專利名稱：：用于干燥細(xì)胞形式的方法和組合物的制作方法用于干燥細(xì)胞形式的方法和組合物相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2005年8月11日提交的美國申請(qǐng)流水號(hào)60/707,425和2006年3月31日提交的美國申請(qǐng)流水號(hào)60/788,133的優(yōu)先權(quán)，并引證并入這兩項(xiàng)申請(qǐng)的全部內(nèi)容。背景病毒顆粒、細(xì)胞生物體(cellularorganisms)和其它膜結(jié)合物質(zhì)(membraneboundmaterials)的干燥形式在制藥產(chǎn)業(yè)和公共衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)中可以有很大的用處。千燥細(xì)胞形式(DCF)在長期儲(chǔ)存、加工便利性、食品投遞、農(nóng)業(yè)和人類衛(wèi)生應(yīng)用等方面顯示出效用。DCF的例子包括用于食品應(yīng)用的干酵母，深低溫保藏的細(xì)胞(例如血細(xì)胞)，以及用于基因投遞的全細(xì)胞(Trsic-Milanovicetal.，JSerb.Chem.Soc.,66:435-42,2001;Diniz-Mendesetal.,Biotechnol.Bioeng.，65:572-8,1999;及Sevilleetal.，J.GeneMed.,4:428-37,2002)。DCF通常由兩種方法制備i)凍干(ly叩hilization)或冷凍干燥(freeze-drying),其涉及對(duì)細(xì)胞形式的含水懸液進(jìn)行批量干燥(bulkdrying);或ii)深低溫保藏(cryopreservation)，其涉及將高水平的冷凍保護(hù)劑(cryoprotectant)注入含水細(xì)胞懸液中，并且以最大程度減少細(xì)胞死亡的規(guī)定速率將懸液溫度降低到0。C以下。凍干(或冷凍干燥)及深低溫保藏的一個(gè)缺andSnell，eds,,1984,MaintenanceofMicroorganisms:AManualofLaboratoryMethods,London,AcademicPress)。兩種技術(shù)都受到跨脂質(zhì)雙層膜傳質(zhì)及相關(guān)的;參透應(yīng)力(osmoticstress)的限制。在卡介苗(BCG)疫苗的產(chǎn)業(yè)化制備中使用凍干。每年數(shù)以百萬計(jì)的新生兒通過注射被給予BCG以防御結(jié)核(TB)，一種由稱作結(jié)核桿菌(tuberclebacillus)或結(jié)才亥分4支一干菌(鄉(xiāng)co6a"en'wmw6ercw/os7》的纟田菌引起的疾病(Rocheetal.,TrendsMicrobiol.,3:307-401,1995)。目前，TB是第六大致死因素，這種全球性傳染病正在以3%的估計(jì)年增長率增加。AIDS的出現(xiàn)和它與結(jié)核的聯(lián)系使得對(duì)新疫苗的需求日益緊迫，這是由于BCG在人體對(duì)TB感染的易感期內(nèi)，典型地是人生命的前30年內(nèi)，僅僅具有中等的效力(Fine,Lancet,346:1339-1345，1995)。BCG缺乏效力的可能原因之一是在生產(chǎn)出的DCF中BCG活力4交低。概述本發(fā)明部分地基于噴霧干燥細(xì)胞物質(zhì)的新方法和組合物的發(fā)現(xiàn)，這些方法和組合物展現(xiàn)顯著的產(chǎn)物得率、較高的生物體活性(例如活力)和良好的粉末加工性能。干燥細(xì)胞形式，例如，由本文公開的組合物和方法產(chǎn)生的干燥細(xì)胞形式，具有低的含水量，可適用于對(duì)受試者吸入給藥。干燥細(xì)胞形式在冰點(diǎn)以上(abovefreezing)的溫度儲(chǔ)存時(shí)保持一段時(shí)間的活性，為方便的儲(chǔ)存(例如長期儲(chǔ)存)和投遞提供了可能。這些性質(zhì)使得本文所述的方法和組合物可以用于疫苗制備物，例如，供注射給藥、口服或吸入的疫苗制備物。在一個(gè)方面中，本發(fā)明包括這樣的干粉末，其具有少于約10%(例如少于約8%、5%、4%、3%、2%或1%)的水(例如游離水)、細(xì)胞物質(zhì)、以及以干重計(jì)至少25%(例如至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或更多)的賦形劑。在一些實(shí)施方案中，粉末是沒有進(jìn)行冷凍而制備的。在一些實(shí)施方案中，粉末是通過噴霧干燥制備的。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞物質(zhì)包括細(xì)菌(例如分枝桿菌(M少co&"eWw附)屬細(xì)菌，例如結(jié)核分才支桿菌(Mrt/6ercw/ow》、恥祐分4支桿菌(Mswegma&)、或卡介苗(BacillusCalmette-Guerin))、病毒、真核微生物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如紅細(xì)胞、干細(xì)胞、粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或血小板)、膜結(jié)核細(xì)胞器、脂質(zhì)體、基于膜的生物反應(yīng)器、或基于膜的藥物投遞系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，賦形劑的質(zhì)量與細(xì)胞物質(zhì)的單位數(shù)之比為至少0.25pg賦形劑每單位細(xì)胞物質(zhì)(例如至少0.25、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10,000或20,000pg賦形劑每單位細(xì)胞物質(zhì))。在一些實(shí)施方案中，賦形劑質(zhì)量對(duì)細(xì)胞物質(zhì)質(zhì)量之比為至少0.1(例如至少0.25、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、100、200、500、1000或2000)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述粉末包括活細(xì)胞(例如細(xì)菌)時(shí)，多于0.5%(例如1%、2%、4%、5%、6%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%或更多)的細(xì)胞是活的。在一些實(shí)施方案中，在超過0。C(例如超過4。C、10。C、20。C、25。C、30。C、40。C或50。C)儲(chǔ)存多于10天(例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120天)的時(shí)間后，粉末中的活細(xì)胞保持它們初始活性的多于1/1000(例如多于1/500、1/200、1/100、1/50、1/20或1/10)。在一些實(shí)施方案中，賦形劑包括亮氨酸、甘露糖醇、海藻糖、右旋糖苷(dextran)、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、清蛋白、甘油、乙醇、或其混合物。在一些實(shí)施方案中，所述粉末不包括冷凍保護(hù)劑，例如添加的冷凍保護(hù)劑或者顯著量的冷凍保護(hù)劑(例如不是所述賦形劑的冷凍保護(hù)劑)。在一些實(shí)施方案中，所述粉末不包括鹽，例如添加的鹽或者顯著量的鹽。所述干粉可以配制為藥物組合物，例如用于吸入給藥的藥物組合物。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明包括制備包括細(xì)胞物質(zhì)的干粉末的方法，所述方法是通過提供水溶液，其中所述水溶液包括至少0.01mg/ml(例如，至少O.l、1、2、.5、10、20、50、100或200mg/ml)賦形劑和至少105單位/ml(例如，至少106、107、108、109或1(T單位/ml)的細(xì)胞物質(zhì)，并且在產(chǎn)生包含所述細(xì)胞物質(zhì)的、含有少于約10%(例如少于約8%、5%、4%、3%、2%或1%)重量的水(例如游離水)的干粉末的條件下，噴霧干燥所述溶液。在一些實(shí)施方案中，賦形劑質(zhì)量與細(xì)胞物質(zhì)單位數(shù)之比為至少0.25皮克賦形劑每單位細(xì)胞物質(zhì)(例如至少0.25、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10,000或20,000pg賦形劑每單位細(xì)胞物質(zhì))。在一些實(shí)施方案中，賦形劑質(zhì)量與細(xì)胞物質(zhì)質(zhì)量之比為至少0.1(例如至少0.25、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、100、200、500、1000或2000)。在一些其中細(xì)胞物質(zhì)包括細(xì)菌(例如革蘭氏陽性細(xì)菌)的實(shí)施方案中，所述溶液不含添加的鹽或冷凍保護(hù)劑。在一些其中細(xì)胞物質(zhì)包括真核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的實(shí)施方案中，所述溶液可以含有鹽或者其它足以使?jié)B透壓最小化的溶質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述溶液包括以干重計(jì)至少10%(例如至少25%、30%、40%、50%、60%、70o/o、80%、90%、92%、94。/o、96。/o、98%、99%或更多)的賦形劑。在一些實(shí)施方案中，所述溶液包括少于10"單位/ml(例如少于109、108、107或1(^單位/ml)的細(xì)胞物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞物質(zhì)包括細(xì)菌(例如分枝桿菌屬的細(xì)菌，例如結(jié)核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、或卡介苗)、病毒、真核微生物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如紅細(xì)胞、干細(xì)胞、小板)、膜結(jié)合細(xì)胞器、脂質(zhì)體、基于膜的生物反應(yīng)器、或基于膜的藥物投遞系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，所述賦形劑包括亮氨酸、甘露糖醇、海藻糖、右旋糖苷、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、清蛋白、甘油、乙醇、或其混合物。在一些實(shí)施方案中，所述水溶液不含有冷凍保護(hù)劑，例如不是所述賦形劑的冷凍保護(hù)劑。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將所述干粉末配制在藥物組合物中，例如用于吸入給藥的藥物組合物。本發(fā)明還包括由所述新方法產(chǎn)生的、包含細(xì)胞物質(zhì)的干粉末。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明包括將細(xì)胞物質(zhì)噴霧，以通過減小滲透應(yīng)力(osmoticstress)使對(duì)該物質(zhì)的損傷最小化的方法?？梢酝ㄟ^下面的方法來減小滲透應(yīng)力獲得待噴霧干燥之細(xì)胞物質(zhì)(本文中又稱細(xì)胞)單位的半徑初始值(W(0));選擇下列各項(xiàng)的值(i)噴霧干燥器的入口和出口氣體溫度差(AT);(ii)平均微滴大小(W);(iii)溶劑的氣化潛熱(義)；(iv)細(xì)胞物質(zhì)的膜對(duì)于冷凍保護(hù)劑的液壓滲透率(hydraulicpermeability)(Zp);(v)細(xì)胞外溶質(zhì)的摩爾數(shù)(:^);(vi)細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的摩爾數(shù)(x',);(vii)細(xì)胞外冷凍保護(hù)劑的摩爾數(shù)0%);(viii)冷凍保護(hù)劑的初始細(xì)胞內(nèi)濃度(C;(O));和(ix)細(xì)胞數(shù)("ce》；用這些值求出方程36<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>sin2(義")-人sin(義")cos(義")—義"2巧,人2-義"sin(義")cos(人)(36)的值，以及，若ic(f)在預(yù)測(cè)的干燥時(shí)間內(nèi)維持在最小極限和最大極限之內(nèi)，則使用所選值的條件噴霧干燥所述細(xì)胞物質(zhì)以使對(duì)所述物質(zhì)的損傷最小化。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括確定預(yù)測(cè)的干燥時(shí)間?？梢詫?duì)最小極限和最大極限加以選擇以使對(duì)所述物質(zhì)的損傷最小化。例如，最小極限可以為初始半徑的至少約60%(例如至少70%、80%、90%、95%、98%或99%)。例如，最大4及限可以為初始半徑的至多160°/。(例如至多140%、125%、110%、105%、102%或101%)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞物質(zhì)包括細(xì)菌(例如分枝桿菌屬的細(xì)菌，例如結(jié)核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、或卡介苗)、病毒、真核樣i生物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如紅細(xì)胞、干細(xì)胞、粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或血小板)、膜結(jié)合細(xì)胞器、脂質(zhì)體、基于膜的生物反應(yīng)器、或基于膜的藥物投遞系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，在即將進(jìn)行噴霧干燥前對(duì)細(xì)胞物質(zhì)添加冷凍保護(hù)劑(例如添加到細(xì)胞物質(zhì)之內(nèi)或之外)。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將所述干粉末配制在藥物組合物中，例如供吸入給藥的藥物組合物中。本發(fā)明還包括由所述新方法制備的、包含細(xì)胞物質(zhì)的干粉末。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明包括產(chǎn)生干粉末的方法，其中所述干粉末包括少于約10%(例如少于約8%、5%、4%、3%、2%或1%)的水(例如游離水)，以及分枝桿菌屬的細(xì)菌，所述方法是通過提供水溶液，其中所述水溶液包括至少0.01mg/ml(例如至少0.1、1、2、5、10、20、50、100或200mg/ml)賦形劑和至少1()5菌落形成單位/ml(例如至少106、107、108、109或101G菌落形成單位/ml)的分枝桿菌屬細(xì)菌，并且在產(chǎn)生含有少于約10%(例如少于約8%、5%、4%、3%、2%或1%)的水(例如游離水)，及所述分枝桿菌屬細(xì)菌的干粉末的條件下，噴霧干燥所述溶液。在一些實(shí)施方案中，所述溶液相對(duì)每個(gè)菌落形成單位的分枝桿菌屬細(xì)菌含有至少0.25pg的賦形劑(例如每個(gè)菌落形成單位至少0.5、1、2、5、10、15、20、25、35或50pg的賦形劑)。在一些實(shí)施方案中，所述水溶液不含冷凍保護(hù)劑，例如不是所述賦形劑的冷凍保護(hù)劑。在一些實(shí)施方案中，所述分枝桿菌屬細(xì)菌是結(jié)核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌(M6owX)或卡介苗細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括將所述干粉末配制在藥物組合物中，例如用于吸入給藥或用于將該粉末在藥用液體載體中復(fù)原(reconstitute)后注射給藥的藥物組合物中。