專利名稱：：柔毛水楊梅提取物用于制備治療肥胖的藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥、食品
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及顯示具有減肥活性的植物藥用提取物，更特定地涉及柔毛水楊梅提取物用于制備治療肥胖的藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著人類生存年齡的提高，飲食生活的改變，運動不足及生活環(huán)境的變化引起的精神壓力和應(yīng)激反應(yīng)的增加，致使患肥胖、癌癥及慢性、老年性疾病的人數(shù)大幅增多，已成為一種迫切丞待解決的問題。肥胖是一種復(fù)雜的，多因素決定的代謝失調(diào)癥，如基因、調(diào)節(jié)能量平衡的激素、環(huán)境、生活方式以及飲食都是可能引起肥胖的因素。但從根本上來說，月巴胖源于食物攝入與能量消耗之間的平衡的破壞。脂肪酸合酶(FAS)是人類和動物體內(nèi)脂肪合成的關(guān)鍵酶，通過抑制脂肪酸酶的活性可以有效預(yù)防和減輕肥胖癥狀。2000年J.Hopkins大學(xué)的Loftus等通過給小鼠腹膜內(nèi)注射FAS抑制劑C75，觀測到小鼠體重顯著減輕。這種體重的減輕呈劑量依賴性，并隨劑量的增加而延長作用的持續(xù)時間。小鼠停藥后隨藥物作用的消失均能恢復(fù)失去的體重，而不會持續(xù)消瘦。這種藥物對小鼠來說有良好的耐受性，且未見明顯的毒性通常，饑餓后機體的正常反應(yīng)是能量消耗的減少，而C75的作用則不同通過C75給藥和饑餓療法的比較表明，C75給藥盡管導(dǎo)致攝食量的減少，但是并不影響機體正常的能量代謝。抑制FAS的活性，既能夠阻滯生脂通路，減少脂肪的合成，又能夠造成丙二酰輔酶A濃度的升高，抑制中樞系統(tǒng)調(diào)控飲食的神經(jīng)肽從而達到降低食欲的目的，具有一舉兩得的作用。因此FAS很可能是體內(nèi)調(diào)節(jié)能量消耗和儲存的重要位點之一，也是一個很好的調(diào)節(jié)靶位。合適的FAS抑制劑既能調(diào)節(jié)脂肪的代謝和儲存，又能降低食欲減少食物攝入，特別是其作用并不依賴于特定的基因缺陷，使得此項研究具有廣泛而深遠的意義，已引起極大關(guān)注。我國學(xué)者田維熙教授等人報道綠茶中的成分-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是有效的FAS抑制劑，它和C75有不同的抑制表現(xiàn)及作用部位，研究表明綠茶和中藥何首烏都具有抑制脂肪酸合酶和減肥的作用。(李麗春等，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，200319(3):297304;張睿等，云南大學(xué)學(xué)報，2004，26(6A)，42-47。)另有報道EGCG能減輕小鼠食欲和體重(KaoJH.，f油c"7。7柳，2000，141(3):980987)。大量的科學(xué)研究已經(jīng)證實了脂肪酸合酶抑制劑在治療和預(yù)防肥胖方面的潛在應(yīng)用。柔毛水楊梅(G醒japonicumThunb.var.chi腦seF.Bolle)是薔薇科路邊青屬植物，藥用全草或根。在貴州少數(shù)民族地區(qū)人們叫它藍布正，并廣泛用來治療頭暈?zāi)垦＃^痛等癥。《中藥大辭典》記載其具有補虛益氣，祛風(fēng)除濕，消腫散瘀的功效。治腹瀉，痢疾，白帶，崩漏，風(fēng)濕腰腿痛，跌打損傷，癰腫瘡瘍。對柔毛水楊梅的研究報道較少，初步研究表明其提取物富含多酚(唐正平等，湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報，2000，6(4):52-55)。香港中文大學(xué)李明等人申請了柔毛水楊梅提取物誘導(dǎo)新生血管形成和肌肉再生的用途專利(W02004052381;W02003043645)。