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油酰胺水解酶的抑制劑的制作方法

文檔序號(hào):1133057閱讀:204來源:國知局
專利名稱:油酰胺水解酶的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及油酰胺(oleamide)水解酶抑制劑以及涉及關(guān)于油酰胺誘導(dǎo)睡眠的興奮劑。更確切的說,本發(fā)明涉及能夠顯示關(guān)于油酰胺水解酶抑制活性和/或關(guān)于油酰胺誘導(dǎo)睡眠的興奮活性的過渡態(tài)模擬和機(jī)理為基礎(chǔ)的(transition-state-mimetic and mechanism-based)的油酰胺衍生物。

背景技術(shù)
油酰胺(1,順-9-十八烯酰胺(octadenamide))是天然存在于腦組織中的一種成份,在睡眠缺乏和睡眠恢復(fù)的狀態(tài)下分別顯示出它的累積和消失(Cavat et al.,Science 1995,268,1506-1509;Lerner etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1994,91,9505-9508;Cravattet al.,J.Am.Chem.Soc.1996,118,580-590)。在特殊結(jié)構(gòu)的方式上,當(dāng)以毫微摩爾量靜脈注射時(shí),1在動(dòng)物體上已顯示可誘導(dǎo)生理性睡眠(Caravat et al.,Science 1995,268,1506-1509)。用存在于細(xì)胞膜上的酶(油酰胺水解酶)水解1可迅速將油酰胺降解成油酸(順-9-十八烯酸)。在努力分離用于控制內(nèi)源性1濃度的調(diào)節(jié)劑中,發(fā)現(xiàn)整合膜蛋白(油酰胺水解酶)可催化油酰胺水解降解,得到油酸(順-9-十八烯酸)和氨(圖3),未顯示出嗜睡的活性(Cravat et al.,Science 1995,268,1506-1509)。
已發(fā)現(xiàn)苯基甲磺酰氟、4,4’-二硫代二吡啶二硫化物(強(qiáng)二硫化物形成劑)和HgCl2(IC50=700 nM,Ki,app=37nM)可抑制油酰胺水解酶,而1mM EDTA卻不能抑制。這表明硫醇密切參與催化過程,所述的酶可以是半胱氨酸酰胺酶或可能是具有半胱氨酸殘基活性位點(diǎn)的絲氨酸酰氨酶。
已介紹了變異的密切連接或不可逆的絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制劑。這些包括不可逆的抑制劑如鹵代甲基酮(Kettner et al.,Biochemistry 1978,17,4778-4784;Kettner et al.,Thromb.Res.1979,14,969-973;C.Giordano,et al.,Eur,J.Med.Chem.1992,27,865-873;Rauber et al.,Biochem,J.1986,239,633-640;Angliker et al.,Biotherm.J.1987,241,871-875),Michael受體(Hanzlik et al.,J.Med.Chem.1984,27,711-712)環(huán)氧化物(C.Parkes,et al.,Biochem.J.1985,230,509-516),O-酰基羰胺(Bromme et al.,Biochem.J.1989,263,861-866)和重氮甲基酮(Green et al.,J.Biol.Chem.1981,256,1923-1928)以及可逆過渡態(tài)模擬抑制劑如酮(Mehdi,S.Bioorg,Chem.1993,21,249-259),醛(Westerik etal.,J.Biol.Chem.1972,247,8195-8197),環(huán)丙烯酮(cyclopropenones)(Ando et al.,J.Am Chem.Soc.1993,115,1174-1175)和缺電子羰基化合物如三氟甲基酮(Wolfenden et al.,Annu.Rev.Biophys.Bioeng.1976,5,271;Gelb et al.,Biochemistry 1985,24,1813-1817;Imperiali;et al.,Biochemistry 1986,25,3760-376;Koutek et al.,J.Biol.Chem.1994,269,22937-22940),α-酮酸衍生物(Li,z,et al.,J.Med.Chem.1993,36,3472-3480;Harbeson et al.,J.Med.Chem.1994,37,2918-2929;Peet et al.,J.Med.Chem,1990,33,394-407;Angelastro et al.,J.Med.Chem.1990,33,11-13)和三羰基化合物(Wasserman et al.,J.Org,Chem.1993,58,4785-4787)。
另一方面,已報(bào)道了僅僅一種可能的特異性的油酰胺水解酶抑制劑([S]=0.26Km時(shí),IC50=3μm)(Maurelli;et al.,F(xiàn)EBS Lett.1995,377,82-86)且到目前為止是唯一公開的研究有關(guān)脂肪酸酰胺酶的抑制劑的報(bào)告(Koutek et al.,J.Biol.Chem.1994,269,22937-22940)。
所需的是抑制油酰胺水解的高效油酰胺水解酶抑制劑和油酰胺誘導(dǎo)睡眠的興奮劑。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面是涉及油酰胺水解酶抑制劑。該抑制劑被設(shè)計(jì)成在油酰胺水解酶中與活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基相互作用。該抑制劑作用迅速,具有選擇性并效力強(qiáng)(Ki=13μM-1nM)。該抑制劑用于抑制油酰胺(一種睡眠誘導(dǎo)因子)的水解。該抑制劑也可作為進(jìn)一步鑒定油酰胺生物作用的工具。
該抑制劑為包含首基和烴尾基的構(gòu)型。首基以共價(jià)連接烴尾上并包括親電子的羰基。優(yōu)選首基選自由下列結(jié)構(gòu)式代表的基團(tuán)
優(yōu)選的烴尾基選自由下列結(jié)構(gòu)式代表的基團(tuán)
優(yōu)選的抑制劑包含如下

本發(fā)明的另一方面涉及抑制與油酰胺水解有關(guān)的油酰胺水解酶的方法。該方法應(yīng)用油酰胺水解酶與抑制劑接觸或結(jié)合的作用。該抑制劑包含有首基和以其共價(jià)鍵連接的烴尾基的構(gòu)型。首基包括親電子的羰基。優(yōu)選首基選自由下列結(jié)構(gòu)式代表的基團(tuán)
優(yōu)選的烴尾基選自由下列結(jié)構(gòu)式代表的基團(tuán)
上述方法中應(yīng)用的優(yōu)選抑制劑包括上述列舉的抑制劑和下面的其它的抑制劑
本發(fā)明的另一方面涉及在對(duì)油酰胺敏感動(dòng)物中誘導(dǎo)睡眠的方法。更確切的說,本發(fā)明該方面涉及對(duì)油酰胺敏感動(dòng)物給予有效劑量的油酰胺水解酶興奮劑。優(yōu)選的興奮劑由下列結(jié)構(gòu)式代表



圖1表示22個(gè)油酰胺水解酶抑制劑具有的抑制常數(shù)(Ki,app(μM);對(duì)油酰胺而言,Km=5±2μM。
圖2表示向CD3OD或丙酮-d6中的親電子羰基定量加入CD3OD或D2O并建立的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示了水合程度和抑制劑羰基的相對(duì)親電子性。預(yù)計(jì)趨勢(shì)如下11>12>8>6≥4。這些趨勢(shì)有代表性的11和12在CD3OD中全部轉(zhuǎn)化成它們的半縮醛而其余的抑制劑表現(xiàn)出降低的半縮醛,形成與其預(yù)期的親電子性的一致性11(100%)、12(100%)、8(75%)、6(48%)和4(47%)。
圖3表示經(jīng)油酰胺水解酶使油酰胺水解降解得到油酸(順-9-十八烯酸)和氨。
圖4表示化合物6(Molar)抑制油酰胺水解酶催化劑油酰胺1降解(1/速率(min/μM)活性的dixon圖。
圖5表示化合物11(Molar)抑制油酰胺水解酶(速率(μM/min/100μL))的能力。
圖6表示由化合物12競(jìng)爭油酰胺水解酶抑制性(1/v(min/μM))的Lineweaver-Burke圖。
