專利名稱：：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及改進(jìn)的肺炎鏈球菌疫苗。
背景技術(shù)：
：不足2歲的兒童對大多數(shù)多糖疫苗不產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，所以一直有必要通過與蛋白載體化學(xué)綴合而使多糖具有免疫原性原性。使作為胸腺不依賴抗原的多糖與作為胸腺依賴性抗原的蛋白偶聯(lián)，賦予多糖胸腺依賴性特性，包^^同種型轉(zhuǎn)換、親和力成熟和記憶誘導(dǎo)。然而，重復(fù)給予多糖-蛋白綴合物或者聯(lián)合多糖-蛋白綴合物形成多價疫苗可能有問題。例如據(jù)才艮道，按照標(biāo)準(zhǔn)的嬰兒免疫程序，，通過與破傷風(fēng)類毒素(TT)(或無TT)和肺炎球菌多糖-TT綴合疫苗同時免疫接種用，對一定劑量范圍的4吏用TT)作為蛋白載體的b型流感嗜血桿菌Cf/aemo;/n71^z'w/7we^ae)多糖(PRP)進(jìn)行了測試。隨著肺炎球菌疫苗劑量的增加，對Hib綴合疫苗PRP多糖部分的免疫應(yīng)答則下降，這表明了可能通過使用相同的載體蛋白對該多糖有免疫干涉(Dagan等,Infectimmun.(1998),2093-2098)。還載證實(shí)體-蛋白的劑量對針對該蛋白自身的體液應(yīng)答的影響具有多面性。據(jù)報道，人類嬰兒中增加四價破傷風(fēng)類毒素綴合物的劑量導(dǎo)致對破傷風(fēng)載體的應(yīng)答被減弱(Dagan等，見上文)。對聯(lián)合疫苗這些效果的典型分析已描述為載體誘導(dǎo)的表位阻抑，其仍沒被完全了解，但據(jù)信歸因于過量的載體蛋白(Fattom,VaccineJJ:126(1999))。這似乎導(dǎo)致B細(xì)胞與載體蛋白、以及B細(xì)胞與多糖竟?fàn)嶵h細(xì)胞。如果B細(xì)胞相對于載體蛋白占優(yōu)勢，則沒有足夠的Th細(xì)胞可用來為對該多糖特異性的B細(xì)胞提供必要的幫助。然而，觀測到的免疫效果與載體蛋白的總量是不一致的，在某些情況下提高免疫應(yīng)答，而在其他情況下降低免疫應(yīng)答。因此將多種多糖綴合物聯(lián)合成為單一而有效的疫苗制劑在技術(shù)上仍存在困難。肺炎鏈球菌是革蘭氏陽性細(xì)菌，可導(dǎo)致相當(dāng)高的病死率(特別是在幼齡人和老年人中)，并引起諸如肺炎、菌血癥和腦膜炎的侵入性疚病以及諸如急性中耳炎的與建群相關(guān)的疾病。美國超過60歲的人患肺炎球菌肺炎的比例估計是每100,000人有3-8位。20%的病例中這導(dǎo)致菌血癥和諸如腦膜炎的其他表現(xiàn)形式，即使使用了抗生素治療，也有接近30%的死亡率。肺炎球菌包被有賦予血清型特異性的化學(xué)連接的多糖。有90種已知的肺炎球菌血清型，并且莢膜是肺炎球菌的主要毒力決定簇，因為莢膜不僅保護(hù)細(xì)菌的內(nèi)表面免受補(bǔ)體作用，而且其自身的免疫原性差。多糖是胸腺不依賴性抗原，并且不能被加工或不能呈遞到MHC分子上與T細(xì)胞相互作用。然而它們可以通過牽涉B細(xì)胞表面受體的交聯(lián)的替代機(jī)制來刺激免疫系統(tǒng)。若干實(shí)驗表明，抗侵入性肺炎球菌疾病的保護(hù)作用與對莢膜特異性的抗體最為相關(guān)，并且該保護(hù)作用是血清型特異性的。肺炎鏈球菌是嬰幼兒中侵入性細(xì)菌性疾病和中耳炎的最為常見的病因。同樣地，老年人對肺炎球菌疫苗產(chǎn)生的應(yīng)答差[Roghmann等，(1987)，J.Gerontol.42:265-270],因此這些人群中細(xì)菌性肺炎的發(fā)生率有所增加[Verghese和Berk,(1983)Medicine(Baltimore)62:271-285]。由肺炎鏈球菌引起的主要臨床綜合征在所有權(quán)威的醫(yī)學(xué)教科書中被廣泛地納入并有論述(FedsonDS,MuscherDM.In:PlotkinSA,OrensteinWA編輯.Vaccine.第4版.PhiladelphiaWBSaundersCo,2004a:529-588)。例如，侵入性肺炎球菌性疾病(IPD)定義為其中可從血液或其他正常無菌的部位分離到肺炎鏈球菌的任何感染(MusherDMStreptococcuspneumoniae(月巿炎鏈J求菌).載于MandellGL,BennettJE，DolinR(編輯)PrinciplesandPracticeofInfectiousdiseases(第5版).NewYork,ChurchillLivingstone,2001，p2128-2147)。慢性阻塞性肺病(COPD)被認(rèn)為包括經(jīng)常共存的若干病癥(氣道梗阻、慢性支氣管炎、細(xì)支氣管炎或小氣道疾病和肺氣肺)?；颊叩呐c氣喘加劇相關(guān)的病癥加重，并且經(jīng)?？人栽黾樱赡艹霈F(xiàn)粘液或膿痰(Wilson,EurRespirJ200117:995-1007)。生理上COPD定義為慢性支氣管炎和/或肺氣胂患者中出現(xiàn)不可逆或部分可逆的氣道梗阻(Standardsforthediagnosisandcareofpatientswithchronicobstructivepulmonarydisease(慢性阻塞肺病患者的診斷和護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)).AmericanThoracicSociety.AmJRespirCritCareMed.1995Nov;152(5Pt2):S77-121)。COPD的加重通常由細(xì)菌(例如肺炎球菌)感染引起(SethiS,MurphyTF.Bacterialinfectioninchronicobstructivepulmonarydiseasein2000:astate-of-the-artreview(2000年'漫性阻塞性肺病中的細(xì)菌感染本領(lǐng)域現(xiàn)狀的綜述).ClinMicrobiolRev.2001Apr;14(2):336-63)。因此本發(fā)明的目的是開發(fā)多價血清型肺炎鏈球菌多糖綴合疫苗的改進(jìn)制劑。附圖簡述圖1條形圖，顯示在老齡恒河猴中l(wèi)l價綴合物的免疫原性。淺色條代表兩次接種磷酸鋁佐劑中的11價綴合物之后的GMC。深色條代表兩次接種C佐劑中的11伯、綴合物之后的GMC。圖2條形圖，顯示接種在C佐劑或磷酸鋁佐劑中的11價綴合物之后的針對PS3的記憶B細(xì)胞。圖3條形圖，顯示對于4價無添加的多糖和4價dPly綴合物的Balb/C小鼠中抗19F多糖的免疫原性。圖4條形圖，顯示對于4價無添加的多糖和4價PhtD綴合物的Balb/C小鼠中的抗22F多糖的免疫原性。圖5條形圖，顯示Balb/c小鼠中的抗22FIgG應(yīng)答。圖6條形圖，顯示Balb/c小鼠中抗22F的調(diào)理吞噬的效價。圖7條形圖，比較了免疫接種配制于不同佐劑中的13價綴合物疫苗之后，在幼齡C57B小鼠中誘導(dǎo)的IgG應(yīng)答。圖8條形圖，顯示在猴肺炎模型中不同疫苗組合的保護(hù)功效。圖9條形圖，顯示免疫接種22F-PhtD或22F-AH-PhtD綴合物之后Balb/c小鼠中抗PMD的IgG應(yīng)答。圖10免疫接種22F-PhtD或22F-AH-PhtD之后小鼠中抗4型肺炎球菌攻擊的保護(hù)作用。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于嬰兒的免疫原性免疫原性組合物，所述組合物包舍多價肺炎鏈球菌疫苗，所述多價肺炎鏈球菌疫苗包含2種或更多種(例如7、8、9、10、11、12、13、14、15種)來自不同血清型的莢膜糖綴合物，其中該組合物包含22F糖綴合物。盡管兒童期感染22F血清型的肺炎球菌并不非常普遍，但發(fā)明人認(rèn)為，兒童期肺炎球菌疫苗中存在22F將有利于誘導(dǎo)該人群中的群體免疫，這致使可以預(yù)防由該血清型所引起的嚴(yán)重老年人疾病的發(fā)病或減輕其嚴(yán)重程度(例如肺炎和/或侵入性肺炎球菌疾病(IPD)和/或慢性阻塞性肺病(COPD)的病情加重)。對于本發(fā)明之目的，"使人類宿主免疫以對抗COPD的加重"或者"治療或預(yù)防COPD加重，，或者"降低COPD加重的嚴(yán)重程度，，指的是降低COPD加重的發(fā)生率或比例(例如O.l、0.5、1、2、5、10、20%或更多的比例降低)或者降低如以上所定義的COPD加重的嚴(yán)重程度，例如在用本發(fā)明的組合物或疫苗免疫過的患者組內(nèi)降低COPD加重的發(fā)生率或比例或者降低所述COPD加重的嚴(yán)重程度。因此在一個實(shí)施方案中，提供了預(yù)防老齡人類宿主患由22F血清型肺炎鏈球菌感染引起的肺炎球菌性疾病(或降低其嚴(yán)重程度)的方法，所述的方法包括對人類嬰兒宿主(或嬰兒人群)給予免疫保護(hù)劑量的本發(fā)明的免疫原性免疫原性組合物或疫苗。本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗在制備用于預(yù)防或減緩老齡人類患者中由22F血清型肺炎鏈球菌感染引起的疾病的嚴(yán)重程度的藥物的應(yīng)用，其中對人類嬰兒(或嬰兒AJf)給予免疫保護(hù)劑量的所述組合物或疫苗。在一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含來自19A和19F血清群的肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物，任選地其中19A與第一細(xì)菌類毒素綴合，而19F與第二細(xì)菌類毒素綴合。術(shù)語莢膜糖包括莢膜多糖和衍生自莢膜多糖的寡糖。寡糖含有至少4個糖殘基。術(shù)語細(xì)菌類毒素包括通過基因突變、化學(xué)處理或綴i合而^支滅活的細(xì)菌毒素。合適的細(xì)菌類毒素包括破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、百曰咳類毒素、細(xì)菌溶細(xì)胞素或肺炎球菌溶血素。對降低肺炎球菌溶血素毒性的肺炎3求菌溶血素(Ply)突變已有描述(WO90/06951,WO99/03884)。同樣地，降低白喉毒素毒性的白喉毒素基因突變也是已知的(參見下文)。白喉毒素的基因去毒類似物包括CRM197和其他突變體，其描述于US4,709,017、US5，843,711、US5,601,827和US5,917,017。CRM197是白喉毒素的無毒形式，但在免疫上無異于白喉毒素。CRM197由感染不產(chǎn)毒噬菌體卩197tox的白喉棒桿菌(C.^p/^en'ae)產(chǎn)生，噬菌體卩197tox通過亞硝基胍誘變產(chǎn)毒素carynephageb而產(chǎn)生(Uchida等NatureNewBiology(1971)233;8-11)。CRM197蛋白具有與白喉毒素相同的分子量，但與白喉毒素不同的是結(jié)構(gòu)基因中單個堿基改變。這導(dǎo)致第52位的氨基酸由甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝滨０?，該轉(zhuǎn)變致使片段A不能與NAD結(jié)合并因此而不具毒性(Pappenheimer1977,AnnRev,Biochem.46;69-94,RappuoliAppliedandEnvironmentalMicrobiologySept1983p560-564)。第一細(xì)菌類毒素和第二細(xì)菌類毒素可以相同或不同。當(dāng)?shù)谝患?xì)菌類毒素和第二細(xì)菌類毒素不同時，指的是它們具有不同的氨基酸序列。例如，19A和19F可以分別與以下毒素綴合破傷風(fēng)類毒素和破傷風(fēng)類毒素；白喉類毒素和白喉類毒素；Crml97和CRM197，肺炎球菌溶血素，肺炎球菌溶血素；破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素；破傷風(fēng)類毒素和CRM197;破傷風(fēng)類毒素和肺炎球菌溶血素；白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素；白喉類毒素和CRM197，白喉類毒素和肺炎球菌溶血素；CRM197和破傷風(fēng)類毒素，CRM197和白喉類毒素；CRM197和肺炎球菌溶素；肺炎球菌溶血素和破傷風(fēng)類毒素；肺炎球菌溶血素和白喉類毒素；或肺炎球菌溶血素CRM197。在一個實(shí)施方案中，除了包含22F(且可以任選包含19A和19F)的肺炎鏈球菌糖綴合物之外，免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌的4、6B、9V、14、18C和23F莢膜糖綴合物。在一個實(shí)施方案中，除了包含22F(且可以任選包含19A和19F)的肺炎鏈球菌糖綴合物之外，免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌的1、4、5、6B、7F、9V、14、18C和23F莢膜糖綴合物。在一個實(shí)施方案中，除了包含22F(且可以任選包含19A和19F)的肺炎鏈球菌糖綴合物之外，免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌的1、4:5、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F莢膜糖綴合物。在一個實(shí)施方案中，除了包含22F(且可以任選包含19A和19F)的肺炎鏈球菌糖綴合物之外，免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌的1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F莢膜糖綴合物。在一個實(shí)施方案中，除了包含22F(且可以任選包含19A和19F)的肺炎鏈球菌糖綴合物之外，免疫原性組合物還包含肺炎鏈球菌的1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F莢膜糖綴合物。本發(fā)明的肺炎鏈球菌疫苗通常將包含莢膜糖抗原(優(yōu)選綴合的莢膜糖抗原)，其中該糖衍生自至少十種肺炎鏈球菌血清型。肺炎鏈球菌莢膜糖的數(shù)量可以從10種不同血清型(或"V"價)到23種不同血清型(23V)。在一個實(shí)施方案中，有10、11、12、13、14或15種不同的血清型。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，該疫苗可以包含綴合型肺炎鏈球菌糖和未綴合型肺炎鏈球菌糖。優(yōu)選糖血清型的總數(shù)少于或等于23種。例如，本發(fā)明可以包含IO種綴合的血清型和13種不綴合的糖。類似地，該疫苗可以包含ll、12、13、14或16種綴合型糖和分別包含12、11、10、9或7種未綴合型糖。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多價肺炎球菌疫苗將選自以下血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、IOA、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，盡管人們會認(rèn)識到可以根據(jù)疫苗受者的年齡和將施用疫苗的地理位置而用一種或兩種其他血清型代替。例如，IO價疫苗可包含來自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的多糖。ll價疫苗還可以包含來自血清型3的糖。12或13價兒科用(嬰兒用)疫苗同樣可以包括補(bǔ)充了以下血清型的所述10或11-階制劑6A和19A、6A和22F、19A和22F、6A和15B、19A和15B、或者22F和15B;而13價老年人疫苗可以包括補(bǔ)充了以下血清型的所述11價制劑19A和22F、8和12F、8和15B、8和19A、8和22F、12F和15B、12F和19A、12F和22F、15B和19A、或者15B和22F。14價兒科疫苗可以包括補(bǔ)充了以下血清型的前文描述的l(H介制劑血清型3、6A、19A和22F;血清型6A、8、19A和22F;血清型6A、12F、19A和22F;血清型6A、15B、19A和22F;血清型3、8、19A和22F1;血清型3、12F、19A和22F;血清型3、15B、19A和22F;血清型3、6A、8和22F;血清型3、6A、12F和22F;或者血清型3、6A、15B和22F。在一個實(shí)施方案中，該組合物包括來源于血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的莢膜糖(優(yōu)選綴合型)。本發(fā)明的又一個實(shí)施方案中，包括了至少11種(價)糖抗原(優(yōu)選綴合型)，例如來源于血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的莢膜糖。本發(fā)明的再一實(shí)施方案中，包含至少12或13種(價)糖抗原，例如疫苗可以包含來源于血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的莢膜糖，或者來源于血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的莢膜糖，盡管本發(fā)明還包括糖抗原，例如23價的糖抗原(如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、IOA、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。本發(fā)明的疫苗可以包含來自流感嗜血桿菌的蛋白(PD)(參見例如EP0594610)。流感嗜血桿菌是引起中耳炎的關(guān)鍵致病生物體，本發(fā)明人已表明，包含此蛋白亍肺炎鏈球菌疫苗中將會提供一定水平的抗流感嗜血桿菌相關(guān)性中耳炎的保護(hù)作用(參考POETpublication(出版物))。在一個實(shí)施方案中，疫苗組合物包含D蛋白。一方面，PD作為一種或更多種糖的載體蛋白存在。另一方面，D蛋白可以作為游離蛋白在疫苗組合物中存在。又一方面，D蛋白可以既作為載體蛋白又作為游離蛋白存在。D蛋白可以全長蛋白或者片段使用(W00056360)。再一方面，D蛋白作為大多數(shù)糖的載體蛋白存在，例如6、7、8、9或更多種糖可以與D蛋白綴合。在此方面，D蛋白同樣可以作為游離蛋白存在。本發(fā)明疫苗包含一種、兩種或更多種不同類型的載體蛋白。每種類型的載體蛋白可以用作不止一種糖的載體，其中所述糖可以相同或不同。例如，血清型3和4可以與相同的載體蛋白綴合，或者與載體蛋白的相同分子或與相同載體蛋白的不同分子綴合。在一個實(shí)施方案中，兩種或更多種不同的糖可以與相同的載體蛋白綴合，或者與載體蛋白的相同分子或與相同載體蛋白的不同分子綴合。本發(fā)明免疫原性組合物中存在的任何肺炎鏈球菌莢膜糖可以與獨(dú)立選自以下的載體蛋白綴合TT、DT、CRM197、TT的C片段、PhtD、PhtDE融合體(特別是描述于WO01/98334和WO03/54007中的融合體)、去毒型肺炎^l菌溶血素和D蛋白?？梢杂糜诒景l(fā)明的綴合物的蛋白載體的更詳盡清單于下文給出。本發(fā)明免疫原性組合物中存在的綴合物中的與一種或更多種肺炎鏈球菌莢膜糖綴合的載體蛋白，任選是多組氨酸三聯(lián)體家族(Pht,polyhistidinetriadfamily)蛋白成員、其片段或其融合蛋白中的成員。PhtA蛋白、PhtB蛋白、PhtD蛋白或PhtE蛋白的氨基^列可以與公開于WO00/37105或WO00/39299的序列(例如對于PhtD蛋白，與WO00/37105的SEQIDNO:4的氨基酸序列第1-838位或者第21-838位)有80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%的同一性。例如，融合蛋白由PhtA蛋白、PhtB蛋白、PhtD蛋白和PhtE蛋白中的2、3或4種的全長或者片段組成。融合蛋白的實(shí)例是PhtA/B、PhtA/D、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/D、PhtB/E、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E、PhtE/A、PhtE/B和PhtE/D，其中這些蛋白與肺炎鏈球菌莢膜糖在N-末端連接(參見例如WO01/98334)。當(dāng)使用Pht蛋白的片段(分別使用或作為融合蛋白的一部分使用)時，每個片段任選包含一個或更多個組氨酸三聯(lián)體模體(histidinetriadmotif)和/或這些多肽的巻曲螺旋區(qū)。組氨酸三聯(lián)體模體是具有HxxHxH序列的多肽的一部分，其中H是組氨酸，而x是非組氨酸的氨基酸。巻曲螺旋區(qū)是由"Coils"算法(Lupus，A等(1991)Science252;1162-1164)預(yù)測的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，該片段或個種片段既包含一個或更多個組氨酸三聯(lián)體才莫體又包含至少一個巻曲螺旋區(qū)。在一個實(shí)施方案中，該片段或每個片段包含恰好或至少2、3、4或5個組氨酸三聯(lián)體模體(任選在兩個或更多個三體之間包含天然Pht序列，或者包含與天然肺炎球菌三體內(nèi)Pht序列(intra-triadsquence)有超過50、60、70、80、90或100%相同的三體內(nèi)序列-例如示于WO00/37105中SEQIDNO:4的PhtD的三體內(nèi)序列)。在一個實(shí)施方案中，該片段或每個片,爻包含'f^f或至少2、3或4個巻曲螺旋區(qū)。在一個實(shí)施方案中，于此公開的PhtD蛋白包含連接了信號序列的全長蛋白、移除了信號肽(例如N-末端的20個氨基酸)的全長成熟蛋白、Pht蛋白的天然變異體以及Pht蛋白的免疫原性片段(例如如前文描述的片段或者包含WO00/37105或WOOO/39299的氨基酸序列中至少15或20個連續(xù)氨基酸的多肽，其中所述多肽能夠誘導(dǎo)針對WO00/37105或WO00/39299中所述氨基酸序列的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng))。詳細(xì)地講，在此使用的術(shù)語"PhtD"包括連接了信號序列的全長蛋白、移除了信號肽(例如N-末端的20個氨基酸)的全長成熟蛋白、Pht蛋白的天然變異體以及Pht的免疫原性片段(例如如前文描述的片4殳或者包舍WO00/37105或WOOO/39299的氨基酸序列中至少15或20個連續(xù)氨基酸的多肽，其中所述多肽能夠誘導(dǎo)針對WO00/37105或WO00/39299中的所述PhtD的氨基齡列(例如對于PhtD而言，WO00/37105中的SEQIDNO:4)的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)a如果組合物中2種或更多種糖的蛋白載體是相同的，那么所述糖可以與蛋白載體(綴合了2種以上不同糖的載體分子)的相同分子綴合[參見例如WO04/083251?