專利名稱：：一種五指毛桃提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種天然植物有效部位提取物，特別涉及一種五指毛桃提取物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：五指毛桃是廣東道地中藥材，五指毛桃別名五指牛奶、五爪龍、南芪，并被譽(yù)為"廣東人參"，特指學(xué)名為?？浦参锎秩~榕Ficuxhirtavahl.的干燥根。五指毛桃在廣東民間使用有上千年歷史，民間用于保健養(yǎng)生，有健脾祛濕、止咳化痰、活筋通絡(luò)功效。五指毛桃的使用歷史悠久，安全無毒副作用，但是五指毛桃的藥用價值一直得不到深入的研究。五指毛桃在民間和臨床上的用藥經(jīng)驗主要集中在治療慢性肺病，如慢性支氣管炎、肺氣腫、肺結(jié)核，和治療慢性肝炎。但在民間和臨床上，五指毛桃主要以中藥復(fù)方形式使用，單味中藥五指毛桃應(yīng)用經(jīng)驗少，難以確定其藥用價值與意義。曾曉春在中國中醫(yī)藥信息雜志2002年2月第2期，發(fā)表研究文章表明五指毛桃有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘作用。中國專利申請200510002111.7公開了五指毛桃在制備化學(xué)性肝損害的輔助治療藥物用途。但是迄今為止對于五指毛桃的有效成分一直未有進(jìn)行深入研究。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種五指毛桃提取物。本發(fā)明的另一目的在于提供上述五指毛桃提取物的制備方法。本發(fā)明的再一目的在于提供上述五指毛桃提取物的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種五指毛桃提取物，按下述方法制備而成(1)五指毛桃用50100%(V/V)的乙醇或甲醇加熱提取13次，每次提取13小時，過濾，合并提取液；或者，用50100%(V/V)乙醇或甲醇浸漬1224小時，310ml/kg'min速度滲漉，收集816倍重量50100%(V/V)乙醇或甲醇的滲漉液。(2)將步驟(1)獲得的提取液或滲漉液經(jīng)濃縮除盡乙醇或甲醇后，加26倍體積量的水后，用石油醚或乙酸乙酯充分萃取，收集有機(jī)溶劑溶解部分經(jīng)濃縮除盡溶劑，干燥，即得到五指毛桃提取物。或者，將步驟(1)獲得的提取液或滲漉液濃縮除盡乙醇或甲醇后，加510%(V/V)乙醇溶解分散后上大孔樹脂吸附，先用24倍柱體積量的水淋洗，棄去水淋洗液，再用26倍柱體積量的4070%(V/V)乙醇洗脫，收集洗脫液經(jīng)濃縮除盡溶劑，干燥，即得五指毛桃提取物。五指毛桃提取物含有香豆精和黃酮成分，其中以紫外分光光度計測定五指毛桃提取物中香豆精成分含量占1540%(質(zhì)量百分比)，黃酮成分含量占2055%(質(zhì)量百分比)。其中，香豆精成分為補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯類，黃酮成分為斧菜素類。五指毛桃提取物通過硅膠柱，薄層制備色譜，以石油醚:乙酸乙酯梯度洗脫，用石油醚:乙酸乙酯結(jié)晶，分別得到補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、芹菜素，經(jīng)過化學(xué)、波譜方式測定這三個化合物通式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>芹菜素所述五指毛桃提取物的制備方法，包括如下步驟(1)五指毛桃用50100%(V/V)乙醇或甲醇加熱提取13次，每次提取13小時，過濾，合并提取液；或者，用50100%(V/V)乙醇或甲醇浸漬1224小時，310ml/kg'min速度滲漉，收集816倍重量50100。/。(V/V)乙醇或甲醇的滲漉液；(2)將步驟(1)獲得的提取液或滲漉液經(jīng)濃縮除盡乙醇或甲醇后，用26倍體積量的水后，用石油醚或乙酸乙酯充分萃取，收集有機(jī)溶劑溶解部分經(jīng)濃縮除盡溶劑，干燥，即得到五指毛桃提取物；或者，將步驟(1)獲得的提取液或滲漉液濃縮除盡乙醇或甲醇后，用510%(V/V)乙醇溶解分散后上大孔樹脂吸附，先用24倍柱體積量的水淋洗，棄去水淋洗液，再用26倍柱體積量的4070%(V/V)乙醇洗脫，收集洗脫液經(jīng)濃縮除盡溶劑，干燥，即得五指毛桃提取物。為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明，步驟(1)中特別優(yōu)選五指毛桃用410倍重量的50100%(V/V)乙醇或甲醇于5085。C加熱提取13次。步驟(1)中，特別優(yōu)選用36倍重量的50100%(V/V)乙醇或甲醇浸漬1224小時。