專利名稱：：用于炎性病癥的草藥組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的草藥組合物，其含有植物絨毛戴星草(5^"mwitos,W/cws)的頭狀花序(floweringhead)和頭狀果序(fruitinghead)的提取物。本發(fā)明還涉及含有從絨毛戴星草的頭狀花序和果序所得之提取物的草藥組合物，其包含作為生物活性標(biāo)志物的化合物3a-羥基-5a,9-二甲基-3-亞甲基-3a,4，5,5a,6,7,8,9b-八氫-3H-萘并[1,2-b]呋喃-2-酮(7-羥基-4,ll(13)-桉葉烷二烯-12,6-內(nèi)酯(化合物1)，以及任選地一種或多種其它活性劑，用于有效治療炎性病癥。本發(fā)明還涉及用于治療炎性病癥的藥物組合物，其包含作為活性成分的3a-羥基-5a,9-二甲基畫3-亞甲基-3a,4，5，5a,6,7，8,9b-八氫-3H-萘并[l,2-b呋喃-2-酮(化合物1)和藥學(xué)可接受載體。本發(fā)明還涉及制備所述組合物的方法。本發(fā)明的所述組合物適于治療炎性病癥。本發(fā)明還涉及所述組合物的腫瘤壞死因子-a(TNF-a)和白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)抑制活性。本發(fā)明還涉及所述組合物對(duì)細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1)和E-選擇蛋白的表達(dá)的抑制。本發(fā)明還公開了施用所述組合物用于治療炎性病癥的方法。任選地，所述提取物或包含所述提取物的組合物或包含化合物1的組合物可與至少一種其它抗炎劑聯(lián)合使用。
背景技術(shù)：
：炎癥在宿主防御和免疫介導(dǎo)疾病的進(jìn)程中發(fā)揮基礎(chǔ)作用。在對(duì)損傷(例如外傷、缺血和外來(lái)顆粒)和感染(例如細(xì)菌或病毒感染)的應(yīng)答中，由多種事件(包括化學(xué)介導(dǎo)物(例如細(xì)胞因子和前列腺素)和炎癥細(xì)胞(例如白細(xì)胞))啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)。其特征在于流向組織的血液流動(dòng)增加，引赴良熱、紅斑、>5更化和疼痛。在炎性反應(yīng)中體液免疫和細(xì)胞免疫因子之間的精巧、良好平衡的相互作用能夠消除有害物和啟動(dòng)受損組織的修復(fù)。當(dāng)此精巧平衡的相互作用被破壞時(shí)，所述炎性反應(yīng)可導(dǎo)致對(duì)正常組織相當(dāng)大的損傷并可能比啟動(dòng)該反應(yīng)的最初損害更有害。在這些不受控制的炎性反應(yīng)的情況下，需要臨床干預(yù)以防止組織損傷和器官功能障礙。疾病比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、哮喘、變態(tài)反應(yīng)、膿毒性休克綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化、炎性腸病以及其它臨床病癥都是以慢性炎癥為特征。細(xì)胞因子，尤其是IL-ip、IL-6、IL-8和TNF-a在炎癥過程中發(fā)揮著重，用。TNF-(x是一種多效性細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，但其也可由其它類型的細(xì)胞產(chǎn)生。TNF-a顯示了有益的以及病理的活性。除了自我調(diào)節(jié)以外，其具有生長(zhǎng)刺激作用和生長(zhǎng)抑制性質(zhì)。TNF-a的有益功能包括通過調(diào)節(jié)機(jī)體晝夜節(jié)律而維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，啟動(dòng)對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲感染的免疫應(yīng)答，通過刺激成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)而替換或重塑受損組織，以及如其名字所示殺死某些腫瘤。盡管TNF-a在先天免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但TNF-a的不當(dāng)生成可產(chǎn)生導(dǎo)致慢性炎癥和組織損傷的病理變化。已經(jīng)顯示，TNF-a在很多慢性炎性疾病的發(fā)病中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，所述慢性炎性疾病例如炎性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、4艮屑病關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、難治性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(refractoryrheumatoidarthritis)、慢性非類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松/骨重吸收、冠心病、脈管炎、潰瘍性結(jié)腸炎、銀屑病、成年型呼吸窘迫綜合征、糖尿病、皮膚遲發(fā)型超敏>^應(yīng)病癥和阿爾茨海默病。白細(xì)胞介素-1(IL-1)是先天免疫系統(tǒng)的重要部分，其調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的功能。在局部組織中IL-1和IL-1受體拮抗劑(IL-lra)之間的平衡影響炎性疾病和所導(dǎo)致結(jié)構(gòu)損傷的可能iL艮。在過量IL-1的存在下，炎性病癥和自身免疫病癥可發(fā)生于關(guān)節(jié)、肺、胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或血管。在各種炎性病癥中，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種自身免疫病癥。RA是病因未知的慢性、全身性的關(guān)節(jié)炎性疾病。在RA中，關(guān)節(jié)的通常較薄的滑膜內(nèi)襯被替換為炎性的、高度血管化的、侵入性的纖維膠原酶組織(關(guān)節(jié)翳)，其對(duì)軟骨和骨都有破壞性?？赡苁苡绊懙膮^(qū)域包括手、腕、頸、顎、肘、膝、足和踝的關(guān)節(jié)。RA中的軟骨破環(huán)與受影響關(guān)節(jié)中細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的異常表i^T關(guān)。釋放于滑膜中的兩種臨床上重要的細(xì)胞因子是IL-ip和TNF-a。TNF-a可上調(diào)其自我表達(dá)并有利于參與RA的其它基因的表達(dá)，所述其它基因包括IL-1(5、IL-6、IL-8、環(huán)加氧酶-2(COX-2),誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1)和E-選擇蛋白。這種正調(diào)節(jié)環(huán)可放大并維持局部炎癥反應(yīng)。因此，TNF-a的不適當(dāng)表達(dá)或過度表達(dá)導(dǎo)致許多基因表達(dá)的協(xié)調(diào)增加，這些基因的產(chǎn)物介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫^_應(yīng)，從而導(dǎo)致RA的臨^J^現(xiàn)。在包括RA的所有慢性炎性病癥的發(fā)病機(jī)制中，白細(xì)胞的募集和駐留是關(guān)鍵事件。此外，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中，循環(huán)白細(xì)胞尤其是單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮的粘附也是關(guān)鍵事件。此過程取決于在內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的粘附分子(比如ICAM-1、VCAM-1和E-選擇蛋白)與其白細(xì)胞上對(duì)應(yīng)配體之間的相互作用。因此，ICAM-1、VCAM-l和E-選擇蛋白負(fù)責(zé)將炎癥細(xì)胞(比如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞)從循環(huán)中募集到炎癥部位。這些粘附蛋白通常在內(nèi)皮細(xì)胞表面是低水平的，樹艮大程度上被多種促炎性細(xì)胞因子(比如TNF-a)誘導(dǎo)。用于治療炎性病癥的最常見治療方法包括4吏用非甾體抗炎藥(NSAID)(例如萘普生、雙氯芬酸、布洛芬)以緩解比如疼痛等癥狀。