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將所述干粉末配制成疫苗，例如用于吸入給藥或用于將該粉末在藥用液體載體中復(fù)原后注射給藥的疫苗。本發(fā)明還包括通過所述新方法制備的、包含分枝桿菌屬細(xì)菌的干粉末。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明包括含干粉末的疫苗組合物，所述干粉末含有少于約10%(例如少于約8%、5%、4%、3%、2%或1%)的水(例如游離水)，細(xì)胞物質(zhì)，和以干重計(jì)至少25%(例如至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或更多)的賦形劑。在一些實(shí)施方案中，所述干粉末是通過本文所述的方法制備的。所述疫苗組合物可以配制為用于腸胃外或粘膜(例如口服或吸入)施用。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞物質(zhì)包括細(xì)菌(例如分枝桿菌屬細(xì)菌，例如結(jié)核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌或卡介苗)、病毒、真核微生物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如紅細(xì)胞、干細(xì)胞、粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或血小板)、或膜結(jié)合細(xì)胞器。疫苗組合物可包含一種或多種佐劑。在一些實(shí)施方案中，將所述一種或多種佐劑與所述細(xì)胞物質(zhì)一起噴霧干燥以形成所述干粉末。在一些實(shí)施方案中，在產(chǎn)生所述干粉末之后將它們與所述一種或多種佐劑混合。本發(fā)明還包括通過對(duì)受試者(例如人或動(dòng)物)施用包含本文所述干粉末的疫苗組合物的免疫方法。在一些實(shí)施方案中，所述干粉末是通過本文所述的方法制備的。疫苗組合物可以配制用于腸胃外或粘膜(例如口服或吸入)施用。在一些實(shí)施方案中，所述受試者是嬰兒、兒童或成人。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞物質(zhì)包括細(xì)菌(例如分枝桿菌屬的細(xì)菌，例如結(jié)核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、或卡介苗)、病毒、真核微生物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如紅細(xì)胞、干細(xì)胞、粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或血小板)、或者膜結(jié)合細(xì)胞器。用于免疫方法中的疫苗組合物可以包括一種或多種佐劑。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明包括儲(chǔ)存本文所述的干粉末的方法，所述方法是通過將所述粉末保持在冰點(diǎn)以上的溫度，例如4。C到50。C(例如4。C到40°C、4。C到30°C、4。C到20°C、4。C到l(TC、l(TC到50°C、10。C到40°C、10。C到3(TC)，經(jīng)過至少1天時(shí)間(例如至少1周、2周、3周、l個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月、7個(gè)月、8個(gè)月、9個(gè)月、10個(gè)月、ll個(gè)月、1年或更長)。在一些實(shí)施方案中，將所述干粉末保持在環(huán)境溫度。在一些實(shí)施方案中，所述干粉末是通過本文所述的方法制備的。在一些實(shí)施方案中，所述干粉末配制為藥物組合物或疫苗組合物。在另外的方面中，本發(fā)明包括運(yùn)輸包含干粉末的藥物組合物或疫苗組合物的方法，所述干粉末含有少于約10%(例如少于約8%、5%、4%、3%、2%或1%)的水(例如游離水)，細(xì)胞物質(zhì)，和以干重計(jì)至少25%(例如至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或更多)的賦形劑。所述方法包括制備包含干粉末(例如通過本文所述方法制備的干粉末)的藥物組合物或疫苗組合物，并在水點(diǎn)以上的溫度，例如4°C到50°C(例如4。C到40。C、4。C到30。C、4。C到20。C、4。C到10。C、l(TC到50°C、1(TC到40。C、1(TC到30。C),運(yùn)輸所述藥物組合物或疫苗組合物。在一些實(shí)施方案中，在環(huán)境溫度運(yùn)輸所述藥物組合物或疫苗組合物。除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員所知道的相同的意義。盡管與本文所述方法和物質(zhì)相似或等同的方法和物質(zhì)可以用于本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中，下文描述了合適的方法和物質(zhì)。本文引證并入本文中提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容。若有矛盾，當(dāng)以包括定義在內(nèi)的本說明書為準(zhǔn)。另外，這里的物質(zhì)、方法和實(shí)施例僅用于示例說明，并不意在限制。附圖和下文的描述給出了本發(fā)明的一種或多種實(shí)施方案的細(xì)節(jié)。根據(jù)該說明書和附圖以及權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征、目的及優(yōu)點(diǎn)是顯然的。圖1是被水包圍的細(xì)胞物質(zhì)的模型的示意圖。Re表示細(xì)胞的半徑。Ces、Cecp、Cs和C'cp分別指示細(xì)胞外鹽濃度、細(xì)胞外冷凍保護(hù)劑濃度、細(xì)胞內(nèi)鹽濃度和細(xì)胞內(nèi)冷凍保護(hù)劑濃度。圖2A是平行膜的二維圖。圖2B是凸平臺(tái)邊界(convexplateauborders)的二維圖。圖3是80:20亮氨酸:恥垢分枝桿菌的噴霧干燥產(chǎn)物的電子顯微照片。圖4是95:5亮氨酸:恥垢分枝桿菌的噴霧干燥產(chǎn)物的電子顯微照片。圖5是90:10亮氨酸:恥垢分枝桿菌的噴霧干燥產(chǎn)物的熒光顯微照片。所用的恥垢分枝桿菌表達(dá)了GFP，并且在顯微照片中顯示焚光。圖6是25'C儲(chǔ)存1周后的95:5亮氨酸:恥垢分技桿菌的電子顯微照片。圖7是描述下列條件下正在干燥的微滴中相對(duì)細(xì)胞體積(V/Vo)的數(shù)值解的圖(a)細(xì)胞內(nèi)的冷凍保護(hù)劑的量大于細(xì)胞外；(b)無冷凍保護(hù)劑；(c)細(xì)胞內(nèi)外冷凍保護(hù)劑的量相等。圖8是描述在相似的滲透應(yīng)力作用下，甘油和鹽對(duì)噴霧干燥的恥垢分枝桿菌活力的影響的圖。圖9是描述噴霧干燥粉末中恥垢分枝桿菌活力得率對(duì)賦形劑(亮氨酸)溶液百分比的圖。圖10是描述50:50亮氨酸/恥垢分枝桿菌(smeg)粉末在三種儲(chǔ)存條件下恥垢分枝桿菌活力得率隨時(shí)間變化的線圖。圖11是描述95:5亮氨酸/恥垢分枝桿菌(smeg)粉末在三種穩(wěn)定條件下恥垢分枝桿菌活力得率隨時(shí)間變化的線圖。所示結(jié)果為5次實(shí)驗(yàn)的平均。圖12A和12B是描述在有和無單磷脂A條件下95:5亮氨酸/恥垢分枝桿菌(smeg)粉末在三種穩(wěn)定條件下恥垢分枝桿菌活力得率隨時(shí)間變化的線圖。圖13是描述在存在表面活性劑泰洛沙泊和PluronicTM-F68的條件下噴霧干燥的95:5和50:50亮氨酸:恥垢分枝桿菌的活力得率的圖。圖14是描述在兩種儲(chǔ)存條件下牛分枝桿菌BCG活力得率隨時(shí)間變化的線圖。圖15是噴霧干燥后1個(gè)月活的NIH3T3胚胎小鼠成纖維細(xì)胞的顯微照片。圖16是原代采集的大鼠心臟成纖維細(xì)胞在噴霧干燥后第3天和第8天的一組20X相差顯微圖像。圖17是NIH3T3胚胎小鼠成纖維細(xì)胞在噴霧干燥后第3天和第8天的一組20X相差顯微圖像。詳述本發(fā)明涉及用于制備干燥細(xì)胞形式(DCF)的新組合物和方法。這些組合物和方法有助于制備大批量的具有良好加工特性和細(xì)胞活力的細(xì)胞物質(zhì)干燥形式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以至少50%(例如至少60%，70%，80%或90%)的典型初始賦形劑濃度(以干重計(jì))干燥細(xì)胞物質(zhì)。但是，在一些情況下初始賦形劑濃度可以低達(dá)25%?？梢赃x擇或加工這些賦形劑使得細(xì)胞物質(zhì)與冷凍保護(hù)劑一起被干燥，以降低干燥過程中的滲透應(yīng)力。本文中描述的組合物和方法可以用來干燥任何細(xì)胞物質(zhì)，例如與藥品、農(nóng)業(yè)或食品應(yīng)用有關(guān)的細(xì)胞物質(zhì)。"細(xì)胞物質(zhì)"在本文中可以與"膜結(jié)合物質(zhì)"(membraneboundmaterial)互換使用，指被脂雙層構(gòu)成的膜包裹的物質(zhì)。示例性的細(xì)胞物質(zhì)包括細(xì)菌(例如革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌，及其疫苗形式)、膜結(jié)合的病毒(例如HIV)、真核微生物(例如酵母)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如血細(xì)胞(例如臍帶血細(xì)胞)、血小板、干細(xì)胞、粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞(例如血管內(nèi)皮細(xì)胞)、肌細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和其它細(xì)胞)、膜結(jié)合細(xì)胞器(例如線粒體)、脂質(zhì)體、基于膜的生物反應(yīng)器(Bosquillonetal.,JCwfro/7e/eaw,99:357-367,2004)、和基于膜的藥物投遞系統(tǒng)(Smithetal.,K固'"e,21:2805-12，2003)。細(xì)胞物質(zhì)的其它例子包括膜結(jié)合病毒(例如流感病毒、狂犬病毒、痘苗病毒、西尼羅河病毒、HIV、HVJ(仙臺(tái)病毒)、乙肝病毒(HBV)、正痘病毒(例如天花病毒和痘苗病毒)、單純皰疹病毒(HSV)、和其它皰疹病毒)。其它示例性的細(xì)胞物質(zhì)包括病毒性傳染病(例如AIDS、AIDS相關(guān)并發(fā)癥(AIDSRelatedComplex),禽痘(水痘)、感冒、巨細(xì)胞病毒感染、科羅拉多壁虱熱、登革熱、埃博拉出血熱、流行性腮腺炎、手足口病、肝炎、單純皰疹、帶狀皰滲、人乳頭瘤病毒(HPV)、流行性感冒(流感)、拉沙熱、麻滲、馬爾堡出血熱、傳染性單核細(xì)胞增多癥、腮腺炎、脊髓灰質(zhì)炎、進(jìn)行性多灶性腦白質(zhì)病、狂犬病、風(fēng)滲、SARS、天花(痘)、病毒性腦炎、病毒性胃腸炎、病毒性腦膜炎、病毒性肺炎、西尼羅河病及黃熱病)的致病原、細(xì)菌性轉(zhuǎn)染病(例如炭疽、細(xì)菌性腦膜炎、布氏菌病、彎曲菌病、貓纟爪病、霍亂、白喉、流行性斑滲傷寒、淋病、膿皰病、軍團(tuán)菌病、麻風(fēng)(漢森氏病)、鉤端螺旋體病、利斯特菌病、萊姆病、類鼻疽、甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)感染、諾卡菌病、疫咳(百日咳)、鼠疫、肺炎球菌性肺炎、鸚鵡熱、Q熱、落磯山斑點(diǎn)熱(RMSF)、沙門氏菌病、猩紅熱、志賀氏菌病、梅毒、破傷風(fēng)、沙眼、結(jié)核、土拉菌病、傷寒、斑滲傷寒，和尿道感染)的致病原，寄生蟲性傳染病(例如非洲錐蟲病、阿米巴病、蛔蟲病、巴貝蟲病、查加斯病、支睪吸蟲病、隱孢子蟲病、嚢蟲病、裂頭絳蟲病、龍線蟲病、棘球坳病、蟯蟲病、片形吸蟲病、姜片蟲病、絲蟲病、自生(free-living)阿米巴感染、賈第蟲病、腭口線蟲病、膜殼絳蟲病、等孢球蟲病、黑熱病、利什曼病、瘧疾、后殖吸蟲病、繩蛆病、盤尾絲蟲病、虱病、蟯蟲感染、疥疳、血吸蟲病、纟條蟲病、弓蛔蟲病、弓形體病、毛線蟲病、》走毛蟲病、賓更蟲病，和4,蟲病)的致病原、及真菌性傳染病(例如曲霉病、芽生菌病、念珠菌病(dandidiasis)、;求孑包子菌病(doccidioidomycosis)、隱5求菌病((Cryptococcosis)、纟且織月包漿菌病和足癬)的致病原。此外，這些致病原的減毒(例如營養(yǎng)缺陷)形式和能夠促進(jìn)抗致病原免疫的相關(guān)物質(zhì)(例如，BCG和痘苗)可以用于本文所述的方法，例如，用于制備疫苗的方法(參見，例如Sambandamurthyetal,Nat.Med.，9:9，2002;Hondalusetal.,Infect.Immun.,68:2888-98，2000;及Sampsonetal.，Infect.Immun.,72:3031-37，2004)。用于本文所述方法和組合物的賦形劑包括，但不限于，相容的碳水化合物、天然和合成的多肽、氨基酸、表面活性劑、聚合物或其組合。典型的賦形劑對(duì)干燥中的細(xì)胞物質(zhì)的膜的反射系數(shù)(reflectioncoefficient)將、于1.0(侈'J^口小于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1)(見侈'J^口AdamskiandAnderson,BiophysJ,44:79-90,1983;及JandSekandSigler,Physiol.Res.，49:191-195,2000)。合適的碳水化合物包括單糖，諸如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖、右旋糖等等。也可以使用二糖，諸如乳糖、海藻糖、麥芽糖、蔗糖等。其它賦形劑包括環(huán)糊精，諸如2-羥丙基-P-環(huán)糊精；和多糖，諸如棉子糖、麥芽糖糊精、右旋糖苷等等；和醛醇/糖醇，諸如甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇等等。合適的多肽包括二肽阿斯巴甜(aspartame)。合適的氨基酸包括任何在標(biāo)準(zhǔn)藥品加工技術(shù)作用下形成粉末的天然存在氨基酸，這些氨基酸包括非極性(疏水)氨基酸和極性(不帶電荷、帶正電荷和帶負(fù)電荷)氨基酸，這些氨基酸被FDA認(rèn)定為一般安全(GRAS)。非極性氨基酸的代表性例子包括丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲疏氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和纈氨酸。極性不帶電荷氨基酸的代表性例子包括半胱氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。極性帶正電荷氨基酸的代表性例子包括精氨酸、組氨酸和賴氨酸。極性帶負(fù)電荷氨基酸的代表性例子包括天冬氨酸和谷氨酸。合適的合成有機(jī)聚合物包括聚[l-(2-氧-l-吡咯烷基)乙烯]，即聚維酮(povidone)或PVP。干燥組合物通常，使用相對(duì)少量賦形劑干燥細(xì)胞物質(zhì)，經(jīng)常涉及冷凍。在沒有冷凍的情況下，所得粉末往往含有顯著量的水，這是因?yàn)榧?xì)胞物質(zhì)若不經(jīng)冷凍，則不能干燥到一定的含水量(例如大約40%重量的水)以下而仍保持活性。具有良好加工性和穩(wěn)定性的干粉末通常需要少于10%重量，優(yōu)選少于5%重量的水。這是因?yàn)檩^高的含水分?jǐn)?shù)導(dǎo)致粉末顆粒之間產(chǎn)生顯著的毛細(xì)力，從而使粉末發(fā)生團(tuán)聚(aggregation)。因此，為了獲得具有良好的粉末加工性和穩(wěn)定性的DCF，就涉及使用大量賦形劑來進(jìn)行噴霧干燥。