專利名稱：：一種明膠代血漿及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種明膠代血漿及其制備方法，更確切的說(shuō)，本發(fā)明涉及以海狗皮為原料的明膠代血漿及其制備方法，是屬于醫(yī)學(xué)血液學(xué)領(lǐng)域里的血漿代用品及其制備方法。
背景技術(shù)：
：休克是臨床上最常見的重癥之一，燒傷、燙傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷及出血的病人，損失大量的水分、鹽類、血漿蛋白和血液有形成分等，如不及時(shí)予以補(bǔ)充，病人即會(huì)發(fā)生休克，生命將受到嚴(yán)重威脅。引起休克的共同途徑是有效循環(huán)血量減少、微循環(huán)障礙及細(xì)胞能量代謝障礙，故輸血、輸液為抗休克的主要措施。但血液的來(lái)源、血液制品的質(zhì)量、疾病的傳播、以及保存等均影響著臨床的應(yīng)用。血漿代用品可以使血容量迅速恢復(fù)正常，且不受血型的限制，隨著醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展，血漿代用品已經(jīng)成為臨床治療各種休克的首選藥物之一。近年來(lái)血漿代用品在臨床中的應(yīng)用日趨廣泛，除補(bǔ)充血容量外，還常作為自身輸血和血液稀釋的一種替代物。當(dāng)前在醫(yī)學(xué)臨床中，普遍應(yīng)用的代血漿是右旋糖酐、羥乙基淀粉和明膠代血漿。右旋糖酐臨床應(yīng)用的不良反應(yīng)較多，如過(guò)敏反應(yīng)、急性腎功能衰竭、蓄積作用、出血傾向、交叉配血實(shí)驗(yàn)的假凝集、加速血沉、抑制吞噬功能系統(tǒng)。羥乙基淀粉在生物學(xué)效應(yīng)取決于它的平均分子量和羥乙基的取代度，較低相對(duì)分子質(zhì)量的羥乙基淀粉的擴(kuò)容強(qiáng)度小，較高相對(duì)分子質(zhì)量的羥乙基淀粉在臟器內(nèi)積存期較長(zhǎng)，使紅細(xì)胞聚集增加，出血時(shí)間延長(zhǎng)，低取代的羥乙基淀粉在血液循環(huán)中易被血液淀粉酶所水解，在循環(huán)中存留時(shí)間較短，高取代羥乙基淀粉因停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)發(fā)生體內(nèi)蓄積和凝血機(jī)制受損。而且這類代血漿的制備工藝復(fù)雜，工藝條件控制較難，成品產(chǎn)量少而價(jià)格高，其成份以低分子量為主，不參與體內(nèi)代謝過(guò)程，無(wú)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。研究表明，明膠代血漿具有最好的血液相溶性，即使大劑量輸注，也幾乎不影響凝血機(jī)制和纖維蛋白溶解系統(tǒng)，在臨床應(yīng)用中過(guò)敏反應(yīng)癥狀也較血漿蛋白或右旋糖酐輕微，是優(yōu)選的代血漿。明膠是一種衍生蛋白，它是一種類似血清蛋白的蛋白質(zhì)?？晒┡R床使用的明膠代血漿有3種，即氧化聚明膠(0PG)、脲聯(lián)明膠、琥珀酰明膠(MFG)。氧化聚明膠(0PG)于1951年用于臨床，但過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率較高，Gordh等曾報(bào)道應(yīng)用后發(fā)生過(guò)敏性休克死亡的病例，對(duì)血沉及血型鑒定亦有影響，現(xiàn)己少用。脲聯(lián)明膠由于其溶液中鈣離子濃度過(guò)高，使得在應(yīng)用中會(huì)出現(xiàn)凝膠現(xiàn)象。琥珀酰明膠(MFG)是由牛膠原經(jīng)琥珀?；傻哪z體溶液，皮膚丘疹反應(yīng)較多，且隨著瘋牛病的出現(xiàn)和全球蔓延，已不再用牛骨制備明膠。尋找新的膠原蛋白的來(lái)源、探索新工藝、制備安全有效的血漿代用品迫在眉睫。CN1055111中對(duì)一種驢皮膠代血漿及其制備方法進(jìn)行了論述。該專利通過(guò)改進(jìn)傳統(tǒng)阿膠的制備工藝"原料的去脂、除熱原處理，原膠熬制分離，原膠的除菌、除熱原精制和代血漿配制"制備符合注射制劑要求的代血漿。該專利所精制的驢皮膠的膠凝點(diǎn)為-7.2°C，在O'C長(zhǎng)期保存不凍結(jié)，且可制成凍干制品，便于儲(chǔ)存運(yùn)輸，加入注射用水可在2min內(nèi)完全溶解。對(duì)失血性休克有一定療效，但因其原料來(lái)源受到限制，且發(fā)現(xiàn)體內(nèi)有蓄積作用而放棄。