步驟(2)中，特別優(yōu)選將步驟(1)獲得的提取液或滲漉液濃縮除盡乙醇或甲醇后，用26倍體積量的510%(V/V)乙醇溶解分散后上大孔樹脂吸附。上述五指毛桃提取物的藥物組合物是以五指毛桃提取物作為活性成分;所述藥物組合物可制成片劑、膠囊、顆粒、滴丸、口服液或噴霧劑。本發(fā)明所述的五指毛桃提取物具有止咳、化痰、平喘作用，可在制備急慢性支氣管炎、哮喘、肺氣腫或慢性阻塞性肺病等藥物中應(yīng)用。本發(fā)明所述的五指毛桃提取物具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力作用，可在制備腫瘤或艾滋病等免疫力低下疾病等藥物中應(yīng)用。本發(fā)明所述的五指毛桃提取物具有抑制乙肝病毒DNA復(fù)制作用，可在制備病毒性肝炎或慢性乙型肝炎等藥物中應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明制備方法簡單、生產(chǎn)成本低、可連續(xù)化生產(chǎn)。本發(fā)明首次從五指毛桃中分離純化得到芹菜素，表明五指桃中含有芹菜素類黃酮成分，并且在五指毛桃中同時得到黃酮、香豆精有效部位的提取物，本發(fā)明五指毛桃提取物可用于制備治療慢性肺病、慢性肝炎、免疫低下疾病等藥物。本發(fā)明五指毛桃提取物在治療慢性肺病中能標(biāo)、本同治，具有明顯的抗肺部支氣管慢性炎癥，有明顯的止咳、祛痰、平喘作用，并且還具有明顯的提高機(jī)體免疫力，提高呼吸道的的防御能力，提高肺部呼吸道對各種細(xì)菌、病毒等有害刺激的抵抗能力，防止慢性肺病的反復(fù)發(fā)作，五指毛桃提取物在治療慢性肺病與目前其它藥物有明顯的優(yōu)勢。本發(fā)明五指毛桃提取物具有明顯的抗乙型肝炎病毒作用，并且保護(hù)病毒引起的免疫性肝損害，使五指毛桃提取物在治療慢性乙型肝炎時同時實現(xiàn)直接抗病毒和經(jīng)免疫機(jī)制抗病毒兩種途徑，提高其乙型肝炎病毒表面抗原轉(zhuǎn)陰率，與目前治療慢性乙型肝炎藥物相比具有明顯優(yōu)勢。具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例h五指毛桃提取物的制備取五指毛桃飲片10kg，用60kg75。/。(V/V)乙醇80。C加熱回流提取2次，每次2小時，過濾，合并濾液(即提取液)減壓濃縮回收除盡乙醇后，濃縮液加3倍體積量的水后，用乙酸乙酯充分萃取，收集乙酸乙酯萃取液部分，減壓濃縮回收乙酸乙酯，除盡溶劑，得萃取浸膏，將萃取浸膏真空干燥，即得到五指毛桃提取物96g。實施例2:五指毛桃提取物的制備取五指毛桃10kg，用40kg75。/。(V/V)甲醇5(TC加熱回流提取3次，每次提取1小時，過濾，合并濾液(即提取液)減壓濃縮回收甲醇后得濃縮液。加4倍體積量的5。/。(V/V)乙醇溶解分散后，上20升AB-8大孔樹脂吸附，用40L水洗脫淋洗除去雜質(zhì)，再用40L70。/。(V/V)的乙醇淋洗，收集洗脫液減壓濃縮回收乙醇，得五指毛桃柱分離浸膏，將浸膏真空干燥即得五指毛桃提取物85g。實施例3:五指毛桃提取物的制備取五指毛桃10kg，用40kg70。/。(V/V)乙醇浸漬24小時，3ml/kg'min速度滲漉，收集100kg70。/。(V/V)乙醇的滲漉液；滲漉液經(jīng)減壓濃縮除盡乙醇后，加2倍體積量的水后，用石油醚充分萃取，收集有機(jī)溶劑溶解部分經(jīng)減壓濃縮除盡溶劑，真空干燥，即得到五指毛桃提取物91g。實施例4:五指毛桃提取物的制備取五指毛桃10kg，用30kg100%(V/V)乙醇浸漬20小時，10ml/kg'min速度滲漉，收集80kg100%(V/V)乙醇的滲漉液；滲漉液減壓濃縮除盡乙醇后，加2倍體積量的10%(V/V)乙醇溶解分散后，上20升DA-201大孔樹脂吸附，依次用80L水洗脫淋洗除去雜質(zhì)，再用120L40%(V/V)的乙醇淋洗，收集洗脫液減壓濃縮回收乙醇，得五指毛桃柱分離浸膏，將浸膏真空干燥即得五指毛桃提取物88g。實施例5:五指毛桃提取物的制備取五指毛桃飲片10kg，用100kg50。/。(V/V)乙醇85。C加熱回流提取1次，每次3小時，過濾，合并濾液(即提取液)減壓濃縮回收除盡乙醇，濃縮液加6倍體積量的水后，用石油醚充分萃取，收集石油醚萃取液部分，減壓濃縮回收石油醚，除盡溶劑，得萃取浸膏，將萃取浸膏真空干燥，即得到五指毛桃提取物97g。實施例6:五指毛桃提取物的制備取五指毛桃10kg，用60kg50%甲醇浸漬12小時，8ml/kg-min速度滲漉，收集160kg50%甲醇的滲漉液；滲漉液減壓濃縮除盡甲醇，加4倍體積量的8%乙醇溶解分散后，上20升DA-201大孔樹脂吸附，依次用60L水洗脫淋洗除去雜質(zhì)，再用100L50%(V/V)的乙醇淋洗，收集洗脫液減壓濃縮回收乙醇，得五指毛桃柱分離浸膏，將浸膏真空干燥即得五指毛桃提取物84g。實施例7:五指毛桃提取物中香豆精、黃酮的測定1.香豆精含量測定儀器紫外分光光度儀PerkElmerLambda35(德國)。