專利名稱：一種治療缺血性腦損傷的組合制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療缺血性腦損傷的組合制劑，通過前列腺素El和鋰鹽 組合制劑的協(xié)同增效作用，誘導(dǎo)熱休克蛋白的生成，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，增加細(xì) 胞缺氧耐受性，抵抗腦缺血損傷。
背景技術(shù)：
腦中風(fēng)又稱腦卒中或腦血管意外，是一組以腦部缺血或出血性損傷癥狀 為主要臨床表現(xiàn)的疾病，主要分為出血性腦中風(fēng)(腦出血及蛛網(wǎng)膜下腔出血) 和缺血性腦中風(fēng)(腦梗塞及腦血栓形成)二大類，其中以缺血性腦中風(fēng)最為 常見。該病發(fā)病急，病死率高，是世界上最主要的致死性疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)， 我國(guó)每年新發(fā)完全性腦中風(fēng)120-150萬(wàn)人，死亡80-100萬(wàn)人，存活者中約 75%致殘，5年復(fù)發(fā)率高達(dá)41%;而美國(guó)每年亦有50萬(wàn)人發(fā)病，其中15萬(wàn) 人死亡。中風(fēng)的死亡率和年齡呈正相關(guān)，目前我國(guó)已ii^老年化社會(huì)，其發(fā) 病率及對(duì)國(guó)人的影響將有進(jìn)一步增加的趨勢(shì)，因此研究與開發(fā)治療中風(fēng)尤其 是缺血性腦中風(fēng)的有效藥物是醫(yī)藥界的一個(gè)重點(diǎn)課題。
目前對(duì)缺血性腦中風(fēng)尚缺乏有效治療措施，臨床上常見的治療方法有藥 物治療、導(dǎo)管插入、頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除等，其中藥物治療是最常見的方法，作 用方式包括溶栓、擴(kuò)血管或抗血小板聚集等。上述治療藥物的共同特點(diǎn)是 針對(duì)性強(qiáng)、作用環(huán)節(jié)明確、但療效單一，難以克服缺血性腦中風(fēng)引起神經(jīng)細(xì) 胞損傷的多種病理學(xué)效應(yīng)，且有不同程度的毒副作用，如溶栓藥物4艮難通過 血腦屏障進(jìn)入受損腦組織發(fā)揮作用，因而療效不肯定，且有引起再灌注損傷 及出血的副作用；擴(kuò)血管藥物可使正常部位血管擴(kuò)張，造成病變區(qū)血液流向 正常腦組織，產(chǎn)生所謂"竊血"現(xiàn)象。因此尋找具有新的作用機(jī)理，且療效 明確、毒副作用小的有效藥物是一項(xiàng)亟待探索的工作。
隨著近年來對(duì)缺血性腦中風(fēng)引起神經(jīng)細(xì)胞死亡分子機(jī)制的探討，取得了 一些令人矚目的研究逸艮其中，細(xì)胞生存/死亡的重要調(diào)節(jié)因子一熱休克 蛋白具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，增加細(xì)胞缺氧耐受性，抵抗進(jìn)一步致死性損傷的作 用，引起了人們的廣泛重視。
熱休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs )是一類高度保守的蛋白，廣 泛存在于原核生物和真核生物中，在蛋白折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝中起重要作用。 研究表明，生物體在缺血損傷時(shí)，多種HSPs如HSP70、 HSP卯和血紅素加 氧酶(hemeoxygenase, HO-l)可被大量誘導(dǎo)產(chǎn)生，參預(yù)抑制細(xì)胞損傷，調(diào) 節(jié)細(xì)胞生存，因而是治療腦缺血的重要靶點(diǎn)。
