專利名稱：：組織保護(hù)性肽及其用途的制作方法組織保護(hù)性肽及其用途1.引言本發(fā)明涉及新的組織保護(hù)性肽。本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可以與組織保護(hù)性受體復(fù)合物結(jié)合。特別地，本發(fā)明涉及來源于細(xì)胞因子受體配體(包括促紅不參與配體與受體復(fù)合物的結(jié)合，例如與EPO受體同二聚體的結(jié)合。相應(yīng)地，本發(fā)明的組織保護(hù)性肽來源于細(xì)胞因子受體配體的區(qū)域的氨基酸序列，這些序列通常位于與受體復(fù)合物相對的配體蛋白質(zhì)區(qū)域之上或之內(nèi)，即，通常來源于當(dāng)配體與受體結(jié)合時背向受體復(fù)合物的配體蛋白質(zhì)區(qū)域的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于工程構(gòu)建合成性組織保護(hù)性肽的共有序列。這些組織保護(hù)性肽也包括設(shè)計為模擬組織保護(hù)性受體配體(例如EPO)內(nèi)關(guān)鍵氨基酸殘基的空間位置的片段、嵌合體以及肽。本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的組織保護(hù)性肽治療、預(yù)防或改善疾病或障礙和/或治療、恢復(fù)或改善組織損傷的方法。本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的組織保護(hù)性肽增強(qiáng)可興奮組織功能的方法。2.
背景技術(shù)：
：促紅細(xì)胞生成素("EPO")是一種糖蛋白激素，通常與紅細(xì)胞壓積的保持有關(guān)，最近發(fā)現(xiàn)，與組織保護(hù)有關(guān)。成熟的人EPO蛋白包含165個氨基酸，分子量為34kDa，糖基殘基占分子重量的大約40%。EPO分子包含四個螺旋，這些螺旋在水環(huán)境中通過它們的疏水域相互作用，形成主要為球形的結(jié)構(gòu)(Cheetham等人，1998，NatStruct.Biol.5:861-866，在此全文引用作為參考)。本發(fā)明源自一發(fā)現(xiàn)，即某些朝向水環(huán)境(即背向疏水性、球形中心核心)的氨基酸介導(dǎo)組織保護(hù)?？梢愿鶕?jù)對申請人已經(jīng)筌定的組織保護(hù)性區(qū)域的理解來衍生或者設(shè)計肽。如上所述，EPO是多能性的。在其激素作用中，EPO通過其在紅系祖細(xì)胞成熟為紅細(xì)胞中的作用來調(diào)節(jié)紅細(xì)胞壓積。EPO在紅系祖細(xì)胞的成熟過程中起抗細(xì)胞凋亡劑的作用，使祖細(xì)胞成熟為紅細(xì)胞。組織氧水平的降低(缺氧)引發(fā)腎臟產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素增加，這導(dǎo)致紅細(xì)胞生成增多。由于腎臟正常地產(chǎn)生大多數(shù)血清促紅細(xì)胞生成素，則腎功能的損失例如慢性腎衰竭導(dǎo)致EPO產(chǎn)生減少并且通常導(dǎo)致貧血。類似地，貧血也可以起因于其它慢性疾病，例如癌癥，或與這些疾病有關(guān)的治療，如直4妻抑制EPO產(chǎn)生的化學(xué)治療。商業(yè)上可以獲得的重組促紅細(xì)胞生成素已經(jīng)可從OrthoBiotech公司(Raritan,NJ)商標(biāo)為PROCRIT和Amgen公司(ThousandOaks,CA)商標(biāo)為EPOGEN的產(chǎn)品獲得，并且已經(jīng)用于治療因晚期腎病、應(yīng)用AZT(齊多夫定)對fflV感染患者、腫瘤患者的治療、以及化學(xué)治療引起的貧血。當(dāng)前，高糖基化的促紅細(xì)胞生成素，ARANESP(Amgen,ThousandOaks,CA)，可用于貧血的治療。另外,這些化合物已經(jīng)用于提高經(jīng)歷手術(shù)的患者的紅細(xì)胞壓積，以減少對異體輸血的需要。最近，有幾條證據(jù)暗示EPO也以旁分泌-自分泌的方式在局部起作用，以使組織損傷最小化。例如，EPO改善了含氧量低的細(xì)胞微環(huán)境，并且減少了由代謝性應(yīng)激引起的程序性細(xì)胞死亡。這兩種活性部分地通過EPO與特異性細(xì)胞表面受體的相互作用來調(diào)節(jié)，該受體部分地由促紅細(xì)胞生成素受體("EPOR")蛋白質(zhì)組成。EPOR是一種大約66kDa的蛋白質(zhì)，是l型細(xì)胞因子受體家族的成員。該家族包括基于胞外域共有的同源性而歸類在一起的受體，包括白介素IL-2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL9、ILll、粒細(xì)胞巨嗛細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落剌激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、血小板生成素、生長激素和促乳素的受體。這些受體的保守的胞外域具有大約200個氨基酸的長度，在氨基末端區(qū)域包含4個在位置上保守的半胱氨酸殘基(Cys294、Cys283、Cys248和Cys238，它們似乎對于受體的保持和結(jié)構(gòu)完整性是關(guān)鍵性的(Murray,1996,HarpersBiochemistry第24版，第524-526頁，Appilion&Lange公司；Caravella等人，1996,Protein:Struct.Funct.Gen.24:394-401,均在此全文引用作為參考)和4婁近跨膜域的Trp-Ser-X-Trp-Ser(SEQIDNO:58)基序。在紅細(xì)胞生成方面，EPOR以類似于1型細(xì)胞因子受體家族內(nèi)的其它受體的方式起作用。首先，受體配體，例如EPO，與預(yù)先形成的EPOR二聚體(EPOR)2結(jié)合。已經(jīng)確定EPO通過配體表面上兩個不同的區(qū)域與經(jīng)典的(EPOR)2同二聚體受體的胞外域相互作用高親和力受體結(jié)合位點(diǎn)(位點(diǎn)l)和低親和力受體結(jié)合位點(diǎn)(位點(diǎn)2)。與位點(diǎn)1相關(guān)的EPO的氨基酸序列是TKVNFY，SEQIDNO:2，對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸44-49,和SNFLRG，SEQIDNO:3，對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸146-151;與位點(diǎn)2相關(guān)的序列是VLERY，SEQIDNO:4，對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸ll-15，和SGLRS，SEQIDNO:5，對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸100-104(Cheetham等人，1998,NatureStructuralBiology5:861-866，在此全文引入作為參考)。EPOR同二聚體的活化導(dǎo)致與EPOR相關(guān)的信號蛋白例如Jak2酪氨酸激酶的酪氨酸磷酸化，該信號蛋白隨后又可活化幾個不同的通路，包括，例如，磷脂酰肌醇(PI)3-激酶通路、Ras/MAP激酶通路和/或STAT通路。這些通路觸發(fā)由促紅細(xì)胞生成素介導(dǎo)的紅細(xì)胞生成所必需的抗細(xì)胞凋亡功能(Kirito等人，2002,Blood99:102-110;Livnah等人，1999,Science283:987-990;Naranda等人，2002,Endocrinology143:2293-2302;Remy等人,1999,Science283:990-993;以及Yoshimura等人，1996,TheOncologist1:337-339，均在此全文引入作為參考)。最近，申請人發(fā)現(xiàn)EPO的組織保護(hù)性質(zhì)由一種受體介導(dǎo)，該受體不僅包含EPOR,而且包含另外一種受體蛋白質(zhì)，(3共同受體("pc")。EPOR/(3c受體與同二聚體(EPOR)2不同，是一種雜合物(heterocomplex)(見下文)，并且已知在可興奮組織的保護(hù)中起作用。參見，例如，2001年12月28日提交的WO2004/096148和PCT號PCT7US01/49479,2000年12月29日提交的美國專利申請?zhí)?9/753，132，以及2002年7月3日提交的美國專利申請?zhí)?0/188,905，均在此全文引用作為參考。盡管申請人已經(jīng)明確(3c受體是這些可興奮組織中組織保護(hù)通路的核心，但是該受體的活化配體的結(jié)構(gòu)還不清楚。3.發(fā)明概迷本發(fā)明涉及在應(yīng)答性細(xì)胞、組織或器官中具有至少一種細(xì)胞保護(hù)活性的分離的多肽，該多肽含有包含以下共有序列的氨基酸基序(a)H廣N廣(X)n-N2-H2，其中n為0、1、2、3、4或5;(b)H廣N廣(X)n-N2國:U,其中n為0、1、2、3、4或5;(c)L廣N廣(X)n-N2-H,，其中n為0、1、2、3、4或5;(d)H廣NH:LVP廣H2，其中n為0或l;或(e)H廣P廣(L)n隱N廣H2，其中n為0或l，并且其中Hi和H2為疏水性氨基酸，N!和N2為帶負(fù)電荷的氨基酸，X為任意氨基酸，Li為極性氨基酸，Pi為帶正電荷的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽還缺乏紅細(xì)胞生成活性，例如，不增加接受者的血紅蛋白或紅細(xì)胞壓積。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多肽由不超過10個、不超過15個、不超過20個或不超過30個氨基酸組成。在其它實(shí)施方案中，分離的肽與SEQIDNO:l所示的成熟人促紅細(xì)胞生成素("EPO")的氨基酸序列的任意部分具有低于90%、低于85%、低于80%、低于75%、低于70%、低于65%、低于60%、低于55%、低于50%、低于45%、低于40%、低于35%、低于30%、或低于20%的序列同一性，其中EPO的所述部分含有與所述肽相同數(shù)目的氨基酸殘基。在上述本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，其中分離的多肽包含結(jié)構(gòu)基序(a)H廣NKX)n隱N2誦H2，其中n為0、1、2、3、4或5(分別表示為序列號6-11，如下文所述)；(b)H廣N廣(L)n-P廣H2，其中n為0或l(分別表示為序列號24-25，如下文所述)；或(e)H廣P廣(L)n-N廣H2，其中n為0或l(分別表示為序列號26-27，如下文所述)，H!和H2可以是相同的疏水性氨基酸。在上文所述的本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，其中分離的多肽包含結(jié)構(gòu)基序(a)H廣N廣(XVN2-H2，其中n為0、1、2、3、4或5;(d)H廣N廣(L)n-P廣H2，其中n為0或l;或(e)H廣P廣(L)n畫N廣H2，其中n為0或1，H!和H2可以是不同的疏水性氨基酸。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的多肽，其包含氨基酸基序(a)H廣N廣(X)n-N2-H2，其中n為0、1、2、3、4或5;(b)H廣N廣(X)n-N2畫L！,其中n為0、1、2、3、4或5;(c)L廣N廣(X)n-N2-Ht，其中n為0、1、2、3、4或5，其中N^口N2可以相同也可以是不同的帶負(fù)電荷的氨基酸。本發(fā)明提供了包含上述氨基酸基序的分離的多肽，其中所述基序由所述多肽的氨基酸序列內(nèi)的連續(xù)氨基酸形成。在根據(jù)該實(shí)施方案的特定實(shí)施例中，本發(fā)明提供了分離的多肽，其包含氨基酸基序H廣N廣N2-H2(SEQIDNO:6)、H廣N廣X隱:N2-H2(SEQIDNO:7)、H廣N廣X-X-N2畫H2(SEQIDNO:8)、H廣N廣:X-:X-X-N2-H2(SEQIDNO:9)、H廣N廣X-X-X-X-N2-H2(SEQIDNO:10)、H廣N廣X-X國X-X-X-N2誦H2(SEQIDNO:ll)、H廣N廣N2誦Li(SEQIDNO:12)、H廣N廣X-N2-Li(SEQIDNO:13)、H廣N廣X匿X-N2-L,(SEQIDNO:14)、H廣N廣X-X-X陽N2曙I^(SEQIDNO:15)、H廣N廣X-X-X隱X-N2-"(SEQIDNO:16)、H廣N廣X-X-X-X-X-N2隱L,(SEQIDNO:17)、L廣N廣N2-H2(SEQIDNO:18)、L廣N廣X-N2-H2(SEQIDNO:19)、1^-N廣:K-X畫N2-H2(SEQIDNO:20)、L廣N廣X-X-X-N2-H2(SEQIDNO:21)、L廣NrX-X-X畫X-N2-H2(SEQIDNO:22)、L廣N廣x畫x畫:x:畫:x:-x-N2-H2(seqidno:2:3;)、h廣n廣p廣H2(seqidno:m)、H廣N廣L廣P廣H2(SEQIDNO:25)、H廣P廣N廣H2(SEQIDNO:26)或H廣P廣L廣N廣H2(SEQIDNO:27),其中Hi和H2為疏水性氨基酸，Ni和N2為帶負(fù)電荷的氨基酸，x為任意氨基酸，；u為極性氨基酸，P!為帶正電荷的氨基酸。在符合該實(shí)施方案的某些方面，其中分離的多肽包含具有氨基酸殘基Hi和H2的基序，Hd。H2可以相同也可以是不同的疏水性氨基酸。在符合該實(shí)施方案的其它方面，其中分離的多肽包含具有氨基酸殘基N!和N2的基序，N！和N2可以相同也可以是不同的帶負(fù)電荷的氨基酸。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的多肽，其中氨基酸基序是由于多肽三級結(jié)構(gòu)內(nèi)氨基酸的空間組織而形成的，即，形成基序的氨基酸是在多肽的三維結(jié)構(gòu)即三級結(jié)構(gòu)中空間上彼此相鄰的，但是可能被多肽鏈的一級氨基酸序列內(nèi)的一個或多個氨基酸隔開。在根據(jù)本實(shí)施方案的特定實(shí)施例中，包含與上述SEQIDNO:6類似的氨基酸殘基H!、N!、&和112的氨基酸基序可能由于肽通過蛋白質(zhì)折疊產(chǎn)生的三級結(jié)構(gòu)而形成，包含例如SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:lO或SEQIDNO:ll，其中Ni和N2之間的氨基酸殘基例如(X)n折疊，使得Ni和N2成為線性相鄰的。相應(yīng)地，本發(fā)明包括分離的肽，其包含氨基酸基序H!N!N2H2;H^W2L"I^Nil^Hi;H!N"Ly^H2，其中n為0或l;或H!P《L)nN!H2，其中n為0或l，該基序是由于所述多肽的三級結(jié)構(gòu)而形成的。在相關(guān)實(shí)施方案中，其中氨基酸基序包含N!和N2，形成三級結(jié)構(gòu)使得N!和N2的羰基碳之間的距離為大約3A至大約5A，優(yōu)選大約4A至大約5A，更優(yōu)選大約4.4A至大約4.8A。在其它實(shí)施方案中，其中氨基酸基序包含N!和N2，形成三級結(jié)構(gòu)使得N!和N2之間的距離在空間上被限制，使得兩者的電荷分離距離，例如帶電荷的側(cè)鏈，介于大約6.5A至大約9A之間。在相關(guān)實(shí)施方案中，Ni和N2由于^f立于形成a螺旋的全部或一部分的氨基酸序列中，因此在空間上被限制，并且可以被形成所述螺旋的所述氨基酸的序列中的l個、2個或2個以上的氨基酸所隔開。在其它相關(guān)實(shí)施方案中，其中氨基酸基序包含N!和P!，形成三級結(jié)構(gòu)使得Ni和P!的羰基石岌之間的距離為大約3A至大約5A，優(yōu)選大約4A至大約5A，更優(yōu)選大約4.4A至大約4.8A。在其它實(shí)施方案中，其中氨基酸基序包含N!和P!，形成三級結(jié)構(gòu)使得Ni和Pi之間的距離在空間上被限制，使得兩者的電荷分離距離，例如帶電荷的側(cè)鏈，介于大約6.5A至大約9A之間。在相關(guān)實(shí)施方案中，N!和P!由于位于形成(x螺旋的全部或一部分的氨基酸序列中，因此在空間上被限制，并且可以被形成所述螺旋的所述氨基酸的序列中的l個、2個或2個以上的氨基酸所隔開。在某些實(shí)施方案中，在所述多肽三級結(jié)構(gòu)內(nèi)形成基序的氨基酸被所述多肽線性氨基酸序列中數(shù)目相等的間插氨基酸殘基彼此隔開。在其它實(shí)施方案中，在所述多肽三級結(jié)構(gòu)內(nèi)形成基序的氨基酸被所述多肽線性氨基酸序列中數(shù)目不等的間插氨基酸殘基彼此隔開。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離多肽形成規(guī)則的三級結(jié)構(gòu)，例如ot-螺旋或P-折疊片，使得所述結(jié)構(gòu)的表面呈現(xiàn)包含所述基序的氨基酸，因而將基序本身，呈現(xiàn)給蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和水環(huán)境的界面，即在折疊多肽的表面上呈現(xiàn)基序。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽在水環(huán)境中在生理條件下形成三級結(jié)構(gòu)，例如，PBS(13mMNaH2P04,137mMNaCl,pH7.4)，370C。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本文上述氨基酸基序的分離的多肽，例如肽A(APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE,SEQIDNO:32)、肽C(NITVPDTKVNFYAWKRMEVG,SEQIDNO:29)、肽D(QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV,SEQIDNO:30)、肽E(GCAEHCSLNENITVPDTKVN,SEQIDNO:31)、狀F(RYLLUNITTGC,SEQIDNO:33)、肽G(QEQLERALNSS,SEQIDNO:40)、肽I(CSLNENIQEQLERALNSS，SEQIDNO:43)、肽J(QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR,SEQIDNO:41)、肽K(WEHVNAIQEARRLL，SEQIDNO:35)或肽L(KIRSDLTALTESYVKH,SEQIDNO:37)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明4是供了包含1個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、或6個以上本文所述氨基酸基序的分離的多肽。在根據(jù)該實(shí)施方案的本發(fā)明的具體方面，其中分離的多肽包含至少兩個本文以上所述的氨基酸基序，所述至少兩個基序可以是相同的基序，也可以是不同的基序。在某些方面，本發(fā)明提供了缺乏紅細(xì)胞生成活性，例如提高接受者中的血紅蛋白的分離的多肽。優(yōu)選地，該分離的多肽缺乏其它活性，包括但不限于血管活性作用(例如血管收縮)、過度活化血小板、促凝活性和刺激凝血細(xì)胞和/或紅細(xì)胞生成依賴性細(xì)胞的增殖和/或產(chǎn)生(參見Coleman等人，2006，PNAS103:5965-5970，在此全文引入作為參考)。在其它方面，本發(fā)明提供了包含至少一種細(xì)胞保護(hù)活性的分離的多肽。這種細(xì)胞保護(hù)活性包括但不限于保護(hù)、維持、增強(qiáng)或恢復(fù)應(yīng)答性哺乳動物細(xì)胞、組織或器官的功能或活力。相應(yīng)地，在一個方面，本發(fā)明涉及本文所述的分離的多肽在制備用于保護(hù)、維持、增強(qiáng)或恢復(fù)應(yīng)答性哺乳動物細(xì)胞和它們相關(guān)的細(xì)胞、組織或器官的功能或活力的藥物組合物中的應(yīng)用。在相關(guān)的實(shí)施方案中，所述組合物用于給需要的受試者施用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述受試者是哺乳動物，優(yōu)選人類。在其它方面，本發(fā)明涉及本文所述的分離的多肽在制備用于在需要的受試者中保護(hù)防止和/或預(yù)防應(yīng)答性組織損傷、用于恢復(fù)或復(fù)原應(yīng)答性組織和/或應(yīng)答性組織功能的藥物組合物中的應(yīng)用。在一個特定方面，由于緊密的內(nèi)皮細(xì)胞屏障，應(yīng)答性哺乳動物細(xì)胞和它們的相關(guān)細(xì)胞、組織或器官位于脈管系統(tǒng)的遠(yuǎn)側(cè)。在另一特定方面，從哺乳動物體內(nèi)分離細(xì)胞、組織、器官或其它機(jī)體部分，例如用于移植。作為非限定性實(shí)例，應(yīng)答性細(xì)胞或組織可以是神經(jīng)元、目艮(例如視網(wǎng)膜)、脂肪、結(jié)締、毛發(fā)、牙、軲膜、胰、內(nèi)分泌、耳、上皮、皮膚、肌肉、心臟、肺、肝、腎、腸、腎上腺(例如腎上腺皮質(zhì)、腎上腺髓質(zhì))、毛細(xì)血管、內(nèi)皮、睪丸、卯巢、骨、皮膚或子宮內(nèi)膜細(xì)胞或組織。進(jìn)一步地，應(yīng)答性細(xì)胞的非限定性實(shí)例包括光感受器(視桿和視錐)、神經(jīng)節(jié)、兩極細(xì)胞、水平細(xì)胞、無長突細(xì)胞、米勒細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞、心肌細(xì)胞、心律調(diào)整細(xì)胞(pacemaker)、竇房結(jié)(sinoatrialnode)、竇房結(jié)(sinusnode)、結(jié)合組織、房室結(jié)、希氏束、肝細(xì)胞、星形細(xì)胞、枯否細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、小管間質(zhì)細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腸腺細(xì)胞(濾泡細(xì)胞)、腸內(nèi)分泌、球狀帶、束狀細(xì)胞(fasciculate)、網(wǎng)狀細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、周細(xì)胞、萊迪希細(xì)胞、塞爾托利細(xì)胞、精子、格拉夫泡嚢狀卵泡(Graffianfollicle)、原始卵泡、胰島、a-細(xì)胞、P-細(xì)胞、y-細(xì)胞、F-細(xì)胞、骨原細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、子宮內(nèi)膜基質(zhì)、子宮內(nèi)膜、干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。應(yīng)答性細(xì)胞的這些實(shí)例只是說明性的。在一個方面，應(yīng)答性細(xì)胞或其相關(guān)細(xì)胞、組織或器官是可興奮細(xì)胞、組織或器官，或主要包括可興奮細(xì)胞或組織。在本發(fā)明的某些方面，可興奮組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織、周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織、心臟組織或^f見網(wǎng)膜組織。在另一方面，應(yīng)答性細(xì)胞或其相關(guān)細(xì)胞、組織或器官不是可興奮細(xì)胞、組織或器官，它們也不主要包括可興奮細(xì)胞或組織。本發(fā)明的分離的多肽在應(yīng)答性細(xì)胞中的紅細(xì)胞生成和/或細(xì)胞保護(hù)活性可以通過本文描述的或本領(lǐng)域公知的任何方法來評價和/或確定。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成和/或細(xì)胞保護(hù)活性通過體外試—瞼確定。在其它實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成和/或細(xì)胞保護(hù)活性通過體內(nèi)試驗確定。在其中細(xì)胞保護(hù)活性為神經(jīng)保護(hù)的相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在體外評價所述活性的方法，包括(a)將原代海馬神經(jīng)元的待測培養(yǎng)物與N-甲基-D-天冬氨酸和所述肽接觸；和(b)在所述接觸48小時后測定細(xì)胞活力，由此如果在步驟(b)中測定的細(xì)胞活力大于不含所述肽的對照培養(yǎng)物的細(xì)胞活力，則該肽具有細(xì)胞保護(hù)活性。在特定實(shí)施方案中，對其使用上述分離的肽的哺乳動物細(xì)胞、組織或器官是已經(jīng)或?qū)⒁谥辽僖环N不利于細(xì)胞、組織或器官活力的狀況下消耗一段時間的細(xì)胞、組織或器官。才艮據(jù)該實(shí)施方案，本發(fā)明的分離的肽才是供了對抗這種狀況引起的組織損傷的保護(hù)和/或預(yù)防，在這種狀況發(fā)生之前、之中或之后在需要的受試者中提供組織和/或組織功能的恢復(fù)，或提供它們的復(fù)原。這種狀況包括創(chuàng)傷性的原位缺氧或代謝功能障礙、手術(shù)誘導(dǎo)的原位缺氧或代謝功能障礙，或原位毒素暴露，后者可能與化學(xué)治療或放射治療有關(guān)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的肽提供對抗疾病或障礙引起的組織損傷的保護(hù)和/或預(yù)防，在這種狀況發(fā)生之前、之中或之后在需要的受試者中提供組織和/或組織功能的恢復(fù)，或提供它們的復(fù)原。在相關(guān)的實(shí)施方案中，所迷損傷是由癲癇發(fā)作、多發(fā)性硬化、中風(fēng)、高血壓、心臟停搏、局部缺血、心肌梗塞、炎癥、與年齡相關(guān)的認(rèn)知功能損失、輻射損傷、大腦性癱瘓、神經(jīng)退行性疾病、阿爾茨海默病、帕金森病、線粒體病、AIDS癡呆、記憶喪失、肌萎縮側(cè)索硬化、酒精中毒、情感障礙、焦慮癥、注意力缺乏癥、自閉癥、庫杰二氏(Creutzfeld-Jakob)病、腦或脊髓創(chuàng)傷或缺血、心肺分流術(shù)、慢性心力衰竭、黃斑變性、糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病^L網(wǎng)膜病、肝炎、胰腺炎、青光眼、3見網(wǎng)膜缺血、；現(xiàn)網(wǎng)膜創(chuàng)傷、心血管疾病、心肺疾病、呼吸疾病、腎病、泌尿系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病、骨病、皮月夫病、結(jié)締組織病、胃腸疾病、內(nèi)分泌異常、代謝異常、或中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或障礙。