然而，盡管廣泛使用NSAID，樹艮多個(gè)體不能耐受長(zhǎng)期治療該病癥所必需的劑量，因?yàn)橐阎狽SAID引起胃侵蝕。而且，NSAID僅治療病癥的癥狀而不是治療病因。當(dāng)患者對(duì)NSAID沒有反應(yīng)時(shí)，使用其它藥物比如氨甲喋呤、金鹽、D-青霉胺和皮質(zhì)類固醇。這些藥物也具有明顯的毒性作用。單克隆抗體藥物比如英利昔單抗(infliximab)、依那西普(etanercept)和阿ii^單抗(adalimumab)可用作抗炎劑，但是具有缺點(diǎn)比如施用途徑(僅胃腸外)、費(fèi)用高、誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)、激活潛伏性結(jié)核、癌癥和充血性心臟病的風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，需要開發(fā)具有更低副作用的改進(jìn)的和替代的藥物，用于預(yù)防和治療由IL-1和TNF-a增加引起的炎性病癥。在M界內(nèi)已經(jīng)知道并使用草藥治療多種病癥。有證據(jù)表明源自植物的產(chǎn)品對(duì)哺乳動(dòng)物具有潛在的藥理作用和治療作用，并傾向于比合成藥物具有較少的有害副作用。本發(fā)明描述了一種新的草藥組合物，其包含植物絨毛戴星草(5^/^IWflM幼MS/flrf/CMS)的頭狀花序和果序的提取物。該組合物可用于治療多種炎性病癥，同時(shí)具有最少的副作用。絨毛戴星草是一種稻田中常見的雜草。它屬于菊科，在印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)(Ayurveda)文獻(xiàn)中，其被稱為mahamundi或gorakhmundi。該植物在整個(gè)印度均可獲得，它是開紫花的有分枝草本植物。其用在肝病和胃病中。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中它用作多種疾病的藥物，所述疾病包括痢疾、子宮和陰道痛、胸部疾病、血液的純化和富集、尿路感染、傷口愈合和若干其它疾病。為對(duì)抗免疫缺陷病癥，已開發(fā)了含有絨毛戴星草的多草藥制劑"RV-08"(IndianJournalofPharmacology,33,454-55,(2001))。已經(jīng)報(bào)道從絨毛戴星草的花中分離到一種新的倍半萜糖苷戴星草內(nèi)酯(sphaeranthanolide)。這種分離化合物戴星草內(nèi)酯表現(xiàn)出免疫刺激活性(Phytochemistry，29(8)，2573-76,(19卯))。已經(jīng)報(bào)道了絨毛戴星草頭狀花序的甲醇提取物的免疫調(diào)節(jié)活性(ArsPharmaceutica45:3;281-91,(2004))。據(jù)報(bào)道，得自絨毛戴星草根的水提取物具有下調(diào)痤瘡丙酸桿菌(戶n，/,Vm幼fl"en'w附誘導(dǎo)的TNF-a和IL-8產(chǎn)生的中度活性。絨毛戴星草引起較小的，但仍是顯著的對(duì)活性氧的抑制(Phytomedicine,10(1),34-38,(2003))。就我們所知，沒有關(guān)于用于治療炎性病癥的包含絨毛戴星草的頭狀花序和果序的提取物的任何藥物的報(bào)道。為克服與現(xiàn)有技術(shù)組合物相關(guān)的該系列治療的副作用問題(比如誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)、激活潛伏性結(jié)核、骨髓抑制、癌癥和充血性心臟病的風(fēng)險(xiǎn)增加)，本發(fā)明人已經(jīng)制備了一種有效對(duì)抗炎癥的新的草藥組合物，其具有對(duì)抗TNF-a、白細(xì)胞介素(IL-l、IL-6、IL-8)以;M"抗細(xì)胞間粘附分子l(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1)和E-選擇蛋白的表達(dá)的抑制活性。本發(fā)明的組合物還可與至少一種其它的抗炎劑聯(lián)合使用。發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種新的草藥組合物，其包含作為活性成分的治療有效量的絨毛戴星草的頭狀花序和果序的提取物以及藥學(xué)可接受載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于治療炎性病癥的組合物，其包含作為活性成分的治療有效量的3a-羥基-5a,9-二甲基-3-亞甲基-33,4，5,5&，6，7，8,913-八氫-311-萘并[1，2-1)呋喃-2-酮(化合物l)以及藥學(xué)可接受載體。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種制備所述組合物的方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于治療由TNF-a和白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)所介導(dǎo)的病癥的組合物，其包含治療有效量的選自絨毛戴星草提取物或化合物1的活性成分。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于治療由細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子l(VCAM-1)和E-選^^蛋白所介導(dǎo)的病癥的組合物，其包含治療有效量的選自絨毛戴星草提取物或化合物1的活性成分。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于治療炎性病癥的組合物，其包含治療有效量的選自絨毛戴星草提取物或化合物1的活性成分。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于治療由TNF-a介導(dǎo)的炎性病癥的組合物，其包含治療有效量的選自絨毛戴星草提取物或化合物1的活性成分。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于治療由白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)所介導(dǎo)的炎性病癥的組合物，其包含治療有效量的選自絨毛戴星草提取物或化合物1的活性成分。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于治療由細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子l(VCAM-1)和E-選^^蛋白所介導(dǎo)的炎性病癥的組合物，其包含治療有效量的選自絨毛戴星草提取物或化合物1的活性成分。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種組合物，其包含治療有效量的選自絨毛戴星草提取物或化合物1的活性成分并聯(lián)合應(yīng)用至少一種生物活性物質(zhì)以獲得協(xié)同作用。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供所述組合物單獨(dú)或與至少一種其它抗炎劑聯(lián)合用于治療包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎性病癥的用途。根據(jù)以下的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它目的和進(jìn)一步的適用性范圍將顯而易見。
