專利名稱：水楊梅根抗腫瘤提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，特別涉及一種水楊梅根抗腫瘤提取物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
水楊梅根為茜草科落葉灌木植物水楊梅(Adina rubella(Sieb.etZucc.)Hance)的根，具有清熱解毒、散淤止痛之功效。郁仁存等人在“腫瘤常用中草藥”，中醫(yī)腫瘤學，1997，72頁中報道，水楊梅根醇浸膏每日以5g/Kg連續(xù)灌胃或腹腔注射6天，對小鼠白血病L615有抑制作用，抑制率為21.4％；對小鼠宮頸癌細胞、小白鼠肉瘤AK、及大白鼠肉瘤均有抑制作用；這提示水楊梅根醇浸膏有廣譜抗腫瘤作用。水楊梅的花果序中含兒茶素類化合物，另有熊果酸、齊墩果酸、β-谷甾醇、水楊梅甲素及生物堿等，但關(guān)于水楊梅根的有效成分報道較少。何直升等人在“水楊梅化學成分的研究”，中草藥，1996，26(6)285～288中報道，他們從水楊梅根中分離出數(shù)種新的Quinovic acid糖苷化合物，但未進行抗腫瘤活性研究。Quinovic acid糖苷在其它抗腫瘤植物中也被發(fā)現(xiàn)，曾有文獻Raffauf RF，etal.Lloydia，1978，41(5)432～434提及，在金雞納樹皮中發(fā)現(xiàn)了Quinovic acid糖苷化合物，該化合物具有抗腫瘤活性，后來Raffauf RF在其它具有抗腫瘤活性的植物藥材中也發(fā)現(xiàn)了此類化合物，這表明Quinovic acid糖苷化合物有可能也是水楊梅根的主要抗腫瘤活性物質(zhì)。
目前，對水楊梅根的研究僅停留在其藥材的粗淺認識上，沒有關(guān)于水楊梅根抗腫瘤有效部位和成分分離方法、制劑技術(shù)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點，提供一種可有效地純化中藥水楊梅根的有效部位，便于工業(yè)化生產(chǎn)的水楊梅根抗腫瘤提取物制備方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述方法制備的水楊梅根抗腫瘤提取物。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種上述水楊梅根抗腫瘤提取物的用途。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)本水楊梅根抗腫瘤提取物的制備方法包括下述步驟(1)用水或有機溶劑在70～100℃溫度下浸提水楊梅根藥材，得到浸出液；(2)在浸出液中加入絮凝劑，沉淀去雜，得到提取液；(3)將提取液的pH值調(diào)節(jié)至2～5，靜置，取得上清液；(4)將上清液過大孔樹脂，用溶劑洗脫，收集洗脫液；(5)將洗脫液回收溶劑后，用乙酸乙酯萃取，得到萃取液；(6)將萃取液濃縮干燥，得到水楊梅根抗腫瘤提取物。
步驟(1)中，所述有機溶劑為30～70％(V/V)乙醇；所述水楊梅根藥材可為水楊梅根塊狀物或粉碎物；所述浸提溫度優(yōu)選70～80℃。
步驟(1)中，所述浸提次數(shù)為1～3次；每次浸提時間為1～2小時；第一次浸提的水楊梅根與水或有機溶劑的重量比為1∶8～10；第二次和第三次浸提的水楊梅根與水或有機溶劑的重量比為1∶4～5。
步驟(2)中，可將浸出液先濃縮，然后再絮凝沉淀；所述絮凝劑可為甲殼素、ZTC絮凝劑或明膠，用量為水楊梅根藥材重量的0.1～1％；所述沉淀可采用過濾或離心分離沉淀。
步驟(3)中，采用酸性試劑來調(diào)節(jié)提取液的pH值，優(yōu)選鹽酸、醋酸。
步驟(4)中，所述大孔樹脂可為各種非極性或弱極性的大孔樹脂；所述溶劑為含水溶劑，優(yōu)選乙醇水或丙酮水。
步驟(5)中，所述乙酸乙酯的用量為洗脫液的1～3倍體積量。
步驟(6)中，所述干燥可為真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥。