具體地說，為了獲得總含水量少于10%或5%的干粉末，應(yīng)當(dāng)用以重量計(jì)至少25%(例如至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或更多)的賦形劑與細(xì)胞形式一起干燥，得到含有相對(duì)較小重量分?jǐn)?shù)的細(xì)胞物質(zhì)的干粉末，這樣在保留足以維持活性的水分的同時(shí)，又不使粉末存在過多水分以致?lián)p害粉末的總體加工性能。噴霧干燥是食品業(yè)、藥業(yè)和農(nóng)業(yè)中使用的標(biāo)準(zhǔn)過程。在噴霧干燥中，通過使噴霧的微滴與干燥介質(zhì)(例如空氣或氮?dú)?混合，使水分從霧化的進(jìn)料液(噴霧(spmy))中蒸發(fā)出去。該過程干燥除去微滴中的揮發(fā)物質(zhì)，留下不揮發(fā)組分的"干"顆粒，這些顆粒的大小、形態(tài)、密度和揮發(fā)物含量由干燥過程所控制。被噴霧的混合物可以是溶液、乳液、懸液或分散體(dispersion)。干燥過程的許多因素可影響干燥顆粒的性質(zhì)，包括噴嘴類型、轉(zhuǎn)鼓大小(dmmsize)、揮發(fā)溶液和循環(huán)氣體的流速、以及環(huán)境條件(SacchettiandVanOort,SprayDryingandSupercriticalFluidParticleGenerationTechniques,GlaxoWellcomeInc.,1996)。通常，噴霧干燥過程包括四個(gè)過程混合物分散為小微滴，噴霧與干燥介質(zhì)(例如空氣)混合，水分從噴霧中蒸發(fā)，及干燥產(chǎn)物與干燥介質(zhì)分離(SacchettiandVanOort,SprayDryingandSupercriticalFluidParticleGenerationTechniques,GlaxoWellcomeInc.,1996》混合物分散成小微滴極大地增加待干燥物的表面積，使得干燥過程更加迅速。典型地，分散能量越高導(dǎo)致所得的微粒越小。分散可以通過本領(lǐng)域已知的任何手段實(shí)現(xiàn)，包括壓力噴嘴、雙流體噴嘴、旋轉(zhuǎn)霧化器、以及超聲噴嘴(Hinds,AerosolTechnology,2ndEdition,NewYork,JohnWileyandSons,1999)。在一些實(shí)施方案中，以小于200psi的壓力噴霧混合物。分散(噴霧)混合物之后，將所得的噴霧與干燥介質(zhì)(例如空氣)混合。典型地，混合在連續(xù)的加熱空氣流中發(fā)生。熱空氣改善對(duì)于噴霧微滴的傳熱，并增加蒸發(fā)速率。空氣流可以在干燥后排放到大氣中，或者循環(huán)并再利用。空氣流通常通過在氣流的任一端一是供正壓和/或負(fù)壓來維持(SacchettiandVanOort,SprayDryingandSupercriticalFluidParticleGenerationTechniques,GlaxoWellcomeInc.,1996)。當(dāng)微滴與干燥介質(zhì)發(fā)生接觸時(shí)，由于微滴比表面積高、尺寸小，很快發(fā)生蒸發(fā)?；诟稍锵到y(tǒng)的性質(zhì)，在經(jīng)干燥的產(chǎn)物中可保留殘余水平的水分(Hinds，AerosolTechnology,2ndEdition,NewYork,JohnWileyandSons,1999)。然后將產(chǎn)物與干燥介質(zhì)分離。典型地，產(chǎn)物的初級(jí)分離發(fā)生在干燥室的底部，然后使用例如旋風(fēng)分離器、靜電沉降器、過濾器或氣體洗滌器回收產(chǎn)物(Mastersetal.，SprayDryingHandbook,Harlow,UK，LongmanScientificandTechnical,1991)。最終產(chǎn)物的性質(zhì)，包括粒度、最終濕度和得率，依賴于干燥過程的許多因素。典型地，對(duì)入口溫度、空氣流速、液體進(jìn)料流速、微滴尺寸、和混合物濃度等參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)以產(chǎn)生期望的產(chǎn)物(Mastersetal.,SprayDryingHandbook,Harlow，UK,LongmanScientificandTechnical,1991)。入口溫度是指經(jīng)加熱的干燥介質(zhì)，通常是空氣，在流入干燥室之前測(cè)得的溫度。典型地，入口溫度可以根據(jù)希望加以調(diào)節(jié)。產(chǎn)物回收部位的干燥介質(zhì)溫度稱為出口溫度，它依賴于入口溫度、干燥介質(zhì)流速、以及被噴霧混合物的性質(zhì)。典型地，較高的入口溫度使最終產(chǎn)物中水分量降低(SacchettiandVanOort,SprayDryingandSupercriticalFluidParticleGenerationTechniques,GlaxoWellcomeInc,，1996)。空氣流速(airflowrate)是指干燥介質(zhì)通過系統(tǒng)的流動(dòng)(flow)?？諝饬骺梢酝ㄟ^在噴霧干燥系統(tǒng)任一端或者內(nèi)部維持正壓和/或負(fù)壓來提供。典型地，較高的空氣流速導(dǎo)致顆粒在干燥設(shè)備中的停留時(shí)間(即干燥時(shí)間)較短，并導(dǎo)致最終產(chǎn)品中殘余水分的量較大(Mastersetal"SprayDryingHandbook,Harlow,UK,LongmanScientificandTechnical,1991)。液體進(jìn)料流速是指每個(gè)單位時(shí)間內(nèi)輸送到干燥室的液體的量。液體的通量(throughput)越高，微滴蒸發(fā)成為顆粒所需的能量越多。因此，流速越高導(dǎo)致輸出溫度(outputtemperature)越低。典型地，降低該流速，同時(shí)保持入口溫度和空氣流速恒定，可降低最終產(chǎn)物的含水量(Mastersetal.，SprayDryingHandbook,Harlow,UK,LongmanScientificandTechnical,1991)。微滴大小/尺寸是指被噴霧噴嘴分散的微滴的大小。典型地，較小的微滴使得最終產(chǎn)物的含水量較低，粒度較小(Hinds,AerosolTechnology,2ndEdition,NewYork,JohnWileyandSons,1999)。待噴霧干燥的混合物的濃度也對(duì)最終產(chǎn)物有影響。典型地，較高的濃度導(dǎo)致最終產(chǎn)物的粒度較大，這是由于每個(gè)被噴霧微滴的物質(zhì)較多(SacchettiandVanOort,SprayDryingandSupercriticalFluidParticleGenerationTechniques,GlaxoWellcomeInc.,1996)。用于噴霧干燥的系統(tǒng)可以從例如Armfield,Inc.(Jackson，NJ)、BrinkmannInstruments(Westbury,NY)、BUCHIAnalytical(NewCastle,DE)、NiroInc(Columbia,MD)、Sono-TekCorporation(Milton,NY)、SprayDryingSystems,Inc.(Randallstown,MD)禾口Labplant,Inc.(NorthYorkshire,England)購買。噴霧干燥粉末的最終含水量可以通過本領(lǐng)域已知的任何手段來確定，例如，通過熱重分析法。熱重分析法通過加熱纟分末并測(cè)量水分蒸發(fā)過程中的質(zhì)量損失來確定含水量(Maaetal.,Pharm,Res.，15:5,1998)。典型地，對(duì)于含有細(xì)胞物質(zhì)(例如細(xì)菌)的樣品而言，水將分兩個(gè)相(phases)蒸發(fā)。第一相稱為游離水，主要是干燥賦形劑的含水。第二相稱為結(jié)合水，主要是細(xì)胞物質(zhì)的含水。對(duì)游離水和結(jié)合水都可以加以測(cè)量，來確定粉末在賦形劑或細(xì)胞物質(zhì)中是否含有所希望的水分含量(Snyderetal.，AnalyticaChimicaActa:536:283-293,2005)。在噴霧干燥過程中減少滲透應(yīng)力待噴霧干燥的細(xì)胞溶液中引入的賦形劑可以通過這樣的方式選擇和/或引入，使得細(xì)胞物質(zhì)的膜承受的總體滲透應(yīng)力最小，從而維持活性。盡管由于上述的原因，相對(duì)于細(xì)胞物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)保持所需的賦形劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)是相當(dāng)重要的，但是對(duì)于細(xì)胞活力而言，這些賦形劑的性質(zhì)、噴霧干燥前引入這些賦形劑的方式，可能是重要的，甚至是關(guān)鍵的。對(duì)于細(xì)胞物質(zhì)而言，微滴在噴霧干燥轉(zhuǎn)鼓中的干燥可以看成類似于生物體在標(biāo)準(zhǔn)深低溫保藏過程中的冷凍過程，如圖1所示(James,"MaintenanceofParasiticProtozoabyCryopreservation,"MaintenanceofMicroorganisms,AcademicPress,London,1984)。當(dāng)含有生物體的微滴蒸發(fā)時(shí)，微滴中(和細(xì)胞外)的鹽濃度(C)相對(duì)于生物體中的鹽濃度(C',)將會(huì)增加。理由是細(xì)胞膜對(duì)于鹽的轉(zhuǎn)移而言是不可通透的，而對(duì)于水的轉(zhuǎn)移而言是相對(duì)可通透的。結(jié)果是，微滴的干燥增加了正在蒸發(fā)的微滴中的鹽濃度，形成對(duì)細(xì)胞膜的滲透應(yīng)力(由膜任一側(cè)的鹽濃度不平衡所致)，導(dǎo)致水從細(xì)胞中被推出?？梢詫⑦@種脫水過程看成膜試圖通過消除鹽濃度的不平衡來機(jī)械性地減少滲透應(yīng)力(Batyckyetal.,Phil.Trans.Roy.Soc.Lond.，A355:2459-88,1997)。細(xì)胞物質(zhì)在微滴蒸發(fā)過程中的"脫水"與細(xì)胞物質(zhì)經(jīng)受冷凍時(shí)發(fā)生的過程是基本相同的。如上所述，過度脫水可導(dǎo)致細(xì)胞物質(zhì)的裂解，為了避免過度脫水，已經(jīng)開發(fā)了與深低溫保藏領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)，也就是冷凍保護(hù)劑的使用和凍融循環(huán)的控制。冷凍保護(hù)劑是以慢于水而快于鹽的速率滲透細(xì)胞膜的藥理學(xué)惰性物質(zhì)。由于這些技術(shù)與噴霧干燥細(xì)胞物質(zhì)的方法相關(guān)，下文對(duì)它們進(jìn)行簡要的綜述(KarlssonandToner,Biomaterials,17:243-256,1996)。首先，鑒于膜對(duì)冷凍保護(hù)劑的半透性，冷凍保護(hù)劑對(duì)膜施加滲透壓，該滲透壓與冷凍保護(hù)劑的濃度成比例，并且對(duì)于最好的冷凍保護(hù)劑而言，它非常接近于相當(dāng)濃度的鹽所施加的滲透壓。這意味著，浸沒在含有非滲透性鹽濃度相似大小冷凍保護(hù)劑的水性介質(zhì)中的細(xì)胞膜所經(jīng)受的滲透應(yīng)力和非等滲條件往往會(huì)受到冷凍保護(hù)劑物質(zhì)的存在的顯著影響。因此，冷凍保護(hù)劑的跨膜擴(kuò)散提供了一種抵消滲透應(yīng)力的手段，即使在膜任一側(cè)的鹽濃度不相等的情況下也是如此。由此，冷凍保護(hù)劑提供了分散(diffuse)滲透乙二醇、丙二醇和甘油(ChesneandGuillouzo,Cryobiology，25:323-330,1988)。在一些實(shí)施方案中，冷凍保護(hù)劑不包括在干燥后的混合物中。在深低溫保藏規(guī)程中，將冷凍保護(hù)劑添加到細(xì)胞物質(zhì)的懸液中，添加的濃度(C^)與鹽濃度顯著相關(guān)。應(yīng)當(dāng)指出，可以控制這種添加以免使細(xì)胞受到過高的滲透應(yīng)力，也就是說，可以以足夠慢的速率添加冷凍保護(hù)劑，使得冷凍保護(hù)劑可以擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜而不使細(xì)胞脫水。然后在冷凍一由于細(xì)胞內(nèi)天然冷凍保護(hù)劑的作用，冷凍導(dǎo)致細(xì)胞外形成冰，從而增加細(xì)胞外的鹽濃度一的過程中，冷凍保護(hù)劑能夠擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜而提高細(xì)胞內(nèi)濃度，從而增加冷凍保護(hù)劑內(nèi)部濃度(C;)。這樣就減輕了細(xì)胞膜上的滲透應(yīng)力，尤其是當(dāng)冷凍以足夠慢的速率進(jìn)行的條件下。這樣，冷凍保護(hù)劑有助于保持細(xì)胞活力，解釋了它在保存血液、精液及其它有用細(xì)胞方面的用途(KarlssonandToner，Biomaterials,17:243-256,1996)。雖然噴霧干燥與深低溫保藏具有類似性，但它對(duì)于細(xì)胞物質(zhì)有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，這種優(yōu)勢(shì)對(duì)于大規(guī)模使用是特別重要的。大批量細(xì)胞懸液的細(xì)胞深低溫保藏是困難的，這是因?yàn)楫?dāng)懸液尺度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于細(xì)胞尺度時(shí)，兩種尺度上的傳質(zhì)動(dòng)力學(xué)要求(在添加或去除冷凍保護(hù)劑和冷凍細(xì)胞過程中所涉及的)是極為不同的。這可能是采用標(biāo)準(zhǔn)深低溫保藏方法的血液冷凍不容易適用于完整器官冷凍的原因之一。噴霧干燥自動(dòng)將細(xì)胞懸液分成較小的量(即微滴)，它們可以粗略地看成深低溫保藏小單位。規(guī)模放大不需要顯著增加噴霧的微滴的量規(guī)模放大是通過增加噴霧干燥容器的尺寸、增加通過噴嘴的懸液流量(flow)，和其它標(biāo)準(zhǔn)規(guī)模放大手段來實(shí)現(xiàn)的。因此，噴霧干燥可以提供用于產(chǎn)生大量DCF的方法，這些DCF的活性比通過深低溫保藏和凍干技術(shù)獲得的活性更高。下文描述了一種理論形式，它提供了對(duì)細(xì)胞形式進(jìn)行噴霧干燥，使膜應(yīng)力最小化，從而使活力最大化的規(guī)則。這些方法依賴于使用冷凍保護(hù)劑和控制噴霧干燥的參數(shù)例如溶劑類型、入口氣體溫度和噴霧干燥噴嘴尺寸和旋轉(zhuǎn)速度(微滴大小)。所述方法確定噴霧微滴能夠在加熱環(huán)境中被干燥的速率，這樣，在深低溫保藏劑存在的條件下，可以調(diào)節(jié)懸浮物質(zhì)的膜半徑。由此，可以防止膜收縮到R^^以下或者擴(kuò)張到R^^以上。舉例說明，在W畫的情況下，并非所有的懸浮物質(zhì)均將由于滲透壓驅(qū)使的脫水作用而收縮到臨界半徑(R:0以下。若細(xì)胞壁是剛性的，可以直接將這種條件與導(dǎo)致失活的臨界應(yīng)力相等同。首先，考慮問題中的理想化幾何條件和濃度，然后考慮兩個(gè)極限條件下的動(dòng)力學(xué)。然后，建立流體力學(xué)和傳質(zhì)方程來描述作為系統(tǒng)參數(shù)之函數(shù)的細(xì)胞半徑變化率。為便于說明，可以設(shè)想這樣一種細(xì)胞懸液，其中細(xì)胞是具有平衡半徑R、的球體。在這些細(xì)胞中有鹽和冷凍保護(hù)劑，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的濃度為C',和C'ep,在細(xì)胞外的濃度為C和C%。在噴霧干燥時(shí)，形成懸浮物質(zhì)的微滴個(gè)體。在這里，我們假設(shè)細(xì)胞在噴霧溶液和噴霧過程中保持均勻分布，因此在各個(gè)被噴霧的微滴中的濃度相等。流速(其可在噴霧干燥中加以物理控制)可由下式明確解出其中a是每單位時(shí)間生成微滴的速率，^^是每個(gè)被噴霧的微滴個(gè)體中懸浮的細(xì)胞數(shù)，N是體積中的總細(xì)胞數(shù)，？。