發(fā)明內(nèi)容因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種新的草藥組合物，其包含作為活性成分的治療有效量的絨毛戴星草的頭狀花序和果序的提取物以及藥學(xué)可接受載體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種用于治療炎性病癥的組合物，其包含作為活性成分的治療有效量的3a-羥基-5a,9-二甲基-3-亞甲基-33，4,5，5&,6,7，8，91)-八氫-311-萘并[1,2-1)呋喃-2-酮(化合物1)以及藥學(xué)可接受載體。才艮據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供一種制備所述組合物的方法。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供一種用于治療由TNF-a和白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)所介導(dǎo)的病癥的組合物，其包含治療有效量的選自絨毛戴星草提取物或化合物1的活性成分。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供一種用于治療由細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1)和E-選擇蛋白所介導(dǎo)的病癥的組合物，其包含治療有效量的選自絨毛戴星草提取物或化合物1的活性成分。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供一種用于治療炎性病癥的組合物，其包含治療有效量的選自絨毛戴星草提取物或化合物1的活性成分。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供一種用于治療由TNF-a介導(dǎo)的炎性病癥的組合物，其包含治療有效量的選自絨毛戴星草提取物或化合物1的活性成分。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供一種用于治療由白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)所介導(dǎo)的炎性病癥的組合物，其包含治療有效量的選自絨毛戴星草提取物或化合物1的活性成分。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供一種用于治療由細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子l(VCAM-1)和E-選擇蛋白所介導(dǎo)的炎性病癥的組合物，其包含治療有效量的選自絨毛戴星草提取物或化合物1的活性成分。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供一種組合物，其包含治療有效量的選自絨毛戴星草提取物或化合物1的活性成分并聯(lián)合應(yīng)用至少一種生物活性物質(zhì)以獲得協(xié)同作用。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供所述組合物單獨(dú)或與至少一種其它抗炎劑聯(lián)合用于治療包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎性病癥的用途。發(fā)明詳述應(yīng)當(dāng)理解，盡管它們表示本發(fā)明的實(shí)施方案，所述詳細(xì)描述和具體實(shí)例是僅以舉例說明的方式給出的，因?yàn)閷?duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和改進(jìn)都將是顯而易見的?；诒疚牡拿枋?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用本發(fā)明達(dá)到其最充分的范圍。以下具體實(shí)施方案只應(yīng)理解為舉例說明，而并非以任何方式限制本公開內(nèi)容的其余部分。除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有如本發(fā)明所述領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"炎性病癥"指以慢性炎癥為特征的疾病或病況，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、難治性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性非類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏木W(wǎng)骨重吸收，冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、脈管炎、潰瘍性結(jié)腸炎、銀屑病、克羅恩病、成年型呼吸窘迫綜合征、皮膚遲發(fā)型^lt反應(yīng)病癥、膿毒性休克綜合征和炎性腸病。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)可接受，，意指必須與制劑中其它成分相容的、且對(duì)其接受者無(wú)害的載體、稀釋劑、賦形劑和/或鹽。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)可接受載體"意指無(wú)毒的惰性固體、半固體、稀釋劑、包封材料或任何類型的制劑輔料。可用作藥學(xué)可接受載體的一些實(shí)例材料是糖比如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉比如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物比如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；麥芽；明膠；滑石；以及其它無(wú)毒的相容的潤(rùn)滑劑比如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑(releasingagent)、包衣劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑；根據(jù)配方師的判斷，防腐劑和抗氧化劑也可存在于所述組合物中。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"治療有效量"意指在合理醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)，足以明顯引起待調(diào)節(jié)或治療之病癥的積極改變、但又足夠低以(以合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比)避免任何可能的副作用的化合物或組合物(例如絨毛戴星草提取物)的量。所述化合物或組合物的治療有效量將隨所治療的具體病癥、最終使用者的年齡和身體狀況、所治療/預(yù)防的病癥的嚴(yán)重程度、治療的持續(xù)時(shí)間、并行治療的性質(zhì)、所用的具體的化合物或組合物、所用的具體的藥學(xué)可接受載體等因素而改變。如本文中所使用的，所有的百分?jǐn)?shù)均以重量計(jì)，除非另外指明。本文中所用的術(shù)語(yǔ)"生物活性標(biāo)志物"用于定義與藥學(xué)活性的可接受程度相關(guān)的特性(或植物化學(xué)特性)。"最大實(shí)用劑量"是成年對(duì)象可安全服用的藥物的最大量。應(yīng)當(dāng)指出，如在說明書和所附權(quán)利要求書中所使用的，未用量詞修飾以及用泛指的"一"修飾的術(shù)語(yǔ)("a"、"an，，以及"the")包括其對(duì)應(yīng)的單數(shù)和復(fù)數(shù)形式，除非文中另外明確指出。本文中提及的"絨毛戴星草提取物"或"絨毛戴星草的提取物，，意指存在于植物絨毛戴星草中的化合物的混合物。這些化合物是使用本領(lǐng)域公知的提取方法(例如使用有機(jī)溶劑比如低級(jí)醇、烷基酯、烷基醚、烷基酮、氯仿、石油醚、己烷和/或無(wú)機(jī)溶劑比如水)從所述植物的干燥頭狀花序和果序中提取的。本發(fā)明的從絨毛戴星草的頭狀花序和果序中提取植物成分衍生物的方法可以放大以用于大規(guī)模制備。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"活性成分"指"絨毛戴星草提取物"或"化合物l"或"含有兩種或更多種活性化合物之混合物的絨毛戴星草的富集提取物"。可使用常規(guī)技術(shù)比如高效液相色鐠法(HPLC)或高效薄層色鐠法(HPTLC)將絨毛戴星草提取物標(biāo)準(zhǔn)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種草藥組合物，其包含標(biāo)準(zhǔn)化的絨毛戴星草提取物與藥學(xué)可接受載體?？梢酝ㄟ^生物活性指導(dǎo)的柱色鐠純化和制備性HPLC，從絨毛戴星草的頭狀花序和果序的提取物中分離出生物活性標(biāo)志化合物。可通過對(duì)波鐠數(shù)據(jù)的分析來(lái)表征化合物。本發(fā)明的草藥組合物包含絨毛戴星草的頭狀花序和果序的提取物以及任選地一種或多種其它活性劑，所述提取物包含2-9%的作為生物活性標(biāo)志物的33-羥基-53，9-二曱基-3-亞甲基-33，4,5,53，6,7,8,91)-八氫-311-萘并[l，2-b呋喃-2-酮(化合物l)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含作為活性成分的3a-羥基-5a，9-二甲基-3-亞甲基-3a，4，5,5a,6,7,8,9b-八氫-3H-萘并[1,2-b呋喃-2-酮(化合物l)以及藥學(xué)可接受載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含3a-羥基-5a，9-二曱基-3-亞甲基-3a,4,5,5a，6,7，8,9b-八氫-3H-萘并[l,2-b呋喃-2-酮(化合物1)的所述組合物在制備用于治療炎性病癥的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及制備可用于治療炎性病癥的組合物的方法。