專利名稱：使用脈沖的電磁場治療來調(diào)節(jié)骨軟骨發(fā)育的方法
使用脈沖的電磁場治療來調(diào)節(jié)骨軟骨發(fā)育的方法 相關(guān)申請的交叉應(yīng)用本申請要求2005年6月3日提交的美國臨時專利申請 60/687,430、 2005年6月23日提交的美國臨時專利申請60/693,490、 2006年3月15日提交的美國臨時專利申請60/782,462和2006年4月 7日提交的美國臨時專利申請60/790,128的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
與骨和軟骨相關(guān)聯(lián)的疾病和損傷對人群有很大的影響。單在美國 每年發(fā)生約5百萬次的骨折。這些中的約10%延遲愈合，并且在這些 中，150,000到200,000個不連合的骨折發(fā)生伴隨有喪失生產(chǎn)力和獨立 能力。在軟骨的情況下，嚴(yán)重的慢性形式的膝關(guān)節(jié)軟骨損害會導(dǎo)致關(guān) 節(jié)軟骨的更大的惡化，并且可能最終導(dǎo)致整膝關(guān)節(jié)的更換。每年，進 行約200,000個整膝關(guān)節(jié)更換手術(shù)，人工關(guān)節(jié)一般僅僅維持10-15年， 導(dǎo)致類似的喪失生產(chǎn)力和獨立能力。而且，就作為對于約4400萬美國人的主要公共健康威脅的骨質(zhì) 疏松癥的發(fā)生率方面看來，骨折的發(fā)生率也預(yù)期保持較高。今天，在 美國，估計1000萬個人已經(jīng)有這種疾病，并且估計幾乎超過3400萬 人具有低骨量，這使他們具有增加的骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險。在超過50 歲的人群中，兩個女性中就有一人、四個男性中就有一人在他們的余 生中發(fā)生與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)聯(lián)的骨折。骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致每年超過150 萬的骨折，包括300,000髖部骨折；700,000脊推骨折；250,000腕 骨骨折；以及300,000其它位置的骨折。用于骨質(zhì)疏松的髖部骨折的 估計全國直接費用(醫(yī)院和療養(yǎng)院)在2002年為180億美元(全國 骨質(zhì)疏松癥基金會年報，2002 )。當(dāng)前可以獲得幾種治療方法來治療頑固性骨折，諸如內(nèi)部和外部固定；骨移植或者移植代用品，包括去除礦物質(zhì)的骨基質(zhì)、血小板提取物和骨基質(zhì)蛋白質(zhì)；以及生物物理刺激，諸如通過外部固定器或者超聲波和電磁場而施加的機械應(yīng)力。類似地，軟骨損傷的典型治療根據(jù)損傷和癥狀的嚴(yán)重性有休養(yǎng)和 其它的保守治療、用于整理和平滑被損壞的軟骨區(qū)域表面的小型關(guān)節(jié) 內(nèi)窺鏡檢查手術(shù)和其它的外科療法，諸如微裂縫、鉆孔和研磨。所有 這些都可以減輕癥狀，但是其益處通常僅僅是暫時的，特別是當(dāng)人的 損傷前的活動水平保持不變時。骨和諸如軟骨等其它組織以生理上有益的方式來響應(yīng)電信號。被應(yīng)用到不連合部分和延遲連合部分的生物電刺激裝置在十九世紀(jì)60 年代首次形成，現(xiàn)在被應(yīng)用到骨和軟骨(Ciombor and Aaron， F卯, 爿rtA:/e C7/". 2005， (4): 579-93 )。當(dāng)前，它們已經(jīng)形成了市場并且在臨 床實踐中的角色已被全面接受。歸因于生物電刺激的不太公知的結(jié)果 是正的骨密度變化(Tabrah， 1990)和骨質(zhì)疏+》癥的預(yù)防(Chang， 2003 )。近來的報告提供了附加的證據(jù)用脈沖電磁場(PEMF)的 刺激大大地加速在牽拉骨生成期間形成骨(Fredericks, 2003)。當(dāng)前，用于骨修復(fù)的電療的臨床使用包括直接地植入到修復(fù)位置 的電極或者非侵入性電容或者電感耦合。經(jīng)由放置在骨修復(fù)位置的目 標(biāo)組織中的一個電極(陰極)和放置在軟組織中的陽極來施加直流 (DC) 。 5-100pA的DC電流足以刺激骨生成。所述電容耦合技術(shù)寸吏 用位于骨折位置的相對側(cè)上的外部皮膚電極。20-200Hz的正弦波通常 用于在修復(fù)位置中獲得l-100mV/cm的電場。電感耦合(PEMF)技術(shù)通過經(jīng)由一個或者兩個電線圏施加時變 的磁場而獲得時變的電場。感應(yīng)電場作為觸發(fā)機構(gòu)，其調(diào)節(jié)由許多生 長因素介導(dǎo)的骨修復(fù)的分子調(diào)節(jié)的正常過程。Bassett等人首先報告 PEMF信號可以使犬齒中的骨修復(fù)加速150%。骨修復(fù)的實驗?zāi)Ｐ惋@ 示使用直流增強了細胞增殖、鈣化和提高了機械強度。這樣的方法也 存在有造成軟骨損傷的可能。受傷的組織相對于正常組織具有電勢。在受傷位置測量的電信號(被稱為"損傷電勢"或者"損傷電流")僅僅是DCC(直流)，其隨著 時間緩慢地改變。骨折修復(fù)和神經(jīng)再生電勢變化一般在負(fù)電極附近比 通常要快，但是在正電極附近(在一些情況下，可能發(fā)生組織萎縮或 者壞死)比通常要慢。為此，大多數(shù)近來的研究著重于更高的頻率、 更復(fù)雜的信號(經(jīng)常不具有凈直流分量)。不幸的是，現(xiàn)在可以獲得的大多數(shù)電子治療裝置依賴于直接植入 電極或者整個電子儀器組件，或者依賴于穿過皮膚的電感耦合，其使 用產(chǎn)生時變磁場的線圏，由此在身體組織內(nèi)感應(yīng)弱的渦電流，這不能 有效地將所迷信號提供到組織，因此除了體積大的線閨之外，還需要 較大的信號發(fā)生器和電池組。在一方面需要手術(shù)和生物相容的材料以 及在另一方面要求過大的電路復(fù)雜性和輸入功率，這已經(jīng)使大多數(shù)這 樣的裝置的價格較高，并且也將這樣的裝置的使用局限于受過高度訓(xùn) 練的人員。因此，仍然需要通用的、成本低廉的裝置，其可以用于提 供生物電刺激以不同地調(diào)節(jié)骨軟骨組織的生長，以促進適當(dāng)?shù)纳L和 愈合。發(fā)明內(nèi)容按照本發(fā)明的主要方面，并且廣義而言，本發(fā)明提供了一種用于 通過對正在生長的或者受損傷的骨或者軟骨組織施加電信號來調(diào)節(jié) 例如骨組織或者軟骨的生長或者修復(fù)的方法。本發(fā)明通過實現(xiàn)生物電信號的提供而克服了現(xiàn)有技術(shù)裝置和方 法的缺點，所述生物電信號被優(yōu)化為對應(yīng)于自然身體信號的所選特 征，導(dǎo)致加速的且更持久的愈合。在此所述的信號與自然信號的所選 特征一致，因此按照本發(fā)明的進行電刺激的組織經(jīng)受最小的生理應(yīng) 力。另外，本發(fā)明是非侵入性的且成本低廉的，這使得可以期望對人 的多個應(yīng)用和單獨使用。而且，本方法提供了電刺激，其中，電信號 接近地模仿自然人體信號的所選特性。被刺激的組織因此受到最小的 應(yīng)力，大大促進了生長和修復(fù)。與傳統(tǒng)的TENS類型的裝置(其旨在阻斷神經(jīng)系統(tǒng)中的疼痛沖動)相反，用于本發(fā)明方法的裝置以低于正常人的疼痛感覺的閾值電 平的刺激電平來操作，因此，大多數(shù)用戶在用于修復(fù)或者促進骨的生 長的治療期間沒有任何感覺。在此所述的技術(shù)使用一類波形，其中一些是新的，其它的有已知 當(dāng)通過感應(yīng)線圏被應(yīng)用時對組織具有正生理效應(yīng)的，但是直到如今還 沒有顯示通過電極具有正生理效應(yīng)。雖然對于骨質(zhì)疏松癥治療當(dāng)前沒有批準(zhǔn)任何商業(yè)的生物電裝置， 但是本發(fā)明提供了一種有前途的候選者。如在此所示，可以有益地在 宏觀的水平(即普通的骨折)以及微觀的水平(即成骨細胞發(fā)育)上應(yīng)用獨特的脈沖電磁場(PEMF)波形模式。本發(fā)明的某些實施方案 將期望的PEMF波形的用途和應(yīng)用最大化例如，脊推骨、髖部和/ 或手腕是骨質(zhì)疏松骨折的最普通的位置，對于這樣類型的骨折，發(fā)明 人提供了簡單的、自粘的皮膚接觸電極片來作為電治療遞送栽體。這 樣的電極片的使用導(dǎo)致改善了在這樣的關(guān)鍵解剖位置的骨量。在微觀 水平上，本發(fā)明人已經(jīng)識別了優(yōu)化成骨細胞發(fā)育的特定PEMF波形和 頻率。如在示例中更詳細地所述(參見實施例l)，發(fā)明人證明了 PEMF信號增強了成骨細胞礦化和基質(zhì)產(chǎn)生，并且所述信號也賦予了結(jié)構(gòu)特 征。本發(fā)明人也表明其它的PEMF信號增強了細胞增殖和伴隨地增加 了骨形態(tài)形成蛋白質(zhì)(BMP)。雖然可以在本發(fā)明中使用脈沖段和連 續(xù)的電信號，但是連續(xù)而不是脈沖段的信號的施加對增殖和礦化提供 了更顯著的影響。本發(fā)明的電信號可以用于促進諸如骨和軟骨等結(jié)構(gòu)組織的修復(fù) 和生長。但是，這樣的系統(tǒng)和方法不必被限制為用于完整的有機體， 因為電子治療波形也可以影響分離的細胞或者組織培養(yǎng)(已經(jīng)觀察到 適當(dāng)?shù)碾姶碳ふ{(diào)節(jié)細胞新陳代謝、分泌和復(fù)制的速度)。電信號一般 可應(yīng)用到其它的結(jié)締組織，諸如皮膚、韌帶、腱等。在此所述的電信 號可以用于刺激其它的組織，以提高組織的修復(fù)并且促進組織的生長 以用于移植目的。例如，可以在適當(dāng)?shù)纳L介質(zhì)中使用本發(fā)明的裝置 和波形來治療分離的皮膚細胞，以提高在制備組織培養(yǎng)的、自生的皮膚移植材料中的細胞增殖和分化。以類似的方式，這些生物電信號可 以被直接地施加到受傷的或者有病的皮膚組織以增強愈合。向骨折處外源性地提供生物電信號和祖細胞(諸如骨髓基質(zhì)細胞(BMSC))可以導(dǎo)致頑固性骨折的愈合和修復(fù)增強。這兩個因素(生 物電和細胞募集)事實上是自然愈合過程的部分。對于這些應(yīng)用，使 用電治療系統(tǒng)在受傷后立即施加使用在此所述的波形的電刺激。