針對性的治療藥物，故相應(yīng)的治療效果并不理想，因此，進(jìn)一步尋找治療老年癡呆的有效藥物仍然是當(dāng)今藥理學(xué)工作者的努力方向。
老年性癡呆的臨床用藥多為緩頰癥狀，且療效不夠滿意。研制更為有效的藥物，尤其是從中草藥中發(fā)掘有效成分，提供一種原料及制備簡單、療效好、副作用小且成本低廉的治療老年癡呆的藥物顯得非常必要。申請?zhí)枮?00510094412.7的發(fā)明專利申請公開了一種預(yù)防和治療老年癡呆癥的藥物及其制劑，該藥物是以淫羊藿總黃酮為主要成分制成的，對老年癡呆癥的預(yù)防和治療有一定效果，但效果不夠理想。淫羊藿總黃酮是從小蘗科淫羊藿屬植物莖葉中提取的淫羊藿苷和淫羊藿次苷等多種黃酮類成分的總稱，經(jīng)過大量的試驗(yàn)研究得知，其中對老年癡呆癥發(fā)揮作用的成分主要為淫羊藿苷。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供淫羊藿苷在制備治療老年癡呆的藥物中的應(yīng)用及產(chǎn)品。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，研制出了淫羊藿苷的單方制劑，其原料及制備工藝簡單，成本低廉，為老年癡呆癥的治療提供了一種療效可靠的藥物。
本發(fā)明是這樣構(gòu)成的淫羊藿苷在制備治療老年癡呆的藥物中的應(yīng)用。
所述的淫羊藿苷是從小檗科淫羊藿屬植物中提取的黃酮醇苷類化合物。
所述淫羊藿苷的提取方法為干燥淫羊藿全株經(jīng)粉粹、過篩后，用75％工業(yè)乙醇回流提取，回收溶劑，用氯仿萃取，母液再用正丁醇萃取，回收溶劑得浸膏，浸膏經(jīng)硅膠柱層析，再經(jīng)重結(jié)晶，即得單體化合物淫羊藿苷。
更具體的說，淫羊藿苷的提取方法為干燥淫羊藿全株經(jīng)粉粹后，過60～80目篩，用75％工業(yè)乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，過濾，合并提取液，回收溶液至無醇味；加入適量水，用等體積氯仿萃取3次，母液再用等體積正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液并回收得到浸膏；浸膏經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇＝5∶1為洗脫劑進(jìn)行分離，再經(jīng)重結(jié)晶，即得單體化合物淫羊藿苷。
一種治療治療老年癡呆的藥物制劑，是以淫羊藿苷為原料，加入適量輔料制成的。
所述的藥物制劑為口服制劑、注射制劑或舌下含服制劑。
具體的說，所述的藥物制劑為片劑、膠囊劑、顆粒劑、軟膠囊、滴丸劑、糖漿劑、注射劑或舌下含片。
所述片劑的制備方法為取淫羊藿苷10～400毫克、硬脂酸鎂0.1～0.40毫克、羧甲基淀粉鈉4～12毫克、微晶纖維素50～100毫克，將淫羊藿苷與羧甲基淀粉鈉、微晶纖維素混合，過篩，使其混勻，加入適量水或乙醇制粒，干燥后，整粒，加入硬脂酸鎂，然后用沖壓裝置將顆粒壓制成片，即得；膠囊劑的制備方法為取淫羊藿苷50～400毫克、硬脂酸鎂0.1～0.30毫克、羧甲基淀粉鈉4～12毫克、淀粉50～100毫克，將淫羊藿苷與羧甲基淀粉鈉、淀粉混合均勻，加入適量乙醇制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸鎂，然后裝入明膠膠囊中，即得；顆粒劑的制備方法為取淫羊藿苷1～10克、糊精或蔗糖1～10克、矯味劑和甜味劑適量，將淫羊藿苷與蔗糖/糊精、矯味劑和甜味劑混合均勻，加入適量水或乙醇制成軟材，過篩制粒，干燥，整粒，分裝，即得；軟膠囊的制備方法為取淫羊藿苷10～400毫克、聚乙醇或豆油100～400毫克、助懸劑3～10毫克、乳化劑3～10毫克和明膠50～100毫克、甘油10～30毫克、純化水50～100毫克及防腐劑適量，將明膠置于溶膠罐中，加入純化水，70℃下加熱使溶解，加入甘油和防腐劑，攪拌均勻，真空除去氣泡后保溫靜置，按比例將淫羊藿苷與聚乙醇/豆油、乳化劑、助懸劑混合均勻，再和制備好的明膠置旋轉(zhuǎn)壓囊機(jī)，壓制成軟膠囊，定型，干燥，即得；滴丸的制備方法為取淫羊藿苷1～10毫克、基質(zhì)(如聚乙二醇4000)20～40毫克、甲基硅油適量，將淫羊藿苷加水制成均勻糊狀，再加入溶融的基質(zhì)液，加熱熔融成澄清液體，倒入已預(yù)熱的滴丸器中，控制滴制溫度和速度，滴入甲基硅油冷凝液中，成丸后吸干冷凝液，收集滴丸，置干燥器內(nèi)，即得；糖漿劑的制備方法為取淫羊藿苷1～20克、羧甲基纖維素納1.5克、糖精鈉0.1克、矯味劑適量、防腐劑適量和純化水100毫升，將羧甲基纖維素納分散在熱水中，冷卻，然后與含有淫羊藿苷、糖精鈉、矯味劑和防腐劑的含水混懸液混合，將溶液調(diào)配成所需體積并混合均勻，滅菌后分裝，即得；注射劑的制備方法為取淫羊藿苷1～50毫克、注射用0.9％氯化鈉溶液5～10毫升，將淫羊藿苷溶解于注射用0.9％氯化鈉溶液中，并將溶液調(diào)至所需體積，調(diào)PH值，灌裝后在高溫下加熱滅菌，即得；舌下含片的制備方法為取淫羊藿苷10～400毫克、可壓蔗糖40～80毫克、硬脂酸鎂0.1～0.3毫克，將淫羊藿苷過篩后與可壓蔗糖、硬脂酸鎂混合均勻，并用沖壓裝置壓片，即得。
以往研究表明淫羊藿苷具有增加腦血流量、改善冠脈循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫、影響內(nèi)分泌和抗衰老等作用。本申請人通過對淫羊藿藥材的化學(xué)成分、藥理作用、作用機(jī)制等方面進(jìn)行深入細(xì)致的研究，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷對血管性癡呆模型和腦缺血再灌損傷神經(jīng)元有良好的保護(hù)作用，可明顯改善三種癡呆大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶成績。
為了驗(yàn)證淫羊藿苷對老年癡呆癥的治療效果，申請人主要進(jìn)行了以下方面的研究 1.采用大鼠神經(jīng)元進(jìn)行原代培養(yǎng)，利用缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖損傷模型模擬腦缺血再灌作用模型觀察其保護(hù)作用； 2.采用Fe2+/維生素C(Fe2+/VitC)氧自由基生成系統(tǒng)建立氧自由基損傷線粒體外模型； 3.雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎慢性腦損傷大鼠模型的影響； 4.小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉合并取血降壓腦缺血再灌損傷模型； 5.大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎再灌大鼠病理模型； 6.對鋁鹽誘導(dǎo)大鼠癡呆模型影響； 7.迷宮法觀察藥物對正常與癡呆大鼠和小鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能影響；跳臺法、暗回避、自發(fā)活動(dòng)方法觀察小鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能影響； 8.腦組織病理學(xué)、電子顯微鏡、免疫組化法、RT-PCR等方法觀察淫羊藿苷對上神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用及并探討其作用機(jī)制。
具體的試驗(yàn)研究過程及結(jié)果如下 (一)淫羊藿苷對原代培養(yǎng)神經(jīng)元缺血再灌損傷保護(hù)作用 1.實(shí)驗(yàn)方法和觀察指標(biāo) 1.1原代神經(jīng)元培養(yǎng) 出生2天以內(nèi)的新生Wistar大鼠乳鼠，用75％的酒精浸泡消毒3～5分鐘后，無菌條件下斷頭取腦。在預(yù)冷的D-Hank’s液中解剖分離大腦皮層。去除腦膜和血管，D-Hank’s液洗2-3次，剪成1mm3左右的小塊。加入0.25％胰蛋白酶37℃消化30min。取出吹打，并用含小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止反應(yīng)。200目篩網(wǎng)過濾，1000r.min-1離心10min。棄上清液，再用含20％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基洗一次。調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度為1×109/L，接種于經(jīng)0.01％多聚賴氨酸浸泡過夜的孔板或培養(yǎng)瓶中，37℃恒溫CO2孵箱內(nèi)(5％CO2，濕度85-98％)培養(yǎng)。接種第4天全量換液，并加入終濃度為5μg/mL的阿糖胞苷作用24h，抑制膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。按瓶內(nèi)培養(yǎng)基指示劑顏色變化，2-3天換液一次。細(xì)胞培養(yǎng)至第10天，經(jīng)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定，神經(jīng)元占全部細(xì)胞的95％以上，僅少數(shù)細(xì)胞是星型細(xì)胞和其他膠質(zhì)細(xì)胞。
1.2實(shí)驗(yàn)分組和處理 實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為三組A組為對照組，B組為損傷模型組，C組為淫羊藿苷組(終濃度分別為0.25mg/L，0.5mg/L和1mg/L)。每組所用96孔板的孔數(shù)n＝4-6。
細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型的建立以缺氧室來誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。取培養(yǎng)8-9d的神經(jīng)細(xì)胞，去除原培養(yǎng)液后，對照組用含糖Earle’s液洗兩次，再加入含糖Earl’s液置于37℃5％CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。模型組用無糖Earle’s液洗兩次，加入無糖Earle’s液后，置于37℃95％N2和5％CO2的密閉缺氧室中孵育。分別處理不同時(shí)間后換為無血清培養(yǎng)基37℃5％CO2孵箱中(復(fù)氧復(fù)糖)繼續(xù)正常培養(yǎng)。淫羊藿苷藥物組在缺氧缺糖和復(fù)氧復(fù)糖的同時(shí)加入不同濃度的藥物，其余處理同模型組。分別在缺氧狀態(tài)下孵育4、6、8h、復(fù)氧復(fù)糖后繼續(xù)培養(yǎng)3、12、24h后檢測各指標(biāo)。
缺氧室的制備采用密閉性好的家用微波爐保鮮盒(聚乙烯，體積1L)、醫(yī)用三通管、輸液器和裝有無菌生理鹽水的輸液瓶制備了簡易、方便、實(shí)用的缺氧小容器。按實(shí)驗(yàn)的不同要求，將細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞培養(yǎng)瓶更換為無糖型Earle’s液后，放入自制缺氧容器中，缺氧容器底部加入少許無菌三蒸水起濕化作用。將缺氧容器密閉并置于37℃培養(yǎng)箱中，打開進(jìn)氣、出氣三通管閥門，先以2L/h速度注入含有95％N2和5％CO2的混合氣體10min，然后以1L/h的速度持續(xù)緩慢通入混合氣體。
1.3MTT檢測 用四唑鹽(噻唑藍(lán)，MTT)，即溴化-3(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑[3-(4，5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2，5-dipenylterazolium bromide]檢測培養(yǎng)的細(xì)胞生存率。MTT可被活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原，形成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶，測定吸光度大小可間接反映細(xì)胞的數(shù)量及活性。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板去除原培養(yǎng)液后，每孔加入180mL培養(yǎng)基和20μL MTT(終濃度為0.5mg/mL)，37℃95％空氣+5％CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸去上清液，D-Hank’s液洗一次。加入二甲基亞砜100μL，37℃水浴搖床10min，使結(jié)晶充分溶解。待結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度值(Absorbance，A)。
1.4LDH檢測 乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)在氧化型輔酶I存在時(shí)能催化乳酸生成丙酮酸，后者與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色，在波長440nm下通過比色測定丙酮酸二硝基苯腙的含量，從而推算LDH的活性。每克組織蛋白37℃與基質(zhì)作用15分鐘，在反應(yīng)體系中產(chǎn)生1μmol丙酮酸為1個(gè)活性單位。其計(jì)算公式為 LDH活力(U/mgprot)＝(測定管OD值-測定空白管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-標(biāo)準(zhǔn)空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(2μmol/ml)÷蛋白濃度(mgprot/ml) 分別收集細(xì)胞裂解前后的培養(yǎng)基上清液，LDH活性參照LDH試劑盒說明書測定。LDH釋放百分率定義為培養(yǎng)細(xì)胞釋放的LDH活性與總LDH活性之比。通過測定釋放到培養(yǎng)基中LDH的量來判斷細(xì)胞損傷狀況。