前列腺素El (Prostaglandin El， PGE1，又名前列地爾)是二十碳不飽 和羥基脂肪酸的衍生物，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于環(huán)戊烯酮前列腺素。PGE1的主要作 用是激活腺苷環(huán)化酶，升高細(xì)胞內(nèi)3， 5-環(huán)腺苷酸(cAMP )濃度，具有擴(kuò)張 血管，抑制血小板聚集，穩(wěn)定細(xì)胞膜、溶酶體膜，改善微循環(huán)，抑制炎癥細(xì) 胞浸潤(rùn)等作用，臨床用途非常廣泛，可用于多種心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸 系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的疾病，臨床上已將PGE1釆用靜脈注射的方式 治療缺血性腦損傷，但是該藥在腦缺血常規(guī)治療劑量存在著由于過度擴(kuò)張血 管引發(fā)低血壓和休克的不良反應(yīng)，降低了臨床應(yīng)用效果。最近Matsuo等發(fā) 現(xiàn)PGE1在治療肝臟缺血再灌注損傷時(shí)，顯著上調(diào)HSP70, GRP78和HSP86 蛋白表達(dá)，保護(hù)肝臟細(xì)胞。因此，我們認(rèn)為PGE1對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)機(jī) 制可能不僅與擴(kuò)血管有關(guān)，也與誘導(dǎo)HSPs表達(dá)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞有關(guān)。
鋰鹽(lithium, Li)自1949年應(yīng)用于臨床，主要用于抗燥狂，有時(shí)也對(duì)抑 郁癥有效，臨床上有情緒穩(wěn)定藥(mood stabilizing)之稱。近年研究發(fā)現(xiàn)鋰 鹽具有神經(jīng)保護(hù)作用，可用于治療慢性神經(jīng)退行性疾病如阿爾采末病、帕 金森病、Tau蛋白病變、亨廷頓舞蹈病等，作用機(jī)制包括抑制糖原合成激 酶-3 (GSK-3)谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性；上調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá) 和激活絲裂原激活蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路等。最近，Ren等發(fā)現(xiàn)，大鼠皮下 注射氯化鋰(0.5-3mmol/L，低于人等效臨床應(yīng)用劑量)具有保護(hù)缺血性腦 損傷作用，作用機(jī)制與誘導(dǎo)HSP70表達(dá)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。申請(qǐng)?zhí)?為200710027721.1的中國(guó)發(fā)明專利公布了鴒酸鋰在制藥中的應(yīng)用，特別是在 腦缺血包括腦功能障礙藥物的制備中的應(yīng)用。但是鋰鹽在臨床應(yīng)用時(shí)存在的 主要問題是安全范圍狹窄，不良反應(yīng)多且重，可能誘發(fā)消化道反應(yīng)，心血 管功能抑制和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是利用前列腺El與鋰鹽產(chǎn)生協(xié)同作用，增強(qiáng)熱休克蛋白 (HSPs)的表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，提供一種治療缺血性腦損傷的組合制劑。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種治療缺血性腦損傷的 組合制劑，其特征在于活性成分由前列腺素E1和鋰鹽組成，前列腺素E1 與鋰鹽的摩爾劑量比為2.26x105 ~ 9.04x105: 1;所述的鋰鹽選擇氯化鋰、 碳酸鋰、醋酸鋰、溴化鉀和枸櫞酸鋰中的一種。
1、上述方案中，所述前列腺素E1和鋰鹽混合制成靜脈注射或輸液合劑。
2、 上述方案中，所述前列腺素El為靜脈注射或輸液劑，鋰鹽為皮下注 射劑。
3、 上述方案中，前列腺素El和鋰鹽的摩爾劑量比為3.16xl(T5 ~ 5.88x10-5:1。
4、 上述方案中，所述的摩爾劑量比是指前列腺素El的摩爾量與鋰鹽的 摩爾量之比。
本發(fā)明工作原理是PGE1和鋰鹽治療腦缺血增效作用的機(jī)理