將絨毛戴星草的標(biāo)準(zhǔn)化提取物與藥學(xué)可接受載體混合并配制成治療劑型。根據(jù)所期望的效果來(lái)選擇每日施用劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供所述包含絨毛戴星草的標(biāo)準(zhǔn)化提取物的草藥組合物用于治療炎性病癥。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含3a-羥基-5a,9-二甲基-3-亞甲基-3a，4，5，5a,6,7,8,9b-八氫-3H-萘并[l,2-b呋喃-2-酮(化合物l)以及藥學(xué)可接受載體的組合物用于治療炎性病癥。通過相關(guān)領(lǐng)域已知的方法從絨毛戴星草中分離出化合物1(3a-羥基畫5a，9畫二曱基畫3-亞甲基畫3a，4，5，5a，6,7，8，9b-八氫畫3H-萘并[l,2■b呋喃-2畫酮)，并通過核磁共振(NMR)和質(zhì)譜法進(jìn)行表征。所述組合物包含化合物1(3a-羥基-5a,9-二曱基-3-亞甲基-3&,4，5，53,6,7,8，91)-八氫-311-萘并[1，2-1)1呋喃-2-酮)，該化合物也可得自其它植物來(lái)源或可通it)it本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)合成方法而制備。因此，本發(fā)明在其范圍內(nèi)涵蓋包含化合物1的用于治療炎性病癥的藥物組合物，所述化合物l可得自其它來(lái)源。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種通過混合3a-羥基-5a,9-二甲基-3-亞曱基-3a,4,5,5a，6，7，8，9b-八氫-3H-萘并[l,2-b呋喃-2-酮(化合物1)與一種或多種藥學(xué)可接受載體和配制成治療劑型來(lái)制備包含化合物1的藥物組合物的方法。才艮據(jù)所期望的效果來(lái)選#^每日施用劑量?？煽诜┯帽景l(fā)明的組合物，例如以丸、片、包衣片、膠嚢、顆粒、酏劑或糖漿的形式。使用絨毛戴星草的頭狀花序和果序的提取物以制備含有3-70%(重量)所述提取物的口服制劑，所述提取物被充分混合進(jìn)常MJ^質(zhì)中，這將在下文中詳細(xì)描述。含有2-9%(w/w)的作為生物活性標(biāo)志物的化合物1的所述頭狀花序和果序的提取物足以達(dá)到所期望的效果。使用化合物1(3a-羥基-5a，9-二甲基-3-亞甲基-3a，4，5，5a,6,7，8，9b-八氫-3H-萘并[l,2-b呋喃-2-酮)制^^有3-99%(重量)的所述化合物的口服制劑，所述化合物被充分混合進(jìn)常規(guī)基質(zhì)中，這將在下文中詳細(xì)描述。本發(fā)明化合物可用于局部施用和透皮施用。可用于本發(fā)明的局部組合物包括適于皮膚局部應(yīng)用的制劑。所述組合物可配制成各種產(chǎn)品形式，其包括但不限于洗劑、乳骨、凝膠、棒(stick)、噴霧劑或軟骨。使用絨毛戴星草的頭狀花序和果序的提取物制M有1-15%(重量)所述提取物的局部制劑，所述提取物被充分混合進(jìn)常規(guī)J^質(zhì)中，這將在下文中詳細(xì)描述。含有約2-9%(w/w)的作為生物活性標(biāo)志物的化合物1的所述絨毛戴星草的頭狀花序和果序的提取物足以達(dá)到所期望的效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供所述組合物用于治療由TNF-a和白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)所介導(dǎo)的炎性病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供所述組合物用于治療由細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子l(VCAM-1)和E-選擇蛋白所介導(dǎo)的炎，性病癥。在本發(fā)明的組合物中，活性成分"絨毛戴星草提取物"或化合物1的實(shí)際劑量水平可以變化，從而獲得有效達(dá)到針對(duì)具體患者、組合物和施用方式而言所期望的治療反應(yīng)的活性成分的量。所選擇的劑量水平將取決于多種因素，包括所使用的具體活性成分"絨毛戴星草提取物"或"化合物l"的活性、施用途徑、施用時(shí)間、所用具體組合物的排泄速率、治療持續(xù)時(shí)間、與其它提取物的聯(lián)合使用、所治療患者的年齡、性別、重量、病癥、一般健康狀況和先前病史、以及在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的類似因素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了聯(lián)合包含活性成分"絨毛戴星草提取物"或化合物1與表現(xiàn)出抗炎活性的至少一種其它草藥提取物的組合物以獲得協(xié)同作用。這樣的其它植物可選自植物比如姜黃(CWc"附fl/o"gfl)和姜(ZfVig幼er6^"Vifl/e)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物還包含活性成分"絨毛戴星草提取物"或化合物1與至少一種生物活性物質(zhì)的組合以獲得協(xié)同作用。在又一個(gè)實(shí)施方案中，包含活性成分"絨毛戴星草提取物"或化合物1的本發(fā)明組合物可任選地含有至少一種其它抗炎劑或者也可與常規(guī)抗炎劑聯(lián)合使用。所述抗炎劑可選自甾類比如潑尼松龍、氫化可的松；疾病緩解型抗風(fēng)濕藥(DMARD)比如氨甲喋呤、柳氮磺胺吡啶；或NSAID比如萘普生、雙氯酚酸、布洛芬等。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了所述包含活性成分"絨毛戴星草提取物"或從絨毛戴星草提取物分離的化合物1的草藥組合物用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案還涉及包含所述活性成分的所述組合物的TNF-a和白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)抑制活性。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案還涉及包含所述活性成分的所述組合物對(duì)粘附分子(比如細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1)和E-選擇蛋白)的細(xì)胞表面表達(dá)的抑制作用。本發(fā)明的組合物適用于治療由TNF-a、白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)和ICAM-1、VCAM-1以及E-選擇蛋白所介導(dǎo)的急性和慢性形式的炎性病癥，對(duì)人來(lái)說尤其是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、難治性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性非類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松/骨重吸收，冠心病、脈管炎、潰瘍性結(jié)腸炎、銀屑病、成年型呼吸窘迫綜合征、阿爾茨海默病。本發(fā)明的組合物還可用于治療疾病中的炎癥，所述疾病如炎性腸病、克羅恩病、膿毒性休克綜^^征、動(dòng)脈粥樣硬化和多種自身免疫疾病等臨床病癥。本發(fā)明還涉及治療炎性病癥的方法，其包括通過口服途徑、通過局部施用、通過透皮施用而選擇性地施用本發(fā)明的組合物o以下實(shí)施例舉例說明但不限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，此處的討論僅為示例性的實(shí)施方案，而不意在限制本發(fā)明更寬泛的方面，其更寬泛的方面通過這些示例性內(nèi)容來(lái)體現(xiàn)。實(shí)施例1絨毛戴星草甲醇提取物的制備將絨毛戴星草的干燥頭狀花序和果序(200g)粉碎。通過攪拌使用曱醇(2.5l)在60"c提取粉末化材料3小時(shí)。真空下過濾提取物。再重復(fù)此提取過程兩次。合并提取物并濃縮。產(chǎn)率23.29g(11.65%w/w)。通過hptlc估算，發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1的提取物含有6%的化合物1(描述于實(shí)施例4中)。實(shí)施例2絨毛戴星草乙酸乙酯提取物的制備將絨毛戴星草的干燥頭狀花序和果序(350g)粉碎。通過攪拌使用乙酸乙酯(3l)在60x:提取粉末化材料3小時(shí)。真空下過濾提取物。