在其它實(shí)施方案中，不利狀況是心肺分流術(shù)(心肺機(jī))的結(jié)果，如在某些手術(shù)操作中采用的。在其它實(shí)施方案中，所述損傷是認(rèn)知功能障礙。在一個特定實(shí)施方案中，對其使用上述分離的肽的哺乳動物細(xì)胞、組織或器官表達(dá)Pc受體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及包含上述分離的多肽的藥物組合物，其用于給需要的受試者施用。在根據(jù)該實(shí)施方案的特定方面，本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可以配制為用于口服、鼻內(nèi)、經(jīng)眼、吸入、經(jīng)皮、直腸、舌下、陰道或腸胃外施用，或者配制為用于保持離體的細(xì)胞、組織或器官活力的灌注液的形式。在本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方案中，受試者是哺乳動物，優(yōu)選人類。在其它方面，本發(fā)明提供了在有此需要的受試者中促進(jìn)分子穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障進(jìn)行轉(zhuǎn)胞吞的方法，包括給所述受試者施用包含與本發(fā)明的分離的肽結(jié)合的所述分子的組合物。在有關(guān)實(shí)施方案中，這種結(jié)合是與所述分子的結(jié)合部位的不穩(wěn)定的共價鍵、穩(wěn)定共價鍵或者非共價結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，如上所述，本發(fā)明的分離的肽能夠穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障。在相關(guān)實(shí)施方案中，該內(nèi)皮細(xì)胞屏障包括血-腦屏障、血-目艮屏障、血-睪丸屏障、血-卵巢屏障、血-胎盤、血-心臟、血-腎、血-神經(jīng)、或血-脊髓屏障。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了分離的核酸分子，該核酸分子包括編碼一種多肽的核苷酸序列，該多肽包括如上所述的分離的多肽。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，^是爿f共了分離的核酸分子，該核酸分子包含核苷酸序列(即cDNA、被內(nèi)含子隔斷或未被內(nèi)含子隔斷的核普酸序列)，該核苷酸序列編碼包含如上所述的本發(fā)明的分離的多肽或由該多肽組成的多肽。在一個實(shí)施方案中，使用有利于在特定宿主細(xì)胞中最佳表達(dá)的偏好密碼子合成編碼本發(fā)明的分離的多肽的核苷酸序列。這些偏好密碼子對于在植物、細(xì)菌、酵母、哺乳動物、真菌或昆蟲物種的細(xì)胞中的表達(dá)是最優(yōu)的。本發(fā)明還提供包含該核酸分子的載體。本發(fā)明還提供了包含核酸分子和至少一種與該核苷酸分子可操作連接的調(diào)節(jié)區(qū)的表達(dá)載體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含該表達(dá)載體的細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，提供了包含該核酸分子的遺傳工程改造的細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了重組制備如上所述的本發(fā)明的分離的肽的方法，包括在適合所述肽表達(dá)的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有核酸分子的宿主細(xì)胞，該核酸分子包含編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列，以及從所述培養(yǎng)基中回收和/或分離表達(dá)的多肽。3.1術(shù)語當(dāng)與數(shù)字連用時，本文使用的術(shù)語"大約"或"近似"是指在所述數(shù)字的1%、5%或10%以內(nèi)的任意數(shù)字。在本發(fā)明的方法的上下文中，術(shù)語"與......結(jié)合施用"是指在疾病、障礙或病癥發(fā)作之前、同時和/或之后施用化合物。術(shù)語"氨基酸"或提到具體氨基酸意在包括天然存在的蛋白原性(proteogenic)氨基酸以及非天然存在的氨基酸如氨基酸類似物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，除非另外明確指出，該定義包括天然存在的蛋白原性(L)-氨基酸，它們的光學(xué)(D)-異構(gòu)體，化學(xué)修飾的氨基酸，包括氨基酸類似物，如青霉胺(3-巰基-D-纈氨酸)，天然存在的非蛋白原性(non-proteogenic)氨基酸，如正亮氨酸，和具有本領(lǐng)域已知的氨基酸的特有性質(zhì)的化學(xué)合成的蛋白質(zhì)。本文使用的氨基酸由如下三字母縮寫或單字母符號表示丙氨酸二Ala或A，精氨酸二Arg或R，天冬酰胺二Asn或N,天冬氨酸Asp或D，半胱氨酸-Cys或C，谷氨酸-Glu或E，谷氨酰胺-Gln或Q，甘氨酸Gly或G，組氨酸His或H，異亮氨酸-Ile或I，亮氨酸-Leu或L，賴氨酸^Lys或K，甲疏氨酸二Met或M,苯丙氨酸二Phe或F，脯氨酸-Pro或P,絲氨酸-Ser或S，蘇氨酸-Thr或T，色氨酸Trp或W，酪氨酸二Tyr或Y，以及纈氨酸二Val或V。另外，術(shù)i吾"氨基酸等同物"是指這樣的化合物它們與天然存在的氨基酸的結(jié)構(gòu)不同，但是基本上具有氨基酸的結(jié)構(gòu)，使得它們可以在肽內(nèi)發(fā)生取代，該肽盡管存在取代仍然保留其生物活性。因此，例如，氨基酸等同物可以包括具有側(cè)鏈修飾或取代的氨基酸，也包括相關(guān)的有機(jī)酸、酰胺等。術(shù)語"氨基酸"意在包括氨基酸等同物。術(shù)語"殘基"既指氨基酸也指氨基酸等同物。如本領(lǐng)域所公知，氨基酸也可以分為以下類別(1)疏水性氨基酸His、Trp、Tyr、Phe、Met、Leu、Ile、Val、Ala;(2)中性親水性氨基酸Cys、Ser、Thr;(3)極性氨基酸Ser、Thr、Asn、Gln;(4)酸性/帶負(fù)電荷的氨基酸Asp、Glu;(5)帶電荷的氨基酸Asp、Glu、Arg、Lys、His;(6)帶正電荷的氨基酸Arg、Lys、His;和(7)堿性氨基酸His、Lys、Arg。本文使用的"可興奮組織"指含有可興奮細(xì)胞的組織。可興奮細(xì)胞是對電刺激積極響應(yīng)并且具有跨細(xì)胞膜的電荷差的細(xì)胞。可興奮細(xì)胞通常能夠產(chǎn)生動作電位。這些細(xì)胞一般表達(dá)通道，如電壓門控通道、配體門控通道，以及牽張通道(stretchchannels),這些通道允許跨膜的離子流(鉀、鈉、釣、氯等)?？膳d奮組織包括神經(jīng)元組織、肌肉組織和腺組織?？膳d奮組織包括但不限于神經(jīng)元組織，如周圍神經(jīng)系統(tǒng)(耳和視網(wǎng)膜)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦和脊髓)的組織；心血管組織，如心臟和相關(guān)神經(jīng)的細(xì)胞；以及"泉組織，如胰腺，其中T型釣通道和細(xì)胞-細(xì)胞間隙連接一同參與胰島素的分泌?？膳d奮組織的示范性列表包括器官和組織，包括神經(jīng)、骨骼肌、平滑肌、心肌、子宮、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脊髓、腦、；現(xiàn)網(wǎng)膜、嗅覺系統(tǒng)、聽覺系統(tǒng)等。本文使用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"是指用核酸分子轉(zhuǎn)染的特定受試細(xì)胞和該細(xì)胞的后代或可能的后代。由于在傳代或核酸分子向宿主細(xì)胞基因組中整合時可能發(fā)生的突變或環(huán)境影響，這樣的細(xì)胞的后代可能與核酸分子轉(zhuǎn)染的親代細(xì)胞不同。"分離的"或"純化的"多肽基本上不含來自從中獲得該蛋白質(zhì)或多肽的細(xì)胞或組織來源的細(xì)胞物質(zhì)或其它污染蛋白質(zhì)，或者基本上不含化學(xué)合成時的化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。語句"基本上不含細(xì)胞物質(zhì)"包括多肽制品，其中多肽與從中分離或重組產(chǎn)生該多肽的細(xì)胞的細(xì)胞組分相分離。因此，基本上不含細(xì)胞物質(zhì)的多肽包括含有低于約30%、20%、10%或5%(干重)異源蛋白質(zhì)(在此也被稱為"污染蛋白質(zhì)")的多肽制品。當(dāng)重組制備多肽時，該多肽優(yōu)選地也基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基占蛋白質(zhì)制品體積的不到約20%、10%或5%。當(dāng)通過化學(xué)合成制備多肽時，該多肽優(yōu)選地基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)，即，與參與蛋白質(zhì)合成的化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)相分離。相應(yīng)地，這些多肽制品具有低于約30%、20%、10%、5%(干重)的感興趣的抗體以外的化學(xué)前體或化合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是分離的或純化的。"分離的"核酸分子是從該核酸分子的天然來源中存在的其它核酸分子中分離出的核酸分子。而且，"分離的"核酸分子，如cDNA分子，可基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)，或培養(yǎng)基(當(dāng)通過重組技術(shù)制備時)，或者基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)(當(dāng)化學(xué)合成時)。在特定實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明多肽的核酸分子是分離的或純化的。本文在提到多肽內(nèi)的結(jié)構(gòu)時，術(shù)語"基序"是指多肽鏈氨基酸序列內(nèi)的一組連續(xù)的氨基酸和/或所述多肽的三級結(jié)構(gòu)內(nèi)的一組線性相鄰氨基酸。因為基序可以全部地或部分地由于蛋白質(zhì)折疊而形成，所述基序中相鄰的氨基酸可以在多肽的線性氨基酸序列內(nèi)間隔O、l個或更多、5個或更多、IO個或更多、15個或更多、或20個或更多的氨基酸。本文使用的術(shù)語"肽"、"多肽"和"蛋白質(zhì)"可以互換并且最廣義地使用，用于指受約束的(即，具有一些結(jié)構(gòu)元件，例如存在起始形成P轉(zhuǎn)角或P折疊片的氨基酸，或者例如由于存在二疏鍵連接的Cys殘基而環(huán)化)或未受約束的(例如線性的)氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽由少于30個氨基酸組成。然而，在閱讀本發(fā)明的公開內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到用來區(qū)分本發(fā)明的肽的不是特定肽的長度而是其結(jié)合組織保護(hù)性受體復(fù)合物和/或與本文所述肽竟?fàn)幗Y(jié)合的能力。術(shù)i吾"肽"、"多肽"和"蛋白質(zhì)"也指含有氨基酸等同物或其它非氨基酸基團(tuán)而仍然保持肽的所需功能活性的化合物。肽等同物與常規(guī)肽的區(qū)別可能在于一個或多個氨基酸被相關(guān)的有機(jī)酸(如PABA)、氨基酸等替代，或者側(cè)鏈或官能團(tuán)的取代或修飾。術(shù)語"預(yù)防疾病、障礙或病癥"意思是延遲這種疾病、障礙或病癥的發(fā)作、阻止其進(jìn)展、阻止其發(fā)生、防止、抑制或消除其發(fā)生或減少其發(fā)病率。術(shù)語"預(yù)防"的使用并非暗示接受預(yù)防性治療的患者群體中的所有患者都永遠(yuǎn)不發(fā)生所預(yù)防的疾病、障礙或病癥，而是該患者群體表現(xiàn)為該疾病、障礙或病癥的發(fā)病率降低。例如，多種流感疫苗在施用該疫苗的人群中并不能100%有效地預(yù)防流感。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定預(yù)防性治療將會使其受益的患者和狀況，例如但不限于，將要參加可能導(dǎo)致外傷和損傷的活動的個體(例如參加軍事作業(yè)的士兵、賽車手等)，計劃進(jìn)行手術(shù)的患者，具有患遺傳性疾病、障礙或病癥風(fēng)險的患者，具有患環(huán)境因素引起的疾病、障礙或病癥風(fēng)險的患者，或者具有患特定疾病、障礙或病癥風(fēng)險的部分人群諸如老人、嬰兒或免疫系統(tǒng)減弱者，或者具有患疾病、障礙或病癥的遺傳上的或其它的風(fēng)險因素的患者。本文使用的術(shù)語"受試者"和"患者"可以互換使用。本文使用的術(shù)語"受試者"是指動物，優(yōu)選哺乳動物，包括非靈長類(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠和小鼠)和靈長類(例如猴或人)，更優(yōu)選人類。本文使用的術(shù)語"組織保護(hù)活性"或"組織保護(hù)"是指抑制或延遲細(xì)胞、組織或器官損傷或死亡的作用。除非另外指出，相對于不存在本發(fā)明的肽的對照條件，評價細(xì)胞、組織或器官的損傷或死亡的"延遲"。組織保護(hù)活性在多種病癥、疾病和細(xì)胞、器官和/或組織損傷中有用，例如，在第5.3節(jié)中所述。組織保護(hù)活性是表達(dá)組織保護(hù)性受體復(fù)合物的組織、細(xì)胞和/或器官(即，分別為反應(yīng)性組織、細(xì)胞和/或器官)特有的，例如，但不限于，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織。在特定實(shí)施方案中，應(yīng)答性細(xì)胞不是紅細(xì)胞祖細(xì)胞。本文使用的術(shù)語"組織保護(hù)性受體復(fù)合物"是指包含至少一個促紅細(xì)胞生成素受體亞單位和至少一個P共同受體亞單位的復(fù)合物。組織保護(hù)性受體復(fù)合物可以含有多個促紅細(xì)胞生成素受體亞單位和/或p共同受體亞單位，以及其它類型的受體或蛋白質(zhì)。參見WO2004/096148，其在此全文引用作為參考。為了確定兩個氨基酸序列的百分同一性，為了最佳對比的目的將兩個序列比對。然后比較相應(yīng)氨基酸位點(diǎn)處的氨基酸殘基。當(dāng)?shù)谝粋€序列中的位點(diǎn)與第二個序列的相應(yīng)位點(diǎn)被相同的氨基酸殘基占據(jù)時，這兩個分子在該位點(diǎn)處是相同的。兩個序列之間的百分比同一性是序列共有的相同位點(diǎn)數(shù)的函數(shù)(即％同一性=相同重疊位點(diǎn)數(shù)/位點(diǎn)總數(shù)xlOOQ/())。在一個實(shí)施方案中，兩個序列長度相同。在替代實(shí)施方案中，兩個序列的長度不同，相應(yīng)地，百分比同一性是指較短序列與較長序列的一部分的比較，其中所述部分與所述較短序列的長度相同。4.附圖簡迷圖1顯示體內(nèi)坐骨神經(jīng)損傷模型的結(jié)果，以比較肽J(SEQIDN0:41)與組織保護(hù)分子氨甲酰化EPO(CEPO)的功效，其中肽J(SEQIDNO:41)是由EPO螺旋B的朝向外側(cè)的氨基酸(即肽G，SEQIDNO:40)與胰多肽的兩親性螺旋(LRRYINMLTRP,SEQIDNO:28)組合成的嵌合肽。圖2顯示在體內(nèi)坐骨神經(jīng)損傷模型中檢測的本發(fā)明肽的組織保護(hù)作用。在該試驗中，使大鼠(每組11=6)的右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷，立即給動物施用PBS，或含有等摩爾濃度的氨甲?；疎PO、EPO肽A(SEQIDNO:32,對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸l-23)、肽D(SEQIDNO:30，對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸58-82)或肽G(SEQIDNO:40)的PBS。肽G(SEQIDNO:40)基于EPO的螺旋B內(nèi)的氨基酸，所述氨基酸從EPO分子的球形中心向外朝向親水性環(huán)境內(nèi)，即存在于多肽的表面上。另外，也包括由已知通過另一受體具有組織保護(hù)性的色素上皮衍生因子的區(qū)域構(gòu)建的20個氨基酸作為陰性對照。此后4天的損傷恢復(fù)證明肽G(SEQIDNO:40)和肽D(SEQIDNO:30)在該體內(nèi)模型試驗中表現(xiàn)出組織保護(hù)效果，其效果等同于或者好于氨甲?；疎PO(CEPO)。圖3顯示肽D(SEQIDNO:30)和已知缺乏紅細(xì)胞生成活性的CEPO的紅細(xì)胞生成效果，這是通過檢測紅細(xì)胞生成活性的UT-7試驗測定的。該體外測定的結(jié)果證明肽D(SEQIDNO:30)和CEPO在高達(dá)10,000pM的劑量時都不顯示紅細(xì)胞生成活性。圖4顯示體內(nèi)測定結(jié)果，該測定用來確定肽F(SEQIDNO:33，對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸14-29)和肽G(SEQIDNO:40)是否具有紅細(xì)胞生成活性，或者誘導(dǎo)針對EPO的中和抗體。結(jié)果證明這兩種蛋白質(zhì)在以0.8ng/kg每周3天皮下(s.c.)施用130天時，都未提高大鼠的血紅蛋白水平。另外，與施用EPO相反，這兩種肽都不引發(fā)抗體應(yīng)答。圖5顯示體外研究結(jié)果，該結(jié)果證明肽D(SEQIDNO:30)保護(hù)運(yùn)動神經(jīng)元避免紅藻氨酸鹽誘導(dǎo)的死亡。圖6顯示劑量為0.1ng/ml和lng/ml的肽D(SEQIDNO:30)保護(hù)P-19細(xì)胞避免與血清剝奪(serumdeprivation)有關(guān)的纟田月包凋亡。圖7A-B顯示在大鼠中進(jìn)行的大腦中動脈閉塞測定的結(jié)果。圖7A所示的圖證明單劑量4.4嗎/kg的肽D(SEQIDNO:30，對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸58-82)能夠與每間隔2小時施用的4劑4.4!ig/kg—樣有效地減少腦中梗塞的體積。圖7B顯示用來確定大腦中動樂jc閉塞引起的行為缺陷的腳誤(footfault)試驗的結(jié)果。圖7B顯示當(dāng)以單劑量方案(lx4.4嗎/kg)和多劑量方案(4x4.4ing/kg)施用肽D(SEQIDNO:30)時證明大鼠的行為改善。圖8A-B顯示糖尿病神經(jīng)病變測定的體內(nèi)測定結(jié)果。使用鏈脲霉素在大鼠中誘發(fā)糖尿病。在證實(shí)誘發(fā)了糖尿病后，用4嗎/kg-bw劑量的肽D(SEQIDNO:30)或PBS腹膜內(nèi)處理大鼠，每周5次，持續(xù)2周。觀察大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)速度和熱板等待時間(hotplatelatency)。圖8A證明用肽D(SEQIDNO:30)處理的大鼠與未處理的大鼠相比表現(xiàn)出提高的傳導(dǎo)速度。圖8B證明被處理大鼠的熱板等待時間比未處理大鼠縮短，進(jìn)一步證明傳導(dǎo)速度提高。圖9A-B顯示用EPO螺旋B嵌合體治療順鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病和腎病的結(jié)果。圖9A證明用肽G(SEQIDNO:40，螺旋B嵌合體)治療的動物在熱板等待時間測定中顯示改善的結(jié)果。圖9B證明肽G(SEQIDNO:40)治療的動物的尿量(腎功能的一個測量指標(biāo))保持正常。圖10顯示肽D(SEQIDNO:30)對與糖尿病視網(wǎng)膜病有關(guān)的視網(wǎng)膜滲漏的效果。該圖證明，肽D(SEQIDNO:30)能夠基本上減少被處理動物的視網(wǎng)膜滲漏o圖1l顯示腎缺血-再灌注模型上肽F(SEQIDNO:33)或肽G(SEQIDNO:40)的結(jié)果。該圖證明在72小時后評價時，這兩種肽都減少了缺血-再灌注損傷60分鐘引起的損傷得分。圖12說明施用肽F(SEQIDNO:33)保護(hù)小鼠避免了實(shí)驗性腦型瘧。圖13是用肽E(SEQIDNO:31)處理的鼠EAE模型的臨床得分。圖13顯示實(shí)驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中神經(jīng)系統(tǒng)功能的臨床過程。每天腹膜內(nèi)施用4.4ng/kg的狀E。狀E的施用相對于比照顯著改善了神經(jīng)系統(tǒng)功能。臨床分期l.尾巴松弛；2.神經(jīng)系統(tǒng)功能和/或后肢輕癱，或慢翻正反射；3.后肢麻痹和/或前肢輕癱；4.前肢輕癱；5.垂死或死亡。5.發(fā)明詳述5.1組織保護(hù)性肽促紅細(xì)胞生成素("EPO")的紅細(xì)胞生成活性已經(jīng)在本領(lǐng)域中很好地表征(參見,例如,Cheetham等人，1998，Nat.Struct.Biol.5;861-866,在此全文引用作為參考)。EPO通過以橋接各個EPOR亞單位上特定位點(diǎn)的方式與預(yù)先形成的促紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)同二聚體(即，(EPOR)2)的胞外部分結(jié)合,從而啟動紅細(xì)胞生成。當(dāng)EPO與(EPOR)2結(jié)合時，球形配體的大部分遠(yuǎn)離結(jié)合區(qū)且面向外部，背離EPO和(EPOR)2的復(fù)合物而朝向水性介質(zhì)內(nèi)。申請人已經(jīng)確定與紅細(xì)胞生成不同的組織保護(hù)是通過不同于(EPOR)2的受體介導(dǎo)的，該受體是由EPOR單體和另一種受體CD131(也被稱為p-共同受體亞單位(Pc))結(jié)合組成的。EPOR和Pc相互作用，形成受體異二聚體EPOR-Pc?，F(xiàn)在還不清楚是否有其它蛋白質(zhì)參與這一相互作用。本發(fā)明公開了由EPO的三維結(jié)構(gòu)衍生的組織保護(hù)性肽，特別是由背離EPOR結(jié)合位點(diǎn)的EPO部分衍生的組織保護(hù)性肽，即，由不與經(jīng)典的紅細(xì)胞生成EPOR(EPOR)2同二聚體相互作用的EPO部分衍生的組織保護(hù)性肽。不希望被任何特定理論所束縛，申請人認(rèn)為EPO分子的該部分與組織保護(hù)性受體相互作用，由此介導(dǎo)組織保護(hù)。EPO的三維結(jié)構(gòu)被公認(rèn)為如Cheetham等人，1998,Nat.Struct.Biol.5;861-866(其在此全文引用作為參考)中所述的結(jié)構(gòu)，并且在SEQIDNO:l(也可以從國家生物技術(shù)信息中心蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(ProteinDataBankoftheNationalCenterforBiotechnologyInformation)以條目"1BUY"獲取的數(shù)據(jù))中顯示。當(dāng)與所述受體結(jié)合時遠(yuǎn)離EPOR同二聚體近膜部分(即，當(dāng)(EPOR)2同二聚體在細(xì)胞表面上表達(dá)時遠(yuǎn)離細(xì)胞膜)的EPO分子的部分由下列二級結(jié)構(gòu)組成環(huán)AB(對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸29-55)、螺旋B(對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸56-82)、環(huán)BC(對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸83-92)和環(huán)CD(對應(yīng)于SEQIDNO:1的氨基酸112-138)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，組織保護(hù)性肽由對應(yīng)于EPO分子的這些不同結(jié)構(gòu)的氨基酸序列組成。不希望被任何特定理論所束縛，申請人認(rèn)為組織保護(hù)性受體是預(yù)先形成的，即，EPOR和pc蛋白質(zhì)亞單位在與EPO相互作用之前功能性結(jié)合。EPO是I型細(xì)胞因子超家族的成員。I型細(xì)胞因子超家族分支的成員的特征是4個螺旋，這些螺旋疏水性相互作用形成球形蛋白，該蛋白的外表面與水性介質(zhì)相接，被稱為"朝向外側(cè)的"。出乎意料的是，申請人已經(jīng)確定由EPO分子的朝向外側(cè)的部分衍生的一種以上的肽具有組織保護(hù)性。更令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，由埋藏在EPO:(EPOR)2復(fù)合物內(nèi)部的EPO分子部分衍生的肽以及可還包含紅細(xì)胞生這些發(fā)現(xiàn)，申請人提出組織保護(hù)性受體的成功活化是由于肽配體內(nèi)恰當(dāng)?shù)?、空間緊湊的電荷構(gòu)象。進(jìn)一步地，這種緊湊的電荷構(gòu)象具體體現(xiàn)為兩種不同的結(jié)構(gòu)基序(l)彼此相鄰的兩個帶負(fù)電荷的氨基酸，且其側(cè)翼為疏水性氨基酸；或(2)彼此緊密相鄰的帶正電荷的和帶負(fù)電荷的(即堿性和酸性)氨基酸，并且其側(cè)翼為單個疏水性或極性氨基酸殘基。這些電荷的接近可以通過肽鍵產(chǎn)生的線性結(jié)構(gòu)而發(fā)生，即，該結(jié)構(gòu)可以由多肽鏈中的連續(xù)氨基酸形成，或者，這種接近也可以通過蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)即三維結(jié)構(gòu)提供的EPO分子(或其它相關(guān)的I型細(xì)胞因子分子)不同部分之間的空間關(guān)系而發(fā)生。