HSP70, HSP卯和HO-l都是熱休克蛋白(HSPs)家族的重要成員。研 究證實(shí)HSP70過表達(dá)可以保護(hù)實(shí)驗(yàn)性大鼠腦缺血模型的神經(jīng)元損傷， HSP70過表達(dá)可以下調(diào)核因子-KB(NF-KB),抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而減輕 神經(jīng)損傷。反之，HSP70基因敲除可以促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素c釋放，活化 caspase-3，進(jìn)而加重神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并增加局灶性腦缺血的腦梗塞面積。與 HSP70相似，在腦缺血過程中也伴隨著HSP卯的激活。HSP卯結(jié)合于Akt 激酶，降低細(xì)胞對(duì)凋亡刺激信號(hào)的敏感性，在高等真核生物中，HSP卯存在 兩種亞型，即HSP卯a(chǎn)和HSP90P。另外，HO-l也稱為HSP32，是一種能 降解血紅素的酶，它對(duì)局部腦缺血再灌注過程中產(chǎn)生的大量自由基有明顯的 拮抗作用，從而產(chǎn)生保護(hù)神經(jīng)元的作用。在本發(fā)明的作用中，缺血后24h大 鼠紋狀體HSP70， HSP卯卩和HO-l蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，單獨(dú)應(yīng)用PGE1 (22.6nmol/kg， 45.2nmol/kg)及氯化鋰(0.5mmol/kg)對(duì)三種蛋白的表達(dá)無 顯著影響，但是，聯(lián)合應(yīng)用PGE1和鋰鹽顯著增加HSP70, HSP90和HO-1 蛋白的表達(dá)。因此，PGE1和鋰鹽對(duì)HSPs的協(xié)同誘導(dǎo)作用在保護(hù)缺血性神 經(jīng)元損傷中起重要作用。
另外，本發(fā)明作用于受試對(duì)象后，鋰鹽對(duì)缺血?jiǎng)游锏哪X血流無明顯影響， 雖然大量報(bào)道指出PGE1具有擴(kuò)血管作用，但是在本發(fā)明的作用中，PGE1 單獨(dú)應(yīng)用以及與鋰鹽合用均對(duì)腦缺血模型大鼠的腦血流無明顯影響，這種差 異可能是由于本實(shí)驗(yàn)中PGE1的劑量較低。因此，PGE1和鋰鹽的神經(jīng)保護(hù) 增效作用與改變腦血流，擴(kuò)張腦血管無關(guān)。
由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果
1、 本發(fā)明PGE1和鋰鹽組合制劑中兩藥應(yīng)用劑量均低于臨床的兩藥常規(guī) 用量，因此可以降低不良反應(yīng)，提高療效。為缺血性腦中風(fēng)的臨床治療提供 一種新的復(fù)方制劑
2、 本發(fā)明PGE1和鋰鹽組合制劑可以顯著減少局灶性腦缺血大鼠腦梗塞
面積，改善神經(jīng)行為障礙，且組合制劑與單用組相比有明顯的增效作用。
3、本發(fā)明通過PGE1和鋰鹽組合制劑的協(xié)同增效作用，將其施用到需要 治療的人或動(dòng)物受試者，誘導(dǎo)熱休克蛋白的生成，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，增加細(xì)胞 缺氧耐受性，抵抗進(jìn)一步致死性損傷的作用。


附圖1為腦梗塞面積TTC染色(PGE1靜脈輸液劑和鋰鹽皮下注射劑)； 附圖2為腦梗塞面積定量分析(PGE1靜脈輸液劑和鋰鹽皮下注射劑)； 附圖3為PGE1輸液劑和鋰鹽注射劑減輕pMCAO致腦水腫； 附圖4為PGE1輸液劑和鋰鹽注射劑改善pMCAO致神經(jīng)行為學(xué)損傷； 附圖5為腦梗塞面積TTC染色(PGE1和鋰鹽靜脈輸液合劑)； 附圖6為腦梗塞面積定量分析(PGE1和鋰鹽靜脈輸液合劑)； 附圖7 PGE1和鋰鹽靜脈輸液合劑改善pMCAO致神經(jīng)行為學(xué)損傷； 附圖8免疫印跡法顯示PGE1和鋰鹽增強(qiáng)pMCAO誘導(dǎo)的HSP70表達(dá)； 附圖9免疫印跡法顯示PGE1和鋰鹽增強(qiáng)pMCAO誘導(dǎo)的HSP90p表達(dá)； 附圖10免疫印跡法顯示PGE1和鋰鹽增強(qiáng)pMCAO誘導(dǎo)的HO-l表達(dá)； 附圖11免疫印跡法定量分析顯示PGE1和鋰鹽增強(qiáng)pMCAO誘導(dǎo)的 HSP70表達(dá)；