CN1634572中公開了一種生物膠原注射液，系由香豬皮經(jīng)消毒殺菌、蒸煮、提膠和純化而成的一種生物膠原液，再配成注射液。此生物膠原注射液生物活性及相容性均很高。作為一種生物膠原液，無(wú)論稀溶液還是濃溶液，貯存期均很短，只適合就地銷售。因此，不能遠(yuǎn)距離銷售，從而不能達(dá)到急救的目的。海狗為海豹科動(dòng)物豎琴海豹的俗稱，棲居于北極和大西洋的北部。由于加拿大政府采取的保護(hù)措施，海狗的數(shù)量以每年7%的速度穩(wěn)定增長(zhǎng)。為保持海狗與魚群之間的生態(tài)平衡，經(jīng)加拿大政府批準(zhǔn)，每年可以捕殺海狗。紐芬蘭及其附近海灣每年可提供大約250000-282000張海狗皮。CN1457881公開了一種以海狗皮為原料應(yīng)用"NaOH浸泡-H2S04浸泡-在HCl溶液中提取"的方法制備明膠代血漿，盡管所制備的明膠代血漿有一定的療效，但由于海狗皮中膠原蛋白存在于真皮層，外周的表皮含有大量的黑色素，皮下層含有大量脂肪，這些不僅不是有效成分存在的部位，而且包裹著真皮，使各種試劑的作用效率大大降低，同時(shí)，若存留在終產(chǎn)品中，還會(huì)引起過(guò)敏等不良反應(yīng)。因此，海狗皮的前處理至關(guān)重要。但在CN1457881中僅用NaOH和1"^04溶液浸泡且沒(méi)有一個(gè)浸泡達(dá)到終點(diǎn)的判定方法，因此很難保證黑色素和脂肪完全除盡，從而影響所制備的明膠代血漿的質(zhì)量。本發(fā)明人仍以原料豐富的海狗皮為原料，經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)，采用不同的提取方法，并對(duì)各步驟進(jìn)行嚴(yán)格的在線監(jiān)測(cè)，確保了所制備的明膠代血漿的質(zhì)量，取得了更好的療效，從而完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種明膠代血漿，該明膠代血漿的滲透壓和pH與血漿相近，具有與生理鹽溶液相同的等滲性，在臨床應(yīng)用時(shí)能參與體內(nèi)代謝，具有良好的擴(kuò)充血容量、保持必要滲透壓、改善微循環(huán)的作用，能夠維持一定的血壓，改善因有效循環(huán)血容量不足引起的休克等癥狀?？膳c其它靜脈輸液劑同時(shí)使用，其療效明顯，無(wú)溶血反應(yīng)，無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，對(duì)靜脈血管無(wú)刺激反應(yīng)，無(wú)毒副作用，用藥安全。本發(fā)明所述的明膠代血漿，其特征在于該明膠代血漿的蛋白含量為14-18mg/ml，優(yōu)選15-17mg/ml。本發(fā)明產(chǎn)品明膠代血漿是以海狗皮為原料提取的分子量為25000-35000、分散度為2.0-3.0的明膠制備的蛋白溶液，本發(fā)明所述范圍的蛋白含量能夠提供人體所需的蛋白質(zhì)，其療效明顯。本發(fā)明所述明膠代血漿的滲透壓為300-335m0sm，pH為7.1-7.4。本發(fā)明產(chǎn)品明膠代血漿的滲透壓和pH與血漿相近，具有與生理鹽溶液相同的等滲性，可保持必要滲透壓，能夠維持一定的血壓。本發(fā)明的另一目的還在于提供該明膠代血漿的制備方法，該方法包括如下1)海狗皮原料的預(yù)處理將冷凍保存的海狗皮解凍，刮去皮下脂肪層，切成塊，在4-25匸溫度下用堿的乙醇溶液浸泡至殘油率小于1%后，水洗；然后用石灰水浸泡至皮料水提液的紫外掃描圖譜無(wú)酪氨酸的特征吸收峰后，洗滌，再加入鹽酸水洗至中性，得到經(jīng)預(yù)處理的海狗皮；2)提取將上述經(jīng)預(yù)處理的海狗皮絞碎，浸于NaOH溶液中，提取30-50小時(shí)得水解明膠粗品；3)純化往上述粗品中加入鹽酸至pH7.0-7.5，然后加入硅藻土，使硅藻土含量為0.3%(w/v)，過(guò)濾，取濾液得純化的水解明膠原液；4)冷凍干燥將上述水解明膠原液冷凍干燥得水解明膠凍干粉末；5)配制明膠代血漿取水解明膠凍干粉末加生理鹽水溶解即得海狗皮明膠代血漿。上述堿的乙醇溶液為NaOH-乙醇的混合溶液，步驟l)和步驟3)中所述的鹽酸均為6mol/L鹽酸，歩驟2)中所述的NaOH溶液為0.lmol/LNaOH溶液。本發(fā)明中堿的乙醇溶液，優(yōu)選Na0H-乙醇的混合溶液。用NaOH溶液可以與原料海狗皮中的脂肪發(fā)生緩慢的皂化反應(yīng)而使其脫脂，乙醇溶液可使難以分解的脂肪溶于其中，從而使脫脂更徹底。上述的NaOH-乙醇溶液為0.5-1.25mol/LNa()H和20%-95%乙醇的混合溶液，最好為0.75-1.25mol/LNa0H和40°/。