專利名稱：：一種含荷葉和田基黃總黃酮提取物的藥物復(fù)合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及抗乙肝病毒藥物，具體涉及一種含荷葉和田基黃總黃酮提取物的藥物復(fù)合物及其在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：荷葉為睡蓮科植物5lNelumbonuciferaGaertn.的干燥葉，是"藥食兩用"的食物。荷葉苦，平，歸肝、脾、胃經(jīng)，用于暑熱煩渴，暑濕泄瀉，脾虛泄瀉，血熱吐衄，便血崩漏。研究顯示，荷葉富含多種活性成分，如胡蘿卜素、黃酮、揮發(fā)油、皂類、甾體等，同時(shí)它也含有荷葉堿、N—去甲荷葉堿、O—去甲荷葉堿等多種生物堿。荷葉中富含的黃酮類物質(zhì)，是大多數(shù)氧自由基的清除劑，可以提高超氧化物歧化酶(SOD)的活力，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛(MDA)及氧化低密度脂蛋白(OX—LDL)的生成，增加冠脈流量，對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞有對(duì)抗作用；對(duì)急性心肌缺血有保護(hù)作用；對(duì)治療冠心病、高血壓等有效果；對(duì)降低舒張壓，防治心律失常、心血管病等也有重要作用；印度學(xué)者證明荷葉提取物可以有效降低小鼠的血糖水平，提高小鼠糖耐量，加強(qiáng)胰島素的作用并抑制血糖的吸收，該作用與提取物中的黃酮有關(guān)。因此荷葉黃酮是一類極有價(jià)值和待開(kāi)發(fā)的物質(zhì)，它既可作為心血管疾病的原料藥，還可廣泛應(yīng)用于功能食品、保健食品和飲料中。此外，荷葉中另一大類活性物質(zhì)-生物堿，生理活性顯著，具有明顯的降血脂、抗病毒等功效，柏田良樹(shù)等發(fā)現(xiàn)荷葉中的生物堿具有抗艾滋病毒(HIV)的作用，Boustie.J等發(fā)現(xiàn)荷葉生物堿具有抗脊髓灰質(zhì)炎病毒的作用。喻澤蘭等通過(guò)觀察荷葉水提物對(duì)小鼠的急性毒性反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在中藥毒性分析的7項(xiàng)指標(biāo)中，荷葉符合其中5項(xiàng)指標(biāo)。因此認(rèn)為荷葉水提物毒性極小，具有廣闊的應(yīng)用前景。但迄今尚物未見(jiàn)有關(guān)荷葉提取物抗乙肝病毒的報(bào)導(dǎo)。田基黃原名地耳草，始載于《生草藥性備要》、《植物名實(shí)圖考》，別名雀舌草，系藤黃科金絲桃屬植物地耳草(HypericumjaponicumThumb.)的干燥全草。味甘、微苦，性涼。歸肝、膽、大腸經(jīng)。具有清熱利濕、散瘀止痛、消腫解毒的功效。有研究從田基黃中分離出內(nèi)酯、香豆素、酚類、蒽醌、黃酮類、維生素類等有效成分。黎七雄等研究表明田基黃注射液對(duì)四氯化碳(CCl4)所致肝損傷有明顯保護(hù)作用，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示田基黃對(duì)正常小鼠肝細(xì)胞色素P-450含量無(wú)明顯影響，但能明顯恢復(fù)CCU所致的肝細(xì)胞色素P-450含量的降低，并對(duì)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(SER)具有保護(hù)作用。肝細(xì)胞色素P-450是機(jī)體解毒過(guò)程中起關(guān)鍵作用的酶系統(tǒng)，田基黃對(duì)細(xì)胞色素P-450的保護(hù)作用有利于肝臟發(fā)揮更好的解毒作用。黎七雄等在田基黃注射液對(duì)醋氨酚(AP)肝臟毒性的保護(hù)作用的研究中，發(fā)現(xiàn)田基黃注射液也有保肝作用，能提高肝細(xì)胞GSH的含量和保護(hù)微粒體GSH的活性，使生成的醋氨酚親電子活性代謝產(chǎn)物與GSH結(jié)合而排出，從而抑制醋氨酚肝脂質(zhì)過(guò)氧化，致使肝臟免受損害。方瑞英等研究結(jié)果顯示田基黃對(duì)半乳糖胺(Glan)或四氯化碳(CCU)引起原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用。許多學(xué)者研究結(jié)果表明田基黃能明顯提高外周血中性粒細(xì)胞(PMN)吞噬率、T淋巴細(xì)胞比率、脾臟特異性抗體形成細(xì)胞率以及特異性玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞數(shù)，但對(duì)血液白細(xì)胞移行抑制因子及肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能無(wú)顯著影響。