專利名稱：：分離自牛樟芝萃取物的新化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于一種新穎化合物，尤其是關(guān)于一種由牛樟芝(J"fra&acamp/zorato)萃取物中所分離純化的化合物及其于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：牛樟芝(^^ra&acflwptorato),又稱樟芝、牛樟菇或紅樟芝等，屬于非褶菌目(^/^/o/^ora/es)、多孔菌科(尸o/y/7oraceae)的多年生蕈菌類，為臺(tái)灣特有種真菌，僅生長(zhǎng)于臺(tái)灣保育類樹(shù)種-牛樟樹(shù)(C7朋"woww^we/z/ra/Hay)的中空腐朽心材內(nèi)壁上。由于牛樟樹(shù)分布數(shù)量極為稀少，加上人為的盜伐，使得寄生于其中方能生長(zhǎng)的野生牛樟芝數(shù)量更形稀少，且由于其子實(shí)體生長(zhǎng)相當(dāng)緩慢，生長(zhǎng)期亦僅在六月至十月之間，因此價(jià)格非常昂貴。牛樟芝的子實(shí)體為多年生，無(wú)柄，呈木栓質(zhì)至木質(zhì)，其具強(qiáng)烈的樟樹(shù)香氣，且形態(tài)多變化，有板狀、鐘狀、馬蹄狀或塔狀。初生時(shí)為扁平型并呈鮮紅色，之后其周邊會(huì)呈現(xiàn)放射反巻狀，并向四周擴(kuò)展生長(zhǎng)，顏色亦轉(zhuǎn)變?yōu)榈t褐色或淡黃褐色，并有許多細(xì)孔，且其為牛樟芝藥用價(jià)值最豐富的部位。在臺(tái)灣民俗醫(yī)學(xué)上，牛樟芝具有解毒、減輕腹瀉癥狀、消炎、治療肝臟相關(guān)疾病及抗癌等功用。牛樟芝如同一般食藥用的蕈菇類，具有許多復(fù)雜的成分，已知的生理活性成分中，包括三碎類化合物(triterpenoids)、多糖體(polysaccharides,如(3-D-葡聚糖)、腺苷(adenosine)、維生素(如維生素B、煙堿酸)、蛋白質(zhì)(含免疫球蛋白)、超氧歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、微量元素(如鈣、磷、鍺)、核酸、固醇類以及血壓穩(wěn)定物質(zhì)(如antodiaacid)等，這些生理活性成分被認(rèn)為具有抗腫瘤、增加免疫能力、抗過(guò)敏、抗病菌、抗高血壓、降血糖及降膽固醇等多種功效。牛樟芝眾多成分中以三萜類化合物被研究的最多，三萜類化合物是由三十個(gè)碳元素結(jié)合成六角形或五角形天然化合物的總稱，牛樟芝所具的苦味即主要來(lái)自三碎類此成分。1995年時(shí)，Chemg等人發(fā)現(xiàn)牛樟芝子實(shí)體萃取物中含有三種新的以麥角甾烷(ergostane)為骨架的三碎類化合物antcinA、antcinB與antcinC(Chemg，I.H.,andChiang,H.C.1995.Threenewtriterpenoidsfrom爿wfra^3cz,"加momea.J.Nat.Prod.58:365-371)。Chen等人以乙醇萃取樟芝子實(shí)體后發(fā)現(xiàn)zhankuicacidA、zhankuicacidB及zhankuicacidC等三種三萜類化合物(Chen,C.H.，andYang,S.W.1995.Newsteroidacidsfrom"'朋amowea，—afungusparasiticonCV"w，ow謂w/cra涵謂.J.Nat.Prod.58:1655-1661)。此外，Chiang等人于1995年也由子實(shí)體萃取物中發(fā)現(xiàn)另外三種分別為倍半薛內(nèi)酯(sesquiterpenelactone)與兩種雙酚類衍生物的新三碎類化合物，此即antrocin,4，7-二甲氧基-5-曱基-1,3-苯并二氧環(huán)(4，7-dimethoxy-5-methy-l,3-benzodioxole)與2,2',5，5'-四曱氧基-3，4,3',4'-雙-亞甲二氧基-6，6'-二曱基聯(lián)苯(2,2',5,5'-teramethoxy-3，4，3',4'-bi-methylenedioxy-6，6'-dimethylbiphenyl)(Chiang,H.C.，Wu，D.P"Chemg，I.W"andUeng，C.H.1995.Asesquiterpenelactone,phenylandbiphenylcompoundsfromJwfro(i/ac/ww(2附owa2.Phytochemistry.39:613-616)。到了1996年，Cherng等人以同樣分析方法再度發(fā)現(xiàn)四種新的三萜類化合物antcinE、antcinF、methylantcinateG、methylantcinateH(Chemg,LH.,Wu，D.P.,andChiang,H.C.1996.Triteroenoidsfrom^w加(i/ac/"w蘭o膨a.Phytochemistry.41:263-267);而Yang等人則發(fā)現(xiàn)了二種以麥角甾烷為骨架的新化合物zhankuicaddD、zhankuicacidE，以及三種以羊毛甾烷(lanostane)為骨架的新化合物15a-乙酰-去氪石危色多孑L菌酸(15a-acetyl曙dehydrosulphurenicacid)、去氫齒孑L酸(dehydroeburicoicacid)與去7JC石克色多孑li菌酸(dehydrasulphurenicacid)(Yang,S.W.，Shen,Y.C.，andChen,C.H.1996.Steroidsandtriterpenoidsofc/wwawomea-afimgusparasiticonC7""owowwwm/cn3"f/2wm.Phytochemistry.41:1389-1392)。雖然由目前諸多的實(shí)驗(yàn)可得知牛樟芝萃取物具有抑癌的功效(如前述Chen(1995)),但究竟為何種有效成分可達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞效果的研究，目前則仍處于試驗(yàn)階段，并未有具體的有效成分發(fā)表，故若能將該萃取物進(jìn)一步純化分析，找出其真正有效抑癌成分，對(duì)于人類癌癥的治療實(shí)將產(chǎn)生莫大的幫助。
