專利名稱：：由β-2’,3’-二脫氫-2’,3’-二脫氧-5-氟胞苷選擇的HIV-1突變的制作方法由p-2'，3'-二脫氫-2'，3'-二脫氧-5-氟胞苷選擇的HIV-1突變本申請是申請日為2000年1月21日、申請?zhí)枮?0802998.9、發(fā)明名稱為"由3-2'，3'-二脫氫-2'，3'-二脫氧-5-氟胞苷選擇的HIV-1突變"的專利申請的分案申請。本發(fā)明部分由美國國家健康研究所的基金資助，許可號為1R01-A1-41980-01。美國政府對本發(fā)明享有某些權(quán)利。本申請要求于1999年1月22日申請的美國臨時專利申請60/116,773的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明背景在1983年，AIDS的病因?qū)W原因被確定為人類免疫缺陷性病毒(HIV)。在1985年，報道了合成核苷3'-疊氮基-3'-脫氧胸苷(AZT)抑制人類免疫缺陷性病毒的復(fù)制。從那時起，其他一些合成核苷被證實對于抗HIV有效，包括2',3'-二脫氧肌苷(DDI)、2',3'-二脫氧胞苷(DDC)、2，,3，-二脫氫-2，,3，-二脫氧胸苷(D4T)、順-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-l-基)-1,3-氧硫戊環(huán)(FTC)、(-)-順-2-羥甲基-5-(胞噴啶-l-基)-1，3-氧硫戊環(huán)(3TC)。在細(xì)胞激酶導(dǎo)致細(xì)胞磷?；癁?'-三磷酸后，將這些合成核苷引入病毒DNA的生長鏈中，由于缺少3'-羥基而導(dǎo)致鏈終止。它們也可抑制反轉(zhuǎn)錄酶這一病毒酶。已認(rèn)識到，在長期使用抗病毒藥進(jìn)行治療之后，可出現(xiàn)HIV的抗藥性變體。最典型地，抗藥性的出現(xiàn)是由病毒復(fù)制中所使用的酶的編碼基因突變引起的，在HIV情況下，最典型的酶是反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶或DNA聚合酶。最近已證實，通過將所述化合物和第二種抗病毒化合物以及可能的第三種抗病毒化合物聯(lián)合或交替給藥，可以延長、提高或恢復(fù)藥物抗HIV感染的有效性，所述第二種抗病毒化合物以及可能的第三種抗病毒化合物誘導(dǎo)不同于所述基本藥所引起的突變的突變。此外，這類聯(lián)合或交替治療可改變藥物的藥物動力學(xué)、生物分布或其他參數(shù)。通常，聯(lián)合治療比交替治療更為優(yōu)選，因為它同時對病毒產(chǎn)生多種影響。但是，人們不能預(yù)測指定藥物在HIV-1基因組中將誘導(dǎo)什么突變、突變是永久的還是暫時的、或被經(jīng)突變的HIV-1序列感染的細(xì)胞對聯(lián)合或交替使用其他藥物的治療將怎樣響應(yīng)。對于用當(dāng)代抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物處理的長期細(xì)胞培養(yǎng)物，缺乏其中抗藥性的動力學(xué)參數(shù)，這一事實加劇了上述的不可預(yù)測性。已從接受這些藥物的長期單一治療的患者中分離出對3'-疊氮基-3'-脫氧胸苷(AZT)、2'，3'-二脫氧肌苷(DDI)或2'，3'-二脫氧胞苷(DDC)顯示出抗藥性的HIV-1變體(LarderBA,DarbyG,RichmanDD.科學(xué)(Science)，1989,243:1731-4;StClairMH,MartinJL,TuborWG等人，科學(xué)(Science)1991，253:1557-9;StClairMH,MartinJL,TudorWG等人，科學(xué)(Science)1991,253:1557-9;和FitzgibbonJE，HowellRM,HaberzettlCA,SperberSJ,GockeDJ,DubinDT.抗微生物藥物和化學(xué)療法(Antimicrob.AgentsChemother.)1992,36:153-7)。臨床數(shù)據(jù)顯示，在兒童和成人中，AZT抗藥性均是不良臨床結(jié)果的指示(MayersDL.在關(guān)于抗微生物藥物和化學(xué)療法的第32屆國際科學(xué)會議上的講稿，(Anaheim,CA.1992);Tudor-WilliamsG，StClairMH,McKinneyRE等人，柳葉刀(Lancet)，1992,339:15-9;OginoMT，DanknerWM，SpectorSA.兒科雜志(JPediatr.)1993,123:1-8;CrumpackerCS,D，AquilaRT,JohnsonVA等人，關(guān)于病毒抗藥性的第三次工作會i義(ThirdWorkshoponViralResistance)(Gaithersburg，MD.1993);以及，MayersD和RV43研究組，關(guān)于病毒抗藥性的第三次工作會議(ThirdWorkshoponViralResistance)(Gaithersburg,MD.1993))。在細(xì)胞培養(yǎng)和人臨床試驗中，HIV對于非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)的抗藥性的快速發(fā)展均已有報道(NunbergJH，SchIeifWA，BootsEJ等人，病毒學(xué)(JVirol)1991,65(9):4887-92;RichmanD,ShihCK，LowyI等人，ProcNatlAcadSci(USA)1991,88:11241-5;MellorsJW，DutschmanGE，ImGJ，TramontanoE，WinklerSR,ChengYC.MolPharm.1992,41:446-51;RichmanDD和ACTG164/168研究組，第二次國際HIV-1抗藥性工作會議，(Noordwijk,芬蘭，1993);和SaagMS，EminiEA,LaskinOL等人，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(NEnglJMed)1993，329:1065-1072)。在麗RTIL'697，661的情況下，在治療的頭2-6周內(nèi)，具有抗藥性的HIV-1出現(xiàn)，與之伴隨的是病毒敗血癥回復(fù)到治療前的水平(SaagMS，EminiEA,LaskinOL等人，NEnglJMed1993，329:1065-1072)。在包括蛋白酶抑制劑在內(nèi)的其他種類的HIV-1抑制劑的情況下，也注意到突破與抗藥株的出現(xiàn)相伴的病毒敗血癥的情況(JacobsenH,CraigCJ，DuncanIBHaenggiM，YasargilK，Mous丄關(guān)于病毒抗藥性的第三次工作會議(Gaithersburg，MD.1993))。這一經(jīng)驗使人們認(rèn)識到，在對所有用于HIV-1的新療法進(jìn)行臨床前評價的早期，必須對HIV-1抗藥性的潛在性進(jìn)行評估。2'，3，-二脫氧-2'，3'-二脫氫-5-氟胞苷(D4FC)是一種已知的化合物。歐洲專利申請公開No.0409227A2(由AjinomotoCo.,Inc.申請)公開了(3-D-D4FC(實施例2)及其在治療乙型肝炎上的用途。荷蘭專利No.8901258(由StichtingRegaV.Z.W.申請)一般地公開了5-鹵代-2'，3'-二脫氧-2，,3，-二脫氫胞苷衍生物，用于治療HIV和乙型肝炎("HBV")。美國專利No.5703058公開了一種治療HIV和HBV感染的方法，包括聯(lián)合或交替給予有效量的(3-L-D4FC和順-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫戊環(huán)、順-2-羥甲基-5-(胞嘧啶-l-基)-1，3-氧硫戊環(huán)、9-[4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯-1-基]-鳥嘌呤(carWir)、9-[2-(羥基乙氧基)甲基]-鳥嘌呤(阿昔洛韋)、干擾素、3'-脫氧-3'-疊氮基-胸苷(AZT)、2'，3，-二脫氧肌苷(DDI)、2'，3，-二脫氧胞苷(DDC)、(-)-2，-氟-5-甲基-(3-L-阿拉伯糖尿苷(L-FMAU)或2，，3，-二脫氫-2',3'-二脫氧胸苷(D4T)。美國專利No.5905070公開了一種治療HIV和HBV感染的方法，包括聯(lián)合或交替給予有效量的P-D-D4FC和順-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-l-基)-1，3-氧硫戊環(huán)、順-2-羥甲基-5-(胞嘧啶-l-基)-1,3-氧硫戊環(huán)、9-[4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯-1-基]-鳥嘌呤(carbovir)、9-[2-(羥基乙氧基)甲基]-鳥嘌呤(阿昔洛韋)、干擾素、3，-脫氧-3'-疊氮基-胸苷(AZT)、2'，3，-二脫氧肌苷(DDI)、2'，3，-二脫氧胞苷(DDC)、(-)-2'-氟-5-甲基-(3丄-阿拉伯糖尿苷(L-FMAU)或2，，3'-二脫氫-2，,3，-二脫氧胸苷(D4T)。