；蛘?，這些糖可以各自分別與蛋白載體(其每個分子只綴合了一種類型糖的蛋白載體)的不同分子綴合。可用于本發(fā)明的載體蛋白的實(shí)例是DT(白喉類毒素)、TT(破傷風(fēng)類毒素)或TT的C片段、DTCRM197(DT突變體)；其他DT點(diǎn)突變體，如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等J.Biol.Chem.218;3838-3844,1973)、CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107;以及由Nicholls和Youle4葛述于GeneticallyEngineeredToxins(基因工程毒素)，F(xiàn)rankel編輯，MaecelDekkerInc，1992的其它突變；Glu-148缺失或突變成Asp、Gin或Ser和/或Ala158缺失或突變成Gly和公開于US4709017或US4950740的其他突變；Lys516、Lys526、Phe530和/或Lys534殘基中的至少一個或更多個殘基的突變以及公開于US5917017或US6455673的其他突變；或者公開于US5843711的片段、肺炎球菌的肺炎球菌溶血素(Kuo等(1995)Infectlmmun63;2706-13)，所述肺炎球菌的肺炎球菌溶血素包括通過某種形式去毒的ply例如dPLY-GMBS(WO04081515，PCT/EP2005/010258)或者dPLY-formol,包括PhtA、PhtB、PhtD、Ph伍的PhtX以及Pht蛋白的融合體，例如PhtDE融合體、PhtBE融合體(WO01/98334和WO03/54007)、(PhtA-E于下文有更詳細(xì)的描述)OMPC(腦膜炎球菌外膜蛋白，通常從腦膜炎奈瑟氏球菌(7V:mem'"g"W力B血清群中提取，EP0372501)、PorB(來自腦膜炎奈瑟氏球菌)、PD(流感嗜血桿菌D蛋白，參見例如EP0594610B)、或其免疫功能等同物、合成肽(EP0378881、EP0427347)、熱休克蛋白(WO93/17712、WO94/03208)、百日咳蛋白(WO98/58668、EP0471177)、細(xì)胞因子、淋巴因子、生長因子或激素(WO91/01146);人工蛋白，所述人工蛋白包括多種來自各種病原體來源的抗原的人CD4+T細(xì)胞表位(Falugi等(20(U)EurJImmunol31;3816-3824)，例如N19蛋白(Baraldoi等(2004)Infectlmmun72;4884-7)、肺炎球菌表面蛋白PspA(WO02/091998)、鐵I菱取蛋白(WO01/72337)、艱難梭菌(C.^^"7e)的毒素A或B(WO00/61761)。Nurkka等尸eJ/a,n'c7n/k^'owjZ)^eoye/om/tzo/.23(11》1008-14,2004Nov.描迷了具有與PD綴合的所有血清型的11價肺炎球菌疫苗。然而，本發(fā)明人已表明與具有和PD綴合的19F的綴合物比較，對于用具有和DT綴合的19F的綴合物誘導(dǎo)的抗體而言，調(diào)理吞噬活性得到改進(jìn)。此外，本發(fā)明人已表明，用與DT綴合的19F，可以看到對19A有更強(qiáng)的交叉反應(yīng)性。因此本發(fā)明組合物的特征是血清型19F與細(xì)菌類毒素綴合，細(xì)菌類毒素例如為TT、肺炎球菌溶血素、DT或者CRM197。一方面，血清型19F與DT綴。本發(fā)明的另一個特征是血清型19A與細(xì)菌類毒素例如TT、肺炎球菌溶血素、DT或CRM197綴合。免疫原性組合物的其余并唐血清型可以與一種或更多種非DT的載體蛋白綴合(即只有19F與DT綴合)，或者可以在一種或更多種非DT的和DT自身的載體蛋白之間分?jǐn)?。在一個實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，而所有其余血清型與PD綴合。在又一個實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，而其余血清型在PD與TT或DT或CRM197之間分?jǐn)?。在又一個實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，而只是一種糖與TT綴合。此實(shí)施方案的一方面，所述一種糖是18C或12F。在又一個實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，而只是兩種糖與TT綴合。在又一個實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，而其余血清型在PD、TTandDT或CRM197之間分?jǐn)?。在又一個實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，而其余血清型在PD、TT和肺炎球菌溶血素之間之間分?jǐn)?。在又一個實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，而其余血清型在PD、TT和CRM197之間分?jǐn)?。在又一個實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，而其余血清型在之間PD、TT、肺炎球菌溶血素和任選的PhtD或PhtD/E融合蛋白之間分?jǐn)?。在又一個實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，19A與肺炎球菌溶血素或TT綴合，而其余血清型在PD、TT、肺炎球菌溶血素和任選的PhtD或PhtD/E融合蛋白之間分?jǐn)?。在又一個實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，19A與肺炎球菌溶血素或TT綴合，再一種糖與TT綴合，再一種糖PhtD或PhtD/E與綴合，并且所有另外的糖與PD綴合。在又一個實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，19A與肺炎球菌溶血素綴合，再一種糖與TT綴合，再一種糖與肺炎球菌溶血素綴合，另外2種糖與PhtD或PhtD/E綴合，而所有其他糖與PD綴合。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含來自流感嗜血桿菌的D蛋白。在此實(shí)施方案中，如果PD不是用于與任何非19F的糖綴合的載體蛋白之一(例如19F與DT綴合)，同時其他的血清型與一種或更多種不同的非PD的載體蛋白綴合，那么PD將會作為游離蛋白存在于疫苗組合物中。如果PD是用于與任何非19F的糖綴合的載體蛋白之一，那么PD可以任選地作為游離蛋白存在于疫苗組合物中。整篇說明書中的術(shù)語"糖"可以指多糖或寡糖，并且包括這兩者。通過已知的方法(參見例如EP497524和EP497525)，優(yōu)選通過孩史流化，可以使多糖從細(xì)菌中分離并將其大小調(diào)整(sized)到某種程度?？梢哉{(diào)整多糖的大小以降低多糖樣品中的粘度和/或以改進(jìn)綴合產(chǎn)物的過濾性。寡糖具有少數(shù)的重復(fù)單元(一般為5-30個重復(fù)單元)，并且一般是經(jīng)水解的多糖。肺炎鏈球菌的莢膜多糖包含可含多至8個糖殘基的重復(fù)寡糖單元。有關(guān)關(guān)鍵肺炎鏈球菌血清型的寡糖單元的綜述參見JONES,Christopher.Vaccinebasedonthecellsurfacecarbohydratesofpathogenicbacteria(基于致病細(xì)菌細(xì)月包表面#唐類的疫苗).Jca^.5ras.Cg"c.,June2005，vol.77,no.2,p293-324.ISSN0001-3765。在一個實(shí)施方案中，莢膜糖抗原可以是全長多糖；然而在其他實(shí)施方案中，它可以是一個寡糖單元，或者比重復(fù)寡糖單元的天然長度的糖鏈更短。在一個實(shí)施方案中，疫苗中存在的所有糖都是多糖。全長多糖可以經(jīng)"大小調(diào)整"，例如它們的大小可以通過各種方法縮減，例如通過酸解處理、過氧化物處理、通過emulsiflex⑧隨后通過過氧化物處理以產(chǎn)生寡糖片段從而調(diào)整其大小，或者通過微流化(microfluidzation)。本發(fā)明人同樣已經(jīng)注意到，本領(lǐng)域中焦點(diǎn)一直是使用寡糖以易于進(jìn)行綴合物生產(chǎn)。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，通過使用天然的或略經(jīng)大小改變的多糖綴合物，可實(shí)現(xiàn)以下的一種或更多種優(yōu)點(diǎn)1)可過濾的高免疫原性綴合物，2)可以改變綴合物中多糖對蛋白的比例，致使綴合物中多糖對蛋白的比例(w/w)可以得到提高(這可能對載體阻抑效應(yīng)有影響)，3)易于水解的免疫原性綴合物通過使用更大糖進(jìn)行綴合而得以穩(wěn)定。使用更大的多糖可以導(dǎo)致與綴合載體有更多交聯(lián)并且可以減少游離糖從綴合物中釋放?，F(xiàn)有^t支術(shù)所描述的綴合疫苗傾向于在綴合之前解使多糖聚合以改進(jìn)綴合。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，保留了更大的糖的綴合疫苗可以提供對抗肺炎球菌疾病的良好的免疫應(yīng)答。因此本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含一種或更多種糖綴合物，其中綴合前每種糖的平均大小(例如重均分子量；MU)高于80kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa或1000kDa。在一個實(shí)施方案中，一種或更多種本發(fā)明的糖綴合物應(yīng)該具有綴合前平均大小為50-1600、80-1400、100-1000、150-500或200-400kDa的糖(請注意，其中平均大小是Mw,'kDa，單位于此應(yīng)當(dāng)用'x103，代替)。在一個實(shí)施方案中，綴合后的綴合物應(yīng)該容易通過0.2微米的過濾器過濾，致使與過濾前的樣品相比，過濾后獲得高于50、60、70、80、90或95%的產(chǎn)率。對于本發(fā)明的目的，"天然多糖，，指的是未經(jīng)加工(例如純化后)的糖，所述加工的目的是為了調(diào)整糖的大小。在正常的純化程序期間多糖的大小可以略微調(diào)整。這種糖仍是天然的。僅當(dāng)用調(diào)整大小的技術(shù)處理多糖時，所述多糖才被i人為不是天然的。對于本發(fā)明的目的，"大'卜調(diào)整多至x2"是指使糖經(jīng)過意圖縮減糖的大小^(旦保留超過天然多糖的一半大小的加工。x3、x4等可以同樣的方式解釋，即使糖經(jīng)過意圖縮減糖的大小但保留超過天然多糖的1/3或1/4等大小的加工。本發(fā)明的一個方面，免疫原性組合物包含與載體蛋白綴合的、來自至少IO種血清型的肺炎鏈球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9種或每種肺炎鏈球菌糖是天然多糖。本發(fā)明的一個方面，免疫原性組合物包含與載體蛋白綴合的、來自至少IO種血清型的肺炎鏈球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9種或每種肺炎鏈球菌糖的大小調(diào)整多至x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或者xio。在這個方面的一個實(shí)施方案中，大部分糖，例如6、7、8或更多種糖的大小調(diào)整多至x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或者x10。糖的分子量或平均分子量(或大小)于此指的是在綴合之前檢測的糖的重均分子量(Mw)并用MALLS檢測。MALLS技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，并且通常按照實(shí)施例2所描述的來實(shí)施。對于肺炎球菌糖的MALLS分析，可以聯(lián)用兩個柱(TSKG6000和5000PWxl)并用水洗脫糖。糖-使用光散射檢測器(例如配備了10mW氬激光器的WyattDawnDSP，于488nm檢測)和干涉儀折射計(inferometricrefractometer)(例如配備了P100和紅光過光器的WyattOtilabDSP,于498nm檢測)。在一個實(shí)施方案中，肺炎鏈球菌糖是天然多糖或者在常規(guī)提取過程中經(jīng)大小調(diào)整的天然多糖。在一個實(shí)施方案中，肺炎鏈球菌糖通過機(jī)械剪切，例如通過微流化或超聲處理來縮減。微流化和超聲處理的優(yōu)點(diǎn)是降低較大的天然多糖的大小，以足夠提供可過濾的綴合物。大小調(diào)整不多于x20、xlO、x8、x6、x5、x4、x3或x2。在一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含肺炎鏈球菌綴合物，所述肺炎鏈球菌綴合物由天然多糖和大小被調(diào)整不多于x20的糖的混合物制成。此實(shí)施方案的一方面，大多數(shù)糖，例如6、7、8或更多種糖的大小被調(diào)整多至x2、x3、x4、x5或者x6。在一個實(shí)施方案中，肺炎鏈球菌糖通過接頭(linker),例如雙功能接頭，與載體蛋白綴合。接頭任選是異雙功能或者同雙功能性的，具有例如活性氨基和活性羧酸基、2個活性氨基或兩個活性羧酸基。接頭具有例如4-20、4-12、5-10個碳原子。一個可能的接頭是ADH。其他接頭包括B-丙酰氨基(WO00/10599)、硝基苯乙胺(Gever等(1979)Med.Microbiol.Immunol.165;171-288)、卣代烷基卣(US4057685)、糖普鍵(US4673574、US4808700)、己二胺和6-氨基己酸(US4459286)。在一個實(shí)施方案中，使用ADH作為接頭用于綴合來自血清型18C的糖。在一個實(shí)施方案中，使用ADH作為接頭用于綴合來自血清型22F的糖。本發(fā)明免疫原性組合物中存在的糖綴合物可以通過任何已知的偶聯(lián)技術(shù)制備。綴合方法可以依靠用四氟硼酸l-氰基-4-二曱基氨基吡啶鏘(CDAP)來活化糖從而形成氰酸酯。因此活化的糖可以直接或通過間隔物(接頭)基團(tuán)與載體蛋白上的氨基綴合。例如，間隔物可以是胱胺或半胱胺，以產(chǎn)生硫醇化(thiolated)多糖，后者可以通過與馬來酰亞胺活化的載體蛋白(例如使用GMBS)或與卣代乙?；d體蛋白(例如使用硪乙酰亞胺[例如乙基碘乙酰亞胺HCl]或溴乙酸N-丁二酰亞胺基酯或SIAB、或SIA、或SBAP)反應(yīng)后獲得的硫醚鍵，與載體偶聯(lián)。優(yōu)選該氰酸酯(任選通CDAP化學(xué)制備的)與己二胺或ADH偶聯(lián)，并且氨基衍生化的糖使用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學(xué)通過蛋白載體上的羧基與栽體蛋白綴合。這些綴合物描述于PCT公開說明書WO93/15760UniformedServicesUniversity和WO95/08348和WO96/29094中。其他合適的技術(shù)使用碳二亞胺、酰肼、活化酯、降冰片烷、對硝基苯甲酸、N-羥基丁二酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多技術(shù)描述于WO98/42721中。綴合可以牽涉羰基接頭，其可以通過糖游離幾基與CDI反應(yīng)(Bethell等J.Biol,Chem.1979,254;2572-4、Hearn等J.Chromatogr.1981.218;509-18)，赫與蛋白反應(yīng)形成氨基曱酸酯鍵而形成。這可以牽涉還原異頭末端成為伯羥基，任選牽涉伯^i基與CDI的反應(yīng)而對伯羥基保護(hù)/去保護(hù)，以形成CDI氨基曱酸酯中間體，并使該CDI氨基甲酸酯中間體與蛋白上的氨基偶聯(lián)。綴合物同樣可以通過如US4365170(Jennings)和US4673574(Anderson)所描述的直接還原性胺化方法制備。其他方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508。又一方法包括用己二酸二酰肼(ADH)衍生化的經(jīng)渙化氫(或CDAP)活化的糖通過碳二亞胺縮合(ChuC.等Infect.Immunity,1983245256)，例如使用EDAC，與蛋白載體偶聯(lián)。在一個實(shí)施方案中，糖上的羥基(優(yōu)選活化的羥基，例如經(jīng)活化以形成氰酸酯的羥基[例如用CDAP])與蛋白上的氨基或羧基直接或間接地(通過接頭)連接。當(dāng)存在接頭時，糖上的羥基優(yōu)選與接頭上的氨基連接，例如通過使用CDAP綴合連接。接頭(例如ADH)中的另一氨基可以與蛋白上的羧酸基綴合，例如通過使用碳二亞胺化學(xué)法，例如通過使用EDAC來綴合。在一個實(shí)施方案中，在接頭與載體蛋白綴合之前，首先將肺炎球菌莢膜糖與接頭綴合?；蛘呓宇^可以在與糖綴合之前，先與載體綴合。同樣可以使用技術(shù)的組合，某些糖-蛋白綴合物通過CDAP制備，而某些則通過還原胺化制備。一般來說，蛋白載體上的以下類型的化學(xué)基團(tuán)可以用于偶聯(lián)/綴合A)羧基(例如通過天冬氨酸或谷氨酸)。在一個實(shí)施方案中，該基團(tuán)與糖上的氨基直接連接，或者用碳二亞胺化學(xué)(例如用EDAC)與接頭上的氛基連4奏。B)氨基(例如通過賴氨酸)。在一個實(shí)施方案中，該基團(tuán)與糖上的羧基直接連接，或者用碳二亞胺化學(xué)(例如用EDAC)與接頭上的羧基連接。在另一個實(shí)施方案中，該基團(tuán)與糖上的用CDAP或CNBr活化的羥基直接連接；與接頭上的這些基團(tuán)連接；與帶有醛基的糖或接頭連接；或者與帶有丁二酰亞胺酯基的糖或接頭連接。C)巰基(例如通過半胱氨酸)。在一個實(shí)施方案中，用馬來酰亞胺化學(xué)，使該基團(tuán)與淡乙?；蜇兑阴；奶腔蚪宇^連接馬來酰亞胺。在一個實(shí)施方案中，該基團(tuán)用雙重氮對二氨基聯(lián)苯(bisdiazobenzidine)活化/修飾。D)羥基(例如通過酪氨酸)。在一個實(shí)施方案中，該基團(tuán)用雙重氮對二氨基聯(lián)苯活化/修飾。，E)咪唑基(例如通過組氨酸)。在一個實(shí)施方案中，該基團(tuán)用雙重氮對二氨基聯(lián)苯活化/修飾。F)胍基(例如通過精氨酸)。G)吲哚基(例如通過色氨酸)。一般來說，以下糖上的基團(tuán)可以用于偶聯(lián)OH、COOH或NH2?？梢栽诒绢I(lǐng)域已知的不同處理后產(chǎn)生醛基，所述處理例如有高碘酸鹽或酯、酸解、過氧化氫等。直接偶聯(lián)法糖-OH+CMBr或CDAP—>氰酸酯+NH2-Prot—->綴合物糖-醛+NH2-Prot—>席夫堿十NaCNBH3—->綴合物糖-COOH+NH2-Prot+EDAC—>綴合物糖陽NH2+COOH-Prot+EDAC—>綴合物通過間隔物(接頭)間接偶聯(lián)法糖-OH+CNBr或CDAP—>氰酸酯+NH2——NH2——>糖——NH2+COOH-Prot+EDAC——->綴合物糖-OH+CNBr或CDAP-~>氰酸酯+NH2~~SH-—>糖—~SH+SH-Prot(帶外露的半胱氨酸或通過例如SPDP修飾蛋白的氨基而獲得的天然蛋白)一>糖-S-S-Prot糖-OH+CNBr或CDAP—>氰酸酯+NH2——SH——>糖——SH+馬來酰亞胺-Prot(修飾^J^)—>綴合物糖-OH+CNBr或CDAP-—>氰酸酯+NH2-——SH——〉糖-SH+卣乙?；?Prot>綴合物糖-COOH+EDAC+NH2隱-—NH2—->糖-NH2+EDAC+COOH-Pr。t…〉綴合物糖-COOH+EDAC+NH2——SH—>糖-——SH+SH-Prot(帶外露的半胱氨酸或通過例如SPDP修飾蛋白的氨基而獲得的天然蛋白)一>糖-S-S-Prot糖-COOH+EDAC+NH2——SH——〉糖—-SH+馬來酰亞胺-Prot(修飾氨基)一>綴合物糖-COOH+EDAC+NH2…SH—>糖-SH+卣乙酰化-Prot…〉綴合物糖-醛+NH2-——NH2—->糖—-NH2+EDAC+COOH-Prot—>綴合物注意可以使用任何合適的碳二亞胺代替前文的EDAC?？傊?，一般可以用于與糖偶聯(lián)的蛋白載體化學(xué)基團(tuán)的類型是氨基(例如賴氨酸殘基上的)、COOH基團(tuán)(例如天冬氨酸和谷氨酸殘基上的)和SH基團(tuán)(若可及的話)(例如半胱氨酸殘基上的)。優(yōu)選載體蛋白對肺炎鏈球菌糖之比在1:5和5:1之；例如1:0.5-4:1、1:1-3.5:1、1.2:1-3:1、1.5:1-2.5:1，例如1:2-2.5:1;1:1-2:1(w/w)。在一個實(shí)施方案中，大多數(shù)的綴合物，例如6、7、8、9或更多種綴合物的載體蛋白對糖的比例高于1:1,例如1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1或1.6:1。在一個實(shí)施方案中，可以用CDAP和EDAC通過接頭使至少一種肺炎鏈球菌糖與栽體蛋白綴合。例如，可以使用CDAP和EDAC如前文所描述，通過接頭(例如末端帶有兩個肼基的接頭，例如ADH)使18C或22F與蛋白綴合。使用接頭時，CDAP可以用于使糖與接頭綴合，而EDAC然后可以用于使該接頭與蛋白綴合；或者，可以首先用EDAC使接頭與蛋白綴合，之后可以用CDAP使接頭與糖綴合。一般來說，本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含0.1-20昭、1-10嗎或1-3昭糖的劑量的每種糖綴合物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含劑量為0.1-20嗎、0.5-10jig、0.5-5嗎或l-3昭糖的每種肺炎鏈球菌莢膜糖。在一個實(shí)施方案中，莢膜糖可以以不同的劑量存在，例如某些莢膜糖可以以1嗎的精確劑量存在，或者某些莢膜糖可以以3嗎的精確劑量存在。在一個實(shí)施方案中，來自血清型3、18C和19F(或4、18C和19F)的糖以比其他糖更高的劑量存在。此實(shí)施方案的一方面，血清型3、18C和19F(或者4、18C和19F)以3嗎的精確或大約劑量存在，同時免疫原性組合物中的其他凈唐以1嗎的精確或大約劑量存在。對于本發(fā)明的目的而言，"大約"或"左右"定義為在給定數(shù)值上下10%的范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，至少一種肺炎鏈球菌莢膜糖與載體蛋白直接綴合(例如使用前文描述的化學(xué)之一)；優(yōu)選至少一種肺炎鏈球菌莢膜糖通過CDAP直接綴合。