再重復(fù)此提取過程兩次。合并提取物并濃縮。產(chǎn)率19g(9.5%w/w)。實(shí)施例3絨毛戴星草水提取物的制備將絨毛戴星草的干燥頭狀花序和果序(200g)粉碎。通過攪拌使用7jc(1.2l)在8ot:-9or;提取粉末化材料3小時(shí)。真空下過濾提取物。重復(fù)此提取過程。合并提取物并濃縮以除去水。將粗提取物通過冷凍干燥進(jìn)一步干燥。產(chǎn)率21g(10.5%w/w)。實(shí)施例43a-羥基-5a,9-二甲基-3-亞甲基-3a,4,5,5a，6,7,8,9b-八氫-3H-萘并[l，2-b呋喃-2-酮(化合物l)的分離將通過實(shí)施例1所述方法制備的甲醇提取物(32g)通過柱色譜(硅膠，氯仿/曱醇)純化。通過制備性HPLC實(shí)現(xiàn)最終純化(硅膠柱，己烷:異丙醇95:5)以獲得標(biāo)題化合物。1H國(guó)R(CDCI3'500MHz):51.085(3H,CH3),4.997(1H's),5.801(1H,S)'6.270(1H,s);MS:m/e(ES)248(M+).通過將所獲得的波i普數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)凈艮道(IndianJournalofChemistry,Vol.25B,233-238,(1986);J.ChemSoc.PerkinTrans.1:(2),157-160,(1988);J.Chem.Research(M),0501-0509,1989)比較，對(duì)化合物進(jìn)行表征。藥理學(xué)結(jié)果通過本領(lǐng)域眾所周知的并在下面描述的多種藥理學(xué)試驗(yàn)，測(cè)定了本發(fā)明的植物提取物、通過對(duì)所述提取物純化而分離的化合物以及制劑在抑制TNF-a和白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6和IL-8)的活性方面的功效。體外篩選以鑒定TNF-d抑制劑實(shí)施例5初步篩選-人外周血單個(gè)核細(xì)胞(hPBMC)根據(jù)Jansky,L.等(Physiol.Res.52:593-598，(2003))描述的方法測(cè)定在hPBMC中由脂多糖(LPS)產(chǎn)生的TNF-a。將健康供血者的血液采集到EDTA鉀真空采血管(vacutainertube)(BD真空采血管)中。在Histopaque-1077溶液(Sigma)中使用梯度離心分離PBMC。將分離出的PBMC懸于含有10%胎牛血清(FBS)(Hyclone，Utah,USA)、100U/ml青霉素(SigmaChemicalCo.StLouis，MO)和100jig/ml鏈霉素(SigmaChemicalCo.StLouis,MO)的RPMI1640培養(yǎng)基(GibcoBRL，Pasley，UK)中。將細(xì)胞濃度調(diào)整到lxl(^個(gè)細(xì)胞/ml。通過臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定的活力均二98%。向96孔培養(yǎng)板的孔中加入細(xì)胞懸液(lOOnl)。在細(xì)胞鋪板后，向細(xì)胞中加入79nl培養(yǎng)基和lnl八種不同濃度的溶解在DMSO(二甲基亞砜,Sigma,MO,USA)中的測(cè)試樣品(最終濃度為0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100照/ml)。將DMSO的最終濃度調(diào)整到0.5%。使用載體(0.5%DMSO)用作對(duì)照。使用咯利普蘭(100、300jiM)作為標(biāo)準(zhǔn)。說明書第14/29頁(yè)將板在37X:于5%C02氣氛下培養(yǎng)30分鐘。最后，加入20jil(10jug/ml)每孔的LPS(大腸桿菌(五"/i^r/^"co//)0127:B8,SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)，最終濃度為1照/ml。將板在37C于5%<:02氣氛下培養(yǎng)5小時(shí)。為評(píng)價(jià)所述植物提取物的細(xì)胞毒作用，在培養(yǎng)5小時(shí)后使用MTS(3-(4，5-二甲基蓬喳-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺?；?-211-四唑鏺)試劑進(jìn)行細(xì)胞活力試驗(yàn)。收獲上清液并按照制造商的說明，通過ELISA(OptiEIAELISAsets,BDBiosciences,Pharmingen)測(cè)定TNF-a。記錄抑制百分率。評(píng)價(jià)測(cè)試樣品與對(duì)照相比的細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)。結(jié)果歸納于表l中。表l:人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的TNF-a抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例6對(duì)LPS刺激后hPBMC釋放的促炎性細(xì)胞因子的作用植物提取物對(duì)促炎性細(xì)胞因子的作用使用在初步篩選試驗(yàn)中產(chǎn)生的上清液測(cè)定TNF-a、白細(xì)胞介素-ip(IL-l卩)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素國(guó)8(IL國(guó)8)。按照制造商的"i兌明(OptiEIAELISAsets,BDBiosciences,Pharmingen)，通過ELISA評(píng)估這些細(xì)胞因子的7JC平。通過非線性回歸方法，使用GraphPad軟件(Prism3.03)計(jì)算50%抑制濃度值(IC50)。表2:實(shí)施例l的提取物對(duì)促炎性細(xì)胞因子的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>結(jié)論發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1的提取物抑制由LPS刺激后hPBMC釋放的促炎性細(xì)胞因子(TNF-a、IL-ip、IL-6和IL-8)。實(shí)施例7化合物1對(duì)由LPS刺激后hPBMC釋放的促炎性細(xì)胞因子的作用通過使用實(shí)施例4的方法得到化合物1。按照實(shí)施例6的方法進(jìn)行生物活性評(píng)價(jià)。化合物1對(duì)促炎性細(xì)胞因子的作用使用在初步篩選試驗(yàn)中產(chǎn)生的上清液測(cè)定TNF-a、白細(xì)胞介素-ip(IL-1(5)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-8(IL畫8)。按照制造商的說明(OptiEIAELISAsets,BDBiosciences,Pharmingen)，通過ELISA評(píng)估這些細(xì)胞因子的水平。通過非線性回歸方法，使用GraphPad軟件(Prism3.03)計(jì)算50%抑制濃度值(IC50)。結(jié)果歸納于表3中。表3:化合物l對(duì)促炎性細(xì)胞因子的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>結(jié)論發(fā)現(xiàn)化合物1抑制由LPS刺激后hPBMC釋放的促炎性細(xì)胞因子(TNF國(guó)a、IL畫ip、IL-6和IL-8)。實(shí)施例8對(duì)由得自RA患者的滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子的作用才艮據(jù)由Brennan，F(xiàn).M.等描述的方法(TheLancet.July29:244-247,(1989)),測(cè)定由得自經(jīng)歷膝置換手術(shù)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者的滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。將所述滑膜組織在含有10%FBS、100U/ml青霉素和100照/ml鏈霉素、4mg/mlI型膠原酶(Worthington)、1.5照/mlI型脫氧核糖核酸酶(Sigma)以及15U/ml肝素的DMEM(Gibco)中消化并在37C培養(yǎng)3小時(shí)。培養(yǎng)后，通過70pm膜過濾消化后組織并在完全培養(yǎng)基(含有10%FBS的DMEM)中清洗細(xì)胞3次。在測(cè)試樣品存在/不存在下，將滑膜細(xì)胞以lx106個(gè)細(xì)胞/1111培養(yǎng)10小時(shí)。通過離心收獲上清液，通過ELISA測(cè)定細(xì)胞因子(TNF-ouIL-ip、IL-6和IL-8)的水平。