發(fā)明內(nèi)容為明了牛樟芝萃取物中究竟是何成分具有抑癌的效果，本發(fā)明由牛樟芝萃取物中分離純化出具下列結(jié)構(gòu)式的新穎化合物；如式(l)結(jié)構(gòu)式的化合物，其中，X是氫氧基(OH)或曱氧基(OCH3)。當(dāng)式(1)結(jié)構(gòu)式化合物中的X為氫氧基(OH)時(shí)，其結(jié)構(gòu)式如下CH3HOH3C^、0\如式(2)結(jié)構(gòu)式的化合物，其化學(xué)名為AntroquinonolB，分子式為C24H3805,分子量為406。當(dāng)式(1)結(jié)構(gòu)式化合物中的X為曱氧基(OCH3)時(shí)，其結(jié)構(gòu)式如下:H3CO.恥CH3(3)如式(3)結(jié)構(gòu)式的化合物，其化學(xué)名為AntroquinonolC,分子式為C25H4Q05,分子量為420。本發(fā)明中AntroquinonolB與AntroquinonolC的化合物分離純化自牛樟芝水萃取物或有機(jī)溶劑萃取物，有機(jī)溶劑可包括醇類(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或卣烷(例如氯曱烷、氯乙烷)，但并不以此為限，其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。藉由前述化合物，本發(fā)明將其應(yīng)用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)上，使能進(jìn)一步應(yīng)用于治療癌癥的醫(yī)藥組成^f分中，增益癌癥的治療效果。本發(fā)明化合物得應(yīng)用的范圍包括對(duì)于乳癌腫瘤細(xì)胞、肺癌腫瘤細(xì)胞、肝癌腫瘤細(xì)胞與前列腺癌腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制效果，使所述腫瘤細(xì)胞無(wú)法迅速生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制腫瘤的增生，延緩胂瘤的惡化，因此，可進(jìn)一步利用于乳癌、肺癌、肝癌與前列腺癌等癌癥的治療。另一方面，本發(fā)明中亦可將式(2)或/與式(3)的化合物利用于治療乳癌、肺癌、肝癌與前列腺癌等醫(yī)藥組合物的成分中，藉以抑制所述腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。前述醫(yī)藥組合物除包括有效劑量的AntroquinonolB與AntroquinonolC化合物外，尚可包括藥學(xué)上可接受的載體。載體可為賦形劑(如水)、填充劑(如蔗糖或淀粉)、黏合劑(如纖維素衍生物)、稀釋劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑或甜味劑，但并未僅限于此。本發(fā)明醫(yī)藥組合物可依一般習(xí)知藥學(xué)的制備方法生產(chǎn)制造，將AntroquinonolB與AntroquinonolC有效成分劑量與一種以上的載體相混合，制備出所需的劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠嚢或其它液體制劑，但未以此為限。以下將配合圖式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，下述所列舉的實(shí)施例用以闡明本發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍，任何熟習(xí)此技藝者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可做些許更動(dòng)與潤(rùn)飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視后附的權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。具體實(shí)施例方式首先取牛樟芝(j"ra^3caw//2orato)菌絲體、子實(shí)體或二者的混合物，利用習(xí)知萃取方式，以水或有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，藉以取得牛樟芝水萃取物或有機(jī)溶劑萃取物。其中，有機(jī)溶劑可包括醇類(例如曱醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或卣烷(例如氯曱烷、氯乙烷)，但并不以此為限。其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。經(jīng)萃取過(guò)后的牛樟芝水萃取物或有機(jī)溶劑萃取物，可進(jìn)一步通過(guò)高效液相層析(HPLC)加以分離純化，之后再對(duì)每一分液(fraction)進(jìn)行抑癌效果的測(cè)試。