在一個實(shí)施方案中，大多數(shù)的莢膜糖，例如5、6、7、8、9或更多種莢膜糖，直接通過CDAP與載體蛋白連接(參見WO95/08348和WO96/29094)。免疫原性組合物可以包含肺炎鏈球菌蛋白，于此稱為本發(fā)明的肺炎鏈王來菌蛋白。這些蛋白可以作為載體蛋白使用，或可以作為游離蛋白存在，或可以既作為載體蛋白又作為游離蛋白存在。本發(fā)明的肺炎^f求菌蛋白要么表面外露，至少是在肺炎球菌的部分生命周期期間，要么是由肺炎球菌分泌或釋放的蛋白。優(yōu)選本發(fā)明的蛋選自以下類別例如具有LXXC的II型信號序列模體的蛋白(其中X是任何氨基酸，例如多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX))、膽堿結(jié)合蛋白(CbpX)、具有I型信號序列模體的蛋白(例如，SplOl)、具有LPXTG模體的蛋白(其中X是任何氨基酸，例如，Spl28、Spl30)以及毒素(例如Ply)。這些類別(或模體)中的優(yōu)選實(shí)例是以下的蛋白或其免疫功能等同物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含至少l種選自以下的蛋白多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、SplOl、Spl30、Spl25和Spl33。在又一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含2種或更多種選自以下的蛋白多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Sp128。在又一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含2種或更多種選自以下的蛋白多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(Ply)和Spl28。Pht(PolyHistidineTriad(多組氨酸三聯(lián)體))家族包括蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。該家族的特征為脂化序列；通過富脯氨酸區(qū)和若干組氨酸三聯(lián)體分開的兩個結(jié)構(gòu)域，其可能參與金屬或核苷結(jié)合活性或酶活性；(3-5個)巻曲螺旋區(qū)、保守的N末端和異質(zhì)的C末端。它存在于所有檢測過的肺炎球菌菌林中。在其他的鏈球菌和奈瑟氏菌中也發(fā)現(xiàn)了同源蛋白。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的PM蛋白是PhtD。然而應(yīng)該理解，術(shù)語PhtA、B、D和E指的是具有以下引用文獻(xiàn)中所公開序列的蛋白，以及具有與參比蛋白有至少90%相同的序列同源性的天然(和人造的)變異體。優(yōu)選它至少95%相同，最優(yōu)選97%相同。關(guān)于PhtX蛋白，PhtA在WO98/18930中公開，并且也被稱為Sp36。如前文所指出的，它是來自多組氨酸三聯(lián)體家族的蛋白并具有LXXC的II型信號模體。PhtD在WO00/37105中公開，并且也被稱為Sp036D。如上所述，它也是來自多組氨酸三聯(lián)體家族的蛋白并具有LXXC的II型信號模體。PhtB在WO00/37105中公開，并且也稱為Sp036B。PhtB家族的另一個成員是C3降解性多肽，在WO00/17370中公開。該蛋白同樣是來自多組氨酸三聯(lián)體家族的蛋白并具有LXXC的II型信號模體。優(yōu)選的免疫功能等同物是公開于WO98/18930中的Sp42蛋白。PhtB截短物(大約79kD)在W099/15675中公開，其也被認(rèn)為是PhtX家族成員。PhtE在WO00/30299中公開并且稱為BVH-3。當(dāng)于此提及任何Pht蛋白時，其意思是可以使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合體。例如，提及PhtX時包括來自任何Pht蛋白的免疫原性片4史或其融合體。提及PhtD或PhtB時，也是提及如在例如WO0198334中發(fā)現(xiàn)的PhtDE或PhtBE融合體。肺炎球菌溶血素是一種具有不同溶細(xì)胞(溶血)活性和補(bǔ)體激活活性的多功能毒素(Rubins等，Am.Respi.Cit.Care.Med,153.1339-1346(1996))。該毒素并不由肺炎球菌分泌，但它在自溶素的影響下裂解肺炎球菌時釋放。其作用包括例如刺激人單核細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子、抑制人呼吸道上皮的纖毛擺動并降低嗜中性粒細(xì)胞的殺菌活性和遷移。肺炎球菌溶血素最明顯的作用在于裂解紅細(xì)胞，其包括結(jié)合膽固醇。因為它是一種毒素，所以在它能夠體內(nèi)施用之前進(jìn)行去毒(即當(dāng)以適于保護(hù)的劑量提供時對人類無毒)。野生型或天然肺炎球菌溶血素的表達(dá)和克隆為本領(lǐng)域所知。參見例如Walker等(InfectImmun，55:1184-1189(1987))、Mitchell等(BiochimBiophysActa,1007:67-72(1989)和Mitchell等(NAR，18:4010(1990))。ply的去毒通過化學(xué)方法實(shí)施，例如經(jīng)過福爾馬林或戊二醛處理或兩者的組合(WO04081515、PCT/EP2005/010258)。用于各種毒素的這些方法是本領(lǐng)域所熟知的?；蛘遬ly可以通過基因去毒。因此，本發(fā)明包括肺炙球菌蛋白的衍生物，其可以是例如突變的蛋白。于此4吏用的術(shù)語"突變的"或"突變型"指的是使用已熟知的用于定點(diǎn)突變的才支術(shù)或任〗T其^f也的常規(guī)方法，使其經(jīng)歷了一個或更多個氨基酸缺失、插入或替換的分子。例如，如前文所描述的，可以改變突變型ply蛋白，致使其無生物活性同時仍保留其免疫原性表位，參見例如，WO90/06951,Berry等(InfectImmun,67:981-985(1999))和WO99/03884。如于此所使用的，應(yīng)該明白術(shù)語"Ply"指的是適合醫(yī)藥應(yīng)用的突變型或去毒型肺炎球菌溶血素(即無毒的)。關(guān)于膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)，該家族的成員最初被確定為可以通過膽堿親和色譜法純化的肺炎球菌蛋白。所有膽>5咸結(jié)合蛋白與細(xì)胞壁磷壁酸的以及膜相關(guān)脂磷壁酸的磷酰膽堿部分(phosphorylcholinemoieties)非共價結(jié)合。整個家族中它們具有若干共同的區(qū)域，盡管這些蛋白的確切性質(zhì)(氨基酸序列、長度等)可以不同。一般來說，膽堿結(jié)合蛋白包含N末端區(qū)域(N)、保守的重復(fù)區(qū)(R1和/或R2)、富脯氨酸區(qū)(P)以及由包含了約該蛋白一半的多個重復(fù)序列組成的保守膽堿結(jié)合區(qū)(C)。正如本說明說所使用的，術(shù)語"膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)"選自在W097/41151中公開的膽堿結(jié)合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD以及CbpG。CbpA在W097/41151中公開。CbpD和CbpG在WO00/29434中公開。PspC在WO97/09994中公開。PbcA在W098/21337中公開。SpsA是在WO98/39450中公開的膽堿結(jié)合蛋白。優(yōu)選膽堿結(jié)合蛋白選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。另一個優(yōu)選的實(shí)施方案是CbpX截短物，其中"CbpX"在上文有定義，而"截短物"指的;l缺少50。/?；蛞陨夏憠A結(jié)合區(qū)(C)的CbpX蛋白。優(yōu)選逸種蛋白缺少整個膽堿結(jié)合區(qū)。更優(yōu)選這種蛋白截短物缺少(i)膽堿結(jié)合區(qū)和(ii)蛋白N-末端一半的一部分，4旦保窗至少一個重復(fù)區(qū)(R1或R2)。再更優(yōu)選截短物具有2個重復(fù)區(qū)(R1和R2)。這種優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)例是如W099/51266或W099/51188中說明的NRlxR2和RlxR2，然而，缺少類似膽i咸結(jié)合區(qū)的其他膽石成結(jié)合蛋白同樣意圖包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。LytX家族是與細(xì)胞裂解有關(guān)的膜相關(guān)蛋白。N-末端結(jié)構(gòu)域包含一個或多個膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域，然而LytX家族并不具有前文所述的在CbpA家族中發(fā)現(xiàn)的所有特征，因此對于本發(fā)明來說，LytX家族被認(rèn)為是有別于CbpX家族的。與CbpX家族相對比，C-末端結(jié)構(gòu)域包含LytX蛋白家族的催化結(jié)構(gòu)域。該家族包括LytA、B和C。關(guān)于LytX家族，LytA在Ronda等，EurJBiochem,164:621-624(1987)中公開。LytB在WO98/18930中公開，并且也稱為Sp46。LytC同樣在WO98/18930中公開，并且也稱為Sp91。該家族的優(yōu)選成員是LytC。另一個優(yōu)選的方案是LytX截短物，其中"LytX"如上文定義，而"截短物"指的是缺少50。/。或以上膽堿結(jié)合區(qū)(C)的LytX蛋白。優(yōu)選這些蛋白缺少整個膽堿結(jié)合區(qū)。本發(fā)明的再一個優(yōu)選方案是CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)。優(yōu)選其包含CbpX的NRlxR2(或RlxR2)和LytX的C-末端部分(Cterm,即缺少膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域)(例如，LytCCterm或Sp91Cterm)。更優(yōu)選CbpX選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。還更優(yōu)選它是CbpA。優(yōu)選LytX是LytC(也稱為Sp91)。本發(fā)明另一個實(shí)施方案是PspA、或缺少膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域(C)并作為具有LytX的融合蛋白表達(dá)的PsaA截短物。優(yōu)選LytX是LytC。關(guān)于PsaA和PspA,均為本領(lǐng)域所知。例如，PsaA和其跨膜缺失變異體已經(jīng)由Berry和Paton，InfectImmun1996Dec;64(12):5255-62描述。PspA和其跨膜缺失變異體已經(jīng)在例如US5804193、WO92/14488和WO99/53940中公開。Spl28和Spl30在WO00/76540中公開。Spl25是具有LPXTG(其中XAi壬何氨基酸)的細(xì)胞壁錨定模體的肺炎球菌表面蛋白的實(shí)例。該類別肺炎球菌表面蛋白中具有該模體的任何蛋白已被發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的范圍中是有用的，因此被認(rèn)為是本發(fā)明的又一蛋白。Spl25其自身在WO98/18930中公開，并且也被稱為ZmpB(—種鋅金屬蛋白酶)。SplOl在WO98/06734中公開(其中它參考編號為y85993)。其特征是I型信號序列。Spl33在WO98/06734中公開(其中它參考編號為y85992)。其特征同樣是I型信號序列?？梢园诼?lián)合疫苗(尤其是用于預(yù)防中耳炎)中的優(yōu)選卡他莫拉菌(Moraxe〃aca^r/wfo)蛋白抗原的實(shí)例是OMP106[WO97/41731(Antex)和WO96/34960(PMC)];OMP21或其片段(WO0018910)、LbpA和/或LbpB[WO98/55606(PMC)];TbpA和/或TbpB[WO97/13785和WO97/32980(PMC)];CopB[HelminenME,等(1993)Infect.Immim.61:2003-2010];UspAl和/或UspA2[WO93/03761(UniversityofTexas)];OmpCD;HasR(PCT/EP99/03824);PilQ(PCT/EP99/03823);OMP85(PCT/EP00/01468);lipo06(GB9917977.2)、lipo10(GB9918208.1);lipoll(GB9918302.2)lipo18(GB9918038.2);P6(PCT/EP99/03038);D15(PCT/EP99/03822);OmplAl(PCT/EP99/06781);Hly3(PCT/EP99/03257);和OmpE?？梢园诼?lián)合疫苗(尤其是用于預(yù)防中耳炎)的無法分型的流感嗜血桿菌抗原或其片段的實(shí)例包括絲束蛋白(Fimbrin)[(US5766608-OhioStateResearchFoundation)]和包含來自該蛋白的肽的融合體[例如LBl(f)肽融合體；US5843464(OSU)或WO99/64067];OMP26[WO97/01638(Cortecs)];P6[EP281673(StateUniversityofNewYork)];TbpA和/或TbpB;Hia;Hsf;Hin47;Hif;Hmwl;Hmw2;Hmw3;Hmw4;Hap;D15(WO94/12641);P2;以及P5(WO94/26304)。本發(fā)明的蛋白也可以有益地聯(lián)合。聯(lián)合是指免疫原性組合物包舍來自以下組合中的所有蛋白，所述蛋白作為載體蛋白、作為游離蛋白或者作為兩者的混合物。例如，如下文中所陳述的兩種蛋白的組合中，這兩種蛋白可以作為載體蛋白使用；或者兩種蛋白可以作為游離蛋白存在；或者兩者可以作為栽體和作為游離蛋白存在；或一種可以作為載體蛋白和游離蛋白存在，同時另一種《又作為載體蛋白或^f又作為游離蛋白存在，或一種可以作為載體蛋白存在，而另一種作為游離蛋白存在。當(dāng)給出三種蛋白的組合時，存在類似的可能性。優(yōu)選的組合包括但不限于PhtD+NRlxR2、PhtD+NRlxR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PIitD+Ply、PhtD+Sp128、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NRlxR2、PhtA+NRlxR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtA十Ply、PhtA+Sp128、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NRlxR2+LytC、NRlxR2+PspA、NRlxR2+PsaA、NRlxR2+Spl28、RlxR2+LytC、RlxR2+PspA、RlxR2+PsaA、RlxR2+Sp128、RlxR2+PhtD、和RlxR2+PhtA。優(yōu)選NR1xR2(或RlxR2)來自CbpA或PspC。更優(yōu)選其來自CbpA。其他組合包括3種蛋白的組合，例如PhtD+NRlxR2十Ply、以及PhtA+NRlxR2+PhtD。在一個實(shí)施方案中，疫苗組合物包含去毒型肺炎球菌溶血素以及作為載體蛋白的PhtD或PhtDE。在又一個實(shí)施方案中，疫苗組合物包含去毒型肺炎球菌溶血素和作為游離蛋白的PhtD或PhtDE。在獨(dú)立的一方面，本發(fā)明^是供了免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含至少四種含有來自不同肺炎鏈球菌血清型的糖的肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物，其中至少一種糖與PhtD或其融合蛋白綴合，并且該免疫原性組合物能夠"i秀導(dǎo)纟元PhtD的有效免疫應(yīng)答。例如通過保護(hù)測定法，諸如在實(shí)施例15中描述的保護(hù)測定法，檢測抗PhtD或其融合蛋白的有效免疫應(yīng)答。在用異種的菌林攻擊之后7天，有效免疫應(yīng)答提供至少40°/。、50%、60%、70%、80%或90%存活率。已知攻擊菌林是異種的，所以所賦予的保護(hù)作用歸因于抗PhtD或其融合蛋白的免疫應(yīng)答?；蛘?，用如實(shí)施例14中描述的ELISA檢測抗PhtD的有效免疫應(yīng)答。有效免疫應(yīng)答產(chǎn)生至少250、300、350、400、500、550或600pg/mlGMC的抗PMDIgG應(yīng)答。例如，免疫原性組合物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種與PhtD或其融合蛋白綴合的來自不同血清型的肺炎鏈球菌莢膜糖。例如血清型22F和另外1、2、3、4、5、6或7種選自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、23F和33F的血清型與PhtD綴合。在一個實(shí)施方案中，血清型3、6A和22F中的兩種或三種與PhtD或其融合蛋白綴合。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含至少一種肺炎鏈球菌莢膜糖，其中所述莢膜糖與PhtD或其融合蛋白通過接頭(例如ADH)綴合。在一個實(shí)施方案中，使用以下列舉的綴合化學(xué)之一。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含至少一種與PhtD或其融合蛋白綴合的肺炎球菌莢膜糖，其中綴合物中PhtD對糖的比例是6:1-1:5、6:1—2:1、6:1-2.5:1、6:1—3:1、6:1-35:1(w/w)或高于(即包含更高比例的PhtD)2.0:1、2.5:1、3.0:1、3.5:1或4.0:1(w/w)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含肺炎球菌溶素。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的免疫原性組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗。本發(fā)明的疫苗可以添加佐劑，尤其是當(dāng)意圖用于老年人群中以及用于嬰兒人群中的時候。合適的佐劑包括諸如氫氧化鋁凝膠、磷酸鋁或明礬的鋁鹽，但也可以是諸如鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽或鋅鹽的其他金屬鹽；或者可以是酰化酪氨酸、或?；恰㈥栯x子衍生化或陰離子衍生化的糖或含聚磷腈的不溶性混懸液。優(yōu)選選擇佐劑作為TH1型應(yīng)答的優(yōu)先誘導(dǎo)物。這種高水平的Thl型細(xì)胞因子往往有利于i秀導(dǎo)對特定抗原的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，同時高水平的Th2型細(xì)胞因子往往有利于誘導(dǎo)對特定抗原的體液免疫應(yīng)答。Thl型和Th2型免疫應(yīng)答的差別并非絕對的?，F(xiàn)實(shí)中，個體會支持被描述為以Thl為主的或以Th2為主的免疫應(yīng)答反應(yīng)。然而方便的是，按照由Mosmann和Coffinan在氣CD4+veT細(xì)胞克隆中所述的(Mosmann,T.R.和Coffinan,R.L.(1989)THlandTH2cells:differentpatternsoflymphokinesecretionleadtodifferentproperties.(THl與TH2細(xì)胞不同形式的淋巴因子分泌導(dǎo)致不同的特性)AnnualReviewofImmunology,7，pl45-173)來限定細(xì)胞因子家族。傳統(tǒng)上，Thl型應(yīng)答與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-y和IL-2細(xì)胞因子相關(guān)。通常直接與誘導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答相關(guān)的其他細(xì)胞因子并不由T細(xì)胞產(chǎn)生，例如IL-12。相比之下，Th2型應(yīng)答與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌相關(guān)。促進(jìn)以Thl應(yīng)答為主的合適的佐劑體系包括單磷酰脂質(zhì)A或其衍生物(或一般為去毒型脂質(zhì)A，參見例如WO2005107798),尤其是3-脫-0-酰化單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)(其制備參見GB2220211A);以及單磷酰脂質(zhì)A(優(yōu)選3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A)與鋁鹽(例如磷酸鋁或氬氧化鋁)或水包油乳劑的組合。在這些組合中，抗原與3D-MPL包含在相同的^f效粒結(jié)構(gòu)中，允"^午更有效^k/f專送抗原信號和免疫刺激性信號。研究業(yè)已表明，3D-MPL能夠進(jìn)一步增強(qiáng)明礬吸附抗原的免疫原性[Thoelen等Vaccine(1998)16:708-14;EP689454-Bl]。增強(qiáng)型體系包括單磷酰脂質(zhì)A和皂苷衍生物的組合，尤其是在WO94/00153中公開的QS21和3D-MPL的組合，或反應(yīng)原性較低的組合物，其中用例如膽固醇淬滅QS21，如在WO96/33739中公開的。涉及水包油乳劑中的QS21、3D-MP和生育酚的特別有效的佐劑制劑描述于WO95/17210中。在一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物另外包括皂苷，后者可以是QS21。所述制劑同樣可以包含水包油乳劑和生育酚(WO95/17210)。含有未曱基化CpG的寡核苷酸(WO96/02555)和其他免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸(WO0226757和WO03507822)也是THl應(yīng)答的優(yōu)先誘導(dǎo)物并且適合在本發(fā)明使用。