不希望被任何特定理論所束縛，申請人認(rèn)為，這一要求通常說明組織保護(hù)性肽將具有一種特有的三級結(jié)構(gòu)(例如螺旋或折疊片)，這種三級結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了帶電荷的氨基酸對(即，兩個帶負(fù)電荷的氨基酸和/或帶正電荷的和帶負(fù)電荷的氨基酸)所需的空間位置。一個簡單的例外是一種線性肽，其中氨基酸對彼此直接相鄰，肽骨架提供了所需的剛性。因此，結(jié)構(gòu)基序(1)包含于線性氨基酸殘基序列如H廣N廣N廣H2(SEQIDNO:6)中，或者包含于線性氨基酸殘基序列中，其中N!和N2被1、2、3、4、5、6個或更多的插入殘基隔開，例如，H廣N廣X-X-X-X-X曙N,-H2(SEQIDNO:ll)。對于組織保護(hù)來說，帶電荷的氨基酸對的空間取向必須使得羰基碳相隔大約3埃(A)至大約5A，優(yōu)選地大約4A至大約5A，更優(yōu)選地大約4.4A至大約4.8A。這可以通過大量方法來實(shí)現(xiàn)，例如，通過在簡單線性肽中相鄰的帶電荷的氨基酸(參見，例如，實(shí)施例2和肽G，SEQIDNO:40,表l),或者對于可以形成a螺旋的肽，帶電荷的氨基酸被插入的氨基酸殘基隔開(參見，例如，實(shí)施例2和肽F，SEQIDNO:33,表l)。應(yīng)當(dāng)注意，當(dāng)肽位于特定微環(huán)境中時，例如處于胞外-細(xì)胞表面膜界面處時，也可以形成三級結(jié)構(gòu)(例如兩親性肽中的a螺旋)(參見，Segrest,1990,Proteins8:103-117,在此全文引入作為參考)。此外，含有帶電荷的氨基酸對由此帶電荷的側(cè)鏈(正電和負(fù)電或兩個負(fù)電)在空間上限制在彼此相距大約6.5A至大約9A之內(nèi)的肽據(jù)預(yù)測具有組織保護(hù)活性。這在a螺旋中可以由被一個或兩個氨基酸隔開的帶電荷的對實(shí)現(xiàn)，這將或多或少地在螺旋的同一側(cè)4是4共電荷，其具有所需的大約6.5A至大約9A的間距。這種肽的非限定性實(shí)例在肽F中發(fā)現(xiàn)(參見，實(shí)施例2，SEQIDNO:33，表1)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以為肽設(shè)計為獲得帶電荷的氨基酸的適當(dāng)三維位置所需的三級結(jié)構(gòu)，以及設(shè)計小分子以模模擬肽內(nèi)的電荷分離。任意氨基酸的氨甲?；贾g或任何兩個氨基酸的側(cè)鏈之間的空間距離可以用任何本領(lǐng)域公知的或者本文所述的任何方法來推斷。例如，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的三維結(jié)構(gòu)已知時，兩個側(cè)鏈的電荷分離或所述蛋白質(zhì)的感興趣的部分內(nèi)兩個氨甲酰基;友之間的空間距離，可以基于公開的或以其它本領(lǐng)域接受的所述感興趣的部分中的氨基酸殘基的三維坐標(biāo)來計算。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的三維結(jié)構(gòu)未知，因而感興趣的部分未知時，或者基于本文的教導(dǎo)構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)未知的完全合成的肽時，兩個側(cè)鏈的電荷分離或所述肽內(nèi)兩個氨甲酰基石炭之間的空間距離，可以利用通過本領(lǐng)域公知的蛋白質(zhì)模建軟件預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)來估計。這些軟件的非限定性實(shí)例是ChemicalComputingGroup(Quebec,加拿大)的MOEtm和Accelrys(SanDiego,California)的Modeler。類似地，同樣可以從上述公司獲得的這些預(yù)測軟件也在本領(lǐng)域中已知用于小分子設(shè)計的，因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于本文的教導(dǎo)能夠制備模擬公開的結(jié)構(gòu)基序的小分子?？梢栽O(shè)計非天然存在的或嵌合的肽，這些肽通過線性氨基酸序列模擬本文以上所述的關(guān)鍵的空間接近。因此，本發(fā)明涉及新的組織保護(hù)性肽，包括那些顯示了這些引發(fā)組織保護(hù)的結(jié)構(gòu)基序的肽。包括但不限于粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-3(IL-3)、血小板生成素(TPO)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和白血病抑制因子(LIF),它們在結(jié)構(gòu)上與上述的EPO的外部呈現(xiàn)的氨基酸序列同源，并且/或者含有上述結(jié)構(gòu)基序。進(jìn)一步地，組織保護(hù)性肽可以是嵌合化合物，其基于以上所述的結(jié)構(gòu)基序，僅將不相鄰的結(jié)構(gòu)元件和表面呈現(xiàn)的氨基酸相結(jié)合。特別是，申請人已經(jīng)確定向上述序列中增加兩親性肽螺旋提高了肽的功效。另外，本發(fā)明的組織保護(hù)性肽包括兩個或多個上述肽組合產(chǎn)生的融合肽，或者與相關(guān)或不相關(guān)的用于特異性轉(zhuǎn)運(yùn)的大分子如天然EPO、胰島素或瘦素組合產(chǎn)生的融合肽。5丄1片段A.EPO-衍生的肽片段本發(fā)明涉及新的組織保護(hù)性肽，在一個實(shí)施方案中，所述組織保護(hù)性肽由EPO的氨基酸序列的片段組成，來源于EPO蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，特別是，來源于遠(yuǎn)離EPOR同二聚體的配體結(jié)合位點(diǎn)和/或內(nèi)部部分的EPO區(qū)域。這些片段來源于以下EPO結(jié)構(gòu)(1)環(huán)AB和螺旋B的N-末端部分(NITVPDTKVNFYAWKRMEVG，SEQIDNO:29，對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸38-57);(2)螺旋B的C-末端部分(QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV，SEQIDNO:30，對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸58-82)，和(3)由小半胱氨酸環(huán)和P-折疊片組成的A-B環(huán)的一部分(GCAEHCSLNENITVPDTKVN，SEQIDNO:31，對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸28-47)。在實(shí)施例2中證明(參見圖l和表l)這些肽片段全部表現(xiàn)出組織保護(hù)性質(zhì)。意料之外的是，來源于包埋的EPO分子的其它區(qū)域的肽和其它包括(EPOR)2結(jié)合位點(diǎn)的部分的肽也具有組織保護(hù)性。例如，由螺旋A的N末端部分組成的肽(APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE,SEQIDNO:32，對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸l-23)具有組織保護(hù)性(參見，實(shí)施例2和表1)，該肽含有EPOR結(jié)合位點(diǎn)2的一部分(以下劃線標(biāo)出)。然而，位點(diǎn)2氨基酸的存在不能說明組織保護(hù)活性，因為由SEQIDNO:l的氨基酸14-19(RYLLEAKEAENITTGC,SEQIDNO:33)組成的、缺乏SEQIDNO:l的氨基酸ll-13(即，VLE;EPO與EPOR二聚體(EPOR)2結(jié)合所需的位點(diǎn)2氨基酸)的肽也具有組織保護(hù)性(參見，實(shí)施例2和表1，也參見Elliott等人，1997,Blood89:493，在此全文引入作為參考)。申請人以前已經(jīng)表明，消除紅細(xì)胞生成的紅細(xì)胞生成結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的突變不改變EPO的組織保護(hù)性質(zhì)(Leist等人，Science(2004)305:239,在此全文引入作為參考)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，不同長度的片段可以形成組織保護(hù)性肽，盡管該片段的長度優(yōu)選地少于30個氨基酸。此外，慎重選擇所包含的其它分子，例如D-氨基酸或聚乙二醇，也將構(gòu)成組織保護(hù)性肽，但是其具有延長的生物半衰期。A.結(jié)構(gòu)基序具體來說，已經(jīng)鑒定了引發(fā)組織保護(hù)性受體復(fù)合物的下列結(jié)構(gòu)基序(a)帶負(fù)電荷的構(gòu)象("結(jié)構(gòu)基序A")。在這種結(jié)構(gòu)基序中，肽具有兩個帶負(fù)電荷的氨基酸，它們被多達(dá)5個的氨基酸隔開，側(cè)翼為疏水性氨基酸。在結(jié)構(gòu)上可以表示為(al)HNNH;(a2)HNXNH;(a3)HNXXNH;(a4)HNXXXNH;(a5)HNXXXXNH;或(a6)HNXXXXXNH,其中H代表疏水性氨基酸(例如，中度疏水性的氨基酸甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和色氨酸，優(yōu)選高度疏水性的氨基酸丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲疏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)，N代表帶負(fù)電荷的氨基酸，如谷氨酸或天冬氨酸，X代表任意氨基酸，但是優(yōu)選親水性氨基酸。在某些實(shí)施方案中，側(cè)翼疏水性氨基酸是相同的。在其它實(shí)施方案中，側(cè)翼氨基酸是不同的。這種結(jié)構(gòu)基序的變化涉及一種肽，其中一個側(cè)翼疏水性氨基酸已經(jīng)被一個極性氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺替換。作為使線性序列中兩個負(fù)電荷相互接近的肽鍵的替代方案，也可以如上文所述利用三維結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)必要的電荷接近(第5.1節(jié))。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸可以在空間上在螺旋的外表面上直接靠近，但是在線性肽序列中被額外的氨基酸隔開。例如，在EPO的螺旋A(對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸10-28)中，E18和E21在三維結(jié)構(gòu)上相鄰，但是在線性肽序列中在它們之間具有兩個間插氨基酸。作為另外一個實(shí)例，在螺旋B(肽D，SEQIDNO:30;對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸58-82)中，E62和E72在螺旋表面上被兩個氨基酸(Q65和L69)隔開，但是在線性肽中在它們之間具有9個氨基酸。由螺旋A或螺旋B構(gòu)成的肽具有組織保護(hù)性(參見，實(shí)施例2和表1，見下文)。相反，肽B(NITTGCAEHCSLN1，SEQIDNO:34)不具有組織保護(hù)性，該肽帶有兩個距離適當(dāng)?shù)呢?fù)電荷(以下劃線標(biāo)出)，但是缺乏側(cè)翼疏水性氨基酸(參見，實(shí)施例2和表1，見下文)。(b)電負(fù)性/電正性的氨基酸構(gòu)象("結(jié)構(gòu)基序B")。在這個結(jié)構(gòu)基序中，肽具有緊鄰著電負(fù)性氨基酸的電正性氨基酸，且這兩個帶電荷的氨基酸的側(cè)翼均有一個疏水性氨基酸。其在結(jié)構(gòu)上可以表示為(bl)HNPH;或(b2)HPNH，其中P代表帶正電荷的氨基酸，如精氨酸、賴氨酸或組氨酸，N代表帶負(fù)電荷的氨基酸谷氨酸或天冬氨酸。和第一種基序一樣，兩個相反的電荷的彼此接近可以通過三維結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)。例如，帶正電荷的和帶負(fù)電荷的氨基酸可以在螺旋表面上在空間上相鄰，但是在線性肽序列中被一個或多個氨基酸隔開。例如，在螺旋B(對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸58-82)中，E72和R76在螺旋外表面上彼此直接相鄰，由這種螺旋構(gòu)成的肽具有組織保護(hù)性(參見，實(shí)施例2和表l)。在這種特定基序的一種變形中，電負(fù)性和電正性的氨基酸可以被極性氨基酸隔開，例如，(b3)HNLPH;(b4)HPLNH，其中L代表極性氨基酸，如絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。這種基序的例子是肽E(GCAEHCSLNENITVPDTKVN，SEQIDNO:34),它具有組織保護(hù)性(參見實(shí)施例2和表1)。假如上述結(jié)構(gòu)基序的核心的長度為4個氨基酸，則該核心結(jié)構(gòu)基序的肽可以引發(fā)組織保護(hù)性受體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含l個結(jié)構(gòu)基序。在替代實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含l個以上、2個以上、3個以上或4個以上的結(jié)構(gòu)基序。在多肽包含至少兩個結(jié)構(gòu)基序的某些實(shí)施方案中，這些基序是相同的。在多肽包含至少兩個結(jié)構(gòu)基序的替代實(shí)施方案中，這些基序是不同的。優(yōu)選地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以生成的本發(fā)明的多種肽具有不到30個氨基酸的長度。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會認(rèn)識到，是上述結(jié)構(gòu)基序而非EPO的實(shí)際氨基酸序列對于本發(fā)明是重要的。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會認(rèn)識到，分離肽可與SEQIDNO:l所示的成熟人促紅細(xì)胞生成素("EPO")氨基酸序列的任意部分具有低于90%、低于85%、低于80%、低于75°/。、低于70%、低于65%、低于60%、低于55%、低于50%、低于45%、低于40%、低于35%、低于30%或低于20%的序列同一性，其中EPO的所述部分含有與所述肽相同數(shù)目的氨基酸殘基。另外，授予O，Brien等人的美國專利號5，700,909(在此全文引入作為參考)公開了EPO的17個氨基酸的肽序列(0，Brien的SEQIDNO:11),該肽在NS20Y、SK-N-MC和PC12細(xì)胞中誘導(dǎo)生物活性，包括芽生、分化、神經(jīng)保護(hù)和預(yù)防神經(jīng)元細(xì)胞死亡。O，Brien的SEQIDNO:1l(設(shè)計的epo肽AB(epopeptideAB))盡管預(yù)言性地披露了具有紅細(xì)胞生成活性，但是實(shí)際上缺乏這種紅細(xì)胞生成活性，后來發(fā)現(xiàn)其缺乏體內(nèi)活性。當(dāng)將epo肽AB注射到小鼠肌肉內(nèi)時，相鄰肌肉中運(yùn)動終板芽生的頻率提高，其提高的方式類似于睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子所誘導(dǎo)的頻率提高。這些數(shù)據(jù)可在這樣的概念下解釋，即神經(jīng)元(而不是血液)細(xì)胞對EPO內(nèi)的肽序列產(chǎn)生應(yīng)答以及EPO可具有分離的神經(jīng)營養(yǎng)活性區(qū)域和血液營養(yǎng)活性區(qū)域(Campana等人，Int.J.MoLMed.(1998)1(1):235-241;J.S.O，Brien的美國專利號5,700,909，1997年12月23日授權(quán)；J.S.O'Brien的美國專利號5,571,787，1996年11月5日授權(quán);J.S.O，Brien的美國專利號5,714，459,1998年2月3日授4又；J.S.0，Brien和Y.Kashimoto的美國專利號5,696,080,1997年12月9日授;k)。然而，O，Brien沒有認(rèn)識到基于在肽三級結(jié)構(gòu)中帶電荷的氨基酸的鄰近而形成的目前的結(jié)構(gòu)基序。C.I型細(xì)胞因子片段假定空間上緊湊的電荷構(gòu)象能夠活化組織保護(hù)性受體，申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，I型細(xì)胞因子的某些片段預(yù)期與組織保護(hù)性受體交叉反應(yīng)。該細(xì)胞因子家族包括但不限于白介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-ll、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、瘦素、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、血小板生成素(TPO)、生長激素、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)和促乳素。對EPO二級結(jié)構(gòu)的考慮為通過氨基酸空間排列制備候選組織保護(hù)性肽提供了指導(dǎo)，所述氨基酸來源于位于其它I型細(xì)胞因子受體配體內(nèi)的同源二級結(jié)構(gòu)內(nèi)的同源氨基酸例如，已經(jīng)表明在這些配體中，GM-CSF和IL-3(Kannan,2000,Neuroimmunomod.8:132-141，全文引用作為參考)具有強(qiáng)神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)活性，申請人認(rèn)為，這很大程度上是通過刺激組織保護(hù)性受體所致。例如，考慮這些I型細(xì)胞因子的螺旋B:血小板生成素(TPO;蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)登錄號1V7M)中的同源氨基酸包括D^2、G65、T68、L69、122、A76和Q80，其中這些氨基酸以線性排列在空間上彼此相鄰；白血病抑制因子(LIF;PDB登錄號IEMR)中的同源氨基酸包括Mi、R64、Y68、S72、N75和D79;睫狀神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子(CNTF;PDB登錄號lCNT)中的同源氨基酸包括I2i、12^。它們?nèi)际且陨?第5丄1節(jié))所述的基序A的實(shí)例，其中用下劃線標(biāo)出的氨基酸帶負(fù)電荷。舉例說明本文以上(第5丄1節(jié))所述結(jié)構(gòu)基序B的來源于I型細(xì)胞因子的肽的實(shí)例包括但不限于GM-CSF螺旋A片羊殳，WEHVNAIOEARRLL(SEQIDNO:35);TPO螺旋A片段，LSKLLRDSHVLH(SEQIDNO:36);TPO螺旋B片段E56，K59;CNTF螺旋A片段，證SDLTALTESYVKH(SEQIDNO:37);CNTF螺旋B片段R89,E92。LIF螺旋B片段，GTEKAKLVELYRIWYL(SEQIDNO:38);和白介素3(IL-3)螺旋A片段，S薩DEIIHHLKRPPNPL(SEQIDNO:39)。上述這些氨基酸只是通過I型細(xì)胞因子受體傳遞信號的細(xì)胞因子超家族的一些成員的代表，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地確定該細(xì)胞因子超家族的其它成員的同源區(qū)域。5丄2嵌合體本發(fā)明也涉及"嵌合的"組織保護(hù)性肽一結(jié)合了EPO分子朝向外側(cè)的氨基酸的非線性結(jié)構(gòu)元件的線性氨基酸序列呈現(xiàn)上述結(jié)構(gòu)基序。本發(fā)明嵌合組織保護(hù)性肽可以由不同的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)元件組合進(jìn)單個肽中而組成。換句話說，嵌合組織保護(hù)性肽可以由來源于非線性的但是相鄰的結(jié)構(gòu)元件的氨基酸序列組成，例如來源于SEQIDNO:l的氨基酸序列110-115、133-136和160-165的片段，該片段將使得螺旋C的C末端部分和環(huán)C-D的N末端部分的結(jié)構(gòu)元件、環(huán)C-D的(3-折疊片、和EPO的C末端部分包含在單個肽中。另外，嵌合組織保護(hù)性肽也可以用來選出特定結(jié)構(gòu)的重要特征，例如，特定三級結(jié)構(gòu)的朝向外側(cè)的氨基酸。因此，嵌合組織保護(hù)性肽可以由螺旋B氨基酸58、62、65、69、72、76、79、80、83、84和85組成的片段組成(例如肽G，QEQLERALNSS，SEQIDNO:40)，或者，換句話說，由EPO螺旋B的所有呈現(xiàn)在外部的氨基酸此外，通過連接兩親性肽螺旋可以提高本發(fā)明的組織保護(hù)性肽的效能。兩親性肽螺旋在本領(lǐng)域中公知，例如，來自通過B類G蛋白偶聯(lián)受體信號傳導(dǎo)的肽(例如，Segrest等人,1990，Proteins8:103，在此全文引入作為參考)，用于將肽配體固定于細(xì)胞膜上。這種螺旋的實(shí)例包括但不限于來自下列物質(zhì)的高度疏水性的區(qū)域降4丐素(ALSILVLLQAGS,SEQIDNO:48);促腎上腺皮質(zhì)素釋^:激素(VALLPCPPCRA,SEQIDNO:49);P內(nèi)啡呔(NAIIKNAYKKG,SEQIDNO:50);高血糖素(GSWQRSLQDTE,SEQIDNO:51);胰泌素(GGSAARPAPP,SEQIDNO:52);血管活性腸肽(NALAENDTPYY,SEQIDNO:53);神經(jīng)肽Y(GALAEAYPSKP,SEQIDNO:54);促性腺激素釋放激素(GCSSQHWSYGL,SEQIDNO:55);甲狀旁腺素(VMIVMLAICFL,SEQIDNO:56);胰多肽(LRRYINMLTRP,SEQIDNO:28);和降釣素基因相關(guān)肽(LALSILVLYQA，SEQIDNO:57)(在Grace等人，2004，PNAS101:12836中公開，其在此全文引入作為參考)。例如，一種嵌合肽由具有EPO螺3走B的表面電荷基序的肽(QEQLERALNSS,SEQIDNO:40)在羧基末端與胰多肽的兩親性螺旋(LRRYINMLTRP,SEQIDNO:28)相連接而形成?？梢詫捎H性螺旋的羧基末端進(jìn)一步修飾而不影響其組織保護(hù)性。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施例中，將上述嵌合肽的末端脯氨酸置換為序列TR(QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR,SEQIDNO:41)產(chǎn)生了具有強(qiáng)組織保護(hù)活性的分子，這在坐骨神經(jīng)測定中得到證實(shí)(參見，圖l)。另外，也可以用其它三級結(jié)構(gòu)代替上述螺旋與組織保護(hù)性肽連4妄。例如，螺旋B外部呈現(xiàn)的氨基酸可以與EPO的AB環(huán)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的P折疊片(CSLNENI,SEQIDNO:42)連j妻，形成具有序列CSLNENIQEQLERALNSS(SEQIDNO:43)的嵌合肽，該嵌合肽具有組織保護(hù)性(參見實(shí)施例2和表1)。另外，螺旋C的末端部分存在的氨基酸(ALGKA，SEQIDNO:44，對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸111、112、113、116和118)可以與環(huán)CD-部分(LGAQKEAISPPDAASAAPLRTI，SEQIDNO:45，對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸l12-133)的全部或一部分組合。優(yōu)選地，在融合的肽之間存在連接臂來提供柔性，以使連接的肽可以采取適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)方向與組織保護(hù)性受體復(fù)合物結(jié)合。這些融合肽可能具有協(xié)同作用，和獨(dú)立的肽相比，連接的肽可能通過與組織保護(hù)性受體復(fù)合物增強(qiáng)的結(jié)合或者延長的生物半衰期，獲得更大的組織保護(hù)作用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到將各種所需的結(jié)構(gòu)元件組合進(jìn)單個肽從而將這些化合物的組織保護(hù)作用最大化的益處。這些嵌合體可以包含氨基酸肽和非氨基酸元件，例如連接子或橋聯(lián)原子或部分(moities)。5.1.3融合肽本發(fā)明進(jìn)一步預(yù)期，兩種或多種上述組織保護(hù)性肽、衍生的片段或嵌合體可以與相關(guān)的或不相關(guān)的蛋白質(zhì)如促紅細(xì)胞生成素、白蛋白等連接。5.1.4組織保護(hù)性肽的制備本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可以用本領(lǐng)域公知的重組或合成技術(shù)來制備。具體而言，固相蛋白質(zhì)合成適合長度相對較短的組織保護(hù)性肽，并且可以提供更高的產(chǎn)率以及更穩(wěn)定的結(jié)果。另外，對于組織保護(hù)性肽的制備，固相蛋白質(zhì)合成還可提供額外的柔性。例如，在合成階段可以向組織保護(hù)性肽中引入所需的化學(xué)修飾在肽合成中可以使用高瓜氨酸而不是賴氨酸，由此在合成后不需要將肽氨甲?；?。合成在肽的固相合成中，將具有oc-氨基和側(cè)鏈保護(hù)基的氨基酸固定在樹脂上。參見，例如,Nilsson,B.,Soellner,M.和Raines,R.ChemicalSynthesisofProteins,Annu.Rev.BiomolStruct.2005.34:91-118;MeldalM.1997.Propertiesofsolidsupports.MethodsEnzymol.289:83-104和SongsterMF，BaranyG.1997.Handlesforsolid-phasepeptidesynthesis.MethodsEnzymol.289:126-74。