是將體積V。噴霧所需的時(shí)間量。待噴霧懸液中細(xì)胞的體積分?jǐn)?shù)將以A表示，其中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>(2)且N是懸浮體積&中的總細(xì)胞數(shù)。假設(shè)這些微滴具有均一的半徑R人，從而細(xì)胞物質(zhì)的分?jǐn)?shù)可以表示為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>其中w是在每個(gè)被噴霧的微滴個(gè)體中懸浮的細(xì)胞數(shù)。在假設(shè)均勻的情況下，在原始懸液中測(cè)得的四個(gè)濃度ceccp等于每個(gè)被噴霧微滴的細(xì)胞中鹽和冷凍保護(hù)劑的初始濃度。已知每個(gè)微滴中鹽和冷凍保護(hù)劑的絕對(duì)摩爾數(shù)必須守恒，這些濃度將基于微滴直徑和細(xì)胞直徑的變化而隨時(shí)間變化。令x',和xV及x;和x、p分別代表在微滴個(gè)體中分散后鹽和冷凍保護(hù)劑在細(xì)胞外部和細(xì)胞內(nèi)部的摩爾數(shù)，這樣就有<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>這里，F(xiàn)^cWW是每個(gè)細(xì)胞個(gè)體中鹽和/或冷凍保護(hù)劑不能分配到其中的體積，將其看作對(duì)時(shí)間恒定的。由于鹽不能滲透過膜，參數(shù)X',和X^(代表細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的鹽摩爾數(shù))對(duì)時(shí)間也是恒定的。這樣上述表達(dá)式中僅有的時(shí)間變量就是W和R"以及細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的冷凍保護(hù)劑摩爾數(shù)x'c。和Xcp。每個(gè)微滴個(gè)體將在噴霧干燥轉(zhuǎn)鼓中蒸發(fā)，其蒸發(fā)速率依賴于外部條件、微滴大小、微滴揮發(fā)性等等。在初始時(shí)，考慮到懸液最初很稀0?！?)的性質(zhì)，細(xì)胞個(gè)體平均而言將是相互遠(yuǎn)離的。隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞將越來越多地緊密接觸，這樣可以設(shè)想兩種極限情開》這里，在干燥過程中0(/)<<1。在此情況下，假設(shè)每個(gè)細(xì)胞個(gè)體是孤立的(isolated),如同它懸浮在無限大的浴(bath)中一樣對(duì)演變中的鹽和冷凍保護(hù)劑濃度(從而對(duì)滲透應(yīng)力)起反應(yīng)。由于問題的對(duì)稱性(參見下文傳質(zhì)的考慮因素)，微滴和細(xì)胞均徑向收縮(或擴(kuò)張)因此，考慮圖1,細(xì)胞個(gè)體中和周圍由于滲透應(yīng)力而不因流體運(yùn)動(dòng)所致的速度分布可表示如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>(8)其中k是在以細(xì)胞中心為原,S的球面坐標(biāo)系統(tǒng)中沿著坐標(biāo)r的單位矢量，V々)是徑向速度的大小。此外，設(shè)細(xì)胞和微滴流體是不可壓縮的。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>或由于細(xì)胞中心處的徑向速度必須為零，結(jié)論是在每一處v=0(11)這個(gè)結(jié)論暗示，細(xì)胞膜的任何徑向運(yùn)動(dòng)必須是"非物質(zhì)性的"(non-material),意思是膜運(yùn)動(dòng)不等于連續(xù)流體的質(zhì)量平均運(yùn)動(dòng)。因此，情況1是這樣一個(gè)問題細(xì)胞個(gè)體在微滴內(nèi)的演變是擴(kuò)散驅(qū)動(dòng)的。在么—l的極限條件下，正在干燥的微滴中的細(xì)胞個(gè)體極度緊密接觸。細(xì)胞膜因滲透應(yīng)力而發(fā)生的演變被限定在這樣的環(huán)境中細(xì)胞膜或者成平面地挨著相鄰的細(xì)胞，或者在所謂"平臺(tái)邊界"(plateauborders)附近形成凸出曲面。這樣的膜環(huán)境顯示在圖2中。在情形2中，情形1的幾個(gè)基本假設(shè)不再成立。首先，考慮到細(xì)胞的緊密接觸和由于細(xì)胞的排除體積而造成的微滴"毗鄰"相傳質(zhì)阻力，預(yù)期外部或連續(xù)相中鹽和冷凍保護(hù)劑濃度的增加相對(duì)于跨細(xì)胞膜水運(yùn)輸而言不會(huì)是即刻的。這就意味著隨著微滴體積持續(xù)減小，微滴外周的鹽和冷凍保護(hù)劑濃度相對(duì)于微滴中心附近的濃度將會(huì)顯著增加，從而靠近微滴外周的細(xì)胞將受到高滲透應(yīng)力，而位于中心的細(xì)胞將受到極少乃至沒有滲透應(yīng)力。于是，使干燥過程中每個(gè)細(xì)胞的徑向擴(kuò)張或收縮最小化這一目標(biāo)的意義就不明確了，因?yàn)楦鱾€(gè)細(xì)胞隨時(shí)間將經(jīng)歷不同的條件。情形2中的目標(biāo)是或者使最易受攻擊的細(xì)胞，即位于外周的那些細(xì)胞的細(xì)胞膨脹最小化，或者考慮對(duì)干燥過程的合理時(shí)間約束，拯救微滴中最大數(shù)目的細(xì)胞。(注意，使外周的細(xì)胞死亡最小所需要的最終干燥限制條件，在極限條件下可能要求無限慢的干燥。)為了本分析的目的，其余的考慮將專門圍繞著情形1進(jìn)行。對(duì)于情形1可以確定兩個(gè)顯著的傳質(zhì)問題。第一個(gè)問題涉及正在干燥的微滴中鹽和冷凍保護(hù)劑的傳質(zhì)，假設(shè)正在干燥的微滴中鹽和冷凍保護(hù)劑的濃度均一地作為時(shí)間的函數(shù)增加。由于細(xì)胞懸液是稀的，微滴干燥問題可以單獨(dú)地考慮。這后一個(gè)問題是球狀水微滴在熱空氣連續(xù)體中干燥的問在外部鹽和冷凍保護(hù)劑濃度均一突然變化的無邊界環(huán)境中的球狀細(xì)胞傳質(zhì)問題早先已經(jīng)由Batycky等人(1997)加以解決。在他們的分析中，細(xì)胞流體被描述為一種連續(xù)體，細(xì)胞內(nèi)的鹽和冷凍保護(hù)劑濃度視為在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)液和內(nèi)部細(xì)胞器中是均勻化的(homogenized),或者是特別平均化的(speciallyaveraged)。根據(jù)膜上滲透壓的標(biāo)準(zhǔn)定義，即雷諾輸運(yùn)定理(ReynoldsTransportTheorem)和對(duì)水通過月莫的;參透性的達(dá)西定4聿描述(Darcylawdescription)，可i正明月莫速度為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>(12)其中Lp是膜的液壓滲透率(m/s.atm);o稱為反射系數(shù)(reflectioncoefficient)(0<C7<1),表示膜對(duì)冷凍保護(hù)劑的滲透性相對(duì)于鹽減少的分?jǐn)?shù)。細(xì)胞中膜處鹽和冷凍保護(hù)劑濃度的時(shí)間變化率可以通過解相關(guān)的傳質(zhì)守恒方程來求出。雖然細(xì)胞中鹽和冷凍保護(hù)劑的濃度很高，對(duì)于恒定的鹽和冷凍保護(hù)劑仍假設(shè)為菲克擴(kuò)散(Fickiandiffusion)。根據(jù)Batyckyetal.(1997)并納入Edwards和Davis(C/z綴5W.，50:1441-54,1995)的結(jié)果,這些擴(kuò)散率表示為過程-尺度系數(shù)(course-scalecoefficients)它們反映細(xì)胞中細(xì)胞器的存在。在Batyckyetal.(1997)中，鹽濃度的控制微分方程可以表述為(13)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>設(shè)初始條件為在上述方程中t二o時(shí)，c;二c:(o),其中t二o時(shí)，C:和5通過下式關(guān)耳關(guān)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>(19)在Batyckyetal.(1997)中，冷凍保護(hù)劑濃度的控制微分方程可以表述為其邊界條件為^+=有限值，Vr=W)c;=d-c;}vr=(ir(t)，t)(20)(21)(22)tifr初始條件為t二O時(shí),C:,C;(O)(23)t二0時(shí)，ic(,)《(24)關(guān)聯(lián)為g《(l-",一，Vr,t(25)其中e是細(xì)胞的滲透壓惰性的部分(細(xì)胞器)，/^=亨利定律吸收系數(shù)，a是細(xì)胞器比表面積，K是進(jìn)入細(xì)胞器的分配系數(shù)。用方程(14)(Batyckyetal.1997)解這些方法得到)其初始條件為t二o時(shí)，ir(0《其中、是下列超越方程非零根的特征值:tan(義")其中，i^是半透性溶質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速率，系數(shù)"定義為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>注意，雖然^在擴(kuò)散的快速時(shí)間尺度上是基本恒定的，它們?cè)诩?xì)胞膜擴(kuò)張的時(shí)間尺度上是隨時(shí)間緩慢變化的。方程(28)將細(xì)胞半徑R^)與外部鹽和冷凍保護(hù)劑濃度相關(guān)聯(lián)，外部鹽和冷凍保護(hù)劑濃度則依賴于微滴蒸發(fā)的速率。下面描述這種關(guān)聯(lián)關(guān)系。許多研究者已經(jīng)考察了在氣相中干燥的球狀微滴，尤其是忽略氣體中的對(duì)流效應(yīng)時(shí)。噴霧干燥器中的蒸發(fā)依賴于蒸發(fā)的控制速率(governingrate)和蒸發(fā)的停留時(shí)間(residencetime)。停留時(shí)間是干燥器中噴霧-空氣運(yùn)動(dòng)的函數(shù)。在微滴相對(duì)于周圍的空氣運(yùn)動(dòng)的情況下，運(yùn)動(dòng)中的微滴周圍的流動(dòng)條件影響蒸發(fā)速率。此時(shí)，若空氣和微滴之間的相對(duì)速度極低，則微滴完全被空氣流所影響。根據(jù)邊界層理論，以零相對(duì)速度運(yùn)動(dòng)的微滴的蒸發(fā)速率與靜態(tài)空氣條件中的蒸發(fā)相同。因此，將微滴通過噴霧干燥的蒸發(fā)作為與靜態(tài)空氣條件下蒸發(fā)類似的機(jī)制進(jìn)行建模。實(shí)驗(yàn)中和理論上，微滴半徑和噴霧干燥過程的控制性參數(shù)之間遵從的一4殳關(guān)系由下式纟合出(Masters,1991,SprayT/a"(i6oc^:，LongmanScientificandTechnical,Harlow,UK):-必<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>(30)其中D^2I^,^是蒸發(fā)中的微滴周圍氣膜的平均熱導(dǎo)率，a是氣相的密度，;i是^1滴的氣化潛熱，丄M7D是由下式定義的對(duì)數(shù)平均溫差<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>2*303/og1(/A:r0/A:riy)其中Ar。和A7;是微滴和氣相之間初始和最終的溫差。對(duì)(30)積分得到其中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>將(32)代入(6)和(7),將鹽和冷凍保護(hù)劑的即時(shí)濃度與微滴蒸發(fā)參數(shù)關(guān)聯(lián)起來<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>噴霧干燥方法可以用下面的微分方程來表示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>通過求解上述方程，可以確定為了使應(yīng)力最小化、使《,<^,0<《。,得以保持、或者使對(duì)懸浮膜結(jié)合物質(zhì)的應(yīng)力最大化而必需的噴霧干燥器入口和出口氣體溫度(即Ar)、噴嘴類型和微滴尺寸的旋轉(zhuǎn)速度CR,、溶劑類型(義)、冷凍保護(hù)劑類型(斗)等條件。在深低溫保藏細(xì)胞冷凍及融解速率的規(guī)則中可以找到與這些規(guī)則相類似的規(guī)則。藥物l且合物本文中描述的干燥細(xì)胞形式，例如用所述新組合物或新方法制備的干燥細(xì)胞形式，可以制備為藥物組合物，例如疫苗組合物。細(xì)胞物質(zhì)可以與多種藥學(xué)可接受的稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、以及其它本領(lǐng)域公知的材料一起噴霧干燥來制備藥物粉末?；蛘撸趪婌F干燥之后，可以將產(chǎn)物與多種藥學(xué)可接受的稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、佐劑、以及其它本領(lǐng)域公知的材料中的至少一種一起配制來制備藥物組合物，例如藥物粉末。術(shù)語"藥學(xué)可接受的"意思是不干擾活性成分的生物學(xué)活性的有效性的無毒物質(zhì)。組合物的特征可以依賴于施用途徑。在一些實(shí)施方案中，組合物在施用之前可以儲(chǔ)存在受控制的溫度。藥物組合物(例如含有干燥細(xì)胞形式的藥物組合物)的施用可以通過多種常規(guī)方式實(shí)施，例如吸入、口腔攝入或皮膚、皮下或靜脈內(nèi)注射。優(yōu)選的是通過吸入施用。在一些實(shí)施方案中，組合物作為疫苗施用。干燥細(xì)胞形式可以配制為利用醫(yī)療裝置，例如吸入器(見例如美國專利6,102,035(粉末吸入器)和6,012,454(干粉末吸入器))來吸入。吸入器可包括單獨(dú)的用于活性化合物的區(qū)室(其具有適于儲(chǔ)存的pH),用于中和緩沖劑的另一區(qū)室，以及用于在即將霧化前將化合物與中和緩沖劑混合的機(jī)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，吸入器是定量吸入器。用來局部投藥于肺氣道的三種常用系統(tǒng)包括干粉末吸入器(DPI)、定量吸入器(MDI)和霧化器。MDI是在最常用的吸入給藥方法中使用的，可以用來投遞溶解形式或作為分散體的藥物。典型地，MDI包含氟利昂或其它相對(duì)高蒸氣壓推進(jìn)劑，其在裝置起動(dòng)時(shí)迫使氣溶膠化的藥物進(jìn)入呼吸道。和MDI不同，DPI通常完全依靠患者用力吸氣來將干粉末形式的藥物導(dǎo)入肺中。霧化器對(duì)液體溶液施加能量來形成供吸入的藥物氣溶膠。也有人:^笨討了使用含氟化合物介質(zhì)在液體通氣(liquidventilation)或肺灌洗(pulmonarylavage)過程中直接對(duì)肺才殳遞藥物。這些方法以及其它方法可以用來投遞干細(xì)胞形式。美國專利6,732,732和6,766,799也記載了示例性的吸入裝置。所述組合物可以方便地以壓縮包裝或霧化器提供的氣溶膠噴霧的形式投遞，其中使用合適的推進(jìn)劑，例如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可以通過提供輸送一定量的閥門來確定劑量單位?？梢耘渲朴糜谖肫骰虼等肫髦械?、含有干燥細(xì)胞形式的膠嚢和藥筒。雖然不是必要的，但可以使用投遞增強(qiáng)劑諸如表面活性劑來進(jìn)一步加強(qiáng)肺投遞。本文中使用的"表面活性劑"是指這樣的化合物，它具有親水部分和親脂部分，這些部分通過與兩個(gè)不能融合的相之間的界面相互作用來促進(jìn)藥物的吸收。表面活性劑對(duì)于千顆粒有用是由于幾個(gè)原因，例如，減少顆粒聚結(jié)、減少巨噬細(xì)胞吞噬等等。當(dāng)與肺表面活性劑偶聯(lián)時(shí)，化合物可以更有效率地吸收，因?yàn)楸砻婊钚詣?