專利名稱：：采用降低的溫度產(chǎn)生樹突細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)抗惡性腫瘤和感染疾病的免疫反應(yīng)的方法和裝置。更具體地，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生抗原呈遞細(xì)胞的改良方法。
背景技術(shù)：
：利用抗原呈遞自然機(jī)制的基于樹突細(xì)胞的免疫療法代表了最有前景的非毒性癌癥治療方法。其可以作為單獨(dú)治療，或者作為其他類型療法(例如外科手術(shù)、放射和化療)的輔助。該策略基于細(xì)胞產(chǎn)物的體外操縱和再導(dǎo)入來繞過免疫功能，目的是誘導(dǎo)腫瘤特異性的免疫反應(yīng)。因此，這種基于樹突細(xì)胞的免疫療法的終極終極目標(biāo)是體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤特異性效應(yīng)細(xì)胞，近期進(jìn)展集中于能夠識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞的CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)。另外，感染疾病例如HIV的治療可以受益于基于樹突細(xì)胞的接種策略。抗原呈遞腫瘤特異性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)，需要表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子以及膜結(jié)合并分泌的共刺激分子的專業(yè)抗原呈遞細(xì)胞(APC)的參與。而且，這種APC必須能夠吸收、加工并呈遞與MHC結(jié)合的抗原。樹突細(xì)胞(DC)是免疫系統(tǒng)的專業(yè)APC，其具有剌激幼稚T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的能力。導(dǎo)致DC成熟的階段與細(xì)胞的某些性質(zhì)有關(guān)。未成熟DC特別善于通過吞噬或胞飲作用吸收細(xì)胞外抗原，并在細(xì)胞內(nèi)區(qū)室例如內(nèi)體和吞噬體中將抗原加工成肽。這里，肽與II類MHC分子結(jié)合。未成熟的DC還具有將肽從外源蛋白質(zhì)負(fù)載至I類MHC分子呈遞途徑的獨(dú)特能力，一種被稱為交叉呈遞的過程。通過激活1型CD4+輔助性T細(xì)胞(Thl細(xì)胞)和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)而有效剌激免疫反應(yīng)的能力關(guān)鍵依賴于成熟DC。只有具有一系列膜結(jié)合共刺激分子和輔助分子(例如CD40,CD80,CD83,CD86和II類MHC)的完全成熟的DC才可能有效誘導(dǎo)抗原特異性T淋巴細(xì)胞的繁殖和分化1。DC的共刺激活性的重要作用由分泌的細(xì)胞因子、特別是IL-12p70來提供。Heufler等(1996)i清楚證明了其在T細(xì)胞活化中的作用以及其偏向Thl型反應(yīng)。而且，Inoue等(2005)報(bào)道了腫瘤中表達(dá)IL-12的成熟DC的存在與患者存活之間的良好相關(guān)性。用于接種的成熟DC應(yīng)該產(chǎn)生有限量的Thl細(xì)胞抑制性細(xì)胞因子IL-IO。CCR7是淋巴結(jié)中基底細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子CCL19和CCL21的受體。表達(dá)足夠水平的活化CCR7的DC響應(yīng)CCL19或CCL2尸而遷移至淋巴結(jié)。這里，它們遇到T淋巴細(xì)胞并可以引發(fā)免疫反應(yīng)。產(chǎn)生成熟DC的方案已經(jīng)描述了用于產(chǎn)生成熟DC的許多方案。目前用于誘導(dǎo)DC的最普遍使用的"標(biāo)準(zhǔn)"方案采用由IL-ip,IL-6,TNF-a和前列腺素E2組成的成熟雞尾酒。盡管有歸因于CCR7的遷移活性和體內(nèi)免疫刺激活性，但是由該雞尾酒成熟的DC產(chǎn)生了IL12p7()S生成能力降低的DC。另一組DC成熟方案包括聚肌苷:聚胞苷酸，聚-(I:C)。其通常與細(xì)胞因子例如TNFa、IL-ip、IFN-y和IFN-a結(jié)合使用。該方法產(chǎn)生的DC生成IL-12p70，但是它們通常表達(dá)低水平的CCR7。聚-(I:C)存在下獲得的DC的低水平CCR7表達(dá)特征，限制了它們?cè)隗w內(nèi)遷移至淋巴結(jié)。近來，公布的專利申請(qǐng)US2005/0003533A1公開了表達(dá)CCR7的樹突細(xì)胞的成熟方法，所述樹突細(xì)胞在CD40L剌激后能夠被誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-12p70。因此，依然存在對(duì)開發(fā)用于產(chǎn)生如下成熟樹突細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化方法的未滿足的要求表達(dá)高水平的活化CCR7，并同時(shí)產(chǎn)生足量的IL隱12p70。而且，盡管許多研究者的努力，但是用于癌癥療法的基于樹突細(xì)胞的疫苗一般提供了最溫和臨床效力的免疫反應(yīng)。這些疫苗主要通過自體DC的體外操縱和抗原負(fù)載來產(chǎn)生。