附圖12免疫印跡法定量分析顯示PGE1和鋰鹽增強(qiáng)pMCAO誘導(dǎo)的 HSP90卩表達(dá)；
附圖13免疫印跡法定量分析顯示PGE1和鋰鹽增強(qiáng)pMCAO誘導(dǎo)的 HO-l表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實(shí)施例一 一種治療缺血性腦損傷的組合制劑 一、動(dòng)物和分組
健康SD大鼠，體重280-310g，分為7組，每組6只，分為j艮手術(shù)組、 模型組、PGE1 (L)、 PGE1 (S)、 Li、 PGE1 (L) +Li和PGEl ( S) +Li 共7組。PGEl (S)組缺血后立即給予22.6nmol/kg的PGE1靜脈輸液劑； PGEl (L)組缺血后立即給予45.2nmol/kg的PGEl靜脈輸液劑，速度為 lml/h。 Li組給予0.5mmol/kg的氯化鋰皮下注射劑，分為兩次給予，缺血前 24小時(shí)給藥一次，缺血前半小時(shí)給藥一次，PGEl( S )+Li組給予22.6nmol/kg 的PGEl靜樂^輸液劑和分別兩次給予0.5mmol/kg的氯化鋰皮下注射劑；
PGE1 (L) +Li組給予45.2nmol/kg的PGE1靜脈輸液劑和分別兩次給予 0.5mmol/kg的氯化鋰皮下注射劑。mol/kg中的kg表示的是大鼠的體重。
上述藥物劑量為動(dòng)物試驗(yàn)用的劑量，具體到成人時(shí)，成人的劑量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng) 為大鼠劑量的約五~七分之一，兒童用藥時(shí)使用兒童的劑量標(biāo)準(zhǔn)。
二、 永久局灶性大腦中動(dòng)脈腦缺血(pMCAO)模型的建立 大鼠4。/。7jC合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，背位固定，頸正中切口，分
離右側(cè)頸總動(dòng)脈，頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈。頸總動(dòng)脈近心端結(jié)扎， 遠(yuǎn)心端用動(dòng)脈夾阻斷血流，在此之間剪一'J、口，將一端加熱成圓珠狀，直徑 < 0.3mm的尼龍線(4-0)插入，去動(dòng)脈夾，將尼龍線緩緩?fù)迫胫燎澳X動(dòng)脈 (自頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處算起約20mm ),再向回拉2mm至大腦前動(dòng)脈起始端 (長(zhǎng)約17mm)，結(jié)扎固定尼龍線，假手術(shù)組僅分離動(dòng)脈但不插線，縫合皮膚。 手術(shù)過程中大鼠體溫保持37°C 。
三、 腦血流量測(cè)定
大鼠右頂部切口，在大鼠前囟后1.5 mm， 中線右側(cè)旁開lmm處鉆孑U 插光纖探頭到大腦皮層表面，用激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)缺血前，手術(shù)中及用 藥后30min腦血流量的變化。缺血24h后再檢測(cè)腦血流。
四、 神經(jīng)癥狀評(píng)分
腦缺血后24h行為學(xué)評(píng)分，方法如下(總分為IO分)①提鼠尾觀察前 肢有無異常表現(xiàn)。凡有左前肢內(nèi)收，內(nèi)旋者，視其輕重評(píng)為l-3分；如大鼠 表現(xiàn)為不停的向左側(cè)轉(zhuǎn)圏，評(píng)分4分。②將動(dòng)物置于光滑平面上，分別推雙 肩向?qū)?cè)移動(dòng)，檢查推擋阻力，根據(jù)向左側(cè)推擋阻力下降程度評(píng)為1-3分。 ③將動(dòng)物雙前肢置一金屬網(wǎng)上，向后輕扯鼠尾，觀察大鼠雙前肢的肌張力， 根據(jù)左前肢肌張力下降程度評(píng)為l-3分。分?jǐn)?shù)越高，動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。
五、 腦梗塞面積測(cè)定