本發(fā)明的一個目的是確定(3-D-D4FC用于治療HIV的最佳給藥方案。本發(fā)明的另一個目的是提供一種方法和包括P-D-D4FC的組合物，用于治療被HIV感染的患者，在單獨給藥P-D-D4FC后，該HIV表現(xiàn)出有利的或已改善的藥物動力學(xué)、生物分布、代謝、抗藥性或其他參數(shù)。本發(fā)明的又一個目的是提供用于治療被HIV感染的患者的方法和組合物，其中(3-D-D4FC與第二種化合物聯(lián)合或交替給藥，所述第二種化合物與卩-D-D4FC協(xié)同對抗HIV。本發(fā)明的又一個目的是提供用于治療被HIV的抗藥形式感染的患者的方法和組合物。本發(fā)明的再一個目的是提供一種方法和試劑盒以評估怎樣給藥(3-D-D4FC才最佳。發(fā)明概述已發(fā)現(xiàn)P-D-D4FC在HIV-1中在反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域的第70(K突變至N)、90或172位密碼子上誘導(dǎo)突變。基于此發(fā)現(xiàn)，提供一種治療HIV的方法，包括向需要治療的人給予I3-D-D4FC或其可藥用前體或鹽，其與一種在HIV-1中在除反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域的第70(K突變至N)、卯或172位密碼子以外的位點上誘導(dǎo)突變的藥物聯(lián)合使用或交替使用。可參考已發(fā)表的針對已知抗HIV藥物的突變模式，或通過確定針對新藥的突變模式，實施本發(fā)明?；诖税l(fā)現(xiàn)，也提供一種對患者使用卩-D-D4FC作為"搶救治療"的方法，所述患者對其他抗HIV藥物表現(xiàn)出抗藥性。已發(fā)現(xiàn)(i-D-D4FC與AZT、DDC、DDI、D4T、3TC、(-)-FTC或卩-L-D4FC沒有顯著的交叉抗藥性。相反，(3-L-D4FC在第184位密碼子上快速誘導(dǎo)突變(蛋氨酸至纈氨酸)，產(chǎn)生對3TC和FTC的高水平抗藥性。(3-D-D4FC通?？勺鳛閾尵戎委熡糜谌魏卧诔鲜龅?0(K突變至N)、90或172位密碼子以外的位點上誘導(dǎo)突變的藥物表現(xiàn)出抗藥性的患者。本文公開的發(fā)明一般地至少包括以下實施方案(i)治療人體中HIV感染的方法，包括向所述人給予有效量的任選位于藥用載體中的[3-D-D4FC或其可藥用前體或鹽，其與一種在HIV-1中在除反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域的第70(K突變至N)、90或172位密碼子以外的位點上誘導(dǎo)突變的藥物聯(lián)合使用或交替使用，該藥物不是順隱2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-l-基)-1，3-氧硫戊環(huán)、順-2-羥甲基-5-(胞嘧啶-l-基)-U-氧硫戊環(huán)、9-[4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯-1-基]-鳥嘌呤(carbovir)、9-[2-(羥基乙氧基)甲基]-鳥嘌呤(阿昔洛韋)、干擾素、3，-脫氧-3'-疊氮基-胸苷(AZT)、2'，3，-二脫氧肌苷(DDI)、2'，3，-二脫氧胞苷(DDC)、(-)-2，-氟-5-甲基-卩丄-阿拉伯糖尿苷(L-FMAU)或2，，3，-二脫氫-2，,3，-二脫氧胸苷(D4T)。(ii)治療人體中HIV感染的方法，包括向所述人給予有效量的任選位于藥用載體中的P-D-D4FC或其可藥用鹽，其與一種在HIV-1中在反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域的第70位密碼子上誘導(dǎo)K突變?yōu)镹(即，賴氨酸至天冬酰胺)、在第90位密碼子上誘導(dǎo)V突變?yōu)镮(即，纈氨酸至異亮氨酸)或在第172位密碼子上誘導(dǎo)R突變?yōu)镵(即，精氨酸至賴氨酸)的藥物聯(lián)合使用或交替使用，該藥物不是順-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-l-基)-1，3-氧硫戊環(huán)、順-2-羥甲基-5-(胞嘧啶-l-基)-1,3-氧硫戊環(huán)、9-[4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯-1-基]-鳥嘌呤(carbovir)、9-[2-(羥基乙氧基)甲基]-鳥嘌呤(阿昔洛韋)、干擾素、3'-脫氧-3，-疊氮基-胸苷(AZT)、2'，3，-二脫氧肌苷(DDI)、2'，3，-二脫氧胞苷(DDC)、(-)-2，-氟-5-甲基-p-L-阿拉伯糖尿苷(L-FMAU)或2，，3，-二脫氫-2，，3，-二脫氧胸苷(D4T)。(iii)治療被對3TC具有抗藥性的HIV病毒株感染的患者的方法，包括向該患者給予有效量的任選位于藥用載體中的P-D-D4FC或其可藥用前體或鹽。(iv)治療被對AZT具有抗藥性的HIV病毒株感染的患者的方法，包括向該患者給予有效量的任選位于藥用載體中的P-D-D4FC或其可藥用前體或鹽。(v)治療被對順-2-羥甲基-5-(氟胞嘧啶-l-基)-1,3-氧硫戊環(huán)具有抗藥性的HIV病毒株感染的患者的方法，包括向該患者給予有效量的任選位于藥用載體中的(3-D-D4FC或其可藥用前體或鹽。(vi)治療被對順-2-羥甲基-5-(胞嘧啶-l-基)-1，3-氧硫戊環(huán)具有抗藥性的HIV病毒株感染的患者的方法，包括向該患者給予有效量的任選位于藥用載體中的(3-D-D4FC或其可藥用前體或鹽。(vii)治療被對2，,3，-二脫氫-2，，3，-二脫氧胸苷(D4T)具有抗藥性的HIV病毒株感染的患者的方法，包括向該患者給予有效量的任選位于藥用載體中的(3-D-D4FC或其可藥用前體或鹽。(viii)治療被對2',3'-二脫氧肌苷(DDI)具有抗藥性的HIV病毒株感染的患者的方法，包括向該患者給予有效量的任選位于藥用載體中的(3-D-D4FC或其可藥用前體或鹽。(ix)治療被對2',3'-二脫氧胞苷(DDC)具有抗藥性的HIV病毒株感染的患者的方法，包括向該患者給予有效量的任選位于藥用載體中的(3-D-D4FC或其可藥用前體或鹽。(x)治療被HIV感染的患者的方法，包括向該患者以聯(lián)合或交替的方式給予有效量的P-D-D4FC或其可藥用前體或鹽和有效量的(S)-6-氯-4-環(huán)丙基乙炔基-4-三氟甲基-1,4-二氫-211-3,1-苯并噁嗪-2-酮(SUSTIVA，參見美國專利No.551卯21)。本文所公開的聯(lián)合、交替或搶救方案在預(yù)防和治療HIV感染和其他相關(guān)病癥中是有用的，所述其他相關(guān)病癥例如為AIDS相關(guān)性綜合癥(ARC)、持久擴(kuò)散性淋巴結(jié)病(PGL)、AIDS相關(guān)性神經(jīng)病、抗HIV抗體陽性和HIV陽性的病癥、卡波西肉瘤、血小板減少性紫癜和條件性病原微生物感染。此外，這些化合物或制劑可預(yù)防性地用于防止或阻礙抗HIV抗體或HIV陽性的或接觸HIV的個體的臨床疾病的進(jìn)展。附圖簡述圖1是顯示(3-D-D4FC的圖。圖2是顯示(3-D-D4FC的濃度(微摩爾)與p24抗原產(chǎn)生的Q/。抑制關(guān)系的圖。該圖說明對(3-D-D4FC敏感性降低的病毒的選擇。發(fā)明詳述I.定義本文中使用的術(shù)語"抗藥性病毒"指的是，與恒定細(xì)胞系中的原初病毒相比，其ECsQ增加三倍、更典型地是增加五倍或更多的病毒，所述恒定細(xì)胞系包括但不限于外周血單核細(xì)胞(PBMC)或者M(jìn)T2或MT4細(xì)胞。術(shù)語D-D4FC可與下面的術(shù)語P-D-D4FC互換使用。本文中使用的術(shù)語"基本上純"或"基本上以一種光學(xué)異構(gòu)體的形式"指的是，核苷組合物至少包括95%-98%、或更優(yōu)選99%-100%的單一一種核苷對映體。在一優(yōu)選實施方案中，以基本上純的形式施用p-D-D4FC，用于任一所公開的適應(yīng)癥。本文中使用的術(shù)語"前藥"指的是，D-D4FC經(jīng)5，和N"?；⑼榛蛄柞；?包括單、二和三磷酸酯以及穩(wěn)定的磷酸酯和磷脂)的衍生物。在一實施方案中，?；鶊F(tuán)是羧酸酯，其中酯基基團(tuán)的非羰基部分選自直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烷氧基垸基(包括甲氧基甲基)、芳垸基(包括芐基)、芳氧烷基(包括苯氧基甲基)、芳基(包括任選被鹵素、烷基、烷基或垸氧基取代的苯基)、磺酸酯如垸基或芳烷基磺?；?包括甲基磺?；?、三苯甲基或單甲氧基三苯甲基、取代的芐基、三烷基甲硅垸基或二苯基甲基甲硅烷基。