特定的佐劑是選自以下的佐劑金屬鹽、水包油乳劑、Toll樣受體激動劑(特別是Toll樣受體2激動劑、Toll樣受體3激動劑、Toll樣受體4激動劑、Toll樣受體7激動劑、Toll樣受體8激動劑以及Toll樣受體9激動劑)、皂苷類或其iE合?？梢耘c本發(fā)明的疫苗組合物一起使用的佐劑是來自革蘭氏陰性細(xì)菌菌抹的泡(bleb)或外膜小泡(outermembranevesile)的制備物，例如由WO02/09746所講授的制備物(尤其是腦膜炎奈瑟氏球菌泡(Wmem'"gz力'cfcblebs))。泡的佐劑特性可以通過保留其表面的LOS(脂寡糖)得到改進(jìn)(例如通過用低濃度的去污劑[例如0-0.1%的脫氧膽酸鹽]提取)。LOS可以通過WO02/09746中討論的msbB(-)或htrB(-)突變?nèi)ザ?。佐劑特性同樣可以通過于腦膜炎球菌泡(blebs)中保留PorB(任選地除去PorA)得到改進(jìn)。佐劑特性也可以通過截短腦膜炎球菌泡上LOS的外部核心糖結(jié)構(gòu)而得到改進(jìn)，例如通過在WO2004/014417中討論的IgtB(-)突變?；蛘?，前述的LOS(例如從msbB(-)和/或IgtB(-)菌林中分離的LOS)可以經(jīng)過純化并在本發(fā)明的組合物中作為佐劑使用?？梢耘c本發(fā)明組合物一起使用的又一佐劑可以選自皂苷、脂質(zhì)A或其衍生物、免疫刺激性寡核苦酸、烷基氨基葡糖苷磷酸酯、水包油乳劑或其組合。又一優(yōu)選佐劑是與另一佐劑組合的金屬鹽。優(yōu)選佐劑是Toll樣受體激動劑，特別是Toll樣受體2、3、4、7、8或9的激動劑；或皂苷，特別是Qs21。更優(yōu)選佐劑體系包含兩種或更多種前文所列舉的佐劑。特別是，這些組合優(yōu)選含有皂苷(特別是Qs21)佐劑和/或Toll樣受體9激動劑(例如含CpG的免疫刺激性寡核苷酸)。其他的優(yōu)選組合包括皂普(特別是QS21)與Toll樣受體4激動劑例如單磷酰脂質(zhì)A或其3脫酰化衍生物(3D-MPL);或皂苷(特別是QS21)與Toll樣受體4配體例如烷基氨基葡糖苷磷酸酯。特別優(yōu)選的佐劑是3D-MPL和QS21的組合(EP0671948Bl)、包含3D-MPL和QS21的水包油乳劑(WO95/17210、WO98/56414)或與其他載體配制的3D-MPL(EP0689454Bl)。其他優(yōu)選佐劑體系包括如US6558670、US6544518中描述的3DMPL、QS21和CpG寡核脊酸的組合。在一個實(shí)施方案中，佐劑是(或包含)Toll樣受體(TLR)4配體，優(yōu)選是激動劑，例如脂質(zhì)A的衍生物，特別是單磷酰脂質(zhì)A或者更特別是3脫?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MPL).3D-MPL可得自GlaxoSm池KlineBiologicalsNorthAmerica,并且主要促進(jìn)IFN-g(Thl)表型的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。它可以按照在GB2220211A中公開的方法制備?；瘜W(xué)上，它是具有3、4、5或6條?；湹?-脫酰化單磷酰脂質(zhì)A的混合物。優(yōu)選在本發(fā)明組合物中使用小微粒3D-MPL。小微粒3D-MPL具有的粒徑使其能夠通過0.22pm過濾器而被除菌過濾。這些制品描述于國際專利申請公開號WO94/21292中。合成的脂質(zhì)A衍生物是已知的并且被認(rèn)為是TLR4激動劑，包括但不限于OM174(2-脫氧-6-o-[2-脫氧-2-[(R)-3-月桂酰氧基-十四烷酰氨基]-4-o-膦酰基-P-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羥基十四烷酰氨基]-a-D-吡喃葡糖基磷酸二氫酯)(WO95/14026)OM294DP(3S,9R)-3-[(R)-月桂酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代5-氮雜-9(尺)-[(11)-3-羥基十四烷酰氨基]癸-l，10-二醇,l,10-雙(磷酸二氬面旨)(WO99/64301和WO00/0462)OM197MP-AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-月桂酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮雜-9-(R)-[(R)-3-羥基十四烷酰氨基]癸-l,10-二醇,1J粦酸二氫酯，10畫(6-氨基己酸酯)(WO01/46127)可以使用的其他TLR4配體是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)，例如*ww,:)"wu。oju"4/T么、或者在US6764840中公開的AGP的藥學(xué)上可接受的鹽。有些AGP是TLR4的激動劑，而有些是TLR4的拮抗劑。兩者均被認(rèn)為可以用作佐劑。用于本發(fā)明中的另一種優(yōu)選的免疫刺激物是QuilA及其衍生物。QuilA是從南美查拉雅屬皂樹(QuilajaSaponariaMolina)中分離的皂苷制劑，并且最初由Dalsgaard等在1974年描述為具有佐劑洽性("Saponinadjuvants"("鬼芬佐劑，，),Archiv.fiirdiegesamteVirusforschung，Vol.44,SpringerVerlag,Berlin,p243-254)。QuilA的純化片段已經(jīng)通過HPLC被分離，其保留了佐劑活性并且沒有QuilA相關(guān)的毒性(EP0362278)，例如QS7和QS21(也稱為QA7和QA21)。QS-21是獲自奎拉雅屬皂樹樹皮的天然皂苷，其誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)、Thl細(xì)胞以及占優(yōu)勢的IgG2a抗體應(yīng)答，而且在本發(fā)明的范圍內(nèi)是優(yōu)選的皂香。QS21的具體制劑已經(jīng)有描述，其特別優(yōu)選，這些制劑還包含固醇(W096/33739)。構(gòu)成本發(fā)明部分的皂苦類可以以膠束、混合膠束(優(yōu)先地但非排他地與膽汁鹽混合)的形式分散；或者可以以ISCOM基質(zhì)(ISCOMmaxtrices)(EP0109942Bl)、脂質(zhì)體或相關(guān)的膠體結(jié)構(gòu)例如蠕蟲狀或環(huán)狀多聚復(fù)合物、或當(dāng)與膽固醇和脂質(zhì)配制時的脂質(zhì)/層狀結(jié)構(gòu)(lipidic/layeredstructure)和薄層(lamellae)的形式^t;或者可以以水包油乳劑的形式分散(例如如WO95/17210中所述)。皂苷可以優(yōu)選與金屬鹽例如氬氧化鋁或磷酸鋁結(jié)合(WO98/15287)。優(yōu)選皂苦以脂質(zhì)體、ISCOM或水包油乳劑的形式存在。增強(qiáng)型體系包括單磷酰脂質(zhì)A(或去毒型脂質(zhì)A)和皂苷衍生物的組合，特別是WO94/00153中7>開的QS21和3D-MPL的組合，或反應(yīng)原性較低的組合物，其中如WO96/33739中公開的，QS21用膽固醇淬滅。包括水包油乳劑中的有或無QS21的生育酚和/或3D-MPL的特別有效的佐劑制劑在WO95/17210中有描述。在一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物另外還包含皂苷，所述皂苦可以是QS21。免疫刺激性寡核苦酸或任何其他的Toll樣受體(TLR)9激動劑也可以使用。用于本發(fā)明佐劑或疫苗中的優(yōu)選寡核苦酸是含有CpG的寡核苷酸，優(yōu)選含有由至少3個、更優(yōu)選至少六個或更多個核苷酸隔開的兩個或更多個二核苦酸CpG模體。CpG模體^J包香酸后接鳥苷酸。本發(fā)明的此CpG寡核苷酸通常是脫氧核苷酸。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸中的核苷酸間(fntemudeotfde)是二硫代磷酸酯，或更優(yōu)選硫代磷酸酯鍵，盡管磷酸二酯鍵和其他核苦酸間鍵也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的還有帶混合的核苦酸間鍵合的寡核苦酸。產(chǎn)生硫代磷酸酯寡核苷酸或二疏代磷酸酯的方法在US5,666，153、US5，278,302和WO95/26204中描述。優(yōu)選寡核苷酸的實(shí)例具有以下序列。所述序列優(yōu)選舍有用硫代磷酸酯修飾的核香酸間鍵合。OLIGOl(SEQIDNO:l):TCCATGACGTTCCTGACGTT(CpG1826)OLIGO2(SEQIDNO:2):TCTCCCAGCGTGCGCCAT(CpG1758)OLIGO3(SEQIDNO:3):ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACGOLIGO4(SEQIDNO:4):TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(CpG2006)OLIGO5(SEQIDNO:5):TCCATGACGTTCCTGATGCT(CpG1668)OLIGO6(SEQIDNO:6):TCGACGTTTTCGGCGCGCGCCG(CpG5456)或者，CpG寡核苷酸可以包含以上優(yōu)選序列，因為它們具有無關(guān)緊要的缺失或插入。本發(fā)明中利用的CpG寡核苷酸可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來合成(例如參見EP468520)。方便的是，該寡核苷酸可以利用自動合成儀來合成。劑。乳劑系統(tǒng)的油相優(yōu)選包括可代謝油。術(shù)語可代謝油的意思為本領(lǐng)域所熟知。可代謝的可以定義為"能夠通過代謝轉(zhuǎn)化，，(Dorland，sIllustratedMedicalDictionary,W.B.SandersCompany,25thedition(第25版)(1974))。該油可以是對接受者無毒并且能夠通過代謝轉(zhuǎn)化的任何植物油、魚油、動物油或合成油。堅果、種子和谷物是纟直物油的一般來源。合成油可樣屬于本發(fā)明的部分并且可以包括市售的油例如NEOBEE⑧及其他油。角鯊烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2,6，10,14，18，22-二十四碳六烯)是不飽和油，其大量存在于魚肝油中，而以較低量存在于橄欖油、麥芽油、米4泉油和酵母中；并iL是用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的油。角鯊烯由于以下事實(shí)是可代謝油它是膽固醇生物合成的中間體(Merckindex,10thEdition(第10版)，entryno.8619)。母育酚(例如維生素E)也經(jīng)常用于油乳劑佐劑(EP0382271Bl、US5667784、WO95/17210)。用于本發(fā)明油乳劑(優(yōu)選水包油乳劑)的母育酚可以按照EP0382271Bl中描述的方法配制，因為母育酚可以是母育酚小滴的^:體，該分散體任選包含乳化劑，所述小滴優(yōu)選直徑少于U敫米?；蛘?，母育酚可以與另一種油聯(lián)用，以形成油乳劑的油相?？梢耘c母育酚聯(lián)用的油乳劑的實(shí)例于此中有描述，例如前文描述的可代i射油。已經(jīng)4€出，水包油乳劑佐劑自身可用作佐劑組合物(EP0399843B)，同樣水包油乳劑與其他活性試劑的組合已經(jīng)被描述作為疫苗用佐劑(WO95/17210、WO98/56414、WO99/12565、WO99/11241)。其他油乳劑佐劑已有描述，例如油包水乳劑(US5,422,109、EP0480982B2)以及水包油包水乳劑(US5,424,067、EP0480981B)。以上提及的全部都構(gòu)成形成本發(fā)明的佐劑和組合物的優(yōu)選油乳劑系統(tǒng)(特別是當(dāng)加入母育酚的時候)。最優(yōu)選該油乳劑(例如水包油乳劑)還包括乳化劑例如吐溫80(TWEEN80)和/或固醇例如膽固醇。優(yōu)選的油乳劑(優(yōu)選水包油乳劑)包含可代謝的無毒油例如角豈烷、角鯊烯的，或者生育酚例如a-生育酚(優(yōu)選既有角鯊烯又有a生育酚)；并且任選包含乳化劑(或表面活性劑)，例如吐溫80。也可以包括固醇(優(yōu)選膽固醇)。產(chǎn)生水包油乳劑的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。一般來說，該方法包括將含有母育酚的油相與表面活性劑(例如PBS/TWEEN80tm溶液)混合，隨后使用均化器均化，本領(lǐng)域的技術(shù)人員所清楚的是，包括使該混合物通過注射器針頭兩次的方法將適合于使小體積液體均化。同樣地，在微射流儀(microfluidiser)中的乳化過程(Ml10S微射流設(shè)備(Microfluidicsmachine),在2分鐘時間內(nèi)于6巴最大壓力輸入(約850巴輸出壓力)下，最多通過50次)可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員修改，以產(chǎn)生更小或更大體積的乳劑。修改可以通過常規(guī)的實(shí)-瞼實(shí)現(xiàn)，包^l奮測量產(chǎn)生的乳劑，直到獲得具有所需直徑的小油滴的制劑。在水包油乳劑中，油和乳化劑應(yīng)該是處于水性載體中。水性載體可以是例如磷酸緩沖鹽水。通過光子相關(guān)光語檢測，在穩(wěn)定的水包油乳劑中小油滴的大小優(yōu)選少于1微米，可以在基本上為30-600nm的范圍，優(yōu)選直徑基本上大約30-500nm，最優(yōu)選直徑基本上是150-500nm,特別是約150nm直徑。在這方面，以數(shù)量計80%的小油滴應(yīng)該在此優(yōu)選范圍之內(nèi)，更優(yōu)選以數(shù)量計超過90%、最優(yōu)選以數(shù)量計超過95%的小油滴在此定義的大小范圍之內(nèi)。在本發(fā)明油乳劑中組分的含量常規(guī)上在以下范圍內(nèi)0.5-20%或2-10%的油(按總劑量體積計)，例如角畫烯；2-10%的a生育酚(如果存在的話)；和0.3-3%的表面活性劑，例如聚氧乙烯山梨坦單油酸酯。優(yōu)選油(優(yōu)選角豊烯):母育酚(優(yōu)選a-生育酚)的比例等于或小于1,因為這提供更穩(wěn)定的乳劑。乳化劑例如吐溫80或Span85也可以以約1%的水平存在。在某些情況下，本發(fā)明的疫苗進(jìn)一步含有穩(wěn)定劑可能是有利的。優(yōu)選的乳劑系統(tǒng)的實(shí)例描述于WO95/17210、WO99/11241和WO99/12565中，文中公開了基于角藍(lán)烯、a-生育酚和吐溫80的乳劑佐劑，所述乳劑佐劑任選與免疫剌激物QS21和/或3D-MPL—起配制。因此，本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的佐劑可以附加地包含另外的免疫刺激物，例如LPS或其衍生物，和/或皂苷類。另外的免疫刺激物的實(shí)例描述于此以及描述于"VaccineDesign-TheSubunitandAdjuvantApproach"L995PharmaceuticalBiotechnology,Volume6，Powell,MF和Newman編輯，MJ.,PlenumPress，NewYorkandLondon,ISBN0-306-44867-X。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明的佐劑和免疫原性組合物包含在如前文所述的油乳劑中的皂苦(優(yōu)選QS21)和/或LPS衍生物(優(yōu)選3D-MPL)，任選地含有固醇(優(yōu)選膽固醇)。另外，油乳劑(優(yōu)選水包油乳劑)可以含有Span85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。包含水包油乳劑、固醇和泉苷的佐劑描述于WO99/12565中。通常對于人類試用而言，皂苷(優(yōu)選QS21)和/或LPS衍生物(優(yōu)選3D-MPL)將以l|ig-200pg/劑的范圍，例如10-100嗎/劑，優(yōu)選lO(ig-50pg/劑存在于人用劑量的免疫原性組合物中。通常油乳劑(優(yōu)選水包油乳劑)會包含2%-10%的可代謝油。優(yōu)選其包含2%-10%的角鯊烯、2%-10%的a生育酚和0.3%-3%的(優(yōu)選0.4—2%)的乳化劑(優(yōu)選吐溫80[聚氧乙烯山梨坦單油酸酯])。當(dāng)既存在角鯊烯又存在a生育酚時，優(yōu)選角鯊烯:a生育酚的比例等于或小于1，因為這^是供更穩(wěn)定的乳劑。Span85(山梨坦三油酸酯)也可以以0.5-1%的水平存在于本發(fā)明使用的乳劑中。在某些情況下，本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗進(jìn)一步含有穩(wěn)定劑例如其他乳化劑/表面活性劑(包括辛酸)(merckindex10thEdition,entryno1739)可能是有利的，其中特別優(yōu)選三辛酸甘油酯。當(dāng)包括角鯊烯和皂苷(優(yōu)選QS21)時，在制劑中也包括固醇(優(yōu)選膽固醇)會有益處，因為這允許降低乳劑中的總油量。這將導(dǎo)致生產(chǎn)成本降低，疫苗的總體適度改進(jìn)以及所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答在數(shù)量和質(zhì)量上得到改進(jìn)，例如IFN-Y的產(chǎn)量提高。因此，本發(fā)明的佐劑系統(tǒng)典型地包含范圍從200:1到300:1的可代謝油:皂苷比例(w/w),本發(fā)明也可以以"低油"的形式使用，其優(yōu)選的范圍是1:1-200:1，優(yōu)選20:1-100:1,最優(yōu)選基本上是48:1，此疫苗保留了所有組分的有利佐劑特性，并且反應(yīng)原性特征(profile)大大降低。因此，特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，角豈烯:QS21(w/w)的比例范圍從1:1到250:1，優(yōu)選范圍是20:1-200:1，優(yōu)選20:1-到200:1，最優(yōu)選基本上是48:1。優(yōu)選也包括固醇(最優(yōu)選膽固醇)，并以于此描述的急苦固醇的比例存在。本發(fā)明的乳劑系統(tǒng)優(yōu)選具有亞微米范圍的小油滴大小。更優(yōu)選該小油滴的大小在120-750nm的范圍內(nèi)，最優(yōu)選直徑為120-600nm。特別有效的佐劑制劑(對于在本發(fā)明的免疫原性組合物中最終與A1P04組合)包括急苷(優(yōu)選QS21)、LPS衍生物(優(yōu)選3D-MPL)和油乳劑(優(yōu)選水包油乳劑中的角鯊烯和a生育酚)，如WO95/17210或WO99/12565中所描述的(特別是在實(shí)施例2表1中的佐劑制劑11)。TLR2激動劑的實(shí)例包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑并喹啉，例如咪喹莫特(Imiquimod)和雷西莫特(Resiquimod)是已知的TLR7激動劑。單鏈RNA也是已知的TLR激動劑(人類中的TLR8和小鼠中的TLR7)，而雙鏈RNA和polyIC(聚肌胞普酸-一種市售的合成的病毒RNA模擬物)是典型的TLR3激動劑。3D-MPL是TLR4激動劑的實(shí)例，同時CPG是TLR9激動劑的實(shí)例。免疫原性組合物可以包含吸附在金屬鹽上的抗原和免疫刺激物。鋁基疫苗制劑描述于EP0576478Bl、EP0689454Bl和EP0633784Bl中，其中抗原與免疫刺激物3-de-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MPL)吸附在同一微粒上。在這些例子中，抗原首先吸附在鋁鹽上，隨后使免疫刺激物3D-MPL吸附在同一鋁鹽微粒上。這些方法首先涉及通過在水浴中超聲處理直到微粒大小達(dá)到80-500nm而使3D-MPL懸浮。通常在室溫中攪拌一小時使抗原吸附到鋁鹽上。然后將3D-MPL懸浮液加到已吸附的抗原中，該制劑于室溫下溫育1小時，然后在4。C下保存待用。在另一種方法中，免疫刺激物和抗原在不同的金屬微粒上，如EP1126876中所述。改進(jìn)的方法包括使免疫刺激物吸附在金屬鹽微粒上，1^使抗原吸附在另一金屬鹽微粒上，隨后混合這些離散的金屬微粒以形成疫苗。用于本發(fā)明的佐劑可以是包含吸附在金屬鹽微粒上的免疫刺激物的佐劑組合物，其特征為金屬鹽微?；旧蠠o其他抗原。此外，疫苗由本發(fā)明提供并且其特征為免疫刺激物吸附在金屬鹽微粒上，所迷金屬鹽微?；旧蠠o其他抗原，并且在吸附了抗原的金屬鹽微粒中基本上無其他免疫刺激物。因此，本發(fā)明提供包含免疫刺激物的佐劑制劑，所述免疫刺激物已經(jīng)吸附在金屬鹽微粒上，其特征是所述組合物基本上無其他抗原。此外，此佐劑制劑可以是中間體，如果使用該佐劑，則此佐劑制劑是疫苗制造所需的。因此，提供了疫苗的制備方法，其包括將佐劑組合物與抗原混合，其中所述佐劑組合物是一種或更多種吸附在金屬微粒上的免疫刺激物。優(yōu)選所述抗原已經(jīng)預(yù)先吸附在金屬鹽上。所述金屬鹽可以等同于或類似于吸附在免疫刺激物上的金屬鹽。優(yōu)選所述金屬鹽是鋁鹽，例如磷酸鋁或氫氧化鋁。本發(fā)明還提供疫苗組合物，所述疫苗組合物包含吸附在第一金屬鹽微粒上的免疫刺激物、和吸附在金屬鹽上的抗原，其特征為第一和第二金屬鹽微粒是單獨(dú)的微粒。于此描述的LPS或LOS書f生物或突變體或脂質(zhì)A衍生物被設(shè)計為比天然脂多糖(例如3D-MPL)毒性低，并且就本文描述的這些部分的任何使用而言，是可互換的等同物。它們可以是前文描述的TLR4配體。其他的這些書f生物描述于WO020786737、WO9850399、WO0134617、WO0212258和WO03065806中。在一個實(shí)施方案中，用于本發(fā)明組合物的佐劑包括脂質(zhì)體載體(通過已知的技術(shù)從磷脂(例如二油酰磷脂酰膽堿[DOPC])和任選的固醇[例如膽固醇]制得)。這些脂質(zhì)體載體可以攜帶脂質(zhì)A衍生物[例如3D-MPL,參見上文]和/或皂苷(例如QS21，參見上文)。在一個實(shí)施方案中，佐劑包含(每0.5mL劑量)0.1-10mg、0.2--7、0.3-5、0.4-2或0.5—1mg(例如0.4-0.6、0.9—1.1、0.5或1mg)的石粦月旨(例:ft口DOPC);0.025—2.5、0.05—1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125—0.25mg(例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)的固醇(例如膽固醇)；5-60、10_50或20-30嗎(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50嗎)的脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL);和5-60、10-50或20-30嗎(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50嗎)的急苦(例如QS21)。