采用上述方法制備得到水楊梅根抗腫瘤提取物；所制備的水楊梅根抗腫瘤提取物有效成分(多酚類)含量可達80～90％。
該水楊梅根抗腫瘤提取物作為活性成分與可接受的藥物載體結(jié)合制成可用于治療各種腫瘤的口服或注射單方以及復方制劑，如以淀粉等為輔料制成的片劑、以微晶纖維素為輔料制成的膠囊劑、以甘露醇為支架制成的注射劑等。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點和效果(1)本發(fā)明對原料藥材采用高溫、多次、長時間浸提，浸提效果好，原料藥材中抗腫瘤有效成分轉(zhuǎn)移率高；(2)工藝簡單，沉淀步驟采用了絮凝沉淀法，可避免醇沉法的因沉淀不完全而造成的損失和乙醇回收而增加的工藝步驟；(3)產(chǎn)品純度高，便于工業(yè)化生產(chǎn)，一方面采用調(diào)酸法除去酸不溶物，提高大孔樹脂的吸附效果；另一方面采用大孔樹脂純化水楊梅根抗腫瘤的有效部位，并采用乙酸乙酯萃取法進一步提高有效部位的純度，提高有效成分含量和精度。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1將1Kg的水楊梅根藥材，加入10L的水，保持在100℃溫度下浸提120分鐘，然后過濾得到第一次浸出液；再在濾渣中加入5L的水，保持在100℃溫度下浸提90分鐘，然后過濾得到第二次浸出液；合并兩次浸出液。
將浸出液減壓濃縮至熱比重為1.05，加入甲殼素1g，攪拌后離心去沉淀，得到提取液；用10％鹽酸將提取液的pH值調(diào)至2，然后靜置、離心去沉淀，取得上清液；將上清液過大孔樹脂D101，然后用70％乙醇水洗脫，再將洗脫液減壓回收乙醇，然后用1倍體積量的乙酸乙酯萃取3次；最后將萃取液常壓濃縮、真空干燥，制得30g的水楊梅根抗腫瘤提取物。經(jīng)測定其多酚含量為85％。
實施例2將1Kg的水楊梅根藥材粉碎成粗粉，加入8L的水，保持在80℃溫度下浸提60分鐘，然后過濾得到第一次浸出液；再在濾渣中加入4L的水，保持在80℃溫度下浸提60分鐘，然后過濾得到第二次浸出液；合并兩次浸出液。
將浸出液加入明膠10g，攪拌后離心去沉淀，得到提取液；用20％醋酸將提取液的pH值調(diào)至5，然后靜置、離心去沉淀，取得上清液；將上清液過大孔樹脂HPD300，然后用70％丙酮水洗脫，再將洗脫液減壓回收丙酮，然后用3倍體積量的乙酸乙酯萃取1次；最后將萃取液減壓濃縮、冷凍干燥，制得35g的水楊梅根抗腫瘤提取物。經(jīng)測定其多酚含量為87％。
實施例3將1Kg的水楊梅根藥材粉碎成粗粉，加入9L的水，保持在90℃溫度下浸提90分鐘，然后過濾得到第一次浸出液；再在濾渣中加入5L的水，保持在90℃溫度下浸提90分鐘，然后過濾得到第二次浸出液；再在濾渣中加入5L的水，保持在90℃溫度下浸提90分鐘，然后過濾得到第三次浸出液；合并三次浸出液。
將浸出液常壓濃縮至熱比重1.03，加入ZTC絮凝劑3g，攪拌后離心去沉淀，得到提取液；用5％鹽酸將提取液的pH值調(diào)至3，然后靜置、離心去沉淀，取得上清液；將上清液過大孔樹脂HPD600，然后用50％丙酮水洗脫，再將洗脫液減壓回收丙酮，然后用2倍體積量的乙酸乙酯萃取3次；最后將萃取液常壓濃縮、噴霧干燥，制得36g的水楊梅根抗腫瘤提取物。經(jīng)測定其多酚含量為83％。
實施例4將1Kg的水楊梅根藥材粉碎成粗粉，加入10L的70％乙醇，保持在70℃溫度下浸提90分鐘，然后過濾得到第一次浸出液；再在濾渣中加入5L的70％乙醇，保持在70℃溫度下浸提60分鐘，然后過濾得到第二次浸出液；合并兩次浸出液。
將浸出液減壓濃縮至熱比重1.05，加入甲殼素3g，攪拌后離心去沉淀，得到提取液；用5％鹽酸將提取液的pH值調(diào)至2，然后靜置、離心去沉淀，取得上清液；將上清液過大孔樹脂HPD300，然后用50％乙醇水洗脫，再將洗脫液減壓回收乙醇，然后用3倍體積量的乙酸乙酯萃取2次；最后將萃取液減壓濃縮、冷凍干燥，制得38g的水楊梅根抗腫瘤提取物。經(jīng)測定其多酚含量為93％。
實施例5將1Kg的水楊梅根藥材粉碎成粗粉，加入8L的50％乙醇，保持在80℃溫度下浸提60分鐘，然后過濾得到第一次浸出液；再在濾渣中加入4L的50％乙醇，保持在80℃溫度下浸提60分鐘，然后過濾得到第二次浸出液；再在濾渣中加入4L的50％乙醇，保持在80℃溫度下浸提60分鐘，然后過濾得到第三次浸出液；合并三次浸出液。