圖7表示油酰胺水解酶分解化合物1對(duì)pH相對(duì)速率曲線圖的pH-透率相關(guān)依從(pH-rate dependent)性,相應(yīng)顯示出明顯的活性位點(diǎn)pKa 5.4、9.7和10.3。速率最大值出現(xiàn)在pH10.0。
圖8表示a)在木瓜蛋白酶和其它半胱氨酸或絲氨酸蛋白酶中存在的常見中間體(O’Leary et al.,Biochemistry 1974,13,2077-2081);b)抑制劑3-15可能的作用方式。
圖9表示中間體和抑制劑3、6、7、8、10、24和2 6的化學(xué)合成路線。
圖10表示從α-羥基酸18化學(xué)合成化合物27的方法并顯示了三氟甲基酮抑制劑12、13、14和15,其中R=C16H32-單-不飽和烴,如圖1所示。
圖11表示氫化飽和的化合物11的化學(xué)合成路線。
圖12表示測(cè)定pH-速率曲線所用的方程。從使用標(biāo)準(zhǔn)最小二乘法方法近似曲線的線性部分得到速率。這些速率對(duì)pH再作圖并用加權(quán)非線性最小二乘法表示的過程,取近似值。

具體實(shí)施例方式 公開了一系列有效的過渡態(tài)模擬和機(jī)理為基礎(chǔ)的油酰胺水解酶抑制劑2-22(圖1-2;9-10和11)及其特征。這些抑制劑可用于探測(cè)和弄清1作為一類新型生物信號(hào)試劑的原始成員(prototypical member)和油酰胺水解酶在其調(diào)節(jié)中作為重要的有效因子所起的作用。
使用離子選擇性電極測(cè)定產(chǎn)生的氨,確定抑制劑的有效性,所述的氨是作為經(jīng)油酰胺水解酶的膜限制制劑100μM水解油酰胺(~20Km)的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)油酰胺的Km為5±2μM。由Dixon方法(圖4-6)確定抑制常數(shù)。經(jīng)溶解性限制,在高濃度所有試驗(yàn)的抑制劑均能取得100%抑制性及沒有一種抑制劑表現(xiàn)出兩種或更多種具有不同Kis分開的活性位點(diǎn)的多樣抑制行為特性。因?yàn)閮煞N或更多種不同的酶連接具有幾乎一致親和力的22種獨(dú)立抑制劑的可解性是太小了,所以這強(qiáng)烈暗示下面制備中的單一酶起著大于90%的所觀察到的油酰胺水解酶活性的作用。
最有效的抑制劑(圖1)具有親電羰基,能夠可逆地形成(硫代)半縮醛或(硫代)半縮酮以模擬絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶催化反應(yīng)(圖8)的過渡態(tài)。發(fā)現(xiàn)抑制劑的相對(duì)效力符合預(yù)期在緊連的α-酮乙酯8(1.4nM)和三氟甲基酮抑制劑12(1.2nM)中反應(yīng)的羰基畜積的親電子特性。在昆蟲蟲卵發(fā)育素酯酶(Linderman et al.,Rev.Pestic.Toxical.1991,1,261-9)和anandaminase(Koutek et al.,J.Biol,Chem.1994,269,22937-22940)的抑制劑中已觀察到羰基親電子性和連接常數(shù)之間的類似的相關(guān)性。然而,在系列最強(qiáng)親電子性的成員中,三羰基抑制劑11在150nM下有相對(duì)較弱的結(jié)合。該現(xiàn)象可以是大體積的叔-丁酯和酶之間減弱了硬脂基相互作用的結(jié)果或是在C-3時(shí)SP2特性的部分原因,天然底物無此特性。
抑制劑羰基的水合程度和相對(duì)的親電子特性通過NMR分析可以容易,準(zhǔn)確測(cè)定,并發(fā)現(xiàn)它們已符合預(yù)期的趨勢(shì)(如11>12>8>6≥4)。三羰基抑制劑11的中間羰基完全水合成制劑和特征化。分離剩余的抑制劑,其特征在于它們的羰基結(jié)構(gòu)未水合,包括有反應(yīng)活性的三氟甲基酮。利用1H NMR和13C NMR確立和分別定量將CD3OD或D2O加入到CD3OD和丙酮-d6中的親電子性羰基中(圖2)。這些趨勢(shì)中有代表性的11和12完全轉(zhuǎn)化成CD3OD中的半縮醛,而其余的試劑表現(xiàn)出降低的半縮醛形成,與預(yù)期的親電子性相一致性11(100%)、12(100%)、8(75%)、6(48%)和4(47%)。
當(dāng)三氟甲基酮12、13、14和15以水溶液形式存在幾乎完全為水合物時(shí),可認(rèn)為這些化合物以可逆共價(jià)鍵酶-抑制劑半縮酮配合物連接酶,如在彈性蛋白酶(Takahasi et al.,J.Mol.Biol.1988,201,423-428)和α-糜蛋白酶(Liang et al.,Biochemistry 1987,26,7603-7608)結(jié)構(gòu)研究中以及一系列絲氨酸蛋白酶(Imperiali et al.,Biochemistry 1986,26,3760-3767)連接到肽基三氟甲基酮中所示。雖然α-羰基酰胺6和7在溶液中可能至少以一部分SP2酮類存在,但在蛋白酶活性位點(diǎn)上已觀察到α-羰基酰胺完全是SP3。類似地,在半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶活性位點(diǎn)上醛連接成硫代半縮醛(Mackenzie et al.,Biochemistry 1986,25,2293-2298;Schultz et al.,F(xiàn)EBS Lett,1975,50,47-49)。盡管16、17和18的結(jié)構(gòu)類似于偕二醇,但它們較弱地抑制油酰胺水解酶則進(jìn)一步證實(shí)這些抑制劑為(硫)-半縮酮連接而不是偕二醇(水合酮)的假設(shè)。我們注意到雖然有反應(yīng)活性羰基的親電子性似乎在支配這些抑制劑連接油酰胺水解酶的親和力上起很大作用,但也可能存在其它因素,使這些化合物對(duì)油酰胺水解酶的親和力受到影響。當(dāng)醛4和α-羰基酰胺7呈現(xiàn)同等的親電子性時(shí),α-羰基酰胺連接得更緊密,因此說明在酶和酰胺官能度之間有額外的互相作用,可能是附加的氫鍵。類似的是雖然三氟甲基酮有更高的親電子性,但α-酮酯8和三氟甲基酮12具有同等的連接緊密程度。
有趣的是,發(fā)現(xiàn)在類似油酰胺C-2的位置加入一個(gè)羰基的醛5比類似油酰胺C-1的位置加入醛羰的4具有強(qiáng)5倍的連接緊密程度。也觀察到α-酮酯系列的抑制劑,其在油酰胺C-2加入親電子性羰基與C-1的對(duì)比(8對(duì)比9)將增加6倍的連接親和力。在α-羰基酰胺或三氟甲基酮中未見這種差異。在這些抑制劑種類中,在油酰胺位置C-2鍵接親電羰基與C-1的對(duì)比可得到同等效應(yīng)的抑制劑。這說明對(duì)油酰胺C-1對(duì)比C-2的羰基位置而言,有微妙連接方式差異的可能性。
這些研究也揭示了油酰胺水解酶顯示出約10倍優(yōu)選于脂肪酸抑制劑,該抑制劑在9位含有順式雙鍵立體化學(xué)結(jié)構(gòu),類似于天然底物,該趨勢(shì)在三氟甲酮系列中表現(xiàn)得最清楚,其中含有順式雙鍵的12比含有反式雙鍵的14或飽和的衍生物15的連接緊密程度約大一個(gè)數(shù)量級(jí)。
大多數(shù)潛在的不可逆抑制劑(3、19-21)在上至溶解度的濃度下,于第一個(gè)15分鐘孵化中,并未表現(xiàn)出可測(cè)出的抑制劑活性依賴時(shí)間的關(guān)系。氯甲基酮3已表現(xiàn)出與時(shí)間無關(guān),但仍為中等抑制活性(Ki=0.7μM),這與在認(rèn)定為活性位點(diǎn)的半胱氨酸和酮之間形成可逆的(硫代)半縮酮(Bell et al.,Advan.Phys.Org.Chem.1966,4,1-29,在此作參考)或可逆的、非共價(jià)鍵的酶-抑制劑配合物相一致。存在于鄰位氯取代基將增加羰基的親電子性,有利于親核進(jìn)攻。2-氯代油酸(20,Ki=0.3μM)也呈現(xiàn)出可逆的連接,它的連接方式可能類似于油酸(Ki=6μM)。重氮甲基酮21連接的更弱(Ki=18μM)。
這樣觀察到的事實(shí)說明1可構(gòu)成一類脂肪酸一級(jí)酰胺生物信號(hào)分子的原件,其中功能的差異和選擇性源于烷烴鏈的長度以及位置、立體化學(xué)和不飽和程度。