該電 治療系統(tǒng)可以是輕質(zhì)的、小型的、便攜的?？梢栽谑軅髱滋靸?nèi)應(yīng)用 電刺激和通常的基于細胞的治療?？梢栽谑軅蟾L的時間點增加自 體固有的細胞。本發(fā)明也提供了用于誘發(fā)再生自然組織而不是疤痕組 織的骨修復(fù)或發(fā)育的方法。因此，本發(fā)明的一個目的是提供用于通過對骨組織施加新的電信 號而調(diào)節(jié)骨組織的增殖和分化以促進骨修復(fù)和發(fā)育的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供新的培養(yǎng)系統(tǒng)，其包括將PEMF用 于骨組織過程。本發(fā)明的另一個目的是提供結(jié)合電刺激的祖細胞的新培養(yǎng)系統(tǒng).本發(fā)明的另一個目的是提供用于生長自體固有的和異源的組織 以在其需要時移植到宿主中的試劑盒。本發(fā)明的另 一個目的是提供用于在生物體外或者在體內(nèi)電刺激 非定向祖細胞以誘發(fā)增殖或者分化的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供用于調(diào)節(jié)軟骨、骨或其它結(jié)締組織的 生長的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供用于調(diào)節(jié)骨形態(tài)形成蛋白質(zhì)的表達 和釋放的方法。通過閱讀下面對于所公開的實施方案和所附的權(quán)利要求的詳細 說明，本發(fā)明的這些和其它目的、特征和優(yōu)點將變得顯然。


圖l是用于刺激骨折愈合的波形的示意圖。圖2a提供了示出用于促進骨的礦化的、基于感應(yīng)的線圏波形并且適于皮膚施加的脈沖模式的有效電信號波形的圖示。圖2b提供了示出用于促進骨的礦化的連續(xù)模式的有效電信號波 形的圖示。圖3a提供了示出用于促進骨細胞的增殖的脈沖模式的有效電信 號波形的圖示。圖3b提供了示出用于促進骨細胞的增殖的連續(xù)模式的有效電信號波形的圖示。圖4提供了示出用于提供電流的實驗室空間的圖示。圖5提供了示出在上清液(左)和膜(右)中的堿性磷酸酶中的改變的條形圖。圖6提供了示出在骨鈣蛋白和鈣沉積物隨著信號"B"的改變的條形圖；圖7提供了示出在存在和不存在L-NAME的情況下作為PEMF 信號波形的對照士標(biāo)準(zhǔn)偏差的百分比的、由DNA測量的細胞數(shù)量上的 提高的條形圖。L-NAME單獨被作為實驗對照。圖8提供了使用用于在體外應(yīng)用中的機械和電子刺激的組合的 設(shè)置的示意圖。本發(fā)明的詳細描述下面的說明包括執(zhí)行本發(fā)明的最佳的當(dāng)前考慮的方式。這個說明 用于說明本發(fā)明的一般原理，不應(yīng)當(dāng)當(dāng)作限定。在此所述的參考文獻 的文本通過引用被整體包含在此，其中包括美國臨時申請60/687,430、 60/693，4卯、60/782,462和60/790,128。應(yīng)當(dāng)理解，在此所述的本發(fā)明的當(dāng)前的體外應(yīng)用也可以被外推到 體內(nèi)應(yīng)用、治療等中。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以理解，使用減少的制 劑和體外模型而開發(fā)的技術(shù)可以最終用于體內(nèi)的應(yīng)用?？梢詮淖泽w外 或者動物模型測試系統(tǒng)得到的劑量響應(yīng)曲線外推體內(nèi)的電子刺激的 有效值和范圍。本發(fā)明使得能夠提供生物電信號，所述生物電信號被優(yōu)化為對應(yīng)于自然身體信號的所選擇的特性，產(chǎn)生加速的和更永久的愈合。在此 所述的信號唯一地符合自然信號的所選擇的特征，因此，按照本發(fā)明 進行電刺激的組織經(jīng)受了最小的生理應(yīng)力。另外，本發(fā)明是非侵入性 的和成本低廉的，使得能夠期望對于人的多次應(yīng)用和單獨使用。骨重塑骨是人體的最硬的組織之一。作為人體骨骼的主要成分，其不僅 支持肌肉結(jié)構(gòu)，而且保護在顱腔和胸腔內(nèi)的重要器官。骨由在細胞間 的鉤化材料(骨細胞外基質(zhì))和不同的細胞類型(成骨細胞、骨細胞 和破骨細胞)構(gòu)成。細胞外基質(zhì)由有機和無機成分構(gòu)成。所述有才幾成 分包括細胞、膠原蛋白、蛋白多糖、透明質(zhì)烷和其它蛋白質(zhì)、磷脂和 生長因子。骨的硬度來自礦化的無機成分，其主要是以羥磷灰石Ca1()(P04)6(OH)2形式結(jié)晶的鈣和磷。膠原蛋白和羥磷灰石的組合使得 骨具有堅硬和剛性特性。從間充質(zhì)來源的祖細胞衍化出成骨細胞，并且所述成骨細胞被分 布在正在出現(xiàn)的骨基質(zhì)旁邊的表面上，并且一個接一個地排列。成骨 細胞的主要功能是確立和發(fā)育骨基質(zhì)，并且在基質(zhì)礦化中起作用。當(dāng) 成骨細胞被嵌入骨基質(zhì)的陷窩中時，成骨細胞被稱為骨細胞，所述成 骨細胞采用略微不同的形態(tài)，保持與其它骨細胞的接觸。破骨細胞是 更大的多核細胞，其包含降血鈣素和整聯(lián)蛋白的受體和其它特殊的結(jié) 構(gòu)特征。破骨細胞的主要功能是再吸收鈣化的骨基質(zhì)的無機和有機成 分。骨重塑是骨組織的重吸收和形成的基本的和高度綜合的過程，其 導(dǎo)致具有礦化基質(zhì)的更新的精確地平衡的骨質(zhì)。上述可更新的過程能 夠?qū)崿F(xiàn)，而不損害骨骼的整體解剖架構(gòu)。內(nèi)部更新的這個連續(xù)過程通 過響應(yīng)于應(yīng)力連續(xù)修復(fù)微裂紋和改變而保證骨保持用于真實再生的 能力和維持骨完整性。成人骨骼的架構(gòu)和構(gòu)成處于永久的動態(tài)平衡。 重塑也提供了用于響應(yīng)于內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的要求而釋放鈣的手段。影響骨 重塑的條件包括機械刺激(諸如固定或者失重狀態(tài))、電流或者電磁場(諸如電容耦合的電場或者脈沖的電磁場)、激素改變或者響應(yīng)于 特定的炎癥。骨重塑通過一系列配合的活動周期而發(fā)生，所述活動周期包括激 活、重吸收、逆轉(zhuǎn)、形成和靜止步驟。激活的特征為存在襯細胞的薄 層。然后，造血系統(tǒng)的循環(huán)的單核細胞開始遷移到激活區(qū)域，并且結(jié) 合在一起以形成破骨細胞。激活后是重吸收，其中，激活的破骨細胞挖開骨性表面。這個步驟通常持續(xù)約2-4周。逆轉(zhuǎn)在重吸收之后發(fā)生， 并且持續(xù)9天，在此期間，在重吸收凹陷中存在失活的前成骨細胞。 下一個步驟是形成，并且需要約3-4月。在這個階段期間，激活的成 骨細胞重新填充挖空區(qū)域。骨重塑的最后階段是靜止，其間，不發(fā)生 重塑行為，直到開始下一個重塑周期。理想地，骨填充的數(shù)量必須等 于重吸收的數(shù)量，并且不丟失骨質(zhì)量。波形本發(fā)明提供了電信號和波形，所述波形使得能夠在生理組織上進 行特定的行為。這樣的波形在體外和體內(nèi)應(yīng)用中都是有效的。在此示 出骨軟骨組織以不同地響應(yīng)于顯著不同的頻率和波形。所特別關(guān)心的是包括交變的矩形或者準(zhǔn)矩形的脈沖的信號，所述 脈沖具有相反的極性和不同的長度，由此形成矩形、不對稱的脈沖序列。特定長度的脈沖已經(jīng)被理論化為激活特定的細胞生化機制，特別 是將4丐或者其它小的、移動的、帶電的物質(zhì)結(jié)合到在細胞膜上的受體， 或者它們的(通常較慢的)解除結(jié)合。具有相反極性的這樣的序列的 多個部分可以平衡來獲得大致凈零的電荷，并且所述序列可以或者是 連續(xù)的或者被劃分為由大致零信號的間隔隔開的多個脈沖段。以脈沖 段模式施加的刺激具有與作為連續(xù)序列施加的那些類似的作用，但是 它們的行為可能由于在零信號期間將帶電的物質(zhì)從受體解除結(jié)合的 (理論上)能力而在細節(jié)上不同，并且所需要的施加時間表也不同。 圖1示出了對于刺激骨和軟骨組織有效的基本波形20的示意圖， 其中，線22表示在連續(xù)模式中的波形，線24表示在脈沖段模式中的較長時標(biāo)上的同一波形。電平26和28表示電壓或者電流的兩個不同 的特征值，并且間隔30、 32、 34和36表示在特定的轉(zhuǎn)換之間的定時。 電平26和28通常被選擇使得當(dāng)在波形的全周期上被平均時，沒有凈 直流(D.c.)分量，雖然如果期望的話可以選擇電平26和28以產(chǎn)生 凈的正或者凈的負(fù)直流分量。在實際應(yīng)用中，諸如20的波形通常在 下述方面被修改所有的電壓或者電流向在電平26和28之間的某個 中間電平以指數(shù)衰減，并且衰減時間常數(shù)優(yōu)選地大于間隔34。結(jié)果被 表示為線38。在此所述的波形一般具有兩個信號分量相對于彼此被 示出為間隔30的較長分量和被示出為間隔32的較短分量。在短和長信號分量長度中的變化對被刺激的組織產(chǎn)生特定的效 果。在本發(fā)明中所關(guān)心的脈沖長度可以被定義如下(以長度增加的順 序)長度a:在持續(xù)時間上在5和75微秒之間，優(yōu)選的是在持續(xù)時 間上在10和50微秒之間，更優(yōu)選的是在持續(xù)時間上在20和35微秒 之間，最優(yōu)選的是在持續(xù)時間上為約28微秒。長度P:在持續(xù)時間上在20和100微秒之間，優(yōu)選的是在持續(xù) 時間上在40和80之間，更優(yōu)選的是在持續(xù)時間上在50和，微秒之 間，最優(yōu)選的是在持續(xù)時間上為約60微秒。長度y:在持續(xù)時間上在100和1000微秒之間，優(yōu)選的是在持 續(xù)時間上在150和800微秒之間，更優(yōu)選的是在持續(xù)時間上在180和 500微秒之間，最優(yōu)選的是在持續(xù)時間上為約200微秒。長度8:在持續(xù)時間上超過l毫秒，優(yōu)選的是在持續(xù)時間上在5 和100毫秒之間，更優(yōu)選的是在持續(xù)時間上在10和20毫秒之間，最 優(yōu)選的是在持續(xù)時間上為約13毫秒。在第一實施方案中，電信號具有長度a的較短分量和長度P的較 長分量因此，在最優(yōu)選的每個類型的脈沖長度(分別是28微秒和 60微秒)下具有約11.4 KHz的頻率。