為評(píng)價(jià)所述植物提取物的細(xì)胞毒作用，使用MTS試劑進(jìn)行細(xì)胞活力試驗(yàn)。通過非線性回歸方法，使用GraphPad軟件(Prism3.03)計(jì)算50%抑制濃度值(IC50)。結(jié)論發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1的提取物抑制由得自RA患者的滑膜細(xì)胞所產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子(TNF-a、IL-ip、IL-6和IL-8)。實(shí)施例9化合物1對(duì)由得自RA患者的滑膜細(xì)胞所產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子的作用按照實(shí)施例8的方法所述，研究了化合物1對(duì)由得自RA患者的滑膜細(xì)胞所產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子的作用。結(jié)果歸納于表4中。表4:化合物l對(duì)由滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子的作用序<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>結(jié)論發(fā)現(xiàn)化合物1抑制由得自RA患者的滑膜細(xì)胞所產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子(TNF-a、IL-6和IL-8)。實(shí)施例10用于粘附分子表達(dá)的細(xì)胞ELISA基于參考文獻(xiàn)Transplantation,Vol63(5)，759-764，1997并有改動(dòng)而設(shè)計(jì)本試驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)和試劑人^#脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)得自CascadeBiologies并在37"C下于5%C02培養(yǎng)箱中維持在添加低血清生長(zhǎng)補(bǔ)充劑(LSGS)的M200(CascadeBiologies,Portland,Or)中。在添加10%FBS(Hyclone,Logan,UT)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)U937細(xì)胞(ATCC,Manassas,VA)。重組人TNF-a，ICAM-1、VCAM誦1和E-選擇蛋白的抗體得自R&DSystems,LPS得自Sigma(St.Louis,MO)。粘附分子表達(dá)的細(xì)胞ELISA以7x105個(gè)細(xì)胞/孔將HUVEC鋪于包被纖連蛋白的96孔板上。在添加測(cè)試化合物后30分鐘，以TNF-a(10ng/ml)或LPS(1jig/ml)剌激細(xì)胞。刺激后，用在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的多聚甲醛固定細(xì)胞(E-選擇蛋白和ICAM-1)。用在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的2%牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異性結(jié)合1小時(shí)，并使所述細(xì)胞與第一抗體一起培養(yǎng)2小時(shí)。為檢測(cè)VCAM-l,將所述細(xì)胞封閉，與第一抗體培養(yǎng)過夜，然后固定。用含0.1%BSA的PBS清洗細(xì)胞，并使細(xì)胞與偶聯(lián)過氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)的抗體(Ab)—起培養(yǎng)卯分鐘。清洗七次后，添加3，3，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺液體底物(TMB底物)，并4吏用微滴定板讀數(shù)儀(Spectramax,MolecularDevices,CA)在450nm測(cè)定每孔的光密度。使用BAY11-7082[(E)-3-(4-甲基苯基磺it^)-2-丙烯腈作為標(biāo)準(zhǔn)，DMSO作為載體對(duì)照。評(píng)價(jià)測(cè)試樣品與對(duì)照相比的抑制百分?jǐn)?shù)。通過非線性回歸方法測(cè)定每個(gè)樣品相對(duì)于對(duì)照的50%抑制濃度(IC5。)。結(jié)果歸納于表5中。表5:實(shí)施例1的提取物和化合物1對(duì)粘附分子表達(dá)的細(xì)胞ELISA<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>結(jié)論實(shí)施例1的提取物和化合物1劑量依賴地降低TNF-a誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(如ICAM-1、VCAM-1和E-選擇蛋白)的表面表達(dá)。實(shí)施例11THP-1單個(gè)核細(xì)胞向HUVEC單層的粘附使用前單核細(xì)胞系THP-1(已在Circ.Res.,97,236-243,2005中確立作為在粘附研究中單核細(xì)胞的有用模型，有改動(dòng))進(jìn)行粘附研究。以標(biāo)記介質(zhì)(M200加LSGS)清洗THP-1細(xì)胞兩次。在室溫下，使用10照/ml的雙-羧乙基-氛基熒光素乙酰氡基甲酯(熒光探針，BCECF-AM;Sigma)標(biāo)記THP-1細(xì)胞(6xl05個(gè)細(xì)胞/ml)30分鐘。在以0.1%BSA猝滅后，將沉淀重懸于標(biāo)記介質(zhì)中。為評(píng)價(jià)單核細(xì)胞粘附，在各種濃度的測(cè)試樣品存在或不存在下，以TNF-a(lng/ml)處理HUVEC單層。除去培養(yǎng)基，清洗，并向孔中加入標(biāo)記的THP-1細(xì)胞(6xl(^個(gè)細(xì)胞/孔)，在室溫下于暗處培養(yǎng)10分鐘。在共培IM^后，清洗孔，加入裂解緩沖液(含0.1%Triton-X的1.5MTris緩沖液)并培養(yǎng)30分鐘。使用熒光讀數(shù)器(PolarStarOptima,BMGLabtech)測(cè)定熒光，^JL峰為485nm，發(fā)射峰為520nm。值為平均值+SEM，代表熒光粘附數(shù)據(jù)。BAY11-7082[(E)-3-(4-曱基苯基磺?；?-2-丙烯腈用作標(biāo)準(zhǔn)，DMSO作為載體對(duì)照。結(jié)果歸納于表6中。表6:由實(shí)施例1的提取物和化合物1引起的THP-1單個(gè)核細(xì)胞<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>結(jié)論實(shí)施例1的提取物和化合物1分別在10pg/ml和1抑制TNF-a刺激后單核細(xì)胞THP-1對(duì)HUVEC的粘附。由于這些化合物抑制粘附分子在HUVEC細(xì)胞表面的表達(dá)以及抑制單核細(xì)胞對(duì)HUVEC的粘附，因此其可阻礙白細(xì)胞遷移，這是慢性炎性疾病中的關(guān)鍵事件并可證實(shí)在多數(shù)炎性病癥中是有益的。體內(nèi)研究實(shí)施例12BALB/c小鼠中脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子(TNF)-a的釋放采用由FukudaT.等(Eur.J.Pharmacol"391:317-320,(2000))描述的方案。將BALB/c小鼠分組，每組10只。給所述小鼠口服(p.o.)施用懸于Tween80和0.5。/。羧甲基纖維素(CMC)中的測(cè)試樣品。一小時(shí)后，以lmg/kg的劑量腹腔內(nèi)施用溶于無(wú)菌、無(wú)熱原鹽水中的LPS。陰性對(duì)照組通過腹腔內(nèi)注射鹽水，而所有其它組接受LPS。使用咯利普蘭(30mg/kg,口服)作為標(biāo)準(zhǔn)藥物。一個(gè)半小時(shí)后，在尿烷麻醉(1.5g/kg,腹腔內(nèi)注射)下，使用以肝素(500IU/ml)沖洗過的lml注射器從腹動(dòng)脈采血。在釆血管中使用肝素(5pl)作為抗凝劑。在室溫下通過在10000rpm離心而分離血漿，將試樣等分并存儲(chǔ)于-70X:直到分析。使用ELISA測(cè)定血樣中的TNF-a水平，并相對(duì)于對(duì)照組計(jì)算TNF-a釋放的抑制百分?jǐn)?shù)。結(jié)果歸納于表7中。