1.5病理形態(tài)學(xué)觀察 從6孔板中取出長有神經(jīng)細(xì)胞的載玻片，用預(yù)冷的PBS沖洗，然后用4％的多聚甲醛固定30分鐘，再用PBS沖洗3次，進(jìn)行常規(guī)HE染色，透明封片。光鏡下觀察神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)變化 1.6凋亡檢測 參照試劑盒說明操作，主要過程包括取細(xì)胞懸液，充分清洗后，加入AnnexinV/FITC混勻，室溫避光孵育10min，離心去上清。用結(jié)合緩沖液清洗、重懸細(xì)胞，加入碘化丙啶(終濃度1μg/mL)混勻。上流式細(xì)胞儀檢測2*104個(gè)細(xì)胞。經(jīng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析，打印結(jié)果。
1.7細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度檢測 制備細(xì)胞懸液，利用5μmol/L的鈣熒光指示劑Fura-2/AM負(fù)載細(xì)胞，37℃恒溫避光振搖50min，離心去上清液。用含2g/L牛血清白蛋白的Hank’S液沖洗2次以防止胞內(nèi)Fura-2/AM外排。用Hank’s液重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為106/ml。RF-5000熒光分光光度計(jì)檢測。發(fā)射波長500nm，激發(fā)和發(fā)射光柵分別為5nm、10nm。先以激發(fā)波長300-400nm連續(xù)測定熒光強(qiáng)度，如在340nm處可見熒光強(qiáng)峰則表明Fura-2/AM負(fù)載成功，然后以340nm作為激發(fā)波長觀察不同狀態(tài)下熒光強(qiáng)度的變化。計(jì)算公式為 [Ca2+]i＝Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)。其中Kd為Fura-2/AM與Ca2+結(jié)合反應(yīng)的解離常數(shù)(224nmol/L)，F(xiàn)為在某因素影響下測得的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)max是加入Triton X-100(終濃度為0.98g/L)測得的最大熒光值，F(xiàn)min為加入EGTA(終濃度為5mmol/L)后測得的最小熒光值。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

表示，組間比較用方差分析ANAVO和t檢驗(yàn)。P＜0.05和P＜0.01有顯著性差異。
2.結(jié)果 2.1原代培養(yǎng)神經(jīng)元的鑒定 成熟的神經(jīng)元可以由其分泌的特殊物質(zhì)做鑒定。本實(shí)驗(yàn)中采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析。
2.2MTT檢測結(jié)果 正常培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞加入淫羊藿苷(0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L)分別培養(yǎng)6h、9h、18h、30h時(shí)各組MTT吸光度值沒有顯著性差異。說明淫羊藿苷對正常培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞沒有明顯影響。
與對照組相比，缺氧缺糖4、6、8h的模型組A值均明顯降低，有顯著性差異(P＜0.01)，顯示缺氧缺糖后神經(jīng)細(xì)胞生長能力下降。淫羊藿苷處理組A值均有所上升，顯示有不同程度的保護(hù)作用。與模型組相比，缺氧缺糖4h時(shí)0.25mg/L、0.5mg/L淫羊藿苷組A值上升無顯著性差異，僅1mg/L淫羊藿苷組有顯著性差異(P＜0.05)。缺氧缺糖6h時(shí)0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L淫羊藿苷組A值均明顯高于模型組，具有顯著性差異(P＜0.01)。缺氧缺糖8h，0.25mg/L淫羊藿苷組與模型組A值無顯著性差異；0.5mg/L、1mg/L淫羊藿苷組與模型組A值相比，有顯著性差異(分別為P＜0.05、P＜0.01)。
缺氧缺糖(6h)/復(fù)氧復(fù)糖(3、12、24h)模型組A值均明顯降低，與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.01)，提示神經(jīng)細(xì)胞損傷較嚴(yán)重。與模型組相比，缺氧缺糖(6h)/復(fù)氧復(fù)糖(3h、12h)時(shí)各淫羊藿苷組A值均明顯高于模型組(P＜0.05或0.01)。缺氧缺糖(6h)/復(fù)氧復(fù)糖(24h)，0.25mg/L淫羊藿苷組與模型組A值無顯著性差異；0.5mg/L、1mg/L淫羊藿苷組與模型組相比，A值有顯著性差異(分別為P＜0.05、0.01)。顯示淫羊藿苷對缺氧缺糖(6h)/復(fù)氧復(fù)糖致神經(jīng)元損傷有不同程度的濃度依賴性保護(hù)作用。
2.3LDH檢測結(jié)果 缺氧缺糖4h、6h、8h模型組LDH漏出率均比正常組明顯上升(P＜0.05或0.01)，顯示細(xì)胞損傷程度逐漸加大。與模型組相比，缺氧缺糖4h時(shí)各組LDH漏出率下降無顯著性差異。缺氧缺糖6h時(shí)0.25mg/L、0.5mg/L淫羊藿苷組LDH漏出率下降與模型組無顯著性差異，僅1mg/L淫羊藿苷組有顯著性差異(P＜0.05)。缺氧缺糖8h，各淫羊藿苷組LDH漏出率均明顯下降，與模型組相比均有顯著性差異(P＜0.05或0.01)。
缺氧缺糖(6h)/復(fù)氧復(fù)糖(3h、12h、24h)各模型組LDH漏出率均比對照組明顯上升(P＜0.01)，提示細(xì)胞損傷程度隨復(fù)氧復(fù)糖時(shí)間延長而逐漸加大。缺氧缺糖(6h)/復(fù)氧復(fù)糖(3、12h)時(shí)各淫羊藿苷組LDH漏出率均明顯低于模型組(P＜0.05或0.01)，且呈濃度依賴性，進(jìn)一步提示淫羊藿苷對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖致神經(jīng)元損傷有明顯保護(hù)作用。缺氧缺糖(6h)/復(fù)氧復(fù)糖(24h)，0.25mg/L淫羊藿苷組LDH漏出率有所下降，但與模型組比較無顯著性差異，僅0.5mg/L、1mg/L淫羊藿苷組LDH漏出率下降有顯著性差異(P＜0.01)。
2.4病理形態(tài)學(xué)變化 倒置相差顯微鏡下觀察可見正常情況下接種24h后，大部分細(xì)胞貼壁良好，有的細(xì)胞伸出粗細(xì)不等的突起。隨后，胞體逐漸增大，突起伸長變粗，光暈明顯且不斷擴(kuò)大。正常培養(yǎng)至8-10d時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞胞體較大，形態(tài)多樣，呈圓形、星形或錐體形等。細(xì)胞核大而透亮，可見較為明顯的核仁。細(xì)胞貼壁較好。細(xì)胞輪廓明顯，胞體有明顯的折光性，立體感強(qiáng)。神經(jīng)突起相互交聯(lián)呈網(wǎng)絡(luò)狀。而缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖損傷后模型組細(xì)胞失去折光性，胞體輪廓模糊；突起減少或回縮、斷裂；有的胞體內(nèi)可見顆粒和空泡；細(xì)胞數(shù)量減少；部分縮小變圓的細(xì)胞和死亡崩解的細(xì)胞從板壁脫離，懸浮于培養(yǎng)液中。HE檢測發(fā)現(xiàn)模型組細(xì)胞還有核固縮、濃染等現(xiàn)象。說明缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖對神經(jīng)細(xì)胞造成了較嚴(yán)重的損傷。淫羊藿苷組對細(xì)胞形態(tài)具有一定的保護(hù)作用，細(xì)胞損傷程度有所降低，細(xì)胞形態(tài)基本正常。
2.5淫羊藿苷對缺氧缺糖(6h)/復(fù)氧復(fù)糖(12h)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 與對照組比較，缺氧缺糖(6h)/復(fù)氧復(fù)糖(12h)模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.01)。淫羊藿苷0.25mg/L、0.5mg/L和1mg/L各濃度組均可降低細(xì)胞凋亡率，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05或0.01)。
2.6淫羊藿苷對缺氧缺糖(6h)/復(fù)氧復(fù)糖(12h)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度 缺氧缺糖(6h)/復(fù)氧復(fù)糖(12h)模型組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度比對照組顯著升高(P＜0.01)。淫羊藿苷0.25mg/L、0.5mg/L和1mg/L各濃度組均可降低細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，均明顯低于模型組(P＜0.01)。
本實(shí)驗(yàn)研究了淫羊藿苷對模擬腦缺血再灌損傷神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響。結(jié)果表明淫羊藿苷可減輕神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+負(fù)荷，提示淫羊藿苷對腦缺血再灌損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制可能與其抑制細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高有關(guān)。
以上結(jié)果說明淫羊藿苷對腦缺血性疾病有一定的防治作用。
(二)淫羊藿苷對大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎致慢性腦損傷大鼠模型的影響 1實(shí)驗(yàn)方法 1.1模型制作 雄性大鼠，體重200-240克，購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物中心，清潔級(合格證號2003003)。先對所有大鼠進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，篩選出達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)的大鼠(學(xué)習(xí)記憶正常鼠)120只，隨機(jī)抽取其中12只作為對照組，其余108只為實(shí)驗(yàn)組。大鼠自由飲食，飼以普通飼料并飲用自來水。
1.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥 按2-VO方法結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，其方法是35％水合氯醛(1ml.kg-1體重)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，頸正中去毛，碘酒酒精消毒，行頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并將其永久性結(jié)扎，縫合切口。對照組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其余處理與實(shí)驗(yàn)組相同。術(shù)后1月進(jìn)行Morris水迷宮檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)顯著性差別時(shí)，將實(shí)驗(yàn)組大鼠分為4組，分別為模型組(n＝12)、ICA低劑量組(30mg.kg-1)(n＝12)、ICA中劑量組(60mg.kg-1)(n＝12)、高劑量組(120mg.kg-1)(n＝12)。連續(xù)灌胃給藥三個(gè)月。每給藥滿一個(gè)月時(shí)，進(jìn)行一次行為學(xué)檢測。
1.3標(biāo)本制備 未次灌胃給藥結(jié)束后，取大鼠6只，經(jīng)35％水合氯醛(1ml.kg-1)麻醉。每只大鼠各眼球采血2ml，于試管中4℃靜置過夜，次日取上清液備用。透心灌注及取腦放入4％的福爾馬林溶液4℃過夜。次日取出大腦標(biāo)本置于20％蔗糖防腐液中4℃保存，待標(biāo)本沉底后切片。每個(gè)腦組織標(biāo)本正中矢狀切分，一側(cè)大腦用于冰凍切片，用于檢測AChE、ChAT的表達(dá)。另一側(cè)用于石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察皮層及海馬細(xì)胞形態(tài)變化。
取大鼠6只，眼球采血后立即斷頭剝?nèi)∧X組織，在冰盤上取出大腦皮層和海馬，電子天平稱重，按1∶10(每克組織中加10ml冷生理鹽水)加生理鹽水，用超聲粉碎機(jī)制成10％組織勻漿(6秒/次，間隔10秒，共20次，勻漿過程始終處于冰水中)，組織勻漿分成數(shù)份，-80℃冰箱保存。光化學(xué)法測定血清中AChE測定；檢測腦組織勻漿中AChE、SOD、MD含量。