此佐劑特別合適于老年人用疫苗制劑。在一個實(shí)施方案中，包括此佐劑的疫苗組合物包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并且可以也包含來自血清型3、6A、19A和22F的一種或更多種糖綴—合物)，其中針對疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F中的一種或更多種(或所有)誘導(dǎo)的GMC抗體效價并不顯著差于由Prevnar⑧疫苗在人類接種者中誘導(dǎo)的效價。在一個實(shí)施方案中，用于本發(fā)明組合物的佐劑包含由可代謝油(例如角豊烯)、乳化劑(例如吐溫80)和任選的母育酚(例如a-生育酚)制得的水包油乳劑。在一個實(shí)施方案中，佐劑包含(每0.5mL劑量)0.5-15、1-13、2-11、4-8或5-6mg(例如2-3、5-6或10_11mg)的可代謝油(例如角鯊烯)；0.1-10、0.3-8、0.6-6、0.9-5、1—4或2—3mg(例如0.9-1.1、2-3或4—5mg)的乳化劑(例如吐溫80)和任選的0.5-20、1-15、2-12、4-10、5-7mg(例如11-13、5-6或2-3mg)的母育酚(例如a-生育酚)。此佐劑可以任選地進(jìn)一步包含5-60、10-50或20-30嗎(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50pg)的脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。這些佐劑特別適合于嬰兒或老年人用疫苗制劑。在一個實(shí)施方案中，包含此佐劑的疫苗組合物包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并且可以也包含來自血清型3、6A、19A和22F的一種或更多種糖綴合物)，其中針對疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F中的一種或更多種(或所有)的GMC抗體效價并不顯箸差于由Prevnar0疫苗在人類接種者中誘導(dǎo)的效價。此佐劑可以任選含有0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)的固醇(例如膽固醇)；5-60、10-50或20—30|ig(例如5—15、40-50、10、20、30、40或50pg)的脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL);和5-60、10-50或20-30iig(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50嗎)的皂普(例如QS21)。此佐劑特別適合于嬰兒或老年人用疫苗制劑。在一個實(shí)施方案中，包含此佐劑的疫苗組合物包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并且可以也包含來自血清型3、6A、19A和22F的一種或更多種糖綴合物)，其中針對疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F中的一種或更多種(或所有)的GMC抗體效價并不顯著差于由Prevnar⑧疫苗在人類接種者中誘導(dǎo)的效價。在一個實(shí)施方案中，用于本發(fā)明組合物的佐劑包括磷酸鋁和脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。該佐劑可以包含(每0.5ml劑量)100-750、200-500或300-400昭作為磷酸鋁的Al和5-60、10-50或20-30嗎(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50嗎)的脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。此佐劑特別地適合于老年人或嬰兒用疫苗制劑。在一個實(shí)施方案中，包含此佐劑的疫苗組合物包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并且可以也包含來自血清型3、6A、19A和22F的一種或更多種糖綴合物)，其中針對疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F中的一種或更多種(或所有)的GMC抗體效價并不顯箸差于由Prevnar⑧疫苗在人類接種者中誘導(dǎo)的效價。含有本發(fā)明免疫原性組合物的疫苗制劑可以通過系統(tǒng)途徑或粘膜途徑施用所述疫苗，用于保護(hù)或治療易于感染的哺乳動物。這些施用可以包括通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑注射；或通過粘膜施用到口月t/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。優(yōu)選鼻內(nèi)施用疫苗以治療肺炎或中耳炎(因為可以更有效地預(yù)防鼻咽攜帶肺炎球菌，因此在感染的最早期削弱感染)。盡管本發(fā)明的疫苗可以作為單一劑量給藥，但其組分也可以于同一時間或不同時間共同施用(例如可以同時地或在施用疫苗的任何細(xì)菌蛋白組分l-2周后，單獨(dú)施用肺炎球菌糖綴合物T使兩者相互之間的免疫應(yīng)答達(dá)到最佳的配合)。對于共同施用，可以在任何或所有不同的施用中存在<右&的Thl佐劑。除了單一的施用途徑以夕卜，還可以使用2種不同的施用途徑。例如，.并奮或糖綴合物可以IM(或ID)施用，而細(xì)菌蛋白可以IN(或ID)施用。此外，本發(fā)明的疫苗對于起始劑量可以IM施用，而對于增強(qiáng)劑量可以IN施用。疫苗中蛋白抗原的含量將通常在1-100昭的范圍內(nèi)，優(yōu)選5-50嗎，最優(yōu)選5-25嗎的范圍內(nèi)。在初次接種疫苗之后，受試者可以在足夠的時間間隔內(nèi)接受一次或若干次增強(qiáng)免疫接種。疫苗制備在VaccineDesign中有詳細(xì)的描述("Thesubunitandadjuvantapproach"(亞單位與佐劑方法)(PowellM.F.和NewmanM丄編輯)(1995)PlenumPressNewYor)。在脂質(zhì)體中包封則由Fullerton，美國專利4,235,877描述。本發(fā)明的疫苗可以貯存于溶液中或凍干。優(yōu)選溶液在糖(例如蔗糖或乳糖)的存在下凍干。更優(yōu)選使它們凍干并在使用之前臨時復(fù)原。，凍干可以產(chǎn)生更穩(wěn)定的組合物(疫苗)，并且在3D-MPL存在而鋁堿佐劑不存在的情況下可能會產(chǎn)生更高的抗體效價。一方面，本發(fā)明提供了疫苗藥盒，所述藥盒包括裝有本發(fā)明免疫原性組合物(任選以凍干的形式)的小瓶；并且進(jìn)一步包括裝有于此描述的佐劑的小瓶。設(shè)想了在本發(fā)明的這個方面，佐劑將可以用于復(fù)原凍干的免疫原性組合物。盡管本發(fā)明疫苗可以以任^f可途徑施用，但將所述疫苗施用到皮膚(ID)構(gòu)成了本發(fā)明的一個實(shí)施方案。人類皮膚包括"角質(zhì)"外表層，稱為角質(zhì)層，該角質(zhì)層覆蓋表皮。在此表皮下面是稱為真皮的一層，其又M皮下組織。研究人員已經(jīng)表明，將疫苗注射進(jìn)皮膚，特別是注射進(jìn)真皮，剌激免疫應(yīng)答，這也可能與許多另外的優(yōu)點(diǎn)相關(guān)。用于此描述的疫苗進(jìn)行皮內(nèi)疫苗接種，構(gòu)成了本發(fā)明的優(yōu)選特征。傳統(tǒng)的皮內(nèi)注射技術(shù)-"芒圖操作(mantouxprocedure)"，包括以下步囅清潔皮膚，然后用一只手展開皮膚，并以小號針(26-31號)的斜面向上，以10-15°的角度將針插入。一旦插入針頭的斜面，將針筒壓低并進(jìn)一步推進(jìn)，同時提供輕微的壓力使針頭在皮膚下提升。然后非常慢地將液體注入，從而在皮膚表面形成一個小泡或腫塊，隨后緩慢地撤回針頭。最近，特別涉及用于施用液體藥劑進(jìn)入或跨越皮膚的裝置已有描述，例如在WO99/34850和EP1092444中描述的裝置，也有在例如以下文獻(xiàn)中描述的噴射式注射裝置(jetinjectiondevices):WO01/13977、US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5,993,412、US5,649,912、US5,569,189、US5,704,911、US5,383，851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520,639,US4,596,556、US4,790,824、US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705和WO97/13537。皮內(nèi)施用疫苗制劑的可供選擇的方法可以包括傳統(tǒng)的注射器和針、設(shè)計用于彈道遞送固體疫苗的裝置(WO99/27961)、透皮貼劑(WO97/48440;WO98/28037)或者應(yīng)用到皮膚表面(透皮或經(jīng)皮遞送WO98/20734、WO98/28037)。當(dāng)要將本發(fā)明的疫苗施用于皮膚時，或更具體地說施用到真皮內(nèi)時，疫苗是以少量的液體體積，特別是約0.05m1-0.2ml的體積。本發(fā)明的皮膚或皮內(nèi)疫苗中的抗原含量可以類似于肌內(nèi)施用疫苗的常規(guī)劑量(參見上文)。然而，皮膚或皮內(nèi)疫苗的特征是制劑可以是"低劑量"。因此，"低劑量"疫苗中的蛋白抗原優(yōu)選以少至0.1-10iig/劑量、優(yōu)選O.l-5^g/劑量存在；而糖(優(yōu)選綴合型)抗原可以以0.01-liig/劑量、優(yōu)選0.01-0.5(ag糖/劑量的范圍存在。正如于此所4吏用的，術(shù)語"皮內(nèi)遞送"是指將疫苗遞送到皮膚中的真皮部位。然而，疫苗不一定僅位于真皮中。真皮是皮膚中位亍距離人類表皮約1.0-2.0mm的皮層，但在個體之間以及在身體不同的部位間存在一定量的變化。一般來說，通過在皮膚表面下進(jìn)入1.5mm可以預(yù)期到達(dá)真皮。真皮處于角質(zhì)層和表面的表皮之間，并且處于皮下層之下。根據(jù)遞送的方式，疫苗可以最終僅處于或主要處于真皮之內(nèi)，或者它可以最終分布到狄和真皮之內(nèi)。本發(fā)明還通過加入流感嗜血桿菌蛋白(例如游離或綴合形式的D蛋白)提供用于預(yù)防或改善由流感嗜血桿菌引起的中耳炎的改進(jìn)型疫苗。此外，通過依靠將一種或兩種作為游離或綴合蛋白的肺炎球菌蛋白添加到本發(fā)明的肺炎鏈球菌綴合組合物中，本發(fā)明還提供用于預(yù)防或改善嬰兒中肺炎球菌感染(例如中耳炎)的改進(jìn)型疫苗。所述肺炎球菌游離蛋白可以是與用作載體蛋白的任何肺炎鏈球菌蛋白相同或不同。一種或更多種卡他莫拉菌蛋白抗原也可以以游離形式或綴合形式包括在聯(lián)合疫苗中。因此，本發(fā)明是誘導(dǎo)抗嬰兒中耳炎的(保護(hù)性)免疫應(yīng)答的改進(jìn)方法。在另在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種改進(jìn)的方法，所述方法通過施用安全有效量的本發(fā)明疫苗[兒科疫苗]，誘導(dǎo)抗嬰兒(在本發(fā)明的范圍內(nèi)定義為0-2歲)中耳炎的(保護(hù)性)免疫應(yīng)答。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案包括提供用于醫(yī)藥的本發(fā)明的抗原性肺炎鏈球菌綴合物組合物；以及本發(fā)明的抗原性肺炎鏈球菌綴合物組合物在制備用于預(yù)防(或治療)肺炎球菌性疾病的藥物中的應(yīng)用。在又一個實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種改進(jìn)的方法，所述方法通過施用安全有效量的本發(fā)明疫苗，優(yōu)選與一種或兩種作為游離蛋白或綴合蛋白的肺炎鏈球菌蛋白結(jié)合，在老年人群(在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如果患者是50歲以上，通常超過55歲，普遍超過60歲，則他們被認(rèn)為是老年人)中誘導(dǎo)的(保護(hù)性)免疫應(yīng)答，所述肺炎鏈球菌蛋白可以與任何用作載體蛋白的肺炎鏈球菌蛋白相同或不同。本發(fā)明的又一方面是使人_類宿主免疫以對抗由肺炎鏈球菌引起的和任選由流感嗜血桿菌感染^起的疾病的方法，所述方法包括對宿主施用免疫保護(hù)劑量的本發(fā)明免疫原性組合物或疫苗或藥盒。本發(fā)明的又一方面是用于治療或預(yù)防由起肺炎鏈球菌和任選由流感嗜血桿菌感染引起的疾病的本發(fā)明免疫原性組合物。本發(fā)明的又一方面是本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗或藥盒在制備用于治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌和任選由流感嗜血桿菌感染引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。在每種情況下，于此的術(shù)語"包含"和"包括"由發(fā)明人意圖用于任選地用術(shù)語"由……組成"代替。本文涉及本發(fā)明的"疫苗組合物"的實(shí)施方案也適用于涉及本發(fā)明的"免疫原性組合物"的實(shí)施方案，反之亦然。在本專利說明書中引用的所有參考文獻(xiàn)或?qū)＠暾堅诖艘鲄⒖?。為了可以使本發(fā)明可被更好地理解，陳列以下實(shí)施例。這些實(shí)施例僅為闡明意圖，而不應(yīng)解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例l:D蛋白的表達(dá)流感嗜血桿菌D蛋白用于D蛋白表達(dá)的遺傳構(gòu)建體原始材料編碼D蛋白的DNAD蛋白在所有血清型和無法分型的流感嗜血桿菌菌抹中高度保守。包含編碼整個D蛋白基因的DNA序列的pHIC348載體已獲自AForsgren博士，DepartmentofMedicalMicrobiology,UniversityofLund，Malm5GeneralHospital,Malmd，Sweden(瑞典)。D蛋白的DNA序列已由Janson等.(1991)Infect.Immun.59:119-125公開。表狄體pMGl表達(dá)載體pMGl是pBR322的衍生物(Gross等，1985)，其中引入了獲自X噬菌體的用于轉(zhuǎn)錄和翻譯外源插入基因的調(diào)控元件(Shatzman等，1983)。此外，用卡那霉素抗性基因置換了氨爺青霉素抗基因。大腸桿菌菌林AR58大腸桿菌菌抹AR58通過用預(yù)先在SA500衍生物(galE::TN10,JCirc1857AH1)中培養(yǎng)的PI謹(jǐn)菌體原種轉(zhuǎn)導(dǎo)N99而產(chǎn)生。N99和SA'5tKT是獲自theNationalInstituteofHealth中的MartinRosenberg博士實(shí)驗室的大腸桿菌K12菌抹。表達(dá)載體pMG1為了生產(chǎn)D蛋白，將編碼D蛋白的DNA克隆到pMG1表達(dá)載體中。此質(zhì)粒利用來自人噬菌體DNA的信號以驅(qū)動所插入的外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻i斧。該載體包含PL啟動子、OL操縱基因以及兩個利用位點(diǎn)(NutL和NutR)以緩和當(dāng)提供N蛋白時的轉(zhuǎn)錄極性效應(yīng)(Gross等，1985)。將包含PL啟動子的載體導(dǎo)入大腸桿菌溶源性宿主以穩(wěn)定該質(zhì)粒DNA。溶源性宿主菌抹含有整合到其基因組中的復(fù)制缺陷型X噬菌體DNA(Shatzman等，1983)。染色體的人噬菌體DNA指導(dǎo)cl阻遏蛋白合成，該阻遏蛋白與載體的OL阻遏物結(jié)合并防止RNA聚合酶與PL啟動子結(jié)合，從而轉(zhuǎn)錄所插入的基因。表達(dá)菌林AR58的cl基因包含溫度敏感突變體，致使PL指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄可以通過溫度變化來調(diào)節(jié)，即培養(yǎng)溫度的升高使阻遏物失活并啟動外源蛋白合成。該表達(dá)體系允許外源蛋白的受控合成，尤其是對細(xì)胞有毒的外源蛋白的受控表達(dá)(Shimataka和Rosenberg,1981)。;^桿菌菌林AR58用于產(chǎn)生D蛋白載體的AR58溶源性大腸桿菌菌林是標(biāo)準(zhǔn)NIH大腸桿菌K12菌抹N99的書f生物(FsirgalK2，IacZ-thf)。它包含缺陷型溶源性人噬菌體(galE::TN10,JCirc1857AH1)。Kir表型防止關(guān)閉宿主大分子合成。c1857突變給cl阻遏物賦予了溫度敏感型損傷。AH1缺失移除了X噬菌體右邊的操縱子以及宿主的bio、uvr3和chlA基因座。菌抹AR58通過用預(yù)先在SA500衍生物(galE::TN10，？JECirc1857AH1)中培養(yǎng)的Pl噬菌體原種轉(zhuǎn)導(dǎo)N99而產(chǎn)生。缺陷型溶源體導(dǎo)入到N99用四環(huán)素來選擇，這是因為在鄰近的galE基因中存在編碼四環(huán)素抗性的TN10轉(zhuǎn)座子。構(gòu)建載體pMGMDPPrD用含有禽流感病毒的非結(jié)構(gòu)Sl蛋白編碼基因的pMG1載體(pMGNSI)構(gòu)建pMGMDPPrD。通過PCR用在5'端和3'端分別含有Ncol和Xbal限制位點(diǎn)的PCR引物，從pHIC348載體中擴(kuò)增D蛋白基因(Janson等1991Infect.Immun.59:119-125)。然后將NcoI/Xbal片段導(dǎo)入pMGNSl的Ncol和Xbal之間，從而產(chǎn)生含有NS1蛋白的N-末端81個氨基酸后接PD蛋白的融合蛋白。此載體標(biāo)記為pMGNSlPrD。基于前文描述的構(gòu)建體，產(chǎn)生用于表達(dá)D蛋白的最終載體。從pMGNSlPrD中移除BamHI/BamHI片段。該DNA水解移除了NS1編碼區(qū)，剩下前三個N-末端殘基。通過載體的重新連接，產(chǎn)生編碼帶有以下N-末端氨基酸序列的融合蛋白的基因-——MDPSSHSSNMANT--—謂NS1D蛋白D蛋白不含前導(dǎo)肽或與脂鏈正常連接的N-末端半胱氨酸。因此，該蛋白既不分泌到周質(zhì)中也不能脂質(zhì)化，而是以可溶的形式保留在細(xì)胞質(zhì)中。通過37。C的熱激將最終的pMG-MDPPrD構(gòu)建體導(dǎo)入AR58宿主菌抹。含有質(zhì)粒的細(xì)菌在卡那霉素存在下進(jìn)行選擇。編碼D蛋白的DNA插入片段的存在通過用所選擇的核酸內(nèi)切酶消化分離的質(zhì)粒DNA而得到證實(shí)。重組的大腸桿菌菌林稱為ECD4。D蛋白的表達(dá)處于XP^啟動子/C^操縱基因控制下。宿主菌林AR58在基因組中^^有溫度敏感型cl基因，該基因在低溫下通過與OL結(jié)合來阻斷源于人PL的表達(dá)。一旦提升溫度，c1則從Ol中幹放，而D蛋白則得到表達(dá)。小頰j莫制備在發(fā)酵結(jié)束時，將細(xì)胞濃縮并冷凍。如下從收集的細(xì)胞提取并純化D蛋白。使冷凍的細(xì)胞培養(yǎng)物沉淀解凍并使其重新懸浮在細(xì)胞裂解溶液中(檸檬酸緩沖液pH6.0)至終OD65o=60。使懸浮液兩次通過P=1000巴的高壓勻漿器。細(xì)胞培養(yǎng)物勻漿通過離心澄清，細(xì)胞碎片通過過濾移除。純化的第一步中，經(jīng)過濾的溶解產(chǎn)物上樣于陽離子交換層析柱(SPSepharoseFastFlow)。PD通過離子相互作用與凝月交基質(zhì)結(jié)合，并通過一步提高(astepincrease)洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度而被洗脫。純化的第二步中，雜質(zhì)保留在陰離子交換基質(zhì)上(QSepharoseFastFlow)。PD不結(jié)合到凝膠上，并可以在流出液中收集。在兩個柱層析步驟中均利用OD監(jiān)視分部收集物。含有純化的D蛋白的陰離子交換柱層析的流出液通過超濾濃縮。最后，使含有D蛋白的超濾截留物質(zhì)通過0.2jim膜。大規(guī)模制備如下從收集的細(xì)胞提取D蛋白并純化。冷卻收集的培養(yǎng)液，并使其兩次直接通過800巴左右的高壓勻漿器。純化的第一步中，稀釋細(xì)胞培養(yǎng)物勻漿并上樣于陽離子交換層析柱(SPSepharoseBigbeads)。PD通過離子相互作用與凝MJ^質(zhì)結(jié)合并通過一步提高洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度而被洗脫。純化的第二步中，雜質(zhì)被保留在陰離子交換基質(zhì)上(QSepharoseFastFIow)。PD不結(jié)^"到^l交上并可以在流出液中收集。在兩個柱層析步驟中均利甩OD監(jiān)視分部收集物。含有純化D蛋白的陰離子交換柱層析的流出液通過超濾濃縮。最后，使含有D蛋白的超濾截留物質(zhì)通過0.2,膜。實(shí)施例lb:表達(dá)PhtDPhtD蛋白是肺炎球菌組氨酸三聯(lián)體(Pht)蛋白家族的成員，其特征在于存在組氨酸三聯(lián)體(HXXHXH模體)。PhtD是有838個氨基酸的分子并帶有5個組氨酸三聯(lián)體(參見MedlmmuneWOOO/37105SEQIDNO:4的氨基酸序列和SEQEDNO:5的DNA序列)。PhtD的中間也含有富脯氨酸區(qū)(氨基酸第348-380位)。PhtD具有帶LXXC模體的20個氨基酸的N-末端信號序列?；驑?gòu)建體使用攜帶pi啟動子的自制pTCMP14載體，將成熟的MedlmmunePhtD蛋白(aa21-aa838)的基因序列重組轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中。大腸桿菌宿主菌株是AR58，其攜帶了cI857熱敏阻遏物，使得能夠熱誘導(dǎo)所述啟動子。進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，以從Medlmmune質(zhì)粒擴(kuò)增phtD基因(攜帶來自肺炎鏈球菌菌抹Norway4(血清型4)的；/^Z)基因-SEQIDNO:5,于WOOO/37105中描述)。