，例如DPPC，會(huì)大大有助于化合物的擴(kuò)散。表面活性劑是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于磷酸甘油酯，例如磷脂酰膽堿、二棕櫚酰L-a-磷脂酰膽堿(DPPC)和二磷脂酰甘油(DPPG);十六醇；脂肪酸；聚乙二醇(PEG);聚氧乙烯-9;月桂酯(aurylether);椋櫚酸；油酸；山梨聚糖三油酸酯(SpanTM85);甘膽酸鹽、表面活性蛋白(surfactin);泊洛沙姆(poloxomer);山梨聚糖脂肪酸酯；山梨聚糖三油酸酯；泰洛沙泊(tyloxapol);和磷月旨。在另一個(gè)方面中，干燥細(xì)胞形式可以與這樣的藥學(xué)可接受載體一起配制，該藥學(xué)可接受載體具有不可吸入的顆粒大小，即使得該載體不會(huì)以任何顯著量被攝入肺中的大小。該制劑可以是干燥細(xì)胞形式的較小顆粒(例如少于10pm)與載體的4交大顆粒(例如約15到100(im)所成的均勻混合物。在分散時(shí)，較小的顆粒隨之被吸入肺中，而較大的顆粒通常保留在口腔中。適合用于混合的載體包括具有可接受的口味并且在毒理學(xué)上無害的結(jié)晶或無定形賦形劑，包括吸入或口服的，例如糖、二糖和多糖。代表性的例子包括乳糖、甘露糖醇、蔗糖、木糖醇等等。對(duì)于口服施用，可以使用藥學(xué)可接受的賦形劑諸如粘合劑(例如預(yù)糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫4丐)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或硅石)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉乙醇酸鈉)；或潤濕劑(例如月桂基石危酸鈉)，將藥物粉末配制成例如通過常規(guī)方式制備的片劑或膠嚢。片劑可以通過本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行包衣。用于口服施用的液體制備物可以采取，例如，溶液、糖漿或懸液的形式，或者可以作為干產(chǎn)品提供，在使用前用水或其它合適的溶々某加以調(diào)制。這樣的液體制備物可以使用藥學(xué)可接受的添加劑諸如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)、乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)、非水性溶媒(例如杏仁油、油性酯、乙醇或經(jīng)分級(jí)的植物油)、和防腐劑(例如對(duì)羥基苯曱酸曱酯或丙酯，或山梨酸)，通過常規(guī)手段加以制備。這些制備物還可視需要含有緩沖劑、鹽、調(diào)味劑、著色劑、和甜味劑。所述組合物可以配制為用于通過注射，例如推注或連續(xù)輸注，進(jìn)行腸胃外施用?；钚猿煞挚梢砸苑勰┑男问教峁?，在使用前用合適的溶媒，例如無菌無熱原水加以調(diào)制。注射用制劑可以以單位劑量形式提供，例如與添加的防腐劑一起裝在安瓿或多劑量容器中。組合物可以采取油性或水性溶媒中的懸液、溶液或乳液的形式，并可含有懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑等物質(zhì)。佐劑本發(fā)明的疫苗可以與其它免疫調(diào)節(jié)劑一起配制。具體地，疫苗組合物可包含一種或多種佐劑。可用于本文所述疫苗組合物中的佐劑包括，但不限于A.含礦物質(zhì)組合物和鈞鹽。還包括礦物質(zhì)鹽諸如氫氧化物(例如羥基氧化物)、磷酸鹽(例如羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等等(例如，見《VaccineDesign》第8和第9章，(1995)Powell和Newman編，ISBN:030644867X.Plenum)、或不同礦物質(zhì)化合物的混合物(例如磷酸鹽和氬氧化物佐劑的混合物，任選地，磷酸鹽為過量)、其中化合物采取任何合適的形式(例如凝膠、結(jié)晶、無定形等等)，對(duì)鹽的吸附是優(yōu)選的。含有礦物質(zhì)的組合物還可以配制為金屬鹽的顆粒(PCT公布號(hào)WO00/23105)。鋁鹽可以包含在本文所述的組合物中，使得A產(chǎn)的劑量是每劑0.2到1.0mg。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明組合物的基于鋁的佐劑是明礬(硫酸鋁鉀(A1K(S04)2)，或者明礬衍生物，例如通過將抗原與明礬在磷酸鹽緩沖液中混合，然后用石威例如氬氧化銨或氫氧化鈉進(jìn)行滴定和沉淀，/人而原位生成的明礬衍生物。另一種用于本發(fā)明疫苗組合物中的基于鋁的佐劑是氫氧化鋁佐劑(Al(OH)3)或結(jié)晶羥基氧化鋁(A100H),后者是一種優(yōu)秀的吸附劑，具有大約500m"g的表面積?；蛘?，提供磷酸鋁佐劑(AIP04)或羥基磷酸鋁，它們含有磷酸基團(tuán)，代替氫氧化鋁佐劑的一些或所有羥基基團(tuán)。本文提供的優(yōu)選的磷酸鋁佐劑是無定形的，可溶于酸性、堿性和中心介質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明組合物的佐劑包含磷酸鋁和氫氧化鋁二者。在它的一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，佐劑含磷酸鋁的量大于氫氧化鋁的量，例如磷酸鋁對(duì)氫氧化鋁的重量比為2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或大于9:1。更具體地，鋁鹽存在的量可以為每個(gè)疫苗劑量0.4到1.0mg,或每個(gè)疫苗劑量0.4到0.8mg，或每個(gè)疫苗劑量0.5到0.7mg，或每個(gè)疫苗劑量約0.6mg。通常，通過最優(yōu)化分子間的靜電引力，使得在所需的pH抗原攜帶與佐劑相反的電荷，來選擇優(yōu)選的基于鋁的佐劑，或者多種基于鋁的佐劑的比例，例如磷酸鋁對(duì)氫氧化鋁的比例。例如，在pH7.4,磷酸鋁佐劑(等電點(diǎn)=4)吸附溶菌酶而不吸附清蛋白。若靶標(biāo)是清蛋白，則選擇氬氧化鋁佐劑(等電點(diǎn)=11.4)?；蛘?，用磷酸預(yù)處理氫氧化鋁可降低其等電點(diǎn)，使其成為用于更堿性抗原的優(yōu)選佐劑。B.油乳液優(yōu)選的佐劑是亞微米水包油乳液。優(yōu)選用于本發(fā)明的亞微米水包油乳液是任選含有不同量MTP-PE的鯊烯-水乳液，例如含4-5%w/v鯊烯、0.25-1.0%w/vTweenTM80(聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯)、和/或0.25-1.0%Span85(山梨聚糖三油酸酯)，以及，任選地，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕櫚酰-s-n-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺[N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isogluatminyl-L-alanine-2-(r-2'-dipalmitoyl-s-n-glycero-3-huydroxyphosphophoryloxy)-ethylamine](MTP-PE)的亞孩i米？K包油乳液，例如，名為"MF59"的亞孩i米水包油乳液(國際/>布WO90/14837;美國專利6,299,884和6，451,325,及Ottetal.,"MF59畫-DesignandEvaluationofaSafeandPotentAdjuvantforHumanVaccines"于《VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach》中(Powell,M.F.和Newman,M.J.編)PlenumPress,NewYork,1995,pp.277-296)。MF59含有4-5%w/v簠烯(例如4.3%)、0.25-0.5%w/vTween80、及0.5%w/vSpan85,以及4壬選的不同量的MTP-PE,使用微流化床(microfluidizer)諸如110Y型微流化床(Microfluidics,Newton，Mass.)配制成亞微米顆粒。例如，MTP-PE可以以約0-500.嗎/劑、更優(yōu)選0-250.pg/劑、最優(yōu)選0-100嗎/劑的量存在。例如，"MF59-100"每劑含100(igMTP-PE,等等。MF69，另一種用于本發(fā)明的亞微米水包油乳液，含有4.3%w/v堇烯、0.25%w/vTweenTM80、及0.75%w/vSpan85,及任選的MTP-PE。另一種亞孩i米水包油乳液是MF75,又稱SAF,含有10%鯊烯、0.4%TweenTM80，5%PluronicTM嵌段聚合物L(fēng)121、以及thr畫MDP,同樣微流體化成亞微米乳液。MF75-MTP代表包含MTP，例如每劑100-400嗎MTP-PE的MF75制劑。用于所述組合物中的亞微米水包油乳液、它們的制備方法和免疫刺激劑，例如胞壁酰肽，在國際公布WO90/14837和美國專利6,299,884和6,451,325中有詳細(xì)記載。完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)也可以在主題組合物中用作佐劑。C.皂苷制劑皂苷制劑也可以在所述組合物中用作佐劑。皂苷是一群異質(zhì)的固醇糖苷和三萜類糖苷，存在于多個(gè)植物物種的樹皮、葉、莖、根甚至花中。從急樹(gw/〃a/as印o"an'aMolina)的樹皮分離的皂苦作為佐劑已經(jīng)得到了廣泛的研究。還可以,人菝葜(5Vm7oxW7ato)(sarsaprilla)、圓4,石頭花(G^/wop/z/〃aj70fm'cw/flto)(bridesveil)和月巴急草(^opowan'aoj^c/a"a/z-s)(急才艮)產(chǎn)業(yè)制備急普。皂苷佐劑制劑包括純化的制劑，例如QS21,和脂質(zhì)制劑，例如免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)。已經(jīng)利用高效薄層層析(HP-TLC)和反相高效液相層析(RP-HPLC)純化了皂苷組合物。使用這些技術(shù)特異性純化的級(jí)分已經(jīng)得到鑒定，包括QS7，QS17,QS18，QS21，QH-A，QH-B和QH-C。典型地，皂苷是QS21。美國專利5，057，540公開了一種制備QS21的方法。皂苷制劑還可以包括固醇，例如膽固醇(見PCT7>布W096/33739)。可以使用皂苷和膽固醇的組合來形成獨(dú)特的顆粒，稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)。ISCOM典型地還包括磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的急苦均可用于ISCOM中。優(yōu)選地，ISCOM包括QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。在EP0109942、W096A1711和W096/33739中進(jìn)一步描述了ISCOM。任選地，ISCOM可不含有其它去污劑。見WO00/07621。在Barretal.，爿dv朋cec/Dn^De/zVew7eWews(1998)32:247-271中可見基于皂苷的佐劑的發(fā)展的綜述。另見Sjolanderetal.，爿dva"cedi>wgDe"ve;^(1998)32:321-338。D.病毒體和病毒樣顆粒(VLP)病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可以用作本發(fā)明組合物的佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常含有一種或多種來自病毒的蛋白質(zhì)，任選與磷脂組合或配制在一起。它們通常是非致病性、非復(fù)制性的，且通常不含有任何天然病毒基因組。病毒蛋白可以重組制備或者從完整病毒分離。這些適合用于病毒體或VLP中的病毒蛋白包括來源于流感病毒(例如HA或NA)、乙型肝炎病毒(例如核心或殼體蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒(Sindbisvims)、專侖^l大病毒、口^帝疫病毒、逆專爭錄病毒、i若瓦克病毒(Norwalkvirus)、人乳頭瘤病毒、HIV、RNA噬菌體、QP噬菌體(例如外殼蛋白)、GA噬菌體、fr噬菌體、AP205噬菌體、和Ty(例如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pl)的蛋白質(zhì)。VLP在WO03/024480、WO03/024481和Niikuraetal.,K/ra/ogy(2002)293:273-280;Lenzetal"To訓(xùn)a/。//m應(yīng)"o/ogy(2001)5246-5355;Pintoetal.,/ow7a/ZXsecwey(2003)188:327-338;及Gerberetal.,Joww"/o/Wra/ogy(2001)75(10):4752-4760中有進(jìn)一步討論。病毒體在例如Glucketal.,Facc/we(2002)20:B10-B16中有進(jìn)一步討論。在鼻內(nèi)三價(jià)INFLEXAIJM產(chǎn)品(Mischler&Metcalfe(2002)Fhcc/we20Suppl5:B17-23)和INFLUVACPLUSTM產(chǎn)品中使用免疫增強(qiáng)性重建流感病毒體(IRIV)作為亞基抗原投遞系統(tǒng)。E.細(xì)菌或微生物書t生物適合用于本發(fā)明組合物中的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，諸如(1)腸桿菌脂多糖(LPS)的無毒衍生物這樣的衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A(MPL)和3-0-脫?；鵐PL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6條酰基化鏈的3-脫-0-?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A的混合物。EP0689454中公開了3-脫-0-?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A的一種優(yōu)選的"小顆粒"形式。這樣的3dMPL"小顆粒"小到足以無菌濾過0.22微米的濾膜(見EP0689454)。其它無毒LPS衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A模擬物，例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸酯(aminoalkylglucosaminidephosphate)衍生物，例如RC-529。參見Johnsonetal.(1999)Met/.C7z置丄故，9:2273-2278。(2)脂質(zhì)A衍生物脂質(zhì)A衍生物包括來自大腸桿菌(&c/zen'c/n'aco")的脂質(zhì)A衍生物，諸如OM-174。OM-174在例如Meraldietal.,Facd"e(2003)21:2485-2491;和Pajaketal.,&cc/we(2003)21:836-842中有記載。(3)免疫刺激性寡核苷酸適合用作佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(一種序列，含有非曱基化的胞嘧啶，其后隨鳥嘌呤，二者通過磷酸酯鍵相連)的核苷酸序列。含有回文或多聚(dG)序列的寡核芬酸或者細(xì)菌雙鏈RNA也已被證明具有免疫刺激性。CpG可包括核苷酸修飾/類似物諸如硫代磷酸酯修飾，并且可以是雙鏈的或單鏈的。任選地，鳥。票呤可以被類似物諸如2，-脫氧-7-脫氮鳥。票呤取代。關(guān)于可能的類似物取^的例子可參見Kandimallaetal.，NucleicAcidsResearch(2003)31(9):2393-2400;WO02/26757和W099/62923。