2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.2.1形為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 迷宮實(shí)驗(yàn)表明，2-VO手術(shù)一月后，VD(血管性癡呆)模型組與假手術(shù)組比較，前者在定位航行實(shí)驗(yàn)中大鼠的逃避潛伏期及搜索距離明顯延長，空間探索實(shí)驗(yàn)中在原安全島所在象限的搜索時(shí)間明顯減少，原安全島所在象限的游泳距離占總距離的百分比明顯降低，提示VD模型組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能出現(xiàn)障礙。ICA灌胃3個(gè)月后，ICA30mg.kg-1組、ICA60mg.kg-1組和ICA120mg.kg-1組與VD模型組相比較，前者在定位航行中均可縮短大鼠的逃避潛伏期及搜索距離，在空間探索實(shí)驗(yàn)中在原安全島所在象限的搜索時(shí)間明顯延長，原安全島所在象限的游泳距離占總距離的百分比明顯增大，且高劑量組優(yōu)于低劑量組，提示ICA對2-VO法建立的VD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙的改善有作用。
2.2.2ICA對大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 光鏡下觀察，假手術(shù)組皮層細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常，海馬錐體細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核圓而大，核仁清晰。模型組海馬錐體細(xì)胞層次減少，排列見稀疏，細(xì)胞核體積變小，深染，結(jié)構(gòu)不清，有核固縮現(xiàn)象。給ICA三個(gè)月組，海馬錐體細(xì)胞排列較整齊，結(jié)構(gòu)清晰，無核固縮現(xiàn)象。
2.2.3ICA對大鼠海馬內(nèi)AChE表達(dá)的影響 連續(xù)灌胃給藥3個(gè)月后透心灌注取腦，恒冷冰凍切片后經(jīng)免疫組化法檢測大鼠海馬內(nèi)AChE的表達(dá)。假手術(shù)組及VD模型組切片中染色較淺，提示AChE表達(dá)量低，ICA組病理切片中海馬神經(jīng)元可見明顯的胞膜及胞漿黃染，提示AChE在給藥組表達(dá)增強(qiáng)。經(jīng)圖象分析測定，假手術(shù)組及VD模型組的平均光密度和平均灰度值無差異，ICA組的平均光密度(meanabsorbanee)較VD模型組增強(qiáng)，平均灰度值(mean gradation)相應(yīng)的較VD模型組降低，且呈現(xiàn)劑量依賴性(表1)。
表1ICA對大鼠海馬AChE的影響
*P＜0.05，**P＜0.01 vs.model。
2.2.4ICA對大鼠海馬內(nèi)ChAT表達(dá)的影響 連續(xù)灌胃給藥3個(gè)月后透心灌注取腦，恒冷冰凍切片后經(jīng)免疫組化法檢測大鼠海馬內(nèi)AChE的表達(dá)。假手術(shù)組切片中海馬神經(jīng)元可見明顯的胞膜及胞漿黃染，提示ChAT表達(dá)量高；VD模型組切片中染色很淺，提示ChAT表達(dá)量低；ICA組病理切片中海馬神經(jīng)元可見明顯的胞膜及胞漿黃染，提示ChAT在給藥組表達(dá)增強(qiáng)。經(jīng)圖象分析測定，假手術(shù)組的平均光密度(mean absorbance)較VD模型組高，平均灰度值(mean gradation)較VD模型組低；ICA組的平均光密度(mean absorbance)較VD模型組增強(qiáng)，平均灰度值(mean gradation)相應(yīng)的較VD模型組降低，且呈現(xiàn)劑量依賴性(表2)。
表2ICA對大鼠海馬ChAT的影響
*P＜0.05，**P＜0.01 vs.model P＜0.05，P＜0.01 vs.sham 2.2.5ICA對大鼠血清中AChE的影響 給ICA治療3月后，各組大鼠血清AChE無差異(表3)。
表3ICA對大鼠血清中AChE的影響
*P＜0.05，**P＜0.01 vs.model P＜0.05，P＜0.01 vs.sham 2.2.6對大鼠腦組織中AChE、SOD、MDA的影響 給ICA治療3個(gè)月后，各組大鼠斷頭取腦，制備腦組織勻漿，用光化學(xué)法檢測AChE的含量、SOD的活性及MDA的含量。與假手術(shù)組比較，VD模型組大鼠腦內(nèi)SOD活性降低，MDA含量增高，AChE含量無明顯變化；與VD模型組比較，ICA組大鼠腦內(nèi)SOD活性增高，MDA含量降低，AChE含量增加(表4)。
表4ICA對大鼠腦組織中AChE、SOD、MDA的影響
*P＜0.05，**P＜0.01 vs.model P＜0.05，P＜0.01 vs.sham 結(jié)論 1.淫羊藿苷對由2-VO法及I10-R10-I10法建立的VD模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙具有改善作用。
2.淫羊藿苷可以增加VD模型大鼠海馬內(nèi)AChE及ChAT的合成及表達(dá)。
3.淫羊藿苷可以提高VD模型大鼠皮層及海馬內(nèi)SOD活性，降低MDA活性，增加AChE的含量 4.淫羊藿苷可以減輕VD模型大鼠海馬神經(jīng)元的損傷，抑制神經(jīng)元凋亡。
(三)淫羊藿苷改善Aβ25-35所致AD(阿爾茨海默病)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的實(shí)驗(yàn)研究 1.實(shí)驗(yàn)方法 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選自發(fā)活動(dòng)活躍的雄性wistar大鼠96只，月齡14～16個(gè)月，體重400～600g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物中心，清潔級動(dòng)物(合格證號2003003)。顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水，12h/12h光/暗環(huán)境；以及出生3天內(nèi)的乳鼠。
1.2實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)一淫羊藿苷對Aβ25-35海馬內(nèi)注射所致AD大鼠的影響 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理行Morris水迷宮訓(xùn)練，淘汰掉學(xué)習(xí)成績太好和太差者，訓(xùn)練至成績穩(wěn)定后將剩余的96只大鼠隨機(jī)分為6個(gè)組，分別是生理鹽水組(NS)，Sham組，模型組，淫羊藿苷低、中、高劑量(淫羊藿苷30mg.kg-1.d-1、淫羊藿苷60mg.kg-1.d-1、淫羊藿苷120mg.kg-1.d-1)治療組，每組16只。NS組在相應(yīng)腦區(qū)注射與Aβ25-35等容積的NS，不給予淫羊藿苷治療；Sham組不用Aβ25-35制模，也不給予淫羊藿苷治療；模型組用Aβ25-35制模但不給予淫羊藿苷治療；淫羊藿苷低、中、高劑量組在用Aβ25-35制模后再給予淫羊藿苷(30mg.kg-1.d-1、60mg.kg-1.d-1、120mg.kg-1.d-1)治療。
Aβ25-35孵育無菌生理鹽水將Aβ25-35稀釋成5μg.μl-1，37℃孵育一周，使其變?yōu)榫奂瘧B(tài)的Aβ25-35。
動(dòng)物模型的制備Aβ組、淫羊藿苷低、中、高劑量治療組大鼠經(jīng)10％水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于大鼠腦立體定位儀上，預(yù)定海馬進(jìn)針坐標(biāo)為AP-4mm(前囟后)，ML-2.8mm(中線右側(cè))，H-3mm(自腦膜起的深度)。定位后鉆開顱骨，微量注射器垂直進(jìn)針3mm，將2μl Aβ25-35緩慢注入，留針5分鐘。NS組注入等體積無菌生理鹽水，Sham組鉆開顱骨后即縫合傷口。各組動(dòng)物術(shù)后常規(guī)腹腔注射芐星青霉素抗感染。
藥物干預(yù)待動(dòng)物清醒后治療組即開始灌胃給藥。淫羊藿苷低、中、高劑量治療組每日定時(shí)(早上8時(shí))灌胃給藥一次，劑量分別為30mg.kg-1.d-1、60mg.kg-1.d-1、120mg.kg-1.d-1；Aβ組、Sham組及NS組用等體積蒸餾水代替，連續(xù)14天。
Morris水迷宮訓(xùn)練大鼠空間辨別學(xué)習(xí)記憶是檢測空間定向、反映時(shí)間、視知覺和結(jié)構(gòu)應(yīng)用等能力，從而評價(jià)其認(rèn)知水平的一種行為模式，是一類關(guān)于場景和事件的學(xué)習(xí)記憶。常用于檢測空間辨別學(xué)習(xí)記憶能力的裝置有Morris水迷宮、多向選擇迷宮、放射臂迷宮、循環(huán)平臺等。Morris水迷宮是英國心理學(xué)家GM.Morris于1981年發(fā)明并用于學(xué)習(xí)記憶的研究中，基本原理是讓動(dòng)物利用空間信息對行為做出正確的選擇。
水迷宮的組成同前。
檢測方法實(shí)驗(yàn)共5天，分為定位航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)。檢測前將大鼠置于無安全島的水池中游泳2分鐘，使其適應(yīng)水環(huán)境。檢測中將大鼠置于放置安全島的池中游泳并由BI2000圖象處理系統(tǒng)中的行為學(xué)模塊自動(dòng)記錄游泳軌跡及時(shí)間。每次實(shí)驗(yàn)安全島固定在同一位置，入水點(diǎn)可以更改。具體方法如下定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)4天，每天上下午定時(shí)各訓(xùn)練一次，檢測大鼠找到安全島的時(shí)間(逃避潛伏期)及游泳路徑長度(搜索距離)，第5天撤除安全島作空間探索實(shí)驗(yàn)，將大鼠從同一入水點(diǎn)放入水中，記錄120秒內(nèi)大鼠在原安全島所在象限的搜索時(shí)間及原安全島所在象限游泳距離占總距離百分比。
制備腦組織切片 制備腦組織石蠟切片 1)麻醉水迷宮檢測結(jié)束后，每組大鼠各取4只，經(jīng)10％水合氯醛(3.5-4ml.kg-1)腹腔注射麻醉。
2)固定標(biāo)本斷頭剝?nèi)∧X組織，放入4℃的4％福爾馬林液中，放置8小時(shí)后放入70％乙醇溶液5分鐘，取出后分別放入80％、90％、95％及無水乙醇中各4小時(shí)，最后放入二甲苯中浸泡30分鐘。
3)切片制備取視交叉至乳頭體組織，常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片，厚度6μm，每隔2張取1張，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察皮層及海馬細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)變化；剛果紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察有無淀粉樣沉淀。
制備腦組織冰凍切片 1)麻醉水迷宮檢測結(jié)束后，每組大鼠各取6只，經(jīng)10％水合氯醛(3.5-4ml.kg-1)腹腔注射麻醉。
2)透心灌注及取腦將麻醉的大鼠仰臥固定，剪開胸骨及兩側(cè)肋骨，以充分暴露胸腔和心臟。用連于恒流泵的16號針頭經(jīng)心尖部插入升主動(dòng)脈，剪開右心耳，夾閉腹主動(dòng)脈后順行灌流預(yù)冷的4℃ 0.1M PBS液，速度為10～15ml.min-1，待動(dòng)物右心耳流出液清澈后改灌4％的4℃福爾馬林液，動(dòng)物尸體僵硬后，小心取出腦組織放入4％的福爾馬林溶液4℃過夜。次日取出大腦標(biāo)本置于20％蔗糖防腐液(加入0.1％NaN3)中4℃保存，待標(biāo)本沉底后切片。
3)制備切片恒冷切片機(jī)在各標(biāo)本相應(yīng)點(diǎn)連續(xù)冠狀切片，片厚30μm，置于盛20％蔗糖防腐液(加入0.1％NaN3)小瓶中，用于檢測AchE和ChAT的表達(dá)及Aβ1-40的含量。
制備腦組織勻漿 水迷宮檢測結(jié)束后，每組大鼠各取6只，經(jīng)10％水合氯醛(3.5-4ml.kg-1)腹腔注射麻醉。斷頭剝?nèi)∧X組織，在冰盤上取出大腦皮質(zhì)和海馬，電子天平稱重，按1∶10(每克組織中加10ml冷生理鹽水)加生理鹽水，用超聲粉碎機(jī)制成10％組織勻漿(6秒/次，間隔10秒，共20次，勻漿過程始終處于冰水中)，組織勻漿分成數(shù)份，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 免疫組化檢測AchE和ChAT的表達(dá)及Aβ1-40的含量采用漂染法結(jié)合SABC法染色，步驟如下 1)從小瓶中取出組織切片于平皿中，0.1M PBS清洗3次； 2)轉(zhuǎn)移組織切片于含0.6％H2O2的0.5％甲醇溶液(蒸餾水配制)中放置30min； 3)0.1M PBS清洗3次，每次5min； 4)加入稀釋后的一抗(兔抗鼠)，4℃冰箱過夜； 5)次日37℃水浴振蕩孵育2.5h； 6)0.1M PBS清洗4次，每次10min； 7)加入Envision后，37℃水浴振蕩孵育1h； 8)0.1M PBS清洗3次，每次5min； 9)DAB顯色5-10min； 10)0.1M PBS清洗3次，每次5min； 11)轉(zhuǎn)移組織切片至載玻片(載玻片需事先用多聚賴氨酸處理)； 12)梯度酒精脫水(75％、95％、100％)，二甲苯透明，每步各2min； 13)中性樹膠封片； 14)顯微鏡下觀察。
圖象分析及處理采用成都泰盟公司的BI2000圖象處理系統(tǒng)中的免疫組化分析模塊進(jìn)行AchE和ChA T表達(dá)及Aβ1-40含量的半定量檢測。
腦組織勻漿中AchE、NOS、SOD及GSH-PX的活性測定 具體操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)二淫羊藿苷對Aβ25-35的神經(jīng)毒性的影響 試劑配制 培養(yǎng)基含10％小牛血清的完全培養(yǎng)基90ml的DMEM-F12溶液+10ml小牛血清+104U的青霉素+104U的鏈霉素。
緩沖液PBS的配制NaCl 8.00g，KCl 0.20g，Na2HPO4·12H2O 3.48g，KH2PO4 0.20g，加三蒸水至1000ml。8磅消毒15分鐘。