用僅對;/^)基因特異性的引物以兩個片段擴(kuò)增；/^)基因。引物攜帶A/"&I和〖;wl限制位點(diǎn)，或攜帶和J^a/限制位點(diǎn)。這些引物不與任何來自該載體的核苷酸雜交，而僅與；/^D特異性基因序列雜交。用攜帶M/el限制位點(diǎn)的第一引物插入人工ATG起始密碼子。然后將產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物插入pGEM-T克隆載體中(Promega)，并確認(rèn)了DNA序列。使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)將片段亞克隆到TCMP14表達(dá)載體中，并將載體轉(zhuǎn)化入v4A5S大腸桿菌。PhtD純化PhtD純化如下實(shí)現(xiàn)在卡那霉素存在下培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞在30°C下培養(yǎng)30小時，然后在39.5。C下誘導(dǎo)18小時。*在作為蛋白酶抑制劑的5mMEDTA和2mMPMSF存在下破碎來自O(shè)D±115的整個培養(yǎng)物的大腸桿菌細(xì)J包Rannie,2次通過，1000巴。用膨脹床式StreamlineQXL層析于室溫(20。C)下進(jìn)行抗原捕獲和細(xì)胞殘渣去除；用NaCl150mM+Empigen0.25%pH6.5洗滌層析柱，用NaCl400mM+Empigen0.25%的25mM磷酸鉀纟爰沖液pH7.4進(jìn)行洗脫。*在Sartobran150柱體(0.45+0.2jim)上過濾。4。C下在5mM咪唑存在下在pH7.4，抗原結(jié)合在Zn++ChelatingSepharoseFFIMAC層析；用5mM咪唑和1%Empigen洗滌層析柱，用50mM咪唑洗脫，兩者均在25mM磷酸鉀緩沖液pH8.0中。*以陽離子模式在FractogelEMDDEAE上在pH8.0(25mM磷酸鉀)于4。C下進(jìn)行弱陰離子交換層析；層析柱用140mMNaCl洗滌并用200mMNaCl洗脫，而雜質(zhì)(蛋白和DNA)仍吸附在交換柱中。*用2mM磷酸Na/KpH7.15在50kDa膜上濃縮并超濾。*純化的半成品(bulk)在Millipak-200.2pm過濾柱體上進(jìn)行除菌過濾。實(shí)施例lc:表達(dá)肺炎球菌溶血素肺炎球菌的肺炎球菌溶血素根據(jù)WO2004/081515和WO2006/032499所描述的進(jìn)行制備并去毒。實(shí)施例2r制備綴合物如何制備純化的肺炎球菌多糖為本領(lǐng)域所熟知。出于這些實(shí)施例的意圖，基本上按照EP072513中描述的方法或通過密切相關(guān)的方法制備多糖。在綴合之前，可以通過以下描述的微流化來調(diào)整多糖的大小。對于每種多糖而言，活化和偶聯(lián)條件是特異的。這些條件在表1給出。經(jīng)大小調(diào)整的多糖(除了PS5、6B和23F以夕卜)溶解于2MNaCl、0.2MNaCl或注射用水(WFI)中。評估所有血清型的最適多糖濃度。除了血清型18C以外，所有的血清型如以下詳述直接與載體蛋白綴合。制備兩種可供選擇的血清型22F綴合物其中一種直接綴合，另外一種通過ADH接頭綴合。由在乙腈或乙腈/水50%/50%溶液中的100mg/ml儲備液，將CDAP(CDAP/PS比例為0.5-1.5mg/mgPS)加到多糖溶液中。1.5分鐘以后，力口入0.2M-0.3MNaOH,以達(dá)到特定的活化pH。在該pH下于25。C下3分鐘進(jìn)行多糖的活化。將純化的蛋白(D蛋白、PhtD、肺炎球菌溶血素或DT)(加入量取決于起始的PS/載體蛋白比例)力口到活化的多糖中，在該特定pH下(在pH調(diào)節(jié)下)進(jìn)行2小時(根據(jù)血清型而定)的偶聯(lián)反應(yīng)。為了淬滅未反應(yīng)的氰酸酯基團(tuán)，將2M甘氨酸溶液加到混合物中。調(diào)整pH到淬滅pH(pH9.0)。于25。C下攪拌溶液30分鐘，隨后于2-8r下過夜，同時進(jìn)行連續(xù)的攪拌。18C的制備18C通過接頭(己二酸二酰肼(ADH))與載體蛋白連接。多糖血清型18C在綴合前經(jīng)過微流化處理。用EDAC對破傷風(fēng)類毒素衍生化為衍生化破傷風(fēng)類毒素，將純化的TT在0.2MNaCl中稀釋到25mg/ml,然后加入ADH間隔物，使最終濃度達(dá)到0.2M。當(dāng)間隔物完全溶解后，將pH調(diào)整到6.2。然后加入EDAC(l-乙基-3國(3-二曱基畫氨基丙基)碳二亞胺)至終濃度為0.02M,并在pH調(diào)節(jié)下攪拌混合物1小時。通迚于25。C提高pH值到9.0達(dá)至少30分鐘，終止該縮合反應(yīng)。然后將衍生化的TT滲濾(IOkDaCO膜)，以除去殘余的ADH和EDAC試劑。最后將TTah半成品(bulk)過濾除菌直至偶聯(lián)步驟，并儲存于-70°C。TTah與PS18C的化學(xué)偶聯(lián)綴合參數(shù)的具體內(nèi)容可在表1中找到。用水稀釋2克經(jīng)微流化處理的PS至規(guī)定的濃度，通過加入NaCl粉末調(diào)整到2MNaCl。加入CDAP溶液(IOOmg/ml，新鮮制備于50/50v/v乙腈/WFI中)以達(dá)到適當(dāng)?shù)腃DAP/PS比例。通過加入0.3MNaOH使pH升高至活化pH9.0，使其穩(wěn)定在此pH下直到TTah的加入。3分鐘以后，加入衍生化的TTAH(20mg/ml,在0.2MNaCl中)至TTah/PS比例為2;調(diào)整pH到偶聯(lián)pH9.0。在pH調(diào)節(jié)下擱置溶液1小時。為了淬滅，將2M甘氨酸溶液加到PS/TTAH/CDAP混合物中。將pH調(diào)整到淬滅pH(pH9.0)。于25。C下攪拌溶液30min，然后在2-8。C下連續(xù)緩慢攪拌下過夜。PS22F^-PhtD綴合物在此糖的第二種綴合方法中(第一種是直接PS22-PhtD綴合法，見表l),22F通過接頭(己二酸二酰肼(ADH))與載體蛋白連接。多糖血清型22F在綴合前經(jīng)過微流化處理。PS22F的衍生化活化和偶聯(lián)通過在控溫水浴中連續(xù)攪拌下于25。C進(jìn)行。稀釋經(jīng)卩微流化處理的PS22F,以在0.2MNaCl中獲得6mg/ml的最終PS濃度，用0.1NHC1使溶液的pH調(diào)整至6.05±0.2。加入CDAP溶液(IOOmg/ml，新鮮制備于乙腈/WFI，50/50中)達(dá)到適當(dāng)?shù)腃DAP/PS比例(1.5Aww)。通iti口入0.5MNaOH，使pH升至活化pH9.00±0.05,并穩(wěn)定在此pH下直到力"入ADH。3分鐘以后，加入ADH以達(dá)到適當(dāng)?shù)腁DH/PS比例(8.9Aw/w);調(diào)整pH到偶聯(lián)pH9.0。在pH調(diào)節(jié)下擱置溶液l小時。將PSA"汙生物濃縮并進(jìn)行:參濾。偶聯(lián)將在0.2MNaCl中的濃度為10mg/ml的PhtD加到PS22Fah衍生物中，以使PhtD/PS22FAH比例達(dá)到4/1(w/w)。用HC1將pH調(diào)整到5.0±0.05。將EDAC溶液(20mg/ml，在0.1MTris-HCIpH7.5中)在10min內(nèi)手動加入(250|al/min)，以達(dá)到1mgEDAC/mgPS22Fah。獲得的溶液在攪拌和pH調(diào)節(jié)下于25。C溫育150min(盡管也可以使用60min)。通過加入lMTris-HClpH7.5(1/10終體積)使溶液中和并于25°C放置30min。在S印hacrylS400HR上洗脫之前，此綴合物通過5jxmMinisart過濾器澄清。所得的綴合物的最終PhtD/PS比為4,1(w/w)，游離PS的含量低于1%，抗原性(a-PS/a-PS)為36.3%,而抗PhtD抗原性為7.4%。綴合物的純化使用經(jīng)0.15MNaCl平衡的SephacrylS400HR(18C用S500HR)凝膠過濾柱凝膠過濾來純化所述綴合物，以去除小分子(包括DMAP)與未敬合PS和蛋白?；赹Jl組分不同的分子大小，PS-PD、PS-TT、PS-PhtD、PS-肺炎球窗溶血素或PS-DT綴合物首先被洗脫，隨后是游離的PS，然后是游離的PD或游離的DT,最后是DMAP和其它鹽(NaCl、甘氨酸)。含有綴合物的級分通過UV280^檢測。根據(jù)級分的Kd將它們合并，除菌過濾(0.22nm)并儲存于+2-8。C中。測定綴合物制備物中PS/蛋白的比例。肺炎鏈球菌PS-D蛋白/TT/DT/PhtD/Plv綴合物的具體活化/偶粉淬滅紐其中"pfluid"在首行中出現(xiàn)，它表明在綴合前所述糖通過微流化調(diào)整大小。微流化處理后糖的大小在表2中給出。表l肺炎鏈球菌PS-D蛋白/TT/DT/PhtD/Plv綴合物的具體活4b/偶^/淬滅條件<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>注意pHa，c，q分別對應(yīng)于活化pH、偶聯(lián)pH和淬滅pH表征對每種綴合物進(jìn)行表征，它們都符合表2中描述的標(biāo)準(zhǔn)。多糖含量(pg/ml)通過Resorcinol試-驗斗企測，而蛋白含量(^g/ml)通過Lowry試-瞼才企測。通過濃度比例確定最終的PS/PD比例(w/w)。游離多糖含量(％):取4。C下貯存或在37。C下保存7天的游離綴合物，與a-載體蛋白抗體和飽和硫酸銨一起溫育，隨后離心，通過所獲得的上清液測定綴合物中的游離多糖含量。用a-PS/a-PSELISA定量上清液中的游離多糖。通過a-載體蛋白/a-PSELISA，以不存在綴合物作為對照?？乖酝ㄟ^夾心型ELISA分析相同綴合物上的抗原性，其中抗體捕捉和抗體檢測的分別是a-PS和a-蛋白。游離蛋白含量(％):未綴合的載體蛋白可以在純化步驟中與綴合物分離。使用大小排阻層析(TSK5000-PWXL),隨后用UV檢測(214nm)，測定游離的殘余蛋白的含量。洗脫條件使游離載體蛋白與綴合物分離a綴合物半成品中游離蛋白含量通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較而確定(0-50pg/ml載體蛋白)。如下獲得游離載體蛋白％:%游離栽體=(游離載體0ig/m1)/(通過Lowry法檢測的相應(yīng)載體蛋白的總濃度Og/ml)*100°/。)。穩(wěn)定性通過HPLC-SEC凝膠過濾(TSK5000-PWXL),測量4'C下貯存和在37。C下保存7天的綴合物的分子量分布(Kav)和穩(wěn)定性。10/11/13/14-價的特征描述在表2中給出(參見該表下的注釋)?？蓪⒌鞍拙Y合物吸附到璘酸鋁上并合并形成最終的疫苗。結(jié)論已經(jīng)制備了免疫原性綴合物，所述免疫原性組合物一直以來都表現(xiàn)為有前景疫苗的組分。表2綴合物的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>*微射流處理天然PS后的PS大小通過混合血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F綴合物(例如劑量分別為1、3、1、1、1、1、1、3、3、1(ig糖/人用劑量)制得10價疫苗。11價疫苗通過進(jìn)一步加入來自表5的血清型3綴合物(例如1嗎糖/人用劑量)制得。13價疫苗通過進(jìn)一步加入前文所述血清型19A和22F綴合物制得(22F直接與PhtD連接，或通過ADH接頭連接)[例如劑量為3jig每種糖/人用劑量]。14價疫苗可以通過進(jìn)一步加入前文所述血清型6A纟叕合物[例如劑量為1嗎糖/人用劑量]制得。實(shí)施例3:在本發(fā)明的免疫原性組合物中含有流感嗜血桿菌D蛋白可以提供對抗急性中耳炎(AOM)的改進(jìn)保護(hù)作用的證據(jù)。研究設(shè)計本研究使用了11Pn-PD疫苗，其包含血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F，其中每種都與來自流感嗜血桿菌的D蛋白綴合(參考實(shí)施例4中的表5)。受試者隨機(jī)地分成兩組，在其約3、4、5和12-15月齡時4妄受四劑11Pn-PD疫苗或/ZflvWx。所有受試者在其3、4和5月齡時接受GSKBiologicals的/"/awWx-/exa(DTPa-HBV-IPV/Hib)疫苗。7h/owrf;c-/jexa是在給藥之前混合的尸e&aWx和Hib的組合。施用第三劑疫苗的2周后，開始"依照方案"的分析進(jìn)行效力隨訪，并一直持續(xù)到24-27月齡。肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的鼻咽攜帶情況在所選擇的受—試者亞群中進(jìn)行評價。如杲孩子患病、出現(xiàn)耳痛、litM的自發(fā)性穿孑L或自發(fā)性耳溢液，則建議其雙親咨詢研究人員。如M究人員懷疑是AOM發(fā)作，則該孩子直接轉(zhuǎn)移至耳鼻喉(ENT)專科醫(yī)生處以確診。AOM的臨床診斷基于目測鼓膜外觀(即紅腫、膨脹、喪失光反射)或出現(xiàn)中耳液體滲出物(通過簡易耳鏡或氣式耳鏡或通過顯微鏡檢查證實(shí))。此外，必須出現(xiàn)以下體征或癥狀中的至少兩種耳痛、耳溢液、聽力受損、發(fā)熱、嗜睡、過敏、食欲減退、嘔吐或腹瀉。如果ENT?？漆t(yī)生確認(rèn)了臨床診斷，則通過鼓膜穿刺術(shù)收集中耳液的樣本以進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗。對于因復(fù)發(fā)疾病就診的受試者，如果從之前的AOM發(fā)作開始已過去了超過30天，則認(rèn)為已經(jīng)開始了新的AOM發(fā)作。此外，如果分離的細(xì)菌/血清型不同于上次的分離抹，則無論這兩次連續(xù)發(fā)作的時間間隔有多久，都認(rèn)為AOM發(fā)作是新的細(xì)菌發(fā)作。試驗結(jié)果總共登記了4968名嬰兒，2489名在11Pn-PD組中，而2479名在對照組中。這兩組之間在人口統(tǒng)計特征或風(fēng)險因素上不存在顯著的差異。臨床發(fā)作與AOM病例定義在依照方案的隨訪期間，在11Pn-PD組中總共記錄了333例臨床AOM發(fā)作，而在對照組中記錄了499例。表3表明了llPn-PD疫苗和之前在芬蘭測試過的兩種7價疫苗(Eskola等NEnglJMed2001;344:403-409和Kilpi等ClinInfectDis200337:1155-64)對抗任何AOM發(fā)作和由不同肺炎球菌血清型、流感嗜jfc^f菌、7VI所和卡他莫拉菌引起的AOM發(fā)作的保護(hù)功效。使用llPn-PD,實(shí)現(xiàn)了總體AOM疾病負(fù)荷量統(tǒng)計學(xué)顯著地和臨床相關(guān)地降低了33.6%,而與病原學(xué)無關(guān)(表3)。對抗歸因于包含在llPn-PD疫苗中的11種肺炎i^菌血清型中任一種的AOM發(fā)作的總體功效是57.6%(表3)。該研究中的另一個重要發(fā)現(xiàn)是由llPn-PD疫苗提供了對抗流感嗜血桿菌引起的AOM的35.6%保護(hù)作用(特別是由NTHi提供了35.3%的保護(hù)作用)。已知在肺炎球菌綴合疫苗時代中流感嗜血桿菌作為AOM主要病因的重要性增加，因此這一發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義。與抗AOM的保護(hù)作用相一致的是，在出生的第二年接種增強(qiáng)劑量后，llPn-PD疫苗同樣減少了流感嗜血桿菌的鼻咽攜帶情況。這些發(fā)現(xiàn)與之前在芬蘭的觀察結(jié)果形成對比，在芬蘭的觀察結(jié)果中對于兩種7價肺炎球菌綴合疫苗，觀察到由流感嗜血桿菌引起的AOM發(fā)作有所增力口(Eskola等和Kilpi等)，以此作為病因取代的證據(jù)。抗由Hi引起的AOM發(fā)作的保護(hù)作用與抗載體D蛋白的抗體水平之間不能建立明確的相關(guān)性，因為在llPn-PD疫苗接種者(仍未出現(xiàn)HiAOM發(fā)作)中的首次接種后的抗PDIgG抗體濃度，基本上與在功效隨訪期間出現(xiàn)至少一次HiAOM發(fā)作的疫苗接種者的首次接種后抗PDIgG抗體濃度相同。然而，盡管在疫苗的生物影響與首次接種后IgG抗PD免疫原性之間不能建立相關(guān)性，但是仍然有理由推測在流感嗜血桿菌菌林中高度保守的PD載體蛋白很大程度上有助于誘導(dǎo)抗Hi的保護(hù)作用。對AOM疾病的作用與對鼻咽攜帶的作用相伴隨，后者對于疫苗血清型肺炎球菌和對流感嗜血桿菌而言程度相似(圖1)。在PD-綴合物疫苗接種者中流感嗜血桿菌鼻咽攜帶的這種減少支持了以下假設(shè)即使保護(hù)性效力不能與通過ELISA檢測的抗PDIgG免疫應(yīng)答相關(guān)聯(lián)，但是PD-綴合物疫苗仍然具有抗流感嗜血桿菌的直接保護(hù)作用。在以下的實(shí)驗中，使用毛絲鼠(chinchilla)中耳炎模型和來自免疫接種了此實(shí)施例的11價制劑或?qū)嵤├?的IO價疫苗(也參見表1和表2以及下面的注釋)的嬰兒的血清合并液。與免疫前血清合并液比較，兩種血清合并液致使患中耳炎動物的百分比顯著地降低。在10價和ll價免疫合并液之間沒有顯著差異。it^明，兩種疫苗在該才莫型中誘導(dǎo)對抗無法分型流感嗜血桿菌所致中耳炎的保護(hù)作用的潛力相似。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>實(shí)施例4:用于血清型19f的載體蛋白的選擇使用的e;jsa法22F抑制ELISA法基本上基于由Concepcion和Frasch在2001年提議并由Henckaerts等2006，ClinicalandVaccineImmunology13:356-360報道的測定法。筒單地說，將純化的肺炎球菌多糖與甲基化人血清白蛋白混合，并吸附在NuncMaxisorp(Roskilde,DK)高結(jié)合微量滴定板上于4。C過夜。用10。/。胎牛血清(FBS)的PBS溶液在室溫下攪拌1小時以封閉這些板。血清樣品稀釋在含有10%FBS、10pg/mL細(xì)胞壁多糖(SSI)和2ng/mL肺炎球菌多糖血清型22F(ATCC)的PBS中，并用相同緩沖液在微量滴定板上進(jìn)一步稀釋。使用89-SF中的血清型特異性IgG的濃度來針對89-SF校準(zhǔn)的內(nèi)部參比物，用相同的方法處理并包括于每一板上。洗滌以后，使用在10。/。FBS(在PBS中)中稀釋并在室溫在攪拌下溫育i小時的過氧化物酶綴合抗人IgG單克隆抗體(StratechScientificLtd.,Soham,UK)(inPBS)，檢測結(jié)合的抗體。使用現(xiàn)成的單一組分四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶免疫檢測底物試劑盒(BioRad,Hercules,CA，US),在室溫黑暗中進(jìn)行顯色。用0.18MH2S04終止反應(yīng)，在450nm讀取光密度。通過在內(nèi)標(biāo)血清曲線上查閱規(guī)定范圍內(nèi)的光密度點(diǎn)，計算出樣品中血清型特異性IgG的濃度(以jig/mL為單位)，該內(nèi)標(biāo)血清曲線通過用SoftMaxProTM(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)軟件計算的4參數(shù)邏輯斯諦對數(shù)方程建模。考慮到檢測限和定量極限，對于所有血清型ELISA的截留值都是0.05jig/mLIgG。調(diào)理吞噬測定在2003年六月的WHOconsultationmeeting(WHO研討會)上，推薦使用Romero隱Steiner等ClinDiagnLabImmunol200310(6):ppl019-1024所述的OPA測定。在以下試驗中，用該方案測試血清型的OPA活性。^^物的制備在研究11Pn-PD&Di-001與11Pn-PD&Di-007中，包括了三種11價疫苗制劑(表4)，其中是3pg19F多糖與白喉類毒素綴合(19F-DT)，而不是1jxg多糖與D蛋白綴合(19F-PD)。用于研究IIPn-PD、11Pn-PD&Di-001以及11Pn-PD&Di-007的綴合參數(shù)分別在表5、6和7中公開。首次接種這些19F-DT制劑后1個月的抗肺炎球菌抗體應(yīng)答和抗血清型19F的OPA活性分別出示于表8和9。表10顯示了在23價普通多糖增強(qiáng)疫苗接種之前和之后，22F-ELISA抗體濃度和到達(dá)0.2jig/mL閾值的受試者的百分比。通過在初次接種后一個月血清陽性率(調(diào)理吞噬效價^1:8)和OPAGMT更高表明，對于由這些19F-DT制劑誘導(dǎo)的抗體而言，調(diào)理吞噬活性表現(xiàn)出明顯提高(表9)。在增強(qiáng)接種23價普通多糖后一個月，對于初次接種19F-DT制劑的兒童而言，19F抗體的調(diào)理吞噬活性仍顯著更佳(表11)。表12給出了與第4次接種連續(xù)劑量的Prevnat⑧相比較先前初次接種了19F-DT或19F-PD綴合物的學(xué)步兒童再接種11Pn-PD增強(qiáng)劑量之后的免疫原性數(shù)據(jù)。已知在美國引入Prevna漲后報告的突破情況，因此當(dāng)與DT載體蛋白綴合時血清型19F的調(diào)理吞噬活性提高對于候選疫苗可能是優(yōu)點(diǎn)。表13提供了關(guān)于交叉反應(yīng)的血清型19A的19F-DT綴合物的ELISA和OPA數(shù)據(jù)?？梢园l(fā)現(xiàn)19F-DT誘導(dǎo)了低量但顯著的抗19A的OPA活性。表4用于臨床研究的肺炎球菌綴合疫苗制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>表5PS肺炎鏈球菌-D蛋白/TT/DT綴合物的特定活化/偶粉淬滅條件<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>表8初次疫苗接種lfig19F-PD、3pg19F-DT或/Vevmir(2嗎19F-CRM)后一個月，19F抗體濃度^0.20ng/mL的受試者的百分比和19F抗體的幾何平均抗體濃度(95%CI下的GMC;Hg/mL)(總?cè)航M<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>—不同制劑的組成在表4中提供表9初次疫苗接種lfig19F誦PD、3照19F-DT或iVev"flf(2照19F-CRM)后一個月，19FOPA效價^1:8的受試者的百分比和19FOPAGMT(總?cè)航M)<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>表11初次疫苗接種l嗎19F-PD、3嗎19F-DT或/Vewmr(2嗎19F-CRM)的兒童接受23價普通多糖增強(qiáng)劑量之前和之后一個月，19FOPA效價^1:8的受試者的百分比和19FOPAGMT(總?cè)航M)<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>表13初次疫苗接種l嗎19F-PD、3照19F-DT或iVevwar(2fig19F-CRM)后一個月，抗體濃fe0.20ng/mL、0PA^1:8的受試者的百分比和抗19A肺炎球菌的GMC/GMT(總?cè)航M)<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>不同制劑的組成在表4中提供實(shí)施例5:臨床前模型中的佐劑實(shí)驗對老齡恒河猴中肺炎球菌11價多糖綴合物的免疫原性的影響為了優(yōu)化老年人群中針對綴合肺炎球菌疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，GSK用新型佐劑-C佐劑配制了ll價多糖(PS)綴合物疫苗，參見下文。