CpG寡核苷酸的佐劑效應(yīng)在Krieg,A^weMeWc/"e(2003)9(7):831-835;McCluskieetal.,美國專利6,207,646;美國專利6,239,116和美國專利6,429,199中有進(jìn)一步討論。CpG序列可以是針對(duì)TLR9的，諸如基序GTCGTT或TTCGTT。見Kandimallaetal"5bc/e(y7h2^wac/z'o/w(2003)31(part3):654-658。CpG序列可以是對(duì)誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答特異性的，例如CpG-AODN,或者它可以是對(duì)誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答更特異性的，例如CpG-BODN。在Blackwelletal.,J/附m朋o/.(2003)170(8):4061-4068;Krieg,T7^VAS/m/mmo/ogv(2002)23(2):64-65和WOOl/95935中討論了CpG-A和CpG-BODN。典型地，所述CpG是CpG-AODN。典型地，CpG寡核苷酸構(gòu)建的方式使得5，末端是受體識(shí)別可及的。任選地，兩個(gè)CpG寡核苷酸序列可以在它們的3'末端搭接形成"免疫體"(imm畫mers)。參見，例如，Kandimallaetal"5朋C(2003)306:948-953;Kandimallaetal.，5/oc/ew/ca/5b".,JhmsaWom1(2003)31(第3邵分)664-658;Bhagatetal.,5J5iC(2003)300:853-861和WO03/035836。(4)ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物細(xì)菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可以在所述組合物中用作佐劑。典型地，所述蛋白質(zhì)來源于大腸桿菌(例如大腸桿菌不耐熱腸毒素"L丁")、霍亂("CT")、或百日咳("PT")。W095/17211描述了脫毒的ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑的用途，W098/42375描述了它作為腸胃外佐劑的用途。優(yōu)選地，佐劑是脫毒的LT突變體諸如LT-K63、LT-R72和LTR192G。ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72作為佐劑的用途可在下歹'J文獻(xiàn)中見到Beignonetal.,/"/e"/o"/www"—(2002)70(6):3012-3019;Pizzaetal.,Facc/"e(2001)19:2534-2541;Pizzaetal"/W.』MedMc油W.(2000)290(4-5):455腸461;Scharton陽Kerstenetal"/"/ec"cw朋dTmmt/mXv(2000)68(9):5306-5313;Ryanetal"awe//mwwm'(v(1999)67(12):6270-6280;Partidosetal.,/wmw"o/.(1999)67(3):209-216;Peppolonietal"F鮮z'聰(2003)2(2):285-293;和Pineetal"j;Cofra//^/eose(2002)85(l-3):263-270。氨基酸取代的編號(hào)基準(zhǔn)典型地依據(jù)Domenighinietal"Mol.Microbiol(1995)15(6):1165-1167中提供的ADP-核糖基化毒素A亞基和B亞基的比對(duì)。F.生物粘附劑和粘膜粘附劑生物粘附劑(bioadhesives)和粘膜粘附劑(mucoadhesives)也可以用作主題組合物中的佐劑。合適的生物粘附劑包括酯化透明質(zhì)酸微球(Singhetal.(2001)Co"f.70:267-276)或粘膜粘附劑諸如聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧曱基纖維素的交聯(lián)衍生物。殼聚糖及其衍生物也可以在所述組合物中用作佐劑。參見例如WO99/27960。G.顆粒微顆粒(microparticles)和納米顆粒(nanoparticles)(例如聚合納米顆粒)也可以在所述組合物中用作佐劑。微顆粒(典型地為直徑~100nm到~150|im，例^口直^圣200nm到~30jum，或直^圣500nm到~10jim的茅貞斗立)和纟內(nèi)米顆粒(典型地為10nm到1000nm的顆粒，例如直徑10nm到100nm,直徑~20nm到500nm,或直徑50nm到~300nm)可以由生物可降解且無毒的材料(例如聚(ct-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己內(nèi)酯等等，與聚(丙交S旨-共-乙交酯)形成。任選地，可以處理顆粒，使它們具有帶負(fù)電荷的表面(例如用SDS處理)或帶正電荷的表面(例如用陽離子去污劑諸如CTAB處理)?？梢詫?duì)顆粒的特異性進(jìn)行改造，使得它們對(duì)期望位置投遞藥物的濃度增力口。參見例如Matsumotoetal.,JP/7ormacew"c^185:93-101,1999;Williamsetal"Cb欣o〃ec7e/e,，91:167-172,2003;Lerouxetal.,/Ccwfro//e(iie/ecwe,39:339-350，1996;Soppimathetal.,乂CowfraZ/eJie/ms^,70:1-20,2001;Chawlaetal.，/尸/z"m7acew"cs,249:127-138，2002;Brannon-Peppas，/P/wrmacew"'cs,116,1-9，1995;Bodmeieretal"/尸Aar顧cei/"cs,43:179-186,1988;Labhasetwaretal.,J<iv.Z>wgDe/fve/^24:63-85,1997;Pinto-Alphandaryetal.，/"/7./爿M"m/cra6/a/^ge"&,13:155-168，2000;Poti腦ietal"JCo"fra〃e"e/e匿，86:223-234,2003;Kostetal"J<iv.Z>wgDe//ver_yiev/e薦,46:125-148,2001;和Saltzmanetal.,Z>wg￡fe，"，1:177-186,2002。顆粒，優(yōu)選是納米顆粒，可以組裝成具有一定結(jié)構(gòu)的、微米大小尺度的聚集體，它們具有由親脂性和/或親水性分子(通常是藥用"賦形劑")的混合物構(gòu)成的外殼或基質(zhì)。納米顆?？梢栽谏衔乃龇椒ㄖ行纬?，并可摻入細(xì)胞物質(zhì)，其中細(xì)胞物質(zhì)充當(dāng)顆粒本體、位于顆粒表面上或包裹在顆粒內(nèi)。聚集顆粒的外殼或基質(zhì)可包含藥用賦形劑諸如脂質(zhì)、氨基酸、糖、聚合物，還可摻入核酸和/或肽和/或蛋白質(zhì)和/或小分子抗原。還可以使用抗原性物質(zhì)的組合。這些聚集顆?？梢栽谙铝蟹椒ㄖ行纬伞Ｃ绹鴮＠暾?qǐng)流水號(hào)2004/0062718描述了一種用作疫苗的多孔納米顆粒聚集體顆粒(PNAP)的制備方法。抗原可通過構(gòu)成納米顆粒、連接于納米顆粒表面或包裹于納米顆粒中而與納米顆粒相結(jié)合，或者可以摻入微顆粒的外殼中，然后引發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫。其它示例性的PNAP制備方法在JohnsonandPrud，homme，Austral.J.Chem.，56:1021-1024，2003中有記載。這些顆粒如Edwardsetal.，尸rac.Ato/.爿cadSc/.19:12001-12005,2002所述的那樣聚集產(chǎn)生由較小的亞單位顆粒所成的較大顆粒(稱為特洛伊/木馬顆粒，因?yàn)樗鼈儽３炙鼈兊妮^小亞單位的獨(dú)特性質(zhì)，同時(shí)也保持較大顆粒的關(guān)^t特征)。藥物可以包裹在亞單位顆粒中，或者包裹在由較小顆粒聚集體構(gòu)成的較大顆粒中。顆粒可采取適于吸入的干粉末形式。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，顆?？删哂猩儆诩s0.4g/cn^的振實(shí)密度。本文將具有少于約0.4g/cmS的振實(shí)密度的顆粒稱為"空氣動(dòng)力學(xué)輕顆粒"(aerodynamicallylightparticles)。更優(yōu)選具有少于約0.1g/cn^的振實(shí)密度的顆粒?？諝鈩?dòng)力學(xué)輕顆粒的優(yōu)選尺寸，例如體積中值幾何直徑(VMGD),為至少大約5樣i米。在一個(gè)實(shí)施方案中，VMGD為大約5微米到大約30微米。在另一個(gè)實(shí)施方案中，顆粒具有大約9微米到大約30微米的VMGD。在另一個(gè)實(shí)施方案中，顆粒的中值直徑、質(zhì)量中值直徑(MMD)、質(zhì)量中值包膜直徑(MMED)或質(zhì)量中值幾何直徑(MMGD)為至少5微米，例如約5微米到約30微米?？諝鈩?dòng)力學(xué)輕顆粒優(yōu)選具有大約1微米到大約5微米的"質(zhì)量中值空氣動(dòng)力學(xué)直徑"(MMAD),本文中又稱"空氣動(dòng)力學(xué)直徑"。在一個(gè)實(shí)施方案中，MMAD為大約1微米到大約3微米。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MMAD為大約3微米到大約5微米。在另一個(gè)實(shí)施方案中，顆粒具有小于約0.4g/cm3的包膜質(zhì)量密度(envelopemassdensity),本文中又稱"質(zhì)量密度"。各向同性顆粒的包膜質(zhì)量密度定義為顆粒質(zhì)量除以能夠?qū)㈩w粒包入其中的最小球形包膜體積。振實(shí)密度可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的儀器，例如雙平臺(tái)微處理器控制才展實(shí)密度測(cè)試4義(DualPlatformMicroprocessorControlledTapDensityTester)(Vankel,N.C.)或GeopycTM儀(MicrometricsInstrumentCorp.,Norcross，Ga,30093)來加以測(cè)量。振實(shí)密度是包膜質(zhì)量密度的標(biāo)準(zhǔn)量度。振實(shí)密度可以使用USPBulkDensityandTappedDensity,UnitedStatesPharmacopiaconvention,Rockville,Md.,10thSupplement,4950-4951，1999的方法來確定?？赡艽俪傻驼駥?shí)密度的特征包括不規(guī)則的表面構(gòu)造及多孔結(jié)構(gòu)。顆粒的直徑，例如它們的VMGD,可以使用電區(qū)傳感儀(electricalzonesensinginstrument)諸^口Multisizerlie(CoulterElectronic,Luton,Beds,England)或者激光衍射儀(例如Helos,Sympatec，Princeton,N丄制造)來測(cè)量。其它用于測(cè)量顆粒直徑的儀器是本領(lǐng)域公知的。樣品中顆粒的直徑將依賴于顆粒組成及合成方法等因素而不同?？梢詫?duì)樣品中顆粒大小的分布加以選捧，以實(shí)現(xiàn)呼吸道內(nèi)目標(biāo)部位中的最優(yōu)沉積?？梢砸赃m于對(duì)呼吸道的選定區(qū)域，諸如肺深部或上氣道或中氣道進(jìn)行局部投遞的材料、表面粗糙度、直徑和振實(shí)密度來制備顆粒。例如，對(duì)上氣道投遞可以使用較高的密度或較大的顆粒，或者，可以施用樣品中帶有相同或不同治療劑的、大小不一的顆粒的混合物，以在一次施用中靶向肺的不同區(qū)域。空氣動(dòng)力學(xué)直徑為大約3到大約5微米的顆粒優(yōu)選用于對(duì)中氣道和上氣道投遞?？諝鈩?dòng)力學(xué)直徑為大約1到大約3微米的顆粒優(yōu)選用于對(duì)肺深部才殳遞。氣溶膠的慣性碰撞和重力沉降是正常呼吸條件下氣道和肺腺泡中主要的沉積機(jī)制(Edwards,/Jemso/5W.，26:293-317，1995)。這兩種沉積機(jī)制的重要性與氣溶膠的質(zhì)量而非與顆粒(或包膜)體積成比例地增加。由于在肺中氣溶膠沉積的部位是由氣溶膠的質(zhì)量決定的(至少對(duì)于平均空氣動(dòng)力學(xué)直徑大于約l微米的顆粒是如此)，通過增加顆粒表面的不規(guī)則性和顆?？紫堵识鴾p小振實(shí)密度，可以在所有其它物理參數(shù)相等的條件下，允許向肺中投遞較大的顆粒包膜體積。可以計(jì)算空氣動(dòng)力學(xué)直徑來提供肺中的最大沉積，這一點(diǎn)在以往是利用直徑小于約5微米，優(yōu)選約2到約3微米的極小顆粒來實(shí)現(xiàn)的，這些顆粒隨后受到吞噬。選擇具有更大的直徑但足夠輕(因此具有"空氣動(dòng)力學(xué)上輕，，的特征)的顆粒，可實(shí)現(xiàn)同等的肺投遞，而尺寸較大的顆粒不被吞噬。相對(duì)于具有光滑表面的顆粒，使用具有粗糙或不均勻表面的顆?？色@得更好的投遞?？梢灾苽浠蚍蛛x合適的顆粒，例如通過過濾或離心，來為顆粒樣品提供預(yù)選擇的大小分布。例如，樣品中多于約30%、50%、70%或80%的顆?？删哂兄辽偌s5微米的選定范圍內(nèi)的直徑。一定百分比的顆粒所必須落入的選定范圍可以是，例如，約5到約30微米，或者任選地，約5到約15微米。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一部分的顆粒具有約9到約ll微米的直徑。任選地，還可以制備這樣的顆粒樣品，其中至少約90%，或任選地約95%或約99%具有選定范圍內(nèi)的直徑。顆粒樣品中較高比例的較大直徑空氣動(dòng)力學(xué)輕顆粒的存在，可增強(qiáng)其中摻入的治療劑或診斷劑對(duì)肺深部的投遞。大直徑顆粒通常意指中值幾何直徑至少約5微米的顆粒。優(yōu)選的靶向抗原呈遞細(xì)胞("APC")的顆粒具有400nm的最小直徑，這是APC吞噬的極限。用于穿過組織運(yùn)輸并靶向細(xì)胞以供攝取的優(yōu)選顆粒具有10nm的最小直徑。最終的制劑可形成適于肺投遞并在室溫穩(wěn)定的干粉末。H.脂質(zhì)體美國專利6,0卯,406、美國專利5,916,588和EP0626169記載了適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子。I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑適合在組合物中使用的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。參見例如W099/52549。這樣的制劑還可以包括聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性劑與辛苯昔醇(octoxynol)的組合(W001/21207),以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑與至少一種其它的非離子型表面活性劑諸如辛苯昔醇的組合(WO01/21152)。優(yōu)選的聚氧乙燁醚選自下組聚氧乙埽-9-月桂基醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂基(steoryl)醚、聚氧乙烯_4_月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。J.聚磷,(PCPP)聚石舞口秦(polyphosphazene)制劑在例如Andrianovetal.，歷omafe",a/s(1998)19(1-3):109畫115和Payneetal.,爿dv.i>wg.De"ve^yiev/ew(1998)31(3):185畫196中有記載。K.胞壁酰肽適合用作佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-l-丙氨酰-d-異谷氨酰胺(nor-MDP)、和N-乙酰胞壁酰-l-丙氨酰-d-異谷氨酰胺酰-l-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚酰-s-n-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)。