由交替的長度a和長度p的脈 沖構(gòu)成的信號在此被稱為"類型a"信號，它們的波形被稱為"類型a" 波形。在圖2a中示出了作為連續(xù)的脈沖序列而施加的"類型a"信號。諸如此的信號有益于促進組織樣本的增殖或者多種生理或者治療應(yīng) 用的培養(yǎng)。在脈沖段模式中，在約0.5到500毫秒(優(yōu)選的是約50毫秒) 的脈沖段中接通"類型A，，波形，并且所述脈沖段以0.1-10 Hz或者優(yōu) 選約1 Hz重復(fù)。在圖2b中示出了這種類型的波形的一個示例。在第二實施方案中，所述電信號具有長度a的較短分量，和具有 長度y的較長分量因此在最優(yōu)選的每個類型的脈沖長度(分別是28 微秒和200微秒)下具有約4.4KHz的頻率。由交替的長度a和長度 y的脈沖構(gòu)成的信號在此被稱為"類型B"信號，它們的波形被稱為"類 型B"波形。在先前美國專利申請第10/875,801號(公開第 2004/0267333號)中描述了這樣的波形。在圖3a中示出了作為連續(xù) 的脈沖序列而施加的"類型B，，信號。諸如此的信號有益于疼痛緩解和 促進骨愈合，并且也刺激體外的成骨細胞培養(yǎng)物中的松質(zhì)骨樣結(jié)構(gòu)的 發(fā)育，并且應(yīng)用到手術(shù)骨修復(fù)和移植材料的領(lǐng)域。在脈沖段模式中，在約1到50毫秒(優(yōu)選的是約5毫秒)的脈 沖段中接通"類型B，，波形，并且所述脈沖段以5-100 Hz或者優(yōu)選約 15Hz重復(fù)。在圖3b中示出了這種類型的波形的一個示例。這個波形 在形狀和幅度上類似于由在不連合的骨刺激產(chǎn)品(例如EBI MEDICA， INC. (Parsippany，紐約州)和ORTHOFIX， INC. (McKinney，德克 薩斯州))普通使用的典型的感應(yīng)(線圏)電磁裝置提供的有效電流。在第三實施方案中，電信號具有長度p的較短分量，和具有長度 y的較長分量因此在最優(yōu)選的每個類型的脈沖長度(分別是60微秒 和200微秒)下具有約3.8KHz的頻率。由交替的長度p和長度y的 脈沖構(gòu)成的信號在此被稱為"類型C"信號，它們的波形被稱為"類型 C"波形。諸如此的信號有益于促進骨再生、成熟和鈣化。在脈沖段模式中，在約1到50毫秒(優(yōu)選的是約5毫秒)的脈 沖段中接通"類型C，，波形，并且所述脈沖段以5-100 Hz或者優(yōu)選約 15 Hz重復(fù)，這與"類型B"很相似。這個波形在形狀和幅度上類似于 由在不連合的骨刺激產(chǎn)品(例如ORTHOFIX，INC^(McKinney，德克薩斯州)、PhysioStim Lite ,被設(shè)計來促進脊柱融合的愈合)普通 使用的其它典型的感應(yīng)(線圏)電磁裝置提供的有效電流。在第四實施方案中，電信號具有長度y的較短分量，和長度3 的較長分量因此在最優(yōu)選的每個類型的脈沖長度(分別是200^:秒 和13微秒)下具有約75 Hz的頻率。由交替的長度Y和長度S的脈 沖構(gòu)成的信號在此被稱為"類型D"信號，它們的波形被稱為"類型D" 波形。諸如此的信號特別有益于促進軟骨愈合和骨鈣化，并且治療或 者逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎。雖然在廣義上類似于如通過引用而被 并入在此的美國專利#5，273，033的圖3中所示的由BIONICARE MEDICAL TECHNOLOGIES INC. 810-1000^通過電極提供的信 號，但是"類型D"信號在波形形狀上實質(zhì)不同(其是矩形的而不是指 數(shù)的)，并且其優(yōu)選是電荷平衡的。在脈沖段模式中，在至少100毫秒(優(yōu)選是約1秒)的脈沖段中 接通"類型D，，波形，并且以一秒或者更大的間隔重復(fù)脈沖段。信號強度也可以不同事實上，更強的信號經(jīng)常不比更弱的信號 有益，并且有時還更差。對于典型的信號(諸如圖l的信號)，峰值 效用通常位于每平方厘米1和10微安(jiA/cm2)之間的某個位置， 并且交叉點在約這個值的100倍處。在這個點之外，所述信號可以緩 慢愈合或者可能本身引起進一步的損傷。以連續(xù)模式而不是脈沖段模式運行的電信號或者波形與本方法 特別相關(guān)。(例如圖2a或者3a)。連續(xù)地運行的信號具有與脈沖段 信號類似的效果，但是可能需要不同的遞送時間表來實現(xiàn)類似的結(jié) 果。對于用于本發(fā)明的方法的波形，典型的所施加的平均電流密度在 每平方厘米0.1和1000孩i安之間，優(yōu)選地在每平方厘米0.3和300孩走 安之間，更優(yōu)選地在每平方厘米1和100孩i安之間，最優(yōu)選地在每平 方厘米10微安，結(jié)果導(dǎo)致在典型的身體組織中，電壓梯度的范圍分 別在每平方厘米0.01和1000之間、0.03和300之間、0.1和IOO之間、 1和IO微安之間。所述獨立的接近方波的信號與長正分段和短負(fù)分段異步，或者反之亦然。所述正負(fù)部分平衡以獲得零凈電荷，或者可選 地可以與在脈沖尾部的均衡脈沖電荷不平衡，以提供在作為整體的波 形上的零凈電荷平衡。由皮膚電極提供的這些波形使用連續(xù)的矩形或 者近似矩形的波形，而不是正弦的或者強指數(shù)衰減的波形。在通過引用而整體被并入在此的、所公開的美國專利申請10/875,801 (公開號 2004/0267333 )中公開了本發(fā)明的方法中可用的其它波形。如上所述的電信號可以在需要治療時在間歇的治療間隔或者在 一天中連續(xù)地施加到細胞、生物組織或者個人。治療間隔在此被定義 為以脈沖段或者連續(xù)模式施加波形的時間間隔。治療間隔可以是在持 續(xù)時間上為約10分鐘到約4小時、在持續(xù)時間上為約30分鐘到約2.5 小時或者在持續(xù)時間上為約1小時。治療間隔可以每天發(fā)生約l到100 次。可以對于每種情況調(diào)整治療間隔的持續(xù)時間和頻率，以獲得有效 數(shù)量的電刺激來促進細胞增殖、細胞分化、骨生長、發(fā)育或者修復(fù)。 所述參數(shù)被調(diào)整以確定最有效的治療參數(shù)。信號不必然在治療間隔上要求長的持續(xù)時間，雖然如果期望的話 可以使用24小時的施加。通常，為了獲得生物效果，需要30分鐘(一 天重復(fù)幾次)?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)手段(諸如細胞計數(shù)、核酸或者蛋白質(zhì) 合成的增加)來測量體外細胞增殖。也可以測量(mRNA和蛋白質(zhì)合 成)基質(zhì)蛋白質(zhì)(膠原蛋白類型I、 III和IV)以及生長因子和細胞 因子(諸如TGF-B、 VEGF、 SLPI、 FN、 MMP)的上調(diào)和下調(diào)?？?以通過損傷的治愈率或者通過測量骨質(zhì)密度來確定體內(nèi)效果。用于骨 組織的增殖、分化或者礦化的其它診斷方法對于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員 是顯然的。在一個實施方案中，依序使用促進增殖和促進分化的信號。這種 波形的組合用于提高細胞數(shù)量，因此促進細胞的分化。作為示例，所 述依序使用增殖和分化信號可以用于促進成骨細胞的增殖，因此促進 將成骨細胞分化為產(chǎn)生礦物質(zhì)的骨細胞，其促進骨的礦化，或者反之 亦然。例如，可以使用一個治療范例，其中，首先在體外或離體向細 胞群施加促進增殖的A型信號達到幾個小時、幾天或者幾周，然后將所述促進增殖的信號替換為促進礦化的B型信號達到幾個小時、幾天 或者幾周，直到已經(jīng)實現(xiàn)了骨礦化。所產(chǎn)生的組織可以然后被移植以 有益于病人。也可以將兩種信號同時施加以同時促進增殖、分化和礦 化?？梢酝ㄟ^皮膚電極或者電化學(xué)連接來提供所述電信號。可以以商 業(yè)方式獲得皮膚電極，其大小諸如l1/〃12、 2x3V4和2x2英寸，其分 別可能有益于施加到脊柱、髖部和臂部。這些可再用的電極是有益的， 因為它們不包含膠乳，并且還沒有顯示大的皮膚刺激。所述可再用電 極可以多次被使用；這也減少病人的費用。這樣的電極可以包括電極 #214(l/5，，xl3，，) 、 #220(2，，x2，，)和#230(2"x3/5，，) ( KOALATY PRODUCTS , Tampa ，佛羅里達州)或者電極弁T2020(2，，x2")和 #T2030(2，，x3.5，，) (VERMED， INC , Bellows Falls,佛蒙特州)。使用皮膚電極來取代電磁線圍具有多個優(yōu)點。首先，皮膚電極更 有效。使用電極，僅僅必須產(chǎn)生將實際被發(fā)送到身體內(nèi)的信號，使用 線圈，因為與組織的不良電磁耦合，所置入的信號必須比在所述組織 中需要的強許多許多倍。這使得所需要的電極產(chǎn)生電路可能比線圏的 產(chǎn)生電路簡單得多，同時需要更少的功率來操作。其次，皮膚電極更 有利于用戶。皮膚電極具有至多需要提供等同的信號電平的線圏的重 量和體積的百分之幾。類似地，因為較好的耦合效率，可以使得用于 驅(qū)動電極的信號發(fā)生器比用于線團的信號發(fā)生器小得多和輕得多。在 短時間后，佩帶者幾乎注意不到它們在那里。第三，皮膚電極更經(jīng)濟。 不像線圏(其每個花費幾百到幾千美元)那樣，電極是"可丟棄"物品， 通常成本小于l美元。而且，因為更大的效率和更簡單，與用于線圏 的相比較，用于驅(qū)動它們的信號發(fā)生器和電池可以小和制造便宜。第 四，皮膚電極允許更簡單的電池結(jié)構(gòu)和更長的電池使用期限，這便利 了使用所述裝置的容易性和病人的順從性。最后，皮膚電極比電磁線 圏更通用。線圏必須被建立來匹配它們將被使用于的身體部分的幾何 特性，并且每個必須足夠大來環(huán)繞或者圍住要治療的部分。這表示， 要"覆蓋"身體，必須有許多許多不同的線圏大小和形狀，其中一些特別大。另一方面，利用電極，僅僅通過電極布置來確定電流分布，可 以容易在其間的全部體積來預(yù)測電流分布，因此，身體可能僅僅被"覆 蓋"幾個電極類型外加良好地選擇的方位的列表。刺激系統(tǒng)本發(fā)明也考慮包括細胞和用于向細胞提供電信號的刺激器的生 物系統(tǒng)。這樣的細胞可以包括但是不限于前驅(qū)細胞，諸如千細胞、非 定向祖細胞、定向祖細胞、多能祖細胞、多向性祖細胞或者在分4匕的 其它階段的細胞。這樣的細胞可以是胚胎的、胎兒的或者成人的細胞， 并且可以從自體固有的或者同種異體的來源采集或者與其分離。在一 個實施方案中，使用增殖細胞，雖然也可以在在此所述的方法中使用 非增殖細胞。