-60%乙醇的混合溶液，優(yōu)選1mol/LNa0H和50%乙醇的混合溶液。上述步驟1)所述的切成塊為切成正方形小塊，優(yōu)選邊長(zhǎng)為2-4cm的小塊。因?yàn)檫呴L(zhǎng)為2-4cm的小塊可使原料海狗皮與NaOH-乙醇溶液更充分地接觸，從而加強(qiáng)石灰水對(duì)海狗皮原料的浸泡和明膠的提取，但是也不能切得太小，因?yàn)榍械锰?，在用石灰水浸泡和水洗的過(guò)程中海狗皮原料容易流失。上述步驟2)中所述的NaOH溶液為0.lmol/LNaOH溶液。本發(fā)明采用在中性條件下，用O.1mol/LNaOH溶液進(jìn)一步提取明膠，可大大縮短明膠的降解時(shí)間，縮短生產(chǎn)周期，提取的明膠質(zhì)量也很高。這樣不僅可以提高資源的利用率，降低生產(chǎn)成本，而且可以減少產(chǎn)品受污染的機(jī)會(huì)，保證產(chǎn)品的質(zhì)量。血漿代用品除了需要有大分子物質(zhì)提供膠體滲透壓，還需要一定濃度的鹽提供晶體滲透壓，故選用0.1mol/LNaOH,并在純化時(shí)用鹽酸，可以中和提取時(shí)所用的NaOH溶液，這樣形成的鹽不僅可以提供晶體滲透壓，還可以在產(chǎn)品的冷凍干燥過(guò)程中起賦形劑的作用。由于膠原蛋白存在于真皮層，外周的表皮含有大量的黑色素，皮下層含有大量脂肪，這些不僅不是有效成分存在的部位，而且包裹著真皮，使各種試劑的作用效率大大降低，同時(shí)，若存留在終產(chǎn)品中，還會(huì)引起過(guò)敏等不良反應(yīng)。因此，海狗皮的預(yù)處理至關(guān)重要?，F(xiàn)有技術(shù)中只是對(duì)海狗皮進(jìn)行堿浸、酸浸，而沒(méi)有一個(gè)浸泡達(dá)到終點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，這樣很難保證黑色素和脂肪完全除盡，從而影響代血槳的質(zhì)量。本發(fā)明中對(duì)原料的預(yù)處理進(jìn)行了嚴(yán)格的在線監(jiān)測(cè)，確保了明膠代血漿的質(zhì)量。本發(fā)明中所采用的在線監(jiān)測(cè)的方法如下(1)采用目測(cè)法判定經(jīng)堿的乙醇溶液浸泡后的海狗皮的顏色由黑色變?yōu)樽丶t色，最終變?yōu)榈S色；(2)采用索氏提取法測(cè)定殘油率判定將經(jīng)堿的乙醇溶液浸泡后的海狗皮剪碎，徹底清洗，瀝干水分，置8(TC烘箱烘干4小時(shí)以除去大部分水分。置索氏提取器中以乙醚為溶劑，于5(TC恒溫水浴回流6小時(shí)，測(cè)定圓底燒瓶的增重從而測(cè)得殘油率。與同法操作的未處理的海狗皮作比較，以殘油率0.1-1%達(dá)到浸泡終點(diǎn)。(3)應(yīng)用紫外掃描圖譜判定在用石灰水浸泡的過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)取皮樣，充分水洗后用熱水抽提，抽提液經(jīng)10.000rpm/min離心5min，取中層清液，以水為空白對(duì)照，測(cè)量和紀(jì)錄200-350nm的吸收光譜。皮料水提液的紫外掃描圖譜無(wú)酪氨酸的特征吸收峰。本發(fā)明中對(duì)海狗皮的預(yù)處理進(jìn)行了嚴(yán)格的監(jiān)測(cè)，確保了海狗皮脫脂脫色徹底，從而保證了所制備的明膠代血漿的質(zhì)量。明膠的物理、化學(xué)性質(zhì)不僅與平均分子量有關(guān)，而且更重要的是與其分子量分布有關(guān)。作為血漿代用品，明膠的分子量及其分布關(guān)系到血容量的擴(kuò)充效果和其在血液循環(huán)中存留的時(shí)間。因此，測(cè)定海狗皮水解明膠注射液的分子量及分子量分布成為研究和控制其生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品質(zhì)量的一項(xiàng)重要工作。本發(fā)明中運(yùn)用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定本發(fā)明產(chǎn)品的分子量及分子量分布。測(cè)得的本發(fā)明產(chǎn)品的重均分子量為25000-35000、分散度為2.0-3.0，分子量分布圖譜基本呈現(xiàn)對(duì)稱的正態(tài)分布峰。分子量范圍符合代血漿的要求，分散度大于1，表明本發(fā)明產(chǎn)品明膠分子大小不均，其優(yōu)點(diǎn)在于其中較小分子易從腎小球?yàn)V過(guò)，在輸入初期有促進(jìn)利尿的作用；而較大分子則滯留在血管內(nèi)，延長(zhǎng)擴(kuò)容效應(yīng)。