腦缺血術(shù)后24h,動(dòng)物斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，用大鼠腦 ;漠冠狀切4刀分為5片，每片厚l,5mm。腦片用紅四氮唑(TTC )染色，染 色液成分為1.5ml (4%TTC)、 0.1ml KH2P04 (lmol/L)和3.4ml生理鹽 水，37。C避光染色30min，正常組織呈紅色，梗死組織為白色。用BioQuant IV Image analysis system軟件計(jì)算腦梗塞面積比值。
六、 腦含水量測(cè)定
腦缺血術(shù)后24h，動(dòng)物斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，稱取大腦 濕重，105。C烘烤48h至恒重，精確稱量干重，計(jì)算含水量。
七、 免疫印跡法
腦缺血術(shù)后24h，取缺血側(cè)大腦紋狀體，在組織勻漿緩沖液中用超聲波將細(xì) 胞粉碎，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜， 與特異性抗體及相應(yīng)二抗結(jié)合，ECL顯影，檢測(cè)各組HSP70, HSP卯P， HO-l 的表達(dá)，以P-actin為上樣對(duì)照，并用sigma pro 5.0進(jìn)行定量分析。
八、 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
數(shù)據(jù)均以均數(shù)士SD (Mean士SD)表示，統(tǒng)計(jì)分析釆用單因素方差分析 (one-way ANOVA )， PO.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性。
九、 結(jié)果
PGE1輸液劑、氯化鋰注射劑對(duì)大鼠pMCAO模型的影響 如附圖1和附圖2所示，單獨(dú)應(yīng)用氯化鋰皮下注射劑(0.5mmol/kg)兩 次或PGE1靜脈輸液劑(22.6nmol/kg，45.2nmol/kg)顯著降低梗塞面積。但 聯(lián)合應(yīng)用氯化鋰皮下注射劑(0.5mmol/kg)兩次和PGE1靜脈輸液劑 (45.2nmol/kg )更顯著降低梗塞面積(與PGE1 ( 45.2nmol/kg )單用組相 比P〈0.05)。另外，如附圖3和附圖4所示，雖然單獨(dú)應(yīng)用氯化鋰皮下注射 劑(0.5mmol/kg)或PGE1靜脈輸液劑(22.6nmol/kg， 45.2nmol /kg)對(duì)腦含 水量和神經(jīng)癥狀評(píng)分沒有明顯改善，但聯(lián)合應(yīng)用氯化鉀皮下注射劑 (0.5mmol/kg)兩次和PGE1靜脈輸液劑(45.2nmol /kg)顯著降低腦含水 量和神經(jīng)癥狀評(píng)分。(與PGE1 ( 45.2nmol/kg)組相比P0.05,)。
附圖1、 2、 3和4中，model組為pMCAO模型組；PGE1 (S)組給予 22.6nmol/kg的PGE1靜脈輸液劑；PGE1 ( L)組給予45.2nmol/kg的PGE1 靜脈輸液劑；Li組分兩次給予0.5mmol/kg的氯化鋰皮下注射劑；PGE1 ( S) + Li組給予22.6nmol/kg的PGE1靜脈輸液劑和分別兩次給予0.5mmol/kg 的氯化鋰皮下注射劑；PGE1 (L) +Li組給予45.2nmol/kg的PGE1靜脈 輸液劑和分別兩次給予0.5mmol/kg的氯化鋰皮下注射劑；mol/kg中的kg表 示的是大鼠的體重。Mean ± SE, * P<0.05，與pMCAO模型組相比；# P<0.05， 與PGE1 (L)組相比。(n = 6)。 PGE1和鋰鹽對(duì)腦血流量的影響。
pMCAO術(shù)后5min，腦血流量(cBF)降低到缺血前20-30 % ，并一直保 持較低水平。PGE1,氯化鋰及合用藥組在全部監(jiān)測(cè)過程中對(duì)腦血流量無顯 著影響。
PGE1和鋰鹽對(duì)HSPs的協(xié)同誘導(dǎo)作用
如附圖8、 9、 10、 11、 12和13缺血后24h，大鼠紋狀體HSP70， HSP90p 和HO-l蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，單獨(dú)應(yīng)用PGE1及氯化鋰對(duì)三種蛋白的表達(dá)無 顯著影響；但是，聯(lián)合應(yīng)用PGE1和氯化鋰顯著增加HSP70， HSP卯p和 HO-l蛋白的表達(dá)(與單用PGE1組相比，P<0.05 )。
