專利名稱：一種新型抗癌復(fù)方藥物的配伍方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥新藥研發(fā)的技術(shù)領(lǐng)域，確切地說是涉及一種新型抗癌藥物 的研究。 技術(shù)背景目前肝癌的治療仍以手術(shù)治療為主,但手術(shù)僅適用于某些局部性肝癌早期和中期的治療;而放療和化療常引起骨髓抑制、免疫低下等毒副反應(yīng),值得注意的是, 化療藥物的耐藥性已成為目前臨床腫瘤治療中的難題之一。因此，從天然藥物中 尋找既能殺傷腫瘤細(xì)胞,毒副作用又較少的活性藥物分子或者有效部位,已成為 臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。中藥乳香為橄欖科植物卡氏乳香(BoswemacarteriiBirdwood)的膠狀樹月旨，有 活血行氣、通經(jīng)止痛、消腫生肌等功效。主治心腹疼痛、風(fēng)濕痹痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、 跌打淤痛等。文獻(xiàn)研究表明,乳香揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗白血病活性。細(xì)胞周期有若干個(gè)調(diào)節(jié)點(diǎn)，其中以Gl/S期轉(zhuǎn)換最為重要。腫瘤細(xì)胞能順利地 通過這2個(gè)關(guān)卡。因此,腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)是細(xì)胞周期運(yùn)行失控,細(xì)胞群體主要處于 DNA合成活躍的S期;而分化細(xì)胞群體主要處于DNA合成靜止的G0/G1期。本 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，O 07 mg mL-l乳香揮發(fā)油作用24h,能明顯抑制SMMC-7721細(xì) 胞增殖;作用48 h、 72h后，均能檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，且阻止細(xì)胞由Gl期向S期轉(zhuǎn)變, 出現(xiàn)G0/ Gl期阻滯，DNA合成和分裂速度逐漸減慢，從而抑制細(xì)胞增殖,最終誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡。作用24 h時(shí)，未檢測(cè)到凋亡,可能只是損傷細(xì)胞DNA。延長(zhǎng)作用時(shí)間 后，則誘發(fā)了凋亡，核酸內(nèi)切酶活化，雙鏈DNA斷裂成180-200bp片段。Bcl-2是主 要的抗凋亡基因，它可以抑制多種途徑的凋亡，Bd-2蛋白主要分布于線粒體膜內(nèi) 外側(cè)，核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜也有分布。Bax是促凋亡基因和bcl-2都屬于bcl-2基因家
族成員,通過編碼相應(yīng)功能蛋白起作用,Bax蛋白主要存在于胞質(zhì)中。Bcl-2家族蛋 白質(zhì)的活性形式一般是二聚體,Bax不僅能和Bcl-2形成異源二聚體抑制凋亡，而 且其自身還能形成同源二聚體誘導(dǎo)凋亡。有研究表明,與Bax分離的Bcl-2失去 了抗凋亡能力,說明Bcl-2與Bax的結(jié)合是Bcl-2發(fā)揮作用的前提。而當(dāng)Bax在細(xì) 胞內(nèi)超表達(dá),并形成同源二聚體時(shí)，細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的反應(yīng)增強(qiáng)。所以Bcl-2與Bax 的比例,即Bax-Bcl-2異源二聚體與Bax-Bax同源二聚體的比例，是決定細(xì)胞接受 致病信號(hào)刺激后成活與否的關(guān)鍵因素，較絕對(duì)量對(duì)于細(xì)胞的影響更為重要。作者 的實(shí)驗(yàn)證明,O 07 mg mL-l乳香揮發(fā)油誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721發(fā)生凋 亡時(shí)，促凋亡基因bax值升高,抑凋亡基因bcl-2值變化不明顯,bax/ Bcl-2比值升 高。bcl-2與bax是細(xì)胞凋亡與否的上游調(diào)控因子，因此我們推測(cè),bcl-2與bax的 表達(dá)變化是乳香揮發(fā)油誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721凋亡，調(diào)控機(jī)制的一部分。現(xiàn)代藥理研究表明,乳香提取物對(duì)急性非淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞有誘導(dǎo)分化作 用，能誘導(dǎo)急性非淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡，能降低HL-60細(xì)胞端粒酶活性。