最后，則針對(duì)具抑癌效果的分液進(jìn)行成分分析，將可能產(chǎn)生抑癌效果的成分再分別進(jìn)一步做不同癌癥腫瘤細(xì)胞的抑制效果測(cè)試。最終即發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中AntroquinonolB與AntroquinonolC化合物具有抑制乳癌、肺癌、肝癌與前列腺癌等癌癥腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效果，且經(jīng)與習(xí)知文獻(xiàn)比對(duì)后，該化合物并未曾發(fā)現(xiàn)于牛樟芝中，因此為新穎的化合物。此外，為證實(shí)AntroquinonolB與AntroquinonolC對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果，本發(fā)明中以MTT分析法，根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(NationalCancerInstitute,NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，對(duì)包括乳癌、肺癌、肝癌與前列腺癌等胂瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞存活率的測(cè)試。由該些測(cè)試證實(shí)，AntroquinonolB與AntroquinonolC對(duì)于乳癌胂瘤細(xì)胞(包括MCF-7與MDA-MB-231)、肺癌腫瘤細(xì)胞(包括A549)、肝癌肺瘤細(xì)胞(包括Hep3B與HepG2)以及前列腺癌腫瘤細(xì)胞(包括LNCaP與DU-145)等皆可降低其存活率，相對(duì)之下并可同時(shí)降低生長(zhǎng)半抑制率所需濃度(即ICso值)，因此得藉由AntroquinonolB與AntroquinonolC應(yīng)用于包括乳癌、肺癌、肝癌與前列腺癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制上，而進(jìn)一步可利用于乳癌、肺癌、肝癌與前列腺癌等癌癥的治療。茲對(duì)前述實(shí)施方式詳盡說(shuō)明如下實(shí)施例1:AntroquinonolB與AntroquinonolC的分離將100克左右的牛樟芝菌絲體、子實(shí)體或二者的混合物，置入三角錐形瓶中，加入適當(dāng)比例的水與醇類(70%100%醇類水溶液)，于2025。C下攪拌萃取至少l小時(shí)以上，之后以濾紙及0.45(im濾膜過(guò)濾，收集萃取液。將前述收集的牛樟芝萃取液，利用高效液相層析儀(HighPerformanceLiquidchromatography),以RP18的層析管(column)進(jìn)行分析，并以曱醇(A)及0.1°/。~0.5%醋酸水溶液(B)做為移動(dòng)相(mobilephase)(其溶液比例是010分鐘，B比例為95%~20%;10~20分鐘，B比例為20%10%;20-35分鐘，B比例為10%90%;35~40分鐘，B比例為10%~95%)，在每分鐘1ml的速度下沖提，同時(shí)以紫外-可見(jiàn)光全波長(zhǎng)偵測(cè)器分析。將21.2分鐘至21.4分鐘的沖提液收集濃縮即可得淡黃色的液體產(chǎn)物，此即AntroquinonolB。經(jīng)分析，該化合物的分子式為C24H3805，分子量406。核磁共振(NMR)分析值則如下所示^-NMR(CDCl3)5(ppm):核磁共振(NMR)分析值則如下所示iH誦NMR(CDCl3)5(ppm):1.21、1.36、1.67、1.71、1.75、1.94、2.03、2.07、2.22、2.25、3.68、4.05、5.71與5.56。13C-NMR(CDC13)5(ppm):12.31、16.1、16.12、17.67、25.67、26.44、26.74、27.00、30.10、40.27、43.34、59.22、60.59、71.8、120.97、123.84、124.30、131.32、134.61、135.92、138.05、160.45與197.11。將23.7分鐘至24.0分鐘的沖提液收集濃縮即可得淡黃色的液體產(chǎn)物，此即AntroquinonolC。經(jīng)分析，該化合物的分子式為C25H4G05，分子量420。核磁共振(NMR)分析值則如下所示^-NMR(CDCl3)5(ppm):核磁共振(NMR)分析值則如下所示'H-NMR(CDCl3)5(ppm):1.21、1.36、1.71、1.75、1.94、2.03、2.07、2.22、2.25、3.24、3.68、4.05、5.12、5.50與5.61。13C-NMR(CDC13)5(ppm):12.31、16.1、16.12、17.67、24.44、26.44、26.74、27.00、37.81、39.81、4.027、43.34、49.00、59.22、60.59、120.97、123.84、124.30、135.92、138.05、160.45與197.12。將AntroquinonolB與AntroquinonolC與化學(xué)式數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，并未發(fā)現(xiàn)與前述相同的化合物結(jié)構(gòu)，因此，這些化合物為新穎且前所未見(jiàn)的化合物。