說(shuō)明田基黃能提高大鼠全身的特異性和非特異性細(xì)胞免疫功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明田基黃能作用于機(jī)體的免疫器官和免疫細(xì)胞，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的分化與成熟，從而增強(qiáng)機(jī)體的特異細(xì)胞免疫和免疫調(diào)節(jié)作用；田基黃還能增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬殺菌功能，從而提高機(jī)體抗細(xì)菌感染能力，但對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能無(wú)顯著影響；田基黃對(duì)T淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞移行抑制因子的作用不明顯，但可明顯提高脾細(xì)胞中特異性抗體形成細(xì)胞的比例，顯示出對(duì)體液免疫的興奮作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的抗乙肝病毒藥物,具體涉及一種含荷葉和田基黃總黃酮提取物的藥物復(fù)合物。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述藥物復(fù)合物在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。本發(fā)明所述藥物復(fù)合物由荷葉總黃酮提取物和田基黃總黃酮提取物按2:1的重量配比組成。本發(fā)明從我國(guó)產(chǎn)的荷葉或田基黃中分別分離提取得到總黃酮提取物，二者的總黃酮提取物按2:l的重量配比制成復(fù)合物，其中的的組分之一為槲皮素-3-0-P-D-吡喃半乳糖苷。所述的復(fù)合物經(jīng)分離純化及質(zhì)譜和"C、'H測(cè)定，其中的化學(xué)組分有槲皮素、槲皮素-3-D-吡喃半乳糖、山奈酚和異槲皮素,其化學(xué)結(jié)構(gòu)分別如下所示本發(fā)明所述的藥物復(fù)合物通過(guò)下述方法制備取中藥材荷葉、田基黃，用50-95%酒精提取，濃縮，上D-101大孔樹(shù)脂，用水和酒精梯度洗脫，收集洗脫液，經(jīng)鎂粉/鹽酸檢測(cè)，收集黃酮含量高的部分，濃縮至干，分別制得荷葉、田基黃總黃酮，其中總黃酮含量分別超過(guò)50%;制得的荷葉和田基黃總黃酮以2:l的重量配比制成復(fù)合物。所述的復(fù)合物經(jīng)體外細(xì)胞模型和體內(nèi)動(dòng)物模型試驗(yàn)后，結(jié)果證實(shí)其具有較強(qiáng)的抗乙肝病毒活性。所述的復(fù)合物可進(jìn)一步制成抗乙肝病毒的膠囊、片劑、顆粒劑等藥物。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l1、提取荷葉、田基黃總黃酮分別取300克荷葉、田基黃藥材，用50-95%酒精提取三次，濃縮提取液至1/4-1/5體積，上D101大孔樹(shù)脂，用水和70%酒精洗脫，收集洗脫液，經(jīng)鎂粉/鹽酸檢測(cè)驗(yàn)證，收集黃酮含量高的部分,洗脫液濃縮至干得固形物即有效部位產(chǎn)物，稱重且測(cè)定總黃酮含量。表1是荷葉總黃酮的提取收率及總黃酮含量。表2是田基黃總黃酮的提取收率及總黃酮含量。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注總黃酮含量為總黃酮提取物中黃酮的含量表2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、取荷葉總黃酮的提取物和田基黃的總黃酮提取物以2:l的重量配比制成復(fù)合物。3、結(jié)構(gòu)鑒定制得的復(fù)合物進(jìn)行分離純化和經(jīng)質(zhì)譜和13C、'H測(cè)定，結(jié)果顯示，其中的化學(xué)組分有槲皮素、槲皮素-3-0-e-D-吡喃半乳糖、山奈酚、異槲皮素等,其化學(xué)結(jié)構(gòu)分別如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>槲皮素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>槲皮素-3-0-P-D-吡喃半乳糖<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>實(shí)施例2取荷葉總黃酮提取物50克和田基黃總黃酮提取物25克，粉碎混勻過(guò)100目篩，加入淀粉3克混合均勻，再加入10%淀粉漿適量制成軟材，20目篩網(wǎng)制粒，60_70°C干燥，過(guò)30目篩整粒，加入羥丙基纖維素3克和硬脂酸鎂1克充分混勻，壓片，薄膜包衣，即得片劑1000片。實(shí)施例3取荷葉總黃酮提取物50克和田基黃總黃酮提取物25克，粉碎混勻過(guò)100目篩，加入淀粉3克，微晶纖維適量，用稀乙醇制粒，20目篩網(wǎng)制粒，60-70t干燥，整粒，加入硬脂酸鎂適量，充分混勻，填入膠囊即得膠囊劑，1000粒。