日益增加的對(duì)患者安全性的需求，要求高水平的重復(fù)性和符合管理內(nèi)容的順應(yīng)性。因此，強(qiáng)烈需要正確產(chǎn)生裝配DC的方法，所述DC有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)并特別提供改良的臨床反應(yīng)。另外，體外產(chǎn)生的DC還可以作為治療疫苗應(yīng)用于治療一些慢性感染疾病，例如HIV以及乙型和丙型肝炎，其中傳統(tǒng)疫苗方法不能有效地起作用。臨床前和首次臨床4—s研究結(jié)果表明，基于DC的免疫療法可能是治療HIV以及乙型和丙型肝炎的慢性感染患者的有前景的策略。對(duì)于癌癥免疫療法，抵抗這些胞內(nèi)感染劑的有效臨床反應(yīng)與產(chǎn)生CD8+效應(yīng)細(xì)胞所需的Thl輔助反應(yīng)的誘導(dǎo)有關(guān)5。因此，可以預(yù)期，體外產(chǎn)生的樹突細(xì)胞應(yīng)該具有相同的用于治療癌癥和慢性感染疾病的特征。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一方面涉及通過在祖細(xì)胞和未成熟樹突細(xì)胞的發(fā)展過程中采用低于37°C的溫度來產(chǎn)生樹突細(xì)胞的方法。本發(fā)明的第二方面涉及樹突細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞通過在祖細(xì)胞和未成熟樹突細(xì)胞的發(fā)展過程中采用低于37°C的溫度來樹突細(xì)胞的方法而產(chǎn)生。本發(fā)明的第三方面涉及包含樹突細(xì)胞群的藥物組合物，其中所述細(xì)胞通過在祖細(xì)胞和未成熟樹突細(xì)胞的發(fā)展過程中采用低于37°C的溫度來樹突細(xì)胞的方法而產(chǎn)生。本發(fā)明的第四方面涉及細(xì)胞群用于刺激和/或擴(kuò)增T細(xì)胞的用途，其中所述細(xì)胞通過在祖細(xì)胞和未成熟樹突細(xì)胞的發(fā)展過程中采用低于37°C的溫度來樹突細(xì)胞的方法而產(chǎn)生。本發(fā)明的第五方面涉及細(xì)胞群用于誘導(dǎo)受體中免疫反應(yīng)的用途，其中所述細(xì)胞通過在祖細(xì)胞和未成熟樹突細(xì)胞的發(fā)展過程中采用低于37°C的溫度來樹突細(xì)胞的方法而產(chǎn)生。本發(fā)明的第六方面涉及細(xì)胞群生產(chǎn)用于治療或預(yù)防癌癥或感染疾病的藥劑的用途，其中所述細(xì)胞通過在祖細(xì)胞和未成熟樹突細(xì)胞的發(fā)展過程中采用低于37°C的溫度來樹突細(xì)胞的方法而產(chǎn)生。下面參考附圖詳細(xì)說明本發(fā)明，其中圖1描述了溫度對(duì)DC的重要共剌激和輔助表面分子的影響。圖IB描述了低溫對(duì)CCR7表達(dá)的影響。圖2描述了溫度對(duì)由培養(yǎng)初期DC(A)產(chǎn)生的IL-IO、以及由未成熟DC(B)和成熟DC(C)產(chǎn)生的IL-IO的影響。圖3描述了溫度3TC、34。C和37。C對(duì)由新方法和標(biāo)準(zhǔn)方法生成的未成熟DC(A)和成熟DC(B)產(chǎn)生的IL-12p70的影響。圖4描述了低溫對(duì)CCR7表達(dá)的效果。圖5描述了根據(jù)本發(fā)明(A)方法生成的未成熟和成熟DC的表型和"標(biāo)準(zhǔn)"方法(B)的對(duì)比。圖6描述了成熟DC隨時(shí)間的表型穩(wěn)定性。圖7描述了DC在第7天和第10天的表型和異種刺激(MLR)活性。圖8描述了根據(jù)本發(fā)明方法和"標(biāo)準(zhǔn)"方法產(chǎn)生的DC的異種刺激活性。圖9描述了通過IFN-y誘導(dǎo)測(cè)量的CMV-抗原的功能展示(ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn))測(cè)定)。具體實(shí)施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明。為了解釋的目的，采用下述定義，并且適當(dāng)時(shí)，單數(shù)使用的術(shù)語也包括復(fù)數(shù)，反之亦然。定義本文使用的"分化步驟"是指其中允許細(xì)胞相應(yīng)確定的分化因子而分化的步驟。本文使用的"成熟步驟"是指其中允許細(xì)胞相應(yīng)成熟因子的存在而成熟的步驟。本文使用的"減小的溫度"或"降低的溫度"是指溫度低于37°C。用于產(chǎn)生樹突細(xì)胞的方法是公知的J.H.Peters的方法，J.H.Peters首次描述了單核細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)化成DC樣細(xì)胞的能力，首先是自發(fā)，然后是在GM-CSF和IL-46存在下。Romani等(1994)7和Sallusto&Lanzavecchia(1994)8公布后，在這兩種細(xì)胞因子存在下培養(yǎng)的單核細(xì)胞廣泛用于制備DC。該過程開始于從外周血液分離單核細(xì)胞，并在GM-CSF和IL-4存在下培養(yǎng)5-7天。獲得的細(xì)胞具有未成熟DC的性質(zhì)，特征為低水平的共剌激分子和高胞吞活性。在LPS、TNF-oc或其他成熟劑誘導(dǎo)的成熟過程中，細(xì)胞顯著上調(diào)共刺激和輔助分子例如CD40、CD80、CD83和CD86，并下調(diào)胞吞活性。