本發(fā)明產(chǎn)品明膠代血漿是具有一定分子量分布的蛋白溶液。氨基酸的組成分析是蛋白質(zhì)化學(xué)研究中最基本的內(nèi)容之一。測(cè)定該明膠代血漿的組成及含量，不僅為其藥理學(xué)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，而且也是控制其制備工藝、保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的有效手段。應(yīng)用HPLC測(cè)定的本發(fā)明產(chǎn)品明膠代血漿的氨基酸組成和含量(每1000殘基中氨基酸殘基數(shù))如下-門冬氨酸33.65谷氨酸56.64羥脯氨酸69.24絲氨酸34.14甘氨酸309.87組氨酸7.38精氨酸50.15蘇氨酸13.25丙氨酸97.73脯氨酸186.86酪氨酸8.16纈氨酸26.06蛋氨酸8.88苯丙氨酸20.03色氨酸2.56賴氨酸24.58從海狗皮水解明膠的氨基酸組成和含量的分析中可以看出，海狗皮水解明膠中含有少量的色氨酸。雖然含量很低，但是肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的多核糖蛋白體對(duì)色氨酸濃度極其敏感，微小的增加即可刺激其白蛋白的合成，從而補(bǔ)充大量流失的血漿蛋白；而其它氨基酸則僅僅是合成蛋白的"原料"。本發(fā)明產(chǎn)品明膠代血漿的滲透壓和pH與血漿相近，具有與生理鹽溶液相同的等滲性，在臨床應(yīng)用時(shí)能參與體內(nèi)代謝，具有良好的擴(kuò)充血容量、保持必要滲透壓、改善微循環(huán)的作用，能夠維持一定的血壓，改善因有效循環(huán)血容量不足而引起的休克等癥狀。可與其它靜脈輸液劑同時(shí)使用，其療效明顯，無(wú)溶血反應(yīng)，無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，對(duì)靜脈血管無(wú)刺激反應(yīng)，無(wú)毒副作用，用藥安全。本發(fā)明產(chǎn)品的氨基酸成分中尤其還含有色氨酸。色氨酸是必需氨基酸中最重要的氨基酸，肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的多核糖蛋白體對(duì)色氨酸濃度極其敏感，微小的增加即可刺激其白蛋白的合成。在患者的血漿蛋白大量流失的情況下輸入一定量的本發(fā)明產(chǎn)品，即可刺激白蛋白的合成，從而補(bǔ)充患者流失的血漿蛋白'，具體實(shí)施方式以下通過(guò)試驗(yàn)例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述明膠代血漿的有益效果。這些試驗(yàn)例包括了本發(fā)明明膠代血漿的藥效學(xué)試驗(yàn)和臨床療效觀察試驗(yàn)。[試驗(yàn)例l]本發(fā)明明膠代血漿體外溶血性試驗(yàn)試驗(yàn)材料試驗(yàn)動(dòng)物品系新西蘭種白色家兔性另IJ:雄性體重2.4kg來(lái)源中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心家兔在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室飼養(yǎng)觀察1周后用于試驗(yàn)。合格證號(hào)京動(dòng)質(zhì)許字(2000)第017號(hào)受試藥物及保存本發(fā)明產(chǎn)品，-2(TC凍存，臨用前室溫融化。溶劑0.9%氯化鈉注射液(NS)為北京雙鶴藥業(yè)生產(chǎn)；蒸熘水(DDW)為中國(guó)藥品生物制品檢定所自制試驗(yàn)器材低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)型號(hào)LD4-2恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)試管架、離心管、消毒注射器、吸管、滅菌玻璃珠試驗(yàn)方法血細(xì)胞懸液的制備采用心臟取血法取兔血10毫升，放入含滅菌玻璃珠的50ml三角燒瓶中同方向震蕩IO分鐘，除去纖維蛋白原，使成脫纖血液。加入生理鹽水約80毫升，分裝至10毫升刻度離心管中，搖勻，1500r/min離心5分鐘，除去上清液，并調(diào)整沉淀的紅細(xì)胞，使其在離心管中0.2ml刻度線上。再用生理鹽水8毫升按上述方法洗滌并調(diào)整4次，至上清液無(wú)色透明為止。將所得紅細(xì)胞加生理鹽水至10ml即配成2%的血細(xì)胞混懸液(RBC)，供試驗(yàn)用。