實(shí)施例4取取荷葉總黃酮提取物50克和田基黃總黃酮提取物25克，混勻粉碎過(guò)100目篩，加入淀粉300克加入10%淀粉漿適量制成顆粒，60-70t干燥，得顆粒劑，分裝200袋。實(shí)施例5抗乙肝病毒體外試驗(yàn)按衛(wèi)生部新藥臨床前藥理指南規(guī)定，采用H印G22.215細(xì)胞，對(duì)藥物的抗乙肝病毒作用進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明制得的荷葉和田基黃的總黃酮提取物的復(fù)合物具有較強(qiáng)的抑制乙肝病毒s抗原和e抗原的作用，聯(lián)合用藥比單一用藥對(duì)s抗原的抑制分別提高6.19%(荷葉)和40.62%(田基黃)，聯(lián)合用藥比單一用藥對(duì)e抗原的抑制分別提高31.90%(荷葉)和26.48%(田基黃)。表3是荷葉、田基黃總黃酮及其復(fù)合物體外抗病毒效果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>抗乙肝病毒體內(nèi)試驗(yàn)按衛(wèi)生部新藥臨床前藥理指南規(guī)定，采用北京芙蓉鴨作為乙肝新藥的動(dòng)物模型，連續(xù)給藥所述的復(fù)合物10天，分別在0天、5天、10天和停藥后3天，測(cè)定鴨血清中DNA的抑制情況。結(jié)果證明本藥物復(fù)合物，給藥量為100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg時(shí)，顯示對(duì)鴨乙肝病毒DNA有較強(qiáng)的抑制作用，其中50mg/kg的給藥量抗乙肝病毒的作用最強(qiáng)。將試驗(yàn)鴨在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出肝臟，做電鏡檢測(cè)，未見(jiàn)因乙肝病毒感染而引起的肝壞死，鴨肝臟腫脹得到明顯改善。結(jié)果證實(shí)口服荷葉、田基黃總黃酮復(fù)合物后，對(duì)鴨乙肝病毒感染引起的肝損傷有明顯的保護(hù)作用。表4是荷葉、田基黃總黃酮復(fù)合物對(duì)鴨乙肝病毒DHBV-DNA的抑制。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*Themeandifferenceissignificantatthe.05level.權(quán)利要求1、含荷葉和田基黃總黃酮提取物的藥物復(fù)合物在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。2、按權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述的藥物復(fù)合物由荷葉總黃酮提取物和田基黃總黃酮提取物按2:l的重量配比組成，所述的復(fù)合物的化學(xué)組分有槲皮素、槲皮素-3-0-e-D-吡喃半乳糖、山奈酚和異槲皮素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)分別如下3、按權(quán)利要求1的所述的用途，其特征是所述的藥物復(fù)合物通過(guò)下述方法制備取中藥材荷葉、田基黃，用50-95%酒精提取，濃縮，上D-101大孔樹(shù)脂，用水和酒精梯度洗脫，收集洗脫液，經(jīng)鎂粉/鹽酸檢測(cè)，收集黃酮含量高的部分，濃縮至干，分別制得荷葉、田基黃總黃酮，其中總黃酮含量分別超過(guò)50%;所述的荷葉、田基黃總黃酮以2:1的重量配比制成藥物復(fù)合物。4、按權(quán)利要求l的用途，其中所述的藥物復(fù)合物制成膠囊、片劑、顆粒。全文摘要本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及荷葉、田基黃總黃酮提取物制成的藥物復(fù)合物及其在制備抗乙肝病毒藥物中的新用途，本發(fā)明所述的荷葉、田基黃總黃酮是從我國(guó)產(chǎn)的荷葉、田基黃中分離提取得到總黃酮提取物，二者的復(fù)合物經(jīng)分離純化、質(zhì)譜和¹³C、¹HNMR測(cè)定，證實(shí)含有化學(xué)成分槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖、異槲皮素、山奈酚等。所述總黃酮提取物的復(fù)合物經(jīng)體外細(xì)胞模型和體內(nèi)動(dòng)物模型試驗(yàn)，證實(shí)其具有較強(qiáng)的抗乙肝病毒和保護(hù)肝臟的活性。所述總黃酮提取物復(fù)合物可進(jìn)一步制備抗乙肝病毒藥物，制成膠囊，片劑，顆粒和針劑等劑型。文檔編號(hào)A61K36/185GK101167805SQ20071017041公開(kāi)日2008年4月30日申請(qǐng)日期2007年11月14日優(yōu)先權(quán)日2007年11月14日發(fā)明者珮周,李繼揚(yáng),盛德鑫,海黃申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)