發(fā)現(xiàn)酶催化油酰胺水解的速率依賴于呈現(xiàn)活性位點(diǎn)pKas的5.4、9.7和10.3的pH(圖7)。獨(dú)特的pH速率的依賴分布圖,對(duì)PMST的油酰胺Km和抑制性結(jié)果與Maurelli結(jié)果一致(Maurelli;et al.,F(xiàn)EBS Lett.1995,377,82-86;Mackenzi et al.,Biochemistry 1986,25,2293-2298),認(rèn)為在此存在油酰胺水解酶(來自大鼠肝臟膜部分)及anandamide酰氨基水解酶(來自小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)的膜部分)是相同的酶,經(jīng)過種間變異。然而,缺乏順序數(shù)據(jù)或純化酶,后者常常難于獲得具有整合膜的蛋白,這有待于證明。然而,我們的結(jié)果相當(dāng)不同于另一個(gè)關(guān)于anadamide酰氨基水解酶在pH 6和8呈現(xiàn)最大速率的活性的報(bào)道(Desarnaud et al.,J.Biol.Chem.1995,270,6030-6035)以致也有證據(jù)支持體內(nèi)脂肪酸酰胺水解的許多酶模式。在pH 10.0測(cè)定抑制劑時(shí),在所述pH的油酰胺水解酶活性為我們測(cè)定條件下的最大值。
興奮劑活性 本發(fā)明的另一方面涉及對(duì)油酰胺敏感動(dòng)物給予有效劑量的油酰胺水解酶興奮劑誘導(dǎo)睡眠的方法。優(yōu)選興奮劑是化合物6。將化合物6溶解于礦物油中并經(jīng)腹膜內(nèi)注射將有效劑量注入大鼠的腹膜內(nèi)。監(jiān)視睡眠4小時(shí)。用標(biāo)準(zhǔn)的電生理學(xué)方法測(cè)定總睡眠時(shí)間。觀察到隨睡醒期減少而深度慢波睡眠(SWS)增加。SWS增加約30%并觀察到睡醒減少的類似百分比。
抑制劑合成 通過已知的方法或改變已知方法從油酸制備許多的抑制劑(圖9)。使從油酸衍生的酰氯[3當(dāng)量(COCl)2,CH2Cl2,25℃,3小時(shí)]與羥胺或重氮甲烷反應(yīng)得到2和21及使油酸與肼(1.1當(dāng)量,2.2當(dāng)量EDCI,0.2當(dāng)量DMAP,CH2Cl2,25℃,19小時(shí))直接縮合得到22。用無水1N HCl-EtOAc處理21(25℃,10分鐘,92%)得到干凈的3。正如所述從油酸直接制備醛4(Mancuso et al.,J.Org.Chem.1978,43,2480-2482)和一起的二甲基乙縮醛16(Marx et al.,J.Med.Chem.1989,32,1319-1322)。衍生于油酸的烯醇物(LDA,THF)與CCl4或O2經(jīng)阱(trap)吸收分別得到20(Snider et al.,J.Org.Chem.1987,52,307-310)和18(Konen et al.,J.Org.Chem.1975,40,3253-3258),經(jīng)過酰氯產(chǎn)生[3當(dāng)量(COCl2)、CH2Cl2,25℃,3小時(shí)]和與NH4OH水溶液縮合轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的一級(jí)酰胺19和17。
通過α-羥基酰胺17(PDC)和α-羥基酸18(Dess-Martin)氧化反應(yīng),隨后形成乙酯,制備在類似于油酰胺C-2而不是C-1的位置帶有親電子性羰基的基于C-18油酸的α-羰基酰胺6和α-酮酯8(圖9)。直接從相應(yīng)的十八碳羧酸、油酸和硬脂酸,使用改良的Dakin-West反應(yīng)(Buchanan et al.,Chem.Soc.Rev.1988,17,91-109)制備類似于油酰胺C-1的位置帶有親電子性羰基的相應(yīng)α-酮酯9和10(圖9)。通過Wolff重排21(cat.AgOB2,CH3OH,25℃,2.5小時(shí),82%)提供甲酯23得到增加一個(gè)碳的油酸來制備類似長度的α-羰基酰胺7。根據(jù)對(duì)6詳細(xì)方法(圖9)水解甲酯,隨后轉(zhuǎn)化C-19羧酸24成α-羰基酰胺。
將相應(yīng)的羧酸轉(zhuǎn)化成有關(guān)的?;炔⒗^之用TFAA-吡啶處理的一步操作來制備三氟甲基酮抑制劑12、13、14和15包括在含有9-順烯的C-18液體的C-2位置上加入親電子羰基的13(Boivin et al.,Tetrahedron Lett.1992,23,1285-1288)(6當(dāng)量/8當(dāng)量,Et2O,0.75-2小時(shí),54-79%)(圖10)。α-羥基酸18[Pb(OAc)4,1.1當(dāng)量,25℃,苯,50m.]的氧化裂解得到醛5。再進(jìn)一步氧化(NaClO2)得到用于制備13的酸27。
根據(jù)Wasserman的詳細(xì)方法可以制備三羰基抑制劑11(Wasserman et al.,Tetrahedron Lett.1992,33,6003-6006)。在雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)存在下,用(三苯磷亞基)乙酸叔-丁酯[tert-butyl(triphenylphosphoranylidene)acetate](29)處理衍生于十六烷酸的酰氯,隨后用臭氧氧化得到11(圖11)。
已開發(fā)出作用于內(nèi)源性誘導(dǎo)睡眠脂質(zhì)(1,順-9-十八烯酰胺)水解的油酰胺水解酶的有效酶抑制劑,提供了深入了解所述酶的機(jī)理及基礎(chǔ)作用以開發(fā)控制和調(diào)節(jié)睡眠有關(guān)藥劑。
合成方法(protocols) 總則 用Perkin-Elmer 241分光光度計(jì)UV測(cè)定旋光度,用BeckmannDU-70分光計(jì)記錄可見光譜。用Bruker AMX-400和AMX-500光譜儀在400和500MHz記錄1H和13C NMR譜。用VG ZAB-ZSE質(zhì)譜儀在快速原子轟擊(FAB)條件下記錄高分辨質(zhì)譜(HRMS)。用70-230目硅膠進(jìn)行柱層析。用Merck Art.5744(0.5mm)進(jìn)行制備的TLC。
化合物1的合成 通過Cravatt等(Science 1995,268,1506-1509)的方法制備化合物1。
化合物4的合成 通過Mancuso,A.J等(J.Org,Chem.1978,43,2480-2482)的方法制備化合物4。
化合物15的合成 通過Koutek,B等(J.Biol.Chem.1994,269,22937-22940)的方法制備化合物15。
化合物16的合成 通過Maxx,M.H等(J.Med.Chem.1989,32,1319-1322)的方法制備化合物16。
化合物18的合成 通過Konen等(J.Org.Chem.1975,40,3253-3258)的方法制備化合物18。
化合物20的合成 通過Snider等(J.Org.Chem.1987,52,307-310)的方法制備化合物20。
化合物29的合成 通過Cooke等(J.Org.Chem.1982,47,4955-4963)的方法制備化合物29。
N-羥基-9Z-十八烯酰胺(2)的合成 在N2下,將油酸(250μL,0.79mmol,1當(dāng)量)溶解在無水CH2Cl2(4ml)中并冷卻至0℃。緩慢加入草酰氯(2M在CH2Cl2中、1.2ml、2.4mmol、3當(dāng)量)。溫?zé)崛芤褐?5℃并在暗處攪拌3小時(shí)。真空除去溶劑并冷卻燒瓶至0℃。緩慢加入過量的EtOAc中的羥胺(使用前由50%NaOH溶液將鹽酸鹽提取到EtOAc中)。真空除去溶劑并層析(SiO2,1.5×13cm,33-66%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到N-羥基-9Z-十八烯酰胺2,為白色固體(104mg,45%)mp 61-62℃;1H NMR(CD3OD,400MHz)δ5.28-5.20(m,2H),2.00-1.91(m,6H),1.50(p,2H,J=6.8Hz),1.22-1.19(m,20H),0.80(t,3H,J=6.9Hz);13C NMR(CD3OD,100MHz)δ173.0,130.9,130.8,33.8,33.1,30.9(2),30.6,30.5,30.4,30.33(2),30.26,30.19,28.2,26.8,23.8,14.5;IR(薄層)·Vmax3276,2999,2917,2849,1665,1621,1463,1428,1117,1067,968cm-1;FABHRMS(NBA-NaI)m/z 320.2577(C18H35NO2+Na+所需值320.2565)。