表7:對(duì)于實(shí)施例1的提取物和對(duì)于化合物1而言的在BALB/c小鼠中由脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的肺瘤壞死因子(TNF)-a的釋放<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>結(jié)論實(shí)施例1的提取物和化合物1抑制BALB/c小鼠中的TNF-a釋放。實(shí)施例13DBA/1J小鼠中^f、誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)使用在弗氏完全佐劑中作為乳液的200照II型膠原，通it^尾根部皮內(nèi)注射來(lái)免疫8-10周齡的雄性DBA/lJ小鼠。21天后，給小鼠施用100照II型膠原的加強(qiáng)免疫。還同時(shí)維持一組未免疫小鼠。從第23天起，使用關(guān)節(jié)指數(shù)作為M,評(píng)價(jià)小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)作。將具有最小后爪得分為2的小鼠納入^研究中。以400111*丄(亳克/千克體重)的劑量通過口服途徑每日兩次施用實(shí)施例1的提取物12天。以50m.p.k.和lOOm.p.k.的劑量通過口服途徑每日兩次施用化合物l，施用12天。使用Enbrel(3mg/kg)作為標(biāo)準(zhǔn)品并每日一次皮下施用。每日記錄爪體積和關(guān)節(jié)指數(shù)。分析表明，數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，處理小鼠的足爪進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。足爪厚度的減少和關(guān)節(jié)指數(shù)的降低的數(shù)據(jù)歸納于表8中。表8:實(shí)施例1的提取物和化合物1在CIA模型中的功效<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>組織病理學(xué)分析評(píng)價(jià)了實(shí)施例1的提取物和化合物1對(duì)于關(guān)節(jié)炎(CIA)DBA/1J小鼠的疾病的有益作用。在對(duì)滑膜關(guān)節(jié)進(jìn)行蘇木素伊紅染色和番紅O染色后進(jìn)行顯樹:鏡檢查。組織病理學(xué)分析表明，與載體處理組相比，無(wú)論是實(shí)施例1的提取物，還是化合物1在減少軟骨破壞、骨破壞和滑膜炎方面均發(fā)揮了有益作用。結(jié)論實(shí)施例1的提取物和化合物1均在關(guān)節(jié)炎的CIA模型中發(fā)揮有益作用。毒性研究實(shí)施例14急性口服毒性按照藥品和化妝品法案(1940，印度)中的"Y方案"中發(fā)布的指導(dǎo)原則，測(cè)試了實(shí)施例1提取物對(duì)SpragueDawley大鼠的急性口Ji艮毒性。將懸于0.5%Tween80水溶液中的實(shí)施例1的提取物以2000mg/kg體重的最大實(shí)用劑量作為單劑量通過管飼法口服施用給由5只雄性大鼠和245只雌性大鼠組成的組。在施用后14天內(nèi)觀察動(dòng)物的死亡率和毒性癥狀，并記錄其體重。在研究結(jié)束時(shí)對(duì)所有大鼠進(jìn)行尸體檢查。結(jié)論在本研究中，以2000mg/kg體重的最大實(shí)用劑量給SpragueDawley大鼠單劑量口月Mfe用實(shí)施例1的提取物，未引起處理大鼠的任何死亡。發(fā)現(xiàn)在以單劑量給SpragueDawley大鼠口月Mfe用后，無(wú)論對(duì)于雄性還是雌性，實(shí)施例1提取物的半數(shù)致死劑量(LD5Q)均大于2000mg/kg體重。實(shí)施例15亞急性口服毒性按照藥品和化妝品法案(1940，印度)中的"Y方案"中發(fā)布的指導(dǎo)原則，進(jìn)行了實(shí)施例1提取物對(duì)SpragueDawley大鼠的亞急性口服毒性(28天)研究。通過管飼法給各組SpragueDawley大鼠(每組6只雄性大鼠和6只雌性大鼠)每日分別施用0、250、500或1000mg/kg體重的劑量的實(shí)施例1提取物，持續(xù)28天，并在第29天將大鼠處死以評(píng)價(jià)其毒性。每天檢查大鼠的毒性癥狀。在實(shí)驗(yàn)期間記錄各個(gè)大鼠的體重和食物消耗以及所有的死亡事件和不健康癥狀。在研究結(jié)束時(shí)進(jìn)行血液的實(shí)驗(yàn)室研究。當(dāng)最終處死時(shí)，對(duì)所有的動(dòng)物進(jìn)行完全的尸體檢查并記錄某些器官的重量。對(duì)來(lái)自對(duì)照組和高劑量組的所有動(dòng)物的所有方案列出的組織均進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。所有接收1000mg/kg以及至多1000mg/kg劑量的實(shí)施例1提取物的動(dòng)物在處理期間均存活。在任何的處理動(dòng)物中，均未，見察到毒性的臨床癥狀。關(guān)于體重增加和食物攝入的數(shù)據(jù)表明，在1000mg/kg劑量以及至多該劑量，沒有因測(cè)試物引起不M^應(yīng)。結(jié)論基于本研究的發(fā)現(xiàn)，在口月良施用28天后，在大鼠中未發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1提取物的可觀察到的不良反應(yīng)水平(NOAEL)超過1000mg/kg體重。制劑實(shí)施例16膠嚢的制備一般方法稱重規(guī)定量的成分01到05并轉(zhuǎn)移至合適的混合器中。將內(nèi)容物充分混合并加入成分09、lO和ll，繼續(xù)混合。向此混合物中加入成分06、07和08并將物料混合30-45分鐘。將混合物通過40目篩，并用于填充膠嚢。表9:絨毛戴星草的膠嚢制劑每粒膠嚢含有<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實(shí)施例17片劑的制備一般方法稱重規(guī)定量的成分01到05并轉(zhuǎn)移至合適的混合器中。加入成分13并將濕物料充分混合。向其中加入成分09、10、11和12，并繼續(xù)混合直到得到均勻的物料。將此濕物料通過16目篩并在7or;士5r干燥濕顆粒。向上述顆粒中加入成分06、07和08并將物料混合30-45分鐘。然后將混合物通過40目篩并使用合適的沖頭壓片。表10:絨毛戴星草的片劑制劑每片含有序號(hào)成分量o/oW/W<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>*僅用于制粒子實(shí)施例18糖漿的制備一般方法稱重成分Ol并在連續(xù)攪拌下向其中加入成分15。向其中加入稱重量的成分03、04、05、06、08、09、10、11、12和14，并連續(xù)攪拌以溶解。稱重成分02和13并將其溶于成分07中。向其中加入純化水并調(diào)整體積到10ml。通過壓濾機(jī)/尼龍布過濾所得的溶液。表ll:絨毛戴星草的糖漿制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例19乳膏制劑的制備一般方法稱重成分01并將其懸于成分17中。熔融成分02至07。稱重成分08、09、10、11、13和14并與成分18的一部分混合。稱重成分12并加入到成分18的余下部分中，與成分15和16—起混合。所有步驟的成分在55"C混合并均化，使其冷卻并包裝于合適的管中。表12:絨毛戴星草的乳骨制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實(shí)施例20凝膠制劑的制備一般方法稱重成分01并懸于成分06中。將成分04溶于成分07中?；旌铣煞?5和08?；旌铣煞?2和03。將混合物充分混合并包裝于合適的管中。表13:絨毛戴星草的凝膠制劑每100g凝膠含有<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例21軟骨制劑的制備一般方法稱重成分02至06并在合適的容器中熔融。向其中加入成分Ol。向此混合物中加入成分07和08。將成分充分混合并包裝于合適的管中。表14:絨毛戴星草的軟骨制劑每100g軟膏含有<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例22片劑的制備一般方法分別稱重成分01和02，通過20目篩并混合。稱重成分03至07并通過40目篩?；旌铣煞?3、04、05和07并向此混合物中加入成分01和02。向此混合物中加入成分06并混合。使用合適的機(jī)器工具壓制所得的潤(rùn)滑的混合物。表15:化合物1的片劑制劑每片含有序號(hào)成分量CT/W01化合物l58.3302」微晶纖維素35.9703滑石2.5004乙醇酸淀粉鈉1.6005膠體二氧化硅0,8006硬脂酸鎂0.5007喹淋黃色素0.30實(shí)施例23片劑的制備一般方法分別稱重成分01和02并通過20目篩。