實(shí)施例2:體外抗乳癌腫瘤細(xì)胞的活性測(cè)試為進(jìn)一步測(cè)試實(shí)施例1中所發(fā)現(xiàn)化合物對(duì)肺瘤細(xì)胞的抑制效果，本實(shí)施例將根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(NationalCancerInstitute,NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，首先取實(shí)施例1中所分離的AntroquinonolB與AntroquinonolC化合物，加入含有人類乳癌腫瘤細(xì)胞MCF-7與MDA-MB-231的培養(yǎng)液中，以進(jìn)行腫瘤細(xì)胞存活率的測(cè)試。細(xì)胞存活率的測(cè)試可采習(xí)知的MTT分析法進(jìn)行分析，而MCF-7與MDA-MB-231皆是人類的乳癌腫瘤細(xì)胞系，其中，MCF-7為原發(fā)性乳癌或早期乳癌的癌細(xì)胞，其對(duì)雌激素具高度^:感性，因此其為雌激素依賴型(estrogen-dependent)乳癌細(xì)胞；MDA-MB-231則屬于不受雌激素影響的非雌激素依賴型(estrogen-independent)乳癌細(xì)胞，其在臨床醫(yī)學(xué)上的治療極為不易且治愈率偏低。MTT分析法是一種常見(jiàn)用于分析細(xì)胞增生(cellproliferation)、存活率(percentofviablecells)以及細(xì)胞毒性(cytotoxicity)的分析方法。其中，MTT(3-[4,5-dimethylthiazol曙2-yl〗2，5-diphenyltetrazoliumbromide)為一種黃色染劑，它可^皮活細(xì)胞吸收并^皮線粒體中的琥珀酸四唑還原酶(succinatetetrazoliumreductase)還原成不溶水性且呈藍(lán)紫色的formazan,因此通過(guò)formazan形成與否，即可判斷并計(jì)算細(xì)胞的存活率。首先將人類乳癌細(xì)胞MCF-7(購(gòu)自食品工業(yè)研究所，細(xì)胞抹編號(hào)BCRC60436)與MDA-MB-231(購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生研究院，細(xì)胞抹編號(hào)CCRC60425)分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)。將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于1,200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入10ml的新培養(yǎng)液，輕孩i搖晃使細(xì)胞再次懸浮，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)。測(cè)試時(shí)，分別于每一孔內(nèi)加入30、10、3、1、0.3、0.1與0.03^g/ml牛樟芝粗萃取物(對(duì)照組，未經(jīng)純化分離的牛樟芝乙醇總萃取物)以及AntroquinonolB與AntroquinonolC(試驗(yàn)組)，于37°C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，在避光的環(huán)境下于每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT,反應(yīng)4小時(shí)后再于每一孔內(nèi)加入100pl的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酶免疫分析儀在570nm吸光波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，藉以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其生長(zhǎng)半抑制率所需濃度(即IC50值)，其結(jié)果如表l所示。表1:體外對(duì)乳癌腫瘤細(xì)胞存活率的測(cè)試結(jié)果IC50(pg/ml)_MCF-7MDA-MB-231<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表1中可知，藉由AntroquinonolB與AntroquinonolC的作用，其可有效降低雌激素依賴型人類乳癌肺瘤細(xì)胞MCF-7的存活率，相較于對(duì)照組牛樟芝粗萃取物所測(cè)得的人類乳癌腫瘤細(xì)胞MCF-7的ICso值(11.13ng/ml)，經(jīng)AntroquinonolB處理人類乳癌胂瘤細(xì)胞MCF-7后，其ICs。值可降低至1.94pg/ml,與對(duì)照組相比對(duì)換算得IC5Q值的降低比率約為82.56%,而經(jīng)AntroquinonolC處理人類乳癌腫瘤細(xì)胞MCF-7后，其ICso值為1.17|_ig/ml,與對(duì)照組相比對(duì)換算得IC5Q值的降低比率約為89.49%，這些結(jié)果顯示兩化合物對(duì)人類乳癌腫瘤細(xì)胞MCF-7的生長(zhǎng)半抑制率所需濃度皆相對(duì)大幅低于對(duì)照組，因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中所分離萃取的AntroquinonolB與AntroquinonolC確實(shí)能夠利用于雌激素依賴型乳癌腫瘤細(xì)胞MCF-7生長(zhǎng)的抑制。