1-氯-10Z-十九烯-2-酮(3)的合成 在25℃,用EtOAc(4.0ml,4.0mmol,3.5當(dāng)量)中的1M HCl處理樣品21(347mg,1.13mmol,1當(dāng)量)10分鐘,然后真空濃縮混合物。層析(SiO2,3×13cm,5%EtOAc-己烷)得到3(328mg,92%)為澄清油狀物1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ5.29-5.21(m,2H),4.18(s,2H),2.48(t,2H,J=7.3Hz),1.93(m,4H),1.50(p,2H,J=7.1Hz);1.31-1.21(m,20H),0.81(t,3H,J=6.8Hz);13C NMR(CD3OD,100MHz)δ204.5,130.9,130.8,49.3,40.3,33.1,30.9,30.8,30.6,30.5,30.40,30.37,30.19,30.17(2),28.1,24.6,23.8,14.5;IR(薄層)·Vmax2925,2854,1722,1463,1403,1260,1101,796,723 cm-1;FABHRMS(NBA)m/z 315.2468(C19H35OCl+H+所需值315.2455)。
8Z-十七烯(5)的合成 在25℃,N2下用Pb(OAc)4(197mg,0.44mmol1.1,當(dāng)量)處理在無水苯(1.6ml)中18(120mg,0.40mmol,1當(dāng)量)溶液并攪拌反應(yīng)混合物50分鐘。加入水(2ml)并用EtOAc(6×2ml)提取水層。干燥(Na2SO4)有機(jī)層,過濾并真空濃縮。層析(SiO2,2×13cm,1-5%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到5(68mg,67%),為澄清油狀物。光譜特征與文獻(xiàn)描述的一致(Doleshall et al.,Tetrahedron Lett.1977,381-382;Kemp et al.,J.Am.OilChem.Soc.1975,52,300-302)。
2-氧代-9Z-十八烯酰胺(6)的合成 用PDC(51mg,0.13mmol,5當(dāng)量)處理Ar下在無水DMF(0.13ml)中17(8mg,0.027mmol,1當(dāng)量)容液并在25℃攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)。用水(2ml)處理粗品反應(yīng)物并用Et2O(4×2ml)提取水層。干燥(Na2SO4)有機(jī)層,過濾并真空濃縮。層析(SiO2,1×3cm,20-66%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到6(6mg,70%)的白色固體及部分回收的起始原料(2mg,26%)。對(duì)于6mp 85-86℃;1H NMR(CDCl3,400MHz)δ6.79(br,1H),5.47(br,1H),5.37-5.28(m,2H),2.89(t,2H,J=7.4Hz),2.02-1.93(m,4H),1.59(p,2H,J=7.2Hz),1.39-1.24(m,20H),0.86(t,3H,J=6.8Hz);13CNMR(CDCl3,100MHz)δ198.6,161.9,130.1,129.6,36.5,31.9,29.7,29.5(2),29.3(2),28.9(2),27.2,27.1,23.1,22.7,14.1;IR(薄層)·Vmax3391,2915,2850,1716,1668,1470,1400,1108cm-1;FABHRMS(NBA-CsI)m/z 428.1547(C18H33NO2+Ca+所需值428.1566)。
2-氧-10Z-十九烯酰胺(7)的合成 在25℃用o-Ph(CO2)I(OAc)3(174mg,0.41mmol,3當(dāng)量)處理無水CH2Cl2(2.8ml)中的26(42mg,0.14mmol,1當(dāng)量)溶液并攪拌反應(yīng)混合物1.5小時(shí)。用10%NaOH水溶液(30ml)處理混合物并用EtOAc(3×30ml)提取水層。干燥(Na2SO4)有機(jī)層,過濾并真空濃縮。層析(SiO2,1.5×13cm,10-20%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到7(24mg,57%)的白色固體mp 69-70℃;1H NMR(CDCl3,400MHz)δ6.82(br,1H),5.68(br,1H),5.36-5.28(m,2H),2.88(t,2H,J=7.4Hz),1.98(m,4H),1.58(p,2H),J=7.0Hz),1.28-1.24(m,20H),0.85(t,3H,J=6.9Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ198.7,162.0,130.0,129.7,36.5,31.9,29.74,29.66,29.5,29.3(2),29.2,29.1,29.0,27.2,27.1,23.1,22.7,14.1;IR(薄層)·Vmax3395,3217,2922,2850,1718,1672,1601,1469,1406,1115cm-1;FABHRMS(NBA-NaI)m/z 332.2570(C19H35NO2+Na+所需值332.2565)。
2-氧-9Z-十八烯酸乙酯(8)的合成 在25℃,N2下,用o-Ph(CO2)I(OAc)3(287mg,0.68mmol,2當(dāng)量)處理在無水CH2Cl2(1.1ml)中的18(102mg,0.34mmol,1當(dāng)量)溶液并攪拌1小時(shí)。用10%NaOH水溶液(20ml)處理反應(yīng)混合物并用EtOAc(3×20ml)提取。干燥(Na2SO4)有機(jī)層,過濾并真空濃縮。將殘留物溶解在無水CH2Cl2(1.5ml)中并在N2下冷至0℃。緩慢加入草酰氯(2M在CH2Cl2中,0.5ml,1.0mmol,3當(dāng)量)。溫?zé)岱磻?yīng)混合物至25℃并在暗處攪拌3小時(shí),之后用真空除去溶劑并加入無水EtOH(5ml)。層析(SiO2,2×10cm,1-5%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到8(36mg,33%)的澄清油狀物1H NMR(CDCl3,400MHz)δ5.37-5.27(m,2H),4.29(q,2H,J=7.2Hz),2.81(t,2H,J=7.3Hz),1.98(m,4H),1.61(p,2H,J=7.1Hz),1.36-1.24(m,21H),0.86(t,3H,J=6.8Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ194.8,161.3,130.1,129.6,62.4,39.3,31.9,29.8,29.5(2),29.3(2),28.92,28.56,27.2,27.1,22.9,22.7,14.1,14.0;IR(薄層)·Vmax2925,2854,1729,1462,1260,1056 cm-1;FABHRMS(NBA-CsI)m/z 457.1706(C20H36O3+Cs+所需值457.1719)。
2-氧代-10Z-十九烯酸乙酯(9)的合成 在25℃,Ar下,用DMAP(4mg,0.03mmol,0.1當(dāng)量)、無水吡啶(77μl,0.95mmol,3當(dāng)量)和草酰氯乙酯(71μl,0.64mmol,2當(dāng)量)處理無水THF(0.2ml)中的油酸(100μl,0.32mmol,1當(dāng)量)溶液。攪拌反應(yīng)混合物24小時(shí),之后加入另一份DMAP(46mg,0.37mmol,1.1當(dāng)量),吡啶(80μl,0.95mmol,3當(dāng)量),草酰氯乙酯(80μl,0.64mmol,2當(dāng)量)和THF(0.5ml)。在25℃再攪拌反應(yīng)混合物24小時(shí),然后溫?zé)嶂?0℃48小時(shí),之后真空濃縮溶劑。層析(SiO2,2×13cm,0-10%EtOAc-己烷)得到9(46mg,43%)的澄清油狀物;1H NMR(CDCl3,400MHz)δ5.36-5.28(m,2H),4.29(q,2H,J=7.1Hz),2.80(t,2H,J=7.3Hz),1.99(m,4H),1.60(m,2H),1.36-1.20(m,23H),0.85(t,3H,J=6.8Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ194.8,161.2,130.0,129.7,62.4,39.3,31.9,29.7,29.6,29.5,29.3(2),29.2,29.0,28.9,27.2,27.1,22.9,22.7,14.1,14.0;IR(薄層)·Vmax 2925,2854,1730,1465,1260,1059cm-1;FABHRMS(NBA-CsI)m/z 471.1875(C21H38O3+Cs+所需值471.1888)。