操作方法另取離心管7支，編號(hào)后分別加入2%紅血球混懸液2.5ml;第1號(hào)管加入NS2.5ml作為陰性對(duì)照管；第2-7號(hào)管分別加入NS2.0-2.4ml;混勻后置37°C土5。C恒溫水浴箱30分鐘；分別再第2-7號(hào)管加入本發(fā)明產(chǎn)品0.5-0.lml及第7號(hào)管加入DDW2.5ml，使每支離心管容積均在5ml，混勻后繼續(xù)在37'C土5'C恒溫水浴箱中保溫；每15分鐘觀察一次，1小時(shí)后改為每小時(shí)觀察一次，共觀察4個(gè)小時(shí)。如試管中的液體呈紅色透明即為溶血；呈棕紅色并有絮狀沉淀即為凝集；上層液體清亮透明，下層是沉淀的紅血球即為不溶血。試驗(yàn)結(jié)果與討論第1-6號(hào)離心管上層液體清亮透明，下層是沉淀的紅血球，未見溶血和凝聚；第7號(hào)離心管中的液體呈紅色透明，管底有少量沉淀殘?jiān)慌卸槿苎?。即受試藥品呈現(xiàn)與陰性對(duì)照相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無(wú)溶血和凝聚發(fā)生；陽(yáng)性對(duì)照管呈澄明紅色，底部有細(xì)胞碎屑，有溶血發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明產(chǎn)品在體外接觸紅血球后不出現(xiàn)溶血和凝聚反應(yīng)。詳見表1和表2。表1.本發(fā)明產(chǎn)品體外溶血性試驗(yàn)描述<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2.本發(fā)明產(chǎn)品體外接觸紅血球的溶血作用觀察<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本發(fā)明產(chǎn)品為具有一定分子量分布的多肽溶液，用作血漿容量擴(kuò)充劑供靜脈滴注。溶血試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明產(chǎn)品在4小時(shí)內(nèi)沒(méi)有發(fā)生溶血和紅細(xì)胞凝聚，表明本發(fā)明產(chǎn)品在該試驗(yàn)條件下不會(huì)引起血細(xì)胞形態(tài)改變，提示本發(fā)明產(chǎn)品的理化性質(zhì)符合溶血試驗(yàn)的規(guī)定，可供注射使用。[試驗(yàn)例2]本發(fā)明明膠代血漿對(duì)家兔靜脈注射給藥血管刺激性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系新西蘭種白色大耳家兔性另lj:雌雄兼用體重2.1-2.3kg來(lái)源中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心家兔在二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室飼養(yǎng)觀察2天，選4只健康、無(wú)稀便的用于試驗(yàn)合格證號(hào)京動(dòng)質(zhì)許字(2000)第017號(hào)飼養(yǎng)環(huán)境實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為三級(jí)空氣過(guò)濾送風(fēng)，日光燈12小時(shí)自動(dòng)照明，每籠1只家兔，籠具為不銹鋼絲，體積30X30X40cm溫度22-24。C濕度40-45%飼料中國(guó)藥品生物制品檢定所動(dòng)物房自制飲水自由飲水受試藥物及配制本發(fā)明產(chǎn)品，一20。C凍存，臨用前室溫融化。對(duì)照藥物生理鹽水實(shí)驗(yàn)器材固定液10%甲醛溶液；顯微鏡OLYPUS(H本)型號(hào)BX51TF5ml注射器實(shí)驗(yàn)方法給藥白色大耳家兔4只。在兔夾上固定后，雙側(cè)耳緣靜脈用75%乙醇涂抹消毒，用5只注射針頭刺入，給藥組分別緩慢注射本發(fā)明產(chǎn)品lOml(5ml/耳)，對(duì)照組注射等容積0.9%生理鹽水，速度大約5min/耳。干棉球壓迫止血5分鐘。每天注射1次，在耳緣同一條靜脈血管的遠(yuǎn)心端上連續(xù)給藥7天，每天觀察局部血管情況。組織學(xué)觀察在第7天注射給藥后的2小時(shí)，棒擊家兔枕部頭顱處死，死亡1小時(shí)待血液完全凝固后，剪取注射靜脈血管近心端的雙耳廓面積2X4cm各一塊，浸泡在10%甲醛固定液中，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后制成標(biāo)本玻片，再經(jīng)H.E染色，顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論對(duì)照組和受試藥組家兔在靜脈注射后無(wú)全身性不良反應(yīng)。