酯中的芳基最好包括苯基。所述烷基可以是直鏈、支鏈或環(huán)狀的，并優(yōu)選Q-Q8。本文中使用的術(shù)語"可藥用鹽"指的是，在給藥至接受者后，能直接或間接提供(3-D-D4FC或自身表現(xiàn)出活性的藥用鹽。本文中使用的氨基酸的縮寫述于表1中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>II.由(3-D-D4FC選擇的在HIV反轉(zhuǎn)錄酶中的突變(i-2',3，-二脫氫-2，,3'-二脫氧-5-氟胞苷(D4FC)的D和L對映體均是HIV的強(qiáng)的和選擇性的抑制劑，盡管D對映體選擇性更強(qiáng)些。通過HIV-1lm在遞增濃度的藥物的存在下在MT-2細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的連續(xù)傳代，評估對D-D4FC抗藥性的體外發(fā)展。具有D-D4FC抗藥性的變體僅在長期接觸藥物的情況下產(chǎn)生。在MT-2細(xì)胞中傳20代后獲得的病毒對D-D4FC表現(xiàn)出5.3倍的抗藥性。盡管進(jìn)行了多次嘗試，但仍不可在PBMC中分離出抗藥性病毒。從在MT-2細(xì)胞中選出的病毒得到的RT的DNA測序揭示出兩種突變K65R和V179D。D-D4FC抗藥性病毒的選擇在MT-2細(xì)胞中重復(fù)進(jìn)行，表現(xiàn)出19.3倍抗藥性的變體編碼三種新的RT突變K70N、V90I和R172K。K65R重組的HIV-ltM病毒對D-D4FC表現(xiàn)出3.9倍抗藥性。V179D是一種賦予非核苷RT抑制劑抗藥性的突變，它很可能對K65R是補(bǔ)償性的。也可通過用單一或多種突變構(gòu)建重組病毒，來評價其他突變在D4FC抗藥性中的作用。但是，所測試的重組體無一被證明具有>2倍的抗藥性。材料和方法化學(xué)物質(zhì)D-D4FC如前所述在我們的實驗室之一中合成(Shi等人，1999)。將它在無菌水中制備成10mM儲備液，并在-20'C下儲存。在臨使用前，解凍該化合物并稀釋到所希望的濃度。細(xì)胞MT-2細(xì)胞(AIDS研究和參考試劑計劃，國家過敏和傳染性疾病研究所，國家健康研究所，由D.Richman提供)在補(bǔ)充有10%胎牛血清、10mMHEPES緩沖液、青霉素(50IU/ml)和鏈霉素(50iag/ml)的RPMI1640(WhittakerM.A.,Bioproducts，Walkersville，MD)中培養(yǎng)。病毒HIV-luu是一種經(jīng)分子克隆的臨床分離物，既用作用于抗藥性選擇的起始病毒，又用于重組突變體的產(chǎn)生。通過將5-10jig的原病毒質(zhì)粒DNA電穿孔入1.3xl(^MT-2細(xì)胞中，制備HIV-lLA!的儲備制備物。當(dāng)病毒的細(xì)胞致病作用達(dá)到頂峰(通常是轉(zhuǎn)染后7天)時，收集來自被感染的培養(yǎng)物的上清液，等分并在-80'C下儲存直至使用。在MT-2細(xì)胞中，利用三倍終點稀釋來測定病毒制備物的效價，用Reed和Muench方程式計算TCID5。?？顾幮圆《镜倪x擇在開始選擇之前，在不存在藥物的條件下，將起始病毒(HIV-1lAI)作為無細(xì)胞的病毒在MT-2細(xì)胞中傳代10個周期。通過在濃度逐步遞增的D-D4FC的存在下在MT-2細(xì)胞中連續(xù)傳代HIV-1卬，來選擇D-D4FC抗藥性病毒。D-D4FC抗藥性病毒的選擇進(jìn)行兩次。通過用O.Olmol病毒接種lxl()eMT-2細(xì)胞來開始選擇。當(dāng)病毒的細(xì)胞致病作用達(dá)到頂峰(感染后4-7天)時，收集來自被感染的培養(yǎng)物的上清液，隨后將0.1-0.3ml用于引發(fā)另一輪的感染。等分上清液并在-8(TC下儲存，用于表征所選擇的病毒。病毒在每一濃度下至少傳代三次，在指定濃度的藥物存在下的周期數(shù)取決于病毒在特定濃度的D-D4FC中生長的能力。在首次選擇過程中，在增加藥物濃度之前，將病毒在藥物不存在的情況下傳代一次(表2)。作為對照，也在藥物不存在的情況下平行地使病毒傳代。首次選擇在0.75jiM下開始，并在37個無細(xì)胞傳代周期的進(jìn)程中逐步增加至4.(^M。第二次選擇在0.2^iM下開始，并在27個無細(xì)胞傳代周期的進(jìn)程中逐步增加至6.2pM(表2)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>抗病毒敏感性實驗通過測量對p24抗原產(chǎn)生的％抑制，測量病毒對D-D4FC的敏感性。簡言之，MT-2細(xì)胞(lxl()S細(xì)胞/ml)在連續(xù)稀釋度的D-D4FC存在下用0.01moi的病毒感染。每一稀釋度平行測試三次。在感染后第7天收獲培養(yǎng)上清液，并使用商品化的檢驗法(DuPont，NEN產(chǎn)品，Wilmington,Del.)來檢驗對p24抗原產(chǎn)生的％抑制。將病毒敏感性表示為50。/。抑制p24抗原產(chǎn)生(ECso)所需的藥物濃度。所選病毒反轉(zhuǎn)錄酶的DNA測序使用TRIzol試劑(GibcoBRL，GrandIsland,NY)分離來自所選病毒的病毒RNA(vRNA)。利用RT-PCR擴(kuò)增全長RT編碼區(qū)域。隨后，PCR產(chǎn)物使用WizardPCRprep(Promega,Madison,WI)純化并測序。突變型重組體HIV-1的產(chǎn)生使用AlteredSitesII體外誘變系統(tǒng)(Promega,Madison,WI)產(chǎn)生突變型RT。誘變在HIV-1^a、被克隆進(jìn)誘變載體(PALTER,Promega)的RT上進(jìn)行。通過對RT基因直接測序，測定所希望的突變的存在。隨后，將突變型RT連接到pxxHIV-lLM載體中。然后，如上所述，通過將5-10(igDNA電穿孔入1.3xl(^個MT-2細(xì)胞中，制備突變型病毒的儲備物。結(jié)果與討論抗藥性病毒的表型在MT-2細(xì)胞中在37(選擇#1)和20(選擇#2)個感染周期后，選擇D-D4FC抗藥性病毒。對來自選擇#1傳了37代的病毒(p37D-D4FC#l)的D-D4FC敏感性的評價證明，正如EC50從0.21pM增加到4.07^M所證實(圖2，表3)，p37D-D4FC#1的D-D4FC敏感性比野生型低19.4倍。對來自選擇#2傳了20代的病毒(p20D4FC#2)的D-D4FC敏感性的評價證明，正如ECso從0.21fiM增加到UpM所證實(圖2，表3)，p20D-D4FC#2的D-D4FC敏感性比野生型低5.3倍?？顾幮圆《镜幕蛐头蛛x來自p37D-D4FC#l和p20D-D4FC弁2的vRNA，并利用RT-PCR擴(kuò)增。對PCR產(chǎn)物的測序揭示在p37D-D4FC#1中存在三個新的突變K70N(AAA—4AAT)、V卯I(GTT—ATT)和R172K(AGA—AAA)(表2)。在p20D-D4FC#2中鑒定了兩個不同的突變K65R(AAA—AGA)和V179D(GTT—GAT)(表3)。在來自這些病毒的RT基因(從氨基酸8-330)中沒有發(fā)現(xiàn)其他突變。另外，在藥物不存在的條件下平行傳代的對照病毒中，沒有發(fā)現(xiàn)突變。用不同的有關(guān)突變對D4FC抗藥性病毒進(jìn)行的分離，可以使用用于分離D4FC抗藥性病毒的不同選擇技術(shù)進(jìn)行。在選擇#1中，在增加藥物濃度之前，在一個感染周期中除去選擇壓力。在第二個選擇方法中，不進(jìn)行此操作。此外，用于每一選擇方法的D-D4FC起始濃度變化約3倍。對選擇弁1使用較高的藥物起始濃度(0.75pM)。這兩個不同點可能是在所選病毒中觀察到不同突變的原因。突變型重組體HIV-1:含有在所選病毒中鑒定的突變的突變型重組體HIV-1經(jīng)定點誘變產(chǎn)生。表4列出所產(chǎn)生的每一種突變型重組病毒以及相應(yīng)的EC5。。盡管K65R病毒xxHIV-l^證實其對D-D4FC的敏感性降低3.9倍，但其他病毒無一顯示出>3.0倍的抗藥性。但是，應(yīng)注意到，三重突變(xxHIV-lLAI，K70N/V90I/R172K)生長得不好，這可能是不能再現(xiàn)在經(jīng)體外選擇的病毒中所觀察到的抗藥性的原因。表3MT-2細(xì)胞中由D-D4FC選擇的病毒的敏感性和相關(guān)突變<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表5所列的是，在被急性感染的人PBM細(xì)胞中(第6天)的平均有效濃度和對于D-D4FC單獨使用或與AZT和D4T聯(lián)合使用的聯(lián)合指數(shù)(C.I.)。表6說明p-D-D4FC或p-L-D4FC在人PBM細(xì)胞中對抗HIV-1和已克隆的病毒的作用。