對5只老齡恒河猴(14-28歲)的組別進(jìn)行肌內(nèi)(IM)免疫接種在第0天和第28天，用500(il的吸附在315昭A1P04上的11價PS綴合物或用500^與C佐劑混合的11價PS綴合物接種。兩種疫苗制劑中，每種11價PS綴合物由以下綴合物組成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD，PS18C-PD、PS19F-PD、PS23F-DT和PS6B-DT。所孑吏用疫苗劑量是4要照表6條件(實(shí)施例4)綴合的疫苗的人用劑量的1/5(除了6B[10嗎]以夕卜，每種糖5(xg/人用劑量)，唯有19F按照以下CDAP法條件制備9mg/ml經(jīng)大小調(diào)整的糖，5mg/mPD，起始PD/PS比例為1.2/1，CDAP濃度為0.75mg/mgPS，PHa=pHc=pHq9.0/9.0/9.0，偶聯(lián)時間為60mim。測定在第42天收集的血清中的抗PSELISAIgG水平和調(diào)理吞噬效價。通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(Elispot)由在第42天收集的外周血細(xì)胞測量抗PS3恒河猴B細(xì)胞的頻率。根據(jù)以下出示的結(jié)果，相對于采用A1P04的綴合物的免疫原性而言，C佐劑顯著地改進(jìn)了老齡恒河猴中的11價PS綴合物的免疫原性。該新型佐劑增強(qiáng)了抗PS的IgG應(yīng)答(圖l)和調(diào)理吞噬抗體效價(表14)。還有支持性證據(jù)表明，PS3特異性記憶B細(xì)胞的頻率由于C佐劑的使用而升高(圖2)。表14，老齡恒河猴中綴合物的免疫原性(第二次接種后(post-II)調(diào)理吞噬效價)<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>B細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(Elispot)該測定的原理依賴于以下事實(shí)在用CpG培養(yǎng)5天后，記憶B細(xì)胞在體外成熟為漿細(xì)胞。體外產(chǎn)生的抗原特異性漿細(xì)胞可以容易地檢測，并且因此可以使用B細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法計數(shù)。特異性漿細(xì)胞的數(shù)量反映在開始培養(yǎng)時的記憶B細(xì)胞頻率。筒要地說，體外產(chǎn)生的漿細(xì)胞在包被了抗原的培養(yǎng)平板中溫育?？乖禺愋缘臐{細(xì)胞形成抗體"元原斑點(diǎn)，后者通過傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫步驟檢測并被計作是記憶B細(xì)胞。在該研究中，已經(jīng)用多糖包被培養(yǎng)平板，以計算各自的記憶B細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果以1百萬個記憶B細(xì)胞中的PS特異性記憶B細(xì)胞的頻率來表示。研究表明，C佐劑能夠緩解已知的PS3增強(qiáng)能力的問題(參見5thInternationalSymposiumonPneumococciandPneumococcalDisease,April2-62006,AliceSprings,CentralAustralia.Specificitiesofimmuneresponsesagainstaserotype3Pneumococcalconjugate(抗血清型3肺炎球菌綴合物的免疫應(yīng)答的特異性).SchuermanL，PrymulaR,PoolmanJ.Abstractbookp245,PO10.06)。實(shí)施例6，去毒型肺炎球菌溶血素(dPIy)作為蛋白載體增強(qiáng)幼齡Balb/c小鼠中PS19F的免疫原性的效力對40只雌性Balb/c小鼠(4周齡)的組別進(jìn)行IM免疫在第0、14和28天，用50jil4價普通PS或4價dPly-綴合的PS,兩者都與C佐劑混合。兩種疫苗制劑都由0.1(ig0唐量)的以下PS中的每一種組成PS8、PS12F、PS19F和PS22F。在第42天收集的血清中測定抗PSELISAIgG水平。如圖3中所例示的，與接種了普通PS的小鼠相比，給予了4價dPly綴合物的小鼠中抗PS19F應(yīng)答得到強(qiáng)烈地提高。觀察到抗PS8、12F和22FIgG應(yīng)答有同樣的改善(凄a居未出示)。實(shí)施例7，肺炎球菌組氨酸三聯(lián)體D蛋白(PhtD)作為蛋白載體增強(qiáng)幼齡Balb/c小鼠中PS22F的免疫原性的效力對40只雌性Balb/c小鼠(4周齡)的組別進(jìn)行IM免疫在第0、14和28天，用50|il4價普通PS或4價PhtD-綴合的PS，兩者都與C佐劑混合。兩種疫苗制劑都由各O.&g(糖量)的以下綴合物組成PS8、PS12F、PS19F和PS22F。在第42天收集的血清中測定抗PSELISAIgG水平。如圖4中所例示的，與接種了普通PS的小鼠相比，給予了4價PhtD綴合物的小鼠中抗PS22F應(yīng)答得到強(qiáng)烈地提高。觀察到抗PS8、12F和19FIgG應(yīng)答有同樣的改善(數(shù)據(jù)未出示)。實(shí)施例8,含有19A-dPly和22F-PhtD的13價PS綴合物在老齡C57BI小鼠中的免疫原性對30只老齡C57BI小鼠(>69周齡)的組別進(jìn)行IM免疫在第0、14和28天，用50^11價PS綴合物或13價PS綴合物，兩者都與C佐劑混合(參見下文)。11價疫苗制劑由各O.l嗎糖量的以下綴合物組成PS1-PD、PS3誦PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1以及表2下面討論的關(guān)于11價疫苗的評述)。13價疫苗制劑另外還含有0.1昭PS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1以及表2下面討論的關(guān)于13價疫苗的注釋[使用直接綴合的22F])。在組2和組4中，用GMBS處理使肺炎球菌溶血素載體去毒，在組3和組5中，用曱醛去毒。在組2和組3中，用PhtD綴合PS22F，在組4和組5中，使用了PhtD—E融合體(構(gòu)建體VP147，來自WO03/054007),在組6中，19A與白喉類毒素綴合，而22F與D蛋白綴合。在第42天收集的各個血清中測定抗PS19A和22F的ELISAIgG水平。檢測合并血清中針對其它PS產(chǎn)生的ELISAIgG應(yīng)答。在13價綴合疫苗制劑內(nèi)施用的19A-dPly和22F-PhtD在老齡C57BI小鼠中表現(xiàn)出免疫原性(表15)。與接受了11價制劑的小鼠相比，在接受了13價制劑的小鼠中針對其他PS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答沒有受到負(fù)面影響。表15，老齡C57BI小鼠中PS的免疫原性(第三次接種后(post-IU)的IgG水平)<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>22FGMCNR5.813.760.540.852.02IC3.2-10.61.8-7.90.3-1.10.4-1.71.2-3.4%血清0%97%90%77%87%97%實(shí)施例9，含有19A-dPly和22F-PhtD的13價PS綴合物在幼齡Balb/c小鼠中的免疫原性對30只幼齡Balb/c小鼠(4周齡)的組別進(jìn)行肌內(nèi)(IM)免疫在第0、14和28天，用50^ll價PS綴合物或13價PS綴合物，兩者都與C佐劑混合(參見下文)。11價疫苗制劑由各O.l嗎糖量的以下綴合物組成PS1-PD、PS3-PD、PS4曙PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1以及表2下面討論的關(guān)于11價疫苗的注釋)。13價疫苗制劑另外還含有0.1昭PS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表1以及表2下面討論的關(guān)于13價疫苗的注釋[使用直接綴合的22F])。在組2和組4中，用GMBS處理使肺炎球菌溶血素載體去毒，在組3和組5中，用曱醛去毒。在組2和組3中，用PhtD綴合PS22F,在組4和組5中，使用了PhtD—E融合體(構(gòu)建體VP147，來自WO03/054007),在組6中，19A與白喉類毒素綴合，而22F與D蛋白綴合。在第42天收集的各個血清中測定抗PS19A和22F的ELISAIgG水平。檢測合并血清中針對其它PS產(chǎn)生的ELISAIgG應(yīng)答。在13價綴合疫苗制劑中施用的19A-dPly和22F-PhtD在幼齡Balb/c小鼠中表現(xiàn)出免疫原性(表16)。與接受了11價制劑的小鼠相比，接受了13價制劑的小鼠中針對其他PS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答沒有受到負(fù)面影響。表16，幼齡Balb/c小鼠中PS的免疫原性(第三次接種后的IgG水平)<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>實(shí)施例10，含有19A-dPly和22F-PhtD的13價PS綴合物在豚鼠中的免疫原性對20只幼齡豚鼠(Hartley品系；5周齡)的組別進(jìn)行IM免疫接種在第0、14和28天，用125plll價PS綴合物或13價PS綴合物，兩者都與C佐劑混合(參見下文)。11價疫苗制劑由各0.25嗎糖量的以下綴合物組成PS1-PD、PS3-PD、PS4國PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F國PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(參見表1以及表2下面討論關(guān)于的11價疫苗的注釋)。13價疫苗制劑另外還含有0.1嗎PS19A-dPly和PS22F-PhtD綴合物(參見表l以及表2下面討論的13價疫苗的注釋[使用直接綴合的22F])。在組2和組4中，用GMBS處理使肺炎球菌溶血素栽體去毒，在組3和組5中，用曱醛去毒。在組2和組3中，用PhtD綴合PS22F，在組4和組5中，使用了PhtD—E融合體(構(gòu)建體VP147,來自WO03/054007)，在組6中，19A與白喉類毒素綴合，而22F與D蛋白綴合。在第42天收集的各個血清中測定抗PS19A和22F的ELISAIgG水平。檢測合并血清中針對其它PS產(chǎn)生的ELISAIgG應(yīng)答。表17，幼齡Balb/c小鼠中PS免疫原性(第三次接種后IgG的水平)<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>實(shí)施例11:制備和檢測的制劑a)制備以下制劑(使用表1的13價疫苗和表5的血清型3-參見表2下面討論的關(guān)于14價疫苗的注釋[使用直接綴合的22F或通過ADH接頭])。如下面所示的，糖與磷酸鋁和3D-MPL—起配制。<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>b)用每種以下的佐劑對相同的糖制劑進(jìn)行佐劑化:-下表中出示了每500pl劑量的乳劑組分的濃度。佐劑A1佐劑A2佐劑A3成分250^1o/w125)alo/w50|alo/w乳劑乳劑乳劑a-生育酚11.88mg5.94mg2.38mg角鯊烯10.7mg5.35mg2.14mg吐溫804.85mg2.43mg0.97mg佐劑A4佐劑A5佐劑A6佐劑A7成分250^1o/w250^1o/w125|alo/w50(xlo/w乳劑乳劑禮劑乳劑a-生育酚U.88mgn.88mg5.94mg2.38mg角鯊烯10.7mg10.7mg5.35mg2.14mg吐溫804.85mg4.85mg2.43mg0.97mg3D-MPL50pg25Hg25pgIO嗎c)糖還與兩種基于脂質(zhì)體的佐劑一起配制:佐劑Bl的組成定性定量(每0,5mL劑量)脂質(zhì)體-DOPC1mg國膽固酉孚0.25mg3DMPL50QS2150ngKH2P04,3.124mg緩沖液Na2HP04!0.290mg緩沖液NaCl2.922mg(100mM)WFIq.s.ad0.5ml溶劑pH6.11.總P04濃度=50mM佐劑B2的組成定性定量(每0，5mL劑量)脂質(zhì)體-DOPC0.5mg-膽固醇0.125mg3DMPL25jigQS2125KH2P0413.124mg緩沖液Na2HP04!0.290mg緩沖液NaCl2.922mg(100mM)麗q.s.ad0.5ml溶劑pH6.1d)糖還與C佐劑"^J己制(參見-bil中已經(jīng)用此佐劑的^^i且合物)定性定量(每O.SmL劑量)水包油乳劑50^1-角鯊烯2.136mg曙a-生育酚2.372mg-吐溫訓(xùn).97mg隱膽固醇0.1mg3DMPL50嗎QS2150嗎KH2P04、0.470mg緩沖液Na2HP04,0.219mg緩沖液NaCl4.003mg(137mM)KC10.101mg(2.7mM)麗q.s.ad0.5ml溶劑pH6.8實(shí)施例12，綴合化學(xué)對Balb/c小鼠中22F-PhtD綴合物的免疫原性的影響對30只雌性Balb/c小鼠的組別進(jìn)行肌內(nèi)(IM)途徑免疫接種在第0、14和28天，用含有PS1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的13價PS制劑(劑量對于PS4、18C、19A、19F和22F是0.3嗎糖/綴合物，而對于其他PS是O.l嗎糖/綴合物)。PS18C與破傷風(fēng)類毒素綴合，19F與白喉類毒素綴合，19A與曱醛去毒型Ply綴合，22F與PhtD綴合，而其他的PS與PD綴合。比較了由通過直接CDAP化學(xué)制備的22F-PhtD或由22F-AH-PhtD(ADH衍生化的PS)組成的兩種制劑。參見實(shí)施例2、表1以及表2下有關(guān)用22F直接綴合或通過ADH間隔物制備的13^f介疫苗特征的注釋。所述疫苗制劑補(bǔ)充了C佐劑。抗PS22FELISAIgG水平和調(diào)理吞噬效價在第42天收集的血清中才企測。根據(jù)兩者的IgG水平(圖5)和調(diào)理吞噬效價(圖6),22F-AH-PhtD表現(xiàn)出遠(yuǎn)高于22F-PhtD的免疫原性。實(shí)施例13.新型佐劑對肺炎鏈球菌莢膜PS綴合物的免疫原性的影響對40只雌性Balb/c小鼠的組別進(jìn)行IM途徑的免疫接種在第0、14和28天，用含有PS1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的13價PS制劑(劑量對于PS4、18C、19A、19F和22F是0.3jig糖/綴合物，而對于其他PS是0.1嗎糖/綴合物)。PS18C與破傷風(fēng)類毒素綴合，19F與白喉類毒素綴合，19A與曱醛去毒型Ply綴合，22F與PhtD綴合，而其他的PS與PD綴合。參見實(shí)施例2、表1以及表2下有關(guān)用直接綴合的22F配制的13價疫苗特征的注釋。比較了補(bǔ)充A1P04、佐劑A1、佐劑A4或佐劑A5的四種制劑。檢測在第42天收集的和每組合并的血清中抗PS、Ply、PhtD和PD的ELISAIgG水平。對每種抗原計算以下比例用所測試的新型佐劑誘導(dǎo)的IgG水平/用A1P04誘導(dǎo)的IgG水平。與典型的A1P04制劑相比，測試的所有新型佐劑使對13價綴合物的免疫應(yīng)答提高至少2倍(圖7)。實(shí)施例14，肺炎球菌猴脒炎模型中的PhtD/去毒型Plv組合的保護(hù)功逸6只恒河猴(3-8歲)的組別，選其作為具有最低預(yù)先存在的抗19F抗體水平的組，進(jìn)行肌內(nèi)免疫接種在第0和28天，使用11價PS鄉(xiāng)炎合物(即lpgPS1、3、5、6B、7F、9V、14和23F，3jxgPS4、18C和19F[的糖])或PhtD(10嗎)+曱趁去毒型Ply(10嗎)或單獨(dú)佐劑。PS18C與石皮傷風(fēng)類毒素綴合，19F與白喉類毒素綴合，而其他的PS與PD綴合。參見實(shí)施例2、表l以及表2下有關(guān)ll價疫苗特征的注釋。所有制劑都補(bǔ)充了C佐劑。在第42天將19F型肺炎5求菌(5.108cfli)接種至右肺。計數(shù)在攻擊后第l、3和7天收集的支氣管肺泡灌洗液中的菌落。結(jié)果通過攻擊后第七天每組中死亡、建群的^^部或清除了病菌的動物的數(shù)量來表示。如圖8中所示，與單獨(dú)使用佐劑的組相比，用ll價綴合物和PhtD+dPly組合獲得了接近統(tǒng)計顯著性(盡管所用的動物數(shù)量少)的良好的保護(hù)作用(p〈0.12，F(xiàn)isher確切檢驗)。實(shí)施例15，綴合化學(xué)法對由22F-PhtD綴合物誘導(dǎo)的抗4型攻擊的抗PhtD抗體應(yīng)答和保護(hù)效力的影響。20只雌性O(shè)F1小鼠的組別通過肌內(nèi)途徑進(jìn)行免疫接種在第0天和第14天，使用3嗎的22F-PhtD(通過直接CDAP化學(xué)制備)、或22F-AH-PhtD(ADH衍生化的PS)、或者單獨(dú)的佐劑。兩種單價22F綴合物通過實(shí)施例2的方法制備(同樣見表1以及表2)。每種制劑都補(bǔ)充了c佐劑?？筆htD的ELISAIgG水平在第27天收集的血清中檢測。在第28天用5.10、fU的4型肺炎球菌鼻內(nèi)攻擊小鼠(即未被所測試的疫苗制劑中存在的PS潛在地覆蓋的肺炎球菌血清型)。監(jiān)測導(dǎo)致的死亡率，直到攻擊后第8天。22F-AH-PhtD比22F-PhtD誘導(dǎo)出顯著更高的抗PhtDIgG應(yīng)答和更好的針對4型攻擊的保護(hù)作用。權(quán)利要求1.一種用于嬰兒的免疫原性組合物，其包含多價肺炎鏈球菌疫苗，所述多價肺炎鏈球菌疫苗包含2種或更多種(例如7、8、9、10、11、12、13、14、15種)來自不同血清型的莢膜糖綴合物，其中所述組合物包含血清型22F糖綴合物。2.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其包含來自血清型19A和/或19F的肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物。3.權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物，其包含來自血清型19A和19F的肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物，其中19A與作為第一細(xì)菌類毒素的載體蛋白綴合，而19F與第二細(xì)菌類毒素綴合。4.權(quán)利要求3的免疫原性組合物，其中第一細(xì)菌類毒素是與第二細(xì)菌類毒素不同的蛋白質(zhì)。5.權(quán)利要求3或4的免疫原性組合物，其中第一細(xì)菌類毒素選自破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、CRM197、百日咳類毒素、細(xì)菌溶細(xì)胞素和肺炎球菌溶血素。6.權(quán)利要求3-5中任一項的免疫原性組合物，其中第二細(xì)菌類毒素選自破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、CRM197、百日咳類毒素、細(xì)菌溶細(xì)胞素和肺炎球菌溶血素。7.權(quán)利要求3-6中任一項的免疫原性組合物，其中第一細(xì)菌類毒素是肺炎球菌溶血素。8.權(quán)利要求3-7中任一項的免疫原性組合物，其中第二細(xì)菌類毒素是白喉類毒素。9.權(quán)利要求1-8中任一項的免疫原性組合物，其還包含肺炎鏈球菌莢膜糖4、6B、9V、14、18C和23F的綴合物。10.權(quán)利要求1-9中的免疫原性組合物，其還包含肺炎鏈球菌莢膜糖1、5和7F的綴合物。11.權(quán)利要求1-10中的免疫原性組合物，其還包含肺炎鏈球菌莢膜糖3綴合物。12.權(quán)利要求1-11的免疫原性組合物，其還包含肺炎鏈球菌莢膜糖6A綴合物。13.權(quán)利要求1-12中任一項的免疫原性組合物，其中2種不同的載體蛋白分別與至少2種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型綴合。14.權(quán)利要求1-12中任一項的免疫原性組合物，其中3種不同的載體蛋白分別與至少3種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型綴合。15.權(quán)利要求1-12中任一項的免疫原性組合物，其中4種不同的載體蛋白分別與至少4種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型綴合。16.權(quán)利要求1-12中任一項的免疫原性組合物，其中5種或更多種不同的載體蛋白分別與至少5種不同的肺炎鏈球菌莢膜糖血清型綴合。17.權(quán)利要求13-16的免疫原性組合物，其包含2種或更多種選自以下列舉的載體蛋白破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、肺炎球菌溶血素、D蛋白和PhtD或其融合蛋白。18.權(quán)利要求1-17的免疫原性組合物，其包含與D蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖1。19.權(quán)利要求1-18的免疫原性組合物，其包含與D蛋白、肺炎球菌溶血素或PhtD或其融合蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖3。20.權(quán)利要求1-19的免疫原性組合物，其包含與D蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖4。21.權(quán)利要求1-20的免疫原性組合物，其包含與D蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖5。22.權(quán)利要求1-21的免疫原性組合物，其包含與D蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖6B。