體內(nèi)組織培養(yǎng)一般在37°C進(jìn)行。已知朗氏細(xì)胞在29-31°C的皮膚環(huán)境溫度下是功能上活性的，并且?guī)讉€(gè)研究己經(jīng)記錄了細(xì)胞系統(tǒng)中降低的培養(yǎng)溫度的體外生物學(xué)作用，所述細(xì)胞系統(tǒng)例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞。與Basil等(2003)9考察發(fā)熱樣溫度對(duì)DC活化和成熟的影響的研究相反，在幾個(gè)案例中測(cè)試了減小的溫度對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。Dexter等(1977)建議使用33°C用于培養(yǎng)造血干細(xì)胞9。Athanasas-Platsis等(1995)發(fā)現(xiàn)，與在37°C相比較，朗氏細(xì)胞標(biāo)志物CDla在單核細(xì)胞上的表達(dá)在34°C培養(yǎng)24小時(shí)過程中被上調(diào)1Q。據(jù)我們了解，還沒有人公開如何使用減小的溫度來產(chǎn)生未成熟或成熟的樹突細(xì)胞。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案涉及在祖細(xì)胞發(fā)展為未成熟樹突細(xì)胞過程中采用低于37°C的溫度來產(chǎn)生樹突細(xì)胞的方法。IL-10是DC發(fā)展的負(fù)調(diào)節(jié)劑，并且在GM-CSF存在下的單核細(xì)胞系活化過程中產(chǎn)生11。Kirkley等(2003)報(bào)道，對(duì)應(yīng)于培養(yǎng)溫度從37°C至31°C的下降，LPS刺激的巨噬細(xì)胞系產(chǎn)生IL-10顯著減少12。因此，本發(fā)明方法中涉及的降低的溫度可以借助例如低IL-10濃度來為DC產(chǎn)生提供改良的條件。已經(jīng)測(cè)試了在GM-CSF和IL-4存在下于不同溫度(3TC、34°C和37T)培養(yǎng)單核細(xì)胞對(duì)未成熟DC的CDla表達(dá)水平的影響，CDla是對(duì)IL-10的抑制性作用極度敏感的分子。我們發(fā)現(xiàn)，更低溫下產(chǎn)生的DC具有更高的表達(dá)水平。所有進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)在34。C下進(jìn)行。下一個(gè)原理發(fā)現(xiàn)是，在更低溫度培養(yǎng)后，培養(yǎng)物上清液中檢測(cè)到的IL-10水平實(shí)際上明顯更低。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種方法，其中生成的樹突細(xì)胞為成熟的樹突細(xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種方法，其中祖細(xì)胞和成熟的樹突細(xì)胞的發(fā)展包括所述細(xì)胞的分化。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種方法，其中分化步驟溫度低于37°C的方法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種方法，其中溫度為3TC至37°C的方法。該溫度可以是31°C、32°C、33°C、34°C、35°C或36°C中的任何溫度。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及其中溫度為34°C的方法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及其中袓細(xì)胞是自體祖細(xì)胞的方法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及其中祖細(xì)胞選自髓樣祖細(xì)胞或干細(xì)胞的方法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及其中髓樣祖細(xì)胞是單核細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的樹突細(xì)胞群。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及樹突細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞表達(dá)CCR7禾口/或IL-12p70。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及樹突細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞表達(dá)CDla、CD14低、CD83、CD86和IL-10低。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及樹突細(xì)胞群，進(jìn)一步包括與細(xì)胞表面的MHC分子結(jié)合呈遞的至少一種抗原。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及樹突細(xì)胞群，其中所述至少一種抗原是腫瘤抗原。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及樹突細(xì)胞群，其中所述腫瘤抗原選自癌癥/睪丸抗原、家族特異性分化抗原、腫瘤過表達(dá)抗原、突變或異常表達(dá)抗原以及病毒抗原。