將浸出液常壓濃縮至熱比重1.03，加入明膠8g，攪拌后離心去沉淀，得到提取液；用20％醋酸將提取液的pH值調(diào)至4，然后靜置、離心去沉淀，取得上清液；將上清液過大孔樹脂HPD600，然后用70％丙酮水洗脫，再將洗脫液減壓回收丙酮，然后用2倍體積量的乙酸乙酯萃取2次；最后將萃取液常壓濃縮、噴霧干燥，制得36g的水楊梅根抗腫瘤提取物。經(jīng)測定其多酚含量為96％。
實施例6將1Kg的水楊梅根藥材，加入9L的30％乙醇，保持在80℃溫度下浸提120分鐘，然后過濾得到第一次浸出液；再在濾渣中加入5L的30％乙醇，保持在80℃溫度下浸提90分鐘，然后過濾得到第二次浸出液；合并兩次浸出液。
在浸出液中加入ZTC絮凝劑5g，攪拌后離心去沉淀，得到提取液；用10％鹽酸將提取液的pH值調(diào)至3，然后靜置、離心去沉淀，取得上清液；將上清液過大孔樹脂D101，然后用70％乙醇水洗脫，再將洗脫液減壓回收乙醇，然后用1倍體積量的乙酸乙酯萃取3次；最后將萃取液常壓濃縮、真空干燥，制得32g的水楊梅根抗腫瘤提取物。經(jīng)測定其多酚含量為90％。
實施例7水楊梅根抗腫瘤提取物的細胞實驗方法將腫瘤細胞(2×106/ml)，放入無菌的96孔培養(yǎng)平板，每孔加腫瘤細胞懸液50μl，加含15％小牛血清的1640培養(yǎng)液50μl，加實施例1～3制備的水楊梅根抗腫瘤提取物的水溶液10μl，每組3孔，孔內(nèi)加等量的生理鹽水振蕩混勻，然后放入5％的CO2培養(yǎng)箱(37℃)培養(yǎng)24h，加入四唑鹽(MTT)磷酸緩沖液，每孔10μl(每ml含MTT5mg)繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后加二甲砜100ml，終止反應，用酶膠免疫檢測儀，分別于波長570nm，630nm處測定光密度OD值，計算結(jié)果。
計算公式 結(jié)果在胃癌RF細胞株和直腸癌LS174T細胞株腫瘤細胞培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，水楊梅根抗腫瘤提取物對兩種腫瘤的抑制率顯著高于其藥材的水提取物(未經(jīng)過沉淀、調(diào)酸、大孔樹脂吸附和萃取的水提濃縮液)，且呈劑量遞增。結(jié)果見附表1。
白蒺藜提取物浸膏 5～30白僵蠶提取物浸膏 5～30牡丹皮提取物浸膏 5～30白附子提取物浸膏 5～30五倍子提取物浸膏 5～30本發(fā)明的另一目的，是提供了一種化妝品物質(zhì)，其中含有作為有效成分的中藥提取物組合物，該化妝品物質(zhì)具有抑制黑色素合成，治療皮膚斑點、雀斑、黃褐斑和色素沉著，預防皮膚老化，保護皮膚和美白皮膚的功能。
本發(fā)明的另一目的，是提供一種果蔬保鮮劑，其中作為預防變黑的有效成分的中藥提取物組合物，用于水果和蔬菜等食品中。
對本發(fā)明的詳細說明本發(fā)明涉及川芎、當歸、白蒺藜、白僵蠶、牡丹皮、白附子和五倍子等多種天然物質(zhì)的提取物組合物對酪氨酸酶的活性的抑制。為了制備以上各種單一中藥提取物浸膏，發(fā)明人采用微波輔助提取技術(shù)，考察了提取劑選擇、液料質(zhì)量比、提取時間、微波功率等因素對提取效果及提取物對酪氨酸酶的相對抑制率的影響，篩選出了最佳的提取工藝條件，見表1所示。
發(fā)明人按最佳提取工藝條件進行了川芎、當歸、白蒺藜、白僵蠶、牡丹皮、白附子等多種天然物質(zhì)的提取，并用活性炭對提取液進行脫色，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮至膏狀后，真空干燥，得到各種單一中藥的提取物浸膏，如表1所示。
權(quán)利要求