D-Hank’s NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na2HPO4·12H2O 0.134g，KH2PO4 0.06g，NaHCO30.35g，加三蒸水至1000ml。8磅消毒15分鐘。
藥物的配制 不同濃度的Aβ25-35用無菌生理鹽水將Aβ25-35稀釋成5μg.μl-1，37℃孵育一周，使其變?yōu)榫奂瘧B(tài)的Aβ25-35，用培養(yǎng)基稀釋成400μmol.l-1。
不同濃度的淫羊藿苷用無水乙醇將淫羊藿苷溶解稀釋為1g.l-1，用培養(yǎng)基將其稀釋為0.01～100mg.l-1。
溶媒對照用培養(yǎng)基將無水乙醇濃度稀釋為10％。
其它液體5mg.ml-1的噻唑蘭稱取臺盼藍(lán)100mg，加生理鹽水配至20ml，過濾除菌；0.125％胰蛋白酶稱取125mg胰蛋白酶，加D-Hank’s至100ml，過濾除菌。
神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)將新生大鼠放入酒精中消毒，然后放入超凈工作臺平皿內(nèi)，剪下頭，剝離頭皮及顱骨，分離大腦皮層，剝離血管，剪碎腦組織，并在37℃下用0.125％胰蛋白酶消化20分鐘，然后用含20％小牛血清的培養(yǎng)基終止消化，取出吹打均勻后，200目尼龍網(wǎng)過濾，離心(1000轉(zhuǎn).分-1，5分鐘)，吸去上清液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè).ml-1，接種于預(yù)先用多聚賴氨酸處理的96孔培養(yǎng)板，每孔200μl。接種后72小時(shí)全量換液，第5天加入10μg.ml-1阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的增殖，以后每周半量換液3次，于接種后第10天制模。
制模接種后第10天，分別加入終濃度為5μmol.l-1、10μmol.l-1、20μmol.l-1“老化”的Aβ25-35，培養(yǎng)24小時(shí)，終止培養(yǎng)前4小時(shí)進(jìn)行MTT測定。
藥物干預(yù)選擇合適的制模濃度(10μmol.l-1 Aβ25-35)后，加入“老化”的Aβ25-35和終濃度為0.001～10mg.l-1的淫羊藿苷，溶媒對照組加入終濃度為1％的無水乙醇，空白對照組加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)，終止培養(yǎng)前4小時(shí)進(jìn)行MTT測定 MTT測定[23]Aβ25-35對神經(jīng)細(xì)胞存活、增殖的影響及淫羊藿苷的干預(yù)作用 終止培養(yǎng)前4h加入5mg.ml-1的MTT溶液20μl.孔-1。終止培養(yǎng)，小心吸出培養(yǎng)基，加入有機(jī)溶劑DMSO 20μL.孔-1，置于37℃搖床20min，使所形成的結(jié)晶溶解，在酶標(biāo)儀上于492nm波長處讀取吸光度值，結(jié)果以復(fù)孔A的均值表示。
1.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

表示。組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0.05認(rèn)為有差異，P＜0.01認(rèn)為有顯著性差異。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 正常大鼠的學(xué)習(xí)成績及分組成績 在分組前對每只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，一直到成績穩(wěn)定為止(連續(xù)兩天成績無顯著性差異，表1)。成績穩(wěn)定后，隨機(jī)分為6個(gè)組，經(jīng)q檢驗(yàn)各組問成績無顯著性差異(表2，3)。
表1正常大鼠的定位航行成績(逃避潛伏期及搜索距離)
表2正常大鼠分組后的定位航行成績(逃避潛伏期及搜索距離)
表3正常大鼠分組后的空間探索成績(安全島所在象限的搜索時(shí)間及原平臺象限游泳距離占總距離百分比)
水迷宮實(shí)驗(yàn)表明，Aβ25-35海馬內(nèi)注射14天后，AD模型組與假手術(shù)組比較，前者在定位航行實(shí)驗(yàn)中大鼠的逃避潛伏期及搜索距離明顯延長(表4、5)，空間探索實(shí)驗(yàn)中在原安全島所在象限的搜索時(shí)間明顯減少(表6)，原安全島所在象限的游泳距離占總距離的百分比降低(表7)，提示AD模型組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能出現(xiàn)障礙。
淫羊藿苷灌胃14天后，淫羊藿苷各治療組與AD模型組相比較，前者在定位航行中均可縮短大鼠的逃避潛伏期及搜索距離(表4、5)，在空間探索實(shí)驗(yàn)中原安全島所在象限的搜索時(shí)間明顯延長(表6)，原安全島所在象限的游泳距離占總距離的百分比明顯增大(表7)。
表4淫羊藿苷灌胃后大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)成績(逃避潛伏期)
#P＜0.05 vs sham，*P＜0.05 vs model 表5淫羊藿苷灌胃后大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)成績(搜索距離)
#P＜0.05 vs sham，*P＜0.05 vs model 表6淫羊藿苷灌胃后大鼠空間探索成績(搜索時(shí)間)
#P＜0.05 vs sham，*P＜0.05 vs model 表7淫羊藿苷灌胃后大鼠的空間探索成績(原平臺象限游泳距離占總距離百分比) *P＜0.05 vs model 2.2淫羊藿苷對大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 光鏡下觀察，假手術(shù)組皮層細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常，海馬錐體細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰。模型組海馬錐體細(xì)胞層次減少，排列見稀疏，細(xì)胞核體積變小，深染，有核固縮現(xiàn)象，海馬及皮層膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生。給淫羊藿苷14天組，海馬錐體細(xì)胞排列較整齊，結(jié)構(gòu)清晰，無核固縮現(xiàn)象。剛果紅染色，模型組見淀粉樣沉淀，而假手術(shù)組未見淀粉樣沉淀。
2.3免疫組化檢測結(jié)果 2.3.1淫羊藿苷對大鼠海馬內(nèi)AChE表達(dá)的影響 連續(xù)灌胃給藥14天后透心灌注取腦，恒冷冰凍切片后經(jīng)免疫組化法檢測大鼠海馬內(nèi)AChE的表達(dá)。假手術(shù)組切片中海馬神經(jīng)元可見明顯的胞膜及胞漿黃染，提示AChE表達(dá)量高；AD模型組切片中染色很淺，提示AChE表達(dá)量低；淫羊藿苷組切片中海馬神經(jīng)元可見明顯的胞膜及胞漿黃染，提示AChE在給藥組表達(dá)增強(qiáng)。經(jīng)圖象分析測定，假手術(shù)組的平均光密度(mean absorbance，MA)較AD模型組高(表8)，平均灰度值(mean gradation，MG)較AD模型組低(表8)；淫羊藿苷組的MA較AD模型組增強(qiáng)(表8)，MG相應(yīng)地較AD模型組降低(表8，)，且呈劑量依賴性。
表8淫羊藿苷對大鼠海馬AChE的影響
##P＜0.01 vs sham，**P＜0.01 vs model 2.3.2淫羊藿苷對大鼠海馬內(nèi)ChAT表達(dá)的影響 連續(xù)灌胃給藥14天后透心灌注取腦，恒冷冰凍切片后經(jīng)免疫組化法檢測大鼠海馬內(nèi)ChAT的表達(dá)。假手術(shù)組切片中海馬神經(jīng)元可見明顯的胞膜及胞漿黃染，提示ChAT表達(dá)量高；AD模型組切片中染色很淺，提示ChAT表達(dá)量低；淫羊藿苷組切片中海馬神經(jīng)元可見明顯的胞膜及胞漿黃染，提示ChAT在給藥組表達(dá)增強(qiáng)。經(jīng)圖象分析測定，假手術(shù)組的MA較AD模型組高(表9)，MG較AD模型組低(表9)；淫羊藿苷組的MA較AD模型組增強(qiáng)(表9)，MG相應(yīng)的較AD模型組降低(表9)。
表9淫羊藿苷對大鼠海馬ChAT的影響
##P＜0.01 vs the sham，**P＜0.01 vs the model 2.3.3淫羊藿苷對大鼠海馬內(nèi)Aβ1-40含量的影響 連續(xù)灌胃給藥14天后透心灌注取腦，恒冷冰凍切片后經(jīng)免疫組化法檢測大鼠海馬內(nèi)Aβ1-40的含量。假手術(shù)組切片中海馬神經(jīng)元染色很淺，提示Aβ1-40含量低；AD模型組切片中可見明顯的胞膜及胞漿黃染，提示Aβ1-40含量高；淫羊藿苷組病理切片中海馬神經(jīng)元染色淺，提示Aβ1-40在給藥組含量降低。經(jīng)圖象分析測定，假手術(shù)組的MA較AD模型組低(表10)，MG較AD模型組高(表10)；淫羊藿苷組的MA較AD模型組降低(表10)，MG相應(yīng)的較AD模型組增強(qiáng)(表10)，且呈劑量依賴性。
表10淫羊藿苷對大鼠海馬Aβ1-40含量的影響
**P＜0.1 vs model，##P＜0.01 vs sham，☆☆P＜0.01 vs sham 2.4淫羊藿苷對大鼠腦組織中NOS、SOD、GSH-PX的影響 給淫羊藿苷治療14天后，與假手術(shù)組比較，AD模型組大鼠腦內(nèi)NOS活性增加(表11)，SOD(表12)及GSH-PX(表12)活性降低；與AD模型組比較，淫羊藿苷組大鼠腦內(nèi)NOS(表11)活性降低，且高劑量組較低劑量組降低明顯，SOD(表12)和GSH-PX(表12)的活性增加，且呈劑量依賴性。
表11淫羊藿苷對大鼠腦組織中NOS的影響
#P＜0.05 vs Sham，*P＜0.05 vs model 表12淫羊藿苷對大鼠腦組織中SOD和GSH-PX的影響
#P＜0.05 vs Sham，*P＜0.05 vs model，**P＜0.01 vs model 2.5Aβ25-35的神經(jīng)細(xì)胞毒性及淫羊藿苷的影響 5μmol.l-1，10μmol.l-1，20μmol.l-1的Aβ25-35與神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，10μmol.l-1，20μmol.l-1的Aβ25-35對細(xì)胞造成較明顯的損傷(表13)，二者差異不大，故選用10μmol.l-1制模。淫羊藿苷可減輕Aβ25-35的神經(jīng)毒性作用(表14)。
表13Aβ25-35的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用
#P＜0.05 vs blank 表14淫羊藿苷對Aβ25-35的神經(jīng)細(xì)胞毒的影響
##P＜0.01 vs blank，**P＜0.01 vs model，*P＜0.05 vs model 結(jié)論 淫羊藿苷對Aβ25-35海馬內(nèi)注射所致AD模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶瘴礙具有改善作用。其機(jī)制可能是(1)增加AChE和ChAT的表達(dá)，促進(jìn)膽堿能系統(tǒng)的功能恢復(fù)；(2)減少皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元的死亡；(3)降低NOS的活性，減少NO的生成；(4)清除自由基，抗脂質(zhì)過氧化；(5)減少Aβ的生成。
(四)淫羊藿苷對腦缺血再灌小鼠智力障礙模型的保護(hù)作用 1.實(shí)驗(yàn)方法和觀察指標(biāo) 1.1腦缺血再灌誘導(dǎo)的VD小鼠模型的制備 采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉合并缺血降壓再灌注法制備小鼠VD模型。實(shí)驗(yàn)鼠術(shù)前12小時(shí)禁食，自由飲水。4％水合氯醛(0.1ml/10g體重)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于鼠解剖板，頸正中剃毛，以碘酒和75％酒精做皮膚常規(guī)消毒，沿前后方向頸正中線縱向剪開頸部皮膚約0.5cm，鈍性分離組織和肌肉，暴露并分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，下穿絲線備用。注意不要損傷迷走神經(jīng)。于鎖骨上方剪一0.5cm切口，分離頸總靜脈，下穿絲線。結(jié)扎頸總靜脈遠(yuǎn)心端，近心端處打一活結(jié)。在結(jié)扎端近心側(cè)用眼科剪小心剪口，將連接于注射器針頭上的聚乙烯導(dǎo)管(導(dǎo)管預(yù)先肝素內(nèi)浸泡，導(dǎo)管外徑0.5mm，長約4cm)，沿頸總靜脈向心臟方向插入。至導(dǎo)管尖端距離小鼠上切齒約3.7cm時(shí)停止，抽血降壓，緩慢抽取小鼠理論血量的30％。然后提起頸總動(dòng)脈下絲線，用無創(chuàng)性微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈20min。記時(shí)結(jié)束，松開動(dòng)脈夾，并回輸血液，拔出導(dǎo)管，結(jié)扎頸總靜脈近心端，縫合傷口。在全部造模過程中觀察動(dòng)物體溫，保持動(dòng)物肛溫在36±0.5℃左右，以防止低溫對腦缺血損傷的保護(hù)作用。