表5在被急性感染的人PBM細(xì)胞中(第6天)，針對D-D4FC單獨使用或與AZT或D4T聯(lián)合使用的平均有效濃度及聯(lián)合指數(shù)(C丄)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>am是斜率士標(biāo)準(zhǔn)偏差，EC5o是平均有效濃度，r是相關(guān)系數(shù)，如由效果中值曲線所確定。bCl<l、=1或>1，指示協(xié)同性、附加性和對抗性。Fa是效果中值方程式的一個組分，指受影響的系統(tǒng)部分(例如，0.50意味著在RT活性降低50。/。的C丄)。C丄值被測定用于相互非排斥的作用(用斜體字表示的值針對相互排斥作用，該作用較弱)。200710166676.8轉(zhuǎn)溢a被15/413表6(<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>III.HIV藥物的聯(lián)合或交替通常，在交替治療過程中，按順續(xù)地給予有效劑量的每一種藥物，而在聯(lián)合治療中，一同給予有效劑量的兩種或更多種藥物。在交替治療中，例如可以給予有效量的一種或多種第一藥物并達(dá)有效的一段時間以治療病毒感染，然后，在治療程序中用一種或多種第二藥物替換那些第一藥物，并同樣以有效量給予并達(dá)有效的一段時間。劑量取決于每種藥物的吸收、生物分布、代謝和排泄率等因素，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的其他因素。應(yīng)注意的是，劑量值也隨有待減輕的病況的嚴(yán)重程度而變化?？蛇M(jìn)一步理解的是，對于任何具體的受治對象，應(yīng)依據(jù)個體需要和給予或監(jiān)督給予所述組合物的人的專業(yè)判斷，調(diào)節(jié)具體的劑量方案和時間表。對于抗HIV化合物，包括核苷衍生物(如AZT、D4T、DDI和3TC)或蛋白酶抑制劑，如奈非那韋(nelfi譜ir)和印地那韋(indinavir)，合適的劑量范圍的實例可在科學(xué)文獻(xiàn)和醫(yī)生手冊(PhysiciansDeskReference)中找到。對于本文所述的其他化合物，合適的劑量范圍的一些實例也可在公共文獻(xiàn)中找到，或者可以通過已知的方法得以確定。這些劑量范圍可按所需進(jìn)行改變，以獲得所希望的結(jié)果。在一優(yōu)選實施方案中，D-D4FC與一種蛋白酶抑制劑聯(lián)合給藥。在具體實施方案中，D-D4FC與印地那韋(Crixivan)、奈非那韋([3S-[2(2S3S"，3-oc,4陽a-(3,8a-P-]]匿N-(l,l-二甲基乙基)十氫-2-)2-羥基-3-[(3-羥基-2-甲基苯甲?；?氨基]-4-(苯基硫代)丁基]-3-異喹啉羧酰胺單甲磺酸酯)(Viracept)、沙奎那韋(saquinavir)(Invirase)或141W94(安普那韋(amprenavir);(S)-四氫呋喃-3-基-N-[(lS,2R)-3-[N-[(4-氨基苯基)磺?；鵠-N-異丁基氨基]-l-芐基-2-羥丙基]氨基甲酸酯；或艾發(fā)韋安"￡&^6112)(8)-6-氯-4-(環(huán)丙基乙炔基)-1，4-二氫-4-(三氟甲基)-211-3,1-苯并嚼嗪-2-酮)聯(lián)合或交替給藥。在另一優(yōu)選實施方案中，D-D4FC與一種核苷類似物聯(lián)合或交替給藥，該核苷類似物包括阿波卡韋(abacavir)(1592U89),即(lS，4R)-4-[2-氨基-6-環(huán)丙基-氨基)-9H-嘌呤-9-基]-2-環(huán)戊烯-l-甲醇琥珀酸酯。在另一實施方案中，D-D4FC與一種非核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑聯(lián)合給藥，非核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑例如為DMP-266((S)-6-氯-4-環(huán)丙基乙炔基-4-三氟甲基-1，4-二氫-211-3，1-苯并嚼嗪-2-酮(SUSTIVA，參見美國專利No.5519021);地拉韋定(delavirdine)(1-[3-(1-甲基-乙基)-氨基]-2-吡啶基-4-[[5-[(甲基磺?；?氨基]-lH-吲哚-2-基]羰基]-,單乙基磺酸酯)、奈韋拉平(nevirapine)或地拉韋定(delarvirdine)。在其他實施方案中，D-D4FC與HIV整合酶抑制劑或趨化因子抑制劑聯(lián)合或交替給藥。II.分析由D-D4FC誘導(dǎo)的HIV基因組突變類似于授權(quán)給Larder等的美國專利No.5409810中所述針對AZT的方法和試劑盒但基于針對D-D4FC的突變情形的方法和試劑盒，可用于分析由D-D4FC誘導(dǎo)的突變的存在，由此構(gòu)成本發(fā)明的一部分。除將該Larder專利以全文引入作為參考之外，還在下面對這些技術(shù)進(jìn)行描述。在本發(fā)明的一個方面，提供評價HIV-1樣品對D-D4FC敏感性的方法，包括(i)從樣品中分離核酸；(ii)將一寡核苷酸雜交到該核酸上，所述寡核苷酸與野生型DNA序列(或其相應(yīng)的RNA)的一個區(qū)域或突變型DNA序列(或其相應(yīng)的RNA)的一個區(qū)域互補(bǔ)；(iii)嘗試從所述寡核苷酸的3'端聚合所述核酸；(iv)確定由寡核苷酸引物延伸的產(chǎn)物是否存在。在此方法中使用自HIV-1樣品中分離的基因組DNA或RNA是可能的。將用于支持HIV-1分離物生長的合適的細(xì)胞溫育一段時間。通過離心回收細(xì)胞。然后，可通過在EDTA和去垢劑如SDS的存在下用蛋白酶K消化所述細(xì)胞，來分離DNA，然后用苯酚提取。熟知的提取和純化方法可用于從樣品中分離DNA?？墒褂靡韵路椒ǚ蛛xRNA。使合適的細(xì)胞感染并溫育一段時間。通過離心回收這些細(xì)胞。將細(xì)胞再次懸浮在RNA提取緩沖液中，然后使用蛋白酶消化緩沖液和蛋白酶K進(jìn)行消化。在苯酚/氯仿混合物的存在下除去蛋白。然后，在進(jìn)一步的離心步驟之后，可回收RNA。(Maniatis，T.等，分子克隆，實驗室手冊，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,(1989))。盡管由于核酸在HIV-1樣品中相對缺乏而使用未經(jīng)擴(kuò)增的核酸也是可以的，但優(yōu)選將其擴(kuò)增?？墒褂镁酆厦告湻磻?yīng)(PCR)技術(shù)選擇性地擴(kuò)增核酸，PCR為體外方法，用于從小量模板產(chǎn)生大量具有限定長度的特定核酸片段和序列。所述PCR由標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)物組成，其中采用Mg^濃度、寡核苷酸引物和使用該引物擴(kuò)增RT基因的溫度循環(huán)條件。挑選引物，從而使所選引物擴(kuò)增整個RT基因或含有對應(yīng)于HIV-1的野生型DNA序列的一個區(qū)域的核苷酸的所選序列，所述DNA序列包括所述發(fā)生突變的密碼子。RNA不能通過PCR直接擴(kuò)增。其相應(yīng)的cDNA必須是合成的。cDNA的合成通常使用寡dT引物通過被引發(fā)的反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。有利的是，對引物進(jìn)行選擇以便使他們簡化進(jìn)行RT的核酸序列或含有對應(yīng)于所述RNA區(qū)域的核苷酸的所選序列，所述RNA或?qū)?yīng)于與反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域的第70(K突變至N)、90或172位密碼子相對應(yīng)的突變型DNA序列的所述區(qū)域。這可通過制備與RNA鏈的一個區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸引物來完成，所述RNA鏈為野生型DNA序列的相應(yīng)序列的上游。然后，可以以同樣方式將由此法(參見Maniatis，T.等，同上)制備的cDNA用于已討論過的DNA。此法的下一階段是將寡核苷酸雜交到所述核酸上，該寡核苷酸與野生型DNA序列(或其相應(yīng)RNA)的一個區(qū)域互補(bǔ)，或與突變型DNA序列(或其相應(yīng)RNA)的一個區(qū)域互補(bǔ)。然后提供條件和試劑以允許所述核酸從寡核苷酸引物的3'端聚合。這類聚合反應(yīng)是本領(lǐng)域所熟知的。如果寡核苷酸引物在其3'端具有一個與突變型基因型互補(bǔ)的核苷酸，該突變型基因型在RT區(qū)域中在第70(K變至N)、卯或172位密碼子發(fā)生核苷酸改變，則所述核酸序列的聚合將僅在樣品核酸與突變型基因型相同的時候發(fā)生。野生型核酸序列的聚合將不會發(fā)生或至少不以顯著的程度發(fā)生，因為在寡核苷酸引物3'端的核苷酸和樣品的核酸序列之間不匹配。如果寡核苷酸引物在其3，末端具有一個與野生型基因型互補(bǔ)的核苷酸，即，該基因型在RT區(qū)域中在第70(K突變至N)、90或172位密碼子為野生型核苷酸，則在該位置上將發(fā)生野生型的核酸序列聚合。