對照品溶液的制備精密稱取對照品補(bǔ)骨脂素4.9mg于50ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，精密稱取該溶液4ml于10ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，得0.0392mg/ml對照品溶液。供試品溶液的制備分別精密稱?、傥逯该姨崛∥?實施例1制得)18.6mg，②五指毛桃提取物(實施例2制得)18.4mg，③五指毛桃提取物(實施例3制得)18.5mg，④五指毛桃提取物(實施例4制得)18.4mg置100ml的容量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度得供試品溶液。分別精密量取四個供試品溶液各lml于5ml容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度得四個供試品溶液的濃度分別為0.0372mg/ml、0.0368mg/ml、0.0370mg/ml、0.0368mg/ml。測定波長的選擇在190550nm分別掃描補(bǔ)骨脂素對照品及樣品①供試品溶液，兩者在286nm處均有一個吸收峰，且峰形變化平緩，便于定量測定，因此，將286nm作為測定波長。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定精密吸取補(bǔ)骨脂素對照品溶液各0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，分別用乙醇定容至5ml容量瓶中。以乙醇為空白，于286nm處測定。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程A=0.0672C-0.0241(r2=0.9995，n=6)。結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂素對照品溶液濃度在1.579.41)ag/ml范圍內(nèi)，吸光度與濃度的線性關(guān)系良好。香豆素含量測定結(jié)果如表l所示。表l測定①、②、③、④樣品中總香豆素的含量結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.黃酮含量測定儀器紫外分光光度儀PerkElmerLambda35(德國)。對照品溶液的制備精密稱取對照品芹菜素4.7mg于50ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，精密稱取該溶液4ml于10ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，得0.0376mg/ml對照品溶液。供試品溶液的制備分別精密稱?、傥逯该姨崛∥?實施例1制得)18.6mg，②五指毛桃提取物(實施例2制得)18.4mg，③五指毛桃提取物(實施例3制得)18.5mg，④五指毛桃提取物(實施例4制得)18.4mg置100ml的容量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度得供試品溶液。分別精密量取四個各lml于5ml容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度得四個供試品的濃度分別為0.0372mg/ml、0.0368mg/ml、0.0370mg/ml、0.0368mg/ml。測定波長的選擇分別精密吸取芹菜素對照品溶液及①供試品溶液，分別置5mL量瓶中，加1mL的5%NaOH乙醇溶液，加乙醇至刻度，搖勻，于50°C水浴加熱2h，放置至室溫，以相應(yīng)試劑作空白，參照紫外一可見分光光度法，在190600nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，考察最大吸收波長。結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液均在250nm處有最大吸收，故確定250nm為測定波長。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定精密吸取芹菜素對照品溶液各0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8ml，按NaOH顯色方法進(jìn)行顯色。以乙醇為空白，于250nm處測定。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程A=0.066C隱0.2786(r、0.9993，n-6)。結(jié)果表明，齊菜素對照品溶液濃度在6.0213.54嗎/ml范圍內(nèi)，吸光度與濃度的線性關(guān)系良好。黃酮含量測定結(jié)果如表2所示。