1.2實(shí)驗(yàn)分組與處理 分組與給藥同前。術(shù)后第15天開始進(jìn)行自發(fā)活動(dòng)和被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)，第17天開始進(jìn)行空間分辨學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)檢測完畢后每組取3只小鼠，進(jìn)行在體灌流固定，制作石蠟切片，HE檢測和免疫組化染色分析。每組隨機(jī)取1只小鼠做電鏡檢測。每組5-6只小鼠迅速斷頭取大腦組織，制備10％的腦組織勻漿，離心取上清液進(jìn)行各種生化檢測。其余標(biāo)本70℃凍存?zhèn)溆谩?br> 1.3行為學(xué)測試 1.3.1小鼠自發(fā)活動(dòng)記數(shù) 采用電腦程控全自動(dòng)自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)儀進(jìn)行。有四個(gè)測試室，測試室周圍有三對光電管，通過數(shù)據(jù)傳輸線與電腦相連。由于動(dòng)物行為活動(dòng)本身有一定的晝夜節(jié)律性，因此，一般在下午6點(diǎn)至晚上12點(diǎn)進(jìn)行。在清潔干凈和安靜的環(huán)境中進(jìn)行測試。每次測試將小鼠放入暗室中，記錄3分鐘內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)。
1.3.2小鼠被動(dòng)回避學(xué)習(xí)記憶能力測試 采用WCX-2型小鼠跳臺儀。跳臺儀測試箱每孔大小為11×11×25cm，邊角有一3×3×3cm絕緣跳臺，底為間隔0.5cm能通以交流電的銅柵構(gòu)成。將小鼠放入測試箱熟悉環(huán)境3min，然后接通36V交流電，持續(xù)通電5min。小鼠為了逃避遭受電擊而躍上安全平臺，此時(shí)斷開電源；當(dāng)小鼠走下平臺時(shí)，又接通電源。如此反復(fù)間隔通電。實(shí)驗(yàn)時(shí)保持環(huán)境安靜。當(dāng)小鼠躍上安全平臺后不再跳下平臺時(shí)，我們認(rèn)為小鼠已學(xué)會(huì)逃避電擊。記錄小鼠上臺時(shí)間(即上臺潛伏期，Escape latency，EL)、受電擊時(shí)間、錯(cuò)誤次數(shù)。小鼠學(xué)會(huì)逃避電擊遭受的電擊次數(shù)，即為錯(cuò)誤次數(shù)，電擊次數(shù)越多，學(xué)習(xí)能力越差。24h后測其記憶能力跳臺箱不通電，將訓(xùn)練過的小鼠穩(wěn)穩(wěn)當(dāng)當(dāng)放于跳臺上，開始記時(shí)，觀察5分鐘。記錄小鼠下臺潛伏期、在平臺總的停留時(shí)間、錯(cuò)誤次數(shù)。記時(shí)開始至小鼠走下平臺所需的時(shí)間，即下臺潛伏期(Stepdown latency，SDL)，SDL超過300秒，則以300秒計(jì)算。SDL越長，說明小鼠記憶能力越好 1.3.3小鼠空間辨別學(xué)習(xí)記憶能力的測試 采用電腦程控SMG-2型小鼠水迷宮。該迷宮共有4個(gè)盲端和1個(gè)平臺。各處分別設(shè)置一對光電管，當(dāng)小鼠進(jìn)入盲端阻斷光線時(shí)，電腦記錄錯(cuò)誤次數(shù)1次。當(dāng)小鼠爬上平臺阻斷光線時(shí)，實(shí)驗(yàn)記數(shù)終止。從實(shí)驗(yàn)開始到小鼠達(dá)到平臺所用時(shí)間為尋臺潛伏期。訓(xùn)練開始時(shí)，將小鼠鼻孔朝箱壁放在靠近平臺的盲端，按由近及遠(yuǎn)的順序分階段進(jìn)行訓(xùn)練，讓其學(xué)會(huì)找到平臺。連續(xù)訓(xùn)練5天，分別記錄每天成績3min內(nèi)到達(dá)平臺的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)。3min內(nèi)未成功找到平臺的尋臺潛伏期以3min記算。
1.3.4在體灌流固定以及切片制備 小鼠用4％的水合氯醛i.p.麻醉，仰臥固定于蛙板上，剪開胸腔，暴露心臟，剝離心包膜，經(jīng)左心室快速滴入肝素化PBS液約50mL，然后緩慢滴入4％的多聚甲醛(0.1mol/L PBS，PH7.4，4℃)約50mL；同時(shí)剪碎肝臟作為血液和灌注液出口。實(shí)施內(nèi)固定腦組織后將大鼠斷頭，快速分離腦組織，放入4％多聚甲醛中固定，切冠狀切片，石蠟包埋，將組織切片粘貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上。一部分切片用于HE染色分析，其余切片用于免疫組化染色分析。
1.3.5組織病理學(xué)分析 HE染色，光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。
1.3.6蛋白含量測定 采用雙縮脲蛋白質(zhì)定量法。雙縮脲試劑中的銅離子可與蛋白質(zhì)中肽鍵及硌氨酸殘基起反應(yīng)，形成紫色復(fù)合物，分光光度計(jì)540nm處比色，根據(jù)吸光度大小可推算出樣品中蛋白質(zhì)含量。具體步驟按蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行。
1.3.7腦組織SOD、MDA等生化指標(biāo)的檢測 1.3.7.1總抗氧化能力檢測 機(jī)體中許多抗氧化物質(zhì)能使Fe3+還原為Fe2+，后者與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，通過520nm的吸光度值反映其抗氧化能力的高低。按試劑盒說明書進(jìn)行操作?；钚詥挝欢x37℃時(shí)每毫克組織蛋白使反應(yīng)體系中吸光度值增加0.01時(shí)為一個(gè)總抗氧化能力單位(U/mg.prot)。
1.3.7.2SOD的活性測定 通過黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，550nm處有最大吸收峰。而SOD則抑制此反應(yīng)。根據(jù)吸光度大小可推算出樣品中SOD活性。具體步驟按SOD試劑盒說明書進(jìn)行。酶的活性單位定義每毫克組織蛋白在1毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50％時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)酶活性單位(U/mg.prot)。
1.3.7.3腦組織MDA含量測定 過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰，根據(jù)吸光度大小可推算出樣品中MDA含量。取10％腦組織勻漿0.1mL，具體步驟按MDA試劑盒說明書進(jìn)行。單位為nmol/mg.prot。
1.3.7.4乙酰膽堿酯酶活性測定 乙酰膽堿酯酶是催化膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水解的酶。產(chǎn)物膽堿和巰基顯色劑反應(yīng)生成黃色化合物。412nm處比色測定，根據(jù)顏色深淺反映酶的活性。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。以每毫克組織蛋白在37℃保溫6min，水解反應(yīng)體系中1μmol基質(zhì)為1個(gè)酶活性單位(U/h/mg.prot)。
1.3.8免疫組化分析 石蠟切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟處理后，進(jìn)行膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(CholineAcetyltransferase，ChAT)免疫組織化學(xué)染色和半定量分析ChAT的蛋白含量。
1.3.9電鏡檢測 隨機(jī)從各組中抽取一只小鼠，斷頭取腦，分離海馬組織。2.5％戊二醛中固定。經(jīng)0.1mol/L PBS漂洗，2％鋨酸后固定，酒精丙酮梯度脫水，包埋劑包埋。制作超薄切片，常規(guī)鉛鈾染色，透射電鏡下觀察拍照。
2.結(jié)果 2.1對小鼠行為學(xué)的影響 2.1.1對小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響 結(jié)果顯示，與正常組相比，正常Ica MD組和假手術(shù)組的小鼠自發(fā)活動(dòng)均無顯著性差異。而模型組小鼠自發(fā)活動(dòng)比假手術(shù)組小鼠明顯減少(P＜0.01)。與模型組相比，Ica LD灌胃對于增加模型小鼠的自發(fā)活動(dòng)無明顯影響。Ica MD和Ica HD灌胃能劑量依賴性增加模型小鼠的自發(fā)活動(dòng)(P＜0.05和0.01)。陽性藥尼莫地平也可以明顯增加模型小鼠的自發(fā)活動(dòng)(P＜0.05)。
2.1.2小鼠被動(dòng)回避反射實(shí)驗(yàn) 2.1.2.1對小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)的影響 結(jié)果顯示，在跳臺實(shí)驗(yàn)的第一天，與正常組相比，正常Ica MD組的小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)有所減少，但無顯著性差異。模型組小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)比假手術(shù)組小鼠增加無顯著性差異。與模型組相比，Ica各劑量組和陽性藥尼莫地平對小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)也無明顯影響。
2.1.2.2對小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)上臺潛伏期的影響 結(jié)果顯示，與正常組相比，正常Ica MD組和假手術(shù)組的小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)上臺潛伏期均無顯著性差異。模型組小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)上臺潛伏期比假手術(shù)組小鼠明顯增多，二者相比有顯著性差異(P＜0.05)。與模型組相比，Ica LD、Ica MD和陽性藥尼莫地平組上臺潛伏期縮短無顯著性差異。Ica HD灌胃能明顯縮短模型小鼠的上臺潛伏期(P＜0.05)。
2.1.2.3對小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)受電擊時(shí)間的影響 結(jié)果顯示，與正常組相比，正常Ica MD組和假手術(shù)組的小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)受電擊時(shí)間均無顯著性差異。模型組小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)受電擊時(shí)間比假手術(shù)組小鼠明顯增多，二者相比有顯著性差異(P＜0.05)。與模型組相比，Ica LD、Ica MD受電擊時(shí)間縮短無顯著性差異。而Ica HD和陽性藥尼莫地平組能明顯縮短模型小鼠的受電擊時(shí)間(P＜0.05)。
2.1.2.4對小鼠記憶能力錯(cuò)誤次數(shù)的影響 在跳臺實(shí)驗(yàn)的第二天，與正常組相比，正常Ica MD和假手術(shù)組的小鼠記憶能力錯(cuò)誤次數(shù)均無顯著性差異。而模型組小鼠記憶錯(cuò)誤次數(shù)比假手術(shù)組小鼠明顯增加，二者有顯著性差異(P＜0.01)。Ica LD組小鼠的記憶錯(cuò)誤次數(shù)有所降低，但與模型組相比，無顯著性差異。Ica MD、Ica HD組和陽性藥尼莫地平組均能明顯減少小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)(P＜0.01)。
2.1.2.5對小鼠下臺潛伏期的影響 結(jié)果顯示，與正常組比較，正常Ica MD和假手術(shù)組的小鼠下臺潛伏期均無顯著性差異。而模型組小鼠下臺潛伏期比假手術(shù)組小鼠明顯減少，二者有顯著性差異(P＜0.01)。IcaLD組小鼠的下臺潛伏期有所增加，但與模型組相比，無顯著性差異。Ica MD、Ica HD組和陽性藥尼莫地平組均能明顯增加小鼠的下臺潛伏期(P＜0.01)。
2.1.2.6對小鼠臺上總停留時(shí)間的影響 結(jié)果顯示，與正常組比較，正常Ica MD和假手術(shù)組的小鼠臺上總停留時(shí)間均無顯著性差異。而模型組小鼠臺上總停留時(shí)間比假手術(shù)組小鼠明顯減少，二者有顯著性差異(P＜0.01)。Ica LD組小鼠的臺上總停留時(shí)間有所增加，但與模型組相比，無顯著性差異。Ica MD、Ica HD組和陽性藥尼莫地平組均能明顯增加小鼠的臺上總停留時(shí)間(P＜0.01)。
2.2小鼠空間分辨學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn) 2.2.1對錯(cuò)誤次數(shù)的影響 結(jié)果顯示。與正常組比較，正常Ica MD和假手術(shù)組小鼠D3，D4，D5的錯(cuò)誤次數(shù)均無顯著性差異。而模型組小鼠D3，D4，D5的錯(cuò)誤次數(shù)比相應(yīng)假手術(shù)組小鼠明顯增加(P＜0.05)。與相應(yīng)模型組相比，Ica LD組小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)減少不明顯。Ica MD、Ica HD組和陽性藥尼莫地平組能不同程度的減少小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)。