在該3，位置上具有突變型核苷酸的核酸將不發(fā)生聚合。每一寡核苷酸的優(yōu)選長度是15-20個核苷酸。寡核苷酸可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行制備(Koster,H.，藥物研究(DrugResearch)，30,第548頁(1980);Koster,H.,四面體通訊(TetrahedronLetters)，第1527頁(1972);Caruthers,四面體通訊(TetrahedronLetters)，第719頁(1980);四面體通訊(TetrahedronLetters)，第1859頁(1981);四面體通訊(TetrahedronLetters)，24，第245頁(1983);Gate.M.核酸研究(NucleicAcidResearch)，8，第1081頁(1980))，通常使用自動化DNA合成儀如AppliedBiosystems381A合成儀進(jìn)行制備。確定由寡核苷酸引物延伸的產(chǎn)物的存在是很方便的。用于該檢測的方法通過使用適宜的標(biāo)記來完成。標(biāo)記可方便地被連接到寡核苷酸引物或連接到將與由引物延伸的聚合產(chǎn)物結(jié)合的其他分子上。標(biāo)記例如可以是酶、放射性同位素或熒光染料。優(yōu)選的標(biāo)記可以是生物素，它可隨后使用與酶如過氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素來檢測。例如可通過在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行聚合反應(yīng)的跑膠和觀察用溴化乙錠標(biāo)記的特定DNA片段，檢測由寡核苷酸引物延伸的聚合產(chǎn)物的存在，或?qū)ζ溥M(jìn)行Southern印跡和放射自顯影以檢測與聚合產(chǎn)物相對應(yīng)的帶的存在與否。如果僅對應(yīng)于標(biāo)記寡核苷酸的主要帶存在，則意味聚合已發(fā)生。如果具有正確的預(yù)定尺寸的帶存在，則意味聚合已發(fā)生。例如，將如本文所述從患者的淋巴細(xì)胞中分離的DNA用作PCR擴(kuò)增的模板，并使用與擴(kuò)增序列匹配或不匹配的合成寡核苷酸引物。已證實PCR在檢測這些突變中具有可行性。PCR使用擴(kuò)增不應(yīng)突變系統(tǒng)(AmplificationRefractoryMutationSystem,"ARMS")(Newton,C.R.等，核酸研究(NucleicAcidsResearch),17，第2503頁，(1989))。產(chǎn)生合成的寡核苷酸，其與特定突變所在區(qū)域相臨近的區(qū)域退火，從而，寡核苷酸的3'ENDE與突變型或野生型序列配對或不配對。進(jìn)行PCR，其導(dǎo)致對其中發(fā)生配對的DNA片段的識別(使用凝膠電泳)，或?qū)ζ渲邪l(fā)生失配的片段的不識別。如本文所述，DNA從經(jīng)HIV-1感染的T細(xì)胞中提取出，并使用這些引物進(jìn)行"ARMS"PCR分析。如上所述，通過使用寡核苷酸引物來鑒定片段的存在，即，通過將寡核苷酸引物用于已擴(kuò)增的DNA片段在嚴(yán)格條件下嘗試聚合，來進(jìn)行鑒定，所述引物可經(jīng)過標(biāo)記，所述嚴(yán)格條件只允許互補(bǔ)的DNA雜交(唯一的區(qū)別是不必進(jìn)行示差雜交，這是因為所述DNA無論源自突變型DNA還是源自野生型DNA，用"ARMS"方法擴(kuò)增的DNA的片段都是相同的。因此可使用共同的寡核苷酸檢測這些片段的存在。這一寡核苷酸的序列源自在各HIV-1株間是保守的DNA片段內(nèi)的DNA序列)?？烧{(diào)整上述PCR實驗，以能夠直接檢測在來自PBL樣品的DNA中與D-D4FC抗藥性相關(guān)的突變，所述PBL樣品來自被感染的個體且未經(jīng)培養(yǎng)以獲得病毒。由于該材料通常比被感染的淋巴培養(yǎng)物中的材料含有大為減少的HIV-1DNA，因此可使用"雙倍PCR"(或嵌套集合)方案(Simmonds，P.，Balfe，P，Peutherer,J.R，Ludlam，C.A.,Bishop,J.O.和LeighBrown,A丄，病毒學(xué)雜志(J.Virol.),64,864-872，(1990))，以增加在樣品中目標(biāo)HIV-1RTDNA信號的量。雙倍PCR克服了稀有模板序列的有限擴(kuò)增問題。少量的欲擴(kuò)增材料可與特別設(shè)計的引物對一起用于第二次PCR中，所述引物對允許對野生型和突變型殘基進(jìn)行區(qū)別。適用于在一實驗中確定HIV-1樣品對D-D4FC抗藥狀況的測試試劑盒包括一寡核苷酸，如本文所述，所述寡核苷酸與野生型DNA序列(或其相應(yīng)的RNA)的一個區(qū)域或突變型DNA序列的一個區(qū)域互補(bǔ)；從所述寡核苷酸3'端聚合及確定由寡核苷酸引物延伸的產(chǎn)物存在的方法所需要的其他材料。所述試劑盒利用依據(jù)本發(fā)明第一方面的方法。所述其他材料包括適宜的酶、緩沖劑和洗滌溶液，以及必要情況下的標(biāo)記和針對該標(biāo)記的底物。如果使用PCR擴(kuò)增核酸，則應(yīng)包括附加材料，如適宜的寡核苷酸引物和dNTP，所述寡核苷酸引物將擴(kuò)增野生型DNA序列(或其相應(yīng)的RNA)的一個區(qū)域或本文所述突變型DNA序列(或其相應(yīng)的RNA)的一個區(qū)域。在本發(fā)明的第二方面，提供一種確定HIV-1樣品對D-D4FC敏感性的方法，包括(i)從樣品中分離核酸；(ii)將一寡核苷酸雜交到該核酸上，所述寡核苷酸與野生型DNA序列(或其相應(yīng)的RNA)的一個區(qū)域或圖1所示的突變型DNA序列(或其相應(yīng)的RNA)的一個區(qū)域互補(bǔ)，該區(qū)域含有在RT區(qū)域中在第70(K突變至N)、卯或172位密碼子區(qū)域上一個或多個核苷酸；和(iii)確定任何產(chǎn)生的寡核苷酸和核酸的雜交體是否在這些位置中的一個上具有互補(bǔ)核苷酸。優(yōu)選對寡核苷酸進(jìn)行這樣的設(shè)計以致形成與其補(bǔ)體完美配對的雜交體。如本發(fā)明第一方面所述，通過前述方法從樣品中分離核酸(DNA或RNA)。類似地，PCR可用于擴(kuò)增RTDNA(或其相應(yīng)RNA)或優(yōu)選用于擴(kuò)增RTDNA(或其相應(yīng)RNA)的一個區(qū)域，該區(qū)域包含在指定位置上含有一個或多個所述核苷酸的DNA(或其相應(yīng)RNA)。在此法的第二階段，將該核酸用于與寡核苷酸雜交，所述寡核苷酸與野生型DNA序列(或其相應(yīng)的RNA)的一個區(qū)域或突變型DNA序列的一個區(qū)域互補(bǔ)。寡核苷酸可以具有任何長度，這取決于受檢測的目標(biāo)核苷酸的位置。如果所設(shè)計的寡核苷酸僅在一個目標(biāo)位置上包括一核苷酸，則該核苷酸優(yōu)選位于或接近所述寡核苷酸的中心位置。為了確定寡核苷酸和核酸序列是否已形成配對的雜交體，設(shè)置特定的雜交條件，從而只有當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域的第70(K突變至N)、90或172位密碼子上的一個或多個核苷酸與允許或不允許雜交的寡核苷酸的一個或多個相應(yīng)核苷酸互補(bǔ)時，雜交體才形成。在進(jìn)行雜交步驟之前確定例如反應(yīng)溫度和鹽溶液濃度是重要的，這樣做用來發(fā)現(xiàn)對保障特異性足夠嚴(yán)格的條件(Maniatis，T.等，分子克隆，實驗室手冊(MolecularCloning,ALaboratoryManual)，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,(1989))。如果寡核苷酸探針具有一DNA序列，該序列在其對應(yīng)于反轉(zhuǎn)錄酶的第70(K突變至N)、卯或172位密碼子的一個或多個核苷酸上與野生型核酸序列互補(bǔ)，則該寡核苷酸將與野生型核酸完美雜交。如果不存在與野生型核酸的完美雜交，則意味著從同一樣品中分離的核酸含有一種或多種突變。如果寡核苷酸探針具有與突變型核酸序列互補(bǔ)的DNA序列，則該寡核苷酸將雜交到突變型核酸上。如果不發(fā)生雜交，則意味著從樣品中分離的核酸不含有這一或這些突變?？蓸?biāo)記寡核苷酸探針，作為如本發(fā)明第一方面所述檢測的工具。雜交和隨后未雜交的核酸的除去，在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行，它只允許互補(bǔ)DNA的雜交而不允許包含不匹配核苷酸的寡核苷酸的雜交(即，如所述使用球蛋白或HLA-DQa基因(Saikt，R.K.等人，自然(Nature),324，第163頁，(1986))、活化的Ras基因(VerLaan-De，Vries,M.