表2測定①、②、③、④樣品中總黃酮的含量結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例8:五指毛桃提取物止咳、化痰、平喘作用研究藥物①五指毛桃提取物(實施例l制得)，②五指毛桃提取物(實施例2制得)，③五指毛桃提取物(實施例3制得)，④五指毛桃提取物(實施例4制得)。動物SPF級NIH小鼠，1822g，雌雄各半；白化豚鼠，200g220g，雌雄各半。儀器:YLS—8A多功能誘咳引喘儀，752N型紫外可見分光光度計，SIGMA3K30冷凍高速離心機(jī)，SartoriusBS224S萬分之一電子天平。1、對小鼠氨水致咳的影響取NIH小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為7組，分別為空白組、磷酸可待因?qū)φ战M，牡荊油滴丸對照組，五指毛桃提取物①、②、③、@四組，每組5.20生藥/kg劑量給藥。各給藥組按劑量灌胃給藥，空白組給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)3d。末次給藥lh后，將小鼠逐只放入YLS—8A多功能誘咳引喘儀中，由儀器噴霧氨水15s，記錄小鼠的咳嗽潛伏期和2min內(nèi)的咳嗽次數(shù)，計算咳嗽次數(shù)抑制率。表3五指毛桃提取物對小鼠氨水致咳的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注①可待因、牡荊油劑量單位為mg/kg;②與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01。實驗結(jié)果如表3所示，五指毛桃提取物具有明顯的鎮(zhèn)咳作用，五指毛桃提取物鎮(zhèn)咳作用接近于可待因鎮(zhèn)咳作用，并明顯優(yōu)于牡荊油的鎮(zhèn)咳作用。2、對小鼠氣管酚紅排泄量的影響取NIH小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為7組，分別為空白組、氯化胺對照組，牡荊油滴丸對照組，五指毛桃提取物①、②、③、④四組，每組5.20生藥/kg劑量給藥。各給藥組按劑量灌胃給藥，對照組給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)3d。末次給藥lh后，各鼠按劑量O.OlmL/g—1體重腹腔注射5%的酚紅溶液，注射后0.5h，將小鼠頸椎脫臼處死，仰位固定于手術(shù)板上剪開頸前皮膚，分離氣管，剝離氣管周圍組織，剪下甲狀軟骨下緣至氣管分叉處之氣管，用5n/。碳酸氫鈉溶液0.5mL沖洗氣管，連續(xù)3次，洗出液合并，置于紫外可見分光光度計上于546nm波長處測定A，并根據(jù)實驗前制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出氣管沖洗液中酚紅濃度。實驗結(jié)果如表4所示，五指毛桃提取物具有明顯的祛痰作用，五指毛桃提取物祛痰作用明顯優(yōu)于牡荊油，接近氯化胺祛痰作用。3、對組織胺噴霧致豚鼠哮喘的影響取豚鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為7組，分別為空白組、氨茶堿對照組，牡荊油滴丸對照組，五指毛桃提取物①、②、③、@四組，每組5.20生藥/kg劑量給藥。各給藥組按劑量灌胃給藥，對照組給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)3d。末次給藥lh后，將豚鼠逐只放入YLS—8A多功能誘咳引喘儀中，由儀器噴霧lmg/mL磷酸組胺lmin，觀察并記錄豚鼠從接受噴霧開始到發(fā)生抽搐跌倒的時間(即引喘潛伏期)，弓l喘潛伏期超過5min者以5min計，以給藥前后引喘潛伏時間差，計算引喘潛伏時間。表4五指毛桃提取物以小鼠氣管酚紅排泄量的影響組別N/只劑量(g生藥/kg)酚紅排泌量(mg/L)空白組12-3.69±1.57氯化胺121006.55±1.45**牡荊油1285.86±1.35**五指毛桃提取物①125.206,88土1.60"五指毛桃提取物②125.207.59±1.57**五指毛桃提取物③125.205.95士1.38"五指毛桃提取物④125.207.20±1.25**①氯化胺、牡荊油劑il:單位為mg/kg;②與空白組比較，*P<0.05,*:*P<0.01。表5五指毛桃對組織胺噴霧豚鼠哮喘的影響組別劑量(g生藥/kg)潛伏期(s)用藥前潛伏期(s)用藥后引喘潛伏期差(s)空白組-35.88±17.4436.50±15,91一氨茶堿4533.38±26.3870.25±26.4736.87牡荊油434.22±21.2050.26±18.5416.04五指毛桃提取物①5,2031.25±16.3960.38±18.3529.13五指毛桃提取物②5.2030.40±13.3964.38±16.5032.98五指毛桃提取5.202譜±13.3356.63±20.3627.75五指毛桃提取物④5.2030.90±16.3962.45±17.6531.55注①氨茶堿、牡荊油劑量單位為mg/kg。