一般j吏用兩種類型的a-氨基-保護(hù)基酸敏感的叔丁氧羰基(Boc)或堿敏感的9-勞甲氧羰基(Fmoc)。WellingsDA,AthertonE.1997.StandardFmocprotocols.MethodsEnzymol.289:44-67。在快速且完全地除去這些ot-氨基-保護(hù)基后，可以將另一具有活化羧基的受保護(hù)氨基酸與未保護(hù)的樹脂結(jié)合的胺偶聯(lián)。通過使用過量的活化的可溶氨基酸，促使偶聯(lián)反應(yīng)完成。重復(fù)去保護(hù)和偶聯(lián)的循環(huán)以完成該序列。利用側(cè)鏈去保護(hù)和切割，樹脂產(chǎn)生所需的肽。GuyCA,FieldsGB.1997.Trifluoroaceticacidcleavageanddeprotectionofresin-boundpeptidesfollowingsynthesisbyFmocchemistry.MethodsEnzymol.289:67-83和StewartJM.1997.CleavagemethodsfollowingBoc-basedsolid-phasepeptidesynthesis.MethodsEnzymol.289:29-44。進(jìn)行固相蛋白質(zhì)合成的其它方法在以下文獻(xiàn)中公開Bang,D.和Kent,S.2004.AOne-PotTotalSynthesisofCrambin.Angew.Chem.Int.Ed.43:2534-2538;Bang,D.,Chopra,N.和Kent,S.2004.TotalChemicalSynthesisofCrambin.J.Am.Chem.Soc.126:1377-1383;Dawson,P.等人1994.SynthesisofProteinsbyNativeChemicalLigation.Science.266:116-119;Kochendoerfer等人2003.DesignandChemicalSynthesisofaHomogenousPolymer-ModifiedErythropoiesisProtein.Science.299:884-887(本段中引用的各參考文獻(xiàn)均全文引用作為參考)。必要時，固相肽合成產(chǎn)生的較小的肽可以通過肽連接如天然化學(xué)連接相組合。在該方法中，一個肽的N末端半胱氨酸殘基的疏醇基(thiolate)攻擊第二個肽的C末端疏醚，以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)疏酯化作用?？焖賁—N酰基轉(zhuǎn)移后形成酰胺鍵。參見Dawson,P.等人1994.SynthesisofProteinsbyNativeChemicalLigation.Science.266:776-779，其全文在此引用作為參考。進(jìn)一步地，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會認(rèn)識到，本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可以包括模擬肽(peptidomimetics),包括天然存在的和非天然存在的氨基酸的肽，如類肽(p印toid)。類肽是N-取代的甘氨酸、甘氨膽酸(glycoholicacid)、thiopronine、肌氨酸和塞奧芬(thiorphan)的寡聚體。這些結(jié)構(gòu)傾向于具有(-(C:0)-CH2-NR-)n的通同結(jié)構(gòu)，其R基團(tuán)作為側(cè)鏈。這些類肽可以依照Simon等人，Peptoids:Amolecularapproachtodrugdiscovery,Proc.Natl.Acad.SciUSA,89:9367-9371(1992)和Li等人，PhotolithographicSynthesisofPeptoids,J.AM.CHEM.SOC.2004，126,4088-4089所述的方法，利用固相合成法合成。上述每一文獻(xiàn)均在此全文引用作為參考。另外，本發(fā)明還涉及與模板肽具有類似特性的模擬肽或肽模擬物、非肽藥物的應(yīng)用(Fauchere,J.(1986)Adv.DrugRes.15:29;Veber和Friedinger(1985)TINS第32頁；及Evans等人(1987)J.Med.Chem30:1229,引用作為參考)。各種類型的模擬肽合成的綜述見例如MethodsofOrganicChemistry(Houben-Weyl),SythesisofPeptidesandPeptidomimetics-WorkbenchEdition第E22c巻(主編GoodmanM.)2004(GeorgeThiemeVerlagStuttgart,NewYork,在此全文引入作為參考)。重組技術(shù)可以應(yīng)用多種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)制備本發(fā)明的組織保護(hù)性肽。這些宿主表達(dá)系統(tǒng)代表了可以通過其制備并且隨后純化感興趣的組織保護(hù)性肽的運(yùn)載體(vehicle)，而且代表了在用適當(dāng)核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時，可以在原位展示經(jīng)修飾的促紅細(xì)胞生成素基因產(chǎn)物的細(xì)胞。它們包括但不限于細(xì)菌、昆蟲、植物、哺乳動物包括人類宿主系統(tǒng)，例如但不限于用含有組織保護(hù)性肽編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用含有促紅細(xì)胞生成素相關(guān)的分子編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)感染的或用含有促紅細(xì)胞生成素相關(guān)的分子編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或攜帶重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)，包括人類細(xì)胞系統(tǒng)，例如HT1080、COS、CHO、BHK、293、3T3,這些構(gòu)建體含有來源于哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子如金屬疏蛋白啟動子或來源于哺乳動物病毒的啟動子如腺病毒晚期啟動子、痘苗病毒7.5K啟動子。另外，可以選擇以所需的特定方式調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)、或修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞抹。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這種修飾和加工對于蛋白質(zhì)的功能而言可能是重要的。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知，不同的宿主細(xì)胞具有特定的翻譯后加工和修飾蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的機(jī)制?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)來確保表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。為此目的，可以使用具有初級轉(zhuǎn)錄物正確加工、基因產(chǎn)物糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞。這樣的哺乳動物宿主細(xì)胞包括人類宿主細(xì)胞，包括但不限于HT1080、CRO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和WB8。為了長期、高產(chǎn)率地制備重組肽，優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可以工程改造穩(wěn)定表達(dá)重組組織保護(hù)性細(xì)胞因子相關(guān)分子基因產(chǎn)物的細(xì)胞系。不使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，可以用被諸如啟動子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)等適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控元件控制的DNA以及選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在引入外源DNA之后，工程化細(xì)胞可以在富集培養(yǎng)基中生長l到2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記使之具有選擇抗性，并且允許細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定地整合到細(xì)胞的染色體中，并生長成灶(foci)，其隨后可被克隆并擴(kuò)增為細(xì)胞系。該方法可有利地用于工程改造表達(dá)組織保護(hù)性產(chǎn)物的細(xì)胞系。所述工程化細(xì)胞系在篩選和評價影響EPO相關(guān)分子基因產(chǎn)物的內(nèi)源活性的化合物中特別有用。進(jìn)一步的修飾可以對組織保護(hù)性肽進(jìn)行額外的修飾。例如，該肽可以用一種或多種(D)-氨基酸合成。選擇在本發(fā)明的肽中包含(L)-或(D)-氨基酸部分地取決于該肽需要的特性。例如，加入一個或多個(D)-氨基酸可以^是供肽在體外或體內(nèi)提高的穩(wěn)定性。加入一個或多個(D)-氨基酸還可以提高或降低肽的結(jié)合活性，如利用將(L)-氨基酸序列的全部或部分置換為相應(yīng)的對映異構(gòu)(D)-氨基酸序列在多肽鏈的相應(yīng)部分提供光學(xué)異構(gòu)結(jié)構(gòu)。(L)-氨基酸序列的全部或部分序列的顛倒產(chǎn)生了這種肽的逆(retro)-類似物。對映異構(gòu)的置換(L到D,或D到L)與序列顛倒的組合產(chǎn)生肽的逆-反(retro-inverso)-類似物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，對映異構(gòu)肽、它們的逆-類似物和它們的逆-反-類似物保持與親本肽的顯著的拓樸學(xué)關(guān)系，且親本和它的逆-反-類似物通常獲得特別高的相似性。這種關(guān)系和相似性可以在肽的生物化學(xué)性質(zhì)中反映出來，特別是相應(yīng)的肽和類似物與受體蛋白質(zhì)的高度結(jié)合。肽的逆-反-類似物性質(zhì)的合成已經(jīng)在例如MethodsofOrganicChemistry(Houben-Weyl),SynthesisofPeptidesandPeptidomimetics-WorkbenchEdition第E22c巻(主編GoodmanM.)2004(GeorgeThiemeVerlagStuttgart,NewYork)和其中引用的參考文獻(xiàn)中討論，這些參考文獻(xiàn)均在此全文引用作為參考。氨基酸"修飾"是指對天然存在的氨基酸的改變以產(chǎn)生非天然存在的氨基酸。具有非天然存在的氨基酸的本發(fā)明的肽的衍生物可以通過化學(xué)合成制備或通過在生物合成中向多肽內(nèi)位點(diǎn)特異性地引入非天然氨基酸而制備，如ChristopherJ.Noren，SpencerJ.Anthony-Cahill,MichaelC.Griffith,PeterG.Schultz,1989Science,244:182-188所述，其在此全文引用作為參考。與治療上有用的肽在結(jié)構(gòu)上類似的肽模擬物可以用來產(chǎn)生等同的治療或預(yù)防效果。通常，模擬肽在結(jié)構(gòu)上類似于模板多肽(即，具有生化性質(zhì)或藥理學(xué)活性的多肽)，但是具有一個或多個被選自下組的鍵任選地置換的肽鍵-CH2-NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH二CH-(順式和反式)、COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO,所述置換是通過本領(lǐng)域公知的并且在下列參考文獻(xiàn)中進(jìn)一步描述的方法Spatola,A.F.的"ChemistryandBiochemistryofAminoAcids,Peptides,andProteins,"B.Weinstein編，MarcelDekker,NewYork,第267頁(1983);Spatola,A.F.,VegaData(1983年3月),第1巻.第3期，"PeptideBackboneModifications"(—般性綜述)；Morely,J.S"TrendsPharmaSci(1980)第463-468頁(一般性綜述)；Hudson,D.等人，(1979)IntJPeptProtRe14:177-185(-CH2-NH-、-CH2-CH2-);Spatola,A.F.等人，(1986)LifeSci38:1243-1249(-CH2-S);Harm,M.M.,(1982)JChemSocPerkinTransI307-314(-CH=CH-，順式和反式)；Almquist,R.G.等人,(1980)JMedChem23:1392(-COCH2-);Jennings-White,C等人，(1982)TetrahedronLett23:2533(-COCH2-);Szelke,M等人，EuropeanAppln.EP45665(1982)CA:97:39405(1982)(-CH(OH)CHr);Holladay，M.W.等人，(1983)TetrahedronLett24:4401-4404(-C(OH)CHr);和Hruby,V.J.,(1982)LifeSci31:189-199(-CHrS-);各文獻(xiàn)均在此引用作為參考。在另一實(shí)施方案中，特別優(yōu)選的非肽鍵是-CH2NH-。這些肽模擬物相對于多肽實(shí)施方案可能具有顯箸的優(yōu)點(diǎn)，包括，例如制備更經(jīng)濟(jì)，化學(xué)穩(wěn)定性更高，藥理學(xué)性質(zhì)(半衰期、吸收、效能、有效性等)提高，特異性改變(例如，廣譜生物活性)，抗原性降低等等。肽模擬物可能有多種設(shè)計。例如，特別考慮到環(huán)肽，其中必要的構(gòu)象通過非肽得以穩(wěn)定，授予Lobl等人的美國專利號5,192,746、授予Aversa等人的美國專利號5,576,423、授予Shashoua的美國專利號5,051,448和授予Gaeta等人的美國專利號5,559,103(均在此引用作為參考)描述了多種制備這樣的化合物的方法。模擬肽序列的非肽化合物的合成也是本領(lǐng)域公知的。Eldred等人,J.Med.Chem.37:3882(1994)(在此全文引用作為參考)描述了模擬肽序列的非肽拮抗劑。同樣，Ku等人，J.Med.Chem38:9(1995)(在此全文引用作為參考)進(jìn)一步闡明了一系列這樣的化合物的合成。在合成后可以進(jìn)行進(jìn)一步的修飾。例如，按照于2003年4月17日以公開號20030072737-Al公開并且披露了化學(xué)修飾的EPO的美國專利申請?zhí)?0/188,905，以及按照2003年7月1日提交的美國專利申請?zhí)?0/612，665和2000年12月29日提交的美國專利申請?zhí)?9/753,132(在此全文引用作為參考)，可以進(jìn)一步化學(xué)修飾組織保護(hù)性肽，即進(jìn)行氨甲酰化、乙?；?、琥珀?；取Ａ硗?，組織保護(hù)性肽可以由重組組織保護(hù)性肽一突變蛋白質(zhì)(mutein)組成。公開的突變包括替換、缺失(包括內(nèi)部缺失)、添加(包括產(chǎn)生融合蛋白的添加)、或?qū)е?沉默"改變的氨基酸序列內(nèi)和/或與氨基酸序列相鄰的氨基酸殘基的保守替換，以及非保守氨基酸改變和較大的插入和缺失，如以前在發(fā)明名-爾為RecombinantTissueProtectiveCytokinesandEncodingNucleicAcidsThereofforProtection,Restoration,andEnhancementofResponsiveCells,Tissues,andOrgans的PCT/US03/20964(在此全文引用作為參考)中所公開的。保守或非保守氨基酸替換可以在一個或多個氨基酸殘基處進(jìn)行。保守和非保守替換都可以進(jìn)行。保守置換是在側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的置換。遺傳編碼的氨基酸可以分為四個家族(1)酸性=天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性=賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性(疏水性)=半胱氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲石克氨酸、色氨酸、甘氨酸、酪氨酸；和(4)不帶電荷的極性的=天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸。非極性氨基酸可以再分為強(qiáng)疏水性的=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸，和中度疏水性的=甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸。以另外一種方式，全部的氨基酸可以分類為(l)酸性=天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性=賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)脂肪族=甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸，絲氨酸和蘇氨酸任選地4皮單獨(dú)歸類為脂肪族-羥基；(4)芳香族=苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；(5)酰胺=天冬酰胺、谷氨酰胺；和(6)含疏的=半胱氨酸和甲硫氨酸。(參見，例如，Biochemistry,第4版，L.Stryer編，WHFreemanandCo.,1995，在此全文引用作為參考)?；蛘?，還可以沿著組織保護(hù)性肽的全部或部分編碼序列隨機(jī)引入突變，例如通過飽和突變引入，并且可以對突變體進(jìn)行生物活性的篩選以鑒定維持活性的突變體。在突變后，可以重組地表達(dá)編碼的肽，并且可以測定重組組織保護(hù)性肽的活性。在另一實(shí)施方案中，可以通過添加聚合物(如聚乙二醇)、糖或其它蛋白質(zhì)(如融合構(gòu)建體)進(jìn)一步修飾組織保護(hù)性肽，以試圖延長組織保護(hù)性肽的半衰期或提高該肽的組織保護(hù)作用。這些修飾的實(shí)例在WO/04022577A3和WO/05025606Al中公開，其在此全文引用作為參考。5.2檢測組織保護(hù)性肽的試驗5.2.1生物學(xué)篩選或試驗可以檢測本發(fā)明的組織保護(hù)性肽的組織保護(hù)活性，例如，保護(hù)細(xì)胞、組織或器官的活性。保護(hù)活性可以用體外和體內(nèi)試驗進(jìn)一步檢測。指示組織保護(hù)活性的體外試驗包括，例如，細(xì)胞增殖試驗，細(xì)胞分化試驗，或者檢測被組織保護(hù)性受體復(fù)合物例如組織保護(hù)性細(xì)胞因子受體復(fù)合物上調(diào)的蛋白質(zhì)或核酸的存在、活性，例如核仁素、腦紅蛋白、胞紅蛋白或frataxin。例如，腦紅蛋白可能參與促進(jìn)氧的轉(zhuǎn)運(yùn)或短期貯存。因此，氧轉(zhuǎn)運(yùn)或貯存試驗可被用作為鑒定或篩選調(diào)節(jié)組織保護(hù)活性的化合物的試驗。腦紅蛋白響應(yīng)缺氧或局部缺血在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞和組織中表達(dá)，并且可以提供針對損傷的保護(hù)(Sun等人2001,PNAS98:15306-15311;Schmid等人，2003，J.Biol.Chem.276:1932-1935，均在此全文引用作參考)。胞紅蛋白在保護(hù)中可能起類似的作用，但是它在多種組織中以不同的水平表達(dá)(Pesce等人,2002,EMBO3:1146-1151,在此全文引用作參考)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，可以在將組織保護(hù)性肽與細(xì)胞接觸之前和之后對細(xì)胞中被上調(diào)的蛋白質(zhì)的水平進(jìn)行測定。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞中與組織保護(hù)活性有關(guān)的被上調(diào)的蛋白質(zhì)的存在可被用來證實(shí)肽的組織保護(hù)活性。核仁素可以保護(hù)細(xì)胞避免損傷。它在細(xì)胞中起到多種作用，包括調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程、序列特異性RNA-結(jié)合蛋白質(zhì)、胞質(zhì)分裂、成核(nucleogensis)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、T細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、染色質(zhì)重塑或復(fù)制。它也可以起到細(xì)胞表面受體DNA/RNA解旋酶、DNA-依賴的ATPase、蛋白質(zhì)穿梭(proteinshuttle)、轉(zhuǎn)錄因子組分、或轉(zhuǎn)錄阻抑劑的作用(Srivastava和Pollard,1999,FASEBJ"13:1911-1922;和Ginisty等人，1999,J.CellSci.,112:761-772，均全文在此引用作為參考)。Frataxin是一種涉及線粒體鐵代謝的蛋白質(zhì)，以前曾經(jīng)證明在體內(nèi)和體外均被EPO強(qiáng)烈上調(diào)(Sturm等人(2005)EurJClinInvest35:711,全文在此引用作為參考)?？梢酝ㄟ^檢測細(xì)胞中對應(yīng)于蛋白質(zhì)的mRNA水平來檢測被上調(diào)蛋白質(zhì)的表達(dá)。mRNA可以與特異性結(jié)合編碼被上調(diào)蛋白質(zhì)的核酸的探針雜交。雜交可以由例如Northern印跡法、Southern印跡法、陣歹'J雜交、親和層析或原]立雜交組成。本發(fā)明的多肽的組織保護(hù)活性也可以利用體外神經(jīng)保護(hù)試驗來檢測。例如，可以通過胰蛋白酶消化從新出生的大鼠海馬中制備原代神經(jīng)元培養(yǎng)物，利用任何本領(lǐng)域公知的和/或本文所述的方法培養(yǎng)，例如在MEM-II生長培養(yǎng)基(Invitrogen),20mMD-葡萄糖，2mML誦谷氨酰胺，10%Nu-血清(牛；BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)，2%B27添力口物(Invitrogen)，26.2mMNaHC03,100U/ml青霉素和lmg/ml鏈霉素中培養(yǎng)(參見例如，Leist等人，2004,Science305:239-242，在此全文引入作為參考)。在接種后一天，添加l(iM胞嗜啶阿拉伯呋喃糖苷。然后將培養(yǎng)了13天的培養(yǎng)物與劑量增高的EPO或CEPO(3-3000pM)預(yù)培養(yǎng)24小時。在第14天，除去培養(yǎng)基，在室溫下用300nMNMDA的PBS溶液激發(fā)該培養(yǎng)物。5分鐘后，將預(yù)處理的培養(yǎng)基加回到培養(yǎng)物中，然后將培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱中放置24小時。細(xì)胞在低聚甲醛中固定，用Hoechst33342(MolecularProbes,Eugene,OR)染色，對凝縮的凋亡細(xì)胞核進(jìn)行計數(shù)。包括NGF(50ng/ml)和MK801(1pM)作為陽性對照。可以利用動物模型系統(tǒng)證明化合物的組織保護(hù)活性，或者證明通過上述本發(fā)明的篩選方法鑒定的化合物的安全性和功效。然后可以利用動物模型對通過該試驗鑒定的化合物對于感興趣的一類組織損傷、疾病、病癥或綜合征的生物活性進(jìn)行檢測。這些動物模型包括經(jīng)工程改造含有與功能讀出系統(tǒng)連接的組織保護(hù)性受體復(fù)合物的動物，如轉(zhuǎn)基因小鼠?？梢杂脕頇z測所鑒定化合物的細(xì)胞或組織保護(hù)活性功效的動物模型包括，例如，針對Lewis大鼠中急性實(shí)驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎發(fā)作(EAE;參見實(shí)施例12)的保護(hù)，小鼠在受到腦外傷、大腦缺血("中風(fēng)"；實(shí)施例5)或興奮毒素類刺激的癲癇后認(rèn)知功能降低的恢復(fù)或保護(hù)(Brines等人，2000,PNAS,97:10295-10672，在此全文引用作為參考)，針對誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜缺血的保護(hù)(Rosenbaum等人，1997,Vis.Res.37:3443-51，在此全文引用作為參考)，針對坐骨神經(jīng)損傷的保護(hù)(參見，實(shí)施例2)，以及針對心臟缺血-再灌注損傷的保護(hù)(體外心肌細(xì)胞研究和體內(nèi)缺血-再灌注損傷，參見，例如Calvillo等人,2003,PNAS100:4802-4806和Fiordaliso等人，2005,PNAS102:2046-2051，均全文引入作為參考)。這些試驗在Grasso等人(2004)MedSciMonit10:BR1-3或PCT公開號WO02/053580中進(jìn)一步詳細(xì)描述，均全文引入作為參考。其中所述的體內(nèi)方法針對EPO的施用，然而，已經(jīng)確定施用組織保護(hù)性蛋白質(zhì)代替EPO也表現(xiàn)出類似的生物活性，例如，Leist等人(2004)Science305;239-242，在此全文引用作為參考。肽也可以代替進(jìn)行檢測。測定肽的組織保護(hù)活性的其它試驗是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。