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及上述樹突細(xì)胞群用于刺激和/或擴(kuò)增T細(xì)胞的用途。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及樹突細(xì)胞群用于刺激和/或擴(kuò)增T細(xì)胞的用途，其中所述T細(xì)胞是自體T細(xì)胞。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及樹突細(xì)胞群用于刺激和/或擴(kuò)增T細(xì)胞的用途，其中所述用途是體外用途。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及樹突細(xì)胞群用于誘導(dǎo)受體中免疫反應(yīng)的用途。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及包含樹突細(xì)胞群的藥物組合物，其中所述群如上所定義。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案涉及藥物組合物作為藥劑的用途。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及包含樹突細(xì)胞群的藥物組合物，進(jìn)一步包含常規(guī)的佐劑和賦形劑。本發(fā)明替代實(shí)施方案涉及樹突細(xì)胞生產(chǎn)用于治療或預(yù)防癌癥或感染疾病的藥劑的用途。本發(fā)明替代實(shí)施方案涉及樹突細(xì)胞生產(chǎn)用于治療或預(yù)防癌癥或感染疾病的藥劑的用途，其中所述癌癥選自黑素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌，或者可以是任何類型的癌癥。本發(fā)明替代實(shí)施方案涉及樹突細(xì)胞生產(chǎn)用于治療或預(yù)防癌癥或感染疾病的藥劑的用途，其中所述感染疾病選自HIV和肝炎或者其他慢性感染疾病。現(xiàn)在通過下述并非以任何方式限制的實(shí)施例描述本發(fā)明。實(shí)施例l:降低溫度下樹突細(xì)胞的生成樹突細(xì)胞通常從血庫獲得的暗黃覆蓋層生成。60mL暗黃覆蓋層用60mL無鈣且無鎂的Dulbecco磷酸緩沖鹽水(DPBS，產(chǎn)品號(hào)BE17-512F,Cambrex,Belgium)稀釋，并應(yīng)用至四個(gè)50-mL管，每個(gè)管含有15mL淋巴細(xì)胞分離齊U(產(chǎn)品號(hào)1053980,AXIS-SHIELDPoCAS，Norway)。離心(460g，30min,20。C)后，將10-20mL上部血漿層轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的管。估計(jì)這是大約40%的血漿(稀釋的血漿)。血槳的最終制備包括添加肝素(25IU/mL)并離心(1500g，15min,4°C)。從界面收集單核細(xì)胞，用含有EDTA的DPBS稀釋兩倍，并通過4-5次離心來洗滌，第一次以250g、第二次以200g，接下來以150g離心，所有離心在4°C,12min。最后一次離心之前，使用Coulter計(jì)數(shù)儀(BeckmanCoulter,modelZ2)計(jì)數(shù)細(xì)胞，單核細(xì)胞的量估計(jì)為平均尺寸約9m的細(xì)胞數(shù)目)。細(xì)胞保存在-80。C(于10%DMSO稀釋的血漿中，每管107個(gè)單核細(xì)胞)，或者立即用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞以2xl06單核細(xì)胞/mL的濃度重懸于吸附介質(zhì)(添加了2mML-谷氨酰胺和2%血漿的RPMI1640(Cambrex))。5mL的細(xì)胞混懸液置于T25非TC處理的Falcon瓶中。37°C吸附1小時(shí)后，除去非粘附細(xì)胞，粘附細(xì)胞用溫的RPMI1640沖洗兩次，然后每個(gè)瓶中添加7mL的培養(yǎng)介質(zhì)(添加了2mML-谷氨酰胺和1%血漿的RPMI1640)。所述瓶置于不同的溫度的單獨(dú)CCV培養(yǎng)箱中31°C、34°C和37°C。在第1、3和5天添加終濃度分別為100ng/mL和50ng/mL的分化因子GM-CSF和IL-4。在第6天添加終濃度為10ng/mL的TNF-a以誘導(dǎo)成熟，溫度升至37。C持續(xù)培養(yǎng)最后24小時(shí)。在第7天，收集細(xì)胞，并通過FACS分析來確定它們的表型。使用直接軛合的抗體CDla-藻紅蛋白(PE)、CD14-異硫氰酸熒光素(FITC)、CD83畫PE、CD86-PE、HLA隱DR、-P,-Q曙FITC(全部來自Pharmingen,BecktonDickinson,Brandby,Denmark)禾口CCR7-FITC(R&DSystemsEurope,Abington,UK)對(duì)細(xì)胞染色。使用適當(dāng)?shù)耐N型對(duì)照。使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BecktonDickinson)和CELLQuest軟件(BecktonDickinson)分析樣品。代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖1。