第2次靜脈注射給藥后，肉眼觀察局部血管皮下組織有少量出血引起的青紫色瘀斑，連續(xù)7天給藥未見異常。病理組織學(xué)切片觀察，對(duì)照組和受試藥組注射部位血管及周圍組織未見出血、水腫、'變性或壞死等刺激性反應(yīng)。給藥期間家兔的反應(yīng)見表3。表3.家兔靜脈注射給藥血管刺激性實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象描述<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>家兔靜脈注射給藥血管刺激性試驗(yàn)中，受試藥品采用與臨床制劑相同濃度連續(xù)7日推注家兔耳緣靜脈，給藥組和對(duì)照組注射部位局部血管肉眼未見明顯異常變化，病理組織學(xué)未見血管存在刺激反應(yīng)。提示受試藥品即本發(fā)明產(chǎn)品符合注射給藥部位刺激性試驗(yàn)的規(guī)定，可供注射使用。[試驗(yàn)例3]過(guò)敏性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物性體來(lái)別:豚鼠(SPF級(jí)DHP白色豚鼠)雌性280—320g中國(guó)藥品生物制品檢定所動(dòng)物中心提供豚鼠在二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室飼養(yǎng)觀察2天，選健康、無(wú)傷、無(wú)病的用于試驗(yàn),京動(dòng)質(zhì)許字(2000)第017號(hào)合格證號(hào)飼養(yǎng)環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室為三級(jí)空氣過(guò)濾送風(fēng)，日光燈12小時(shí)照明。每籠8只，籠體積100X50X20cm,無(wú)菌鋸末為墊料。溫度22-24°C濕度40-45%飼料無(wú)菌飼料自由飲食飲水去離子水自由飲水受試藥物及配制本發(fā)明產(chǎn)品，一20。C凍存:，臨用前室溫融化。對(duì)照藥物生理鹽水、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)實(shí)驗(yàn)器材lml注射器、苦味酸標(biāo)記液實(shí)驗(yàn)方法分組將18只豚鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，分別給以相應(yīng)藥品陰性對(duì)照組生理鹽水(NS)陽(yáng)性對(duì)照組牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品14.8mg/支(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，以生理鹽水溶解使成為3mg/ml的溶液(ALB)受試藥組本發(fā)明產(chǎn)品不稀釋致敏用lml注射器分別吸取相應(yīng)藥物，在l，3,5天隔日腹腔注射，每只動(dòng)物0.5ml/次，共3次。激發(fā)激發(fā)途徑一次快速靜脈內(nèi)給藥激發(fā)次數(shù)將每組6只動(dòng)物分成兩小組，每小組3只。分別在首次注射后第14曰及第21日二次激發(fā)。激發(fā)劑量相應(yīng)藥液lml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論三次腹腔致敏注射給藥后未見豚鼠精神、活動(dòng)和行為出現(xiàn)異常；第14天或第21天靜脈攻擊注射給藥后受試藥組和溶劑對(duì)照組的豚鼠呼吸均勻、被毛不豎，無(wú)抓鼻、咳嗽、嘔吐、噴嚏等癥狀，未見其它精神、行為的異常和過(guò)敏反應(yīng)癥狀；陽(yáng)性對(duì)照組則出現(xiàn)抓鼻、豎毛、噴嚏、干嘔、咳嗽、呼吸困難、抽搐、窒息及死亡等一系列過(guò)敏反應(yīng)癥狀。第21天攻擊給藥后豚鼠的過(guò)敏反應(yīng)較第14天攻擊給藥的更為顯著。詳見表4。表4.