我們在前期研究中從其甲醇提取物中分離純化了包括GeminA在內(nèi)的幾個多酚類化合物(劉宏偉等，沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2006，23(11):694-697.)。在我們的研究中，首次發(fā)現(xiàn)了柔毛水楊梅提取物具有很好的抗脂肪酸合酶活性和減肥的作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了可從柔毛水楊梅的植物全草獲得的植物提取物在生產(chǎn)治療和預(yù)防減肥藥物或膳食補充劑中的用途。柔毛水楊梅提取物可選用水及甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等有機溶劑或上述任何兩種或多種互溶的混合溶劑，在室溫下浸漬提取或超聲提取或加熱回流提取獲得，提取次數(shù)可為一次或多次，減壓干燥，稱重。提取物分散到適量的水中，然后利用等量氯仿、正己烷、環(huán)己垸或石油醚等有機溶劑中的任何一種萃取除去脂溶性雜質(zhì)，再利用等量正丁醇萃取獲得活性提取物。參照2005版中國藥典的方法(皮粉法)測定了柔毛水楊梅正丁醇提取物的鞣質(zhì)含量，含量大于30。/。。利用高效液相的方法表征了提取物的指紋圖譜(C18(RP)分析型色譜柱；流動相AO.1%醋酸-水溶液；B甲醇；0-10min，10%B;20-50min，10%B-30%B;50-70min，30%B-100%B)，流速為1.OmL/min，可監(jiān)測到10-16個色譜峰，活性化合物GeminA的保留時間是31分鐘。本發(fā)明的優(yōu)點是我們采用體外抗脂肪酸合酶活性檢測方法，對柔毛水楊梅正丁醇提取物的生物活性進行了研究，證實了柔毛水楊梅正丁醇提取物具有很的強抗脂肪酸合酶活性，并通過體內(nèi)試驗證實了柔毛水楊梅正丁醇提取物的減肥作用。柔毛水楊梅正丁醇提取物，配以適當(dāng)?shù)馁x形劑，可制備治療和預(yù)防肥胖的各種藥物劑型或膳食補充劑。圖l為柔毛水楊梅正丁醇提取物的HPLC分析圖譜。具體實施例方式實施例l:柔毛水楊梅正丁醇提取物的制備取柔毛水楊梅干燥藥材100克，加入500毫升甲醇室溫浸提48小時，提取3次，過濾合并提取液，40攝氏度噴霧干燥獲得柔毛水楊梅提取物9.3克，收率9.3%。將甲醇提取物分散到100毫升的水中，利用等體積的氯仿萃取3次，然后用等體積正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取部分，減壓干燥得到正丁醇提取物3克。實施例2:柔毛水楊梅正丁醇提取物可水解鞣質(zhì)含量測定精密稱取實施例1正丁醇提取物1.0克，置于100毫升容量瓶，加水溶解，并定容至100毫升作為供試液。精密吸取lmol/L醋酸鋅20mL置500mL容量瓶中，加入氨水14mL，搖勻，使生成的白色沉淀溶解，精密加入供試品溶液30mL，振搖lmin，置(35±2)°C水浴溫?zé)?0min，不斷振搖。取出，冷卻至室溫，加蒸餾水至刻度，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液50mL置500mL錐形瓶中，分別加入蒸餾水300mL、氨-氯化氨緩沖液25mL和鉻黑T指示劑lmL，搖勻，用EDTA(010508mol/L)緩緩滴定，至紫紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{綠色，結(jié)果用空白校正。按公式計算鞣質(zhì)含量，鞣質(zhì)含量(％)二011556X[20XCZn2+-10(V空-V樣)CEDTA]/VX100%。其中O.1556為lmol*L-1Zn2+標(biāo)準溶液消耗量與藥材中鞣質(zhì)含量的比例常數(shù)，V為供試品溶液的體積。結(jié)果表明鞣質(zhì)含量在35%。