實驗結(jié)果如表5所示，五指毛桃提取物具有明顯的平喘作用，五指毛桃提取物平喘作用接近于氨茶堿作用，并明顯優(yōu)于牡荊油的平喘作用實施例9:五指毛桃提取物治療慢性支氣管炎的研究藥物①五指毛桃提取物(實施例l制得)，②五指毛桃提取物(實施例2制得)，③五指毛桃提取物(實施例3制得)，④五指毛桃提取物(實施例4制得)。試劑內(nèi)毒素。儀器萬分之一電子稱，全自動生化分析儀，奧林巴斯顯微鏡等。動物SPF級Wistar大鼠。取雄性SPF級Wistar大鼠，體重180220g，隨機(jī)分為空白組、COPD模型組(模型組)、牡荊油滴丸陽性藥物組、五指毛桃提取物①、②、③、四組每組5.20生藥/kg劑量給藥，每組10只。除空白組外，其余各組大鼠第l、14天氣管內(nèi)注入2g/2L內(nèi)毒素LPS(Sigma公司)200uL，第228天(第14d除夕卜)將大鼠置入有機(jī)玻璃倉內(nèi)，注入大前門過濾嘴香煙煙霧，濃度約5%(v/v)，0.5h/d。造模的同時，各給藥組按劑量灌胃給藥，空白組和模型組給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)28d。支氣管形態(tài)學(xué)測量隨機(jī)選取HE染色切片中直徑(100200um)較規(guī)整的小支氣管橫截面，每只動物選3個，采用多功能彩色圖像分析系統(tǒng)(CMIAS)。管腔測量模塊測量下列指標(biāo)管腔內(nèi)徑、管腔外徑。表6五指毛桃提取物對大鼠慢性支氣管炎支氣管壁厚度影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注①牡荊油劑量單位為mg/kg;②與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。實驗結(jié)果如表6所示，五指毛桃提取物能明顯減輕煙熏+LPS致大鼠慢性支氣管炎模型的細(xì)支氣管炎癥增厚狹窄，并且效果明顯優(yōu)于牡荊油對照組。表明五指毛有明顯治療支氣管慢性炎癥作用。實施例10:五指毛桃提取物對乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原的抑制作用藥物①五指毛桃提取物(實施例l制得)，②五指毛桃提取物(實施例2制得)，③五指毛桃提取物(實施例3制得)，④五指毛桃提取物(實施例4制得)；培養(yǎng)液配成5mg/ml，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，0.2um濾膜除菌過濾。實驗用細(xì)胞2.2.15細(xì)胞株。2.2.15細(xì)胞株是用共轉(zhuǎn)染法將克隆的HBV-DNA和抗6418質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入人肝癌細(xì)胞株HepG2而建立，能長期穩(wěn)定地分泌HbsAg、HBcAg和完整的Dane顆粒，是目前體外抗HBV藥物篩選和評價較好的細(xì)胞模型。2.2.15細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液添加10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，80ug/mlG418,0.03%谷氨酰氨，用0.238%Hepes調(diào)pH至6.8。用0.06%胰蛋白酶將2.2.15細(xì)胞分散成單個細(xì)胞懸液，按3xl0"細(xì)胞/0.1ml/孔分種于96孔板，2d后換用含藥培養(yǎng)液，每個濃度加四孔，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，3組五指毛桃提取物用細(xì)胞維持液分別稀釋成8個濃度10mg/ml、5mg/ml、2.50mg/ml、1.25g/ml、0.625mg/ml、0.312mg/ml、0.156mg/ml、0.078mg/ml，并設(shè)空白對照組和細(xì)胞對照組。與細(xì)胞作用lld后，吸上清液以ELISA法測定HBsAg和HBeAg，余下細(xì)胞用MTT法測定藥物細(xì)胞毒性。MTT法測定藥物對細(xì)胞生長的半數(shù)毒性濃度，向細(xì)胞加入400ug/mlMTT0.1ml/孔，37°C5%C02孵育4h，可見黃黑色甲攢顆粒，棄去MTT液，加入100%DMSO0.1ml/L，待甲攢顆粒完全溶解(約10min)后，用酶標(biāo)儀570nm波長測定OD值，空白對照設(shè)四孔，力口100%DMSO0.1ml〃L。按下式計算半數(shù)毒性濃度(丁<:50)。