綜 上所述,乳香揮發(fā)油能夠抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。乳 香揮發(fā)油作為一種抗腫瘤的天然藥物,有效果明顯、毒副作用小的特點(diǎn)，作者正在 對(duì)它的化學(xué)成分、抗腫瘤作用及其機(jī)制做深入的研究。紫草為藥典收戴臨床常用傳統(tǒng)中草藥。它最初記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，屬于紫草科多年生草本植物，根用于藥，其中主要含有萘醌類色素、多糖兩大類有效成 分。具有抗炎、抗腫瘤、保肝和免疫調(diào)節(jié)、避孕、殺菌抗病毒等作用?？寡准?消炎、收斂和解毒，其水提物、醇提物、醚提物都有此作用。新疆紫草素是從新 疆紫草根中提取的萘醌類化合物。新疆紫草含P , 0 -二甲基丙烯紫草素、紫草素、乙酰紫草素、異丁酰紫草素、異戊紫草素等，據(jù)報(bào)道,紫草根對(duì)絨毛膜上皮癌、小 鼠腹水型肉瘤S180及惡性葡萄胎有一定療效。路桂榮等的研究證明紫草素對(duì)人 胃癌細(xì)胞(BGC823)和人食道癌細(xì)胞(Egal09)具有明顯的抑制作用。但紫草素對(duì) 肝癌細(xì)胞的抑制作用的研究還鮮見報(bào)道。我們的實(shí)驗(yàn)中，可以看出新疆紫草素三 個(gè)劑量10ug/ml、 5ug/ml、 2.5tig/ml均能不同程度抑制人肝癌細(xì)胞系增殖。對(duì) SMMC-7721腫瘤細(xì)胞的殺傷作用中新疆紫草素組的殺傷活性分別為47.2%、 31.9%、 24.8%。新疆紫草素組對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤率分別為66.32%、 53.30%、 50.02°/。。新疆紫草素10mg/kg、 5mg/kg、 2.5 mg/kg體重對(duì)小鼠肝癌具有明顯抑 制作用，不同濃度的新疆紫草素均提高H22荷瘤小鼠NK細(xì)胞活性及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn) 化率,并且與對(duì)照組相比10 mg/kg、 5mg/kg、 2.5 mg/kg體重組,提高NK細(xì)胞活 性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而10mg/kg、 5mg/kg體重組提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率具有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義。由此我們認(rèn)為,新疆紫草素具有抗腫瘤效用,是一種調(diào)控機(jī)體免疫功能的 中藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的基于上述開發(fā)的研究背景，獨(dú)創(chuàng)將兩種藥物通過一定的 濃度配伍，以便開發(fā)出新型的抗癌復(fù)方制劑。 具體是實(shí)施方式 方法將乳香粉碎，超臨界C02萃取實(shí)驗(yàn)儀以壓力25MPa，溫度55°C，萃取時(shí)間6h 的條件萃取。得到乳香SFE-C02萃取物。藥物SFE-C02萃取物紫草素=0. 7mg: 10. 0 u g/ml(溶媒DMSO濃度0 '1%)。 給藥方法MTT法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞數(shù)大于95%。 0. 25%胰蛋白酶消化人肝癌S麗C-7721細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RP-MI1640培養(yǎng) 液配制成單細(xì)胞懸液，以每毫升5X104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積 100 w 1。將培養(yǎng)板置于C02孵箱中，24小時(shí)后加入藥物，每孔100 u 1，在37°C、5%C02飽和濕度下培養(yǎng)48小時(shí)。并設(shè)空白對(duì)照(不加藥物)和溶媒(DM-S0)對(duì)照， 置于37。C含5 % C02孵箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加MTT(5 mg mL-1)20 uL，作用4 h后棄上清。各孔加入150 uL DMSO，振蕩10 min，使甲結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo) 儀570 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度A值。紀(jì)錄結(jié)果。
權(quán)利要求