與37。C培養(yǎng)的細(xì)胞相比，降低溫度下培養(yǎng)的細(xì)胞更多表達(dá)CDla，而在更低溫度下培養(yǎng)的細(xì)胞群中觀察到更少的CD83和CD86陽性細(xì)胞。31°C和34°C培養(yǎng)后的CDla的平均熒光指數(shù)(MFI)兩倍于37°C培養(yǎng)。通過表達(dá)CD83和CD86的DC的百分比判斷的成熟度在31-34。C更低。這反映了對(duì)降低溫度下培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)成熟因子更低的敏感度，或者成熟過程本身需要37°C的溫度。實(shí)施例2:降低的溫度對(duì)IL-10生成的影響。在單核細(xì)胞分化為樹突細(xì)胞過程中考察了作為DC負(fù)調(diào)節(jié)劑的IL-10的產(chǎn)生。測(cè)量了其在第1、3和5天于培養(yǎng)上清液中的濃度。通過包括捕獲抗體(Ab)、標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、生物素化的檢測(cè)Ab和HRP-鏈霉抗生物素的夾心ELISA測(cè)量IL-10的產(chǎn)生，使用了eBioscience的"Ready-Set-Go"試劑盒，基本根據(jù)生產(chǎn)商推薦并做了一些調(diào)整。捕獲Ab與Nuncmaxisorp96孔板結(jié)合過夜并洗滌后，室溫下延長(zhǎng)封閉步驟至少3小時(shí)。通過開始于200pg/mLIL-10的七個(gè)連續(xù)的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在室溫下保持2小時(shí)，隨后在4°C保持過夜。接下來的步驟根據(jù)生產(chǎn)商方案進(jìn)行。來自相同試劑盒的四甲基聯(lián)苯胺基質(zhì)溶液用于HRP的酶反應(yīng)，終止反應(yīng)后，測(cè)量光密度，由于490nm和620nm讀數(shù)之間的差異而進(jìn)行波長(zhǎng)校正。這類實(shí)驗(yàn)的一個(gè)的結(jié)果示于圖2A。單核細(xì)胞在第一天自發(fā)產(chǎn)生的IL-10是低的，而在第一天添加了GM-CSF和IL-4之后顯著上調(diào)。34°C培養(yǎng)至5天的細(xì)胞一般產(chǎn)生比37°C培養(yǎng)的細(xì)胞顯著更低量的IL-IO。在第5天對(duì)幾種DC培養(yǎng)物的測(cè)試顯示相似的模式(圖2B)。甚至在第5天洗滌細(xì)胞、將它們置于37°C、第6天添加成熟劑并在第8天收集上清液之后，34°C與37°C相比降低的IL-10產(chǎn)生依然持續(xù)(圖2C)。這些結(jié)果表明，在低于37°C的溫度下培養(yǎng)的細(xì)胞需要低IL-10產(chǎn)生的穩(wěn)定表型。實(shí)施例3:降低的溫度對(duì)IL-12p70生成的影響。我們還考察了溫度對(duì)IL-12p70產(chǎn)生的影響。通過包括捕獲抗體(Ab)、標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、生物素化的檢測(cè)Ab和HRP-鏈霉抗生物素的夾心ELISA測(cè)量IL-12p70的產(chǎn)生。使用了針對(duì)IL-12p70的試劑盒"DuoSetELISA生成系統(tǒng)"(R&DSystems),基本根據(jù)生產(chǎn)商推薦并做了一些調(diào)整。捕獲Ab與Nuncmaxisorp96孔板結(jié)合過夜并洗滌后，室溫下延長(zhǎng)封閉步驟至少3小時(shí)。通過開始于500pg/mLIL-12p70的七個(gè)連續(xù)的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在室溫下保持2小時(shí)，隨后在4°C保持過夜。接下來的步驟根據(jù)生產(chǎn)商方案進(jìn)行。使用過氧化氫-四甲基聯(lián)苯胺混合物作為HRP的基質(zhì)溶液，在終止反應(yīng)后測(cè)量光密度，由于490nm和620nm讀數(shù)之間的差異而進(jìn)行波長(zhǎng)校正。表l.在培養(yǎng)開始的5天里，溫度對(duì)MCM模擬物誘導(dǎo)的成熟過程中產(chǎn)生IL-12p70的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>可以看到(表l)，34'C產(chǎn)生的細(xì)胞產(chǎn)生明顯更高水平的IL-12p70。實(shí)施例4:組織培養(yǎng)塑料的選擇我們比較了兩種組織培養(yǎng)塑料非組織培養(yǎng)聚苯乙烯(PS)(產(chǎn)品號(hào)353813,T25BD-Bioscience,USA)和PrimariaTM塑料(產(chǎn)品號(hào)353813,T25BD-Bioscience,USA)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施例1中描述的過程類似，使用2%自體血漿預(yù)處理15-45min的塑料表面作為組分來源，例如額外細(xì)胞組分，象纖維蛋白素原和纖維結(jié)合素，再不含血清的AIM-V介質(zhì)中34"C直至第5天，隨后將培養(yǎng)物置于37°C。在第6天添加成熟劑TNFa,IL-1卩，1L-6和前列腺素E2，在第8天收集培養(yǎng)物。