另一方面，相較于對(duì)照組牛樟芝粗萃取物所測(cè)得的IC5o值(25.81ng/ml),AntroquinonolB與AntroquinonolC皆可有效抑制非雌激素依賴型人類乳癌腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231的生長(zhǎng)，經(jīng)AntroquinonolB與AntroquinonolC處理人類乳癌腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231后，其1<:5()值可分別降低至8.72pg/ml與21.9pg/ml,與對(duì)照組相比對(duì)換算得IC5o值的降低比率分別約為66.21%與15.15%,此結(jié)果顯示AntroquinonolB與AntroquinonolC對(duì)人類乳癌腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231的生長(zhǎng)半抑制率所需濃度皆相對(duì)低于對(duì)照組，其中又以AntroquinonolB的抑制效果為最佳，因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中所分離萃取的AntroquinonolB與AntroquinonolC確實(shí)能夠利用于非雌激素依賴型乳癌肺瘤細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)的抑制。實(shí)施例3:體外抗肺癌肺瘤細(xì)胞的活性測(cè)試本測(cè)試也根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所抗腫瘤藥物篩檢模式進(jìn)行，將實(shí)施例1中所分離的AntroquinonolB與AntroquinonolC化合物，加入含有人類肺癌胂瘤細(xì)胞A549的培養(yǎng)液中，并釆前述MTT分析法進(jìn)4亍分析，藉以測(cè)試肺癌腫瘤細(xì)胞存活率。首先將人類肺癌細(xì)胞A549(購(gòu)自食品工業(yè)研究所，細(xì)胞抹編號(hào)為BCRC60074)分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)。將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于1,200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入10ml的新培養(yǎng)液，輕^f效搖晃使細(xì)胞再次懸浮，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)。測(cè)試時(shí)，分別于每一孔內(nèi)加入30、10、3、1、0.3、0.1與0.03|ig/ml牛樟芝粗萃取物(對(duì)照組，未經(jīng)純化分離的牛樟芝乙醇總萃取物)以及AntroquinonolB與AntroquinonolC(試驗(yàn)組)，于37°C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，在避光的環(huán)境下于每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT,反應(yīng)4小時(shí)后再于每一孔內(nèi)加入100pi的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酶免疫分析儀在570nm吸光波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，藉以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其生長(zhǎng)半抑制率所需濃度(ICso值)，其結(jié)果如表2所示。表2:體外對(duì)肺癌胂瘤細(xì)胞存活率的測(cè)試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>B與AntroquinonolC可有效降低人類肺癌腫瘤細(xì)胞A549的存活率，相較于對(duì)照組牛樟芝粗萃取物所測(cè)得的人類肺癌胂瘤細(xì)胞A549的ICso值(13.21pg/ml),經(jīng)AntroquinonolB與AntroquinonolC處理人類肺癌腫瘤細(xì)胞A549后，其IC5Q值可分別降低至11.9pg/ml與8.21|ug/ml，與對(duì)照組相比對(duì)換算得IC5o值的降低比率分別約為9.92%與37.85%，這些結(jié)果顯示兩化合物對(duì)人類肺癌腫瘤細(xì)胞A549的生長(zhǎng)半抑制率所需濃度皆相對(duì)低于對(duì)照組，其中又以AntroquinonolC的抑制效果為最佳，因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中所分離萃取的AntroquinonolB與AntroquinonolC確實(shí)能夠利用于人類肺癌腫瘤細(xì)胞A549生長(zhǎng)的抑制。實(shí)施例4:體外抗肝癌腫瘤細(xì)胞的活性測(cè)試本測(cè)試也根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所抗腫瘤藥物篩檢模式進(jìn)行，將實(shí)施例1中所分離的AntroquinonolB與AntroquinonolC化合物，加入含有人類肝癌腫瘤細(xì)胞Hep3B與HepG2的培養(yǎng)液中，并采前述MTT分析法進(jìn)行分析，藉以測(cè)試肝癌腫瘤細(xì)胞存活率，其中Hep3B與HepG2皆是人類的肝癌腫瘤細(xì)胞系。