2-氧-十九烯酸乙酯(10)的合成 在25℃,Ar下,用DMAP(4mg,0.03mmol,0.1當(dāng)量)、無水吡啶(85μl,1.1mmol,3當(dāng)量)和草酰氯乙酯(79μl,0.71mmol,2當(dāng)量)處理無水THF(0.2ml)中的硬脂酸(101mg,0.36mmol,1當(dāng)量)溶液。攪拌反應(yīng)混合物24小時(shí),之后真空濃縮溶劑。層析(SiO2,2×13cm,5-10%EtOAc-己烷)得到10(35mg,30%),為白色固體物mp 43-44℃;1H NMR(CDCl3,400MHz)δ4.29(q,2H,J=7.2Hz),2.80(t,2H,J=7.4Hz),1.60(p,2H,J=7.2Hz),1.35(t,3H,J=7.1Hz),1.33-1.23(m,28H),0.86(t,3H,J=6.8Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ194.8,161.2,62.4,39.3,31.9,29.7(7),29.6,29.40,29.35,29.28,28.9,23.0,22.7,14.1,14.0;IR(薄層)·Vmax2916,2848,1733,1472,1463,723cm-1;FABHRMS(NBA-NaI)m/z363.2885(C21H40O3+Na+所需值363.2875)。
3-氧-2,2-二羥基十八烷酸叔-丁酯(11)的合成 用Oxone(249mg,0.41mmol,1.6當(dāng)量)處理THF-H2O(2∶1;3ml)中的28(161mg,0.26mmol,1當(dāng)量)的溶液并在25℃攪拌反應(yīng)混合物7小時(shí)。加水(30ml)并用EtOAc(3×30ml)提取水層。合并有機(jī)層,干燥(Na2SO4),過濾并真空濃縮。層析(SiO2,2×15cm,10-20%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到11(65mg,64%)的白色固體物mp 49-51℃;1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ6.96(s,2H),2.17(t,2H,J=7.4Hz),1.49-1.38(m,11H),1.22(s,24H),0.84(t,3H,J=6.8Hz);13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δ205.6,174.5,94.2,81.5,35.6,33.6,31.3,29.0(3),28.9,28.8,28.72,28.70,28.53,28.46,27.4(2),24.5,22.9,22.1,13.9;IR(薄層)·Vmax3440,2914,2849,1728,1471,1371,1260,1122,831,718cm-1;FABHRMS(NBA-NaI)m/z 409.2925(C22H42O5+Na+所需值409.2930)。
1,1,1-三氟-10Z-十九烯-2-酮(12)的合成 在N2下將油酸(100μl,0.32mmol,1當(dāng)量)溶解于無水CH2Cl2(1.5ml)中并冷卻至0℃。緩慢加入草酰氯(CH2Cl2中2M,0.47ml,0.94mmol,3當(dāng)量)。將反應(yīng)混合物溫?zé)嶂?5℃并在暗處攪拌3小時(shí),之后真空除去溶劑。在25℃加入無水Et2O(2.2ml)、三氟乙酸酐(270μl,1.9mmol,6當(dāng)量)和吡啶(0.2ml,2.5mmol,8當(dāng)量)并攪拌溶液45分鐘,之后被冷卻至0℃。加入H2O(30ml)驟停反應(yīng)和用CH2Cl2(3×30ml)提取水層。干燥(Na2SO4)有機(jī)層,過濾并真空濃縮。層析(SiO2,1.5×13cm,5%EtOAc-己烷中含1%Et3N)得到8(75mg,71%)的澄清油狀物1H NMR(CDCl3,400MHz)δ5.37-5.28(m,2H),2.68(t,2H,J=7.3Hz),1.98(m,4H),1.65(p,2H,J=7.1Hz),1.29-1.25(m,20H),0.86(t,3H,J=6.9Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ191.6(d,J=17Hz),130.0,129.5,115.6(q,J=145Hz),36.3,31.9,29.8,29.6,29.5,29.3(2),29.1,29.0,28.7,27.2,27.1,22.7,22.4,14.1;IR(薄層)·Vmax2926,2855,1766,1467,1404,1261,1208,1153,1039,802,709cm-1;ESIMS m/z(M+)334。
1,1,1-三氟-9Z-十八烯-2-酮(13)的合成 在N2下,將無水CH2Cl2(1.8ml)中的27(101mg,0.38mmol,1當(dāng)量)的溶液冷卻至0℃并用草酰氯(CH2Cl2中2M,0.56ml,1.1mmol,3當(dāng)量)滴加處理。將反應(yīng)混合物溫?zé)嶂?5℃并攪拌3小時(shí),之后真空除去溶劑。在25℃加入無水Et2O(2.5ml),三氟乙酸酐(0.32ml,2.3mmol,6當(dāng)量)和無水吡啶(0.12ml,1.5mmol,4當(dāng)量)并攪拌溶液2小時(shí),之后被冷至0℃。用水(30ml)處理反應(yīng)混合物并用EtOAc(3×30ml)提取水層。干燥(Na2SO4)有機(jī)層,過濾并真空濃縮。層析(SiO2,2×15cm,10%EtOAc-己烷中含1%Et3N)得到13(65.5mg,54%)的澄清油狀物1HNMR(CDCl3,400MHz)δ5.39-5.26(m,2H),2.69(t,2H,J=7.2Hz),1.99(m,4H),1.66(m,2H),1.35-1.24(m,18H),0.86(t,3H,J=6.9Hz);13CNMR(CDCl3,100MHz)δ191.4,130.5,129.1,115.6(q,J=146Hz),36.3,31.9,29.7,29.5,29.3(3),29.2,28.3,27.2,26.8,22.7,22.3,14.1;IR(薄層)·Vmax2926,2855,1765,1462,1209,1154,1024 cm-1;ESIMS m/z(M+Na+)343。
1,1,1-三氟-10E-十九烯-2-酮(14)的合成 在N2下,將無水CH2Cl2(3.5ml)中的反油酸(204mg,0.72mmol,1當(dāng)量)的溶液冷卻至0℃并用草酰氯(CH2Cl2中2M,1.1ml,2.2mmol,3當(dāng)量)處理。溫?zé)岱磻?yīng)混合物至25℃,攪拌3小時(shí),之后真空除去溶劑。在25℃加入無水Et2O(5ml),三氟乙酸酐(0.6ml,4.3mmol,6當(dāng)量)和無水吡啶(0.23ml,2.8mmol,4當(dāng)量)并攪拌溶液1小時(shí),之后冷卻至0℃。用H2O(30ml)處理混合物并用EtOAc(3×30ml)提取水層。干燥(Na2SO4)有機(jī)層,過濾并真空濃縮。層析(SiO2,2×13cm,5-10%EtOAc-己烷中含1%Et3N梯度洗脫)得到14(190mg,79%)的澄清油狀物1HNMR(CDCl3,400MHZ)δ5.41-5.31(m,2H),2.68(t,2H,J=7.3Hz),1.94(m,4H),1.64(p,2H,J=6.9Hz),1.28-1.24(m,2OH),0.86(t,3H,J=6.6Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ191.5(q,J=35Hz),130.6,130.1,115.6(q,J=291Hz),36.3,32.6,32.5,31.9,29.7,29.5(2),29.3,29.2,29.1,28.8,28.7,22.7,22.4,14.0;IR(薄層)·Vmax2925,2855,1765,1466,1208,1152,967,709cm-1;FABHRMS(NBA-NaI)m/z 334.2475(C19H33OF3-H+所需值334.2484)。