2.2.2對尋臺潛伏期的影響 結(jié)果顯示，與正常組比較，正常Ica MD和假手術(shù)組小鼠D3，D4，D5的尋臺潛伏期均無顯著性差異。而模型組D3的尋臺潛伏期顯著上升，與假手術(shù)組相比有顯著性差異(P＜0.01)。隨著訓(xùn)練次數(shù)增多，模型組D4、D5的潛伏期仍顯著增加(P＜0.05)。與相應(yīng)模型組相比，Ica LD組對小鼠的尋臺潛伏期影響不明顯。Ica MD、Ica HD和尼莫地平組能不同程度的縮短小鼠的尋臺潛伏期 2.3病理形態(tài)學(xué)變化 HE染色后，光鏡下觀察可見假手術(shù)組小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目多，呈多層，排列整齊緊密。細(xì)胞核呈圓形，大而清晰，核仁明顯。神經(jīng)纖維密集，排列整齊。腦缺血再灌模型組海馬神經(jīng)元數(shù)目有所減少，脫失現(xiàn)象明顯，層次少而不清，排列紊亂。核固縮為三角形或多角形，濃染。神經(jīng)纖維稀疏，排列紊亂，間隙擴(kuò)大。藥物防治組海馬神經(jīng)元損傷有不同程度的改善。陽性藥尼莫地平組(20mg/kg)能明顯改善海馬神經(jīng)元的損傷。使神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)基本正常，排列較為整齊，核固縮現(xiàn)象有所改善，神經(jīng)纖維明顯增加。低劑量Ica組(10mg/kg)改變不明顯。中劑量(30mg/kg)和高劑量(100mg/kg)Ica組能劑量依賴性明顯改善細(xì)胞形態(tài)，海馬神經(jīng)元趨于正常。
2.4對腦缺血再灌小鼠腦組織總抗氧化能力的影響 結(jié)果表明，腦缺血再灌后腦組織勻漿總抗氧化能力明顯下降，與假手術(shù)組比較差異有顯著性(P＜0.01)。Ica LD組總抗氧化能力與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ica MD、Ica HD和尼莫地平組均能明顯升高總抗氧化能力，與模型組比較，差異有顯著性(P＜0.01)。
2.5對腦缺血再灌小鼠腦組織SOD酶活性的影響 結(jié)果顯示，腦缺血再灌模型組小鼠腦組織總SOD活性明顯下降，與假手術(shù)組相比，兩者差異有顯著性(P＜0.01)。與模型組比較，尼莫地平組能明顯升高SOD活性(P＜0.01)。Ica各組均能明顯升高SOD活性，呈一定的量效關(guān)系(P＜0.05或0.01)。
2.6對腦缺血再灌小鼠腦組織MDA含量的影響 結(jié)果顯示，腦缺血再灌可使腦組織中MDA含量比假手術(shù)組明顯升高(P＜0.01)，說明缺血再灌引起了脂質(zhì)過氧化損傷。Ica LD組MDA含量雖然有所下降，但與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ica MD、Ica HD和陽性藥尼莫地平組MDA含量均顯著降低，與模型組相比有顯著性差異(P＜0.01)。
2.7對腦缺血再灌小鼠腦組織AchE酶活性的影響 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較小鼠腦缺血再灌后腦組織AchE酶活性明顯下降(P＜0.05)。與模型組相比，Ica LD、Ica MD組AchE酶活性無顯著變化。Ica HD和陽性藥尼莫地平組均能明顯阻遏AchE酶活性的降低(P＜0.05)。
2.8對腦缺血再灌小鼠腦組織ChAT表達(dá)的影響 小鼠腦組織切片膽堿乙?；该庖呓M化顯示，抗ChAT抗體陽性細(xì)胞在皮質(zhì)和海馬內(nèi)廣泛分布，呈卵圓形、三角形或不規(guī)則形，胞質(zhì)和胞膜均著色。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)ChAT免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)目減少，并可能降低ChAT表達(dá)著色較淺，提示腦缺血再灌可能損傷膽堿能神經(jīng)元。用生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行ChAT半定量分析發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，Ica MD、Ica HD組和尼莫地平組ChAT免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞著色較深，低劑量組改變不明顯 2.9超微結(jié)構(gòu) 通過透射電鏡可以觀察到假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。核大呈圓形或橢圓形，常染色質(zhì)分布均勻，核仁明顯。核膜清晰、完整。線粒體雙層膜完整、線粒體嵴正常。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，高爾基體發(fā)達(dá)。腦缺血再灌模型組可見神經(jīng)細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色質(zhì)聚集于細(xì)胞核周邊(邊集化)。細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核膜凹陷。膠質(zhì)細(xì)胞增生、浸潤和吞噬神經(jīng)元。神經(jīng)元縮小、變形。胞漿和核灶性空泡化。核糖體減少。線粒體腫脹，空泡樣變，線粒體嵴斷裂。神經(jīng)細(xì)胞周圍有變性髓鞘。Ica LD組部分細(xì)胞有核染色質(zhì)邊集化、胞漿空泡化、線粒體嵴斷裂、與周圍組織連接疏松等現(xiàn)象。Ica MD組細(xì)胞損傷明顯減輕，大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，有的可見核仁增多、靠邊，高爾基體有少許擴(kuò)張，游離核糖體增多等現(xiàn)象，說明細(xì)胞處于修復(fù)期。Ica HD組神經(jīng)細(xì)胞基本正常。
(五)淫羊藿苷對氧自由基損傷大鼠腦線粒體保護(hù)作用 1.實(shí)驗(yàn)方法 1.1大鼠腦線粒體的提取 用蔗糖密度梯度離心法提取大鼠腦線粒體。大鼠斷頭迅速取全腦(去小腦)，稱重后按1∶9(w/v)比例加入預(yù)冷的勻漿液(mmol·L-1蔗糖250，EDTA 0.5，Tris-HCl 10，pH7.40)置于玻璃勻漿器中冰浴手動(dòng)勻漿。2000×g離心3min。取上清液，12000×g離心8min。將沉淀仔細(xì)懸于Ficoll梯度中，11500×g離心30min。棄上清液，沉淀用勻漿液洗1次，12000×g離心8min，所得沉淀即為線粒體。以上所有操作均在4℃進(jìn)行。Follin酚法測定線粒體懸液的蛋白含量，調(diào)整濃度為線粒體蛋白2g·L-1。用于測定呼吸鏈復(fù)合體酶的線粒體蛋白懸液分裝后-70℃保存，保存時(shí)間不超過2周。測定前將線粒體蛋白置于20℃/-20℃反復(fù)凍融3次，使之成為線粒體膜片段以達(dá)到最大酶活性。用于測定線粒體腫脹度的線粒體蛋白置于冰浴，放置加測定的時(shí)間不超過72h，以保持線粒體膜的完整性。其余實(shí)驗(yàn)所用線粒體均于-20℃保存。
1.2 Fe2+/維生素C(Fe2+/VitC)自由基產(chǎn)生體系損傷線粒體模型的建立和分組 用Tris-HCL緩沖液配制不同濃度的FeSO4和VitC，分別加入新鮮分離的線粒體0.2ml(含線粒體蛋白1mg)，37℃孵育30min，20mM EDTA終止反應(yīng)。10000×g離心10min，用懸浮介質(zhì)洗一次。實(shí)驗(yàn)分組正常對照組；損傷組(1mM Fe2+/1mM VitC、10mM Fe2+/10mMVitC)；淫羊藿苷處理組(0.01mg·L-1、0.03mg·L-1、0.1mg·L-1)。在相同條件下只含線粒體，不含藥物和Fe2+、VitC的作為對照組。藥物組，預(yù)先向線粒體懸液中加入不同濃度的淫羊藿苷(淫羊藿苷用少量無水乙醇助溶，體積比小于5％)，三蒸水配制為1g·L-1原液，100℃水浴加熱溶解。依次用三蒸水稀釋為1、3、10mg·L-1的工作液，臨用時(shí)100倍稀釋為所需濃度，5min后再加入Fe2+/VitC，37℃反應(yīng)30min，其余同模型組。
1.3線粒體腫脹程度 所用線粒體為新鮮制備未經(jīng)凍融的，測定前于4℃放置。含線粒體蛋白0.5mg，加入不同濃度的淫羊藿苷，溫孵5min后加入Fe2+/VitC，反應(yīng)終體積1mL。分別于加入Fe2+/VitC之后0，2，4，6，8，10，20min用分光光度計(jì)測定520nm處的吸光度(A520nm)值。以不同時(shí)間點(diǎn)A520nm與0min時(shí)A520nm的差值表示結(jié)果。A520nm值的降低與線粒體腫脹度呈正比。
1.4線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶活性測定 按方法1.3處理后離心收集的線粒體蛋白，測定前置于20℃/-20℃反復(fù)凍融3次，使之成為線粒體膜片段以進(jìn)行線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶活性測定。測定溫度為30℃，反應(yīng)體積為1mL 1.4.1呼吸鏈復(fù)合體酶I活性測定 5-10μg線粒體蛋白加入反應(yīng)緩沖體系(mmol·L-1pH 7.2磷酸鉀緩沖液35，MgCl2 5，迭氮鈉2)中，加入抗霉素A(2mg·L-1)、CoQ10(65μmol·L-1)混勻后，30℃溫孵5min。加入NADH(0.13mmol·L-1)啟動(dòng)反應(yīng)，1min內(nèi)連續(xù)測定340nm處吸光值的變化。空白管加入魚藤酮(2mg·L-1)以抑制復(fù)合體酶I的活性。以1min內(nèi)NADH降低速率表示呼吸鏈復(fù)合體酶I的活性，單位μmol·min-1·mg-1。
1.4.2呼吸鏈復(fù)合體酶II活性測定 5-10μg線粒體蛋白加入反應(yīng)緩沖體系(mmol·L-1pH 7.2磷酸鉀緩沖液35，MgCl2 5，迭氮鈉2)中，加入抗霉素A(2mg·L-1)、CoQ10(65μmol·L-1)、魚藤酮(2mg·L-1)、DCPIP(88mmol·L-1)混勻后，30℃溫孵5min。加入新配的琥珀酸鈉(25 mmol·L-1)啟動(dòng)反應(yīng)，1min內(nèi)連續(xù)測定600nm處吸光值的變化。通過監(jiān)測被FADH2還原的DCPIP的量變化來反應(yīng)呼吸鏈復(fù)合體酶II的活性。
1.4.3呼吸鏈復(fù)合體酶III活性測定 5-10μg線粒體蛋白加入反應(yīng)緩沖體系(mmol·L-1pH 7.2磷酸鉀緩沖液35，MgCl2 5，迭氮鈉2，EDTA 0.5，氧化型細(xì)胞色素C 0.035)中，混勻后，加入新還原的CoQ10(0.1mmol·L-1)啟動(dòng)反應(yīng)，1min內(nèi)連續(xù)測定A550nm值的變化。根據(jù)A550nm處細(xì)胞色素C吸光度值的變化來反應(yīng)呼吸鏈復(fù)合體酶III的活性。
還原型CoQ10的制備將10μmol的CoQ10完全溶解于2mL四氫呋喃中，加入NaBH4 1mg，反復(fù)吹打至溶液由黃色變?yōu)闊o色為止。再加入無水乙醚2mL萃取2次，合并萃取液后揮發(fā)干乙醚。所得淡黃色粉末溶于1mL四氫呋喃和無水乙醇的混合液(1∶1)中，即得新還原的CoQ10(0.1mmol·L-1)。臨用前現(xiàn)配制。
1.4.4呼吸鏈復(fù)合體酶IV活性測定 40-60μg線粒體蛋白加入反應(yīng)緩沖體系(8.8mmol·L-1磷酸鉀緩沖液，pH 7.0)加入0.1％還原型細(xì)胞色素C(以過量VitC還原至A550nm/A565nm＞12)啟動(dòng)反應(yīng)，1min內(nèi)連續(xù)測定A550nm值的變化。根據(jù)A550nm處細(xì)胞色素C吸光度值的變化來反應(yīng)呼吸鏈復(fù)合體酶IV的活性。
1.5MDA含量測定 過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。單位為nmol/mg prot。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.1淫羊藿苷對自由基損傷線粒體腫脹度的影響 結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組0.1mM Fe2+/0.1mM VitC造成線粒體腫脹作用不明顯；而1mM Fe2+/1mM VitC、10mM Fe2+/10mM VitC均能造成線粒體明顯腫脹(P＜0.01)，且10mM Fe2+/10mM VitC對線粒體損傷更為嚴(yán)重。
在1mM Fe2+/1mM VitC損傷的線粒體中預(yù)先加入淫羊藿苷(0.03mg·L-1、0.1mg·L-1)能顯著抑制線粒體腫脹(P＜0.01或0.05)，而淫羊藿苷(0.01mg·L-1)組對線粒體腫脹無明顯抑制作用。在10mM Fe2+/10mM VitC損傷的線粒體中預(yù)先加入淫羊藿苷(0.03mg·L-1、0.1mg·L-1)能顯著抑制線粒體腫脹(P＜0.01或0.05)，而淫羊藿苷(0.01mg·L-1)組抑制效果不明顯。
2.2淫羊藿苷對自由基損傷線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶I活性的影響 結(jié)果顯示，與對照組相比，1mM Fe2+/1mM VitC損傷的線粒體模型組呼吸鏈復(fù)合體酶I活性略有升高；隨著Fe2+/VitC濃度的增高，10mM Fe2+/10mM VitC損傷的線粒體模型組呼吸鏈復(fù)合體酶I活性有所上升。但與對照組相比，模型組復(fù)合體酶I活性變化均無顯著性差異。在1mM Fe2+/1mM VitC損傷線粒體中預(yù)先加入淫羊藿苷(0.01、0.03mg·L-1、0.1mg·L-1)對呼吸鏈復(fù)合體酶I活性無顯著性影響。在10mM Fe2+/10mM VitC損傷的線粒體中預(yù)先加入淫羊藿苷(0.01、0.03mg·L-1、0.1mg·L-1)能使升高的呼吸鏈復(fù)合體酶I活性降低(P＜0.05)。
2.3淫羊藿苷對自由基損傷線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶II活性的影響 結(jié)果顯示，1mM Fe2+/1mM VitC損傷的線粒體模型組呼吸鏈復(fù)合體酶II活性變化無顯著性差異。但是與對照組相比，10mM Fe2+/10mM VitC損傷的線粒體模型呼吸鏈復(fù)合體酶II活性顯著降低(P＜0.01)。預(yù)先加入淫羊藿苷(0.01、0.03mg·L-1、0.1mg·L-1)對1mMFe2+/1mM VitC損傷線粒體的呼吸鏈復(fù)合體酶II活性無明顯影響。在10mM Fe2+/10mM VitC損傷線粒體組預(yù)先加入淫羊藿苷(0.01mg·L-1)對酶II活性的降低無明顯影響，而預(yù)先加入淫羊藿苷(0.03mg·L-1、0.1mg·L-1)均能一定程度的阻止呼吸鏈復(fù)合體酶II活性的降低(P＜0.05或0.01)，而且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。