這樣的細胞可以在體外，例如在組織培養(yǎng)物中被組合，用。移植的干細胞可以選擇性地被吸引到受傷或者疾病的位置，然后 被電刺激以增強愈合。按照本發(fā)明的方法和目的的刺激細胞培養(yǎng)物也需要用于同時向 許多培養(yǎng)孔提供均勻的波形而不干擾孵育過程或者引起污染的實用手段。在此提供用于使用用于信號施加的、特殊設(shè)計的電容耦合陽極化的電極系統(tǒng)來達到下述目的的裝置用于在孵育期間電刺激培養(yǎng) 物，所述培養(yǎng)物優(yōu)選地包含6個組織培養(yǎng)孔，它們被連接為多孔系統(tǒng)。 通過使用帶狀電纜附件，在孵化器的密封上的泄露被最小化，以保持 用于培養(yǎng)物的受控二氧化碳環(huán)境。在圖4中以部分示意的形式示出了典型的設(shè)置。例如在圖4所示的設(shè)置中，互連6個組織培養(yǎng)孔110a-110f，并 且每個孔在室端部包括由兩條15毫米和一條7.5毫米的直的導(dǎo)線分段 形成的電極140，所述兩條15毫米和一條7.5毫米的直的導(dǎo)線分段通 過回頭彎而結(jié)合，并且通過直角彎而連接到橋112的中央部分142。 在圖4中示出了 7個這樣的橋。電極140被定大小以適配Lab-Tek11 滑動箱的端壁，所述滑動箱測量尺寸為18x48毫米，其內(nèi)部具有典型的3毫米填充深度。這樣的電極的電容是約0.56微法。橋112a和U2g 不同在具有端孔螺旋144，每個端孔螺旋包含約15 cm的導(dǎo)線。結(jié)果 產(chǎn)生的在橋?qū)Ь€112a或者112g和對應(yīng)的銀電極104之間的電容是約 2.3微法。由固態(tài)的較為惰性的金屬形成的橋112a、 112b等在端孔106a 和106b之間電串聯(lián)室110a、 110b等。雖然在此示出了 6個室110a 到110f和七個橋112a到112g，但是可以使用任何其它方便的室數(shù)量 "n"和橋的數(shù)量"n+l"。另外，多個這樣的串聯(lián)的分組(每個由"n"個 室、"n+l"個橋和兩個端孔構(gòu)成)可以使用信號分布裝置(諸如電阻 器網(wǎng)絡(luò)以在分組之間分擔(dān)信號能量)來用于單個信號源100，這是電 子信號傳輸領(lǐng)域中公知的。所示設(shè)置的總的電阻抗(具有所述的12個室電極端、2個端孔 螺旋電極106和6個所述室)主要具有電容0.045微法外加約1萬歐 姆的電阻分量。在信號源100和端孔106a之間連接的串聯(lián)電阻器(未 示出)可以將所施加的電流調(diào)整到期望的電平，并且也"淹沒，，所迷串 聯(lián)的電抗的電容部分，例如，對于1M歐姆的電阻器，頻率響應(yīng)從5 Hz到3 Mhz在+/- 3dB內(nèi)是均勻的。如果期望的話，可以這樣用在放大的室110b中所示的探針來測 量在室中的信號能量分布。探針120被沉浸在介質(zhì)122中，并且被移 動到一連串位置，優(yōu)選標(biāo)注矩形的網(wǎng)格，所述探針120由任何合理的 惰性金屬構(gòu)成，但是優(yōu)選由作為電極104a和104b的99.9%的純銀構(gòu) 成，其除了在它們的尖端之外被絕緣，并且這些尖端以已知和固定的 距離相間。在每個位置的差動電壓被差動放大器124 (諸如模擬裝置 AD522 )讀取，并且被發(fā)送到用于顯示或者記錄的示波器或者其它裝 置(一般地被指示為126)。結(jié)果被方便地表示為數(shù)字陣列，用于表 示在每個點的信號強度與整體平均值的比率，如在圖4的底部的放大的室110b再次所示?；蛘?，可以使用其它的手段，諸如彩色編碼或 者三雄圖形。如在圖4中的網(wǎng)格所示，在電極被布置在矩形室的窄端的情況下的信號分布通常相當(dāng)均勻，除了在緊鄰電極本身的小區(qū)域之外。當(dāng)切 斷的或者破裂的氧化物復(fù)原時，均勻性也隨著時間或者在介質(zhì)中或者在普通鹽水中改善。例如在圖4左下的平均值以上的讀數(shù)可能產(chǎn)生自 在切斷的導(dǎo)線端的不完全復(fù)原的氧化物。為了處理方便、最小化介質(zhì)蒸發(fā)和容易保持無菌性，在分組中的 所有的室、橋和端孔可以方便地被組配在硬玻璃板或者其它可以滅菌 的載體上，并且這些板的一個或多個一旦被組配則可以被圍在諸如硬 塑料箱之類的外部容器中。本發(fā)明也提供了新的刺激裝置，用于提供電信號以便促進骨生長 或者修復(fù)。具體地，提供了新的無源電極系統(tǒng)，用于提供電信號。這 些電極系統(tǒng)耦合用于體外或者體內(nèi)應(yīng)用的時變電信號；并且替代傳統(tǒng) 的電解液橋技術(shù)(用于通過有利于電容耦合的感應(yīng)來提供PEMF類型 的信號)。所述電極系統(tǒng)可以由諸如但是不限于下述的材料構(gòu)成陽 極化的金屬，諸如鈮、鉭、鈦、鋯、鉬、鎢和釩。鋁和不銹鋼共享這 樣特性，但是程度很低，因為它們被包含氯離子的溶液緩慢地侵蝕。 在可用的頻率(通常在約5Hz和3MHz之間，并且在電路改進的情 況下，從小于約1Hz到超過約30MHz)，可忽略DC電流通過。鈮是自我鈍化(由此當(dāng)被暴露到氧氣和濕氣時形成薄但是很耐久 的表面氧化物層)的幾種金屬之一。這個過程可以被陽極化控制。一 般地，自我鈍化建立可靠的連接，而其它方法比較困難，但是，本設(shè) 計獨特地使用電容耦合來在電極中感應(yīng)電流，由此避免與其它金屬形 成電連接的困難。這種電極系統(tǒng)提供了可忽略的電解，并且沒有生理 上嚴(yán)重的細胞毒性，也有益于體內(nèi)應(yīng)用。用于本發(fā)明的電極系統(tǒng)的導(dǎo)線是"自我保護的"，當(dāng)被暴露到濕氣 或者氧氣時形成非活性氧化物的薄的但是很耐久和緊密粘著的表面 層。如此形成的氧化物具有高的介電常數(shù)，并且氧化物的厚度大致均 勻，并且可以被密切地控制。保護性氧化物薄層允許所述金屬作為耦 合電容器，用于向具有均勻分布和可忽略的電解的培養(yǎng)介質(zhì)引入交流 (零凈電荷，或者ZNC)電信號。一般被指示為100的刺激器或者其它信號源通過導(dǎo)線、接線或者 通過任何其它方便的裝置102而被連接到一對較為惰性的金屬電極 104a和104b，它們被浸沒在端孔106a和106b中的導(dǎo)電液體中。這 些裝置提供了信號對于其要應(yīng)用到的培養(yǎng)室110a、 110b等的組件的 進入點。電極104a和104b優(yōu)選使用純銀(99.9%純)，端孔106a和 106b中的液體優(yōu)選使用鹽(氯化鈉溶液)，因為在使用中，氯化4艮薄 層形成在界面上，并且通過可逆的電化學(xué)反應(yīng)便利了電流的通過。但 是，也可以使用其它的金屬和液體。橋112a、 112b等可以由任何較為惰性的金屬形成，只要所迷金 屬不是細胞毒性的。通常被用作惰性電極以用于生物液體的金屬是 銀、金、鉑和其它柏族金屬。不幸的是，它們成本高，可以允許甚至 催化在它們的表面的一些電化學(xué)反應(yīng)(特別是如果存在小的雜質(zhì)的 話)，并且這樣的反應(yīng)的生成物可能是細胞毒性的。由于這個原因，在本發(fā)明中優(yōu)選使用所謂的"自我保護"金屬的 組，所述金屬與水或者水溶液接觸，形成薄的、連續(xù)的、高度不可溶 解的和生理上惰性的表面氧化物層，其將所述金屬表面密封以免其它 的液體接觸。這個氧化物形成電信號傳遞系統(tǒng)和培養(yǎng)介質(zhì)之間的唯一 接觸。這樣的金屬包括鈮、鉭、鈦、鋯、鉬、鎢和釩。鋁和不銹鋼共 享這個屬性，但是是以較小的程度，因為它們被包含氯離子(幾乎所 有的生物液體都如此)的溶液緩慢地侵蝕。通過陽極化，可以增強在這樣的金屬上的氧化物形成，并且以密 切可控的方式來提高所述氧化物的厚度。均勻的氧化物厚度提供了金 屬表面每單位面積均勻的電容，于是得出在表面上的較為均勻的信號 強度，而幾乎與其在液體中的形狀無關(guān)。通過切割和形成而引起的在 氧化物中的小裂縫通過與所述液體的進一步的反應(yīng)而迅速地愈合。本申請尤其優(yōu)選使用鈮，因為由于通過經(jīng)由陽極化產(chǎn)生的表面氧 化物(Nb205)中的光干涉形成的鮮艷和穩(wěn)定的顏色，它在珠寶中常 見，因此可以以合理的價格以方便的形式和多種常備的顏色來獲得 它。里奧格蘭德(Rio Grande )珠寶公司例如存儲了 20和22規(guī)格的圓形鈮導(dǎo)線，其被預(yù)先陽極氧化為"紫色"、"桃紅色"、"藍黑色"、"深 青色"、"綠色"和"金色"，每種顏色表示不同的氧化物厚度。所述導(dǎo)線容易被加工和形成為任何期望的電極形狀。在給出Nb20s的折射率 (ND = 2.30)及其介電常數(shù)Ur-41sJ的情況下，可以從光反射鐠 容易地測量所述氧化物厚度，并且可以計算結(jié)果產(chǎn)生的每單位面積的 電容或者導(dǎo)線長度。"紫色"導(dǎo)線具有最薄的氧化物，從420納米的峰 值反射率測量為48納米，因此對于22規(guī)格的"紫色"導(dǎo)線(直徑為0.644 厘米，里奧格蘭德目錄編號638-240)，電容被計算為每厘米導(dǎo)線長 度0.154微法。直接測量初始由于氧化物裂縫而給出非常高的讀數(shù)， 但是在鹽水中24小時后，所測量的電容穩(wěn)定在每厘米0.158微法，接 近預(yù)測值。橋112a、 112b等因此非常像傳統(tǒng)的鹽橋那樣電作用，除了不可 能有液體或者離子流通過它們，因此避免了在室之間或者在室和端孔 之間的可能的交叉污染。另外，避免了傳統(tǒng)鹽橋遇到的蒸發(fā)和可能的 泄露的問題以及操作瓊脂或者其它膠凝劑的不方便。因為它們是電容 性的，因此所述橋阻擋直流，因此達到所述室的信號在相位之間電荷 平衡，去除了任何直流分量。優(yōu)選的是，與生長介質(zhì)接觸的所有的橋端具有相同的大致尺寸， 并且包含大致相同的導(dǎo)線長度，因此全部具有大致相等的電容，并且 靠著培養(yǎng)室(其本身優(yōu)選是矩形的)的窄端布置，如圖4中的放大的 室110b中所示。與在端孔中的液體接觸的橋端(例如在圖4中的橋 112a和112g的左端)如果期望的話可以被提供不同的形狀，以增加 接觸，降低電容，并且/或者更好地適配端孔(如果這些與培養(yǎng)室不同) 的大小和形狀。例如，當(dāng)使用圓形端孔時，在它們中浸入的橋端可以 方便地被形成為螺旋144，如圖4中所示。因此總之，本發(fā)明所考慮的生物系統(tǒng)包括下面的元件電子模擬 器、陽極化的金屬電極和細胞。