23.權(quán)利要求1-22的免疫原性組合物，其包含與D蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖7F。24.權(quán)利要求1-23的免疫原性組合物，其包含與D蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖9V。25.權(quán)利要求1-24的免疫原性組合物，其包含與D蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖14。26.權(quán)利要求1-25的免疫原性組合物，其包含與D蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖23F。27.權(quán)利要求l-26的免疫原性組合物，其包含與破傷風(fēng)類類毒素綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖18C。28.權(quán)利要求l-27的免疫原性組合物，其包含與肺炎球菌溶血素綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖19A。29.權(quán)利要求1-28的免疫原性組合物，其包含與PhtD或其融合蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖22F。30.權(quán)利要求l-29的免疫原性組合物，其包含與肺炎球菌溶血素或流感嗜血桿菌蛋白綴合、任選與D蛋白或PhtD或其融合蛋白綴合的肺炎鏈球菌莢膜糖6A。31.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其包含與載體蛋白直接綴合的莢膜糖19A。32.權(quán)利要求1-30中任一項的免疫原性組合物，其中19A莢膜糖通過接頭與載體蛋白綴合。33.權(quán)利要求32的免疫原性組合物，其中所述接頭是ADH。34.權(quán)利要求32或33中的免疫原性組合物，其中所述接頭通過碳二亞胺化學(xué)與載體蛋白連接，優(yōu)選使用EDAC。35.權(quán)利要求31-34中任一項的免疫原性組合物，其中使用CDAP化學(xué)，使糖19A與載體蛋白或與接頭綴合。36.權(quán)利要求1-35中任一項的免疫原性組合物，其包含血清型19A的綴合物，其中載體蛋白乂于糖19A的比例為5:1-1:5、4:1-1:1或3.5:1-2.5:1(w/w)。37.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其包含與載體蛋白直接綴合的19F莢膜糖。38.權(quán)利要求1-36中任一項的免疫原性組合物，其中19F莢膜糖通過接頭與載體蛋白綴合。39.權(quán)利要求38的免疫原性組合物，其中接頭是ADH。40.權(quán)利要求38或39的免疫原性組合物，其中通過碳二亞胺化學(xué)使接頭與載體蛋白連接，優(yōu)選使用EDAC。41.權(quán)利要求37-40中任一項的免疫原性《且合物，其中^f吏用CDAP化學(xué)使19F糖與載體蛋白或與接頭綴合。42.權(quán)利要求1-41中任一項的免疫原性組合物，其包含19F糖綴合物，其中載體蛋白對19F糖的比例為5:1-1:5、4:1-1:1或2:1-1:1(w/w)，或者為1.5:1-1.4:1。43.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其包含與載體蛋白直接綴合的22F莢膜糖。44.權(quán)利要求l-42中任一項的免疫原性組合物，其包含通過接頭與載體蛋白綴合的22F莢膜糖。45.權(quán)利要求44的免疫原性組合物，其中接頭是ADH。46.權(quán)利要求44或45的免疫原性組合物，其中通過碳二亞胺化學(xué)使接頭載體蛋白連接，優(yōu)選使用EDAC。47.權(quán)利要求43-46中任一項的免疫原性組合物，其中使用CDAP化學(xué)使22F糖與載體蛋白或與接頭綴合。48.權(quán)利要求1-47中任一項的免疫原性組合物，其包含22F糖綴合物，其中載體蛋白對22F糖的比例為5:1-1:5、4:1-1:1或2:1-1:1(w/w)。49.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其包含19A糖綴合物，其中19A糖的平均大小(例如Mw)高于100kDa。50.權(quán)利要求49的免疫原性組合物，其中19A糖的平均大小(例如Mw)為50-800kDa、110-700kDa、110-300、120-200、130-180或在140-160kDa。51.權(quán)利要求49或50的免疫原性組合物，其中19A糖是天然多糖或經(jīng)大小調(diào)整不超過x5。52.權(quán)利要求49-51的免疫原性組合物，其中19A糖通過微射流法而調(diào)整大小。53.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其包含血清型19A糖綴合物，其中19A糖綴合物的劑量為1-lOjig、l-5嗎、1-3(ig糖。54.權(quán)利要求53的免疫原性紐_合物，其中19A糖綴合物的劑量是3嗎糖。55.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其包含22F糖綴合物，其中22F糖的平均大小(例如Mw)高于100kDa。56.權(quán)利要求55的免疫原性組合物，其中22F糖的平均大小(例如MJ為50-800kDa、110-700kDa、110-300、120-200、130-180或150-170kDa。57.權(quán)利要求55或56的免疫原性組合物，其中22F糖是天然多糖或經(jīng)大小調(diào)整不超過x5。58.權(quán)利要求55-57中的免疫原性組合物，其中22F糖通過微射流法而調(diào)整大小。59.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其包含血清型22F糖綴合物，其中22F糖綴合物的劑量為1-10(ig、1-5昭、或1-3(ig糖。60.權(quán)利要求59的免疫原性組合物，其中22F糖綴合物的劑量是3嗎糖。61.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其中所述糖的平均大小(例如Mw)高于50kDa，例如50-1600、80-1400、100-1000、150-500、或200-400kDa。62.權(quán)利要求61的免疫原性組合物，所述免疫組合物包含平均糖大小(例如Mw)為100-1000、200-800、250-600或300-400kDa的血清型1(糖綴合物)。63.權(quán)利要求61或62的免疫原性組合物，其包含平均糖大小(例如MJ為50-500、60-300、70-200或75-125kDa的血清型4(糖綴合物)。64.權(quán)利要求61-63的免疫原性組合物，其包含平均糖大小(例如Mw)為100-1000、200-700、300-500或350-450kDa的血清型5(糖綴合物)。65.權(quán)利要求61-64中任一項的免疫原性組合物，其包含平均糖大小(例如Mw)為500一1600、750-1500或1000-1400kDa的血清型6B(糖綴合物)。66.權(quán)利要求61-65中任一項的免疫原性組合物，其包含平均糖大小(例如Mw)為50-1000、100-750、150-500或200-300kDa的血清型7F(糖綴合物)。67.權(quán)利要求61-66中任一項的免疫原性組合物，其包含平均糖大小(例如Mw)為50-1000、100-750、150-500、200-400、或250-300kDa的血清型9V(糖綴合物)。68.權(quán)利要求61-67中任一項的免疫原性組合物，其包含平均糖大小(例如Mw)為50-1000、100-750、150-500或200-250kDa的血清型14(糖綴合物)。69.權(quán)利要求61-68中任一項的免疫原性組合物，其包含平均糖大小(例如Mw)為500-1500,700-1300、800-1100或900一1000kDa的血清型23F(糖綴合物)。70.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其包含作為天然糖的血清型5、6B和23F(和任選的6A)。71.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其中莢膜糖綴合物的劑量為1-10昭、l-5昭或l-3pg糖/綴合物。72.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其包含劑量為3嗎糖/綴合物的血清型4、18C、19F和22F(和任選的19A)的綴合物。73.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其包含劑量為l嗎糖/綴合物的血清型1、5、6B、7F、9V、14和23F(和任選的6A和/或3)的綴合物。74.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其還包含血清型不同于綴合型糖的未綴合型肺炎鏈3求菌糖，這致使綴合型糖和未綴合型糖的血清型少于或等于23種。75.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其還包含一種或更多種未綴合型或綴合型肺炎鏈球菌蛋白。76.權(quán)利要求75的免疫原性組合物，其包含一種或更多種未綴合型肺炎鏈球菌蛋白。77.權(quán)利要求75或76的免疫原性組合物，其中所述一種或更多種肺炎鏈球菌蛋白選自多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、去毒型肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、Spl01、Spl30、Spl25和Sp133。78.權(quán)利要求75-77的免疫原性組合物，其包含肺炎球菌溶血素。79.權(quán)利要求75-78中任一項的免疫原性組合物，其包含PhtX蛋白。80.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其包含作為游離蛋白或載體蛋白的肺炎球菌溶血素。81.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其包含作為游離蛋白或載體蛋白的PhtX蛋白。82.權(quán)利要求81的免疫原性組合物，其中所述PhtX蛋白是PhtD或PhtBD或PhtDE融合蛋白。83.任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，其還包含佐劑。84.權(quán)利要求83的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含脂質(zhì)體載體。85.權(quán)利要求84的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含(每0.5mL劑量)0.1-10mg、0.2—7、0.3—5、0.4-2或0.5-1mg(例如0.4-0.6、0.9—1.1、0.5或1mg)石粦月旨"列^口DOPC)。86.權(quán)利要求84或85的免疫原性組合物，其中佐劑包含(每0.5mL劑量)0.025—2.5、0.05—1.5、0.075-0.75、0.1—0.3或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3、0,1-0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如膽固醇)。87.權(quán)利要求84-86的免疫原性組合物，其中佐劑包含(每0.5mL劑量)5—60、10—50或20-30jag(例^口5—15、40—50、10、20、30、40或50嗎)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。88.要求84-87中的免疫原性組合物權(quán)利，其中佐劑包含(每0.5mL劑量)5—60、10—50或20—30pg(例^口5—15、40—50、10、20、30、40或50嗎)皂苦(例如QS21)。89.權(quán)利要求83的免疫原性組合物，其中佐劑包含水包油乳劑。90.權(quán)利要求89的免疫原性組合物，其中佐劑包含(每0.5mL劑量)0.5-15、1-13、2-11、4-8、或5-6mg(例如2-3、5-6或10-11mg)可代謝油(例如角豊烯)。91.權(quán)利要求89或90的免疫原性組合物，其中佐劑包含(每0.5mL劑量)O.l-lO、0.3—8、0.6-6、0.9-5、1-4或2-3mg(例如0.9-1.1、2-3或4-5mg)乳化劑(例如吐溫80)。92.權(quán)利要求89-91的免疫原性組合物，其中佐劑包含(每0.5mL劑量)0.5-20、1-15、2-12、4-10、5—7mg(例如11-13、5-6、或2-3mg)母育酚(例如a-生育酚)。93.權(quán)利要求89-92中的免疫原性組合物，其中佐劑包含(每0.5mL劑量)5—60、10—50或20—30pg(舍B口5—15、40—50、10、20、30、40或50嗎)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。94.權(quán)利要求89-93中的免疫原性組合物，其中佐劑包含(每0.5mL劑量)0.025-2.5、0.05—1.5、0.075—0.75、0.1—0.3或0.125—0.25mg(例如0.2-0.3、0.1—0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如膽固醇)。95.權(quán)利要求89-94中的免疫原性組合物，其中佐劑包含(每0.5mL劑量)5—60、10—50或20—30(igCf歹'B口5—15、40—50、10、20、30、40或50嗎)皂苦(例如QS21)。96.權(quán)利要求83的免疫原性組合物，其中佐劑包含金屬鹽和脂質(zhì)A書f生物。97.權(quán)利要求％的免疫原性組合物，其中佐劑包含(每0.5mL劑量)100-750、200-500或300-400嗎作為磷酸鋁的AI。98.權(quán)利要求96或97的免疫原性組合物，其中佐劑包含(每0.5mL齊'1量)5—60、10—50或20—30pg(例d(口5—15、40—50、10、20、30、40或50嗎)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。99.一種疫苗藥盒，其包舍權(quán)利要求1-82中任一項的免疫原性組合物，并還包含伴隨地或序貫地施用的如權(quán)利要求83-98中任一項所定義的佐劑。100.—種疫苗，其包含權(quán)利要求1-98中任一項的免疫原性組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。101.—種制備權(quán)利要求100的疫苗的方法，其包括將權(quán)利要求1-98中任一項的免疫原性組合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑混合的步驟。102.—種免疫人類宿主以4氐雄卩由肺炎鏈球菌(S^e/7tococc^;wewmom'ae)感染引起的疾病的方法，其包括給予宿主免疫保護(hù)劑量的權(quán)利要求1-98中任一項的免疫原性組合物或權(quán)利要求100的疫苗。103.權(quán)利要求102的方法，其中所述人類宿主是老年人，而所述疾病是肺炎或侵入性肺炎球菌疾病(IPD)中的任一種或這兩者。104.權(quán)利要求102或103的方法，其中所述人類宿主是老年人，而所述疾病是慢性阻塞性肺病(COPD)加重。105.權(quán)利要求102的方法，其中所述人類宿主是嬰兒，而所述疾病是中耳炎。106.權(quán)利要求102或105的方法，其中所述人類宿主是嬰兒，而所述疾病是腦膜炎和/或菌血癥。107.權(quán)利要求102、105或106的方法，其中所述人類宿主是嬰兒，而所述疾病是肺炎和/或結(jié)膜炎。108.權(quán)利要求1-98中的免疫原性組合物或權(quán)利要求100的疫苗，其用于治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染引起的疾病。109.權(quán)利要求1-98中的免疫原性組合物或權(quán)利要求100的疫苗在制備用于治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。110.權(quán)利要求109的應(yīng)用，其中所述疾病是老年人肺炎或侵入性肺炎球菌疾病(IPD)中的任一種或這兩者。111.權(quán)利要求109或110的應(yīng)用，其中所述疾病是老年人慢性阻塞性肺病(COPD)加重。112.權(quán)利要求109的應(yīng)用，其中所述疾病是人類嬰兒的中耳炎。113.權(quán)利要求109或112的應(yīng)用，其中所述疾病是人類嬰兒的腦膜炎和/或菌血癥。114.權(quán)利要求109、112或113的應(yīng)用，其中所述疾病是人類嬰兒的肺炎和/或結(jié)膜炎。115.—種在嬰兒中誘導(dǎo)抗中耳炎保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所方法包括序貫或伴隨地施用作為分開的或聯(lián)合的以下組分(i)權(quán)利要求1-98中任一項的免疫原性組合物或疫苗，和(ii)來自流感嗜血桿菌的D蛋白，其中D蛋白可以是游離的和/或綴合的。116.—種通過施用任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物或疫苗，誘導(dǎo)對嬰兒的抗肺炎鏈球菌保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法。117.—種通過聯(lián)合、序貫或伴隨地施用以下組分誘導(dǎo)老年人的抗肺炎鏈球菌保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法(i)任一前述權(quán)利要求的免疫原性組合物，(ii)一種或更多種選自PhtX家族和肺炎球菌溶素的肺炎鏈球菌表面蛋白。118.權(quán)利要求1-98的免疫原性組合物或權(quán)利要求100的疫苗，其包含來源于至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F，其中在人類疫苗接種者中針對疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F中的一種或更多種的GMC抗體效價并不顯著地劣于由Prevnar⑧疫苗誘導(dǎo)的抗體效價。119.權(quán)利要求118的免疫原性組合物，其中在人類疫苗4秦種者中針對血清型4的GMC抗體效《介并不顯著地劣于由Prevnar⑧疫苗誘導(dǎo)的抗體效價。120.權(quán)利要求118或119的免疫原性組合物，其中在人類疫苗接種者中針對血清型6B的GMC抗體效價并不顯著地劣于由Prevnar疫苗誘導(dǎo)的抗體效價。121.權(quán)利要求118-120的免疫原性組合物，其中在人類疫苗接種者中針對血清型9V的GMC抗體效價并不顯著地劣于由Prevnai^疫苗誘導(dǎo)的抗體效價。122.權(quán)利要求118-121的免疫原性組合物，其中在人類疫苗接種者中針對血清型14的GMC抗體效價并不顯著地劣于由Prevna漲疫苗誘導(dǎo)的抗體效價。123.權(quán)利要求118-122的免疫原性組合物，其中在人類疫苗接種者中針對血清型18C的GMC抗體效價并不顯著地劣于由Prevnar⑧疫苗誘導(dǎo)的抗體效價。124.權(quán)利要求118-123的免疫原性組合物，其中在人類疫苗接種者中針對血清型19F的GMC抗體效價并不顯著地劣于由Prevnar⑧疫苗誘導(dǎo)的抗體效價。125.權(quán)利要求118-124的免疫原性組合物，其中在人類疫苗接種者中針對血清型23F的GMC抗體效價并不顯著地劣于由Prevnar⑧疫苗誘導(dǎo)的抗體效價。126.權(quán)利要求118-125的免疫原性組合物，其包含血清型3糖綴合物。127.權(quán)利要求118-126的免疫原性組合物，其包含血清型6A糖綴合物。128.權(quán)利要求118-127的免疫原性組合物，其包含血清型19A糖綴合物。129.權(quán)利要求118-128的免疫原性組合物，其包含血清型22F糖綴合物。130.—種免疫組合物，其包含至少四種肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物，所述綴合物含有來自不同的肺炎鏈球菌血清型的糖，其中至少一種糖與PhtD或其融合蛋白綴合，所述免疫原性組合物能夠誘導(dǎo)抗PhtD的有效免疫應(yīng)答。131.—種預(yù)防老年人類宿主患由肺炎鏈球菌血清型22F感染引起的肺炎球菌疾病(或降低所迷疾病的嚴(yán)重程度)的方法，所述方法包括給予嬰兒宿主(或嬰兒人群)免疫保護(hù)劑量的權(quán)利要求1-98中任一項的免疫原性組合物或權(quán)利要求100的疫苗。132.權(quán)利要求131的方法，其中所述疾病^IJ申炎或侵入性肺炎疾病(IPD)中的任一種或這兩者。133.權(quán)利要求131或132的方法，其中所述疾病是慢性阻塞性肺病(COPD)加重。134.權(quán)利要求1-98中的免疫原性組合物或權(quán)利要求100的疫苗在制備用于預(yù)防老年患者中由血清型22F肺炎鏈球菌感染引起的疾病或減緩所述疾病嚴(yán)重程度的藥物中的應(yīng)用，其中將免疫保護(hù)劑量的所述組合物或疫苗施用于嬰兒(或嬰兒人群)。135.權(quán)利要求134的應(yīng)用，其中所述疾病是老年人肺炎或侵入性肺炎疾病(IPD)中的任一種或這兩者。136.權(quán)利要求134或135的應(yīng)用，其中所述疾病是老年人慢性阻塞性肺病(COPD)加重。全文摘要本發(fā)明屬于肺炎球菌莢膜糖綴合物疫苗的領(lǐng)域。具體地說，提供了用于嬰兒的免疫原性組合物，其包含多價肺炎鏈球菌綴合疫苗，所述多價肺炎鏈球菌綴合疫苗包含2種或更多種來自不同血清型的莢膜糖綴合物，其中該組合物包含血清22F糖綴合物。此疫苗可以用于嬰兒人群以減少老年肺炎球菌疾病的發(fā)病率，例如COPD加重和/或IPD。文檔編號A61K39/09GK101378779SQ200680053139公開日2009年3月4日申請日期2006年12月20日優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日發(fā)明者J·普爾曼,M·P·范梅歇倫,N·M·-J·加孔,P·V·赫爾曼德,R·L·比曼斯申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司