首先將人類肝癌細(xì)胞Hep3B(購(gòu)自食品工業(yè)研究所，細(xì)胞編號(hào)為BCRC60434)與HepG2(購(gòu)自食品工業(yè)研究所，細(xì)胞編號(hào)為BCRC60025)分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)。將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以l倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于1,200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入10ml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮，再將細(xì)胞分置于96孔孩i量盤內(nèi)。測(cè)試時(shí)，分別于每一孔內(nèi)加入30、10、3、1、0.3、0.1與0.03lag/ml牛樟芝粗萃取物(對(duì)照組，未經(jīng)純化分離的牛樟芝乙醇總萃取物)以及AntroquinonolB與AntroquinonolC(試驗(yàn)組)，于37°C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，在避光的環(huán)境下于每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT，反應(yīng)4小時(shí)后再于每一孔內(nèi)加入100^的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酶免疫分析儀在570nm吸光波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，藉以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其生長(zhǎng)半抑制率所需濃度(即IC5Q值)，其結(jié)果如表3所示。表3:體外對(duì)肝癌肺瘤細(xì)胞存活率的測(cè)試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表3中可知，藉由AntroquinonolB與AntroquinonolC的作用,其可有效降低人類肝癌腫瘤細(xì)胞Hep3B及HepG2的存活率。相較于對(duì)照組牛樟芝粗萃取物所測(cè)得的人類肝癌肺瘤細(xì)胞Hep3B的IC5Q值(5.10pg/ml)，經(jīng)AntroquinonolB處理后的IQo值為1.21pg/ml,經(jīng)與對(duì)照組比對(duì)換算得1(:50值的降低比率約為76.27%，而經(jīng)AntroquinonolC處理人類肝癌腫瘤細(xì)胞Hep3B后的ICso值為1.32^ig/ml,經(jīng)與對(duì)照組比對(duì)換算得ICs()值的降低比率約為74.12%,此表示兩化合物對(duì)于人類肝癌腫瘤細(xì)胞Hep3B生長(zhǎng)半抑制率所需濃度皆大幅低于對(duì)照組；相較于對(duì)照組牛樟芝粗萃取物所測(cè)得的人類肝癌腫瘤細(xì)胞HepG2的ICso值(18.63pg/ml),經(jīng)AntroquinonolB處理后的1(350值為3.32pg/ml,經(jīng)與對(duì)照組比對(duì)換算得IC5o值的降低比率約為82.18%，而經(jīng)AntroquinonolC處理人類肝癌腫瘤細(xì)胞Hep3B后的ICso值為5.12|ug/ml,經(jīng)與對(duì)照組比對(duì)換算得IC5o值的降低比率約為72.52%，此表示兩化合物對(duì)于人類肝癌腫瘤細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)半抑制率所需濃度皆大幅低于對(duì)照組，因此，由該些結(jié)果可證實(shí)牛樟芝萃取物中所分離萃取的AntroquinonolB與AntroquinonolC確實(shí)能夠利用于肝癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。此外，由表3中亦可發(fā)現(xiàn)，經(jīng)AntroquinonolB處理后的癌細(xì)胞IC5o值低于經(jīng)AntroquinonolC處理后的癌細(xì)胞ICs()值，此顯示僅需較低濃度的AntroquinonolB便可有效抑制半數(shù)人類肝癌腫瘤細(xì)胞H印3B與HepG2的生長(zhǎng)，因此AntroquinonolB抑制肝癌細(xì)胞的功效優(yōu)于AntroquinonolC。實(shí)施例5:體外抗前列腺癌腫瘤細(xì)胞的活性測(cè)試本測(cè)試也根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所抗腫瘤藥物篩抬r模式進(jìn)行，將實(shí)施例1中所分離的AntroquinonolB與AntroquinonolC化合物，加入含有人類前列腺癌腫瘤細(xì)胞LNCaP與DU-145的培養(yǎng)液中，并采前述MTT分析法進(jìn)行分析，藉以測(cè)試前列腺癌腫瘤細(xì)胞存活率，而LNCaP與DU-145皆是人類的前列腺癌腫瘤細(xì)胞系，其中，LNCaP為發(fā)源于前列腺腺體上皮細(xì)胞的癌癥，且癌細(xì)胞生長(zhǎng)初期需倚賴男性荷爾蒙，因此其屬于男性荷爾蒙依賴型(androgen-dependent)前列A泉癌細(xì)胞；DU-145則屬于復(fù)發(fā)型前列腺癌細(xì)胞，其不需倚賴男性荷爾蒙便能夠生長(zhǎng)，故屬于非男性荷爾蒙依賴型(androgen-independentprostatecancer)前列A袈癌纟田月包，而這種復(fù)發(fā)的癌癥至今仍未發(fā)現(xiàn)有效的治療方式。