用于這樣的系統(tǒng)中的適當(dāng)?shù)腜EMF信 號包括如例如在圖2或者3氧化氮產(chǎn)生。組織工程本發(fā)明的方法也可以用于組織工程應(yīng)用?？梢越Y(jié)合生物相容的支 架使用本發(fā)明的方法和培養(yǎng)系統(tǒng)來培養(yǎng)細胞，以在體外或離體產(chǎn)生功 能組織，或者所述細胞被移植以在體內(nèi)形成功能組織。被移植的細胞 或者宿主細胞也可以被選擇性地移植或者吸引到受傷或者疾病位置， 然后被使用在此所述的電信號刺激以增強愈合或者修復(fù)。組織支架可 以由生物相容的自然聚合物、合成聚合物或者其組合被形成為具有大 致開放的架構(gòu)的非織的開放的細胞化的基質(zhì)，所述基質(zhì)提供了培養(yǎng)系 統(tǒng)內(nèi)的或者體內(nèi)的細胞浸潤的足夠空間，同時在將支架集成到宿主體 內(nèi)的目標(biāo)位置中期間，保持足夠的機械強度來承受由在所述支架內(nèi)的 細胞生長施加的收縮的、壓縮的或者拉伸的力。組織支架可以是硬結(jié) 構(gòu)，用于產(chǎn)生具有限定形狀的固態(tài)的三維機構(gòu)，或者，支架可以是半 固態(tài)的基質(zhì)，用于產(chǎn)生柔性組織。本發(fā)明的方法和培養(yǎng)系統(tǒng)包括使用由聚合物單獨、共聚物或者其 混合物制成的支架。所述聚合物可以是可生物降解的或者生物穩(wěn)定的 或者其組合。在此使用的"可生物降解的"材料是包含可以在生理條 件，包括酶促的或者化學(xué)鍵的水解分裂下被裂解的鍵。適當(dāng)?shù)淖匀痪酆衔锇ǖ遣幌抻诙嗵?，諸如海藻酸鹽、纖維素、右旋糖苷、支鏈淀粉(pullane)、聚透明質(zhì)酸、幾丁質(zhì)、聚(3-羥基 烷酸酯)、聚3-羥基辛酸酯和聚(3-羥基脂肪酸)。在本發(fā)明中也考 慮所述自然聚合物的化學(xué)衍生物，包括化學(xué)基團的取代和/或添加(諸 如烷基、烯基、羥基化、氧化)以及本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員熟悉的其它 修改。也可以從諸如膠原蛋白、玉米蛋白、酪蛋白、明膠、谷蛋白和 血清白蛋白的蛋白質(zhì)中選擇所述自然聚合物。適當(dāng)?shù)暮铣删酆衔锇?但是不限于聚磷腈、聚乙烯醇、聚酰胺、聚酯酰胺、聚氨基酸、聚酐、 聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚亞烷基、聚亞烷基甘醇、聚亞烷基氧化物、 聚亞烷基對苯二甲酸鹽、聚原酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚卣代乙烯、聚酯、聚交酯、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚已內(nèi)酯、聚羥基丁酸酯、聚氨酯、苯乙烯異丁酯苯乙烯嵌段聚合物(SIBS )和共聚物及其組合。 可生物降解的合成聚合物是優(yōu)選的，并且包括但是不限于聚a-羥基酸，諸如聚L-乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物(即 聚D,L-乳酸共-乙醇酸(PLGA))以及透明質(zhì)酸。FDA批準(zhǔn)聚a-羥 基酸用于人類臨床應(yīng)用。應(yīng)當(dāng)注意，某些聚合物(包括多糖和透明質(zhì) 酸)是水溶性的。當(dāng)使用水溶性聚合物時，重要的是通過化學(xué)修飾(例 如通過使用交聯(lián)劑)使得這些聚合物呈部分地水不溶性的?？缮锝到獾木酆衔锘|(zhì)的優(yōu)點之一是可以將血管生成的和其 它的生物活性的化合物直接地并入所述基質(zhì)中，以便它們在所述基質(zhì) 在體內(nèi)降解時緩慢地被釋放。當(dāng)細胞聚合物結(jié)構(gòu)被血管化并且所述結(jié)構(gòu)降解時，細胞將按照它們的固有特性分化。包括營養(yǎng)素、生長因子、 分化或去分化(即，促使分化的細胞失去分化性能并且獲得例如增殖 等性能以及更多的一般功能)的誘導(dǎo)劑、分泌產(chǎn)物、免疫調(diào)節(jié)劑、炎 癥抑制劑、退化因子、生物活性化合物(可增強或允許淋巴網(wǎng)絡(luò)或神 經(jīng)纖維的向內(nèi)生長)、透明質(zhì)酸、以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的藥物(由 諸:ft口 Collaborative Research, Sigma Chemical Co.等供應(yīng)商提供，并 且在告知有效劑量的情況下可以商購)、血管生長因子(例如血管內(nèi) 皮生長因子(VEGF) )、 EGF和HB-EGF等因子可以被并入基質(zhì)中 或與基質(zhì)組合而被提供。類似地，含有例如附著肽RGD(Arg-Gly-AsP) 的肽的聚合物可以被合成，以用于形成基質(zhì)。 試劑盒在本發(fā)明中還提供了試劑盒，其將電刺激器與生物相容的支架結(jié) 合，以支撐細胞生長并且將整合到被聯(lián)合的組織中。內(nèi)裝有電極的容 器可以被設(shè)置有試劑盒，電極可以由自鈍化材料或其它傳統(tǒng)的電極材 料制成。這些試劑盒可以可選地包括例如生長介質(zhì)等試劑以及生長因 子，以促進細胞與支架的結(jié)合。包括在試劑盒中的支架可以被設(shè)計成 具有被固定于其表面的促進生長的分子和粘合分子。這種試劑盒.可選 地與關(guān)于適當(dāng)使用和最佳化的使用說明被包裝在一起。直到細胞可以與試劑盒的其它元素結(jié)合而生成適當(dāng)?shù)慕M織之前， 細胞可以被設(shè)置在試劑盒中，以保護材料保存的形式。在一個具體實 施方式中，所提供的細胞是被低溫儲藏在液氮中或者是在諸如海藻酶 糖的存在下干燥的細胞。細胞可以是未分化的祖細胞，包括干細胞、 多能干細胞、多向性干細胞或定向祖細胞?？蛇x地，最終被分化的細 胞也可以被用于這些試劑盒。這些試劑盒可以被設(shè)計為制備用于例 如，但不限于，骨、軟骨、肌肉、腎、肝、神經(jīng)系統(tǒng)、肺、心、血管 系統(tǒng)等中任一器官系統(tǒng)的替換組織。細胞也可以從需要治療的病人獲取，以便從病人自己的組織基因 工程替換組織。使用病人自己的組織提供了一種生成移植組織的方 法，其減少了與組織排斥相關(guān)的并發(fā)癥。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)除了單純的電刺激之外，體外的電和機械刺激的組合可 能對某些方面有利。機械刺激可以包括拉伸負(fù)荷、壓縮負(fù)荷或剪切負(fù)荷。典型的裝置如圖8a到圖8e的剖面圖所示。在各種負(fù)荷的情況中，測試裝置都圍繞本領(lǐng)域所熟悉的任何一種 類型的培養(yǎng)孔或室200而安裝，該培養(yǎng)孔或室內(nèi)裝有介質(zhì)202,細胞 層204通常附著于底片或膜206，該底片或膜可以是或不是培養(yǎng)孔的 剛性機械底部208的一部分。電極210可以是如所描述的任意一種可 用的金屬，但優(yōu)選可自保護的金屬，更優(yōu)選陽極化處理的鈮，該電極 210以在整個介質(zhì)202中形成相對均勻的電流分布的方式被設(shè)置在室 200中。對于拉伸負(fù)荷而言，膜206在如圖8a中所示的培養(yǎng)孔或室200 中形成另外的或者"偽，，底部。膜206可以由任意的適當(dāng)柔性且彈性的 材料制成，細胞自行粘附于其上，該材料可以是例如經(jīng)過等離子蝕刻 的硅橡膠。管212用外接的泵或其它穩(wěn)定的或波動的壓力或真空源216 連接膜206與剛性室底部208之間的空間214。壓力或真空源216的 間歇運轉(zhuǎn)促使膜206上下彎曲，在膜中從而在附著于該膜的細胞層204 中形成間歇張力?？蛇x地，源216可以長期地幾乎不或完全不在膜20( 上施加壓力，這使得細胞204可以長滿未展開狀態(tài)的膜，然后施加一個不同的壓力，從而例如在培養(yǎng)生長中的一個點上拉伸膜206，細胞 在該點上剛好實現(xiàn)融合并且建立起縫隙連接的接觸。對于壓縮負(fù)荷而言，不同的是，培養(yǎng)孔或室200用蓋220密封并 且直接連接于如圖8b所示的壓力源216。源216在介質(zhì)202中形成穩(wěn) 定的或波動的液靜壓，從而將該液靜壓直接地施加給細胞層204。作為用于壓縮負(fù)荷的一個可選裝置，管212和壓力源216被取消 并且室蓋220采用可移動的活塞的形狀，穩(wěn)定的或變動的壓力可以通 過該室蓋直接施加給介質(zhì)202，從而施加給細胞204，如圖8c所示。對于剪切負(fù)荷而言，不同的是，培養(yǎng)孔200通過兩根管212a和 212b連接于壓力源216，介質(zhì)202通過該兩根管循環(huán)流動，如圖8d 所示。該流動可以是在一個單獨方向上恒定的，間歇的，或是振蕩的。 各管優(yōu)選裝配有隔板220，以獲得如通過箭頭222總體表示的更均勻 的流。隔板220可以與所示電極210分開地制成，或者可選地，電極 可以被穿孔或另外制成不連續(xù)的，以便自身形成隔板。介質(zhì)202的移 動和其與細胞層204的摩擦產(chǎn)生所需的剪切負(fù)荷。作為用于提供剪切負(fù)荷的備選裝置，用移動的葉輪230代替管 212a和212b以及壓力源216，該葉輪保持介質(zhì)202相對于細胞層204 移動(如箭頭232總體表示)。葉輪230可以采用幾種形式中的任何 一種，但是可以有利地采用如圖8e所示的圓柱形，其中室200的剛 性底部208采用大致相同的形狀，并且與葉輪表面保持相對一致的間 隔。因此僅僅通過保持葉輪230在恒定速度下旋轉(zhuǎn)，使介質(zhì)202以一 穩(wěn)定速度連續(xù)地掃過細胞204?；蛘撸淖?nèi)~輪230的速度可以改變 流動速度，從而改變剪切負(fù)荷的水平。電極210未示出，因為它們可 以位于該配置中的多個位置上。但是，優(yōu)選地，剛性室底208和葉輪 230自身由適當(dāng)?shù)碾姌O金屬制成，更優(yōu)選由自保護金屬制成，最優(yōu)選 由陽極化的鈮制成，并且它們自身被用作電極。骨生長的分化調(diào)節(jié)如上所述的本發(fā)明的波形在用于促進體內(nèi)骨組織生長和修復(fù)的方法中也是有用的。如上所述，具有A類波形的刺激可提高細胞增殖。 A類波形也導(dǎo)致用于促進分化的骨形態(tài)形成蛋白質(zhì)的增加。