根據(jù)培養(yǎng)條件，袓細(xì)胞選擇發(fā)展成巨噬細(xì)胞或DC。培養(yǎng)幾天后，本該發(fā)展成巨噬細(xì)胞的細(xì)胞形成附著細(xì)胞培養(yǎng)物，而本該發(fā)展成DC的細(xì)胞形成松散附著的細(xì)胞培養(yǎng)物。最初，相等數(shù)目的細(xì)胞被接種并附著至不同的組織培養(yǎng)塑料。從第6天對(duì)DC培養(yǎng)物光學(xué)顯微鏡檢査，顯示PrimariaTM塑料上附著的細(xì)胞數(shù)目明顯少于另一種塑料上生長(zhǎng)的細(xì)胞。通常，PrimariaTM塑料上生長(zhǎng)的細(xì)胞還表現(xiàn)為更"清潔"，即更少碎屑，反映了在成熟過程中更小程度的細(xì)胞死亡。我們測(cè)試了使用不同濃度的血漿來預(yù)處理塑料。2%，10%，20%或40%血漿預(yù)處理PrimariaTM塑料后沒有發(fā)現(xiàn)DC性質(zhì)上的顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。但是，我們發(fā)現(xiàn)，污染淋巴細(xì)胞的量隨著血漿濃度增加至10%而減少。因此，我們?cè)陔S后實(shí)驗(yàn)中在實(shí)施例1中所述方法中加入了使用10%血漿處理PrimariaTM塑料的步驟。在隨后實(shí)驗(yàn)中，我們比較了本發(fā)明方法與"標(biāo)準(zhǔn)方法"，除非另有說明，其如下所述進(jìn)行。樹突細(xì)胞通常從獲自血庫的暗黃覆蓋層產(chǎn)生。60ml暗黃覆蓋層用60mL無Ca和無Mg的Dulbecco磷酸緩沖鹽水(DPBS,產(chǎn)品號(hào)BE17-512F，Cambrex，Belgium)稀釋，并應(yīng)用至4個(gè)50-mL管，每個(gè)管含有15mL淋巴細(xì)胞分離劑(產(chǎn)品號(hào)1053980,AXIS-SHIELDPoCAS,Norway)。離心后(460g,30min，20°C)，10-20mL上部血漿層轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的管。從界面收集單核細(xì)胞，用無鈣和鎂的PBSEDTA稀釋兩次，3次離心洗滌，首次250g，第二次175g，最后一次110g，所有離心在《C,12min。最后一次離心之前，使用Coulter計(jì)數(shù)儀(BeckmanCoulter,modelZ2)計(jì)數(shù)細(xì)胞，單核細(xì)胞的量估計(jì)為平均大小約9pm的細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞以2x106單核細(xì)胞/mL的濃度重懸于吸附介質(zhì)(RPMI1640(Cambrex)，添加有2mML-谷氨酰胺和1%熱失活自體血漿)。5mL的細(xì)胞混懸液置于T25無處理的Primaria瓶中。37。C吸附1小時(shí)后，除去非吸附的細(xì)胞，向每個(gè)瓶添加5mL培養(yǎng)介質(zhì)(RPMI1640，添加有2mML-谷氨酰胺和1%血漿)。第1天，培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基。第3天，添加2ml培養(yǎng)基。第5天，收集所有非吸附細(xì)胞并置于含有新鮮培養(yǎng)基的T25PrimariaTM瓶中。所述瓶置于37。C的C02-培養(yǎng)箱中。在第1、3和5天添加濃度分別為100ng/mL和50ng/mL的分化因子GM-CSF和IL-4。在第6天添加TNF-a或細(xì)胞因子雞尾酒(IL-1，IL-6,TNF-a和PGE-2)以誘導(dǎo)成熟。在第7天，收集細(xì)胞，并通過FACS分析確定其表型。實(shí)施例5:IL-12p70的產(chǎn)生。圖3顯示了IL-12p70產(chǎn)生經(jīng)過兩天后(第7天和第8天)的測(cè)量，我們能夠顯示，新方法產(chǎn)生的樹突細(xì)胞比標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生的樹突細(xì)胞產(chǎn)生了更高量的IL-12p70。實(shí)施例6:CCR7的表達(dá)。為考察低溫對(duì)CCR7表達(dá)的影響，我們采用了由IL-1(3、IL-6、TNF-a和前列腺素E2組成的成熟雞尾酒來替代僅使用TNF-a。圖1B中所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較了新方法和標(biāo)準(zhǔn)方法的3個(gè)不同溫度?？梢钥吹?，新方法的CCR7表達(dá)高于標(biāo)準(zhǔn)方法。我們還在標(biāo)準(zhǔn)遷移實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了新方法產(chǎn)生的樹突細(xì)胞的CCR7受體表達(dá)的功能性(ChemotxDisposableChemotaxisSystem(116-5型)，來自NeuroProbe,Gakhersburg,MD,USA)。這里，我們看到樹突細(xì)胞向趨化因子CCL19遷移，且新方法產(chǎn)生的DC(數(shù)據(jù)未顯示)證實(shí)了功能性CCR7受體的表達(dá)。實(shí)施例7:細(xì)胞產(chǎn)量。本文描述的新方法還顯示了比標(biāo)準(zhǔn)方法提高的細(xì)胞產(chǎn)量。在三個(gè)不同運(yùn)行中，我們發(fā)現(xiàn)在所有測(cè)試溫度(31。