在攪拌下將成分04溶于成分08中。使用粘合溶液將上述混合物制粒。使?jié)裎锪贤ㄟ^合適的篩。在室溫(25x:)下干燥此過篩的物料，然后在約4or;下干燥。使干物料通過合適的篩篩分。使成分03、05和07分別通過40目篩并混合。將其加入該干物料中并混合。向此混合物中加入成分06并使用合適的機(jī)器工具壓制此潤(rùn)滑的混合物。表16:化合物l的片劑制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實(shí)施例24膠嚢的制備一般方法分別稱重成分01和02，通過20目篩并混合。稱重成分03并通過40目篩篩分?；旌纤械某煞植⑹褂贸煞?4潤(rùn)滑。使用合適的機(jī)器工具將此混合物填充進(jìn)空的硬明膠膠嚢中。表17:化合物l的膠嚢制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>權(quán)利要求1.一種組合物，其包含作為活性成分的治療有效量的植物絨毛戴星草(Sphaeranthusindicus)的頭狀花序和果序的提取物以及藥學(xué)可接受載體。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述絨毛戴星草的提取物包含生物活性標(biāo)志物。3.權(quán)利要求2的組合物，其中包含于所述絨毛戴星草提取物中的所述生物活性標(biāo)志物是3a-羥基-5a,9-二甲基-3-亞甲基國(guó)3a，4，5，5a，6，7，8，9b-八氫-3H-萘并[l,2-b]呋喃-2-酮(化合物1)。4.權(quán)利要求3的化合物，其中所述絨毛戴星草的提取物包含2-9%的所述化合物1。5.—種組合物，其包含作為活性成分的治療有效量的3a-羥基-5a,9-二曱基-3-亞甲基-3a,4,5，5a,6,7，8，9b-八氫-3H-萘并[l，2-b呋喃-2-酮(化合物l)以及藥學(xué)可接受載體。6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的組合物，其中提供所述組合物用于治療由腫瘤壞死因子-a(TNF-a)和白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)所介導(dǎo)的病癥。7.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物適于治療炎性病癥。8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述炎性病癥是由TNF-a所介導(dǎo)的炎性病癥。9.權(quán)利要求7的組合物，其中所述炎性病癥是由白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)所介導(dǎo)的炎性病癥。10.權(quán)利要求7的組合物，其中所述炎性病癥是由細(xì)胞間粘附分子l(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1)和E-選擇蛋白所介導(dǎo)的炎性病癥。11.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的組合物，其中將所述組合物口服、局部或透皮施用給需要治療炎性病癥的對(duì)象。12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述組合物配制成片劑、膠嚢或糖漿的形式供口服施用。13.權(quán)利要求ll的組合物，其中所述組合物配制成乳骨、凝膠或軟骨的形式供局部施用。14.權(quán)利要求7至13中任一項(xiàng)的組合物，其中所述炎性病癥選自炎性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、4艮屑病關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、難治性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性非類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松/骨重吸收、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、脈管炎、潰瘍性結(jié)腸炎、4艮屑病、成年型呼吸窘迫綜合征、糖尿病、皮膚遲發(fā)型超^t反應(yīng)病癥和阿爾茨海默病。15.治療炎性病癥的方法，其包括給有此需要的對(duì)象施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的組合物。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述組合物配制成供口服施用。17.權(quán)利要求15的方法，其中所述組合物配制成供局部施用。18.權(quán)利要求15的方法，其中所述組合物配制成供透皮施用。19.權(quán)利要求15的方法，其中所述炎性病癥選自炎性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、難治性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性非類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松/骨重吸收、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、脈管炎、潰瘍性結(jié)腸炎、銀屑病、成年型呼吸窘迫綜合征、糖尿病、皮膚遲發(fā)型超敏>^應(yīng)病癥和阿爾茨海默病。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述炎性病癥是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。21.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的組合物，還包含至少一種抗炎劑。22.權(quán)利要求21的組合物，其中所述抗炎劑選自潑尼松龍、氫化可的松、氨甲喋呤、柳氮磺胺吡啶、萘普生、雙氯酚酸、布洛芬。23.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的組合物在制備用于治療炎性病癥的藥物中的用途。24.權(quán)利要求23的組合物的用途，其中所述炎性病癥選自炎性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、4艮屑病關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、難治性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性非類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏;f公/骨重吸收、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、脈管炎、潰瘍性結(jié)腸炎、4艮屑病、成年型呼吸窘迫綜合征、糖尿病、皮膚遲發(fā)型超M應(yīng)病癥和阿爾茨海默病。全文摘要本發(fā)明涉及一種新的包含植物絨毛戴星草的頭狀花序和果序的提取物的草藥組合物。所述絨毛戴星草的提取物包含作為生物活性標(biāo)志物的化合物3a-羥基-5a，9-二甲基-3-亞甲基-3a，4，5，5a，6，7，8，9b-八氫-3H-萘并[1，2-b]呋喃-2-酮(7-羥基-4，11(13)-桉葉烷二烯-12，6-內(nèi)酯)(化合物1)。本發(fā)明還涉及包含3a-羥基-5a，9-二甲基-3-亞甲基-3a，4，5，5a，6，7，8，9b-八氫-3H-萘并[1，2-b]呋喃-2-酮(化合物1)作為活性成分的組合物。本發(fā)明還涉及制備所述組合物的方法。本發(fā)明還涉及給需要治療炎性病癥的對(duì)象施用所述組合物的方法。本發(fā)明還涉及所述組合物的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)抑制活性。本發(fā)明涉及所述組合物對(duì)細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1)和E-選擇蛋白的表達(dá)的抑制作用。所述組合物可任選地包含至少一種抗炎劑或可與至少一種抗炎劑組合使用。文檔編號(hào)A61K133/00GK101304756SQ200680040770公開日2008年11月12日申請(qǐng)日期2006年9月28日優(yōu)先權(quán)日2005年9月30日發(fā)明者斯瓦蒂·巴爾-滕貝,沙普那·豪?！づ晾锟?維賈伊·周漢,達(dá)南賈伊·沙普雷,阿希什·素他,阿沙·庫(kù)爾卡尼-阿爾梅達(dá),阿肖克·庫(kù)馬爾·甘戈帕德亞申請(qǐng)人:皮拉馬爾生命科學(xué)有限公司