在一個實 施方案中，使用A類或在更低程度上使用B類電信號可實現(xiàn)BMP-2 和BMP-7產(chǎn)量的增加。對適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)組織愈合或形成組織移植物而 言，該效果是高度有價值的，它提供了增強生成足夠組織的方法。對 提供足夠的可滲透入用于組織工程目的的聚合物支架的細胞量而言， 該信號也是有價值的。在另一實施方案中，如體外試驗所示，體內(nèi)刺 激提供了成骨細胞的增殖和分化，以增加用于礦化的成骨細胞數(shù)量。 細胞數(shù)量上的這種增加提供了用于在通過電刺激發(fā)育或再生骨時填 入間隙或孔的方法。由A類波形誘導(dǎo)的通過增殖生成的細胞可以^皮立 即使用或利用傳統(tǒng)的細胞儲存方法進行保存直至將來需要時。用B類波形的刺激在較小程度上促進增殖，并且具有不同于A 類波形的作用。由B類波形促進的作用包括，但不限于，礦化作用、 細胞外蛋白質(zhì)生成、以及基質(zhì)機化。B類波形的作用也是有價值的， 可提供增強新骨組織的礦化步驟和骨化作用的方法。在一個實施方案 中，用B類波形刺激發(fā)育或再生骨組織，以增強礦化作用速率。已經(jīng) 有人提出，B類波形可以通過鈣/鈣調(diào)蛋白途徑并且通過G蛋白質(zhì)偶 連受體或機械感受器對骨細胞的刺激而進行作用(Bowler, Front Biosci， 1998，3:d769-780; Baribault et al， Mol Cell Biol， 2006， 26(2):709-717)。這樣，還提供了調(diào)節(jié)鈣/鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)的反應(yīng)活性以 及利用電刺激的G蛋白質(zhì)偶連受體或機械感受器的方法。這些細胞通 道和受體的調(diào)節(jié)對促進體外或體內(nèi)骨組織的生長和修復(fù)都是有價值 的。用C類波形的剌激可促進骨再生、成熟以及鈣化。這些波形也 是有價值的，并且提供了增強新骨組織的礦化步驟和骨化作用的方 法。用D類波形的刺激可促進軟骨發(fā)育和愈合以及骨鈣化，對治療 或逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎是有用的。這些波形的應(yīng)用包括體內(nèi) 應(yīng)用，例如修復(fù)損壞的軟骨，增加患有骨質(zhì)疏松癥的病人的骨密度；以及例如與軟骨的組織工程相關(guān)的體外應(yīng)用。還提供了組合或順次使用本申請中所述的波形的方法，以開發(fā)可 對骨軟骨組織的發(fā)育或再生產(chǎn)生具體生物效果的治療方案。在一個實施方案中，患有骨障礙的病人的骨折可以用信號治療， 以治愈骨折然后加固骨。作為該實施方案的非限制性實施例，患骨折的骨質(zhì)疏松病人可以通過首先用A類信號的刺激進行治療，以促進生 長因子的增殖和釋放，然后用B類波形，以促進在修復(fù)位置上的骨密 度增加，從而增加骨質(zhì)量密度和防止再骨折。在另一實施方案中，可以將本申請中所述的波形的兩類或多類組 合用于促進骨軟骨組織的相繼增殖、分化以及礦化。作為該實施方案 的一個非限制性實施例，在與聚合物基質(zhì)的結(jié)合中或結(jié)合之前，成骨 細胞的培養(yǎng)物可以在A類信號的影響下生長。當(dāng)接種聚合物基質(zhì)以 后，將B類信號施加給細胞-基質(zhì)結(jié)構(gòu)，以促進作為骨移植而有用的 結(jié)構(gòu)的礦化。在第三實施方案中，可以同時施加兩個或多個信號，以促進體內(nèi) 或體外骨軟骨組織的伴隨增殖、分化和礦化。不同的信號也可以被依次施加給骨軟骨組織，以便獲得比單獨傳輸其任一種信號更好的效 果。該依次施加的步驟可以根據(jù)需要而重復(fù)，以生成另外的組織(例 如骨)，該方法通過以足夠次數(shù)循環(huán)進行該兩步法來獲得所需的生物 效應(yīng)。作為一個特定的非限制性實施例，可以首先施加A類信號，以 首先通過增殖作用生成更多的骨細胞，然后施加B類信號，以誘導(dǎo)大 量的骨細胞而產(chǎn)生更多的骨組織(基質(zhì)、礦物和組織)，然后如果需 要則進行重復(fù)。利用相繼刺激重復(fù)的方案而生成的骨量將大于通過單 獨或組合的信號而生成的骨量。祖細胞刺激本申請所述的方法和波形可以被應(yīng)用于未分化的前體細胞，以促 進增殖和/或分化成定向的譜系。這種祖細胞可以包括，但不限于，干 細胞、非定向的祖細胞、定向祖細胞、多能祖細胞、多向性祖細胞或其它分化階段的細胞。具體還包括有成骨細胞和成軟骨細胞。在一個實施方案中，用A類信號體外刺激多能成體干細胞(間充質(zhì)干細胞或 骨髓干細胞)，以促進多能成體干細胞增殖和分化成具體的通道，例 如骨、結(jié)締組織、脂肪等。如前面所述的祖細胞刺激包括組合或者依 次施加這兩種信號?；蛘?，本申請中所述的波形和方法也可以被應(yīng)用于體內(nèi)多能成體干細胞(間充質(zhì)干細胞或骨髓干細胞)，以便用A類信號刺激細胞， 以促進將多能成體干細胞增殖和分化成具體通道，例如骨、結(jié)締組織、 脂肪等。也可包括這兩種信號的組合或者依次施加。祖細胞的電刺激也可以伴隨有已知用于促進祖細胞增殖或分化 的增殖和分化因子。增殖因子包括具有對細胞的致有絲分裂作用的任 何化合物。這種增殖因子可以包括，但不限于，bFGF、 EGF、粒細 胞集落刺激因子、IGF-I，等。分化因子包括具有對細胞的分化作用的 任何化合物。這種分化因子可以包括，但不限于，視黃酸、BMP-2、 BMP-7等。本申請所述的電波形提供了對體外或體內(nèi)骨軟骨組織的生長和 發(fā)育的分化和組合調(diào)節(jié)。在礦化作用之前，用A類信號增加細胞的增 殖，增大了骨細胞的數(shù)量，因此實現(xiàn)了由用B類信號刺激完成的隨后 的礦化作用的增加。本發(fā)明的波形也通過釋放一氧化氮和骨形態(tài)形成 蛋白質(zhì)促進了祖細胞增殖和分化。電容耦合用自鈍化金屬的體外和體內(nèi)刺激的制備通常很難，因為其很難獲 得金屬間電連接。本發(fā)明提供了可獲得使用自鈍化金屬電極的益處的 方法，而不存在與獲得可靠電連接相關(guān)的問題。這些電極的電容耦合 提供了感應(yīng)直流電流經(jīng)過自鈍化金屬電極的方法，其不需要任何電連 接。在該方法中，將由例如鈮、鉭、鈦、鋯、鉬、鎢和釩等自鈍化金 屬、鋁以及不銹鋼制成的電極滅菌，并設(shè)置在將被刺激的細胞群的附 近。電路導(dǎo)線被設(shè)置在例如鹽水溶液等導(dǎo)電介質(zhì)中的金屬電極附近，電信號通過電路導(dǎo)線傳輸從而刺激細胞群，其中，被電容耦合的電流 從導(dǎo)線經(jīng)過鹽水溶液和氧化物層進入自鈍化金屬電極。在一個實施方 案中，電容耦合刺激被用于體外應(yīng)用，例如，但不限于，細胞培養(yǎng)物。 可以使用該方法刺激一個培養(yǎng)皿，或者可以將幾個培養(yǎng)皿或孔連接在 一起，以進行相同的電刺激。在另一實施方案中，電容耦合刺激被用于體內(nèi)應(yīng)用，其中無菌陽 極化金屬電極被植入需要治療的病人體內(nèi)，而電路導(dǎo)線與皮膚接觸地 被設(shè)置在病人體外，以便在對促進組織的修復(fù)或生長有效量的時間內(nèi) 在被植入的金屬電極中感應(yīng)電流。例如，電極的外端可以在緊挨皮膚 的下方形成一個扁平線圈，信號可以使用設(shè)置于線圏正上方的皮膚上 的傳統(tǒng)皮膚接觸電極而耦合于該線圏中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，電:的任何絕緣材料覆蓋，從而使信號損，失和對不進行治療的組織的不 期望刺激最小。在例如骨修復(fù)的具體實施例中，由自鈍化金屬制成的 無菌陽極化金屬電極被植入需要治療的病人體內(nèi)，并且被刺激。當(dāng)骨 修復(fù)進行足夠時間之后，可以從病人體內(nèi)取出電極。增加BMP表達本發(fā)明進一步包括使用A類和B類波形來促進從被刺激的細胞 表達和釋放骨形態(tài)形成蛋白質(zhì)(BMP)的方法和裝置。本申請所述的 電信號可以被用于促使在足以對暴露于該信號的組織產(chǎn)生益處的電 平下釋放BMP。益處可以產(chǎn)生于不是直接地暴露于信號的組織中。BMP是骨誘導(dǎo)反應(yīng)中所涉及的多肽。除了 BMP-1之外，它們隸 屬于轉(zhuǎn)化生長因子P家族。至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并研究了至少20種BMP, 但是僅BMP 2、 4、 7已經(jīng)可以對使干細胞分化為成骨細胞的成熟細 胞的整個步驟進行體外刺激。目前的研究試圖開發(fā)用于整形外科組織 再生的輸送BMP的方法。(Seeherman， Cytokine Growth Factor Rev. 2005 Jun;16(3):329-45)。本申請所提供的方法是通過電刺激來誘導(dǎo)用 于整形外科組織再生的體外或體內(nèi)BMP釋放，而不是通過在技術(shù)上嚴(yán)格要求且成本高的輸送方法中的輸送外源性BMP。在一個實施方案中，使用A類以及在較低程度上使用B類波形， 以誘導(dǎo)外源性BMP的表達和釋放。內(nèi)源性BMP的釋放促進目標(biāo)組 織的生長和分化。刺激電極的設(shè)置對體外制備的局部區(qū)域或在需要增 加BMP表達的病人體內(nèi)提供了一種耙定BMP表達的方式。在一個實 施方案中，BMP-2或BMP-7或其組合被外源性地釋放，以實現(xiàn)目標(biāo) 組織的分化和生長。在一個特定的實施方案中，釋放BMP-2和BMP-7 之一或其兩者可以促進骨或軟骨組織中的分化、礦化、蛋白質(zhì)生成以 及基質(zhì)機化。通過一氧化氮刺激骨、軟骨或其它結(jié)締組織細胞本申請中所述的方法和電信號也可以被用于促進骨、軟骨或其它 結(jié)締組織的修復(fù)和生長。在一個實施方案中，B類波形通過釋放一氧 化氮(NO)增加了細胞的生長。波形可以促使在足以對暴露于該信 號的組織產(chǎn)生益處的電平下釋放一氧化氮。益處可以產(chǎn)生于不直接暴 露于該信號的組織中。通過與電刺激結(jié)合共同施用NO供體可以進一 步增加骨、軟骨、或其它結(jié)締組織細胞生長。NO供體包括，但不限 于，硝普鈉(SNP) 、 SIN-1、 SNAP、 DEA/NO以及SPER/NO。