2-羥基-9Z-十八烯酰胺(17)的合成 在N2下,將無水CH2Cl2(0.7ml)中的18(52mg,0.18mmol,1當(dāng)量)的溶液冷卻至0℃并用草酰氯(CH2Cl2 中2M,0.22ml,0.44mmol,3當(dāng)量)處理。使溶液溫?zé)嶂?5℃并在暗處攪拌3小時(shí),真空除去溶劑并將?;壤渲?℃。用過量濃NH4OH水溶液處理樣品。層析(SiO2,1.5×10cm,66-100%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到17(31mg,60%)的白色固體物mp103-104℃;1H NMR(CDCl3,400MHz)δ6.37(br,1H),5.64(br,1H),5.36-5.28(m,2H),4.12(t,1H,J=3.8Hz),2.66(br,1H),2.02-1.94(m,4H),1.86-1.77(m,1H),1.68-1.59(m,1H),1.43-1.24(m,20H),0.86(t,3H,J=6.8Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ176.6,130.0,129.7,71.9,34.8,31.9,29.7,29.6,29.5,29.3(2),29.2,29.1,27.2,27.1,24.9,22.7,14.1;IR(薄層)·Vmax3381,3289,2917,2848,1637,1461,1417,1331,1074cm-1;FABHRMS(NBA)m/z 298.2760(C18H35NO2+H+所需值298.2746)。
2-氯-9Z-十八烯酰胺(19)的合成 在N2下,將無水CH2Cl2(0.7ml)中的20(48mg,0.15mmol,1當(dāng)量)的溶液冷卻至0℃并用草酰氯(CH2Cl2中2M,0.23ml,0.46mmol,3當(dāng)量)處理。使溶液溫?zé)嶂?5℃并在暗處攪拌3小時(shí),之后真空除去溶劑。冷卻粗品酰氯至0℃并用過量濃NH4OH水溶液處理。層析(SiO2,1.5×10cm,20-33%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到19(37mg,78%)的黃色固體物mp 49-50℃;1H NMR(CDCl3,400MHz)δ6.49(br,1H),5.92(br,1H),5.36-5.27(m,2H),4.29(m,1H),2.12-1.86(m,6H),1.53-1.16(m,20H),0.85(t,3H,J=6.9Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ171.9,130.1,129.6,60.6,35.5,31.9,29.7,29.6,29.5,29.3(2),29.0,28.7,27.2,27.1,25.8,22.7,14.1;IR(薄層)·Vmax3383,3183,3001,2921,2850,1657,1465,1412,1240,1100 cm-1;FABHRMS(NBA)m/z 316.2415(C18H34NOCl+H+所需值316.2407)。
1-重氮-10Z-十九烯-2-酮(21)的合成 在N2下,將油酸(1.0ml,3.2mmol,1當(dāng)量)溶解于無水CH2Cl2(15ml)中。冷卻溶液至0℃并加入草酰氯(CH2Cl2中2M,4.8ml,9.6mmol,3當(dāng)量)。溫?zé)岱磻?yīng)混合物至25℃并在暗處攪拌3小時(shí)。真空除去溶劑,之后用無磨砂玻璃接口將酰氯轉(zhuǎn)移至燒瓶中并冷卻至0℃。加入過量的在Et2O中的重氮甲烷(從50%KOH水溶液中的N-亞硝基甲脲制得并用KOH片干燥)。在0℃攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí),然后溫?zé)嶂?5℃過夜。用EtOAc(60ml)稀釋溶液和用飽和NaHCO3水溶液(60ml)和飽和NaCl水溶液(60ml)洗滌。干燥(Na2SO4)有機(jī)層,過濾和真空濃縮。層析(SiO2,4.0×16cm,5-10%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到21(0.89g,92%)的黃色油狀物1H NMR(CD3OD,400MHz)δ5.72(br,1H),5.29-5.21(m,2H),2.23(m,2H),1.94(m,4H),1.50(p,2H,J=6.9Hz),1.23-1.20(m,20H),0.81(t,3H,J=6.9Hz);13C NMR(CD3OD,100MHz)δ198.8,130.9,130.8,41.6,33.1,30.9,30.8(2),30.6,30.5,30.4(2),30.3,30.2,28.1(2),26.5,23.8,14.5;IR(薄膜)Vmax3083,2924,2854,2102,1644,1463,1372,1144cm-1;FABHRMS(NBA)m/z 307.2738(C19H34N2O+H+所需值307.2749)。
N-氨基-9Z-十八烯酰胺(22)的合成 在N2下,0℃,用EDCI(267mg,0.90mmol,1.1當(dāng)量)和DMAP(20mg,0.16mmol,0.21當(dāng)量)處理無水CH2Cl2(12ml)中的油酸(250μl,0.79mmol,1當(dāng)量)和肼一水合物(42μl,0.87mmol,1.1當(dāng)量)的溶液,之后在25℃攪拌反應(yīng)混合物7小時(shí)。加入另一份EDCI(269mg,0.91mmol,1.1當(dāng)量)并在25℃再攪拌反應(yīng)物12小時(shí),之后真空除去溶劑。層析(SiO2,3×18cm,20-100%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到22(123mg,52%)的白色固體物mp 95-96℃;1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.94(s,1H),5.36-5.27(m,2H),2.23(t,2H,J=7.6Hz),1.98(m,4H),1.63(p,2H,J=7.0Hz),1.27-1.24(m,20H),0.86(t,3H,J=6.7Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ169.7,130.0,129.7,34.1,31.9,29.8,29.7,29.5,29.3(2),29.23,29.19,29.12,27.21,27.17,25.4,22.7,14.1;IR(薄膜)Vmax3201,2917,2848,1595,1410,1184,1090,927,717,671 cm-1;FABHRMS(NBA-NaI)m/z 297.2916(C18H36N2O+H+所需值297.2906)。
10Z-十九烯酸甲酯(23)的合成 在N2下,將苯甲酸銀(21.8mg,0.095mmol,0.1當(dāng)量)和無水Et3N(0.19ml,1.36mmol,1.4當(dāng)量)溶液滴加到1-重氮基-10Z-十九烯-2-酮(21,298mg,0.97mmol,1當(dāng)量)的無水甲醇(1.5ml)的溶液中并在25℃攪拌反應(yīng)物2.5小時(shí)。用EtOAc(30ml)稀釋反應(yīng)混合物并用1N HCl水溶液(30ml)和飽和NaHCO3水溶液(30ml)洗滌。干燥(Na2SO4)有機(jī)層,過濾并真空濃縮。層析(SiO2,3×15cm,1-5%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到23(246mg,82%)的澄清油狀物1H NMR(CDCl3,400MHz)δ5.35-5.27(m,2H),3.63(s,3H),2.27(t,2H,J=7.6Hz),1.97(m,4H),1.59(p,2H,J=7.3Hz),1.26-1.24(m,22H),0.85(t,3H,J=6.8Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ174.3,129.9,129.8,51.4,34.1,31.9,29.74,29.70,29.5,29.3(2),29.2(2),29.1(2),27.2(2),24.9,22.6,14.1;IR(薄膜)Vmax2925,2854,1744,1465,1436,719cm-1;FABHRMS(NBA-NaI)m/z311.2969(C20H38O2+H+所需值311.2950)。