5.2.2細(xì)胞結(jié)合{式—險或者，也可以用細(xì)胞結(jié)合試驗來評價本發(fā)明的多肽。例如，可將感興趣的組織保護(hù)性肽與生物學(xué)標(biāo)記如熒光或放射標(biāo)記的標(biāo)記物結(jié)合，以便易于檢測，并且檢測它與被轉(zhuǎn)染的表達(dá)EPOR和/或Pc受體的BaF3細(xì)胞的結(jié)合。在96孔板中加入8個在生長培養(yǎng)基(RPMI1640，10%胎牛血清，1mM丙酮酸鈉，2mML-谷氨酰胺)中1:2系列稀釋的感興趣的組織保護(hù)性肽，使得每孔中的終體積約為100|^1。用生長培養(yǎng)基(見上)將BaF3親本細(xì)胞系和EPOR和/或Pc受體轉(zhuǎn)染的BaF3細(xì)胞洗滌三次，將沉淀物重懸浮在生長培養(yǎng)基中，計數(shù)細(xì)胞，并在生長培養(yǎng)基中稀釋為5,000細(xì)胞/100)il。然后向每個肽稀釋液中添加IOOpl稀釋的細(xì)胞。然后將檢測板在37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天。然后洗滌板/細(xì)胞，利用熒光讀板儀或其它適當(dāng)?shù)姆椒ㄗx板，以檢測與感興趣的組織保護(hù)性肽的生物活性有關(guān)的生物標(biāo)記的水平。類似地，也可以利用竟?fàn)幮栽囼灤_定組織保護(hù)性肽是否具有組織保護(hù)性。在竟?fàn)幮栽囼炛校蓪⒁阎哂薪M織保護(hù)性的化合物包括但不限于組織保護(hù)性細(xì)胞因子，如美國專利申請?zhí)?0/188,905和10/185,841(均在此全文引用作為參考)中公開的那些，與適當(dāng)?shù)纳飿?biāo)記物連^t妻。在96孔板中加入8個用適當(dāng)生長培養(yǎng)基1:2系列稀釋的已知組織保護(hù)性化合物/生物標(biāo)記物，以及相同稀釋系列的已知的組織保護(hù)性化合物/生物標(biāo)記物和過量的感興趣的組織保護(hù)性肽。每個稀釋物的終體積應(yīng)當(dāng)約為100jl1。再次如上所述將BaF3細(xì)胞接種到培養(yǎng)板中，并進(jìn)行培養(yǎng)。在適當(dāng)?shù)臅r間后，洗滌細(xì)胞，利用熒光讀板4義或本領(lǐng)域公知的任何其它適當(dāng)?shù)姆椒ㄗx板，以檢測生物標(biāo)記物。如果含有已知的組織保護(hù)性化合物/生物標(biāo)記物和感興趣的組織保護(hù)性肽的板和/或孔的讀數(shù)小于僅含有已知的組織保護(hù)性化合物/生物標(biāo)記物的讀數(shù)，則感興趣的組織保護(hù)性肽具有組織保護(hù)性。5.2.3細(xì)胞因子和細(xì)胞增殖/分化活性迄今為止發(fā)現(xiàn)的多種蛋白質(zhì)因子，包括所有已知的細(xì)胞因子，在一種或多種因子依賴性細(xì)胞增殖試驗中表現(xiàn)出活性，因而這些試驗可以方便地確認(rèn)細(xì)胞因子的活性。組織保護(hù)性肽的活性可以利用若干對細(xì)胞系的常規(guī)因子依賴性細(xì)胞增殖試驗中的任意一種來證實(shí)，這些細(xì)胞系不受限地包括32D、DA2、DA1G、TIO、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(preBM+)、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL2、TF-1、Mo7e和CMK。這些細(xì)胞在存在或不存在組織保護(hù)性肽的條件下培養(yǎng)，并且通過例如測量氮化胸苷的摻入或者利用基于3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)代謝分解的比色試驗來檢測細(xì)胞增殖(Mosman，1983，J.Immunol.Meth.65:55-63,全文引入作為參考)。5.2.4其它試驗如果組織保護(hù)性肽表現(xiàn)出組織保護(hù)活性，則本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，利用一種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的神經(jīng)保護(hù)和組織保護(hù)試—斷例如但不限于P-19和PC-12細(xì)胞試驗)來驗證該結(jié)果是有利的。另外，各種體內(nèi)模型，例如與脊髓損傷、缺血性中風(fēng)、周圍神經(jīng)損傷、心臟、眼睛、腎臟等有關(guān)的動物模型，將有助于進(jìn)一步表征組織保護(hù)性肽。合適的體外和體內(nèi)試驗在美國專利申請?zhí)?0/188,905和10/185，841中公開，其在此全文引用作為參考。5.3治療用途本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可作為治療或預(yù)防多種疾病、障礙和病癥的治療劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將認(rèn)識到，可以利用這些肽實(shí)現(xiàn)對組織保護(hù)性受體復(fù)合物如組織保護(hù)細(xì)胞因子復(fù)合物的調(diào)節(jié)?？梢杂糜谠u價例如上述發(fā)明性試驗所鑒定的化合物的治療適應(yīng)癥的體外和體內(nèi)技術(shù)在PCT申請?zhí)朠CT/US01/49479、美國專利申請?zhí)?0/188,905和10/185,841中公開，均在此引用作為參考。上述本發(fā)明的組織保護(hù)性肽通常可用于預(yù)防、治療性處理或預(yù)防性處理主要具有神經(jīng)或精神癥狀的人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病或障礙、眼部疾病、心血管疾病、心肺疾病、呼吸性疾病、腎臟疾病、泌尿和生殖系統(tǒng)疾病、骨病、皮力夫病、結(jié)締組織疾病、胃腸疾病、內(nèi)分泌和代i射異常。應(yīng)用的實(shí)例包括但不限于防止和修復(fù)由腦部(缺血性中風(fēng)、鈍傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血)、脊髓(局部缺血、鈍力外傷)、周圍神經(jīng)(坐骨神經(jīng)損傷、糖尿病神經(jīng)病變、腕管綜合征)、視網(wǎng)膜(黃斑水胂、糖尿病視網(wǎng)膜病、青光眼)和心臟(心肌梗死、慢性心力衰竭)創(chuàng)傷及所致炎癥引起的損傷。具體而言，這些疾病、障礙和病癥包括低氧狀態(tài)，這種狀態(tài)不利地影響應(yīng)答性組織，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織、周圍3申經(jīng)系統(tǒng)組織或心臟組織或網(wǎng)膜組織中的可興奮組織，例如腦、心臟或視網(wǎng)膜/眼睛。因此，本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可以用于治療或預(yù)防各種條件和環(huán)境下由低氧狀態(tài)引起的應(yīng)答性組織的損傷。這些條件和環(huán)境的非限定性實(shí)例在下文的表格中提供。組織保護(hù)性多肽在調(diào)節(jié)干細(xì)胞活性方面也是有意義的。已經(jīng)證實(shí)，顯示組織保護(hù)活性的細(xì)胞因子，如EPO，能夠調(diào)動干細(xì)胞，在例如再生作用中刺激向損傷區(qū)域的遷移并且?guī)椭迯?fù)過程。例如，在實(shí)驗性中風(fēng)中，EPO在恢復(fù)期介導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞向局部缺血損傷區(qū)域的遷移，以使神經(jīng)元再生(Tsai等人，J.Neurosci(2006)26:1269-74，在此全文引用作為參考)。作為另一個實(shí)例，EPO和CEPO將內(nèi)皮祖細(xì)胞從骨髓調(diào)動到循環(huán)中。這些細(xì)胞然后導(dǎo)向遠(yuǎn)處的區(qū)域，并且參與新血管的形成(關(guān)于EPO的效果參見Bahlmann等人，2003,KidneyInt.64:1648-1652，在此全文引用作為參考)。不希望#:任何特定理"^侖所束縛，相信本文公開的分離的多肽對干細(xì)胞的遷移具有相似的作用。在可用本發(fā)明的組織保護(hù)性肽治療和預(yù)防的神經(jīng)元組織病狀的實(shí)例中，這些病狀包括神經(jīng)元組織含氧減少引起的病狀?？梢杂帽景l(fā)明的組織保護(hù)性肽治療降低神經(jīng)元組織的氧利用度、導(dǎo)致應(yīng)激、損傷及最終神經(jīng)元細(xì)胞死亡的任何病癥。這些病癥通常被稱為缺氧和/或缺血，起因于或者包括但不限于中風(fēng)、血管閉塞、出生前或出生后缺氧、窒息(suffocation)、氣哽、接近淹溺、一氧化石炭中毒、煙吸入、外傷(包括手術(shù)和放射治療)、窒息(asphyxia)、癲癇、低血糖癥、慢性阻塞性肺疾病、肺氣肺、成人呼吸窘迫綜合征、低血壓休克、膿毒性休克、過敏性休克、胰島素休克、鐮狀細(xì)胞危象、心臟停搏、節(jié)律障礙、氮麻醉、和心肺分流術(shù)引起的神經(jīng)性缺乏。在一個實(shí)施方案中，例如，利用本發(fā)明的試驗鑒定的本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可以單獨(dú)施用或者作為組合物的一部分施用，以在外科手術(shù)或醫(yī)學(xué)操作之前、期間或之后防止由損傷或組織損傷風(fēng)險引起的損傷或組織損傷。例如，外科手術(shù)可以包括肺瘤切除或動脈瘤修復(fù)，醫(yī)學(xué)操作可以包括分娩或生產(chǎn)?？捎帽景l(fā)明組織保護(hù)性肽治療的由低血糖產(chǎn)生或引起的其它病狀包括胰島素過量，也^皮稱為醫(yī)源性超高胰島素血癥、胰島素瘤、生長激素缺乏、低皮質(zhì)醇癥、藥物過量和某些腫瘤?？膳d奮神經(jīng)元組織損傷引起的其它病狀包括癲癇發(fā)作，如癲癇癥、驚厥或慢性癲癇發(fā)作。其它可治療的病癥和疾病包括但不限于諸如中風(fēng)、多發(fā)性硬化、低血壓、心臟停搏、阿爾茨海默病、帕金森病、大腦性癱瘓、腦或脊髓損傷、AIDS癡呆、與年齡相關(guān)的認(rèn)知功能喪失、記憶喪失、肌萎縮側(cè)索硬化、癲癇發(fā)作、酒精中毒、視網(wǎng)膜缺血、青光眼引起的視神經(jīng)損傷、和神經(jīng)元損傷等疾病。本發(fā)明的特定組織保護(hù)性肽可以用于治療或預(yù)防由疾病病癥或多種創(chuàng)傷引起的炎癥，如物理或化學(xué)誘導(dǎo)的炎癥。組織保護(hù)性肽還預(yù)期用于治療和預(yù)防一種或多種器官或組織中的炎癥，包括但不限于腦、脊髓、結(jié)締組織、心臟、肺、腎和尿道、胰、眼和前列腺。這種創(chuàng)傷的非限定性實(shí)例包括肌腱炎、脈管炎、慢性支氣管炎、胰腺炎、骨髓炎、類風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、視神經(jīng)炎、顳動脈炎、腦炎、腦膜炎、橫貫性脊髓炎、皮肌炎、多肌炎、壞死性筋膜炎、肝炎和壞死性小腸結(jié)腸炎。進(jìn)一步地，組織保護(hù)性細(xì)胞因子可被用于治療或預(yù)防缺血和非缺血情況引起的炎癥，這些情況包括但不限于變態(tài)反應(yīng)、風(fēng)濕性疾病、運(yùn)動相關(guān)損傷、包括病毒、真菌和細(xì)菌在內(nèi)的感染。炎癥可以是急性或慢性的。炎癥領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用可見2004年9月29日提交的PCT/US2004/031789，其公開號為WO2005/032467,在此全文引入作為參考。本發(fā)明的特定組織保護(hù)性肽可被用來治療由脫髓鞘或髓鞘損傷引起的中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病。這些疾病被定義為主要涉及未知來源的炎性髓鞘損傷，例外的是髓鞘形成缺陷疾病如腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥，以及由明顯原因引起的疾病。多發(fā)性硬化癥(MS)是一種典型的脫髓鞘疾病，在病理學(xué)上，它的特征是改變，主要是炎性脫髓鞘，以及神經(jīng)膠質(zhì)增生。由于它的病因還不清楚，因此它的診斷是以臨床特征為基礎(chǔ)的，即，空間多發(fā)性及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷隨時間的多發(fā)性。此外，脫髓鞘疾病還包括急性播散性腦脊髓炎(ADEM)、炎性彌漫性硬化、急性和亞急性壞死性出血性腦白質(zhì)炎和橫貫性脊髓炎。此外，周圍神經(jīng)組織還依賴許旺氏細(xì)胞來維持髓鞘，如果這些細(xì)胞受到損傷，則引起周圍脫髓鞘疾病。本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可以用來治療或預(yù)防心臟的疾病和損傷，包括任何與心臟和/或相關(guān)組織(例如心包、主動脈和其它相關(guān)血管)有關(guān)的慢性或急性病理事件，包括缺血-再灌注損傷；充血性心力衰竭；心臟停搏；心肌梗塞；動脈粥樣石更化、二尖瓣滲漏、心房樸動、諸如藥物(例如多柔比星、赫賽汀、疏利達(dá)。秦和西沙必利)的化合物引起的心毒性；寄生蟲感染(細(xì)菌、真菌、立克次體和病毒，例如梅毒、慢性克魯斯錐蟲感染)引起的心臟損傷；暴發(fā)性心臟淀粉樣變性；心臟手術(shù)；心臟移植；血管成形術(shù)、腹腔鏡手術(shù)、創(chuàng)傷性心臟損傷(例如穿透性或鈍性心臟損傷，和主動脈瓣破裂)、胸主動脈瘤的手術(shù)修補(bǔ)；腎上主動脈瘤；心肌梗塞或心力衰竭引起的心源性休克；神經(jīng)源性休克和過風(fēng)險(即，心臟不能以代謝組織所需的速率泵送血液，或者心臟只有在充盈壓升高時才能這樣)的個體。具有這種風(fēng)險的患者包括患有心肌梗塞、冠狀動脈病、心肌炎、化學(xué)治療、心肌病、高血壓、心臟瓣膜病(最常見的是二尖瓣關(guān)閉不全和主動脈狹窄)和毒素(例如乙醇、可卡因等)誘導(dǎo)的心肌病等的患者或者具有患上述疾病風(fēng)險的患者。本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可以用來治療或預(yù)防眼睛例如視網(wǎng)膜組織的疾病和損傷。這些疾病包括但不限于視網(wǎng)膜缺血、黃斑變性、視網(wǎng)膜脫落、視網(wǎng)膜色素變性、動射J更化性視網(wǎng)膜病變、高血壓性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜動脈阻塞、i見網(wǎng)膜靜月永阻塞、低血壓和糖尿病^L網(wǎng)膜病。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組織保護(hù)性肽和本發(fā)明的原理可以用來預(yù)防或治療應(yīng)答性組織的輻射損傷引起的損傷。本發(fā)明的組織保護(hù)性肽的進(jìn)一步應(yīng)用在于治療中毒，如神經(jīng)毒素中毒(例如軟骨藻酸蛤貝中毒)、毒素(乙醇、可卡因等)，化學(xué)治療劑或射線照射的結(jié)果；山黧豆中毒；關(guān)島(Guam)??；肌萎縮側(cè)索石更化；和帕金森病。如上所述，本發(fā)明還涉及通過外周施用如上所述的組織保護(hù)性細(xì)胞因子，將本發(fā)明的組織保護(hù)性肽用于增強(qiáng)哺乳動物應(yīng)答性細(xì)胞、組織和器官中組織功能。有多種疾病和病癥適合用該方法治療。例如，該方法可用于增強(qiáng)可興奮組織的功能，甚至在不存在任何病癥或疾病的情況下，也導(dǎo)致認(rèn)知功能的提高。進(jìn)一步地，組織保護(hù)細(xì)胞因子可用于改善創(chuàng)傷愈合的質(zhì)量、縮短愈合所需的時間、提高痊愈組織的質(zhì)量、以及減少傷口引起的粘連的發(fā)生率。參見，2004年9月29日提交的、公開號為WO2005/032467的PCT/US2004/031789，在此全文引入作為參考。本發(fā)明的這些用途在下面進(jìn)一步詳細(xì)描述，包括人類和非人哺乳動物中學(xué)習(xí)和訓(xùn)練的提高?？梢杂帽景l(fā)明的組織保護(hù)性肽治療或預(yù)防的涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病癥和疾病包括但不限于情緒障礙、焦慮癥、抑郁癥、自閉癥、注意力缺陷伴多動癥、認(rèn)知功能障礙。這些病癥受益于神經(jīng)元功能的增強(qiáng)。按照本發(fā)明的教導(dǎo)可以被治療的其它疾病包括睡眠破壞例如睡眠呼吸暫停和旅行相關(guān)障礙；蛛網(wǎng)膜下和動脈瘤出血、低血壓休克、震蕩性損傷、膿毒性休克、過敏性休克、以及各種腦炎和腦膜炎如結(jié)締組織病相關(guān)的大腦炎的后遺癥，例如狼瘡。其它用途包括對以下疾病和病癥的預(yù)防或保護(hù)神經(jīng)毒素中毒如軟骨藻酸蛤貝中毒、山黧豆中毒和關(guān)島(Guam)病、肌萎縮側(cè)索硬化、帕金森病；對栓塞性或缺血性損傷的手術(shù)后治療；全腦照射；鐮狀細(xì)胞危象；和子癇。用本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可以治療或預(yù)防的另一類病癥包括遺傳性或獲得性的線粒體功能障礙，它們是以神經(jīng)元損傷和死亡為典型的多種神經(jīng)疾病的病因。例如，利氏(Leigh)病(亞急性壞死性腦病)的特征是神經(jīng)元脫離引起的進(jìn)行性視力喪失和腦病，以及肌病。在這些情況中，缺陷的線粒體代謝不能供應(yīng)足夠的高能量底物來為可興奮細(xì)胞的代謝提供能量。組織保護(hù)性肽優(yōu)化多種線粒體疾病中缺陷的功能。如上所述，低氧條件不利地影響可興奮組織。可興奮組織包括但不限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織、周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織和心臟組織。除了上述條件以外，本發(fā)明的組織保護(hù)性肽還可用于治療吸入性中毒，例如一氧化石友和煙吸入、重度哮喘、成人呼吸窘迫綜合征、氣哽和接近淹溺。產(chǎn)生低氧條件或通過其它方式誘導(dǎo)應(yīng)答性組織如可興奮組織損傷的其它病癥包括可以在胰島素不當(dāng)給藥中發(fā)生或者伴隨產(chǎn)胰島素胂瘤(胰島素瘤)而發(fā)生的低血糖癥。描述為源于可興奮組織損傷的各種神經(jīng)心理障礙可以用本發(fā)明的組織保護(hù)性肽治療。涉及神經(jīng)元損傷并且可用本發(fā)明治療或預(yù)防的慢性疾病包括涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，包括與年齡相關(guān)的認(rèn)知功能喪失和老年性癡呆、慢性癲癇癥、阿爾茨海默病、帕金森病、癡呆、記憶喪失、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、結(jié)節(jié)性硬化癥、威爾森氏(Wilson，s)病、大腦和進(jìn)行性核上麻痹、關(guān)島(Guam)病、路易體癡呆、朊病毒病，如海綿狀腦病，例如庫賈氏(Creutzfeldt-Jakob)病、亨廷頓氏(Huntington，s)病、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、弗里德賴希氏(Freidrich，s)共濟(jì)失調(diào)和其它共濟(jì)失調(diào)，以及抽動移語綜合征(GillesdelaTourettesyndrome)、癲癇疾病,如癲癇和慢性癲癇發(fā)作、中風(fēng)、腦或脊髓創(chuàng)傷、AIDS癡呆、酒精中毒、自閉癥、視網(wǎng)膜缺血、青光眼、自主功能障礙如高血壓和睡眠障礙，和神經(jīng)精神障礙，包括但不限于精神分裂癥、情感性分裂癥、注意力缺乏癥、低落性情感障礙、重郁癥、躁狂癥、強(qiáng)迫癥、使用精神活性物質(zhì)所致的障礙、焦慮、驚恐癥、以及單極和雙極情感障礙。其它神經(jīng)精神和神經(jīng)退行性疾病包括，例如，美國精神病協(xié)會(AmericanPsychiatricAssociation)的精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊(DiagnosticandStatisticalManualofMentalDisorders，DSM)所列出的那些，其最新版本在此全部引用作為參考。另一組使用本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可以治療或預(yù)防的病癥包括腎病，如急性和慢性腎衰竭。腎臟的血液供應(yīng)可能由于多種原因而被切斷，這些原因包括侵入血流的感染引起的休克(敗血病)、內(nèi)出血或外出血、嚴(yán)重痢疾或燒傷引起的體液損失、輸血反應(yīng)、心臟停搏或心律失常、手術(shù)創(chuàng)傷和腎移植。上述情況引起的通向腎臟的血流減少可使血流減少至危險的低水平，其持續(xù)時間長度足以導(dǎo)致急性腎衰竭的形成。血流減少也導(dǎo)致腎臟中的壞死或組織死亡，損傷腎小管細(xì)胞。腎衰竭也可能由疾病(間質(zhì)性和糖尿病性)腎病綜合征、感染、損傷(CPB誘導(dǎo)的)、毒素(造影劑誘導(dǎo)的、化學(xué)治療誘導(dǎo)的、環(huán)孢菌素)、自身免疫性炎癥(例如狼瘡、紅細(xì)胞生成等)引起。本發(fā)明的組織保護(hù)性肽幫助修復(fù)或預(yù)防這種損傷，有助于緩解急性腎衰竭。下表列出了適合用上述組織保護(hù)性肽治療的各種病癥和疾病的其它典型的、非限定性的適應(yīng)癥。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>:現(xiàn)網(wǎng)膜病變、:現(xiàn)網(wǎng)膜動樂K阻塞、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、低血壓、糖尿病4見網(wǎng)膜病、青光眼和黃斑水腫胚胎疾病窒息局部缺血CNS慢性疲勞綜合征、急性和慢性低滲性和高滲性綜合征、AIDS癡呆、電擊致死腦型痗腦炎狂犬病、皰滲腦膜炎硬腦膜下血胂尼古丁成癮藥物濫用和戒斷可卡因、海洛因、快克(crack)、大麻、LSD、PCP、多藥濫用、搖頭丸(ecstasy)、鴉片、鎮(zhèn)靜催眠劑、苯丙胺、咖啡因強(qiáng)迫癥推管狹窄、橫貫性脊髓炎、格林-巴利綜合征(GuillianBarre)、創(chuàng)傷、神經(jīng)才艮壓迫、腫瘤壓迫、熱休克ENT耳鳴、梅尼爾氏(Meuniere，s)綜合;f正、聽力損失外傷、氣壓傷腎臟腎衰竭急性、慢性血管/缺血性、間質(zhì)病、糖尿病性腎病、腎病綜合征、感染、損傷、造影劑誘導(dǎo)的、化學(xué)治療誘導(dǎo)的、環(huán)孢菌素、CPB誘導(dǎo)的或預(yù)防的輻射損傷過敏性紫癜橫紋肌自身免疫病重癥肌無力皮肌炎多肌炎<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>如上所述，這些疾病、障礙或病癥只是本發(fā)明的組織保護(hù)性肽提供的益處范圍的示例。因此，本發(fā)明通常才是供對機(jī)械創(chuàng)傷或人類疾病后果的防止性、治療性或預(yù)防性治療。涉及CNS和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、障礙或病癥的預(yù)防或治療性或預(yù)防性治療。拔:供了對具有精神病成分的疾病、障礙或病癥的預(yù)防或治療性或預(yù)防性治療。才是供了對包括但不限于具有眼睛、心血管、心肺、呼吸、腎臟、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、胃腸道、內(nèi)分泌或代謝成分的疾病、障礙或病癥的預(yù)防或治療性或預(yù)防性治療。在一個實(shí)施方案中，這種包含組織保護(hù)性肽的藥物組合物可以全身性給藥，以保護(hù)或增強(qiáng)靶細(xì)胞、組織或器官。這種給藥可以是腸胃外、經(jīng)吸入、或經(jīng)粘膜給藥，例如經(jīng)口、經(jīng)鼻、直腸、陰道內(nèi)、舌下、經(jīng)眼、粘膜下或經(jīng)皮給藥。優(yōu)選地，給藥是腸胃外給藥，例如通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射，也包括但不限于動月永內(nèi)、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)和皮下給藥。對于其它給藥途徑，例如利用灌注液、向器官內(nèi)注射、或其它局部給藥，將"t是供藥物組合物，該組合物產(chǎn)生如上所述的組織保護(hù)性肽的類似水平。優(yōu)選大約15pM-30nM的水平。本發(fā)明的藥物組合物可以包含治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。在特定實(shí)施方案中，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"是指得到聯(lián)邦或州政府管理部門批準(zhǔn)的，或者在美國藥典或其它公認(rèn)的國外藥典中列出的用于動物，更優(yōu)選地用于人類的。術(shù)語"載體"是指與治療劑一同給藥的稀釋劑、佐劑、賦形劑或運(yùn)載體(vehicle)。這些藥物載體可以是無菌液體，例如在水和油中的鹽水溶液，所述油包括石油、動物、植物或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)藥物組合物靜脈內(nèi)給藥時，鹽水溶液是優(yōu)選的載體。鹽水溶液和右旋糖和甘油水溶液也可以用作液體載體，特別用于注射溶液。適當(dāng)?shù)乃幬镔x形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。需要時，組合物還可含有少量的濕潤劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可以采用溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、緩釋制劑等的形式。該組合物可以用傳統(tǒng)的粘合劑和載體如甘油三酯類配制為栓劑。本發(fā)明的化合物可以配制為中性或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括與游離氨基形成的鹽，例如鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸衍生的鹽，以及與游離羧基形成的鹽，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等衍生的鹽。