首先將人類前列腺癌細(xì)胞LNCaP(購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生研究院，細(xì)胞抹編號(hào)為CCRC60088)與DU-145(購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生研究院，細(xì)胞林編號(hào)為CCRC60348)分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)。將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于1,200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入10ml的新培養(yǎng)液，輕^t搖晃使細(xì)胞再次懸浮，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)。測(cè)試時(shí)，分別于每一孔內(nèi)加入30、10、3、1、0.3、0.1與0.03iLig/ml牛樟芝粗萃取物(對(duì)照組，未經(jīng)純化分離的牛樟芝乙醇總萃取物)以及AntroquinonolB與AntroquinonolC(試驗(yàn)組)，于37°C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，在避光的環(huán)境下于每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT,反應(yīng)4小時(shí)后再于每一孔內(nèi)加入100|il的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酶免疫分析儀在570nm吸光波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，藉以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其生長(zhǎng)半抑制率所需濃度(即ICso值)，其結(jié)果如表4所示。表4:體外對(duì)前列腺癌腫瘤細(xì)胞存活率的測(cè)試結(jié)果測(cè)試樣口OIC50(pg/ml)LNCaPDU-145對(duì)照組牛樟芝粗萃取物11.4941.39實(shí)驗(yàn)組AntroquinonolB5.6710.12AntroquinonolC8.7212.21由表4中可知，藉由AntroquinonolB與AntroquinonolC的作用，其可有效降低人類前列腺癌腫瘤細(xì)胞LNCaP與DU-145的存活率。相較于對(duì)照組牛樟芝粗萃取物所測(cè)得的IQo值(LNCaP:11.49嗎/ml與DU-145:41.39|ig/m),AntroquinonolB與AntroquinonolC對(duì)于人類前列腺癌腫瘤細(xì)月包LNCaP的IC50值可分別降至5.67pg/ml與8.72pg/ml，經(jīng)與對(duì)照組比對(duì)換算得1(35。值的降低比率分別為50.65%以及24.11%，且AntroquinonolB與AntroquinonolC對(duì)于人類前列腺癌腫瘤細(xì)胞DU-145的ICs。值亦可分別降至10.12pg/ml與12.21|ug/ml，經(jīng)與對(duì)照組比對(duì)換算得IC5Q值的降低比率分別為75.55%以及70.5%，此表示兩化合物對(duì)于人類前列癌腫瘤細(xì)胞LNCaP與DU-145生長(zhǎng)半抑制率所需濃度皆可大幅低于對(duì)照組，因此，由該些結(jié)果可證實(shí)牛樟芝萃取物中所分離得的AntroquinonolB與AntroquinonolC確實(shí)能夠利用于前列腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制；此外，由表4中亦可發(fā)現(xiàn)，經(jīng)AntroquinonolB處理后的癌細(xì)胞ICsoY直遠(yuǎn)小于經(jīng)AntroquinonolC處理后的癌細(xì)月包IC50{￡，；t匕顯示AntroquinonolB抑制前列腺癌細(xì)胞的功效優(yōu)于AntroquinonolC。另一方面，由前述結(jié)果可知，AntroquinonolB與AntroquinonolC皆可有效抑制具有不同特性的前列腺癌腫瘤細(xì)胞LNCaP與DU-145的生長(zhǎng)，此顯示AntroquinonolB與AntroquinonolC除可應(yīng)用于抑制男性荷爾蒙依賴型前列腺癌細(xì)胞LNCaP，亦可利用于抑制非男性荷爾蒙依賴型前列腺癌細(xì)胞DU-145的生長(zhǎng)上，藉以幫助于前列腺癌與再?gòu)?fù)發(fā)性前列腺癌的治療。綜上所述，本發(fā)明自牛樟芝萃取物中所分離出的新化合物AntroquinonolB與AntroquinonolC可有效抑制乳癌、肺癌、肝癌與前列腺癌等人類腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此該些化合物可用于抑制前述腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的醫(yī)藥組合物的成分中，此醫(yī)藥組合物除包含有效劑量的牛樟芝AntroquinonolB與AntroquinonolC化合物外，尚可包括藥學(xué)上可接受的載體。