1、一種新型抗癌復(fù)方藥物的配伍，其特征在于配伍方法包括以下步驟乳香為橄欖科植物卡氏乳香(BoswelliacarteriiBirdwood)的膠狀樹脂，有活血行氣、通經(jīng)止痛、消腫生肌等功效。主治心腹疼痛、風(fēng)濕痹痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌打淤痛等。文獻(xiàn)研究表明，乳香揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗白血病活性。紫草為藥典收戴臨床常用傳統(tǒng)中草藥。它最初記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，屬于紫草科多年生草本植物，根用于藥，其中主要含有萘醌類色素、多糖兩大類有效成分。具有抗炎、抗腫瘤、保肝和免疫調(diào)節(jié)、避孕、殺菌抗病毒等作用。抗炎即消炎、收斂和解毒，其水提物、醇提物、醚提物都有此作用。新疆紫草素是從新疆紫草根中提取的萘醌類化合物。新疆紫草含β，β-二甲基丙烯紫草素、紫草素、乙酰紫草素、異丁酰紫草素、異戊紫草素等。1.1配伍方法將乳香粉碎(購于山東科信醫(yī)藥科技有限公司)，超臨界CO2萃取實(shí)驗(yàn)儀以壓力25MPa，溫度55℃，萃取時(shí)間6h的條件萃取。得到乳香SFE-CO2萃取物。將乳香SFE-CO2萃取物與紫草素(由長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院提供)按SFE-CO2萃取物∶紫草素＝0.7mg∶10.0μg/ml(溶媒DMSO濃度0·1％)的比例配伍1.2藥物活性研究1.2.1實(shí)驗(yàn)儀器及藥物藥物SFE-CO2萃取物∶紫草素＝0.7mg∶10.0μg/ml(溶媒DMSO濃度0·1％)。細(xì)胞株、人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、小鼠肝癌細(xì)胞系H22均由吉林省腫瘤防治研究所提供。α-蒎烯對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；乙酸正辛酯(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，含量大于98％)；丙酮等為分析純；四甲基唑氮藍(lán)(MTT)購自SIGMA公司。動(dòng)物 昆明種小鼠購自吉林大學(xué)新民校區(qū)動(dòng)物部。1.2.2實(shí)驗(yàn)方法MTT法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞數(shù)大于95％。0.25％胰蛋白酶消化人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，用含10％胎牛血清的RP-MI1640培養(yǎng)液配制成單細(xì)胞懸液，以每毫升5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μl。將培養(yǎng)板置于CO2孵箱中，24小時(shí)后加入藥物，每孔100μl，在37℃、5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)48小時(shí)。并設(shè)空白對(duì)照(不加藥物)和溶媒(DM-SO)對(duì)照，置于37℃含5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h后，每孔加MTT(5mg·mL-1)20uL，作用4h后棄上清。各孔加入150uL DMSO，振蕩10min，使甲結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處讀取吸光度A值。由此測(cè)定藥物抗癌細(xì)胞活性。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗癌藥物的配伍方法，將乳香揮發(fā)袖與紫草素 配伍，其特征在于SFE-C02萃取物紫草素二0.7mg: 10.0ug/ml (溶媒DMSO濃 度0 1%)。將上述兩種藥材經(jīng)上述比例配伍后，發(fā)現(xiàn)對(duì)S麗C-7721細(xì)胞的殺傷 率在90%以上。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型復(fù)方抗癌藥物的配伍方法。本發(fā)明將乳香揮發(fā)油與紫草素通過一定的比例配伍，研究其對(duì)抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，發(fā)現(xiàn)配伍后的藥物對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞株增殖有很強(qiáng)的殺傷作用可達(dá)90％左右。
文檔編號(hào)A61K36/324GK101156884SQ20071011293
公開日2008年4月9日 申請(qǐng)日期2007年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月14日
發(fā)明者張岱州, 朱春花, 梁大連, 陳彤彤, 河 馬 申請(qǐng)人:山東省醫(yī)藥工業(yè)研究所