L.咪唑并喹啉化合物適合在所述化合物中用作佐劑的咪唑并喹啉(imidazoquinoline)化合物的例子包括咪奮莫特(Imiquimod)及其類似物，它們?cè)赟tanley,C".Exp.Z)ermato/.(2002)27(7):571-577;Jones,Cwr.Op/"./"veWg.Z>Mg5(2003)4(2):214-218;和美國專利4,689，338、5,389,640、5,268,376、4,929,624、5,266,575、5,352,784、5,494,916、5,482,936、5,346,905、5,395,937、5，238，944及5,525,612中有進(jìn)一步描述。M.縮氨基硫脲化合物縮氨基硫脲(thiosemicarbazone)化合物的例子，以及配制、制造、和篩中記載的那些?？s氨基硫脲用于刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞因子，例如TNF-a,是尤其有效的。N.色胺酮化合物色胺酮(tryptanthrin)化合物的例子，以及配制、制造、和篩選所有適合在所述組合物中作為佐劑的化合物的方法，包括在WO04/64759中記載的那些。色胺酮化合物用于刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞因子，例如TNF-a,是尤其有效的。0.人免疫調(diào)節(jié)劑適合在所述組合物中用作佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，諸如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(例如干擾素-力、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、及腫瘤壞死因子。所述組合物還可包括一種或多種上述佐劑的組合方面。例如，下面的佐劑組合物可以用于本發(fā)明中(1)皂苷和水包油乳液(W099/11241);(2)皂苷(例如QS21)+無毒LPS衍生物(例如3dMPL)(見WO94/00153);(3)皂苷(例如QS21)+無毒LPS衍生物(例如3dMPL)+膽固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任選+固醇)(W098/57659);(5)3dMPL與例如QS21和/或水包油乳液的組合(見歐洲專利申請(qǐng)0835318,0735898和0761231);(6)SAF,含10%鯊烯、0.4%Tween80、5%PluronicTM嵌段聚合物L(fēng)121、和thr-MDP,或者樣i流體化成為亞農(nóng)t米乳液，或者渦旋振蕩形成顆粒尺寸較大的乳液；(7)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(RibiImmunochem),含2%鯊烯、0.2%Tween80、和選自下組的一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分單磷酰脂質(zhì)A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、和細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS(Detox);(8)—種或多種礦物質(zhì)鹽(例如鋁鹽)+無毒的LPS書f生物(例如3dPML);和(9)一種或多種礦物質(zhì)鹽(例如鋁鹽)+免疫刺激性寡核苷酸(例如包括CpG基序的核苷酸序列)。鋁鹽和MF59是用于可注射疫苗的典型佐劑。細(xì)菌毒素和生物粘附劑是用于粘膜投遞疫苗，諸如鼻用或吸入疫苗的典型佐劑。其它可用于粘膜疫苗的佐劑在例如StevcevaandFerrari,C群,P/z簡.Z)e&,11:801-11,2005和Coxetal.,L,37:511-39,2006中有所討論。實(shí)施例實(shí)施例1:恥垢分枝桿菌懸液的噴霧干燥為了舉例說明對(duì)沒有賦形劑的細(xì)胞形式進(jìn)行噴霧干燥會(huì)產(chǎn)生過于潮濕而無法制備或加工的粉末，使用恥垢分枝桿菌作為模型微生物。使用Biichi孩l型噴霧干燥器B-2卯(BtichiMiniSprayDryerB-2卯)(BrinkmannInstruments,Westbury,NY)進(jìn)行噴霧干燥來形成干粉末，其中對(duì)入口溫度、流速和賦形劑濃度均進(jìn)行控制。在不存在賦形劑的條件下將微生物噴霧干燥。將純恥垢分枝桿菌的溶液在PBS-Tween80中洗滌后，重懸于90mL水中，以得到3x108CFU/mL的細(xì)菌濃度。在19.5。C和48。/。濕度的環(huán)境條件下，以入口溫度130。C、出口溫度50°C、流速22mL/min將該恥垢分枝桿菌溶液噴霧干燥。細(xì)菌團(tuán)塊在噴霧干燥器缸體中聚集，未能以粉末形式從旋風(fēng)分離器噴出。從噴霧干燥器中收集的物料是潮濕的，幾乎無法加工。實(shí)施例2:使用亮氨酸噴霧干燥恥垢分枝桿菌為了舉例說明相對(duì)少量的賦形劑不能產(chǎn)生成功干燥的粉末，使用亮氨酸作為^f莫型賦形劑將恥垢分枝桿菌噴霧干燥。干燥的溶液由80%(以重量計(jì))的4mg/mL亮氨酸溶液和20%的3x109CFU/mL恥垢分枝桿菌懸液組成400mL溶液。溶液在即將到達(dá)噴嘴前在線(inline)混合。在20。C和69。/。濕度的環(huán)境條件下，以入口溫度150。C、出口溫度60。C、流速8mL/min將溶液噴霧干燥。平均微滴大小估計(jì)為50-60微米。該過程通過噴霧干燥器的旋風(fēng)分離器產(chǎn)生了產(chǎn)物，但產(chǎn)物過于潮濕，得率低。得到了含活細(xì)菌的微黃色粉末(圖3)。但該粉末結(jié)團(tuán)，且表現(xiàn)的流動(dòng)性質(zhì)較差。實(shí)施例3:使用較高濃度的亮氨酸噴霧干燥恥垢分枝桿菌較高濃度的賦形劑，諸如亮氨酸，可產(chǎn)生良好的噴霧干燥粉末，而更高的賦形劑濃度可增加微生物活力。再次通過將90%和95%的4mg/mL亮氨酸溶液和10%及5%的3xl09CFU/mL恥垢分枝桿菌懸液混合制備了400ml的溶液。這些溶液也是在即將到達(dá)噴嘴之前在線混合。在20。C和69。/o濕度的環(huán)境條件下，以入口溫度150°C、出口溫度55°C、流速8mL/min將溶液噴霧干燥。平均微滴大小估計(jì)為50-60微米。表1提供了噴霧干燥操作所得的結(jié)果。在所有情況下，噴霧干燥均得到了細(xì)微、白色、有活力的粉末，適于氣溶膠分散，產(chǎn)物得率較高?；盍σ院泵顾氐?H9瓊脂平板上的菌落形成單位數(shù)計(jì)算。與90:10(亮氨酸:恥垢分枝桿菌)的粉末相比，95:5的粉末觀察到了顯著較高的生物體活力(約20-80倍)(圖4),說明在噴霧干燥過程中添加的賦形劑對(duì)保護(hù)微生物的重要性。根據(jù)粉末的大體外觀來估計(jì)含水量。使用熱重分析法(TGA)對(duì)含水量加以定量分析。圖5是描繪表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的恥垢分枝桿菌的熒光顯微照片，這些恥垢分枝桿菌使用90:10亮氨酸:恥垢分枝桿菌進(jìn)行了噴霧干燥。該顯微照片顯示，粉末的顆粒中只有一部分含有發(fā)熒光的恥垢分枝桿菌(綠色)。表l.用亮氨酸噴霧干燥恥垢分枝桿菌<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表1中的產(chǎn)物得率以終產(chǎn)物中的質(zhì)量相比于被噴霧溶液中溶質(zhì)質(zhì)量的比例來計(jì)算。終產(chǎn)物的質(zhì)量包括粉末中的任何殘留水。通常，一部分質(zhì)量粘附于干燥設(shè)備而無法回收。實(shí)施例4:用甘露糖醇噴霧干燥恥垢分枝桿菌為了證明可以用其它賦形劑來噴霧干燥微生物，使用糖類甘露糖醇進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。賦形劑溶液由95%的10mg/mL甘露糖醇溶液和5%的3xl09CFU/mL恥垢分枝桿菌懸液組成，溶液體積為200mL，通過在即將到達(dá)噴嘴之前在線混合生成。在21.9。C和63%濕度的環(huán)境條件下，以入口溫度145。C、出口溫度55。C、流速12mL/min將溶液噴霧干燥。平均微滴大小估計(jì)為50-60微米。噴霧干燥得到了細(xì)微、白色、有活力的粉末，適于氣溶膠分散，產(chǎn)物得率為50%，含有活細(xì)菌。實(shí)施例5:干燥的恥垢分枝桿菌在儲(chǔ)存中的活力為了測(cè)定經(jīng)噴霧干燥的恥垢分枝桿菌在儲(chǔ)存過程中的活力，如實(shí)施例3那樣進(jìn)行了噴霧干燥，并將所得粉末在密封容器中于4°C、25X:和40'C儲(chǔ)存1到2周?；盍σ云桨迳系木湫纬蓡挝粩?shù)計(jì)。95:5亮氨酸:恥垢分枝桿菌粉末在4'C或25。C儲(chǔ)存1周后保留了顯著的活力，但在40。C儲(chǔ)存后沒有顯著活力。卯:IO亮氨酸:恥垢分枝桿菌粉末在4。C儲(chǔ)存1周后保留了活力，但在更高的溫度則無活力。圖6顯示了95:5亮氨酸:恥垢分枝桿菌粉末在25。C儲(chǔ)存1周后的電子顯微照片。實(shí)施例6:采用冷凍保護(hù)劑的噴霧干燥的模擬為了顯示噴霧干燥過程中賦形劑導(dǎo)入的方式可能是活力保留的重要因素，用方程36來模擬在無冷凍保護(hù)劑、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外有等濃度的冷凍保條件下噴霧干燥過程中的細(xì)胞物質(zhì)體積(圖7)。目的是證明一種范式，根據(jù)該范式，通過在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外，或細(xì)胞內(nèi)外兩側(cè)引入冷凍保護(hù)劑(賦形劑)可以使膜應(yīng)力最小化。才莫擬使用Mathematica⑧程序(Wolfram,Inc.,Champaign,IL)來進(jìn)行。對(duì)所有三個(gè)圖，初始細(xì)胞半徑(iT(O))設(shè)定為1pm，初始微滴半徑(i)設(shè)定為25將相對(duì)細(xì)胞體積對(duì)時(shí)間作圖。Z^設(shè)定為1.0)im/(atmmin);i，設(shè)定為0.08205745867258821(atmL)/(Kmol);T設(shè)定為295.15K。在所有三種情況下，/1=-(i^ZMT/))/(/^)(方程33)。通過設(shè)定入口溫度500。C、出口溫度200。C、初始孩t滴溫度20。C和最終樣i滴溫度65。C來求出LMri)。將這些值輸入方程30，得到丄M7D=((500。C—20。C)—(200。C—65。C))/(2.303*log10((500。C_20。C)/(200。C—65。C)))。&設(shè)定為0.02kcal/(mhr。C);;i設(shè)定為530kcal/kg;pj殳定為1000kg/m3。細(xì)胞數(shù)("c函)設(shè)定為100,排除體積(K油^)設(shè)定為初始體積的0.46倍。！5^設(shè)定為10氣對(duì)于圖7中的軌跡(a)，細(xì)胞外的冷凍保護(hù)劑濃度低于細(xì)胞內(nèi)的冷凍保護(hù)劑濃度，細(xì)胞外鹽的量(;v^)設(shè)定為0.26M乘以初始微滴體積(F^=4/3兀(i)3),細(xì)胞內(nèi)鹽的量(x',)設(shè)定為0.26M乘以初始微滴體積，細(xì)胞外冷凍保護(hù)劑的量(%%)設(shè)定為Omol,細(xì)胞內(nèi)冷凍保護(hù)劑的濃度(C^(0))設(shè)定為1M。使用這些條件，對(duì)0到0.105秒的時(shí)間求方程36的值，得到軌跡(a)。對(duì)于圖7中的軌跡(b),細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)沒有冷凍保護(hù)劑，細(xì)胞外鹽的量和細(xì)胞內(nèi)鹽的量(x^和乂,)設(shè)定為0.26M乘以初始微滴體積。細(xì)胞內(nèi)冷凍保護(hù)劑的量(x;)和濃度(C^(0))分別設(shè)定為0mol和0M。使用這些條件，對(duì)0到0.105秒的時(shí)間求方程36的值，得到軌跡(b)。對(duì)于圖7中的軌跡(c),細(xì)胞內(nèi)的冷凍保護(hù)劑濃度等于細(xì)胞外的冷凍保護(hù)劑濃度，細(xì)胞外鹽的量和細(xì)胞內(nèi)鹽的量(xe,和x',)設(shè)定為0.26M乘以初始微滴體積。細(xì)胞內(nèi)的冷凍保護(hù)劑濃度(cv(o))和細(xì)胞外的冷凍保護(hù)劑濃度設(shè)定為1M,從而細(xì)胞外冷凍保護(hù)劑的量(X;)為1M乘以初始微滴體積。使用這些條件，對(duì)0到0.105秒的時(shí)間求方程36的值，得到軌跡(c)。這些結(jié)果顯示，依賴于導(dǎo)入冷凍保護(hù)劑賦形劑的方法，得到差異極大的體積偏移(volumeexcursion)(或膜應(yīng)力)分布圖。從這一認(rèn)識(shí)可以發(fā)展出4吏細(xì)胞活力損失最小化的細(xì)胞形式噴霧干燥方法。實(shí)施例7:通過最小化膜滲透應(yīng)力最優(yōu)化恥垢分枝桿菌的細(xì)胞活力為了舉例說明最小化膜應(yīng)力可如何改善干燥細(xì)胞的活力，如實(shí)施例3中那樣，將95%的4mg/mL亮氨酸溶液和5%的3xl09CFU/mL恥垢分枝桿菌懸液混合，制備了400ml的溶液。但是在這種情況下，沒有向恥垢分枝桿菌懸液添加甘油。同樣，在沒有甘油，并使用等滲鹽水(0.9%NaCl)代替前面所有實(shí)施例中使用的蒸餾水的條件下，將相同溶液噴霧干燥。溶液也是在即將到達(dá)噴嘴時(shí)在線混合。在20°C、69%濕度的環(huán)境條件下，以入口溫度150。C、出口溫度55。C、流速8mL/min對(duì)溶液進(jìn)行噴霧干燥。平均微粒大小估計(jì)為50-60微米。表2.使用和不使用甘油對(duì)95:5(恥垢分枝桿菌/亮氨酸)噴霧干燥甘油CFU入CFU出質(zhì)量入(mg)質(zhì)量出(mg)%活力%產(chǎn)物得率有1.50x10107鹿10810165628.4%55.3%無1.50x10101.93x109152083024.1%53.5%表2提供了用和不用甘油對(duì)95:5亮氨酸/恥垢分枝桿菌混合物進(jìn)行噴霧干燥操作所得的結(jié)果。在所有情況下，噴霧干燥均得到了細(xì)微、白色、有活力的粉末，適于氣溶膠分散，產(chǎn)物得率較高。活力以含潮霉素的7H9瓊脂平板上的菌落形成單位數(shù)計(jì)算。與使用甘油的95:5(亮氨酸:恥垢分枝桿菌)粉末相比，不使用甘油的粉末觀察到了顯著較高的生物體活力。不使用甘油并使用0.9%等滲鹽水對(duì)95:5(亮氨酸:恥垢分枝桿菌)混合物進(jìn)行噴霧干燥時(shí)，相對(duì)于不使用甘油且不使用鹽的95:5(亮氨酸:恥垢分枝桿菌)，觀察到很低的細(xì)胞活力(圖8)，說明從被噴霧干燥的溶液中去除滲透壓活性物質(zhì)對(duì)于在噴霧干燥過程中保護(hù)微生物的重要性。這些結(jié)果確證了實(shí)施例6的預(yù)測(cè)，即在細(xì)胞物質(zhì)懸液的干燥過程中，冷凍保護(hù)劑或鹽的存在可能對(duì)細(xì)胞膜造成顯著的應(yīng)力，導(dǎo)致活力下降，后者可以推測(cè)是干燥過程中細(xì)胞死亡所致。實(shí)施例8:恥垢分枝桿菌活力高的噴霧干燥的粉末中細(xì)胞含量增加為了舉例說明噴霧干燥的細(xì)胞保留高活力可導(dǎo)致噴霧干燥粉末中游離水含量降低并從而導(dǎo)致細(xì)胞含量升高，如實(shí)施例7中那樣，通過混合90%、50%、40%、30%、20%和10%的4mg/mL亮氨酸溶液和10%、50%、60%、70%、80%和90%的3xl09CFU/mL恥垢分枝桿菌懸液一不使用甘油且不使用鹽，制備了400ml的溶液。同樣，在即將到達(dá)噴嘴之前將溶液在線混合。在20。C、69%濕度的環(huán)境條件下，以入口溫度150°C、出口溫度55。C、流速8mL/min對(duì)溶液進(jìn)行噴霧干燥。平均微粒大小估計(jì)為50-60微米。圖9顯示噴霧干燥操作的活力結(jié)果。