2.4淫羊藿苷對自由基損傷線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶III活性的影響 結(jié)果顯示，與對照組比較，1mM Fe2+/1mM VitC損傷的線粒體模型呼吸鏈復(fù)合體酶III活性顯著降低(P＜0.05)。預(yù)先加入淫羊藿苷(0.01mg·L-1、0.03mg·L-1、0.1mg·L-1)對阻止呼吸鏈復(fù)合體酶III活性的降低無顯著性影響。隨著Fe2+/VitC濃度的增高，10mMFe2+/10mM VitC損傷的線粒體模型呼吸鏈復(fù)合體酶III活性進(jìn)一步顯著降低(P＜0.01)。而預(yù)先加入淫羊藿苷(0.03mg·L-1、0.1mg·L-1)均能顯著阻止呼吸鏈復(fù)合體酶III活性的降低(P＜0.01)。
2.5淫羊藿苷對自由基損傷線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶IV活性的影響 結(jié)果顯示，與對照組比較，1mM Fe2+/1mM VitC損傷的線粒體模型組呼吸鏈復(fù)合體酶IV活性顯著降低(P＜0.05)。隨著Fe2+/VitC濃度的增高，10mM Fe2+/10mM VitC損傷的線粒體模型呼吸鏈復(fù)合體酶IV活性進(jìn)一步顯著降低(P＜0.01)。在1mM Fe2+/1mM VitC損傷的線粒體中預(yù)先加入淫羊藿苷(0.01mg·L-1、0.03mg·L-1)對呼吸鏈復(fù)合體酶IV活性的降低無明顯影響，而預(yù)先加入淫羊藿苷(0.1mg·L-1)能阻遏呼吸鏈復(fù)合體酶IV活性的降低(P＜0.05)。在10mM Fe2+/10mM VitC組線粒體預(yù)先加入淫羊藿苷(0.03mg·L-1、0.1mg·L-1)均能顯著阻止呼吸鏈復(fù)合體酶IV活性的降低(P＜0.05或0.01)，而且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。
2.6淫羊藿苷對自由基損傷線粒體MDA含量的影響 結(jié)果顯示，與對照組比較，F(xiàn)e2+/VitC損傷的線粒體模型組中，隨著Fe2+/VitC濃度的升高，線粒體的MDA含量顯著增加(P＜0.01)。預(yù)先加入淫羊藿苷能明顯抑制Fe2+/VitC引起的線粒體MDA生成。與相應(yīng)模型組比較，淫羊藿苷(0.01mg·L-1)組抑制效果均不明顯。而淫羊藿苷(0.03mg·L-1、0.1mg·L-1)組均能顯著抑制MDA生成(P＜0.01)。
以上結(jié)果說明淫羊藿苷可保護(hù)腦線粒體，防止氧化損傷，這對改善氧應(yīng)激狀態(tài)下的能量代謝障礙具有重要意義。提示淫羊藿苷在腦保護(hù)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
(六)腦缺血再灌對小鼠腦細(xì)胞色素C氧化酶亞基II mRNA的影響及淫羊藿苷的作用 1.實(shí)驗(yàn)方法和觀察指標(biāo) 1.1動(dòng)物模型的制備 小鼠腦缺血再灌模型的建立方法同(五)。
1.2實(shí)驗(yàn)分組和處理 隨機(jī)分組為正常對照組(不分時(shí)間點(diǎn))，模型組(分別設(shè)腦缺血再灌術(shù)后1h、3h、24h、72h、14d幾個(gè)時(shí)間點(diǎn))和淫羊藿苷防治組。防治組按淫羊藿苷(臨用時(shí)用0.3％羧甲基纖維素鈉制成混懸液)100mg/kg的劑量，于術(shù)前30min和術(shù)后每天早晨空腹灌胃一次，直至進(jìn)行檢測。模型組予以0.3％羧甲基纖維素鈉灌胃。
1.3小鼠大腦組織總RNA的提取 在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)，每組取4只動(dòng)物，分離腦組織，去除腦干。按華舜生物工程公司的組織細(xì)胞總RNA抽提試劑盒說明進(jìn)行操作。
(1)取小鼠腦組織約50mg，加入裂解液TCL 0.5ml，在冰浴中用玻璃勻漿器將腦組織徹底勻漿。將勻漿液移入1.5mL離心管中，立即用帶針頭的一次性5mL注射器反復(fù)抽打裂解物10次。室溫下，12000g離心3min。
(2)將上清液移入另一個(gè)1.5mL離心管中，加入250μL 75％乙醇。徹底混勻后全部移入吸附柱中，12000g離心30sec。
(3)倒掉收集管中的液體。在吸附柱中加入500μL RP液。12000g離心30sec。
(4)倒掉收集管中的液體。在吸附柱中加入500μL W3液。室溫放置1min，12000g離心15sec。
(5)倒掉收集管中的液體。在吸附柱中再次加入500μL W3液。室溫放置1min，12000g離心15sec。
(6)倒掉收集管中的液體。室溫下，12000g離心1min，徹底去除多余液體。
(7)將吸附柱放入另一個(gè)干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入50μL純水。室溫放置5min，12000g離心1min。
(8)RNA提取物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，以檢查鑒定RNA是否被降解。
(9)用紫外分光光度計(jì)測定RNA含量和純度。要求A260/A280比值在1.8-2.0范圍內(nèi)為合格。并根據(jù)A260的值估計(jì)RNA含量，使每個(gè)樣品RNA濃度為1mg/ml。所得RNA于-70℃保存?zhèn)溆? 1.4逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測定CO II mRNA表達(dá) 1.4.1引物制備 分別參照GenBank基因庫中關(guān)于小鼠COII和b-actin的mRNA序列設(shè)計(jì)引物。其中，β-actin引物對為5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3’和5’ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3’。用來擴(kuò)增300bp的b-actin片段，作為內(nèi)參照。引物由北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心合成。目的基因COII引物對為5’GCCTACCCATTCCAACTTGGTC3’和5’AATTATTGAAGCAGATCAGTTTTCG3’。用來擴(kuò)增683bp的COII片段。引物由TaKaRa生物工程公司合成。
1.4.2RT-PCR (1)采用TaKaRa生物工程公司的一步法RT-PCR試劑盒，按照其說明書進(jìn)行。
(2)RT-PCR條件 第一階段50℃×30min(逆轉(zhuǎn)錄)，94℃×2min，1個(gè)循環(huán)。
第二階段94℃×30s，56℃×30s，72℃×30s，25個(gè)循環(huán)。
第三階段72℃×7min，4℃保持。
(3)PCR產(chǎn)物-20℃保存。
1.5RT-PCR產(chǎn)物的電泳和半定量分析 經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。擴(kuò)增出300bp(β-actin)和683bp(CO II)的兩條片段。紫外照射下照相，用BIORAD凝膠成像分析系統(tǒng)分析。以目的片段和內(nèi)參照的掃描積分光密度值之比反映各目的片段mRNA量的相對高低。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.1總RNA的提取與鑒定 紫外分光光度計(jì)測量A260和A280，其A260/A280值在1.8-2.0范圍內(nèi)。說明RNA純度較好。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見清晰的2-3條帶。RNA電泳后18S、28S兩條帶非常清晰而且具有較高的亮度，未見明顯的降解條帶，證明RNA提取質(zhì)量較好。
2.2腦缺血再灌損傷對小鼠大腦CO II mRNA表達(dá)量的影響 結(jié)果顯示，經(jīng)電泳條帶經(jīng)BIORAD凝膠成像分析系統(tǒng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌后1h、3h時(shí)小鼠大腦CO II mRNA的表達(dá)量呈降低趨勢，并且3h時(shí)CO II mRNA的表達(dá)量與對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)。24h時(shí)COIImRNA的表達(dá)量趨近于正常，與對照組相比無顯著性差異。72h時(shí)COIImRNA的表達(dá)量明顯上升，差異有顯著性(P＜0.01)。在腦缺血再灌后14d時(shí)COIImRNA的表達(dá)量又有所降低，(P＜0.05)。
2.3淫羊藿苷對腦缺血再灌小鼠大腦CO II mRNA表達(dá)量的影響 結(jié)果顯示，淫羊藿苷對小鼠腦缺血再灌后3h時(shí)CO II mRNA表達(dá)量的降低略有所阻遏，但與相應(yīng)模型組比較無顯著性差異。在腦缺血再灌后72h時(shí)CO II mRNA表達(dá)量顯著上升，而灌胃給予淫羊藿苷可以明顯阻止COIImRNA表達(dá)量的升高，與相應(yīng)模型組比較有顯著性差異。在腦缺血再灌后14d時(shí)CO II mRNA表達(dá)量又有所降低，而灌胃給予淫羊藿苷可阻止CO II mRNA表達(dá)量的降低。
(七)淫羊藿苷對鋁鹽誘導(dǎo)癡呆模型大鼠的影響 1.實(shí)驗(yàn)方法 取72只合格大鼠隨機(jī)分為對照組(n＝24)和模型組(n＝48)，模型組飲用1.6g·L-1 AlCl3溶液誘導(dǎo)大鼠的癡呆模型，Morris水迷宮檢測大鼠的空間辨別學(xué)習(xí)記憶能力，飲鋁5個(gè)月學(xué)習(xí)記憶下降后，再將其分為模型對照組、ICA低(30mg·kg-1·d-1)、中(60mg·kg-1·d-1)、高(120mg·kg-1·d-1)劑量治療組，每組12只。24只對照組大鼠分為正常給藥組(ICA 60mg·kg-1·d-1)和正常對照組。ICA灌胃3月后免疫組化法檢測海馬內(nèi)AChE、ChAT表達(dá)及Aβ1-40含量，并通過圖象處理軟件半定量分析；光化學(xué)法檢測大鼠大腦皮層及海馬組織中AChE活性、SOD活性、MDA含量和Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性。另選12只合格大鼠隨機(jī)分為正常對照組(n＝6)和模型對照組(n＝6)，模型對照組處理辦法同前，3月后用石墨爐原子吸收光譜法檢測大鼠腦內(nèi)鋁含量。
2.結(jié)果 結(jié)果顯示模型組大鼠飲用1.6g·L-1 AlCl3溶液5個(gè)月后出現(xiàn)明顯的空間辨別學(xué)習(xí)記憶障礙。ICA連續(xù)灌胃給藥3個(gè)月后，與模型對照組比較，ICA ICA 60mg·kg-1及120mg·kg-1可以縮短大鼠在定向航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期及搜索距離，增加空間探索實(shí)驗(yàn)中大鼠在原安全島所在象限的搜索時(shí)間及原安全島所在象限游泳距離占總距離百分比(P＜0.05；P＜0.01)；免疫組化結(jié)果顯示，ICA明顯降低海馬內(nèi)AChE表達(dá)減少AChE活性，抑制ChAT表達(dá)下降(P＜0.01)；升高SOD活性、降低MDA含量(P＜0.05，P＜0.01)；腦組織勻漿測定顯示，ICA 120mg·kg-1明顯增加Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性；降低Aβ1-40含量(P＜0.01)。飲用AlCl3溶液3個(gè)月的模型對照組大鼠學(xué)習(xí)記憶下降(P＜0.05)，同時(shí)腦鋁含量較正常對照組明顯增加(P＜0.01)。結(jié)論ICA對鋁鹽誘導(dǎo)的癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與以下因素有關(guān)1.增加大鼠腦內(nèi)Ach含量；2.清除氧自由基，抑制鋁負(fù)荷引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)；3.穩(wěn)定細(xì)胞膜，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞；4.減少Aβ生成。
綜上所述，通過對上述老年癡呆模型作用及其機(jī)理研究，結(jié)果表明，淫羊藿苷可明顯改善上述三種癡呆大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶成績；同時(shí)可提高小鼠的自發(fā)活動(dòng)，改善被動(dòng)學(xué)習(xí)記憶成績和空間學(xué)習(xí)記憶成績；提高損傷的原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的存活率，減少神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放，降低缺氧(糖)/復(fù)氧(糖)損傷的神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡率，抑制細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的升高，對缺氧(糖)/復(fù)氧(糖)損傷的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用；減輕線粒體腫脹，減少M(fèi)DA含量，提高呼吸鏈復(fù)合體酶II-IV的活性。淫羊藿苷對鋁鹽誘導(dǎo)的癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與以下因素有關(guān)1.增加大鼠腦內(nèi)ACh含量；2.清除氧自由基，抑制鋁負(fù)荷引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)；3.穩(wěn)定細(xì)胞膜，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞；4.減少Aβ的生成、減輕病理性損傷程度。