適當(dāng)?shù)乃幬镙d體的實(shí)例在E.W.Martin的"Remington'sPharmaceuticalSciences"中描述，其在此全文引用作為參考。這些組合物將含有治療有效量的化合物，優(yōu)選為純化的形式，以及適量的載體，以提供給患者恰當(dāng)給藥的形式。該制劑應(yīng)當(dāng)適合給藥模式。本發(fā)明也包含用于提高肽如長效組織保護(hù)性肽的經(jīng)粘膜吸收的制劑。適用于口服的藥物組合物可以以如下形式提供膠囊或片劑；粉劑或顆粒劑；溶液、糖漿或懸浮液(在水或非水的液體中)；可食用的泡沫或打發(fā)物(whips);或乳劑。片劑或硬明膠膠囊可以包含乳糖、淀粉或其衍生物、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂、硬脂酸或其鹽。軟明膠膠囊可包含植物油、蠟、脂肪、半固體、或液體多元醇等。溶液和糖漿可包含水、多元醇和糖。用于口服的活性劑可以用延遲活性劑在胃腸道內(nèi)崩解和/或吸收的材料進(jìn)行包衣或混合(例如，可以使用單石更脂酸甘油或二;更脂酸甘油)。因此，活性劑的持續(xù)釋放可以維持很多個小時，如果需要，可以阻止活性劑在胃內(nèi)降解。用于口服的藥物組合物可以經(jīng)配制促進(jìn)活性劑由于特定的pH或酶條件在胃腸道的特定部位的釋放。適合于經(jīng)皮給藥的藥物組合物可以以旨在延長的時間段內(nèi)保持與受試者表皮緊密接觸的不連續(xù)貼劑(discretepatch)的形式提供。適合于局部給藥的藥物組合物可以以如下形式^是供軟膏劑、乳膏劑、懸浮劑、洗劑、粉劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑。對于皮膚、口腔、眼睛、或其它外部組織的局部給藥，優(yōu)選使用局部軟膏劑或乳膏劑。當(dāng)配制成軟膏劑時，活性成分可以與石蠟或易與水混溶的軟膏基質(zhì)一起使用?；蛘?，活性成分可以與水包油或油包水基質(zhì)配制成乳膏劑。適合眼睛局部給藥的藥物組合物包括滴眼劑。在這些組合物中，活性成分可以溶解或懸浮在適當(dāng)?shù)妮d體例如水性溶劑中。適合口腔局部給藥的藥物組合物包括錠劑、軟錠劑和漱口劑。適用于經(jīng)鼻和肺部給藥的藥物組合物可以包含固體載體，如粉末(優(yōu)選的顆粒大小在20微米到500微米范圍內(nèi))。粉末可以通過鼻吸，即從靠近鼻子的含粉末容器中快速吸入鼻腔的方式來給藥。或者，適合經(jīng)鼻給藥的組合物可包含液體載體，如噴鼻劑或滴鼻劑?；蛘?，化合物直接吸入肺中可以通過深吸或者利用通過口腔管伸入到口咽中的裝置來實(shí)現(xiàn)。這些組合物可以含有活性成分的水性或油性溶液。用于吸入給藥的組合物可以用特別調(diào)適的裝置提供，所述裝置包括但不限于，壓力氣霧器、噴霧器、或吹入器，其可被構(gòu)造以提供預(yù)定劑量的活性成分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物直接向鼻腔內(nèi)^^藥，或者通過鼻腔或口咽向肺內(nèi)^^藥。適合于直腸給藥的藥物組合物可以以栓劑或灌腸劑的形式提供。適合于陰道給藥的藥物組合物可以以陰道栓劑、棉塞劑、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑的形式^是^洪。適合于腸胃外給藥的藥物組合物包括水和非水無菌注射溶液或懸浮液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使組合物與預(yù)期接受者血液基本上等滲的溶質(zhì)。可以存在于這些組合物中的其它成分包括，例如，水、醇、多元醇、甘油和植物油。適合于腸胃外給藥的組合物可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如，密封的安瓿和小瓶中，并且可以在凍干(冷凍干澡)條件下保存，在這種情況下只需在使用之前即刻加入無菌液體載體，例如注射用無菌鹽溶液。臨時注射液和懸浮液可以從無菌粉末、顆粒和片劑制備。在一個實(shí)施方案中，可提供含有組織保護(hù)性肽注射液的自動注射器用于救護(hù)車、急診室和戰(zhàn)場情況下緊急使用，甚至用于在家庭環(huán)境中自已給藥，特別是在可能發(fā)生創(chuàng)傷性截斷時，例如不小心使用割草機(jī)的情況。甚至在醫(yī)務(wù)人員到達(dá)現(xiàn)場之前，或者在斷趾個體到達(dá)急診室之前，盡可能快地對已切斷部分的多個位點(diǎn)施用組織保護(hù)性肽，可以提高已切斷的足或趾中的細(xì)胞和組織在再接后存活的可能性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，按照常規(guī)步驟將組合物配制為適合于對人類靜脈給藥的藥物組合物。靜脈給藥的組合物一般是在無菌等滲水緩沖液中的溶液。如果需要，該組合物還可包含增溶劑和局部麻醉劑如利多卡因，以減輕注射部位的疼痛。這些成分通常分開提供或者以單位劑量形式混合在一起提供，例如，作為凍干粉或無水濃縮物的形式存在于密封的容器內(nèi)，如標(biāo)有活性劑的量的安瓶或小藥囊中。當(dāng)通過輸注方式施用組合物時，可以用含有無菌藥物級水或鹽水的輸液瓶進(jìn)行分散。當(dāng)以注射方式施用組合物時，可以提供含有無菌鹽水的安瓿以在施用前混合各成分。栓劑通常含有0.5%至10%重量的活性成分；口服制劑優(yōu)選地含有10%至95%的活性成分?？梢圆攀枪┕嘧⒁航M合物用于移植器官浴或原位灌注，或者用于在器官收集前給器官供者的脈管系統(tǒng)施用。這些藥物組合物可以含有不適合急性或慢性、局部或全身給個體給藥的組織保護(hù)性肽水平或組織保護(hù)性肽形式，但是在將處理的器官或組織暴露于或返回常規(guī)循環(huán)之前，在消除或減少其中所含的組織保護(hù)性肽水平之前，在尸體、器官浴、器官灌注液或原位灌注液中起到此處預(yù)期的功能。本發(fā)明還提供包括一個或多個容器的藥包或試劑盒，該容器中充填了本發(fā)明藥物組合物的一種或多種成分。這些容器任選地可以結(jié)合管理藥物或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府部門所規(guī)定的形式的通告，該通告反映了該部門批準(zhǔn)生產(chǎn)、使用或銷售用于人類給藥。在另一實(shí)施方案中，例如，組織保護(hù)性肽可以在控釋系統(tǒng)中遞送。例如，該肽可以利用靜脈輸注、可植入滲透泵、透皮貼劑、脂質(zhì)體或其它給藥模式施用。在一個實(shí)施方案中，可以使用泵(參見Langer，同上；Sefton,1987,CRCCritRef.Biomed.Eng.14:201;Buchwald等人，1980，Surgery88:507;Saudek等人，1989,N.Engl.J.Med.321:574,均在此全文引用作為參考)。在另一實(shí)施方案中，該化合物可以在囊泡中，特別是在脂質(zhì)體中遞送(參見Langer,Science249:1527-1533(1990);Treat等人,LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer,Lopez-Berestein和Fidler(編)，Liss，NewYork,第353-365頁(1989);WO91/04014;美國專利號4，704,355;Lopez-Berestein，同上，第317-327頁；同上)。在另一實(shí)施方案中，可以使用聚合材料(參見MedicalApplicationsofControlledRelease,Langer和Wise(編),CRCPress:BocaRaton,Florida,1974;ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen和Ball(編)，Wiley:NewYork(1984);Ranger禾口Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61,1953;也參見Levy等人，1985,Science228:190;During等人，1989,Ann.Neurol.25:351;Howard等人，1989,J.Neurosurg.71:105,(均在此全文引用作為參考)。在另一實(shí)施方案中，可以將控釋系統(tǒng)置于治療耙點(diǎn)即耙細(xì)胞、組織或器官附近，從而只需要全身劑量的一部分(參見例如，Goodson,MedicalApplicationsofControlledRelease,第2巻，第115-138頁，同上，1984，在此全文引用作為參考)。其它控釋系統(tǒng)在Langer(1990，Science249:1527-1533，在此全文引用作為參考)的綜述中討論。在另一實(shí)施方案中，適當(dāng)配制的組織保護(hù)性肽可以經(jīng)鼻、經(jīng)口、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、經(jīng)眼、經(jīng)皮、腸胃外或舌下方式施用。在特定實(shí)施方案中，可能希望向需要治療的區(qū)域局部施用本發(fā)明的組織〃限護(hù)性肽；這可以通過以下方式來實(shí)現(xiàn)，例如但不限于手術(shù)中的局部輸注、局部使用例如手術(shù)后與傷口敷料一起、注射、利用導(dǎo)管、利用栓劑、或利用植入物，所述植入物是多孔的、非多孔的或明膠材料，包括膜例如硅橡膠膜或纖維。該實(shí)施方案的非限定性實(shí)例是用本發(fā)明的組織保護(hù)性肽包覆的冠脈支架。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過考慮若干因素可以容易地確定優(yōu)選的有效劑量的選擇，這些因素是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。這些因素包括組織保護(hù)性肽的具體形式和其藥代動力學(xué)參數(shù)，如生物利用度、新陳代謝、半衰期等，這些因素在獲得藥考慮劑量曰3頭K岡百a苻,仔K益處、患者的體重、給藥途徑、給藥是短期的還是長期的、伴隨藥物和其它熟知的影響所施用的藥物試劑有效性的因素。因此，精確的劑量應(yīng)當(dāng)根據(jù)專業(yè)人員的判斷和每名患者的情況來確定，例如根據(jù)個體患者的狀況和免疫狀態(tài)，并且才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的藥物組合物可以在制劑中包含組織保護(hù)性肽和至少一種顯示組織保護(hù)功能的小分子。合適的小分子包括但不限于類固醇類(例如拉扎洛依和糖皮質(zhì)激素)、抗氧化劑(例如輔酶Qu)、a疏辛酸、NADH)、抗分解代謝酶(例如谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氬酶、合成催化凈化劑、和模擬物)、"引咮衍生物(例如巧l咮胺、咕唑、咕啉)、硝酸中和劑、腺苷/腺苷激動劑、植物化學(xué)劑(黃酮類)、草藥提取物(銀杏和姜黃)、維生素(維生素A、E和C)、氧化酶電子受體抑制劑(例如黃嘌呤氧化酶電子受體抑制劑)、礦物質(zhì)(例如銅、鋅和鎂)、非甾體抗炎藥(例如阿司匹林、萘普生和布洛芬)、和它們的組合?？梢耘c本發(fā)明的藥物組合物一起使用的其它試劑包括但不限于抗炎藥(例如皮質(zhì)類固醇、潑尼松和氫化可的松)、糖皮質(zhì)激素、類固醇、非甾體抗炎藥(例如阿司匹林、布洛芬、雙氯芬酸和COX-2抑制劑)、P-激動劑、抗膽堿能藥和甲基黃噤呤、免疫調(diào)節(jié)劑(例如有機(jī)小分子、T細(xì)胞受體調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)劑、T細(xì)胞排除劑、細(xì)胞因子拮抗劑、單核因子拮抗劑、淋巴細(xì)胞抑制劑或抗癌劑)、金注射劑、柳氮磺吡啶、青霉胺、抗血管形成劑(例如血管抑制素)、TNF-a拮抗劑(例如抗TNFoc抗體)和內(nèi)皮生長抑素)、氨笨砜、補(bǔ)骨脂素(例如甲氧沙林和三甲沙林)、抗癥劑(例如羥氯喹)、抗病毒劑和抗生素(例如紅霉素和青霉素)。在本發(fā)明的另一方面，提供灌注液或灌注溶液用于灌注或存儲移植器官，灌注溶液包含有效保護(hù)應(yīng)答性細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞、組織或器官的量的組織保護(hù)性肽。移植包括但不限于同種異體移植，其中從一個供者中收集器官(包括細(xì)胞、組織或其它身體部分)并移植到不同的接受者中，這兩者是相同物種；自體移植，其中從身體的一個部分采集器官，并在另一部分進(jìn)行替代，包括手術(shù)臺手術(shù)，其中可以將器官取出，離體切割、修復(fù)或以其它方式操作，例如進(jìn)行肺瘤切除，然后返回原位點(diǎn)；或異種移植，其中在物種間移植組織或器官。在一個實(shí)施方案中，灌注溶液是威斯康辛大學(xué)(UW)的溶液(美國專利號的組織保護(hù)性肽、5%的幾乙基淀粉(分子量為大約200,000至大約300，000，基本上不含乙二醇、氯乙醇、氯化鈉和丙酮)；25mMKH2P04;3mM谷胱甘肽；5mM腺苷；10mM葡萄糖；10mMHEPES緩沖液；5mM葡萄糖酸鎂；1.5mMCaCl2;105mM葡萄糖酸鈉；200,000單位青霉素；40單位胰島素；16mg地塞米松；12mg酚紅；pH為7.4-7.5，滲透壓約為320mOsm/1。使用該溶液在移植前保存尸體腎和胰。使用該溶液，保存可以延長到超過尸體腎保存推薦的30小時的限度。這種特定的灌注液只是許多這樣的溶液的示例，這些溶液通過包含有效量的組織保護(hù)性肽而適合于本用途。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，灌注溶液含有大約1至大約500ng/ml的組織保護(hù)性肽，或者大約40至大約320ng/ml的組織保護(hù)性肽。如上所述，在本發(fā)明的該方面可以使用任何形式的組織保護(hù)性肽。盡管為了本文的目的，組織保護(hù)性肽的優(yōu)選接受者是人類，但是本發(fā)明的方法同樣可用于其它哺乳動物，特別是馴養(yǎng)動物、家畜、寵物和動物園動物。然而，本發(fā)明并非限定性于此，其益處可以應(yīng)用于任何哺乳動物。在離體發(fā)明的進(jìn)一步的方面，可以使用任何組織保護(hù)性肽，例如但不限于上述組織保護(hù)性肽。在本發(fā)明的另一方面，提供用于提高細(xì)胞、組織或器官活力的方法和組合物，這些細(xì)胞、組織或器官沒有4皮內(nèi)皮細(xì)胞屏障從l^管系統(tǒng)中分離，所述提供方法包括使這些細(xì)胞、組織或器官直接接觸含有組織保護(hù)性肽的藥物組合物，或者向組織或器官的脈管系統(tǒng)施用或接觸含有組織保護(hù)性肽的藥物組合物。被處理組織或器官中應(yīng)答性細(xì)胞增強(qiáng)的活性引起其所發(fā)揮的正面作用。類似于以促紅細(xì)胞生成素為基礎(chǔ)的其它組織保護(hù)性化合物，本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可能從具有內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的器官例如腦、視網(wǎng)膜和睪丸的腔表面轉(zhuǎn)移到其毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基膜表面。因此，跨過屏障的應(yīng)答性細(xì)胞是組織保護(hù)性肽的有益效果的敏感耙點(diǎn)，含有應(yīng)答性細(xì)胞并且全部或部分地不希望被任何特定理論所束縛，在轉(zhuǎn)胞吞作用后，組織保護(hù)性肽可以與應(yīng)答性細(xì)胞上的組織^床護(hù)性受體相互作用，所述細(xì)胞例如是神經(jīng)元、目艮(例如^L網(wǎng)膜)、脂肪、結(jié)締組織、毛發(fā)、牙齒、粘膜、胰腺、內(nèi)分泌、聽覺、上皮、皮膚、肌肉、心臟、肺、肝、腎、小腸、腎上腺(例如腎上腺皮質(zhì)、腎上腺髓質(zhì))、毛細(xì)血管、內(nèi)皮、睪丸、卵巢或子宮內(nèi)膜細(xì)胞，且受體結(jié)合可以啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，導(dǎo)致應(yīng)答性細(xì)胞或組織內(nèi)基因表達(dá)程序的激活，導(dǎo)致保護(hù)細(xì)胞或組織或器官免遭損傷，例如毒素、化療劑、放射治療、缺氧等造成的損害。在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)PCT申請?zhí)朠CT/US01/49479、美國專利申請?zhí)?0/188,905和10/185,841的教導(dǎo)(在此引用作為參考)，組織保護(hù)性肽可以與一種可穿過屏障的化合物如氨甲?；拇偌t細(xì)胞生成素交聯(lián)以穿過屏障。因此，下文詳細(xì)描述了保護(hù)含有應(yīng)答性細(xì)胞的組織免遭損傷或缺氧應(yīng)激并且增強(qiáng)該組織的功能的方法。在本發(fā)明一個實(shí)施方案的操作中，哺乳動物患者進(jìn)行治療癌癥的全身化學(xué)治療，包括放射治療，該治療通常具有副作用，如神經(jīng)、肺、心臟、卵巢或睪丸損傷。在化學(xué)治療和/或放射治療之前和期間如上所述進(jìn)行包含組織保護(hù)性肽的藥物組合物的給藥，以保護(hù)各種組織和器官免遭化療劑的傷害，例如保護(hù)睪丸。治療可以持續(xù)到化療劑的循環(huán)水平降到對哺乳動物身體的潛在危險水平以下。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案的操作中，計劃從汽車事故遇難者處收集各種器官移植到多個接受者中，其中一些器官需要延長距離和延長時間的運(yùn)輸。在器官收集之前，給^"者輸注含有本文所述的組織保護(hù)性肽的藥物組合物。給所要運(yùn)輸?shù)氖占钠鞴俟嘧⒑斜疚乃龅慕M織保護(hù)性肽的灌注液，并且貯存在含有組織保護(hù)性肽的浴槽中。用搏動灌注裝置給某些器官連續(xù)灌注含有本發(fā)明的組織保護(hù)性肽的灌注液。在器官運(yùn)輸過程中和原位植入和再灌注中發(fā)生了最少的器官功能的損壞。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，危險活動的參加者可以服用一劑含有組織保護(hù)性肽的藥物組合物，其劑量足以阻止(即延遲發(fā)作、抑制或停止)、防止或減輕應(yīng)答性細(xì)胞、組織或器官損傷引起的傷害。特別是，這種處理方法可用于易遭受損傷的各種職業(yè)，例如但不限于職業(yè)運(yùn)動員(跳水員、賽車手、足球運(yùn)動員等)、軍事人員(士兵、傘兵)、緊急事件處理人員(警察、消防員、EMS和救災(zāi)人員)、特技表演者和建筑工人。另外，涉及組織保護(hù)性肽在如下的娛樂項目中的預(yù)防性用途，包括但不限于具有受傷危險的攀巖、繩索下降、跳傘、賽車、自行車賽車、足球、橄欖球、棒球和跳水。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，修復(fù)心臟瓣膜的手術(shù)操作需要暫時的心麻痹和動脈閉塞。在手術(shù)前，給患者輸注組織保護(hù)性肽。這種治療防止了低氧缺血細(xì)胞損傷，特別是在再灌注后。另外，本發(fā)明的藥物組合物也可以預(yù)防性地用于使個體為手術(shù)做好準(zhǔn)備，以限制與手術(shù)操作有關(guān)的創(chuàng)傷，或者幫助個體從手術(shù)操作中恢復(fù)。盡管這種使用含有組織保護(hù)性肽的藥物組合物進(jìn)行治療的方法為手術(shù)操作提供了預(yù)防性用途，但是其特別可用于誘導(dǎo)暫時的局部缺血事件的操作，包括但不限于旁路術(shù)(冠狀動脈旁路)、血管成形術(shù)、截肢術(shù)和移植，以及直接對應(yīng)答性細(xì)胞、組織或器官進(jìn)行的手術(shù)，如腦和脊髓手術(shù)，和心臟直視手術(shù)。這些手術(shù)可涉及心肺(心臟肺)旁路的使用。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，在任何手術(shù)操作如心肺旁路術(shù)中可以使用本發(fā)明的組織保護(hù)性肽。在一個實(shí)施方案中，在旁路術(shù)之前、期間和/或之后施用如上所述的含有組織保護(hù)性肽的藥物組合物，以保護(hù)腦、心臟和其它器官的功能。在將本發(fā)明的組織保護(hù)性肽用于離體應(yīng)用或體內(nèi)應(yīng)用以治療應(yīng)答性細(xì)胞如神經(jīng)元組織、視網(wǎng)膜組織、心臟、肺、肝臟、腎臟、小腸、腎上腺皮質(zhì)、腎上腺髓質(zhì)、毛細(xì)血管內(nèi)皮、睪丸、卵巢或子宮內(nèi)膜細(xì)胞或組織的上述實(shí)例中，本發(fā)明提供了適于保護(hù)或增強(qiáng)遠(yuǎn)離脈管系統(tǒng)的應(yīng)答性細(xì)胞、組織或器官的劑量單位形式的藥物組合物，該形式包含范圍在約0.01pg至7.5mg、5pg至6.5mg、1pg至5mg、500pg至5mg、1ng至5mg、500ng至5mg、1嗎至5mg、500嗎至5mg或lmg至5mg的組織保護(hù)性肽，和藥學(xué)上可接受的載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，組織保護(hù)性肽的量在大約0.5pg至lmg的范圍內(nèi)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該制劑含有無紅細(xì)胞生成活性的組織保護(hù)性肽。在本發(fā)明的另一方面，可以施用組織保護(hù)性肽恢復(fù)遭受腦外傷的哺乳動物的認(rèn)知功能。在5天或30天的延遲后，與安慰劑處理的哺乳動物相比，施用組織保護(hù)性肽能夠恢復(fù)功能，表明組織保護(hù)性肽具有再生或恢復(fù)腦活性的能力。因此，本發(fā)明也涉及組織保護(hù)性肽在制備用于治療腦外傷和其它認(rèn)知功能障礙的藥物組合物中的用途，這種治療包括損傷后(例如3天、5天、l周、1個月或更長)治療。本發(fā)明還涉及通過施用有效量的組織保護(hù)性肽治療損傷后認(rèn)知功能障礙的方法。本文所迷的任何組織保護(hù)性肽都可以用于本發(fā)明的這一方面。此外，本發(fā)明的這一恢復(fù)方面涉及本文所述的任何組織保護(hù)性肽在制備用于恢復(fù)細(xì)胞、組織或器官功能障礙的藥物組合物中的用途，其中在導(dǎo)致這種功能障礙的最初的損傷后開始治療。而且，應(yīng)用本發(fā)明的組織保護(hù)性肽進(jìn)行治療可以在急性期以及慢性期貫穿疾病或病癥的過程。本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可以全身施用，其施用劑量為每次施用約lng至約100i!g/kg體重，優(yōu)選約5-50lag/kg體重，最優(yōu)選約10-30嗎/kg體重。這種有效劑量在施用后足以達(dá)到大于約80、120或160ng/ml血清的組織保護(hù)性肽血清水平。這種血清水平可以在施用后大約l、2、3、4、5、6、7、8、9或10小時后達(dá)到。必要時該劑量可以重復(fù)。例如，只要臨床上需要可以每天重復(fù)給藥，或者在適當(dāng)?shù)拈g隔后給藥，例如每1-12周，優(yōu)選地每l-3周給藥一次。在一個實(shí)施方案中，有效量的組織保護(hù)性肽和藥學(xué)上可接受的載體可以包裝在單劑量瓶或其它容器中。在另外一個實(shí)施方案中，使用能夠發(fā)揮此處所述的活性但是不引起血紅蛋白濃度或紅細(xì)胞壓積增加的組織保護(hù)性肽。在試圖長期提供本發(fā)明的方法的情況下，這種組織保護(hù)性肽是優(yōu)選的。5.4轉(zhuǎn)胞吞作用載體分子和組織保護(hù)性肽本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過施用組合物促進(jìn)組織保護(hù)性肽穿過哺乳動物的內(nèi)皮細(xì)胞屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的方法，該組合物包含與載體肽結(jié)合的組織保護(hù)性肽，該載體肽能夠穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障，例如如上所述的促紅細(xì)胞生成素。體內(nèi)某些器官中內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接對某些分子的進(jìn)入產(chǎn)生屏障。為了治療被屏障的器官內(nèi)的各種病癥，可能需要促進(jìn)組織保護(hù)性肽通過的手段。作為載體分子的組織保護(hù)性肽本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可以作為載體用于遞送其它分子通過血-腦屏障和它們可以穿過的其它類似的屏障。制備含有希望與組織保護(hù)性肽一同穿過屏障的分子的組合物，且該組合物的外周施用導(dǎo)致組合物穿過屏障的轉(zhuǎn)胞吞作用。待轉(zhuǎn)運(yùn)通過屏障的分子與組織保護(hù)性肽之間的結(jié)合可以是不穩(wěn)定的共價鍵，在這種情況下，在穿過屏障后從與組織保護(hù)性肽的結(jié)合中釋放出分子。如果分子的所需藥理學(xué)活性被保持或者不受與組織保護(hù)性肽結(jié)合的影響，則可以施用這種復(fù)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道各種通過共價、非共價和其它方式將分子與本發(fā)明的組織保護(hù)性肽和上述其它試劑結(jié)合的手段。此外，對組合物功效的評價可以在實(shí)驗系統(tǒng)中容易地進(jìn)行。分子與組織保護(hù)性肽的結(jié)合可以利用多種方法實(shí)現(xiàn)，包括不穩(wěn)定的共價結(jié)合、交聯(lián)等?？梢圆捎蒙锼?親和素相互作用；例如，生物素化的本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可以與親和素和希望轉(zhuǎn)運(yùn)的分子的不穩(wěn)定偶聯(lián)物復(fù)合。如上所述，可以通過重組或合成方法制備雜合分子，例如，包括該分子的具有所需藥理活性的結(jié)構(gòu)域和負(fù)責(zé)肽組織保護(hù)性受體活性調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)域的融合或嵌合多肽。該分子中可以包含蛋白酶切割位點(diǎn)。分子可以通過多功能分子即多功能交聯(lián)劑與本發(fā)明的組織保護(hù)性肽偶聯(lián)。本文使用的術(shù)語"多功能分子"包括具有一個可相繼反應(yīng)多次的官能團(tuán)的分子如甲醛，以及具有一個以上的反應(yīng)基的分子。