等人，基因(Gene)，50，第313頁，(1986))和(3地中海貧血(Wong,C.等人，自然(Nature),330，第383頁，(1987))用于檢測鐮狀細(xì)胞突變的寡核苷酸特異性雜交)?？赏ㄟ^將RT核酸序列固定到硝酸纖維素、尼龍或其他固相基質(zhì)上，進(jìn)行雜交(如斑點印跡)。通過使用標(biāo)記工具來測定雜交體的存在是很方便的。例如，可使用酶、放射性同位素或熒光染料適當(dāng)?shù)貥?biāo)記化學(xué)合成的寡核苷酸探針。優(yōu)選的探針可以是生物素，它可隨后使用與酶如過氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素來檢測。此外，通過將上述未標(biāo)記的化學(xué)合成的寡核苷酸固定到上述固相載體上和隨后用前述標(biāo)記的RT核酸序列進(jìn)行雜交，也可完成雜交。在上述的兩種針對雜交所討論的情況中，將引入合適的對照反應(yīng)，以確定有效雜交的發(fā)生(如寡核苷酸雜交到互補(bǔ)的寡核苷酸上)。結(jié)果易于解釋為，經(jīng)分離的核酸或雜交到野生型寡核苷酸上，或雜交到突變型寡核苷酸上。適用于實驗中以確定HIV-1樣品對D-D4FC的敏感性的測試試劑盒包括一寡核苷酸，如本文所述，所述寡核苷酸與野生型DNA序列(或其相應(yīng)的RNA)的一個區(qū)域或突變型DNA序列的相關(guān)區(qū)域互補(bǔ)；進(jìn)行雜交所需要的其他材料。該試劑盒利用依據(jù)本發(fā)明第二方面的方法。所述其他材料包括適宜的緩沖劑和洗滌溶液，以及必要情況下的標(biāo)記和針對該標(biāo)記的底物。通常將寡核苷酸標(biāo)記。如果在雜交前使用PCR擴(kuò)增核酸，則應(yīng)包括附加材料，如適宜的寡核苷酸引物、適宜的酶和dNTP(脫氧核苷三磷酸)，所述寡核苷酸引物將擴(kuò)增野生型DNA序列(或其相應(yīng)的RNA)的一個區(qū)域或突變型DNA序列的一個區(qū)域。在所述實驗的另一種替代形式中，擴(kuò)增中的dNTP可與檢測分子如放射性同位素、生物素、熒光染料或酶偶聯(lián)或未偶聯(lián)。使用RNA擴(kuò)增系統(tǒng)在分離自臨床樣品的HIV-1RTRNA中檢測zidovudine抗藥性突變也是可能的。使用Guatelli等人所述的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.，(USA)，8/7，1874-1878，U9卯年3月))，通過使用對于逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制所必需的三種酶活性反轉(zhuǎn)錄酶、RNaseH和DNA依賴性RNA聚合酶，可在等溫條件下在體外按指數(shù)規(guī)律地復(fù)制(擴(kuò)增)一目標(biāo)核酸序列。這一方法可在雜交步驟之前應(yīng)用，以將突變型與前述野生型核苷酸區(qū)分開。藥物組合物的制備對于患有由本文所述疾病、特別是HIV感染引起的所述疾病的人可如下進(jìn)行治療，對患者給以有效量的位于藥用載體或稀釋劑中的D-D4FC或其可藥用鹽或前體，用于如本文具體所述的任何適應(yīng)癥或給藥方式?；钚晕镔|(zhì)可以以液體或固體形式，通過任何適當(dāng)?shù)耐緩浇o藥，例如口服、腸胃外給藥、腸內(nèi)給藥、靜脈注射、皮內(nèi)給藥、皮下給藥、透皮給藥、鼻內(nèi)給藥或局部給藥。將活性化合物包含在可藥用載體或稀釋劑中，其量足以對患者釋放出治療有效量的化合物以抑制病毒在體內(nèi)的復(fù)制，尤其是HIV的復(fù)制，而對受治療的患者不產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性作用。"抑制劑量"是指足夠產(chǎn)生抑制作用例如按照上述測試方法測定的抑制作用的活性成分的里。在所有的上述條件下，優(yōu)選的化合物劑量可以是約l-75mg/kg，優(yōu)選1-20mg/kg體重每天，更一般的情況下，為每天每千克受治者體重0.1-約100mg?？伤幱醚苌锏挠行┝糠秶梢愿鶕?jù)釋放的母體核苷的重量進(jìn)行計算。如果衍生物本身具有活性，可以按照上述方法用衍生物的重量，或者按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它方法估算有效劑且雖?；衔锟煞奖愕匾詥挝粍┝啃问交蛉魏芜m當(dāng)?shù)膭┝啃问浇o藥，包括但不限于每單位劑量形式含有7-3000mg，優(yōu)選70-1400mg的活性成分。通常50-1000mg的口服劑量是方便的?；钚猿煞莸睦硐虢o藥方式是活性化合物的血漿峰濃度達(dá)到約0.02-70mmol，優(yōu)選約0.5-10mM，這一點可以通過，例如靜脈注射0.1-25%活性成分的溶液(任選在生理鹽水中)，或者以活性成分的大丸劑形式給藥來實現(xiàn)?；钚曰衔镌谒幬锝M合物中的濃度依賴于藥物的吸收、生物分布、代謝和排泄速率，以及其它的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的因素。值得一提的是劑量標(biāo)準(zhǔn)也隨著待治療病情的嚴(yán)重程度而變化?？梢岳斫獾倪€有對于具體的受治療者，應(yīng)當(dāng)根據(jù)個體的需要和給藥人員或主管給藥人員的專業(yè)判斷，隨時間調(diào)整具體的劑量配給方案。本文所述的濃度范圍僅僅是示范性的，而不是用來限定所要求保護(hù)的組合物的范圍和實施?；钚猿煞挚梢砸淮涡越o藥，也可以分成數(shù)個較小的劑M在不同的時間間隔給藥?；钚曰衔飪?yōu)選的給藥方式是口服，口服組合物通常含有惰性稀釋劑或可食用的載體。它們可以包封在明膠膠囊中或被壓成片劑。為了便于口服給藥治療，活性化合物可以與賦型劑混合，以片劑、錠劑或膠囊形式使用。藥學(xué)上適合的粘結(jié)劑和/或輔劑也可以作為部分組成包括在內(nèi)。片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑等可以含有以下任意組分或性質(zhì)相似的化合物粘結(jié)劑如微晶纖維素、黃耆膠或明膠；賦型劑如淀粉或乳糖；崩解劑如海藻酸、Primogd或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes;助滑劑如膠質(zhì)二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或矯味劑如薄荷油、水楊酸甲酯或橙味調(diào)味料。如果劑量單位形式是膠囊，那么，除了上述類型物質(zhì)以外，還可以含有液體載體如脂肪油。此外，劑量單位形式可以含有改善劑量單位物理形狀的其它各種物質(zhì)，例如，糖衣、蟲膠包衣或其它腸衣劑。化合物可以作為酏劑、懸浮劑、糖漿劑、糯米紙囊劑、咀嚼膠或類似劑型的一個組分給藥。糖槳劑除了活性化合物以外，可以含有蔗糖作為甜味劑，以及一些防腐劑、染料、著色劑和調(diào)味香料。化合物或其可藥用的衍生物或鹽還可以和無損于所需作用的其它活性物質(zhì)相混合，或者與具有增補(bǔ)所需作用的物質(zhì)相混合，例如抗生素、殺真菌劑、抗炎劑、蛋白酶抑制劑，或其它核苷類或非核苷類抗病毒劑，如上面詳細(xì)所述的。用于腸胃外給藥、透皮給藥、皮下給藥或局部應(yīng)用的溶液或懸浮液可以包括下面的組分無菌稀釋劑如注射用水、生理鹽水、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及張力調(diào)節(jié)劑如氯化鈉或葡萄糖。腸胃外給藥制劑可以封裝在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器和多倍劑量的小瓶中。如果是靜脈注射，優(yōu)選的載體是生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。脂質(zhì)體懸浮液(包括脂質(zhì)體，其帶有靶向受染細(xì)胞的病毒抗原的單克隆抗體)也是優(yōu)選的可藥用載體。這些均可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法制備，如美國專利4,522,811(其以全文引入作為參考)所述。舉例來講，制備脂質(zhì)體制劑可以將適當(dāng)?shù)闹|(zhì)如硬脂酰磷脂?；掖及?、硬脂酰磷脂?；憠A、二十垸酰磷脂?；憠A和膽固醇溶解于無機(jī)溶劑，然后蒸發(fā)，在容器表面留下一層干脂質(zhì)薄膜，將活性化合物或其單磷酸酯、二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液加入到容器中，然后用手旋轉(zhuǎn)搖動容器，以使容器壁上的脂質(zhì)物質(zhì)脫離并分散脂質(zhì)聚集體，從而形成脂質(zhì)體懸浮液?？