本發(fā)明產(chǎn)品對(duì)豚鼠攻擊致敏后的觀察(出現(xiàn)反應(yīng)的動(dòng)物數(shù))<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本試驗(yàn)采用全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)，對(duì)致敏成立的動(dòng)物體內(nèi)靜脈注射抗原，觀察抗原與抗體結(jié)合后導(dǎo)致肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒、釋放活性介質(zhì)而致的全身性過(guò)敏反應(yīng)。供試藥即本發(fā)明產(chǎn)品激發(fā)后15分鐘內(nèi)未發(fā)現(xiàn)豚鼠出現(xiàn)明顯全身性過(guò)敏反應(yīng)(如有豎毛、呼吸困難、噴嚏、干嘔或咳嗽3聲等現(xiàn)象中的兩種以上者；或羅音、抽搐、虛脫或死亡現(xiàn)象之一者應(yīng)判斷為陽(yáng)性)。提示本發(fā)明產(chǎn)品符合注射過(guò)敏性試驗(yàn)的規(guī)定，可供注射使用。[試驗(yàn)例4]本發(fā)明明膠代血漿治療休克患者的臨床觀察l.一般資料收治休克患者共50例，這些患者或因內(nèi)外出血、失血量過(guò)大、收縮壓降至80ramHg,或脈壓差小于20mmHg，或因嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷處于休克狀態(tài)。2.診斷標(biāo)準(zhǔn)重度休克收縮壓在70,Hg以下，失血量在2000ml以上者；多器官，系統(tǒng)的嚴(yán)重創(chuàng)傷的休克患者。中輕度休克收縮壓在70mmHg以上，失血量少于2000ml者；有明顯原因的進(jìn)行性休克代償期，如進(jìn)行性血?dú)庑兀?肝、脾破裂等)。3.治療方法每例患者快速輸注本發(fā)明代血漿500-1500ml。4.療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)顯效血壓回升，脈壓差增大，循環(huán)迅速改善，休克在短期內(nèi)得到糾正，并保持穩(wěn)定。5.治療結(jié)果見表5表5.輸入本發(fā)明明膠代血漿后改善情況<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明明膠代血漿的制備方法，所述的實(shí)施例是用于描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。[實(shí)施例1]1)海狗皮原料的預(yù)處理將冷凍保存的海狗皮解凍，刮去皮下脂肪層，清洗后切成邊長(zhǎng)為2cm的正方形小塊。14'C下用lmol/LNaOH和50%乙醇的混合溶液浸泡15小時(shí)，海狗皮顏色為淡黃色，殘油率為0.5%，徹底水洗。再在室溫下用石灰水浸泡兩周，皮料水提液的紫外掃描圖譜無(wú)酪氨酸的特征吸收峰。然后用水充分洗滌，再加入6mol/L的鹽酸，并水洗至中性。2)提取將經(jīng)上述預(yù)處理的海狗皮絞碎，浸于O.1mol/LNaOH溶液中提取40小時(shí)得水解明膠粗品。3)純化往上述粗品中加入6mol/L的鹽酸至pH7.2。然后加入硅藻土，使硅藻土含量為0.3%(w/v)，過(guò)濾，取濾液得純化的水解明膠原液4)冷凍干燥將上述水解明膠原液冷凍干燥得水解明膠凍干粉末。5)配制明膠代血漿取水解明膠凍干粉末500mg，加100ml生理鹽水溶解即得海狗皮明膠代血漿。分子量為29960、分散度為2.9，滲透壓為328m0sm，pH為7.2，運(yùn)用BCA蛋白測(cè)定法測(cè)得的蛋白含量為16mg/ml。實(shí)施例2、3、4、5、6的操作步驟同實(shí)施例1，其中實(shí)施例2、3的步驟1)中的正方形小塊為邊長(zhǎng)3cm的正方形小塊，實(shí)施例4、5的步驟l)中的正方形小塊為邊長(zhǎng)4cm的正方形小塊，實(shí)施例6的步驟1)中的正方形小塊為邊長(zhǎng)2.5cm的正方形小塊，各工藝參數(shù)見附表。附表:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>1)海狗皮原料的預(yù)處理將冷凍保存的海狗皮解凍，刮去皮下脂肪層，清洗后切成邊長(zhǎng)為2cm的正方形小塊。14。C下用lmol/LK0H和50%乙醇的混合溶液浸泡15小時(shí)，海狗皮顏色為淡黃色，殘油率為0.5%，徹底水洗。再在室溫下用石灰水浸泡兩周，皮料水提液的紫外掃描圖譜無(wú)酪氨酸的特征吸收峰。然后用水充分洗滌，再加入鹽酸水洗至中性。2)提取將經(jīng)上述預(yù)處理的海狗皮絞碎，浸于0.15mol/LNaOH溶液中提取40小時(shí)得水解明膠粗品。3)純化往上述粗品中加入鹽酸至pH7.2。然后加入硅藻土，使硅藻土含量為0.3%(w/v)，過(guò)濾，取濾液得純化的水解明膠原液。