C、34°C和37。C)下，新方法具有比標(biāo)準(zhǔn)方法更高的細(xì)胞產(chǎn)量，參見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例8:根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的DC的批間標(biāo)志物變化為符合對(duì)生產(chǎn)醫(yī)療目的的樹突細(xì)胞的GMP要求，樹突細(xì)胞性質(zhì)的批間差異應(yīng)該小。為此目的，我們從8個(gè)不同供體的血液在3周時(shí)段內(nèi)進(jìn)行樹突細(xì)胞的制備，使用了相同批次的所有采用的試劑和0.5%自體血槳添加至AIM-V介質(zhì)。為了比較，使用"標(biāo)準(zhǔn)"方法(37。C)進(jìn)行DC生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)在融化的PBMC上進(jìn)行。表3概括了這些實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的DC的性質(zhì)。與通過"標(biāo)準(zhǔn)"方法產(chǎn)生的DC性質(zhì)的高差異相反，發(fā)現(xiàn)通過新方法獲得的DC性質(zhì)差異度非常低。表3.通過標(biāo)準(zhǔn)方法或新方法產(chǎn)生的樹突細(xì)胞的不同標(biāo)志物表達(dá)百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>S:標(biāo)準(zhǔn)方法，N:本發(fā)明方法，ND:未測(cè)定，X:平均值最后，圖4A表示了通過新方法產(chǎn)生的未成熟(第5天)和成熟(第8天)樹突細(xì)胞的表型。這里，我們還測(cè)量了CD80、甘露糖受體(MR)和兩種朗氏細(xì)胞標(biāo)志物-CD207(langerin)和E-鈣黏著蛋白的表達(dá)?？梢钥吹?，通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞不是朗氏細(xì)胞。圖5B表示通過新方法和標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生的未成熟(第5天)和成熟(第8天)樹突細(xì)胞的表型。這里，我們針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)DC標(biāo)志物的表達(dá)而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。對(duì)于未成熟(第5天)，我們具有更清潔的CDla群。成熟群(第8天)顯示了與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，新方法產(chǎn)生的細(xì)胞中的高且均一的HLAD、CD83和CD86表達(dá)。而且，通過新方法，CCR7表達(dá)更均一表達(dá)。實(shí)施例9.通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的樹突細(xì)胞的穩(wěn)定性。在注射入有機(jī)體后，樹突細(xì)胞應(yīng)該遷移并達(dá)到淋巴結(jié)，以刺激T細(xì)胞。因此，DC保持其表型幾天是非常重要的。進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試的普遍方式是收集第8天的細(xì)胞，洗出細(xì)胞因子后繼續(xù)在缺乏刺激性細(xì)胞因子下培養(yǎng)細(xì)胞。我們已經(jīng)通過不用細(xì)胞因子培養(yǎng)細(xì)胞兩天而進(jìn)行了這種實(shí)驗(yàn)。圖5表示了第8天和額外兩天培養(yǎng)后收集的DC的FACS分析結(jié)果。顯然，測(cè)量參數(shù)CDla、CD14、CD83、HLA-D和CCR7的表達(dá)很大程度上保持不變，因此表型保持穩(wěn)定。在類似實(shí)驗(yàn)中，在第8天沒有洗出細(xì)胞因子，我們測(cè)試了第7天和第10天的樹突細(xì)胞的表型和異種刺激活性。圖6A和6B分別顯示了表型和異種刺激活性。結(jié)果顯示，異種刺激作用在培養(yǎng)10天后依然高，第10天的表型特征類似于第7天測(cè)量的特征，證實(shí)了所產(chǎn)生的樹突細(xì)胞的高穩(wěn)定性。實(shí)施例10.由新方法生成的樹突細(xì)胞的異種刺激。我們比較了通過"標(biāo)準(zhǔn)"方法和本發(fā)明方法獲得的DC的異種刺激能力。細(xì)胞在含有5%AB人血清的RPMI1640介質(zhì)中培養(yǎng)。響應(yīng)細(xì)胞是通過外周血液暗黃覆蓋層密度分離從健康供體獲得的單核細(xì)胞。刺激細(xì)胞是暴露于成熟細(xì)胞因子雞尾酒2天后獲得的經(jīng)輻射的成熟樹突細(xì)胞，如實(shí)施例4所述。剌激細(xì)胞，0.1xl(f個(gè)細(xì)胞/10(^1，與圖7所示滴定數(shù)目的剌激細(xì)胞(10(V1)混合，并在U底96孔微滴定板中培養(yǎng)5天。最后18個(gè)小時(shí)添加3H-胸腺嘧啶核苷(0.1ji居里/mL)。隨后，收集細(xì)胞用于閃爍計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)給出為四個(gè)平行培養(yǎng)的平均cpm值。