蒯屩苿┧性诖瞬糠至信e的關(guān)于控釋制劑的美國專利均以全文引入作為參考。自1966年Kulksmi等人報道了聚乳酸的合成和可生物降解性("聚乳酸用于外科移植"(Polyacticacidforsurgicalimplants),外科檔案(Arch.Surg.)，93:839)以來，可生物降解的聚合物領(lǐng)域得到迅速發(fā)展。已報道作為基質(zhì)材料用于傳遞手段的其他聚合物的實例包括，聚酸酐、聚酯如聚乙交酯和聚(丙交酯/乙交酯)、聚氨基酸如聚賴氨酸、聚氧化乙烯的聚合物和共聚物、以丙烯酸為末端的聚氧化乙烯、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚原酸酯、聚丙烯腈和聚磷腈(polyphophazene)。例如參見，授權(quán)給Langer的美國專利No.4891225和4906474C聚酸酐)、授權(quán)給Hutchinson的4767628(聚丙交酯、聚(丙交酯/乙交酯))、授權(quán)給Tice等人的4530840(聚丙交酯、聚乙交酯和共聚物)。還參見，授權(quán)給Hubbell等人的美國專利No.5626863，其描述可光聚合的可生物降解的水凝膠作為組織接觸性材料和控釋載體(已聚合和交聯(lián)的高分子的水凝膠，包括帶有可生物降解的單體延伸或低聚體延伸的親水性低聚物，這些延伸是能聚合和交聯(lián)的已封端的單體或低聚體)；和由Focal，Inc.申請的PCTWO97/05185，其涉及作為用于藥物傳遞的控釋制劑和組織治療劑的復(fù)塊可生物降解的水凝膠。生物來源的可降解材料是熟知的，例如有交聯(lián)的白明膠。透明質(zhì)酸已被交聯(lián)并己被用作為可降解的溶脹聚合物，用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用(授權(quán)給DellaValle等人的美國專利4957744;(1991)"用于減少血栓形成對聚合生物材料進(jìn)行表面改性"，聚合物材料科學(xué)工程(Polym.Mater.Sci.Eng.)，62:731-735)。目前將一些分散體系用作，或正在研究將其用作物質(zhì)的載體，特別是生物活性化合物的載體。用于藥物或化妝品制劑的分散體系可分為懸浮液或乳濁液。懸浮液被限定為大小從幾納米至數(shù)百微米、使用懸浮劑分散在液體介質(zhì)中的固體顆粒。固體微粒包括微球體、微囊體和納球體。乳濁液被限定為由乳化劑如表面活性劑和類脂的界面膜穩(wěn)定的、一種液體在另一種液體中的分散體。乳濁液制劑包括油包水和水包油乳濁液、多重乳濁液、微滴乳濁液、微液滴和脂質(zhì)體。微液滴是單層磷脂囊泡，其由一內(nèi)部含油相的球形類脂層構(gòu)成，正如授權(quán)給Haynes的美國專利No.4622219和4725442所限定。脂質(zhì)體是通過混合水不溶性的極性類脂與水溶液而制備的磷脂囊泡。由水不溶性類脂在水中混合引起的不利的熵，產(chǎn)生高度有序聚集的、同心會合的內(nèi)含水溶液的磷脂膜。授權(quán)給Dimn等人的美國專利4938763公開一種用于形成原位植入體的方法，其通過將非反應(yīng)性的水不溶性的熱塑性聚合物溶解于生物相容性的水溶性溶劑中以形成液體、將該液體置于機(jī)體中、并允許所述溶劑散逸以形成固體植入體而形成原位植入。聚合物溶液可利用注射器置入機(jī)體中。植入體可呈現(xiàn)出其圍空穴的形狀。在另一實施方案中，從反應(yīng)性的液態(tài)低聚的聚合物形成植入體，所述聚合物為不含溶劑的聚合物，和通常伴有固化催化劑的添加而在原地固化以形成固體的聚合物。—些專利公開了可用于施用D-D4FC或者其核苷酸或其他限定前藥的藥物傳遞系統(tǒng)。美國專利No.5749847公開一種用于通過電穿孔將核苷酸傳遞到有機(jī)體中的方法。美國專利No.5718921公開包括聚合物和分散在其中的藥物的微球體。美國專利No.5629009公開一種用于生物活性因子控釋的傳遞系統(tǒng)。美國專利No.5578325公開了非直鏈的親水疏水性復(fù)塊共聚物的毫微粒和微粒。美國專利No.5545409公開了用于生物活性因子控釋的傳遞系統(tǒng)。美國專利No.5494682公開了離子交聯(lián)的聚合微囊體。授權(quán)給AndrxPharmaceuticals,Inc.的美國專利No.5728402公開一種包括一內(nèi)相和一外相的控釋制劑，所述內(nèi)相包括與水凝膠形成劑混合的活性藥物、其鹽或前藥，所述外相包括對抗在胃中溶解的包衣。授權(quán)給AndrxPharmaceuticals,Inc.的美國專利No.5736159和5558879公開了具有極小水溶性的藥物控釋制劑，其中在原位形成一通路。授權(quán)給AndrxPharmaceuticals,Inc.的美國專利No.5567441公開每日服用一次的控釋制劑。美國專利No.5508040公開一多微粒搏動藥物傳遞系統(tǒng)。美國專利No.5472708公開一搏動粒子基藥物傳遞系統(tǒng)。美國專利5458888公開了可用混合物制備的一控釋片劑，具有內(nèi)部含藥物相和包括平均分子量為3000-10000的聚乙二醇聚合物的外相。美國專利No.5419917公開了一種改變水凝膠形式的藥物的釋放速率的方法，其基于有效量的藥用離子化化合物的使用，該化合物能使藥物從水凝膠中以基本上零級釋放速率釋放。美國專利No.5458888公開了一控釋片劑。授權(quán)給ElanCo卬oration,plc的美國專利No.5641745公開了一種控釋藥物制劑，其包括在可生物降解聚合物中的活性藥物以形成微球體或納球體。適合的可生物降解聚合物為聚D，L-丙交酯或者聚D，L-丙交酯與聚D，L-(丙交酯/乙交酯)的混合物。授權(quán)給ElanCorporation,plc的美國專利No.5616345描述了用于每日給藥一次的控制吸收制劑，包括與有機(jī)酸相伴的活性化合物和一多層膜，該膜圍繞在核的周圍并含有占主要部分的藥用膜形成性、水不溶性合成聚合物和占小部分的藥用膜形成性、水溶性合成聚合物。美國專利No.5641515公開了一基于可生物降解毫微粒的控釋制劑。美國專利No.5637320公開一用于每日給藥一次的控制吸收制劑。美國專利No.5580580和5540938針對制劑及其在神經(jīng)病治療中的用途。美國專利No.5533995針對一有關(guān)控制藥物傳遞的被動透皮裝置。美國專利No.5505962描述一控釋藥物制劑。前藥制劑正如下面具體描述的，D-D4FC或者任何本文所述的用于與D-D4FC或其相關(guān)化合物聯(lián)合或交替治療的核苷或其他化合物，可作為?；那八幓蚝塑账崆八幗o藥。本文所述的任何核苷或其他含有羥基或氨基官能團(tuán)的化合物均可以作為核苷酸前藥進(jìn)行給藥，以提高核苷的活性、生物利用度、穩(wěn)定性或改變其性質(zhì)。許多核苷酸前藥配基是已知的。一般情況下，對所述化合物或核苷的一、二或三磷酸酯的羥基進(jìn)行垸基化、?；蚱渌H脂性的修飾，都會增強(qiáng)核苷的穩(wěn)定性?？梢栽诹姿狨ゲ糠只蛄u基上置換一個或多個氫的取代基例子是垸基、芳基、類固醇、碳水化合物(包括糖)、1,2-二酰基甘油和醇。更多的描述在R.Jones和N.Bischofberger,抗病毒研究(AntiviralResearch),27(1995)1-17，所有這些均可用于和所公開的核苷或其他化合物聯(lián)合，以達(dá)到期望的效果。活性核苷或其他含羥基化合物也可以醚脂提供(和，對于核苷，特別提供為5'-醚脂)，正如以下以全文引入作為參考的文獻(xiàn)所公開的Kucera，L.S.，N.Iyer,E，Leake，A.Raben，ModestE.K.，D丄.W.禾卩C.Piantadosi.1990."新的抑制感染性HIV-1產(chǎn)生的和誘導(dǎo)缺陷性病毒形成的膜作用性醚脂類似物"(Novelmemberane-interactiveetherlipidanalogsthatinhibitinfectiousHIV-1productionandinducedefectivevirusformation),愛滋病研究及人逆轉(zhuǎn)錄病毒(AIDSRes.Hum.RetroViruses.)6:491國501;Piantadosi，C.,J.MarascoC丄,S丄.Morris-Natschke,K丄.Meyer，F(xiàn),Gumus,J.R,Surles,K.S.Ishaq,L.S,Kucera，N.Iyer,C.A.Wallen,S.Piantadosi和E丄Modest.1991."新醚脂核苷偶聯(lián)物的合成和抗HIV活性評價"(Synthesisandevaluationofnoveletherlipidnucleosideconjugatesforanti-HIVactivity)，藥物化學(xué)雜志(J.Med.Chem.)34:1408-1414;Hosteller,K.Y.