附圖8、 9、 10、 11、 12和13中，sham組為假手術(shù)組，model組為模型 組；PGE1 (S)組給予22.6nmo1 /kg的PGE1靜脈輸液劑；PGE1 (L)組 給予45.2nmol /kg的PGE1靜脈輸液劑；Li組分兩次給予0.5mmol/kg的氯 化鋰皮下注射劑；PGEl ( S) + Li組給予22.6nmol /kg的PGEl靜脈輸液劑 和分別兩次給予0.5mmol/kg的氯化鋰皮下注射劑；PGEl (L) + Li給予 45.2nmol /kg的PGEl靜脈輸液劑和分別兩次給予0.5mmol/kg的氯化鋰皮 下注射劑；mol/kg中的kg表示的是大鼠的體重。Mean ± SE, * P<0.05與假 手術(shù)組相比；# P<0.05與才莫型組相比；$ P<0.05與PGEl( S )組相比，& P<0.05 與PGEl ( L )組相比。(n = 6 )。
實(shí)施例二 一種治療缺血性腦損傷的組合制劑
一、 動(dòng)物和分組
健康SD大鼠，體重280-310g，分為6組，每組8只，即模型組、PGEl (L)用PGEl靜脈輸液劑45.2nmol/kg、 PGEl ( S )用PGEl靜樂灘液劑 22.6nmol/kg、 Li組用氯化鋰靜脈輸液劑0.5mmol/kg、 PGEl (L) +Li MIX (45.2nmol/kg+0.5mmol/kg)靜脈輸液合劑和PGE1 ( S ) +Li (22.6nmol/kg +0.5mmol/kg)靜脈輸液合劑共6組，缺血后立即應(yīng)用PGE1、氯化鋰以及 PGE1+Li合劑，合劑為靜脈輸液劑，速度為lml/h。
上述藥物劑量為動(dòng)物試驗(yàn)用的劑量，具體到成人時(shí)，成人的劑量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng) 為大鼠劑量的約五~七分之一 ，兒童用藥時(shí)使用兒童的劑量標(biāo)準(zhǔn)。
二、 永久局灶性大腦中動(dòng)脈腦缺血(pMCAO)模型的建立 大鼠4y。水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，背位固定，頸正中切口，分
離右側(cè)頸總動(dòng)脈，頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈。頸總動(dòng)脈近心端結(jié)扎， 遠(yuǎn)心端用動(dòng)脈夾阻斷血流，在此之間剪一小口，將一端加熱成圓珠狀，直徑 < 0.3mm的尼龍線(4-0)插入，去動(dòng)脈夾，將尼龍線緩緩?fù)迫胫燎澳X動(dòng)脈 (自頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處算起約20mm )，再向回拉2mm至大腦前動(dòng)脈起始端 (長(zhǎng)約17mm)，結(jié)扎固定尼龍線，縫合皮膚。手術(shù)過程中大鼠體溫保持37。C。
三、 神經(jīng)癥狀評(píng)分
腦缺血后24h行為學(xué)評(píng)分，方法如下(總分為10分)①提鼠尾觀察前
肢有無異常表現(xiàn)。凡有左前肢內(nèi)收，內(nèi)旋者，視其輕重評(píng)為l-3分；如大鼠 表現(xiàn)為不停的向左側(cè)轉(zhuǎn)圏，評(píng)分4分。②將動(dòng)物置于光滑平面上，分別推雙 肩向?qū)?cè)移動(dòng)，檢查推擋阻力，根據(jù)向左側(cè)推擋阻力下降程度評(píng)為1-3分③ 將動(dòng)物雙前肢置一金屬網(wǎng)上，向后輕扯鼠尾，觀察大鼠雙前肢的肌張力，根 據(jù)左前肢肌張力下降程度評(píng)為l-3分。分?jǐn)?shù)越高，動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。
四、 腦梗塞面積測(cè)定