細(xì)胞對照OD值-藥物實驗組OD值y，/就ir石^v蜜。/)二-艦W、H刀+VW細(xì)胞對照od值-空白對照組od值50-<50%破壞百分率_TC5。=Antil。g(B+>50%破壞百分率-<50%破壞百分率乂A-log〉50。/。藥物濃度；B=log<50%藥物濃度；C=A-BHBsAg、HBeAg的檢測，采用ELISA測定盒檢測。用酶標(biāo)儀450/630nm雙波長測定每孔OD值，并計算藥物的半數(shù)有效濃度(ICso)抑制百分率(%):細(xì)胞對照OD值-藥物實驗組OD值x丄UU細(xì)胞對照OD值-空白對照組OD值『A.，50-<50%抑制百分率IC50=Antilog(B+-^-xC)>50%抑制百分率-<50%抑制百分率A=log>50%藥物濃度；B=log<50%藥物濃度；OA-B;治療指數(shù)(TI)TI-TCso/IC50。選擇HBsAg、HBeAg作為藥物效果的初步篩選指標(biāo)，通過MTT法測定藥物的細(xì)胞毒性濃度，并相應(yīng)計算出治療指數(shù)來評價藥物臨床應(yīng)用前景，其中TI"為有效低毒，KTK2為低效有毒，TK1為毒性作用。研究結(jié)果顯示，受試藥物對細(xì)胞存活影響較小，治療指數(shù)大于2，均屬有效低毒，五指毛桃提取物對HBsAg和HBeAg的分泌呈著抑制作用。表7五指毛桃提取對HBsAg和HBeAg的抑制效果及其細(xì)胞毒性藥物TC50HBsAgHBeAgIC50TIIC50TI第一次試驗五指毛桃水提物①>1005,29>18.908.95>11.17五指毛桃醇提物②>1000.34>294.110.67>149.25五指毛桃醇提物③>1000.14>714.280.31>322.58五指毛桃醇提物④>1000.12>833.330.28>357.14第二次試驗五指毛桃水提物①>1005.0i>20.009.45>10.58五指毛桃醇提物②>1000.44>227.270.74>135.14五指毛桃醇提物③>1000.11>909.090.29>344,82五指毛桃醇提物④>1000,13>769.230.22>454,55實驗結(jié)果如表7所示，五指毛桃提取物有明顯體外抗HBsAg和HBeAg作用。實施例11:五指毛桃提取物對免疫性肝損害的保護(hù)作用研究藥品①五指毛桃提取物(實施例l制得)，②五指毛桃提取物(實施例2制得)，③五指毛桃提取物(實施例3制得)，④五指毛桃提取物(實施例4制得)。動物SPF級NIH小鼠，1822g，雌雄各半。將實驗小鼠隨機(jī)分成7組，模型組、陽性藥物對照組、五指毛桃提取物①、②、③、④四組，每組5.20生藥/kg劑量給藥，每只尾靜脈各注射卡介苗(BCG，含菌量約為5><106/只)0.2ml，空白組注射等體積生量鹽水0.2ml，用藥組每日給藥一次，感染BCG后12天，末次給藥2h后，ivLPS10ug/鼠，16h后測血清轉(zhuǎn)氨酶水平。表8五指毛桃提取物對BCG+LPS誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用組別動物數(shù)(只)劑量(g/kg)ALT(U/L)空白組12-56.27±16,48模型組12-167.36土21.65聯(lián)苯雙酯12870.13±19.55**五指毛桃提取物①125.2064.85±20,60**五指毛桃提取物②125.2059.65±17.20**五指毛桃提取物③125,2076,52±23.40**五指毛桃提取物④125.2062.25±19.30**注①聯(lián)苯雙酯劑it單位為mg/kg;②與空白組比較，*PO.05,**PO.Ol。實驗結(jié)果如表8所示，用BCG+LPS誘導(dǎo)免疫性肝損傷模型鼠血清ALT明顯升高，而五指毛桃提取物能顯著降低血清ALT水平，且接近空白組，說明五指毛桃提取物對小鼠免疫性肝損傷有明顯保護(hù)作用。實施例12:五指毛桃提取物對環(huán)磷酰胺致小鼠免疫功能低下的作用實驗藥物①五指毛桃提取物(實施例1制得)，②五指毛桃提取物(實施例2制得)，③五指毛桃提取物(實施例3制得)，④五指毛桃提取物(實施例4制得)。實驗動物雌性健康Balb/c小鼠，體重1822g。取雌性健康小鼠72只，隨機(jī)分為7組，生理鹽水空白對照組，五指毛桃提取物①、②、③、@四組，每組5.20生藥/kg劑量給藥，模型組，每組12只。實驗開始時除正常對照組外，其余各組小鼠分別每3d分別腹腔注射環(huán)磷酰胺30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg,共3次。同時按各劑量組開始灌胃給藥，正常對照組及環(huán)磷酰胺模型組每日灌胃給予同體積的生理鹽水。給藥2周，于末次給藥30min后，將小鼠處死，解剖，取脾臟，胸腺準(zhǔn)確稱重。結(jié)果用臟器指數(shù)(mg/10g^胸腺或脾重量(mg)/小鼠體重"Og。