4)冷凍干燥將上述水解明膠原液冷凍干燥得水解明膠凍干粉末。5)配制明膠代血衆(zhòng)取水解明膠凍干粉末500mg，加100ml生理鹽水溶解即得海狗皮明膠代血漿。分子量為29962、分散度為2.8，滲透壓為327m0sm，pH為7.2，運(yùn)用BCA蛋白測(cè)定法測(cè)得的蛋白含量為16mg/ml。權(quán)利要求1.一種明膠代血漿，是以海狗皮為原料提取的明膠制備的，其特征在于該明膠代血漿的蛋白含量為14-18mg/ml。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種明膠代血漿，其特征在于該明膠代血槳的蛋白含量為15-17呢/ml。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種明膠代血漿，其特征在于該明膠代血漿的滲透壓為300-350m0sm，pH為7.1-7.4。4、一種如權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的明膠代血漿的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟1)海狗皮原料的預(yù)處理將冷凍保存的海狗皮解凍，刮去皮下脂肪層，切成塊，在4-25'C溫度下用堿的乙醇溶液浸泡至殘油率小于1%后，水洗；然后用石灰水在室溫下浸泡至皮料水提液的紫外掃描圖譜無(wú)酪氨酸的特征吸收峰后洗滌，再加入鹽酸水洗至中性，得到經(jīng)預(yù)處理的海狗皮；2)提取將上述經(jīng)預(yù)處理的海狗皮絞碎，浸于NaOH溶液中，提取30-50小時(shí)得水解明膠粗n3)純化往上述粗品中加入鹽酸至pH7.0-7.5，然后加入硅藻土，使硅藻土含量為0.3%(w/v)，過(guò)濾，取濾液得純化的水解明膠原液；4)冷凍干燥將上述水解明膠原液冷凍干燥得水解明膠凍干粉末；5)配制明膠代血漿取水解明膠凍干粉末加生理鹽水溶解即得海狗皮明膠代血漿。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的明膠代血漿的制備方法，其特征在于步驟l)中所述的堿的乙醇溶液為NaOH的乙醇溶液。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的明膠代血漿的制備方法，其特征在于所述的NaOH的乙醇溶液為0.5-1.25mol/LNa0H和20%-95%乙醇的混合溶液。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種明膠代血漿的制備方法，其特征在于所述的混合溶液為0.75-1.25mol/LNa0H和40%-60%乙醇的混合溶液。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種明膠代血漿的制備方法，其特征在于所述的混合溶液為lmol/LNaOH和50%乙醇的混合溶液。9、根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種明膠代血漿的制備方法，其特征在于步驟l)中所述的切成塊為切成正方形小塊，優(yōu)選邊長(zhǎng)為2-4cra的小塊。10、根據(jù)權(quán)利要求4所述的明膠代血漿的制備方法，其特征在于步驟2)中所述的NaOH溶液為0.lmol/LNaOH溶液。全文摘要本發(fā)明涉及一種明膠代血漿的制備方法，該明膠代血漿特征是以海狗皮為原料提取的分子量為25000-35000、分散度為2.0-3.0的明膠制備的蛋白溶液，該明膠代血漿的滲透壓為300-350mOsm，pH為7.0-7.4，運(yùn)用BCA蛋白測(cè)定法測(cè)得的蛋白含量為14-18mg/ml。該明膠代血漿的滲透壓和pH與血漿相近，具有與生理鹽溶液相同的等滲性，在臨床應(yīng)用時(shí)能參與體內(nèi)代謝，具有良好的擴(kuò)充血容量、保持必要滲透壓、改善微循環(huán)的作用，能夠維持一定的血壓，改善因有效循環(huán)血容量不足引起的休克等癥狀?？膳c其它靜脈輸液劑同時(shí)使用，其療效明顯，無(wú)溶血反應(yīng)，無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，對(duì)靜脈血管無(wú)刺激反應(yīng)，無(wú)毒副作用，用藥安全。文檔編號(hào)A61P7/00GK101254210SQ20071007958公開日2008年9月3日申請(qǐng)日期2007年3月1日優(yōu)先權(quán)日2007年3月1日發(fā)明者徐康森,李榮立,飛林申請(qǐng)人:中國(guó)生化制藥工業(yè)協(xié)會(huì)