本文^f吏用的術(shù)i吾"反應(yīng)基"是指交聯(lián)劑上的官能團(tuán)，它與分子(例如將要遞送通過內(nèi)皮細(xì)胞屏障的肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸，特別是激素、抗生素、或抗癌劑)上的官能團(tuán)反應(yīng)，由此在交聯(lián)劑和該分子之間形成共價鍵。術(shù)語"官能團(tuán)"保持它在有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)含義。可以使用的多功能分子優(yōu)選是生物相容的連接子，即它們在體內(nèi)不致癌，無毒，并且基本上沒有免疫原性。多功能交聯(lián)劑，例如本領(lǐng)域公知和本文所述的那些，可以在動物模型中容易地檢測以確定其生物相容性。多功能分子優(yōu)選是雙功能的。本文使用的術(shù)語"雙功能分子"是指具有兩個反應(yīng)基的分子。雙功能分子可以是異雙功能或同雙功能的。異雙功能交聯(lián)劑允許矢量偶聯(lián)。特別優(yōu)選的是，多功能分子具有足夠的水溶性，以在水溶液如pH6-8的緩沖水溶液中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，并且生成的偶聯(lián)物保持水溶性，以具有更有效的生物分布。多功能分子一般與氨基或巰基官能團(tuán)共價鍵合。然而，本發(fā)明也涉及對其它官能團(tuán)如羧酸或羥基具有反應(yīng)性的多功能分子。同雙功能分子具有至少兩個反應(yīng)性官能團(tuán)，這些官能團(tuán)是相同的。同型雙功能分子上的反應(yīng)性官能團(tuán)包括，例如，搭基和活性酯基團(tuán)。具有醛基的同型雙功能分子包括，例如戊二醛和subaraldehyde。戊二醛作為交聯(lián)劑的應(yīng)用在Poznansky等人，Science223，1304-1306(1984)中公開。具有至少兩個活性酯單位的同雙功能分子包括二羧酸和N-羥基琥珀酰亞胺的酯。這種N-琥珀酰亞胺酯的實(shí)例包括辛二酸二琥珀酰亞胺酯和二石克-雙-(琥珀酰亞胺丙酸酯)，和它們的可溶性二磺酸和二磺酸鹽，例如它們的鈉鹽和鉀鹽。這些同雙功能試劑可從Pierce，Rockford,Illinois獲得。異雙功能分子具有至少兩個不同的反應(yīng)基。這些反應(yīng)基與不同的官能團(tuán)例如存在于肽和分子上的官能團(tuán)反應(yīng)。與異雙功能交聯(lián)劑上的反應(yīng)基反應(yīng)的兩種不同的官能團(tuán)通常是氨基，例如賴氨酸的s氨基；巰基，例如半胱氨酸上的疏醇基；羧酸，例如天冬氨酸上的羧酸鹽；或羥基，例如絲氨酸上的羥基。當(dāng)然，本發(fā)明的組織保護(hù)性肽中的一些可能沒有可用于某些交聯(lián)劑的適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)基；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員充分了解根據(jù)本發(fā)明組織保護(hù)性肽中可用于交聯(lián)的基團(tuán)來選擇交聯(lián)劑。當(dāng)異雙功能分子的反應(yīng)基與氨基形成共價鍵時，共價鍵通常是酰胺鍵或亞胺鍵。與氨基形成共價鍵的反應(yīng)基可以是，例如，活化的羧基、卣代羰基或酯基。優(yōu)選的卣代羰基是氯羰基。酯基優(yōu)選地是活性酯基團(tuán)，例如N-羥基-琥珀酰亞胺酯基團(tuán)。其它官能團(tuán)一般是疏醇基，能夠轉(zhuǎn)化為疏醇基的基團(tuán)，或與疏醇基形成共價鍵的基團(tuán)。共價鍵通常是疏醚鍵或二疏鍵。與巰基形成共價鍵的反應(yīng)基可以是，例如，與疏醇基反應(yīng)的雙鍵或活化的二疏鍵。含有能與疏醇基反應(yīng)的雙鍵的反應(yīng)基有馬來酰亞氨基，盡管其它反應(yīng)基如丙烯腈也是可能的。反應(yīng)性二疏基可以是，例如，2-吡啶基二疏基或5,5'-二疏代-雙-(2-硝基苯甲酸)基團(tuán)。含有反應(yīng)性二硫鍵的異雙功能試劑的一些例子包括3-(2-吡啶基-二疏代)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(Carlsson,等人，1978,BiochemJ.,173:723-737)、S-4-琥珀酰亞氨基氧羰基-a-甲基千基疏代疏酸鈉和4-琥珀酰亞氨基氧羰基-a-甲基-(2-吡啶基二疏基)甲苯。優(yōu)選3-(2-吡啶基-二硫代)丙酸N-琥珀酰亞胺酯。含有具有與硫醇基反應(yīng)的雙鍵的反應(yīng)基的異雙功能試劑的一些例子包括4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-l-羧酸琥珀酰亞胺酯和間-馬來酰亞氨基苯甲酸珀酰亞胺酯。其它異雙功能分子包括3-(馬來酰亞氨基)丙酸琥珀酰亞胺酯、4-(對-馬來酰亞氨基-苯基)丁酸疏代琥珀酰亞胺酯、4-(N-馬來酰亞氨基甲基-環(huán)己烷)-l-羧酸石克代琥珀酰亞胺酯、馬來酰亞氨基苯甲酰-N-羥基-琥珀酰亞胺酯。優(yōu)選間-馬來酰亞氨基苯甲酸的鈉磺酸鹽。上述多種異雙功能試劑和它們的磺酸鹽可從Pierce化學(xué)品乂>司，Rockford,Illinois,美國獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定是否需要上述偶聯(lián)為可逆的或不穩(wěn)定的。可以在體外檢測偶聯(lián)物的期望的藥理活性。如果偶聯(lián)物保持兩種性質(zhì)(被偶聯(lián)的分子的性質(zhì)和組織保護(hù)性肽的性質(zhì))，則可以在體內(nèi)檢測其適用性。如果被偶聯(lián)的分子需要從組織保護(hù)性肽中分離才具有活性，則優(yōu)選與長效促紅細(xì)胞生成素或長效組織保護(hù)性細(xì)胞因子的不穩(wěn)定鍵或可逆結(jié)合。在體內(nèi)檢測之前也可以利用標(biāo)準(zhǔn)體外方法檢測不穩(wěn)定性。關(guān)于如何制備和使用這些以及其它多功能試劑的其它信息可以從以下出版物或本領(lǐng)域可以獲得的其它文件中獲得Carlsson,J.等人，1978,Biochem.J.173:723-737;Cumber,J.A.等人，1985，MethodsinEnzymology112:207-224;Jue,R.等人，1978,Biochem17:5399-5405;Sun,T.T.等人，1974,Biochem.13:2334-2340;Blattler,W.A.等人，1985,Biochem.24:1517-152;Liu，F(xiàn).T.等人，1979,Biochem.18:690-697;Youle,RJ.和Neville,D.M.Jr.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:5483-5486;Lerner，R.A.等人，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:3403-3407;Jung,S.M.和Moroi,M.,1983,Biochem.Biophys.Acta761:162;Caulfield,M.P.等人，1984,Biochem.81:7772-7776;Staros,J.V.,1982,Biochem.21:3950-3955jYoshitake,S.等人，1979,Eur.J.Biochem.101:395-399;Yoshitake,S.等人，1982,J.Biochem.92:1413-1424;Pilch,P.F.和Czech,M.P.，1979,J.Biol.Chem.254:3375-3381;Novick,D.等人，1987,J.Biol.Chem.262:8483-8487;Lomant,A丄和Fairbanks,G.,1976，J.Mol.Biol.104:243-261;Hamada，H.和Tsuruo,T.,1987,Anal.Biochem.160:483-488;或Hashida,S.等人，1984,J.AppliedBiochem.6:56-63,均在此全文引用作為參考。另外，Means和Feeney,1990,BioconjugateChem.1:2-12綜述了交聯(lián)方法，在此全文引用作為參考。由本發(fā)明的組合物和上述方法穿過的屏障包括但不限于血-腦屏障、血-眼屏障、血-睪丸屏障、血-卵巢屏障、血-神經(jīng)屏障、血-脊髓屏障和血-胎盤屏障。穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的候選分子包括，例如，激素如生長激素、神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗生素、抗病毒藥、或抗真菌藥如通常被大腦和其它被屏障的器官排除的那些、肽放射性藥物、反義藥物、抗體和針對生物活性劑的抗病毒藥、藥物和抗癌劑。這些分子的非限定性實(shí)例包括激素如生長激素、神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子pi(TGFpi)、轉(zhuǎn)化生長因子(32(TGFP2)、轉(zhuǎn)化生長因子(33(TGFP3)、白介素l、白介素2、白介素3和白介素6、AZT、抗肺瘤壞死因子抗體和免疫抑制劑如環(huán)孢菌素。另外，染料或標(biāo)記物可以連接到本發(fā)明的組織保護(hù)性肽上以便為了診斷目的顯示大腦和其它被屏障器官內(nèi)的細(xì)胞、組織或器官。作為例子，用來顯示大腦內(nèi)的斑塊的標(biāo)記物可以連接到組織保護(hù)性肽上，以確定患者的阿爾茨海默病的進(jìn)展。本發(fā)明還涉及組合物，其包含將要通過轉(zhuǎn)胞吞作用通過內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的分子和如上所述的組織保護(hù)性肽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及如上所述的分子和組織保護(hù)性肽細(xì)胞因子的偶聯(lián)物在制備用于穿過如上所述的屏障遞送分子的藥物組合物中的用途。保護(hù)和轉(zhuǎn)胞吞作用的體外測試，用來證明本發(fā)明的組織保護(hù)性肽的有效性。對于轉(zhuǎn)胞吞作用，評價與本發(fā)明的長效促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)的模型蛋白質(zhì)在腸胃外施用后向腦內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。這些在體外模型和動物模型中的測試對本發(fā)明的化合物在其它哺乳動物種包括人類中的功效具有預(yù)測性。參照下面的非限定性實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例作為本式。然而，它們不應(yīng)以任何方式被視為對本發(fā)明范圍的限制。6.實(shí)施例實(shí)施例l:肽合成方法A.肽A(SEQIDNO:32，對應(yīng)于EPO氨基酸序列38-57)和肽B(SEQIDNO:34，對應(yīng)于EPO氨基酸序列58-82)的合成肽A,SEQIDNO:32，和肽B，SEQIDNO:34,是EPO的片段(見表l)，使用"原位中和"Boc化學(xué)分步固相肽合成法合成，該方法在Band,D.，Chopra,N和Kent,S.,"TotalSynthesisofCrambin，"J.AM.CHEM.SOC.2004,126,1377-1383(全文引入作為參考)中描述。簡要地說，在-OCH2-Pam-樹脂(游離"羧基肽")或HSCH2CH2CO-Leu-OCH2-Pam-樹脂("疏酯肽")上合成對應(yīng)于EPO氨基酸序列38-57(肽C，NITVPDTKVNFYAWKRMEVG，SEQIDNO:29)和EPO氨基酸序列58-82(肽D,QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV,SEQIDNO:30)的兩個片段。在合成過程中，對各種氨基酸的側(cè)鏈進(jìn)行如下保護(hù)Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(4-CH3Bzl)或Cys(ACM)、Glu(OcHex)、Lys(2-Cl-Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Tyr(Br-Z)。在肽鏈裝配后，將肽脫保護(hù)，同時通過在0t用含有對-甲酚的無水HF(90:10，v/v)處理l小時從樹脂支持物上切下肽。減壓蒸發(fā)HF后，用冷卻的二乙醚沉淀并研磨粗產(chǎn)物，將肽溶解在含有0.P/oTFA的50。/。乙腈水溶液中，并且用制備型HPLC系統(tǒng)純化。使用LC-MS確i人肽組成。實(shí)施例2.肽介導(dǎo)的組織保護(hù)的確認(rèn)使用坐骨神經(jīng)試驗檢觀'J組織保護(hù)性肽的任何組織保護(hù)活性。用異氟烷(BaxterNPC10019-773-60)和臺面式實(shí)驗室麻醉系統(tǒng)(流量計設(shè)定為2-3升/分鐘，55psi)將Sprague-Dawley大鼠(250-300克)(每組6只，包括對照)麻醉至少3分鐘。然后將大鼠置于恒溫毯上，以確保操作過程中大鼠的體核溫度保持在35-37°C。通過直腸探針監(jiān)測體核溫度。通過四頭肌剝離在腿中部暴露被麻醉大鼠的右側(cè)坐骨神經(jīng)；穿過平行于并覆蓋四頭肌的皮膚用15號手術(shù)刀形成2cm的切口，并且切開四頭肌用解剖剪暴露坐骨神經(jīng)。然后除去坐骨神經(jīng)周圍的膜。2-0號編織絲線(Ethicon,685-G)在神經(jīng)下通過，縫合線的末端通過保持與神經(jīng)垂直的引導(dǎo)器。然后將縫合線的末端與非彈性索系在一起，然后將非彈性索繞在滑輪系統(tǒng)(帶有NYL滑輪的MTD1/4"B(PO號04174-01)，具有穩(wěn)定器)上，并且緩慢釋放連接到非彈性索上的100克重量。將該重量懸掛l分鐘，之后切斷絲線縫合線釋放重量。然后使用1/2cc的胰島素注射器將劑量為289pmol/kg的氨甲?；偌t細(xì)胞生成素、劑量為289pmol/kg的來自系列A-J的一種肽(見表1)或PBS注射到尾靜脈中。用不遵照以上教導(dǎo)的來自色素上皮衍生生長因子(PEDF)的20個氨基酸的片段(對應(yīng)于氨基酸102-121)作為對照。然后閉合肌肉和手術(shù)切口，向大鼠內(nèi)皮下注射5ml乳酸鹽林格溶液。在恢復(fù)過程中使用加熱毯使大鼠的體核溫度保持在35-37。C。在之后4天，將大鼠置于數(shù)字掃描儀掃描表面上的直徑為30cm的丙烯酸管中，測定大鼠的后趾外張。等待5分鐘使其順從后，對大鼠的后足進(jìn)行掃描，清楚地顯示全部5趾。每只大鼠進(jìn)行三次可接受的掃描。通過掃描測量趾伸展(ToeSpread)(第一趾球部與第五趾球部之間的距離)和中間趾伸展(IntermediateToeSpread)(第二趾球部與與第四趾球部的距離)。然后按照S.Erbayraktar等人，2003,ProcNatlAcadSciUSA100,6741-6746(在此全文引用作為參考)所述計算靜態(tài)坐骨神經(jīng)指數(shù)，并且進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。除肽B(SEQIDNO:34)、H(SEQIDNO:47)和PEDF衍生物之外的所有肽具有同樣的保護(hù)性，靜態(tài)坐骨神經(jīng)指數(shù)("SSI")為大約-0.57，與之相比，PBS/PEDF片段的SSI為約-67或約-68(圖2)。圖2還顯示了陽性肽與氨甲?；偌t細(xì)胞生成素相比，其功效即使沒有提高，也至少是相等的。表l還顯示了受試肽的羰基碳之間的大致距離。使用Cheetham等人，1998,Nat.Struct.Biol.5:861-866(引用作為參考)才是供的三維坐標(biāo)計算距離。檢測為組織保護(hù)活性陽性的肽的羰基^5友與羰基^5友之間的距離/間隔介于大約3A與大約5A之間。表L采用體內(nèi)生物測定(坐骨神經(jīng)損傷模型)測定的代表性肽的組織保護(hù)效果<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>實(shí)施例3.組織保護(hù)性肽無紅細(xì)胞生成活性A.體夕卜評價將UT-7epo，人促紅細(xì)胞生成素依賴的白血病細(xì)胞系，用于測定肽的紅細(xì)月包生成能力。UT-7epo細(xì)月包(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ)，目錄號ACC363)在含有10。/。FBS和5ng/ml促紅細(xì)胞生成素的完全RPMI-1640培養(yǎng)基中生長。暴露于促紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞的增殖/存活(=活力增加)應(yīng)答由經(jīng)典的紅細(xì)胞型促紅細(xì)胞生成素受體介導(dǎo)，并且是促紅細(xì)胞生成素-變體刺激經(jīng)典促紅細(xì)胞生成素受體的能力的定量量度。將UT-7epo細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮的含有10。/o供體牛血清、4mML-谷氨酰胺并且補(bǔ)充了5ng/ml重組人促紅細(xì)胞生成素的完全RPMI1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞保持在每瓶含有20ml培養(yǎng)基的75cn^燒瓶中，置于含5。/。C02的37。C潮濕培養(yǎng)箱中48小時。在試驗的第2天，即48小時，將細(xì)胞從燒瓶中轉(zhuǎn)移到50-ml錐形管中，在室溫下以l,000rpm離心5分鐘。棄去上清液，用10ml饑餓培養(yǎng)基(3。/。供體牛血清，4mML-谷氨酰胺)洗滌細(xì)胞兩次。然后將細(xì)胞重懸浮在饑俄培養(yǎng)基中，通過吹吸行為獲得單細(xì)胞懸浮液。用饑餓培養(yǎng)基稀釋重懸浮的細(xì)胞，獲得4x105細(xì)胞/ml的密度，并且以每個25cn^燒瓶10ml的總培養(yǎng)體積鋪盤。培#4小時后，再將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50-ml錐形管中。對照細(xì)胞自始至終用5ng/ml的重組人促紅細(xì)胞生成素保持。用饑餓培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋為200，000細(xì)胞/ml，以IOO^1/孔接種于96孔板上，并且暴露于不同濃度的促紅細(xì)胞生成素、氨甲?；拇偌t細(xì)胞生成素、和肽D,SEQIDNO:30。使用含3。/。血清的RPMI1640培養(yǎng)基中的系列10倍稀釋液產(chǎn)生從0.2pM到20nM的待測化合物的濃度。在進(jìn)一步培養(yǎng)48小時后，向每孔中加入15mlWST-l細(xì)胞增殖試劑溶液(Roche)，并且在C02中37。C培養(yǎng)1小時。混合1分鐘后，用讀板儀讀板(在450nm處的吸光度，減去650nm處的背景吸光度)。肽D在高達(dá)IO,OOOpM的劑量時顯示沒有紅細(xì)胞生成活性(圖3)。優(yōu)選地，該肽在低于1pg/ml的劑量時，更優(yōu)選地在低于10|ng/ml的劑量時，沒有紅細(xì)胞生成活性。B.體內(nèi)評價為了評價組織保護(hù)性肽F(SEQIDNO:33)或肽G(SEQIDNO:40，如上文所述，由螺旋B存在的殘基構(gòu)成的肽)的紅細(xì)胞生成活性，每周三次給雄性SpragueDawley大鼠皮下施用0.8(ig/kg的肽。劑量方案對應(yīng)于以前確定的引起最大紅細(xì)胞生成的EPO等同劑量(基于摩爾)。定期利用自動化分析儀(Keska公司)測定血紅蛋白濃度。在研究過程中，肽B或肽C都不顯示任何紅細(xì)胞壓積增加(圖4;示出了對于等摩爾劑量的EPO的應(yīng)答，用于比較)。對于EPO在3周后觀察到血紅蛋白的減少是由于產(chǎn)生了抗-EPO中和抗體，該抗體引起純紅細(xì)胞再生障礙。相反，肽G或肽F沒有觀察到中和抗體應(yīng)答。實(shí)施例4.肽在體外試驗中具有組織保護(hù)性利用多種體外試驗可以容易地評價肽的組織保護(hù)。例如，利用紅藻氨酸鹽誘導(dǎo)的小鼠運(yùn)動神經(jīng)元死亡可以確定針對于興奮毒性的保護(hù)。如前所述(Siren等人，2001,PNAS98:4044，在此全文引入作為參考)，從15天大的Sprague-Dawley大鼠胚胎中獲得脊髓。前角用胰蛋白酶消化，以300xg通過40/。BSA墊離心10分鐘。將細(xì)胞(代表混合的神經(jīng)元-膠質(zhì)培養(yǎng)物)以2,000個細(xì)胞/cn^的密度接種在用聚-DL鳥氨酸和層祐連蛋白預(yù)包被的24-mm孔培養(yǎng)板中。通過免疫淘選(immunopanning)進(jìn)一步純化運(yùn)動神經(jīng)元，將細(xì)胞以低密度(20,000個細(xì)胞/cm、接種在用聚-DL鳥氨酸和層粘連蛋白預(yù)包被的且含有完全培養(yǎng)基[Neurobasal/B27(2。/。)；0.5mML-谷氨酰胺；2%馬血清；25mM2-巰基乙醇；25mM谷氨酸鹽；1%青霉素和鏈霉素；1ng/mlBDNF]的24-mm孔培養(yǎng)板上。在第4天和第6天向培養(yǎng)物中再添加培養(yǎng)基(不含谷氨酸鹽)。在培養(yǎng)的第6天通過與紅藻氨酸(對于混合的神經(jīng)元-膠質(zhì)培養(yǎng)物為5mM;對于純化的培養(yǎng)物為50mM)培養(yǎng)48小時誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡前72小時向培養(yǎng)物中添加肽D(5ng/mL)或運(yùn)載體。然后棄去培養(yǎng)基，用4%(體積/體積)的多聚甲醛的PBS溶液固定細(xì)胞40分鐘，用0.2。/oTritonX-100通透化處理，用10。/。(體積/體積)FCS的PBS溶液封閉，與抗非磷酸化神經(jīng)微絲抗體(SMI-32;l:9,000)培養(yǎng)過夜，利用親和素-生物素法用二氨基聯(lián)苯胺顯示。通過計數(shù)蓋玻片四邊內(nèi)的SMI-32陽性細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上評價運(yùn)動神經(jīng)元的活力，并且使用H33258進(jìn)行凋亡體的染色。肽D(SEQIDNO:30,對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸58-82)完全保護(hù)運(yùn)動神經(jīng)元避免了紅藻氨酸鹽引起的損傷(圖5)?；蛘撸部梢允褂貌捎眯∈驪19細(xì)胞的試驗測定肽引起的組織保護(hù)，小鼠P19細(xì)胞是神經(jīng)元樣的，在去除血清后通過凋亡而死亡。如以前所述(Siren等人，2001,PNAS98:4044，在此全文引用作為參考)，使用P19克隆P19S1801A1比較肽D(SEQIDNO:30)和EPO的組織保護(hù)。在添加了2mML谷氨酰胺；100單位/ml的青霉素G;100mg/ml的疏酸鏈霉素(GIBCO);10%(體積/體積)FBS(HyClone)并且含有1.2g/LNaHC03和10mMHepes緩沖液的DMEM(下文中稱為完全培養(yǎng)基)中，細(xì)胞保持不分化。無血清培養(yǎng)基含有與以上相同的成分，但是去除了血清，并添加了5mg/ml胰島素；100mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白；20nM孕酮；100mM腐胺；30nMNa2Se03(來自Sigma)。為進(jìn)行實(shí)驗，50%匯合的細(xì)胞用EPO或運(yùn)載體預(yù)處理過夜，用胰蛋白酶解離，用無血清培養(yǎng)基洗滌，并且以104個細(xì)胞/cm2的終密度接種于組織培養(yǎng)瓶中單獨(dú)的或添加有EPO的無血清培養(yǎng)基中。細(xì)胞活力用臺盼藍(lán)排除法和血細(xì)胞計數(shù)儀測定?；谥亓?，肽C,SEQIDNO:29(對應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸38-57)在防止p19細(xì)胞凋亡上比EPO至少強(qiáng)10倍(圖6)。實(shí)施例5.大腦中動^c閉塞模型體重為250-280g的雄性Crl:CD(SD)BR大鼠從CharlesRiver，Calco,意大利獲得。按照Brines等人,2000,PNASUSA97:10526-1053l(在此全文引用作為參考)的教導(dǎo)進(jìn)行手術(shù)。簡言之，用水合氯醛(400mg/kg-bw，腹膜內(nèi))麻醉大鼠，暴露頸動脈，通過兩次縫合阻塞右頸動脈，并切斷?？拷已劭粜纬傻你@孔允許看見大腦中動脈("MCA"),其在鼻動脈的遠(yuǎn)端燒灼。為了圍繞這一固定的MCA損傷產(chǎn)生半暗帶(邊緣帶區(qū))，用精細(xì)鑷通過牽引阻塞對側(cè)頸動脈l小時，然后再次打開。SpmgueDawley大鼠(每組8只)進(jìn)行上述MCAO方案。在阻塞釋放時給大鼠施用PBS、氨甲酰化促紅細(xì)胞生成素(44嗎/kg)或肽D(氨基酸58-82;4.4ng/kg)。另夕卜，對另一組在阻塞后每間隔2小時分4劑施用肽D(氨基酸58-82;4.4|ig/kg)。為了評價損傷，在手術(shù)24小時后，按照以前所述的方案對大鼠進(jìn)行行為測試，或者在通過對腦切片進(jìn)行四唑鹽染色測量損傷體積。圖7A顯示的圖證明了MCAO方案產(chǎn)生的損傷體積。單劑量或多劑量的肽D(SEQIDNO:30)的治療使MCAO手術(shù)所致的損傷體積縮小了大約三分之二這在統(tǒng)計學(xué)上等同于氨甲?；偌t細(xì)胞生成素的組織保護(hù)作用。(b)組織保護(hù)性細(xì)胞因子的治療窗口本實(shí)施例重復(fù)如上所述的MCAO方案。在阻塞步驟后，在頸動脈中建立再循環(huán)后立即(即發(fā)生局部缺血后l小時)給大鼠施用PBS、氨曱?；偌t細(xì)胞生成素(44嗎/kg，靜脈內(nèi))或肽D(SEQIDNO:30)(4.4嗎/kg)。另外，在阻塞后每間隔2小時分4劑施用肽D(SEQIDNO:30)(每次4.4嗎/kg-bw)。(每組8只大鼠)。(c)^亍為測"j:式也按照腳誤(footfault)行為方案測試一組單獨(dú)的大鼠。按照Markgraf等人,1992,BrainResearch575:238-246(在此全文引用作為參考)所述，大鼠在抬高的網(wǎng)格大小為30mm的30cmx30cm不銹鋼網(wǎng)格板上測試。將大鼠置于網(wǎng)格上時，大鼠將試圖來回移動，并且其腳偶然會踩入網(wǎng)格孔中而不是踩在網(wǎng)格上("腳誤")。測量l分鐘內(nèi)的腳誤數(shù)。腳誤(圖7B)。施用多劑量的肽D(SEQIDNO:30)后沒有觀察到明顯的額外的益處。