使用Wilcoxon測(cè)試來估計(jì)用于產(chǎn)生DC的兩種方法之間的差異?？梢钥吹剑ㄟ^本發(fā)明方法獲得的樹突細(xì)胞具有3-10倍的異種刺激活性。實(shí)施例11.由新方法生成的樹突細(xì)胞的抗原呈遞為了說明DC呈遞抗原至T細(xì)胞的潛力，對(duì)通過裸露的或CMV肽脈沖的DC刺激的T細(xì)胞進(jìn)行INFyELISPOT測(cè)定。選擇INFyELISPOT測(cè)定是因?yàn)樵摐y(cè)定提供了單細(xì)胞水平上的清晰結(jié)果，并且T細(xì)胞遇到APC呈遞的抗原之后釋放INF。使用的CMV肽限于HLA-A2，并且供體材料已知為HLA-A2陽性，因?yàn)樵撊旱?0%具有CMV反應(yīng)，所以選擇該病毒模型。圖9描述了ELISPOT測(cè)定結(jié)果，顯示了用載有CMV肽的DC刺激的T細(xì)胞存在強(qiáng)反應(yīng)，表明這些DC能夠?qū)⒖乖蔬f至T細(xì)胞。參考文獻(xiàn)1.Heufler，C,Koch，F(xiàn).，Stanzl，U.，Topar,G.，Wysocka,M.'Trinchieri，G.，Enk，A.，Steinman，R.M.,Romani,N.，andSchuler，G.lnterleukin-12isproducedbydendriticcellsandmediatesThelper1developmentaswellasinterferon-gammaproductionbyThelper1cells.Eur.丄lmm,l.，26:659-668，1996.2.Scandella，E.，Men,Y.,Gillessen，S.，F(xiàn)orster，R.，andGroettmp，M.ProstaglandinE2isakeyfactorforCCR7surfaceexpressionandmigrationofmonocyte-deriveddendriticcells.Blood,100:1354-1361，2002.3.Jonuleit，H.，Kuhn，U.，Muller，G.，Steinbrink，K.,Paragnik，L.，Schmitt，E,，Knop，丄，andEnk，A.H.Pro-inflammatorycytokinesandprostaglandinsinducematurationofpotentimmunostimulatorydendriticcellsunderfetalcalfsemm-什eeconditions.Eur.丄lmmunol"27:3135-3142，1997.4.Chen,M.，Li，Y.G.，Zhang，D.Z.，Wang,Z.Y.，Zeng,W.Q.!Shi，X.F.，Guo，Y.，Guo，S.H.，andRen,H.TherapeuticeffectofautologousdendriticcellvaccineonpatientswithchronichepatitisB:aclinicalstudy.World丄Gastroenterol.，11:1806-1808，2005.5.Lu，W.，Arraes，L.C，F(xiàn)erreira，W.T.，andAndrieu,丄M.Therapeuticdendritic-cellvaccineforchronicHIV-1infection.Nat.Med.，10:1359-1365，2004.6.Peters,丄H.,Xu，H.，Ruppert，丄，Ostermeier，D.，F(xiàn)riedrichs，D.，andGieseler，R.K.Signalsrequiredfordifferentiatingdendriticcellsfromhumanmonocytesinvitro,Adv.Exp,Med.Biol.,329:275-280,1993.7.Romani，N.，Gruner，S.，Brang，D.,Kampgen,E.，Lenz，A.，Trockenbacher，B.，Konwalinka，G.，F(xiàn)ritsch，P.O.，Steinman，R.M.,andSchuler,G.Proliferatingdendriticcellprogenitorsinhumanblood.丄Exp.Med.，180:83-93，1994.8.Sallusto,F.andLanzavecchia,A.Efficientpresentationofsolubleantigenbyculturedhumandendriticcellsismaintainedbygranulocyte7macrophagecolony-stimulatingfactorplusinterleukin4anddownregulatedbytumornecrosisfactora.丄Exp.Med.，179:1109-1118，1994.9.Dexter，T.M.，Allen,T.D.，andLajtha,L.G.Conditionscontrollingtheproliferationofhaemopoieticstemcellsinvitro.J.CellPhysiol,91:335-344，1977.10.Athanasas-Platsis，S.，Savage,N.W,'Winning,T.A.，andWalsh,匕.丄InductionoftheCD1aLangerhanscellmarkeronhumanmonocytes.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