腦缺血術(shù)后24h,動(dòng)物斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，用大鼠腦 模冠狀切4刀分為5片，每片厚l.Smm。腦片用紅四氮唑(TTC )染色，染 色液成分為1.5ml 4%TTC， 0.1ml lmol/L KH2PO^， 3.4ml生理鹽水，37 。C避光染色30min，正常組織呈紅色，梗死組織為白色。用BioQuant IV Image analysis system庫(kù)欠^f牛i十算月畝梗塞面^U匕值。
五、 結(jié)果
PGE1+Li靜脈輸液合劑對(duì)大鼠pMCAO模型的影響
如附圖5、 6和7單獨(dú)用氯化鋰靜樂械液劑(0.5mmol/kg)或PGE1靜脈 輸液劑(22.6nmol/kg, 45.2nmol/kg)均顯著降低梗塞面積，改善行為學(xué)障 礙(與模型組相比P<0.05);但PGEl+Li靜脈輸液合劑(22.6nmol/kg +0.511111101/1^)更顯著降低梗塞面積，改善行為學(xué)障礙，且合劑與單用藥組相 比具有顯著的增效作用(與PGEl ( 22.6nmol/kg )組相比P<0.05 )。
附圖5、 6和7中，model組為pMCAO模型組；PGEl (S)組給予 22.6nmol/kg , 的PGEl靜脈輸液劑；PGEl (L)組給予45.2nmol /kg的 PGEl靜脈輸液劑；Li組給予0.5mmol/kg的氯化鋰靜脈輸液劑；PGEl ( S ) + Li Mix組給予22.6nmol /kg的PGEl和0.5mmol/kg的氯化鋰靜脈輸液合 劑；PGEl ( L) + Li Mix組給予45.2nmol /kg的PGEl和0.5mmol/kg的氯 化鋰靜脈輸液合劑；mol/kg中的kg表示的是大鼠的體重。Mean ± SE, * P<0.05， **P<0.01，與pMCAO才莫型組相比；#P<0.05, ##P<0.01，與PGEl (S)組相比。(n = 8)。
上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng) 技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保 護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種治療缺血性腦損傷的組合制劑，其特征在于活性成分由前列腺素E1和鋰鹽組成，前列腺素E1與鋰鹽的摩爾劑量比為2.26×10-5～9.04×10-5∶1；所述的鋰鹽選擇氯化鋰、碳酸鋰、醋酸鋰、溴化鉀和枸櫞酸鋰中的一種。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的組合制劑，其特征在于所述前列腺素E1和鋰 鹽混合制成靜脈注射或輸液合劑。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的組合制劑，其特征在于所述前列腺素E1為靜 脈注射或輸液劑，鋰鹽為皮下注射劑。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的組合制劑，其特征在于前列腺素E1和鋰鹽的 摩爾劑量比為3.16xl(T5~ 5.88xl0-s: 1。
全文摘要
一種治療缺血性腦損傷的組合制劑，活性成分由前列腺素E1和鋰鹽組成，前列腺素E1和鋰鹽可以混合制成靜脈注射或輸液合劑，也可以將前列腺素E1制成靜脈注射或輸液劑，鋰鹽制成皮下注射劑。本發(fā)明通過前列腺素E1和鋰鹽組合制劑的協(xié)同增效作用，將其施用到需要治療的人或動(dòng)物受試者，誘導(dǎo)熱休克蛋白的生成，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，增加細(xì)胞缺氧耐受性，抵抗缺血腦損傷作用。本發(fā)明PGE1和鋰鹽組合制劑中兩藥應(yīng)用劑量均低于臨床的兩藥常規(guī)用量，因此可以降低不良反應(yīng)，提高療效。為缺血性腦中風(fēng)的臨床治療提供一種新的復(fù)方制劑。
文檔編號(hào)A61K33/14GK101176735SQ200710190570
公開日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2007年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月3日
發(fā)明者瑞 盛, 秦正紅, 蓉 韓 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)