表9五指毛桃提取物對正常小鼠免疫器官，脾指數(shù)，胸腺指數(shù)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注-.與空白組對比"PO.Ol。實驗結(jié)果如表9所示，用環(huán)磷酰胺引起小鼠免疫低下模型，小鼠脾指數(shù)與胸腺指數(shù)明顯降低，而五指毛桃提取物能顯著對抗環(huán)磷酰胺致小鼠免疫低下，且接近空白組，說明五指毛桃提取物對小鼠免疫力有明顯提高作用。實施例13:五指毛桃提取物對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響實驗藥物①五指毛桃提取物(實施例l制得)，②五指毛桃提取物(實施例2制得)，(D五指毛桃提取物(實施例3制得)，④五指毛桃提取物(實施例4制得)。實驗動物雌性健康Balb/c小鼠，體重1822g。取50只雌性健康Balb/c小鼠，隨機(jī)分為6組，生理鹽水空白對照組，五指毛桃提取物①、②、③、四組，每組5.20生藥/kg劑量給藥，黃芪顆粒對照組，每組10只。分別給小鼠灌胃給各組藥物，連續(xù)給7d。第8天脫頸處死小鼠，迅速剪開腹腔皮膚，無菌注射Hank's溶液3ml于腹腔中，輕揉腹部，抽取腹腔液，1000r/min離心10min，取上清液。用PH7.4磷酸緩沖液定容至5ml，加入O.5。/。雞紅細(xì)胞0.4ml，于37。C，5%(302養(yǎng)箱孵育30min。取1~2滴離心推片，用瑞氏液染色l分鐘，再加等量蒸餾水，輕輕混合，經(jīng)5分鐘后用蒸餾水沖洗，待干，油鏡下觀察鏡檢，計算吞噬百分?jǐn)?shù)=(吞噬CRBC的巨噬細(xì)胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù))xlOO%和吞噬指數(shù)=(被吞噬的CRBC數(shù)/計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù))。表10五指毛桃提取物對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注與空白組對比申P(guān)0.05，**P<0.01實驗結(jié)果如表IO所示，五指毛桃提取物能明顯提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力，且效果明顯優(yōu)于黃芪對照組。實施例14:五指毛桃提取物滴丸的制備五指毛桃滴丸各組份的重量配比為五指毛桃提取物4.35g聚乙二醇(4000)26.10g聚乙二醇(6000)6.53g制備五指毛桃滴丸的方法如下將聚乙二醇(4000)26.10g、聚乙二醇(6000)6.53g置于水浴上加熱，使熔融；加入4.35g五指毛桃提取物，攪拌均勻，持續(xù)攪拌，98'C保溫待用；將滴丸機(jī)預(yù)熱，貯液室恒溫為98士2。C，冷卻大豆油預(yù)冷至1012°C，調(diào)節(jié)滴嘴與冷卻液面的距離，將藥液倒入貯液室，啟動閥門，將藥液逐滴滴入冷卻劑中，滴速約為30滴/分；打開收集口閥門，收集滴丸，紗布濾除冷卻劑，并吸除表面殘余油漬，攤開，晾干，即得成型的五指毛桃提取物滴丸。實施例15:五指毛桃提取物膠囊的制備五指毛桃膠囊各組份的重量配比為五指毛桃提取物5g淀粉100g乳糖20g羥丙纖維素聚山梨酯80滑石粉20g16g2.5g將按上述配比的五指毛桃提取物、淀粉、乳糖和羥丙纖維素過60目篩混均，加入16g的聚山梨酯80，制軟材，過20目篩制粒。405(TC烘箱鼓風(fēng)干燥，干顆粒過20目篩整粒，加入2.5g的滑石粉，混合均勻。按處方量灌裝l號膠囊，即得五指毛桃提取物膠囊。實施例16:五指毛桃提取物片的制備五指毛桃片各組份的重量配比為五指毛桃提取物5g淀粉100g微晶纖維素20g羥甲基纖維素鈉20g聚山梨酯8016g滑石粉2.5g將按上述配比的五指毛桃提取物、淀粉和微晶纖維素、羥甲基纖維素鈉過60目篩混均，加入16g的聚山梨酯80，制軟材，過20目篩制粒。405(TC烘箱鼓風(fēng)干燥。干顆粒過20目篩整粒，加入2.5g的滑石粉，混合均勻，壓片，即得五指毛桃提取物片。實施例17:五指毛桃提取物顆粒的制備五指毛桃顆粒各組份的重量配比為五指毛桃提取物5g甲基纖維素15g糖粉240g將五指毛桃提取物、甲基纖維素和糖粉按上述配比混合均勻，用70%乙醇制成軟材，制粒，揮去乙醇，制成顆粒，即得五指毛桃提取物顆粒。實施例18:五指毛桃提取口服液的制備五指毛桃提取物糖粉100g吐溫-8010ml無菌水1000ml將按上述配比的五指毛桃提取物和糖粉溶于1000ml無菌水中，加入10ml吐溫-80，攪勻琳解，過濾，分裝于10ml棕色瓶中，置滅菌柜中滅菌，即得五指毛桃提取物口服液。