通 過與電刺激結(jié)合共同施用NO合酶抑制劑可以降低骨、軟骨或其它結(jié) 締組織細胞生長。這種NO合酶抑制劑包括，但不限于，N(G) -硝基-l-精氨酸甲酯(L-NAME) 、 NG-單甲基-L-精氨酸 (L-NMMA)、以及7-硝基吲唑(7-NI)。可以根據(jù)具體要求使 用這些方法來調(diào)節(jié)骨、軟骨或其它結(jié)締組織細胞生長。本發(fā)明的裝置和方法的應(yīng)用通過使用本申請所述的本發(fā)明的裝置和方法，該裝置和方法對促 進骨軟骨組織的生長、分化、發(fā)育和礦化是有效的?？梢韵嘈?，通過加強將例如在對不同生理條件的細胞反應(yīng)中所涉 及的細胞因子類等化學(xué)因子的釋放，該裝置可以直接在治療位置上操 作。這加劇了血液流動并且抑制了在治療位置上的進一步發(fā)炎，從而增強了身體的內(nèi)在治療處理。本發(fā)明尤其可用于加速愈合簡單的或復(fù)雜的(多處的或粉碎性 的)骨折，包括，但不限于，在手術(shù)過程中被鋸開的或被斷開的骨。 本發(fā)明可以被用于促進脊推融合手術(shù)之后的推骨融合。本發(fā)明可以被用于治療不愈合的骨折；治療、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏 松癥；治療、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)減少；治療、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)骨壞死；延遲 或消除編織骨(骨痂、骨刺)的形成；延遲或逆轉(zhuǎn)長期臥床休息中的 骨鉀質(zhì)流失；延遲或逆轉(zhuǎn)微重力下的骨鈣質(zhì)流失。此外，本發(fā)明可以 被用于加劇局部血液循環(huán)，增加外傷傷口區(qū)域的血液流動，增加慢性 皮膚潰瘍區(qū)域的血液流動并且調(diào)節(jié)血液凝固。還可以利用本發(fā)明的 一 個方面是加速愈合^皮損壞的或凈皮撕傷的 軟骨。而且，本發(fā)明可以被用于加速皮膚外傷或潰瘍的愈合(表皮形 成)。本發(fā)明可以被進一步用于加速所培養(yǎng)的細胞或組織的生長，調(diào)節(jié) 細胞增殖，調(diào)節(jié)細胞分化，調(diào)節(jié)細胞循環(huán)進度，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子的 表達，調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達，調(diào)節(jié)軟骨生長因子的表達，調(diào)節(jié) 胰島素樣生長因子的表達，調(diào)節(jié)成纖維細胞生長因子的表達，調(diào)節(jié)腫 瘤壞死因子的表達，調(diào)節(jié)白細胞間介素的表達以及調(diào)節(jié)細胞因子類的 表達。本發(fā)明的方法和裝置通過下面的非限制性實施例進一步說明。本 領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本申請的描述之后，在不脫離本發(fā)明的精神和/ 或所附的權(quán)利要求范圍的條件下，可以借助其它各種實施方案、變形 例、以及它們的等同替換。具體實施方案 實施例1PEMF信號結(jié)構(gòu)對原始成骨細胞培養(yǎng)物中的礦化和形態(tài)的影響本研究的目標(biāo)是通過評價原始骨細胞培養(yǎng)物中的生物化學(xué)和形態(tài)變化來比較用電容耦合輸送的兩種PEMF波形結(jié)構(gòu)。方法成骨細胞培養(yǎng)物原始的人體成骨細胞(CAMBREX , Walkersville, MD)被擴增到75%融合(confluence)，并且以50000 個細胞/ml的密度直接接種在前面所述的LAB-TEKTM (NALGE NUNC INTERNATIONAL1 , Rochester, NY)室中。培養(yǎng)物最初是在 沒有分化因子的條件下用基礎(chǔ)成骨細胞介質(zhì)支持的。當(dāng)培養(yǎng)物在室內(nèi) 達到70%融合時，介質(zhì)被補充有氬化可的松-21 -半琥珀酸鹽 (200mM的最終濃度)、p-甘油磷酸鹽U0mM的最終濃度)和抗 壞血酸。在37。C、 5%C02、 95%空氣下的潮濕空氣中培養(yǎng)成骨細胞 持續(xù)21天。在試驗期間每隔兩天更換一次介質(zhì)并對每個室補充4ml。電刺激刺激培養(yǎng)物，每天刺激兩次且每次持續(xù)30分鐘或兩小 時。將兩種電信號方案可選擇地施加到細胞上，其中一種是表示為"信 號A"的連續(xù)波形(60/28正/負(fù)信號持續(xù)時間，以微秒計)，而另一種 是表示為"信號B，，的連續(xù)波形(200/28正/負(fù)信號持續(xù)時間，以微秒 計)。在樣本中測得的密度為2.4 mV/cm (峰到峰)。未被刺激的成 骨細胞(NC)以相似的方式以相同的密度(作為對照例)進行接種。 使用具體方法中的步驟測量以下內(nèi)容堿性磷酸酶、鈣、骨鈣蛋白和 組織結(jié)構(gòu)。將下面圖中的各個符號記為"A"信號和"B"信號，將30分 鐘持續(xù)時間記為"l"，將2小時持續(xù)時間記為"2"，將NC(或融合) 作為沒有電流(即，Al就是A信號-30分鐘；B2就是B信號-2小 時)。本申請所用的電裝置實現(xiàn)了將連續(xù)波形的電刺激同時應(yīng)用到多 個外植體。對每個試驗而言，六對外植體被設(shè)置在4ml培養(yǎng)介質(zhì)中的 單個的孔中。在相同條件下培養(yǎng)對照樣本，其僅有的不同在于缺乏所 輸送的信號。本試驗的結(jié)構(gòu)包括通過鈮導(dǎo)線的線圏段串聯(lián)連接的六個 測試培養(yǎng)孔(17x42mm)。將人體成骨細胞設(shè)置在LAB-TEKTM II滑孑L (NALGE NUNC INTERNATIONALtm， Rochester, NY )中，該各滑孔具有表面面積為 約lOcm2。通過使其經(jīng)由鈮導(dǎo)線串聯(lián)連接而將信號同時施加給幾個室，其中鈮導(dǎo)線用作耦合電容。該刺激是200/28微秒雙極矩形脈沖以15/ 秒重復(fù)的9毫秒脈沖段、傳輸9mV/cm (類似于標(biāo)準(zhǔn)臨床骨治療信號) 的指定信號B;或是60/28微秒基本單極脈沖的48毫秒脈沖段、傳輸 4mV/cm的指定信號A。培養(yǎng)物每天接受兩次30分鐘或2小時的刺激。 在7、 14和21天的時間點上從介質(zhì)中取出樣本并分析堿性磷酸酶、 骨鈣蛋白、基質(zhì)鈣和組織學(xué)。伴隨形態(tài)的礦化已通過VonKossa染色 法得到確認(rèn)。所有的生物化學(xué)分析都是通過傳統(tǒng)的分析方法進行的。結(jié)果使用可商購的ELISA試劑盒(R&D SYSTEMS11, Minneapolis MN; INVITROGEN， INC.TM， Carlsbad, CA )來評價PGE2生成量。 其結(jié)果以pg/mg組織/24小時(即，nM/g/24hrs)為單位進行表示。堿性磷酸酶(AP):在研究設(shè)計中所表示的時間點上，溶解細 胞(Mammalian-PE， Genotech, St. Louis， MO)并收集上清液。通過在 鎂存在的堿性條件下將對硝基苯磷酸鹽(PNPP)裂解為硝基苯 (PNP)，測量堿性磷酸酶。最終產(chǎn)品PNP的比色度是在405納米處 具有吸收峰。使用0.5M碳酸鹽緩沖液可以獲得pH10.3的堿性條件。 直接分析培養(yǎng)介質(zhì)以獲得ALP活性。用氚核X-100的溶液萃取細胞 層ALP，并測量等分試樣的ALP活性。在溶解緩沖萃取之后測量上 清液和膜中的堿性磷酸酶(圖5)。如在其它研究(Lohman, 2003)中 所預(yù)期那樣，在膜中的堿性磚酸酶表達在接近7日時最高。但是，在 "B"刺激下培養(yǎng)的細胞中，培養(yǎng)介質(zhì)持續(xù)顯示可測量的AP增加。骨鈣蛋白骨鈣蛋白(5800道爾頓(dalton ))是成骨細胞的具體產(chǎn)物。少量的骨鈣蛋白被直接地釋放到循環(huán)中；它主要被沉積在骨基質(zhì)中。研究表明，骨鈣蛋白作為完整的(l-49)蛋白質(zhì)和作為N-末端片段進行循環(huán)。主要的N-末端片段是肽(1-43) 。 Mid-Tact Osteocacin Elisa試劑盒因其高特異性而被選擇。該分析是高度敏感的 (0.5ng/ml)并且僅需要25微升的樣本。對照組與我們的試驗組同時 進行，這對由BTI制造商(BTI， Stoughton， MA)提供的期望值提供了強相關(guān)。在冷卻處理培養(yǎng)物后測定的并且由基質(zhì)成分確定的骨4丐蛋白 沉積在進行"B，，刺激后更加顯著，并且在21日時達到最高(圖6)。DNA含量用0.1N氫氧化鈉萃取細胞層，并且取等分試樣 (aliquot )用CyQuant分析試劑盒(INVITROGEN， INC.TM， Carlsbad CA.)分析DNA含量。對于用氚核X-100萃取來測量ALP含量的細胞 樣本，用l N氫氧化鈉調(diào)節(jié)萃取物至(UN氬氧化鈉。標(biāo)準(zhǔn)曲線包含 匹配的緩沖液。對于還要求蛋白質(zhì)含量的樣本，采用染色結(jié)合法 (Bradford)取等分試樣測量蛋白質(zhì)含量。鈣通過Schwarzenbach理論方法用形成紫色絡(luò)合物的鄰曱酚 酞氨縮絡(luò)合劑測量鉤。通過添加2ml的0.5M醋酸并過夜，4丐被溶解 并且通過在552nm的比色分析而對照定量測得其含量(CORE LABORATORY SUPPLIESTM， Canton, MI)。在培養(yǎng)物中的4丐分布也是通過組織學(xué)來評價的。將細胞固定在2%戊二醛中，用卡可酸鹽緩沖液清洗，用PBS清洗，然后再進行水合 以如所說明的染色。各時間段是相繼進行的；代表性的形態(tài)持續(xù)顯示 了21天，比較了"A"信號與"B"信號，并且將這兩種信號與對照組進 行了比較(圖6)。對于信號B，最顯著的測定值是具有明顯的優(yōu)選 排列的(我們將其解釋為"假松質(zhì)性"骨)的鈣分布。對于信號A，呈 現(xiàn)出比信號B更高質(zhì)量的細胞增殖和更少的基質(zhì)生成(但是，信號A 明顯比對照物具有更多基質(zhì))。骨測量法分析是由Croucher方法發(fā)展和變化而來的。在該二維 室系統(tǒng)中，研究了相對于取樣的柵格樣本的整體面積的平均小梁骨面 積(trabecular area )。