盡管在接受多劑量肽的組中平均腳誤數(shù)較少，但是觀察到的與接受單劑量組的差異不顯著。實(shí)施例6.^唐尿病神經(jīng)病變?nèi)缫郧八?Bianchi等人，2004，ProcNatlAcadSciUSA101,823-828，在此全文引入作為參考)，通過給禁食的大鼠腹膜內(nèi)施用60mg/kg單劑量的鏈脲菌素，在SpragueDawley大鼠(CharlesRiver,Calco,意大利)中諸導(dǎo)糖尿病。血清葡萄糖水平升高到大于每分升300mg(mg。/。)則證實(shí)為糖尿病(正常水平〈100mg%)。然后每周5次用肽D(SEQIDNO:30;4ng/kg)或運(yùn)載體腹膜內(nèi)處理糖尿病動物。誘導(dǎo)糖尿病狀態(tài)2周后，利用尾神經(jīng)測量神經(jīng)傳導(dǎo)速度。如圖8A所示，糖尿病動物顯示尾神經(jīng)傳導(dǎo)速度從大約22m/s(正常)降至大約19m/s。肽D(SEQIDNO:30)的施用伴隨著傳導(dǎo)速率增加至大約23m/s。另外，通過在"熱板"測試中測量爪縮回的時間來定量熱疼痛閾值?？s回等待時間被定義為置于熱板上與后爪縮回舔拭之間的時間。每只動物測試兩次，休息間隔30分鐘。在誘導(dǎo)糖尿病4周后測量后爪熱閾值。肽D(SEQIDNO:30)縮短了糖尿病動物在熱板上的等待時間(圖8B)。實(shí)施例7:保護(hù)坐骨神經(jīng)和腎臟免遭順鉑誘導(dǎo)的損傷如Bianchi等人，2006,ClinCancerRes12:2607-2612(在此全文引入作為參考)所述，給雄性Sprague-Dawley大鼠腹膜內(nèi)施用2mg/kg的順鉑(CDDT),每周兩次，持續(xù)5周。將動物分組，每組6只。在5周的CDDT給藥期間，動物還腹膜內(nèi)接受0.4嗎/kg-bw的肽G(SEQIDNO:40)或PBS，每周三次。對照組接受PBS而不是CDDT。熱板等待時間如以上實(shí)施例6所述確定。接受CDDT和僅接受PBS的動物表現(xiàn)出等待時間比對照組延長即，CDDT與受損的熱敏度有關(guān)。相反，接受肽的動物表現(xiàn)正常的熱板等待時間(圖9A)。用肽處理也防止了CDDT誘導(dǎo)的多尿(圖9B)。具體而言，已經(jīng)接受PBS的動物表現(xiàn)為每日尿量從大約30mL/天顯著增加為大約47mL/天。相反，接受組織保護(hù)性肽的動物與接受PBS而不是CDDT的對照動物沒有顯著差異。實(shí)施例8:防止糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管滲漏組織保護(hù)性肽對高血糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管滲漏的有益效果可以用大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病模型來確定。在該模型中，如Xu等人，2001,InvestOphthal.Vis.Sci42:789-794(在此全文引用作為參考)所述，使用伊文思藍(lán)(Evansblue)測定從血管向組織中的滲漏。伊文思藍(lán)與白蛋白緊密結(jié)合，因此保留在循環(huán)內(nèi)，除非發(fā)生血管壁滲漏，如無法控制的糖尿病所致。在該模型中，禁食的雄性Sprague-Dawley大鼠接受單劑量的鏈脲霉素(60mg.kg，腹膜內(nèi))。兩天后，在證實(shí)發(fā)展為糖尿病后(空腹血清葡萄糖大于300mg%)，將動物分為6只動物一組，以及不接受鏈脲菌素的對照組。！^兩個糖尿病組腹膜內(nèi)施用4嗎.kg的肽D(SEQIDNO:30)，每周5天，或者按照相同的日程施用PBS。在不受控的糖尿病發(fā)生3周后，將動物麻醉并且靜脈內(nèi)施用伊文思藍(lán)染料(30mg/kg),允許該染料循環(huán)2小時。然后利用心臟穿刺給動物灌注PBS,直到流出液澄清，然后施用4%多聚甲醛。然后取下眼睛，從眼球上小心地剝下視網(wǎng)膜。將視網(wǎng)膜在甲酰胺中于80。C培養(yǎng)18小時測定視網(wǎng)膜的伊文思藍(lán)含量。然后去除上清液，保存用于分析，將視網(wǎng)膜完全干燥并稱重。上清液中的伊文思藍(lán)濃度用分光光度計測定，并且建立溶解在甲酰胺中的伊文思藍(lán)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如困10所見，接受肽D(SEQIDNO:30)給藥的動物與對照組相比，視網(wǎng)膜內(nèi)伊文思藍(lán)染料沒有增多。相反，只接受PBS的糖尿病動物顯示視網(wǎng)膜伊文思藍(lán)含量增加，表明血管滲漏已經(jīng)發(fā)生。實(shí)施例9:防止急性腎衰竭組織保護(hù)性肽對于防止局部缺血情況下的腎臟損傷也是有效的。將成年雄性Wistar大鼠麻醉，在腹部形成切口，以顯示兩條腎動Ji^。利用無創(chuàng)血管鉗壓迫兩條動脈60分鐘，完全停止腎血流。然后去掉血管鉗恢復(fù)循環(huán)，并靜脈內(nèi)施用290pmol/kg-bw的肽F(SEQIDNO:33)或肽G(SEQIDNO:40)。另外一個局部缺血組只靜I^內(nèi)施用PBS。再灌注72小時后，將動物麻醉，利用多聚甲醛進(jìn)行灌注-固定。將固定的動物徑向?qū)Π肭虚_，并在室溫下浸沒在10%甲醛中進(jìn)一步固定一天。腎臟的組織學(xué)評價按照Sharpies等人，2005,JAmerSocNephrol:15:2115(全文引用作為參考)的方案進(jìn)行。簡言之，在用梯度乙醇脫水后，將腎片包埋在石蠟中，切成5微米的切片，并固定在載玻片上。載玻片上的切片用二甲苯脫蠟，用蘇木精和伊紅復(fù)染，在光學(xué)顯微鏡下檢查。每個腎檢查100個視野，對每個腎小管分布給予0-3的得分0，組織學(xué)正常；1，腎小管細(xì)胞膨脹，刷狀緣丟失，核凝縮，核損失可達(dá)三分之一；2,類似于得分l，但是多于三分之一，少于三分之二的腎小管顯示核損失；3，多于三分之二的腎小管顯示核損失。將所有得分加起來計算每個腎的組織學(xué)得分，最大得分為300。肽F(SEQIDNO:33)或肽G(SEQIDNO:40)的施用對照組相比伴隨著損傷得分的顯著減少(p〈0.05)。實(shí)施例ll.組織保護(hù)性肽在腦型癥中的功效按照Kaiser等人，2006,J.Infect.Dis.193:987-995(在此全文引用作為參考)所述建立腦型癥嚙齒動物模型。7周齡的雌性CBA/J小鼠按每組20只動物分組。每組通過腹膜內(nèi)施用劑量為10^PbA感染的紅細(xì)胞用伯氏癥原蟲(尸/oswo^MW6erg/2ez'爿"&,PbA)進(jìn)行感染。小鼠在第4、5、6天接受腹膜內(nèi)注射的劑量為2.6pg/kg的PBS或肽F(SEQIDNO:33)。在追蹤觀察中收集臨床狀態(tài)和血涂片的數(shù)據(jù)(終點(diǎn)為30天)。按照Kaplan-Meier法計算累積長期存活率，并且用時序檢驗法(logranktest)比較各組。存活時間是從變量。p-值O.05被認(rèn)為具有顯著性。如圖12所示，對照組(鹽水)的所有小鼠到第8天都死亡。相反，接受肽F(SEQIDNO:33)的小鼠顯示延長的存活期，使用時序檢驗法，與對照組相比有顯著差異(p〈0.005)。實(shí)施例12:組織保護(hù)性肽在鼠EAE模型中的功效按照Savino等人，2006,JNeuroimmunol172:27-37(在此全文引入作為參考)所述，在C57BL/6雌性小鼠(6-8周齡)中誘發(fā)實(shí)驗性自身免疫性腦脊髓炎("EAE")。通過在脅部用總量為200pg的MOG35-55(MultiplePeptideSystems,SanDiego,CA，美國)皮下免疫來誘導(dǎo)EAE,所述MOG35-55置于補(bǔ)充了8mg/ml結(jié)核分枝桿菌(H37RA抹；Difco,Detroit,MI,美國)的不完全弗氏佐劑(Sigma,St.Louis,MO，美國)中。將動物飼養(yǎng)在無特定病原體的條件下，使它們自由獲取食物和水。小鼠在免疫時和48小時后靜脈內(nèi)接受500ng的百日咳毒素(Sigma)。每天記錄體重和臨床得分(0=健康，1=尾巴松弛，2=共濟(jì)失調(diào)、和/或后肢輕癱、或慢翻正反射、28C，3=后肢麻痹和/或前肢輕癱，4=前肢下肢輕癱，5=垂死或死亡)。食物丸和飲用水置于籠底的Petri皿中，以使病鼠能夠食用和飲用。從免疫后第4天開始，每天皮下施用劑量為4.4mg/kg-bw的肽E(SEQIDNO:31)。肽E(SEQIDNO:31)的施用顯著縮短了被治療動物中AEA的時程并且減輕了其臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度(p<0.01)(圖13)。本發(fā)明的范圍不受所述具體實(shí)施方案的限制，這些實(shí)施方案旨在作為本發(fā)明的各個方面的單一說明，功能上等同的方法和組分也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，基于上述描述和附圖，除了本文所顯示和描述的，本發(fā)明的各種改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。這些改變預(yù)期落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage97</formula>權(quán)利要求1.分離的多肽，由不超過30個氨基酸的序列組成，并且包含以下氨基酸基序:(a)H1-N1-(X)n-N2-H2，其中，n為0-5；(b)H1-N1-(X)n-N2-L1，其中，n為0-5；或者(c)L1-N1-(X)n-N2-H1，其中n為0-5；并且其中H1和H2為疏水性氨基酸，N1和N2為帶負(fù)電荷的氨基酸，X為任意氨基酸，L1為極性氨基酸；并且其中所述多肽在應(yīng)答性細(xì)胞、組織或器官中具有細(xì)胞保護(hù)活性。2.分離的多肽，由不超過30個氨基酸的序列組成，并且包含以下氨基酸基序(a)H廣N廣(L)n-P廣H2，其中n為0-l;或者(b)H廣Pr(LVNrH2，其中n為0-l;并且其中I^和H2為疏水性氨基酸，Ni為帶負(fù)電荷的氨基酸，L!為極性氨基酸，P!為帶正電荷的氨基酸；并且其中所述多肽在應(yīng)答性細(xì)胞、組織或器官中具有細(xì)胞保護(hù)活性。3.分離的多肽，包含(i)與和所述多肽具有相同數(shù)目氨基酸殘基的SEQIDNO:l的任意部分具有少于90%的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)以下氨基酸基序(a)H廣Nr(X)n-N2-H2，其中n為0國5;(b)H廣N廣(X)n-N2-I^，其中n為0-5;或者(c)L廣Nr(X)n-N2-Hi,其中n為0-5;并且其中H!和H2為疏水性氨基酸，Ni和N2為帶負(fù)電荷的氨基酸，X為任意氨基酸，L,為極性氨基酸；并且其中所述多肽在應(yīng)答性細(xì)胞、組織或器官中具有細(xì)胞保護(hù)活性。4.分離的多肽，包含(i)與和所述多肽具有相同數(shù)目氨基酸殘基的SEQIDNO:l的任意部分具有不到90%的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)以下氨基酸基序(a)H廣N廣(L)n-P廣H2，其中n為0-l;或(b)H廣P廣(L)n-NrH2，其中n為0陽l;并且其中H,和H2為疏水性氨基酸，Ni為帶負(fù)電荷的氨基酸，"為極性氨基酸，Pi為帶正電荷的氨基酸；并且其中所述多肽在應(yīng)答性細(xì)胞、組織或器官中具有細(xì)胞保護(hù)活性。5.權(quán)利要求1或3的分離的多肽，其中所述多肽的三級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的Ni和N2之間的距離為大約3A至大約5A。6.權(quán)利要求5的分離的多肽，其中所述距離為大約4A至大約5A。7.權(quán)利要求6的分離的多肽，其中所述距離為大約4.4A至大約4.8A。8.權(quán)利要求2或4的分離的多肽，其中所述多肽的三級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的N!和P2之間的距離為大約3A至大約5A。9.權(quán)利要求8的分離的多肽，其中所述距離為大約4A至大約5A。10.權(quán)利要求9的分離的多肽，其中所述距離為大約4.4A至大約4.8A。11.分離的多肽，由不超過30個氨基酸的序列組成，并且包含以下氨基酸基序(a)HiNjNA;(b)H,順2Li;或(c)L晶N諷，該基序是由于所述多肽的三級結(jié)構(gòu)而形成的，使得N,和N2的羰基碳之間的距離為大約3A至大約5A，其中H!和H2為疏水性氨基酸，N!和N2為帶負(fù)電荷的氨基酸，U為極性氨基酸；并且其中所述多肽在應(yīng)答性細(xì)胞、組織或器官中具有細(xì)胞保護(hù)活性。12.分離的多肽，由不超過30個氨基酸的序列組成，并且包含以下氨基酸基序(a)H!N!(L)nP,H2，其中n為O-l;或(b)H^(L)nNiH2，其中n為O-l;該基序是由于所迷多肽的三級結(jié)構(gòu)而形成的，使得N!和P2的羰基^5炭之間的距離為大約3A至大約5A，其中Hi和H2為疏水性氨基酸，Nt為帶負(fù)電荷的氨基酸，Li為極性氨基酸，Pi為帶正電荷的氨基酸；并且其中所述多肽在應(yīng)答性細(xì)胞、組織或器官中具有細(xì)胞保護(hù)活性。13.分離的多肽，其包含(i)與和所述多肽具有相同數(shù)目氨基酸殘基的SEQIDNO:l的任意部分具有不到90%的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)以下氨基酸基序(a)H晶N2H2;(b)HN亂??；或(c)"順諷，該基序是由于所述多肽的三級結(jié)構(gòu)而形成的，使得N!和N2的羰基碳之間的距離為大約3A至大約5A,其中H,和H2為疏水性氨基酸，N,和N2為帶負(fù)電荷的氨基酸，1^為極性氨基酸；并且其中所述多肽在應(yīng)答性細(xì)胞、組織或器官中具有細(xì)胞保護(hù)活性。14.分離的多肽，其包含(i)與和所述多肽具有相同數(shù)目氨基酸殘基的SEQIDNO:l的任意部分具有不到90%的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)以下氨基酸基序(a)H,N《L卿2，其中n為0-l;或(b)H^(L)nN,H2，其中n為0-l;該基序是由于所述多肽的三級結(jié)構(gòu)而形成的，使得N和P2的羰基碳之間的距離為大約3A至大約5A，其中Ht和H2為疏水性氨基酸，^為帶負(fù)電荷的氨基酸，"為極性氨基酸，P!為帶正電荷的氨基酸；并且其中所述多肽在應(yīng)答性細(xì)胞、組織或器官中具有細(xì)胞保護(hù)活性。15.權(quán)利要求l、3和5-7中任意一項的分離的多肽，其中所述氨基酸基序為(a)，并且其中H!和H2為相同的疏水性氨基酸。16.權(quán)利要求11或13的分離的多肽，其中所述氨基酸基序為(a)，并且其中Hi和H2為相同的疏水性氨基酸。17.權(quán)利要求l、3和5-7中任意一項的分離的多肽，其中所述氨基酸基序為(a),并且其中Hi和H2為不同的疏水性氨基酸。18.權(quán)利要求11或13的分離的多肽，其中所述氨基酸基序為(a)，并且其中&和H2為不同的疏水性氨基酸。19.權(quán)利要求2、4和8-10中任意一項的分離的多肽，其中所述氨基酸基序為(a)或(b)，并且其中Hi和H2為相同的疏水性氨基酸。20.權(quán)利要求12或14的分離的多肽，其中所述氨基酸基序為(a)或(b)，并且其中H,和H2為相同的疏水性氨基酸。21.權(quán)利要求2、4和8-10中任意一項的分離的多肽，其中所述氨基酸基序為(a)或(b)，并且其中&和H2為不同的疏水性氨基酸。22.權(quán)利要求12或14的分離的多肽，其中所述氨基酸基序為(a)或(b)，并且其中H!和H2為不同的疏水性氨基酸。23.權(quán)利要求l、3和5-7中任意一項的分離的多肽，其中所述氨基酸基序為(a)、(b)或(c)，并且其中N!和N2為相同的帶負(fù)電荷的氨基酸。24.權(quán)利要求11或13的分離的多肽，其中所述氨基酸基序為(a)、(b)或(c)，并且其中N!和N2為相同的帶負(fù)電荷的氨基酸。25.權(quán)利要求l、3和5-7中任意一項的分離的多肽，其中所述氨基酸基序為(a)、(b)或(c)，并且其中N!和N2為不同的帶負(fù)電荷的氨基酸。26.權(quán)利要求11或13的分離的多肽，其中所述氨基酸基序為(a)、(b)或(c),并且其中1S^和N2為不同的帶負(fù)電荷的氨基酸。27.權(quán)利要求l-26中任意一項的分離的多肽，其中所述肽由I型細(xì)胞因子書f生而來。28.權(quán)利要^27的分離的多肽，其中該I型細(xì)胞因子是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白介素-3、血小板生成素、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子或白血病抑制因子。29.權(quán)利要求l-28中任意一項的分離的多肽，其中所述多肽進(jìn)一步包含至少另外一種下列氨基酸基序(a)H廣N廣(X)n-N2-H2，其中n為0-5;(b)H廣N廣(X)n-N2-L,，其中n為0-5;(c)L廣N廣(X)n-N2-Hb其中n為0-5;(d)H廣Nr(L)n匿P廣H2，其中n為0-l;(e)H廣P廣(L)n-N廣H2，其中n為0畫l;(f)顯美H2;(g)H顯2";(h)L,諷；(i)賜(L)nP凡,其中n為0-1;或G)柳L諷H2，其中n為0-l;其中基序(f)、(g)或(h)是由于所述多肽的三級結(jié)構(gòu)而形成的，使得Ni和N2的羰基^5友之間的距離為大約3A至大約5A;其中基序(i)或(j)是由于所述多肽的三級結(jié)構(gòu)而形成的，使得N!和P2的羰^炭之間的距離為大約3A至大約5A;且其中H!和H2為疏水性氨基酸，N,和N2為帶負(fù)電荷的氨基酸，X為任意氨基酸，L!為極性氨基酸，且Pi為帶正電荷的氨基酸。30.權(quán)利要,it29的分離的多肽，其中至少兩種所述基序是不同的。31.權(quán)利要求l-29中任意一項的分離的多肽，其中所述多肽是進(jìn)一步包含兩親性肽螺旋的嵌合肽。32.權(quán)利要求31的分離的多肽，其中所述兩親性肽螺旋包含氨基酸序列ALSILVLLQAGS(SEQIDNO:48);VALLPCPPCRA(SEQIDNO:49);NAIIKNAYKKG(SEQIDNO:50);GSWQRSLQDTE(SEQIDNO:51);GGSAARPAPP(SEQIDNO:52);NALAENDTPYY(SEQIDNO:53);GALAEAYPSKP(SEQIDN0.54);GCSSQHWSYGL(SEQIDNO:55);VMIVMLAICFL(SEQIDNO:56);LRRYINMLTRP(SEQIDNO:28);或LALSILVLYQA(SEQIDNO:57)。33.權(quán)利要求l-30中任意一項的分離的多肽，其中所述多肽不增加接受者中的血紅蛋白。34.權(quán)利要求1-31中任意一項的分離的多肽，其中所述細(xì)胞保護(hù)活性保護(hù)、維持、增強(qiáng)或恢復(fù)所述細(xì)胞、組織或器官的功能和/或存活力。35.權(quán)利要求l-32中任意一項的分離的多肽，其中所述多肽在神經(jīng)元、骨、眼、脂肪、結(jié)締組織、毛發(fā)、牙齒、粘膜、胰、內(nèi)分泌、耳、上皮、皮膚、肌肉、心臟、肺、肝、腎、腸、腎上腺、毛細(xì)血管、內(nèi)皮、睪丸、卵巢或子宮內(nèi)膜細(xì)胞或組織中具有細(xì)胞保護(hù)活性。36.權(quán)利要求l-32中任意一項的分離的多肽，其中所述多肽在干細(xì)胞中具有細(xì)胞保護(hù)活性。37.權(quán)利要求l-32中任意一項的分離的多肽，其中所述多肽在可興奮組織中具有細(xì)胞保護(hù)活性。38.權(quán)利要求35的分離的肽，其中所述可興奮組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織、周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織、心臟組織或#見網(wǎng)膜組織。39.權(quán)利要求l-36中任意一項的分離的肽，其中所述肽能夠穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障。40.權(quán)利要,jt37的分離的肽，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞屏障包括血-腦屏障、血-眼屏障、血-睪丸屏障、血-卵巢屏障、血-神經(jīng)屏障或血-脊髓屏障。41.包含權(quán)利要求1-38中任意一項的分離的多肽和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。42.權(quán)利要求39的藥物組合物，其中所述組合物配制用于口服、鼻內(nèi)、經(jīng)眼、吸入、經(jīng)皮、經(jīng)直腸、舌下或腸胃外給藥。43.權(quán)利要求39的藥物組合物，其中所述組合物配制為灌注液。44.保護(hù)、維持或增強(qiáng)從哺乳動物體內(nèi)分離的應(yīng)答性細(xì)胞、組織或器官的活力的方法，包括將所述細(xì)胞、組織或器官暴露于藥物組合物，包括將所述細(xì)胞、組織或器官暴露于;^又利要求39、40或41的藥物組合物。45.權(quán)利要求l-38中任意一項的分離的肽在制備用于在需要的受試者中保護(hù)和/或預(yù)防組織損傷、用于恢復(fù)或用于復(fù)原組織和/或組織功能的藥物組合物中的用途。46.權(quán)利要求l-38中任意一項的分離的肽在制備用于在需要的受試者中預(yù)防、治療性處理或預(yù)防性處理心血管疾病、心肺疾病、呼吸性疾病、腎臟疾病、泌尿系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病、骨病、皮膚病、胃腸疾病、內(nèi)分泌異常、代謝異常、認(rèn)知功能障礙、或中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或障礙的藥物組合物中的用途。47.權(quán)利要求43或44的用途，其中所述受試者是哺乳動物。48.權(quán)利要求45的用途，其中所述哺乳動物是人。49.促進(jìn)分子通過有此需要的受試者的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)胞吞的方法，包括給所述受試者施用包含與權(quán)利要求l-38中任意一項的分離的肽結(jié)合的所述分子的組合物。50.權(quán)利要求47的方法，其中所述結(jié)合是與所述分子的結(jié)合位點(diǎn)的不穩(wěn)定的共價鍵、穩(wěn)定的共價鍵、或非共價結(jié)合。51.包含編碼權(quán)利要求l-38中任意一項的分離的肽的核苷酸序列的分離的核酸。52.包含權(quán)利要求49的核酸的載體。53.權(quán)利要求50的載體，該載體是表達(dá)載體。54.含有權(quán)利要求51的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。55.重組制備權(quán)利要求l-38中任意一項的分離的肽的方法，所述方法包括i)在適合表達(dá)所述肽的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng);f又利要求52的宿主細(xì)胞，和ii)從所述培養(yǎng)基中回收和分離所述肽。56.權(quán)利要求2的分離的肽，其中所述肽包含氨基酸序列肽A(APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE,SEQIDNO:32)、肽C(NITVPDTKVNFYAWKRMEVG,SEQIDNO:29)、肽D(QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV,SEQIDNO:30)、肽E(GCAEHCSLNENITVPDTKVN,SEQIDNO:31)、肽F(RYLLUNITTGC,SEQIDNO:33)、肽G(QEQLERALNSS，SEQIDNO:40)、肽I(CSLNENIQEQLERALNSS,SEQIDNO:43)、肽J(QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR,SEQIDNO:41)、肽K(WEHVNAIQEARRLL,SEQIDNO:35)或肽L(KIRSDLTALTESYVKH,SEQIDNO:37)。57.權(quán)利要求l-38中任意一項的分離的肽，其中所述至少一種細(xì)胞保護(hù)活性是神經(jīng)保護(hù)，該活性利用方法在體外評價，該方法包括(a)將原代海馬神經(jīng)元的待測培養(yǎng)物與N-甲基-D-天冬氨酸和所述肽接角蟲^牙口(b)在所述接觸后48小時測定細(xì)胞活力，使得如果在步驟(b)中測定的細(xì)胞活力大于不含所述肽的對照培養(yǎng)物的細(xì)胞活力，則該肽具有細(xì)胞保護(hù)活性。全文摘要本發(fā)明涉及新的組織保護(hù)性肽。本發(fā)明的組織保護(hù)性肽可以與組織保護(hù)性受體復(fù)合物結(jié)合。特別地，本發(fā)明涉及來源于細(xì)胞因子受體配體(包括促紅細(xì)胞生成素(EPO))的部分或與該部分具有共有序列的組織保護(hù)性肽，所述部分不參與配體與受體復(fù)合物的結(jié)合，例如與EPO受體同二聚體的結(jié)合。相應(yīng)地，本發(fā)明的組織保護(hù)性肽來源于細(xì)胞因子受體配體的區(qū)域的氨基酸序列，這些序列通常位于與受體復(fù)合物相對的配體蛋白質(zhì)區(qū)域之上或之內(nèi)，即，通常來源于當(dāng)配體與受體結(jié)合時背向該受體復(fù)合物的配體蛋白質(zhì)區(qū)域的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于工程構(gòu)建合成性組織保護(hù)性肽的共有序列。這些組織保護(hù)性肽也包括設(shè)計為模擬組織保護(hù)性受體配體(例如EPO)內(nèi)關(guān)鍵氨基酸殘基的空間位置的片段、嵌合體以及肽。本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的組織保護(hù)性肽治療或預(yù)防疾病或障礙的方法。本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的組織保護(hù)性肽增強(qiáng)可興奮組織功能的方法。文檔編號A61K38/00GK101378772SQ200680034824公開日2009年3月4日申請日期2006年8月7日優(yōu)先權(quán)日2005年8月5日發(fā)明者安東尼·賽拉米,托馬斯·科爾曼,邁克爾·布萊尼申請人:阿拉伊姆藥品公司