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種五指毛桃提取物，其特征在于所述五指毛桃提取物按下述方法制備而成(1)五指毛桃用50～100％乙醇或甲醇加熱提取1～3次，每次提取1～3小時，過濾，合并提取液；或者，用50～100％乙醇或甲醇浸漬12～24小時，3～10ml/kg·min速度滲漉，收集8～16倍重量50～100％乙醇或甲醇的滲漉液；(2)將步驟(1)獲得的提取液或滲漉液經(jīng)濃縮除盡乙醇或甲醇后，加2～6倍體積量的水后，用石油醚或乙酸乙酯充分萃取，收集有機(jī)溶劑溶解部分經(jīng)濃縮除盡溶劑，干燥，即得到五指毛桃提取物；或者，將步驟(1)獲得的提取液或滲漉液濃縮除盡乙醇或甲醇后，用5～10％乙醇溶解分散后上大孔樹脂吸附，先用2～4倍柱體積量的水淋洗，棄去水淋洗液，再用2～6倍柱體積量的40～70％乙醇洗脫，收集洗脫液經(jīng)濃縮除盡溶劑，干燥，即得五指毛桃提取物。2、權(quán)利要求1所述的五指毛桃提取物的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)五指毛桃用50100%乙醇或甲醇加熱提取13次，每次提取13小時，過濾，合并提取液；或者，用50100%乙醇或甲醇浸漬1224小時，310ml/kg'min速度滲漉，收集816倍重量50100%乙醇或甲醇的滲漉液；(2)將步驟(1)獲得的提取液或滲漉液經(jīng)濃縮除盡乙醇或甲醇后，加26倍體積量的水后，用石油醚或乙酸乙酯充分萃取，收集有機(jī)溶劑溶解部分經(jīng)濃縮除盡溶劑，干燥，即得到五指毛桃提取物；或者，將步驟(1)獲得的提取液或滲漉液濃縮除盡乙醇或甲醇后，用510%乙醇溶解分散后上大孔樹脂吸附，先用24倍柱體積量的水淋洗，棄去水淋洗液，再用26倍柱體積量的4070%乙醇洗脫，收集洗脫液經(jīng)濃縮除盡溶劑，干燥，即得五指毛桃提取物。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的五指毛桃提取物的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中五指毛桃用410倍重量的50100%乙醇或甲醇于5085。C加熱提取13次。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的五指毛桃提取物的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中用36倍重量的50100%乙醇或甲醇浸漬1224小時。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的五指毛桃提取物的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中將步驟(1)獲得的提取液或滲漉液濃縮除盡乙醇或甲醇后，用26倍體積量的510%乙醇溶解分散后上大孔樹脂吸附。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種五指毛桃提取物的制備方法，其特征在于所述五指毛桃提取物含有香豆精和黃酮成分，所述香豆精成分質(zhì)量百分比含量占1540%，黃酮成分質(zhì)量百分比含量占2055%。7、一種權(quán)利要求1所述的五指毛桃提取物的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物是以五指毛桃提取物作為活性成分；所述藥物組合物制成片劑、膠囊、顆粒、滴丸、口服液或噴霧劑。8、權(quán)利要求1所述的五指毛桃提取物在制備急慢性支氣管炎、哮喘、肺氣腫或慢性阻塞性肺病藥物中的應(yīng)用。9、權(quán)利要求1所述的五指毛桃提取物在制備免疫力低下疾病藥物中的應(yīng)用。10、權(quán)利要求1所述的五指毛桃提取物在制備病毒性肝炎或慢性乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種五指毛桃提取物及其制備方法，該五指毛桃提取物含有香豆精、黃酮成分，其中香豆精成分質(zhì)量百分比含量占15～40％，黃酮成分質(zhì)量百分比含量占20～55％。本發(fā)明還公開了五指毛桃提取物在制備急慢性支氣管炎、哮喘、肺氣腫、慢性阻塞性肺病藥物、免疫力低下疾病藥物、病毒性肝炎、慢性乙型肝炎等藥物中的應(yīng)用。以五指毛桃提取物作為活性成分的藥物組合物可制成片劑、膠囊、顆粒、滴丸、口服液或噴霧劑等劑型。本發(fā)明制備方法簡單、生產(chǎn)成本低、可連續(xù)化生產(chǎn)。本發(fā)明首次從五指毛桃中分離純化得到芹菜素，并且在五指毛桃中同時得到黃酮、香豆精有效部位的提取物。文檔編號A61K9/10GK101129473SQ20071002981公開日2008年2月27日申請日期2007年8月21日優(yōu)先權(quán)日2007年8月21日發(fā)明者楊燕軍,陳振權(quán),陳楚鎮(zhèn)申請人:河源市金源綠色生命有限公司