10Z-十九烯酸(24)的合成 在25℃,用LiOH·H2O(250mg,5.96mmol,3當(dāng)量)處理THF-CH3OH-H2O(3∶1∶1;7ml)中的23(620mg,2.0mmol,1當(dāng)量)的溶液并攪拌反應(yīng)混合液3小時(shí)。加入1N HCl水溶液(60ml)酸化反應(yīng)混合物并用EtOAc(2×60ml)提取水層(2×60ml)。干燥有機(jī)層(Na2SO4),過濾并真空干燥。層析(SiO2,4×15cm,10-100%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到24(510mg,86%)淺黃色油狀物1H NMR(CDCl3,400MHz)δ5.37-5.28(m,2H),2.32(t,2H,J=7.5Hz),1.98(m,4H),1.61(p,2H,J=7.3Hz),1.27-1.25(m,22H),0.86(t,3H,J=6.9Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ180.4,130.0,129.8,34.1,31.9,29.8,29.7,29.5,29.3(2),29.2(2),29.0(2),27.20,27.17,24.6,22.7,14.1;IR(薄膜)Vmax2925,2854,1711,1466,1412,1260,1093,1019,938,801,722cm-1;FABHRMS(NBA-NaI)m/z319.2605(C19H36O2+Na+所需值319.2613)。另外,通過Doleshall.G.的方法可制備本化合物(Tetrahedron.Lett.1980,21,4183-4186)。
2-羥基-10Z-十九烯酸(25)的合成 在Ar下,在-55℃從無水THF(2ml)中的二異丙胺(0.4ml,2.9mmol,4.5當(dāng)量)和正-Buli(2.3M,1.1ml,2.5mmol,4當(dāng)量)制備LDA的新鮮溶液。在-55℃將THF(0.5ml)中的10Z-十九烯酸(24,188mg,0.63mmol,1當(dāng)量)和無水HMPA(0.11ml,0.63mmol,1當(dāng)量)的溶液滴加到LDA溶液中。逐漸溫?zé)岱磻?yīng)混合物至25℃并在50℃溫?zé)?0分鐘。再將反應(yīng)混合物冷至25℃之后,向溶液吹入O220分鐘。用1N HCl水溶液(30ml)處理混合物并用EtOAc(3×30ml)提取水層。干燥(Na2SO4)有機(jī)層,過濾并真空濃縮。層析(SiO2,2×13cm,50-100%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到25(96mg,49%)的白色固體物mp 53-54℃;1H NMR(CDCl3,400MHz)δ5.36-5.28(m,2H),4.24(dd,1H,J=7.5Hz,7.6Hz),1.98(m,4H),1.83(m,1H),1.67(m,1H),1.47-1.24(m,22H),0.86(t,3H,J=6.8Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ179.8,130.0,129.7,70.2,34.0,31.9,29.8,29.7,29.5,29.33,29.31(2),29.22,29.19,27.20,27.16,24.8,22.7,14.1;IR(薄層)·Vmax3512,2917,2849,1704,1467,1293,1274,1251,1212,1143,1079,1041,918,726,648cm-1;FABHRMS(NBA-NaI)m/z 335.2574(C19H35O3+Na+所需值335.2562)。
2-羥基-10Z-十九烯酰胺(26)的合成 在N2下,將無水CH2Cl2(1.5ml)中的25(71mg,0.23mmol,1當(dāng)量)溶液冷至0℃并用草酰氯(CH2Cl2中2M,0.34ml,0.68mmol,3當(dāng)量)滴加處理。溫?zé)岱磻?yīng)混合物至25℃并在暗處攪拌3小時(shí)。真空除去溶劑,冷卻殘留物至0℃,并加入過量的濃NH4OH水溶液(2ml)。層析(SiO2,1.5×13cm,50-66%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到26(53mg,75%)的白色固體物mp 101-102℃;1H NMR(CDCl3,400MHz)δ6.36(br,1H),5.65(br,1H),5.36-5.28(m,2H),4.12(dd,1H,J=7.9Hz,8.0Hz),1.99(m,4H),1.81(m,1H),1.63(m,1H),1.43-1.24(m,22H),0.86(t,3H,J=6.9Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ176.6,130.0,129.8,71.9,34.8,31.9,29.8,29.7,29.5,29.4,29.3(3),29.2,27.20,27.16,24.9,22.7,14.1;IR(薄層)·Vmax3383,3290,2917,2849,1644,1467,1426,1331,1075cm-1;FABHRMS(NBA-NaI)m/z 334.2731(C19H37NO2+Na+所需值334.2722)。
8Z-十七烯酸(27)的合成 在25℃,N2下,用去離子H2O(2.5ml)中的NaClO2(80%,208mg,2.3mmol,9當(dāng)量)和NaH2PO4·H2O(250mg,1.8mmol,7當(dāng)量)溶液滴加處理5(66mg,0.26mmol,1當(dāng)量)和2-甲基-2-丁烯(1.6ml,15.1mmol,58當(dāng)量)的tBuOH(6.5ml)的溶液。使反應(yīng)混合物再攪拌15分鐘,之后真空濃縮。用水(30ml)處理殘留物并用EtOAc(3×30ml)提取水層。干燥(Na2SO4)有機(jī)層。過濾并真空濃縮。層析(SiO2,2×13cm,10-20%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到27(66mg,95%)的澄清油狀物。光譜特征與文獻(xiàn)描述一致(Miralles et al.,Lipids 1995,30,459-466;Couderc et al.,Lipids1995,30,691-699)。
3-氧代-2-(三苯磷亞基)十八烷酸酯(28) 在N2下,將無水CH2Cl2(2ml)中的十六烷酸(103mg,0.40mmol,1當(dāng)量)的溶液冷卻至0℃并用草酰氯(CH2Cl2中2M,0.6ml,1.2mmol,3當(dāng)量)處理。在25℃攪拌溶液3小時(shí),之后真空除去溶劑。在5℃用苯(3ml)中的粗品酰氯溶液滴加處理在無水苯(3ml)中的(三苯磷亞基)乙酸叔-丁酯(Cooke et al.,J.Org.Chem.1982,47,4955-4963)29,167mg,0.44mmol,1.1當(dāng)量)和雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(195μl,0.79mmol,2當(dāng)量)的溶液。溫?zé)岱磻?yīng)混合物至25℃并攪拌1.5小時(shí),之后真空除去溶劑。層析(SiO2,2×15cm,10-20%EtOAc-己烷梯度洗脫)得到28(193mg,78%)的澄清油狀物1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.67-7.61(m,6H),7.49-7.37(m,9H),2.82(t,2H,J=7.6Hz),1.55(p,2H,J=7.0Hz),1.23-1.21(m,24H),1.04(s,9H),0.86(t,3H,J=6.8Hz);13C NMR(CDCl3,100MHz)δ197.7(d,J=6Hz),167.3(d,J=13Hz),132.9(d,6C,J=9Hz),131.3(3),128.4(d,6C,J=12Hz),127.4(d,3C,J=96Hz),78.4,71.2(d,J=114Hz),40.0,31.9,29.70(8),29.66,29.3,28.1(3),25.9,22.7,14.1;IR(薄層)·Vmax3426,2923,2852,1665,1551,1438,1363,1302,1173,1106,1081,746,690cm-1;FABHRMS(NBA-CsI)m/z 615.3959(C40H55O3P+H+所需值615.3967)。
連接常數(shù)的測(cè)定 使用離子選擇氨電極(ATI/Orion)直接測(cè)定隨反應(yīng)產(chǎn)物形成的氨來評(píng)價(jià)這些化合物對(duì)油酰胺水解的效力。通過Dixon方法測(cè)定除油酸外的所有Kis。(使用公式Ki=-Xint/[1+[S]/Km]在恒定底物濃度下將[I]的加權(quán)線性近似對(duì)1/速率曲線圖的X截距可轉(zhuǎn)化成Ki)。從速率的非線性加權(quán)最小二乘法近似對(duì)底物和抑制劑濃度的關(guān)系曲線可得到油酸Ki。在調(diào)至pH 10.0的10ml 50mM CAPS緩沖液(Sigma)中恒速攪拌進(jìn)行測(cè)定,酶催化油酰胺水解速率的pH是最大的值。在涉及Dixon分析的所有情況中底物濃度是100μM。在底物濃度范圍10-100μM測(cè)定油酸Ki。在加入50mM CAPS緩沖液之前將底物和抑制劑溶解于DMSO中,產(chǎn)生1.67%的最終DMSO分析濃度。上至20%DMSO濃度僅表現(xiàn)出較小的對(duì)速率的作用。在無抑制劑存在下將酶濃度調(diào)節(jié)至產(chǎn)生大約0.2μM/min速率,用7-10分鐘觀察產(chǎn)生氨的速率。