1.一種水楊梅根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)用水或有機溶劑在70～100℃溫度下浸提水楊梅根藥材，得到浸出液；(2)在浸出液中加入絮凝劑，沉淀去雜，得到提取液；(3)將提取液的pH值調(diào)節(jié)至2～5，靜置，取得上清液；(4)將上清液過大孔樹脂，用溶劑洗脫，收集洗脫液；(5)將洗脫液回收溶劑后，用乙酸乙酯萃取，得到萃取液；(6)將萃取液濃縮干燥，得到水楊梅根抗腫瘤提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水楊梅根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于步驟(1)中，所述有機溶劑為30～70％乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水楊梅根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于步驟(1)中，浸提溫度為70～80℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水楊梅根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于步驟(1)中，所述浸提次數(shù)為1～3次；每次浸提時間為1～2小時；第一次浸提的水楊梅根與水或有機溶劑的重量比為1∶8～10；第二次和第三次浸提的水楊梅根與水或有機溶劑的重量比為1∶4～5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水楊梅根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于步驟(2)中，所述絮凝劑的用量為水楊梅根藥材重量的0.1～1％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水楊梅根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于步驟(3)中，采用鹽酸或醋酸來調(diào)節(jié)提取液的pH值。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水楊梅根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于步驟(4)中，所述溶劑為乙醇水或丙酮水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水楊梅根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于步驟(5)中，所述乙酸乙酯的用量為洗脫液的1～3倍體積量。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1～8任一項所述方法制備的水楊梅根抗腫瘤提取物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的水楊梅根抗腫瘤提取物的應用，其特征在于將水楊梅根抗腫瘤提取物作為活性成分與可接受的藥物載體結(jié)合制成用于治療各種腫瘤的口服或注射單方以及復方制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水楊梅根抗腫瘤提取物及其制備方法和用途。該水楊梅根抗腫瘤提取物可通過水或有機溶劑在70～100℃溫度下浸提、然后絮凝沉淀、調(diào)酸、過大孔樹脂、回收溶劑、萃取、濃縮干燥制得。該水楊梅根抗腫瘤提取物可作為活性成分與可接受的藥物載體制成用于治療各種腫瘤的口服或注射單方以及復方制劑。本發(fā)明浸提效果好，原藥材中抗腫瘤有效成分轉(zhuǎn)移率高；工藝簡單，沉淀步驟采用了絮凝沉淀法，可避免醇沉法的乙醇回收而增加的工藝步驟；產(chǎn)品純度高，便于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61P35/00GK1679795SQ20051003266
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月4日
發(fā)明者葉勇 申請人:華南理工大學