載體可為賦形劑(如水)、填充劑(如蔗糖或淀粉)、黏合劑(如纖維素衍生物)、稀釋劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑或甜味劑，但并未僅限于此。本發(fā)明醫(yī)藥組合物可依一般習(xí)知藥學(xué)的制備方法生產(chǎn)制造，將有效成分劑量的所述牛樟芝化合物與一種以上的載體相混合，制備出所需的劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠嚢或其它液體制劑，但未以此為限。權(quán)利要求1.一種具下列結(jié)構(gòu)式的化合物其中，X是氫氧基(OH)或甲氧基(OCH3)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述化合物分離自牛樟芝。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，當(dāng)X為氫氧基(OH)時(shí)，所述化合物為AntroquinonolB。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中，所述化合物AntroquinonolB分離自牛樟芝。5.沖艮據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，當(dāng)X為甲氧基(OCH3)時(shí)，所述4匕合物為AntroquinonolC。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其中，所述化合物AntroquinonolC分離自牛樟芝。7.—種用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的如權(quán)利要求3所述化合物，其中，所述腫瘤細(xì)胞為乳癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物，其中，所述乳癌細(xì)胞為MCF-7或MDA-MB-231細(xì)胞系。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述用于抑制胂瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物，其中，所述肝癌細(xì)胞為Hep3B或HepG2細(xì)胞系。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物，其中，所述前列癌細(xì)胞為L(zhǎng)NCaP或DU145細(xì)胞系。11.一種用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的醫(yī)藥組合物，其至少包括有效劑量如權(quán)利要求3所述的化合物以及醫(yī)學(xué)上可接受的載體，其中，所述腫瘤細(xì)胞為乳癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞或前列^泉癌細(xì)胞。12.—種用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的如權(quán)利要求5所述化合物，其中，所述腫瘤細(xì)胞為乳癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物，其中，所述乳癌細(xì)胞為MCF-7或MDA-MB-231細(xì)胞系。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述用于抑制肺瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物，其中，所述肝癌細(xì)胞為Hep3B或HepG2細(xì)胞系。15.根據(jù)權(quán)利要求12所述用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物，其中，所述前列癌細(xì)胞為L(zhǎng)NCaP或DU145細(xì)胞系。16.—種用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的醫(yī)藥組合物，其至少包括有效劑量如權(quán)利要求5所述的化合物以及醫(yī)學(xué)上可接受的載體，其中，所述腫瘤細(xì)胞為乳癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明是關(guān)于一種新穎化合物及其用途，尤其是關(guān)于一種由牛樟芝萃取物中所分離出的AntroquinonolB與AntroquinonolC并可有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明中，前述化合物首見(jiàn)于牛樟芝中，其可應(yīng)用于抑制乳癌、肺癌、肝癌與前列腺癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)可作為抑制前述腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的醫(yī)藥組合物的成分。文檔編號(hào)A61P35/00GK101417934SQ200710167420公開(kāi)日2009年4月29日申請(qǐng)日期2007年10月24日優(yōu)先權(quán)日2007年10月24日發(fā)明者劉勝勇,溫武哲,郭茂田申請(qǐng)人:國(guó)鼎生物科技股份有限公司