實施例3:柔毛水楊梅正丁醇提取物可水解鞣質(zhì)定性分析將1中得到的柔毛水楊梅正丁醇提取物真空干燥至恒重，精密稱取100mg，加少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移到10毫升容量瓶，定容。吸取20微升，注入AgilentSeries1100高效液相系統(tǒng)，記錄HPLC色譜圖(如圖-1)。色譜柱及洗脫條件等如下色譜柱C18(RP)分析型色譜柱(5,，4.6腿-250鵬；Shi腿zu，Japan)流速1.0mL/min檢測波長254nm流動相(A)0.1%醋酸-水溶液；(B)甲醇0-10min，10%B;20-50min，10%B-30%B;50-70min，30%B—100%B實施例3:在37。C下，在2毫升石英比色皿中加入該酶底物0.2mM乙酰輔酶A溶液25微升，0.4mM丙二酰輔酶A溶液50微升和1.3raMNADPH溶液50微升，再加入0.1M，pH7.0磷酸鹽緩沖液1.85毫升及FAS溶液30微升混勻，啟動酶促反應(yīng)。用分光光度計監(jiān)測單位時間內(nèi)340nm波長處吸光值A(chǔ)的變化(AA/min)來表示FAS的活力。在一定濃度柔毛水楊梅正丁醇提取物存在下，F(xiàn)AS全酶反應(yīng)的活力下降，當(dāng)其活力下降一半時所需柔毛水楊梅正丁醇提取物的濃度即為ICS。，用該數(shù)值表示柔毛水楊梅正丁醇提取物對FAS的抑制能力，上述測活體系中FAS的終濃度為7微克/毫升。結(jié)果如表l所示柔毛水楊梅正丁醇萃取物具有非常強的抗脂肪酸合酶的活性，IG(,是2.5ug/ml.。實施例6:大鼠減肥實驗，將雌性大鼠隨機分組(10只每組，1只每籠)，每只大鼠體重約200克。柔毛水楊梅正丁醇提取物加水溶解，可以適當(dāng)加熱，超聲，配成濃度O.3g/mL的溶液。與對照組詞喂雙蒸水，試驗組飼喂按上述方法準備的柔毛水楊梅正丁醇提取物，每公斤400毫克。實驗中飼料為標(biāo)準配方。詞喂方法為用圓頭灌注器插入大鼠食道向胃內(nèi)灌注，每天一次，每只2ml，上午1011時喂藥.飼料和飲水為自主取食.實驗時間20天，每2天測量一次每只大鼠的體重和攝食量，并觀察其排泄物狀況。數(shù)據(jù)表明喂柔毛水楊梅正丁醇提取物的大鼠，體重下降約10.2%，有減肥作用。表l柔毛水楊梅正丁醇提取物的減肥作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、柔毛水楊梅正丁醇提取物在制備用于治療或預(yù)防肥胖的藥物或膳食補充劑中的用途。2、一種提取用于如權(quán)利要求l所述應(yīng)用的柔毛水楊梅正丁醇提取物的方法，其特征在于選用水及甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯、丁醇等有機溶劑或上述任何兩種或多種互溶的混合溶劑，在室溫下浸漬提取或超聲提取或加熱回流提取獲得，提取次數(shù)可為一次或多次，提取物分散到適量的水中，然后利用與分散該提取物的水等量的氯仿、正己垸、環(huán)己垸或石油醚等有機溶劑中的任何一種萃取除去脂溶性雜質(zhì)，再利用與分散該提取物的水等量的正丁醇萃取獲得活性提取物。3、如權(quán)利要求1所述的用途，其中柔毛水楊梅正丁醇提取物是以活性成分GeminA作為標(biāo)記物的提取物，其特征是富含鞣質(zhì)，含量在30%以上。全文摘要本發(fā)明涉及柔毛水楊梅植物提取物用于制備治療肥胖的藥物的用途。柔毛水楊梅植物提取物為以活性化合物GeminA為標(biāo)記物的提取物，其中可水解鞣質(zhì)的含量大于30％。柔毛水楊梅植物提取物在體外顯示了很強的抗脂肪酸合酶活性，在動物實驗中也表現(xiàn)出了很好的減肥作用，可用于制備治療肥胖的藥物。文檔編號A61K36/73GK101406537SQ20071016392公開日2009年4月15日申請日期2007年10月11日優(yōu)先權(quán)日2007年10月11日發(fā)明者劉宏偉,穎夏,宋學(xué)英,張英俠,趙文華申請人:首都醫(yī)科大學(xué)