所使用的酶為來自小鼠肝臟的粗品,非均勻、含生物膜的制劑。煮沸酶5分鐘使其無活性。在溶解度限度內(nèi),所有抑制劑在大于100Ki濃度時(shí)均獲得100%抑制活性。在無加入的油酰胺存在下,未發(fā)現(xiàn)可測(cè)得的活性。同樣,在這樣pH無酶存在下,從100μM油酰胺僅測(cè)得非常小的產(chǎn)生氨速率。這說明在粗品酶制劑中觀察到催化油酰胺水解活性是從單一蛋白引起。
從4個(gè)獨(dú)立分析中得到平均Km值作為測(cè)定油酰胺的Km。在Lineweaver-Burke圖中從加權(quán)線性近似適合數(shù)據(jù)中得到各自獨(dú)立的Km值。通過非線性方法測(cè)定油酸抑制的結(jié)果可得到第5個(gè)同時(shí)產(chǎn)生的Km。用標(biāo)準(zhǔn)Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)方程處理適合的速率數(shù)據(jù)(在水情況下,當(dāng)?shù)诙孜餄舛葹楹愣〞r(shí),將Ping Pong BiBi動(dòng)力學(xué)速率方程簡化成簡單的Michaelis-Menten-like方程)。在30-100μM范圍內(nèi),反應(yīng)速率基本具有取決于底物濃度的零序。
因?yàn)槲覀冞€不能夠測(cè)定存在于酶樣品中油酰胺水解酶的數(shù)量,所以我們?cè)诖瞬荒苋max值。我們的抑制數(shù)據(jù)提示酶濃度應(yīng)低于2mM,因?yàn)檩^高酶濃度可引起溶液中抑制劑的明顯消耗,在[E]>>Ki的限度情況下,引起明顯測(cè)定的Ki值為[E]/2。因?yàn)?nM是測(cè)定的最低抑制恒量。所以[E]<2nM。
對(duì)Kis帶來的誤差值,應(yīng)考慮由數(shù)據(jù)的誤差處理擴(kuò)散(propagation)衍生的擬合良好度評(píng)價(jià)。它們不必是再現(xiàn)性的標(biāo)志。然而,在重復(fù)實(shí)驗(yàn)的情況下,正如在此給出明顯誤差值所預(yù)計(jì)的,其結(jié)果是在統(tǒng)計(jì)范圍內(nèi)。
pH-速率相關(guān)性 將粗品酶加到有適當(dāng)pH,含5%DMSO的20ml緩沖液中的200μM油酰胺(約為溶解度極限)的溶液中。(高達(dá)20%DMSO濃度僅對(duì)酶速度具有最小的作用)。使用50mM檸檬酸鈉/Bis-tris緩沖液作為pH 4-9范圍的數(shù)據(jù)取值點(diǎn)。使用50mM Bis-tris/CAPS作為8-11范圍的數(shù)據(jù)取值點(diǎn)。在pH 12,設(shè)定溶液為自身緩沖液。在定期間隔中,除去1ml等份,用9ml pH 14緩沖液稀釋。用對(duì)照已知標(biāo)準(zhǔn)校定的連接720A計(jì)(Orion)的離子選擇氨電極(Orion)測(cè)試氨濃度。從使用標(biāo)準(zhǔn)最小二乘方法相應(yīng)曲線的線性部分得到速率。這些速率對(duì)pH再作圖并采用加權(quán)非線性最小二乘法(Connors,K.A.,Binding Constants;WileyNew York.1987,pp 385-395)與圖12的方程擬合(Fersht,A.,Enzyme Structure andMechanism;W.H.Freeman and Co.New York.1985,pp 157 Connors,K.A.,Binding Constants;WileyNew York.1987,pp 385-395)。
在兩個(gè)pKa為緊密靠攏的情況中(小于1個(gè)單位),在溶液中存在充分混合的各種酶。在這樣的條件下,實(shí)際上未觀察到那種酶在理論上表現(xiàn)出速率最大值,因?yàn)樽钣谢钚缘拿割愐策_(dá)不到這樣高的豐富程度。正是這個(gè)原因用簡單圖解方法測(cè)定pKa,可以與在此給出的9.7和10.3 pH單位值不一致。
大規(guī)模(12-14只大鼠肝臟)肝質(zhì)膜的制備 將12-14只大鼠肝切成片,置于300ml 1mM NaHCO3中。滲濾被切成小片的肝溶液并用另外的300ml的1mM NaHCO3洗滌。除去任何明顯連接的組織。將肝轉(zhuǎn)移至新鮮的800ml的1mM NaHCO3中,攪拌,然后以400ml等份轉(zhuǎn)移至混和器中,合并混和的肝液,并經(jīng)8層干酪布(cheesecloth)過濾。用1mM NaHCO3稀釋至1.0L并在4℃6000rpm離心20分鐘(Beckman JA-17rotor)。傾出上清液,在1mM NaHCO3重新懸浮片狀物,合并并用dounce勻漿器勻漿。重復(fù)離心,傾折和再懸浮/勻漿,得到最終的約90ml體積。將勻漿物加到2體積量的67%蔗糖中,充分混合,并轉(zhuǎn)移到超離心相配管中。用30%蔗糖加到管頂部,在27000旋轉(zhuǎn)2小時(shí)(SW-28 rotor)。從蔗糖梯度中除去中間黃色帶,合并,在1 mM NaHCO3中重新懸浮并用dounce勻漿器勻漿。在4℃,于17000rpm進(jìn)一步離心樣品45分鐘(JA-17 rotor)。除去上清液,在100mM Na2CO3中再懸浮片狀物,用dounce器勻漿并放置冰上30分鐘。在27000rpm離心溶液1小時(shí)(SW-28 rotor),傾出上清液并在15ml50mM Tris HCl,pH 7.4(含有1mM EDTA)中再懸浮片狀物,用dounce勻漿器勻漿。將該原料分成若干等份,在-78℃冷凍備用。每份酶樣品僅冷凍一次。
權(quán)利要求
1.下述抑制劑在制備用于抑制油酰胺水解酶的藥物中的用途,其中所述抑制劑包含首基和以共價(jià)鍵連接于所述的首基的烴尾基,其中所述的首基包括親電子羰基和選自由下列結(jié)構(gòu)式代表的基團(tuán)
和其中所述的烴尾基選自由下列結(jié)構(gòu)式代表的基團(tuán)
如果首基是式(11)的基團(tuán),則烴尾基是式(III)或(IV)的基團(tuán),如果首基是式(1)或(2)的基團(tuán),則烴尾基是式(III)或(IV)的基團(tuán),
如果首基是式(8)的基團(tuán),則烴尾基是式(I)或(II)的基團(tuán)。
2.權(quán)利要求1的用途,其中所述抑制劑由下面結(jié)構(gòu)式代表
3.權(quán)利要求1的用途,其中所述抑制劑由下面結(jié)構(gòu)式代表
4.權(quán)利要求1的用途,其中所述抑制劑由下面結(jié)構(gòu)式代表
5.權(quán)利要求1的用途,其中所述抑制劑由下面結(jié)構(gòu)式代表
6.權(quán)利要求1的用途,其中所述抑制劑由下面結(jié)構(gòu)式代表
7.權(quán)利要求1的用途,其中所述抑制劑由下面結(jié)構(gòu)式代表
8.權(quán)利要求1的用途,其中所述抑制劑由下面結(jié)構(gòu)式代表
全文摘要
設(shè)計(jì)和合成導(dǎo)致內(nèi)源性誘導(dǎo)睡眠脂質(zhì)(1,順-9-十八烯酰胺)水解的油酰胺水解酶抑制劑。大多數(shù)有效抑制劑具有親電子羰基,能夠可逆形成(硫代)半縮醛或(硫代)半縮酮模擬絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶催化反應(yīng)的過渡態(tài)。特別是發(fā)現(xiàn)緊密結(jié)合的α-羰基乙酯8(1.4nM)和三氟甲基酮抑制劑12(1.2nM)具有特殊的抑制劑活性。除抑制劑活性外,某些抑制劑表現(xiàn)出誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物睡眠的興奮劑活性。
文檔編號(hào)A61K31/231GK101156840SQ200710166760
公開日2008年4月9日 申請(qǐng)日期1997年6月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月26日
發(fā)明者R·A·勒爾納, C·-H·王, D·L·波格爾, S·H·亨克森 申請(qǐng)人:斯克里普斯研究學(xué)院
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