和前面的實(shí)施例一樣，活力隨賦形劑濃度的降低而下降，證明高水平的賦形劑對(duì)于良好的細(xì)胞活力是必需的。但與前面的實(shí)施例不同的是，用低達(dá)50%的賦形劑濃度獲得了活力良好的細(xì)微干粉末。這似乎表明，當(dāng)細(xì)胞完整性得以維持時(shí)，和/或當(dāng)不使用像甘油那樣在室溫仍保持液態(tài)的添加劑時(shí)，較低濃度的賦形劑(低于90%)可能提供良好的結(jié)果?；盍σ院泵顾氐?H9瓊脂平板上的菌落形成單位數(shù)計(jì)算，顯示的是每個(gè)比例四個(gè)重復(fù)測(cè)定的結(jié)果。這些結(jié)果顯示，除去冷凍保護(hù)劑，導(dǎo)致在降低的賦形劑濃度條件下的細(xì)月包活力i曾力口。實(shí)施例9:含恥垢分枝桿菌的噴霧干燥粉末的保存期穩(wěn)定性為了舉例說明在沒有冷凍的條件下，細(xì)胞活力可以在干燥后維持一段時(shí)間，將實(shí)施例8中用50:50和95:5亮氨酸:恥垢分枝桿菌制備的粉末置于4'C、25。C和4(TC的批量儲(chǔ)存條件下，并以含潮霉素的7H9瓊脂平板上的菌落形成單位數(shù)計(jì)算活力。圖10和11顯示了作為時(shí)間函數(shù)的兩種粉末的活力結(jié)果?；盍S持了數(shù)月，其中前3個(gè)月中活力損失最劇烈，在更長的期間內(nèi)則活力穩(wěn)定。儲(chǔ)存在4'C條件下的粉末在3個(gè)月內(nèi)保持了超過十分之一的原活力。儲(chǔ)存在25。C條件的粉末維持了高于對(duì)投遞而言最優(yōu)的106閾值的活力，而儲(chǔ)存在4(TC條件的粉末維持活力達(dá)2個(gè)月。50:50粉末和95:5粉末之間活力隨時(shí)間的差異可能是由于細(xì)菌濃度不同所致，細(xì)菌濃度影響粉末中的含水量。實(shí)施例10:使用單磷脂A的穩(wěn)定性效果確定了親脂性物質(zhì)單磷脂A(MpLA)對(duì)噴霧干燥的恥垢分枝桿菌的穩(wěn)定性的效果。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定是否可以把油性外殼用作保留細(xì)菌內(nèi)的內(nèi)部水分的手段，以增加其在更長時(shí)間點(diǎn)上的活力。用95%的4g/ml亮氨酸溶液和5%的恥垢分枝桿菌懸液，以及0.25。/。MpLA,如上面所述噴霧干燥恥垢分枝桿菌。以124。C的入口溫度和45。C的出口溫度對(duì)該溶液噴霧干燥。環(huán)境溫度為31.6。C和34。/。相對(duì)濕度。這些條件得到了66%的質(zhì)量得率。如圖12A和12B所示，與沒有MpLA處理的細(xì)菌相比，用MpLA處理的細(xì)菌能夠在16周的期間內(nèi)維持活力。在長達(dá)1年的儲(chǔ)存之后仍測(cè)量到活力。實(shí)施例ll:多種表面活性劑的效果為了舉例說明可以使用多種分散劑得到上述的結(jié)果且不影響活力，使用0.05%泰洛沙泊(前述實(shí)施例中使用的分散劑)和0.05%及0.1%PluronicTM-F68制備了95:5和50:50的恥垢分枝桿菌制劑。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖13中。與使用泰洛沙泊制備的粉末相比，使用這些PluronicTM-F68沒有顯著影響所得粉末的活力。實(shí)施例12:含牛分枝桿菌BCG的噴霧干燥粉末的保存期穩(wěn)定性為了舉例說明我們的結(jié)論對(duì)疫苗生物體的適用性，我們用牛分枝桿菌BCG進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。我們使用與實(shí)施例3相同的方法，不用鹽或冷凍保護(hù)劑，制備了95:5亮氨酸:牛分枝桿菌BCG的粉末，并將干燥后的物料置于4。C、25。C和4(TC的批量儲(chǔ)存條件下，以7H9瓊脂平板上的菌落形成單位數(shù)計(jì)算活力。圖14顯示到3個(gè)月為止作為時(shí)間函數(shù)的兩種粉末的活力結(jié)果。儲(chǔ)存在4'C條件下的粉末在3個(gè)月的儲(chǔ)存過程中大體維持了它們的原活力。儲(chǔ)存在25。C條件下的粉末維持了相似的活力，在3個(gè)月時(shí)有一些損失。這些活力結(jié)果與圖9和IO所示的恥垢分枝桿菌細(xì)菌的結(jié)果相似。實(shí)施例13:哺乳動(dòng)物細(xì)胞的噴霧干燥為了證明亮氨酸濃度高而膜滲透應(yīng)力最小的制劑可進(jìn)一步適用于非細(xì)菌細(xì)胞，我們用培養(yǎng)的NIH3T3胚胎小鼠成纖維細(xì)胞和原代采集的大鼠心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。我們制備了3種制劑我們用4毫克亮氨酸每毫升蒸餾水來懸浮每毫升1百萬個(gè)成纖維細(xì)胞，其中亮氨酸溶液/細(xì)胞溶液的體積/體積比為30/70、50/50和70/30。我們用實(shí)施例3中對(duì)恥垢分枝桿菌所用的相似條件將這些制劑噴霧干燥。所有實(shí)驗(yàn)均表明，原代采集的大鼠心臟成纖維細(xì)胞和NIH3T3胚胎小鼠成纖維細(xì)胞經(jīng)受噴霧干燥過程的存活能力大致相等。較高濃度的亮氨酸似乎導(dǎo)致噴霧干燥時(shí)較高的活力；但是，鑒于成纖維細(xì)胞的細(xì)胞膜比細(xì)菌的膜剛性低，對(duì)細(xì)胞內(nèi)滲透壓活性物質(zhì)(osmolyticallyactivesubstances)產(chǎn)生的滲透應(yīng)力更為敏感，通過在PBS(表3)或"Tyrode"溶液(表4)中噴霧干燥細(xì)胞獲得了更高的活力和更低的凈滲透應(yīng)力。將細(xì)胞和亮氨酸懸浮在PBS或Tyrode中并如上噴霧干燥，其中亮氨酸溶液/細(xì)胞溶液的體積/體積比為30/70、50/50和70/30。在后一種情況下，在噴霧干燥后回收了活NIH3T3胚胎小鼠成纖維細(xì)胞，并在噴霧干燥后1個(gè)月觀察到了活NIH3T3胚胎小鼠成纖維細(xì)胞，如圖15中所示。表3.磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)配方<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>表4.Tyrode哺乳動(dòng)物細(xì)胞外電解質(zhì)溶液配方<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>噴霧干燥后，從70/30、50/50和30/70制劑回收活的NIT3T3胚胎小鼠成纖維細(xì)胞和原代釆集的大鼠成纖維細(xì)胞并鋪板。圖16和17顯示噴霧干燥后第3天和第8天的鋪板細(xì)胞。這些圖顯示較高的賦形劑濃度(亮氨酸濃度)在干燥時(shí)產(chǎn)生較高的活細(xì)胞數(shù)。其它實(shí)施方案已經(jīng)描述了本發(fā)明的數(shù)個(gè)實(shí)施方案。但是，應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的同時(shí)，可以作出各種修改。因此，其它實(shí)施方案落入所附權(quán)利要求的范圍。權(quán)利要求1.一種干粉末，包含少于約10％的水、細(xì)胞物質(zhì)、和以干重計(jì)至少約25％的賦形劑。2.權(quán)利要求l的干粉末，其中所述粉末不包含顯著量的鹽或者冷凍保護(hù)劑。3.權(quán)利要求1的干粉末，其中所述細(xì)胞物質(zhì)包括細(xì)菌、病毒、真核微生物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、膜結(jié)合細(xì)胞器、脂質(zhì)體、基于膜的生物反應(yīng)器、或者基于膜的藥物投遞系統(tǒng)。4.權(quán)利要求3的干粉末，其中所述細(xì)胞物質(zhì)包括細(xì)菌。5.權(quán)利要求4的干粉末，其中超過1%的細(xì)菌是活的。6.權(quán)利要求4的干粉末，其中所述細(xì)菌是結(jié)核分枝桿菌或恥垢分枝桿菌纟田菌。7.權(quán)利要求4的干粉末，其中所述細(xì)菌是卡介苗(BCG)細(xì)菌。8.權(quán)利要求3的干粉末，其中所述細(xì)胞物質(zhì)包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞。9.權(quán)利要求8的干粉末，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括紅細(xì)胞、干細(xì)胞、粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、或血小板。10.權(quán)利要求l的干粉末，其中所述細(xì)胞物質(zhì)包括活細(xì)胞。11.權(quán)利要求l-10任一項(xiàng)的干粉末，其中所述賦形劑包括亮氨酸、甘露糖醇、海藻糖、右旋糖苷、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、清蛋白、甘油、乙醇、或它們的混合物。12.—種制備藥物組合物的方法，包括產(chǎn)生權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的干粉末，和將所述干粉末配制在藥物組合物中。13.權(quán)利要求ll的方法，其中所述藥物組合物配制為供吸入施用。14.一種產(chǎn)生包含細(xì)胞物質(zhì)的干粉末的方法，該方法包括提供水溶液，該水溶液包含至少1mg/ml的賦形劑和至少1()S單位/ml的細(xì)力包物質(zhì)；和在產(chǎn)生含水少于約10%重量的包含所述細(xì)胞物質(zhì)的千粉末的條件下，噴霧干燥所述溶液。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述細(xì)胞物質(zhì)包括細(xì)菌、病毒、真核微生物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、膜結(jié)合細(xì)胞器、脂質(zhì)體、基于膜的生物反應(yīng)器、或者基于膜的藥物投遞系統(tǒng)。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述細(xì)胞物質(zhì)包括細(xì)菌。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述細(xì)菌是結(jié)核分枝桿菌或恥垢分枝桿菌纟田菌。18.權(quán)利要求16的方法，其中所述細(xì)菌是卡介苗(BCG)細(xì)菌。19.權(quán)利要求14的方法，其中所述細(xì)胞物質(zhì)包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括紅細(xì)胞、干細(xì)胞、粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、或血小板。21.權(quán)利要求14-20任一項(xiàng)的方法，其中所述賦形劑包括亮氨酸、甘露糖醇、海藻糖、右旋糖苷、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、清蛋白、甘油、乙醇、或它們的混合物。22.權(quán)利要求14-21任一項(xiàng)的方法，還包括將所述干粉末配制在藥物組合物中。23.—種通過權(quán)利要求14-22任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的干粉末。24.—種噴霧干燥細(xì)胞物質(zhì)的方法，所述方法包括獲得待噴霧干燥之細(xì)胞物質(zhì)單位的半徑初始值(^(o));確定預(yù)測(cè)的干燥時(shí)間；選擇下列各項(xiàng)的值(i)噴霧干燥器的入口和出口氣體溫度差(A7);(ii)平均微滴大小(W);(iii)溶劑的氣化潛熱(義)；(iv)細(xì)胞物質(zhì)的膜對(duì)于冷凍保護(hù)劑的液壓滲透率(")；(v)細(xì)胞外溶質(zhì)的摩爾數(shù)(x)；(vi)細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的摩爾數(shù)(x'》；(vii)細(xì)胞外冷凍保護(hù)劑的摩爾數(shù)(x^);(viii)冷凍保護(hù)劑的初始細(xì)胞內(nèi)濃度(CV(0));和(ix)細(xì)胞數(shù)("^》；用這些值求出方程361、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(36)的值;并且若iT(o在預(yù)測(cè)的干燥時(shí)間內(nèi)維持在最小極限和最大極限之內(nèi)，貝'J使用所選值的條件噴霧干燥所述細(xì)胞物質(zhì)。25.權(quán)利要求24的方法，其中選擇所述值使得干燥過程中對(duì)細(xì)胞物質(zhì)的損傷最小化。26.權(quán)利要求24或25的方法，其中所述細(xì)胞物質(zhì)包括細(xì)菌、病毒、真核微生物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、膜結(jié)合細(xì)胞器、脂質(zhì)體、基于膜的生物反應(yīng)器、或者基于膜的藥物投遞系統(tǒng)。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述細(xì)胞物質(zhì)包括細(xì)菌。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述細(xì)菌是結(jié)核分枝桿菌或恥垢分枝桿菌細(xì)菌。29.權(quán)利要求27的方法，其中所述細(xì)菌是卡介苗(BCG)細(xì)菌。30.權(quán)利要求26的方法，其中所述細(xì)胞物質(zhì)包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括紅細(xì)胞、干細(xì)胞、粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、或血小板。32.權(quán)利要求24-31任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包括在即將噴霧干燥所述細(xì)胞物質(zhì)之前向細(xì)胞添加冷凍保護(hù)劑。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述冷凍保護(hù)劑添加到細(xì)胞之內(nèi)。34.權(quán)利要求32的方法，其中所述冷凍保護(hù)劑添加到細(xì)胞之外。35.通過權(quán)利要求25-34任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的干粉末。36.權(quán)利要求25-34任一項(xiàng)的方法，還包括將經(jīng)噴霧干燥的細(xì)胞物質(zhì)配制在藥物組合物中。37.—種產(chǎn)生含水少于約10%重量的包含分枝桿菌屬細(xì)菌的干粉末的方法，所述方法包括提供水溶液，該水溶液包含至少lmg/ml的賦形劑和至少105菌落形成單位/ml的分枝桿菌屬細(xì)菌；和在產(chǎn)生含水少于約10%重量的包含分枝桿菌屬細(xì)菌的干粉末的條件下，噴霧干燥所述溶液。38.權(quán)利要求36的方法，其中所述水溶液不含添加的鹽或冷凍保護(hù)劑。39.通過權(quán)利要求36的方法產(chǎn)生的干粉末。40.權(quán)利要求37或38的方法，還包括將所述干粉末配制在藥物組合物中。全文摘要本發(fā)明提供了噴霧干燥細(xì)胞物質(zhì)的方法和組合物，所述方法和組合物為細(xì)胞物質(zhì)的保存提供可能。在一個(gè)方面中，將細(xì)胞物質(zhì)與一定量的賦形劑一起噴霧干燥。在另一個(gè)方面中，使用冷凍保護(hù)劑將細(xì)胞物質(zhì)噴霧干燥。文檔編號(hào)A61K35/74GK101283085SQ200680037757公開日2008年10月8日申請(qǐng)日期2006年8月11日優(yōu)先權(quán)日2005年8月11日發(fā)明者凱文·K·帕克,布賴恩·普利亞姆,戴維·愛德華茲,肖恩·希伊,黃韻鈴申請(qǐng)人:哈佛大學(xué)的校長及成員們