，D.D.Richman,D.A.Carson，L.M.Stuhmiller，G.M.T.vanWijk禾BH.vandenBoscli.1992"3，-脫氧胸苷的一種前體一一3，-脫氧胸苷二磷酸二肉豆寇酰甘油，在CEM和HT4-6C細(xì)胞中大大增強(qiáng)對I型人類免疫缺陷性病毒的抑制"(GreatlyenhancedinhibitionofhumanimmunodeficiencyvirustypeIreplicationinCEMandHT4-6Ccellsby3，-deoxythymidinediphosphatedimyristoylglycerol,alipidprodrugof3，-deoxythymidine)，抗微生物藥物和化學(xué)療法(Antimicrob.AgentsChemother.)36:2025-2029;Hosteller,K.Y.，L.M.Stuhmiller,H.B.Lenting，H.vandenBosch和D.D.Richman，1990."疊氮胸苷和其他抗病毒核苷的磷脂類似物的合成和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性"(Synthesisandantiretroviralactivityofphospholipidanalogsofazidothymidineandotherantiviralnucleosides.)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)265:61127。一些美國專利公幵了適當(dāng)?shù)目梢砸怨矁r鍵結(jié)合到核苷或其他含羥基或胺化合物上的親脂性取代基，優(yōu)選結(jié)合到核苷或親脂性制備物的5'-OH上，非限定性的例子包括美國專利5,149，794(1992年9月22日，Yatvin等人)、5,194,654(1993年3月16日，Hostetler等人)、5,223,263(1993年6月29日，Hostetler等人)、5,256,641(1993年10月26日，Yatvin,等人)、5,411,947(1995年5月2日，Hostetler等人)、5,463,092(1995年10月31日，Hostetler等人)、5,543,389(1996年8月6日，Yatvin等人)、5,543,390(1996年8月6日，Yatvin等人)、5,543,391(1996年8月6日，Yatvin等人)和5,554,728(1996年9月10日，Basava等人)。所有這些文獻(xiàn)均以全文引入作為參考。一些外國專利申請公開了可結(jié)合到本發(fā)明核苷上的親脂性取代基或親脂性制劑，包括WO89/02733、WO90/00555、WO91/16920、WO91/18914、WO93/00910、WO94/26273、WO96/15132、EP0350287、EP93917054.4和WO91/19721。在以下文獻(xiàn)中描述了核苷酸前藥的非限定性例子Ho，D.H.W.(1973"l卩-D-阿拉伯呋喃糖胞苷的激酶和脫氨酶在人和小鼠組織中的分布"(DistributionofKinaseanddeaminaseofl(3-D-arabinofuranosylcytosineintissuesofmanandmuse)，癌癥石開究(CancerRes.)33,2816-2820;Holy,A.(1993)"經(jīng)等極磷修飾的核苷酸類似物"(Isopolarphosphorous-modifiednucleotideanalogues)，發(fā)表于DeClercq編輯的抗病毒藥物設(shè)計進(jìn)展(AdvancesinAntiviralDrugDesign)，第I巻，JAI出版社，179-231頁；Hong,C丄，Nechaev,A.和West,C.R.(1979a)"lp-D-阿拉伯呋喃糖胞苷皮質(zhì)醇和可的松偶聯(lián)物的合成禾口抗月中瘤活性"(Synthesisandantitumoractivityof1P-D-arabino-furanosylcytosineconjugatesofCortisolandcortisone.)，生物化學(xué)生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Rs.Commun.)88,1223-1229;Hong,C.I.,Nechaev，A.,Kirisits,A丄Buchheit，D丄和West,C.R.(1980)"作為潛在抗腫瘤劑的核苷偶聯(lián)物，3.l-(P-D-阿拉伯呋喃糖胞苷皮質(zhì)甾類和所選親脂性醇的偶聯(lián)物的合成和抗腫瘤活性。)"(Nucleosideconjugatesaspotentialantitumoragents.3.Synthesisandantitumoractivityofl-((3-D-arabinofuranosyl)cytosineconjugatesofcorticosteroidsandselectedlipophilicalcohols.)藥物《七學(xué)雜'志(JMedChem.)28，171-177;Hosteller,K.Y.,Stuhmiller，L.M.,Lenting，H.B.M.vandenBosch，H.禾口Richman，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)265，6112-6117;Hosteller,K.Y.,Carson,D.A.和Richman，D.D.(1991);"磷脂酰疊氮胸苷在CEM細(xì)胞中抗逆轉(zhuǎn)錄病毒作用的機(jī)理"(Phosphatidylazidothymidine:mechanismofantiretroviralactioninCEMcells.)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)266，11714-11717;Hosteller,K.Y"Korba,B.Sridhar,C.，Gardener,M.(1994a)"在感染乙型肝炎的細(xì)胞中的磷脂酰二脫氧胞苷抗病毒活性和在小鼠中增強(qiáng)的肝攝取"(Antiviralactivityofphosphatidyl-dideoxycytidineinhepatitisB-infectedcellsandenhancedhepaticuptakeinmice.)抗病毒研究(Antiviral.Res,)24，59-67;Hosteller,K.Y.，Richman,D.D.,Sridbar.C.N.Feigner,P.L.Feigner,J.，Ricci，J.,Gardener,M.F.Selleseth，D.W.和Ellis,M.N.(1994b)"磷脂酰疊氮胸苷和磷脂酰二脫氧胞苷對在小鼠淋巴組織中的攝取和在被人類免疫缺陷性病毒感染的細(xì)胞和被勞舍爾氏白血病病毒感染的小鼠中的抗病毒活性的評價"(Phosphatidylazidothymidineandphosphatidyl隱ddC:Assessmentofuptakeinmouselymphoidtissuesandantiviralactivitiesinhumanimmunodeficiencyvirus-infectedcellsandinrauscherleukemiavirus-infectedmice.)抗微生物藥物的化學(xué)療法(AntimicrobialAgentsChemother.)38，2792-2797;Hunston,R.N.,Jones,A.A.,McGuigan,C.，Walker,R.T.,Balzarini，J.禾口DeClercq，E.(1984)"從2'-脫氧-5-氟尿苷衍生的一些環(huán)磷酸三酯的合成和生物學(xué)性質(zhì)"(Synthesisandbiologicalpropertiesofsomecyclicphosphotriestersderivedfrom2'-deoxy-5-fluorouridine.)藥物4七學(xué)雜'志(J.Med.Chem.)27,440-444;Ji,Y.H.,Moog,C.,Schmitt,G.，Bischoff,P.和Luu，B.(1990);"7-p-羥基膽固醇和嘧啶核苷的單磷酸酯作為潛在抗腫瘤藥合成和抗腫瘤活性的初步評價"(Monophosphoricacidestersof7-(3-hydroxycholestero1andofpyrimidinenucleosideaspotentialantitumoragents:synthesisandpreliminaryevaluationofantitumoractivity.)藥物化學(xué)雜志(J.Med.Chem.)332264-2270;Jones,A.S.,McGuigan,C.，Walker,R.T.，Balzarini,J.和DeClercq，E.(1984)"—些核苷環(huán)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