此外，申請人還進(jìn)行了毒性試驗(yàn)和與專利申請200510094412.7的對比實(shí)驗(yàn)，具體如下 (一)急性毒性實(shí)驗(yàn) 采用改進(jìn)寇氏法測定，7.0g/Kg淫羊藿苷(藥物最大溶解度，動(dòng)物最大胃容量)灌胃給藥7天未引起小鼠死亡，不能測定半數(shù)致死量。按最大給藥量實(shí)驗(yàn)說明該藥毒性小。
(二)與專利申請200510094412.7的對比 淫羊藿總黃酮(epimedium total flavonoids)、淫羊藿苷對Aβ25-35海馬內(nèi)注射所致AD大鼠行為學(xué)的影響 1.材料和方法 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(II級)雄性KM小鼠，28-33克，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證書號SCXK(渝)20020001。飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程中遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)的有關(guān)準(zhǔn)則。
主要試劑與藥品淫羊藿苷 由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，HPLC(高效液相色譜分析)純度大于98％。
1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理行Morris水迷宮訓(xùn)練，淘汰掉學(xué)習(xí)成績太好和太差者，訓(xùn)練至成績穩(wěn)定后將剩余的36只大鼠隨機(jī)分為6個(gè)組，分別為假手術(shù)組，模型組，淫羊藿總黃酮低、高劑量治療組，淫羊藿苷低、高劑量治療組，每組6只。
1.3動(dòng)物模型的制備同實(shí)驗(yàn)一 1.4藥物干預(yù) 待動(dòng)物清醒后治療組即開始灌胃給藥。治療組每日定時(shí)(早上8時(shí))灌胃給藥一次，淫羊藿總黃酮低、高劑量治療組分別給予淫羊藿總黃酮30mg.kg-1.d-1、60mg.kg-1.d-1；淫羊藿苷低、高劑量組分別給予淫羊藿苷30mg.kg-1.d-1、60mg.kg-1.d-1；連續(xù)14天。
1.5Morris水迷宮訓(xùn)練同前。
1.6數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

表示。組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0.05認(rèn)為有差異，P＜0.01認(rèn)為有顯著性差異。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 水迷宮實(shí)驗(yàn)表明，Aβ25-35海馬內(nèi)注射14天后，AD模型組與假手術(shù)組比較，前者在定位航行實(shí)驗(yàn)中大鼠的逃避潛伏期及搜索距離明顯延長(表15、16)，空間探索實(shí)驗(yàn)中在原安全島所在象限的搜索時(shí)間明顯減少(表17)，原安全島所在象限的游泳距離占總距離的百分比降低(表18)，提示AD模型組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能出現(xiàn)障礙。
淫羊藿苷灌胃14天后，各治療組與AD模型組相比較，前者在定位航行中均可縮短大鼠的逃避潛伏期及搜索距離(表15、16)，在空間探索實(shí)驗(yàn)中原安全島所在象限的搜索時(shí)間明顯延長(表17)，原安全島所在象限的游泳距離占總距離的百分比明顯增大(表18)。淫羊藿苷對AD模型大鼠行為學(xué)的改善較淫羊藿總黃酮更明顯。
表15淫羊藿苷灌胃后大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)成績(逃避潛伏期)
#P＜0.05 vs sham，*P＜0.05 vs model。
表16淫羊藿苷灌胃后大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)成績(搜索距離)
#P＜0.05 vs sham，*P＜0.05 vs model。
表17淫羊藿苷灌胃后大鼠空間探索成績(搜索時(shí)間)
#P＜0.05 vs sham，*P＜0.05 vs model。
表18淫羊藿苷灌胃后大鼠的空間探索成績(原平臺象限游泳距離占總距離百分比) *P＜0.05 vs model。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明為淫羊藿苷的單方制劑，其原料及制備工藝簡單，成本低廉，療效顯著，服用量小，無毒副作用，為老年癡呆癥的治療提供了一種療效可靠的藥物。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明的實(shí)施例1淫羊藿苷的提取干燥淫羊藿全株經(jīng)粉粹后，過60～80目篩，用75％工業(yè)乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，過濾，合并提取液，回收溶液至無醇味；加入適量水，用等體積氯仿萃取3次，母液再用等體積正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液并回收得到浸膏；浸膏經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇＝5∶1為洗脫劑進(jìn)行分離，再經(jīng)重結(jié)晶，即得單體化合物淫羊藿苷。
本發(fā)明的實(shí)施例2取淫羊藿苷200毫克、硬脂酸鎂0.25毫克、羧甲基淀粉鈉8毫克、微晶纖維素80毫克，將淫羊藿苷與羧甲基淀粉鈉、微晶纖維素混合，過篩，使其混勻，加入適量水或乙醇制粒，干燥后，整粒，加入硬脂酸鎂，然后用沖壓裝置將顆粒壓制成片，即得治療老年癡呆的片劑。
本發(fā)明的實(shí)施例3取淫羊藿苷200毫克、硬脂酸鎂0.20毫克、羧甲基淀粉鈉8毫克、淀粉80毫克，將淫羊藿苷與羧甲基淀粉鈉、淀粉混合均勻，加入適量乙醇制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸鎂，然后裝入明膠膠囊中，即得治療老年癡呆的膠囊劑。
本發(fā)明的實(shí)施例4取淫羊藿苷5克、糊精或蔗糖5克、矯味劑和甜味劑適量，將淫羊藿苷與蔗糖/糊精、矯味劑和甜味劑混合均勻，加入適量水或乙醇制成軟材，過篩制粒，干燥，整粒，分裝，即得治療老年癡呆的顆粒劑。
本發(fā)明的實(shí)施例5取淫羊藿苷200毫克、聚乙醇或豆油250毫克、助懸劑6毫克、乳化劑6毫克和明膠80毫克、甘油20毫克、純化水80毫克及防腐劑適量，將明膠置于溶膠罐中，加入純化水，70℃下加熱使溶解，加入甘油和防腐劑，攪拌均勻，真空除去氣泡后保溫靜置，按比例將淫羊藿苷與聚乙醇/豆油、乳化劑、助懸劑混合均勻，再和制備好的明膠置旋轉(zhuǎn)壓囊機(jī)，壓制成軟膠囊，定型，干燥，即得治療老年癡呆的軟膠囊。
本發(fā)明的實(shí)施例6取淫羊藿苷5毫克、基質(zhì)(聚乙二醇4000)30毫克、甲基硅油適量，將淫羊藿苷加水制成均勻糊狀，再加入溶融的基質(zhì)液，加熱熔融成澄清液體，倒入已預(yù)熱的滴丸器中，控制滴制溫度和速度，滴入甲基硅油冷凝液中，成丸后吸干冷凝液，收集滴丸，置干燥器內(nèi)，即得治療老年癡呆的滴丸。
本發(fā)明的實(shí)施例7取淫羊藿苷10克、羧甲基纖維素納1.5克、糖精鈉0.1克、矯味劑適量、防腐劑適量和純化水100毫升，將羧甲基纖維素納分散在熱水中，冷卻，然后與含有淫羊藿苷、糖精鈉、矯味劑和防腐劑的含水混懸液混合，將溶液調(diào)配成所需體積并混合均勻，滅菌后分裝，即得治療老年癡呆的糖漿劑。
本發(fā)明的實(shí)施例8取淫羊藿苷25毫克、注射用0.9％氯化鈉溶液8毫升，將淫羊藿苷溶解于注射用0.9％氯化鈉溶液中，并將溶液調(diào)至所需體積，調(diào)PH值，灌裝后在高溫下加熱滅菌，即得治療老年癡呆的注射劑。
本發(fā)明的實(shí)施例9取淫羊藿苷200毫克、可壓蔗糖60毫克、硬脂酸鎂0.2毫克，將淫羊藿苷過篩后與可壓蔗糖、硬脂酸鎂混合均勻，并用沖壓裝置壓片，即得治療老年癡呆的舌下含片。通過改變淫羊藿苷與輔料的比例可壓制成不同重量或不同強(qiáng)度的含片。
權(quán)利要求
1.淫羊藿苷在制備治療老年癡呆的藥物中的應(yīng)用。
2.按照權(quán)利要求1所述淫羊藿苷的應(yīng)用，其特征在于所述的淫羊藿苷是從小檗科淫羊藿屬植物中提取的黃酮醇苷類化合物。
3.按照權(quán)利要求1或2所述淫羊藿苷的應(yīng)用，其特征在于所述淫羊藿苷的提取方法為干燥淫羊藿全株經(jīng)粉粹、過篩后，用75％工業(yè)乙醇回流提取，回收溶劑，用氯仿萃取，母液再用正丁醇萃取，回收溶劑得浸膏，浸膏經(jīng)硅膠柱層析，再經(jīng)重結(jié)晶，即得單體化合物淫羊藿苷。
4.按照權(quán)利要求3所述淫羊藿苷的應(yīng)用，其特征在于所述淫羊藿苷的提取方法為干燥淫羊藿全株經(jīng)粉粹后，過60～80目篩，用75％工業(yè)乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，過濾，合并提取液，回收溶液至無醇味；加入適量水，用等體積氯仿萃取3次，母液再用等體積正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液并回收得到浸膏；浸膏經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇＝5∶1為洗脫劑進(jìn)行分離，再經(jīng)重結(jié)晶，即得單體化合物淫羊藿苷。
5.一種治療老年癡呆的藥物制劑，其特征在于它是以淫羊藿苷為原料，加入適量輔料制成的。
6.按照權(quán)利要求5所述治療老年癡呆的藥物制劑，其特征在于所述的藥物制劑為口服制劑、注射制劑或舌下含服制劑。
7.按照權(quán)利要求6所述治療老年癡呆的藥物制劑，其特征在于所述的藥物制劑為片劑、膠囊劑、顆粒劑、軟膠囊、滴丸劑、糖漿劑、注射劑或舌下含片。
8.按照權(quán)利要求5、6或7所述治療老年癡呆的藥物制劑，其特征在于片劑的制備方法為取淫羊藿苷10～400毫克、硬脂酸鎂0.1～0.40毫克、羧甲基淀粉鈉4～12毫克、微晶纖維素50～100毫克，將淫羊藿苷與羧甲基淀粉鈉、微晶纖維素混合，過篩，使其混勻，加入適量水或乙醇制粒，干燥后，整粒，加入硬脂酸鎂，然后用沖壓裝置將顆粒壓制成片，即得；膠囊劑的制備方法為取淫羊藿苷50～400毫克、硬脂酸鎂0.1～0.30毫克、羧甲基淀粉鈉4～12毫克、淀粉50～100毫克，將淫羊藿苷與羧甲基淀粉鈉、淀粉混合均勻，加入適量乙醇制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸鎂，然后裝入明膠膠囊中，即得；顆粒劑的制備方法為取淫羊藿苷1～10克、糊精或蔗糖1～10克、矯味劑和甜味劑適量，將淫羊藿苷與蔗糖/糊精、矯味劑和甜味劑混合均勻，加入適量水或乙醇制成軟材，過篩制粒，干燥，整粒，分裝，即得；軟膠囊的制備方法為取淫羊藿苷10～400毫克、聚乙醇或豆油100～400毫克、助懸劑3～10毫克、乳化劑3～10毫克和明膠50～100毫克、甘油10～30毫克、純化水50～100毫克及防腐劑適量，將明膠置于溶膠罐中，加入純化水，70℃下加熱使溶解，加入甘油和防腐劑，攪拌均勻，真空除去氣泡后保溫靜置，按比例將淫羊藿苷與聚乙醇/豆油、乳化劑、助懸劑混合均勻，再和制備好的明膠置旋轉(zhuǎn)壓囊機(jī)，壓制成軟膠囊，定型，干燥，即得；滴丸的制備方法為取淫羊藿苷1～10毫克、基質(zhì)20～40毫克、甲基硅油適量，將淫羊藿苷加水制成均勻糊狀，再加入溶融的基質(zhì)液，加熱熔融成澄清液體，倒入已預(yù)熱的滴丸器中，控制滴制溫度和速度，滴入甲基硅油冷凝液中，成丸后吸干冷凝液，收集滴丸，置干燥器內(nèi)，即得；糖漿劑的制備方法為取淫羊藿苷1～20克、羧甲基纖維素納1.5克、糖精鈉0.1克、矯味劑適量、防腐劑適量和純化水100毫升，將羧甲基纖維素納分散在熱水中，冷卻，然后與含有淫羊藿苷、糖精鈉、矯味劑和防腐劑的含水混懸液混合，將溶液調(diào)配成所需體積并混合均勻，滅菌后分裝，即得；注射劑的制備方法為取淫羊藿苷1～50毫克、注射用0.9％氯化鈉溶液5～10毫升，將淫羊藿苷溶解于注射用0.9％氯化鈉溶液中，并將溶液調(diào)至所需體積，調(diào)PH值，灌裝后在高溫下加熱滅菌，即得；舌下含片的制備方法為取淫羊藿苷10～400毫克、可壓蔗糖40～80毫克、硬脂酸鎂0.1～0.3毫克，將淫羊藿苷過篩后與可壓蔗糖、硬脂酸鎂混合均勻，并用沖壓裝置壓片，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了淫羊藿苷在制備治療老年癡呆的藥物中的應(yīng)用及產(chǎn)品，所述淫羊藿苷是從小檗科淫羊藿屬植物中提取的黃酮醇苷類化合物，本發(fā)明藥物制劑是以淫羊藿苷為原料制成的單方制劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所用原料及制備工藝簡單，成本低廉，療效顯著，服用量小，無毒副作用，為老年癡呆癥的治療提供了一種療效可靠的藥物。
文檔編號A61K9/48GK101129396SQ20071020129
公開日2008年2月27日 申請日期2007年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月7日
發(fā)明者石京山 申請人:遵義醫(yī)學(xué)院