在各個強度下從兩室采用最少20個視野進行 骨形成、類骨質(zhì)寬度以及細胞數(shù)目的研究。為了直接比較以及去除誤 差，使用隨機的具體柵格。另外，刺激室和對照室的成骨細胞培養(yǎng)物 都是通過Von Kossa法(Mallory， 1961)直接染色而檢查組織學(xué)和 定量測定鉀在培養(yǎng)物中的分布。結(jié)論在接近10~14天時升至峰值然后逐漸減退的堿性磷酸酶在由信 號B刺激的上清液中增加。在冷卻處理培養(yǎng)物之后測定的并且通過基 質(zhì)成分確定的骨鈣蛋白沉積在僅施加信號B時更顯著，并且在21天 時增大至最高點。所測定的以mg/dl為單位的基質(zhì)鉀和作為組織培養(yǎng) 皿的面積的函數(shù)的基質(zhì)鉤在僅施加信號B的情況下為最多。由組織學(xué) 和Von Kossa染色法獲得的礦物分布驗證了來自化驗分析的生物化學(xué) 數(shù)據(jù)。B刺激獲得了更大量的礦物，而且形成可在三維小梁骨排列中 提供所期望的類似張力動力的網(wǎng)狀二維圖形。用信號A比對照物更高 質(zhì)量地呈現(xiàn)出細胞增殖，但是用信號B的顯著增加的礦化和圖形在 21天時更為明顯。這兩種信號結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了非常不同的效果，這一事實可以通過分析 信噪比(SNR)來容易地說明，該分析表明在采用Ca/CaM目標(biāo)時， 信號B的可檢測性比信號A高10倍。該研究首次表明PEMF具有潛 在的能實現(xiàn)與組織形態(tài)學(xué)一致的結(jié)構(gòu)變化。幾何圖形在培養(yǎng)21天后 變得明顯，其反映出與松質(zhì)骨一致的小梁骨網(wǎng)狀物，并且與在對照物 中和在所有評價時間點上暴露于信號A的培養(yǎng)物中的細胞的隨機定 向形成鮮明對比。這樣的結(jié)果表明優(yōu)選的信號結(jié)構(gòu)能夠?qū)崿F(xiàn)以前限于 組織水平觀察的結(jié)構(gòu)層次。實施例2用于體外PEMF刺激的鈮"鹽"橋的使用 引言開發(fā)使用陽極化鈮導(dǎo)線的無源電極系統(tǒng)，以便將時變的電信號耦 合到培養(yǎng)室中。該設(shè)計的目的在于通過代替?zhèn)鹘y(tǒng)的用于傳輸PEMF類 信號(例如，由EBI重復(fù)脈沖段骨生長刺激器在用于細胞、組織研究 的體外組織中電容地而不是電感地產(chǎn)生的信號)的電解質(zhì)橋技術(shù)來降 低復(fù)雜性和提高再現(xiàn)性。經(jīng)陽極化處理的鈮導(dǎo)線容易獲得，并且僅要 求筒單的手動工具即可形成電極橋。在可利用的頻率下(通常在5Hz到3Hz之間)，可以忽略DC電流的通過。背景
電容耦合的電場通常都已被引入到具有傳統(tǒng)的電解質(zhì)鹽橋的培 養(yǎng)介質(zhì)中，這種鹽橋具有受限的頻率響應(yīng)并且很難在后續(xù)的暴露時間 中不受污染地進行使用。鈮(鈳)是可以自鈍化的若干金屬中的一種， 當(dāng)被暴露于氧氣或濕氣中時形成薄而很耐久的表面氧化物層。其它金 屬有鉭、鈦、以及在一個更低程度上有不銹鋼。該步驟可以通過陽極 化處理加速或控制。自鈍化的問題是使得與其它金屬的可靠連接變得 困難。本設(shè)計避免了這個難題。
材料和方法
氧化鈮(Nb2Os)是堅硬的、透明的、電絕緣的，并且對水、普 通試劑和寬pH范圍下的生物液體都是惰性的。陽極化鈮形成顯示一 系列鮮艷光千涉色彩的具有均勻厚度的Nb2Os，并且產(chǎn)生穩(wěn)定且可再 現(xiàn)的電容，由于沒有添加染料，該光干涉色彩可用于珠寶。珠寶商的 鈮以標(biāo)準(zhǔn)色彩進行出售，每種色彩代表一種不同的氧化物厚度。由于 Nb2Os的介電接觸異常高Ur-41so)并且該層很薄(48~70nm)， 所以它們的電容都格外大。"紫色的"鈮具有最薄的氧化物和最高級別 的電容(對于22號導(dǎo)線(Rio Grande # 638-240 )為0.158>iF /cm )， 接近對48nM氧化物(420nM峰值反射)的計算值。在水或生理鹽水 中，在彎曲過程中形成的剪斷線端和小瑕疵很快由氧化物愈合，不需 要再陽極化處理
鈮橋
在本申請中，氧化鈮與介質(zhì)形成唯一的電接觸，并且PEMF類 信號電容性地經(jīng)過它。在小于幾毫安的信號電平下，引起人為現(xiàn)象的 電解或pH變化可以忽略。多個室可以串聯(lián)連接，每個室均接收相同 的信號。各鈮橋均被彎曲，以在各末端上形成片狀電極，鈮橋通常的 電容為0.56pF。在矩形室的端部設(shè)置電極橋形成幾乎均勻的電流分布 和在整個介質(zhì)中的電壓梯度。在培養(yǎng)變換器、電極以及PEMF類信號
的典型裝置中測量的梯度如在圖4中預(yù)先示出，并且在其相應(yīng)的文字中已經(jīng)描述，該梯度表明主要在電極附近或介質(zhì)在深度方向上的顯著
變化處的平均變動為±3%。 一個室或幾個串聯(lián)連接的室通過特定鈮端 的橋而被賦予能量，各橋的外端通過鹽水而電容耦合到形成連接終端 的銀片電極。這消除了將鈮連接于自身或任何其它金屬的必要。電流 通過一串聯(lián)極限電阻(series limiting resistance ) R咖控制。所獲得的 帶通(額定值為土3dB)隨R，im而稍微變化，但是，在5Hz 3MHz之 間運行的測試裝置中，最高頻率通過了試驗。因此PEMF類信號可以 通過電容耦合在體內(nèi)不失真地傳輸。
試驗
使用前面所述的B類波形在成骨細胞和軟骨細胞培養(yǎng)物上測試 鈮電極橋的實用性。在不存在細胞的情況下，將該信號施加在OGMtm 成骨細胞介質(zhì)(CAMBREX , Walkersville， MD)上，24小時后測得的 pH為8.29，而沒有被賦能的對照物為8.27，這證實了可以忽略的電 解。使用A類和B類波形兩者的OGMTM在21天中成骨細胞強力增 殖和分化和多孔性骨類結(jié)構(gòu)的發(fā)育表明不存在生理有效的細胞毒性。 持續(xù)21天進行30分鐘和兩小時暴露于培養(yǎng)物中的波形，然后，用能 量色散X射線(EDX)分析細胞和基質(zhì)。沒有檢測到鈮。在其它研究 中，將B類信號應(yīng)用到含1 %胎牛血清的培養(yǎng)介質(zhì)中的人體軟骨細胞 (HCC)持續(xù)96小時。B類信號導(dǎo)致細胞數(shù)量增加154。/。，細胞數(shù)量 是通過測量細胞層中的DNA含量而獲得的，該增加再次表明沒有有 效細胞毒性。直接比較電容耦合的信號與除了是電磁耦合之外其余相 同的信號，它們均每天被傳輸30分鐘，持續(xù)四天，通過DNA測得成 骨細胞增加，它們的增加都顯著不同于對照物(鈮157% ， EM耦合 164%)，但相互之間沒有明顯不同。
結(jié)論
已經(jīng)研發(fā)出一種用于將電容耦合的PEMF類信號施加給培養(yǎng)物 中的細胞/組織的新鈮電極橋。鈮橋的帶通為5Hz到3MHz，因此例如用于骨和傷口修復(fù)的臨床應(yīng)用的PEMF類信號可不失真地通過。與 標(biāo)準(zhǔn)電解質(zhì)橋結(jié)構(gòu)不同，鈮橋在培養(yǎng)皿中提供了均勻的電流密度。長 期的PEMF暴露的應(yīng)用表明沒有電解或生理有效的細胞毒性。
實施例3
使用電容耦合的PEMF信號刺激軟骨細胞 引言
目前正在測試類似于用于骨修復(fù)的臨床應(yīng)用的PEMF信號對減 輕關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)疼痛的能力。所關(guān)心的是該疼痛減輕信號是否還 可以改善受損軟骨的潛在問題。
背景
與藥物治療和生物制劑相比，基于PEMF的治療方法提供了容 易使用的非侵入性治療，該治療不包含具有潛在副作用的外來試劑， 并且具有零清除時間。PEMF治療方法的問題包括識別響應(yīng)細胞、 說明細胞上的物理轉(zhuǎn)導(dǎo)位置、以及確定導(dǎo)致細胞響應(yīng)的反應(yīng)的生物機 理。本研究的目的在于確定目前正在,皮測試疼痛減輕的具體PEMF信 號(MEDRELIEF⑧，Healthonics， Inc， GA)是否可以體外刺激軟骨細胞 或者反應(yīng)的生物機理是否可以被解釋。
方法
將正常人體軟骨細胞(HCC; CAMBREX , Walkersville， MD)以 單層附著在矩形的細胞室中。PEMF應(yīng)用通過鈮電極橋系統(tǒng)而電容耦 合，該系統(tǒng)允許時變電流均勻流過室。本申請所描述的脈沖段B類信 號由不對稱矩形脈沖的10毫秒脈沖段構(gòu)成，寬度為200/28，以15Hz 重復(fù)。每次治療施加PEMF信號30分鐘。用細胞層的DNA含量評 價細胞生長。通過使用由INVITROGEN INC. (Carlsbad， CA)提供 的分析試劑盒的Griess反應(yīng)評價培養(yǎng)介質(zhì)的一氧化氮(NO)含量。 其結(jié)果以NO的微摩爾數(shù)除以通過細胞層的DNA含量確定的細胞數(shù)量來表達。 結(jié)果
PEMF信號在持續(xù)96小時的期間內(nèi)每12小時以峰到峰為400 微安施加一次給生長在含1%胎牛血清的培養(yǎng)介質(zhì)中的HCC細胞， 該信號導(dǎo)致細胞生長增加153±22%， p<0.001。所關(guān)心的是，在第一 次PEMF治療之后的24小時收集的條件培養(yǎng)基顯示NO增加196±14 %， p<0.001，其在96小時時下降到非有效水平。在類似條件下，當(dāng) 將SNP ( NO供體——硝普鈉)添加到最終濃度為3微克/ml時，也 出現(xiàn)在24小時時的NO的增加(174±26%， p〈0.001)和在96小時時的 細胞數(shù)目的增加(168士22。/。，p〈0.001)(與未經(jīng)治療的對照物相比)。 在隨后的試驗中，血清濃度降低到0.1% ，每24小時一次地在40微 安下施加PEMF,并且在72小時后進行測量。PEMF治療將條件培 養(yǎng)基中的NO含量增大至154±30% ， <0.01。如圖7所示，PEMF治 療增加了細胞數(shù)量并且該細胞響應(yīng)被L-NAME (—氧化氮合酶抑制 劑)減弱。
結(jié)論
這些結(jié)果表明目前正在測試降低由關(guān)節(jié)炎引起的關(guān)節(jié)疼痛的 PEMF信號也可以對軟骨提供益處。數(shù)據(jù)表明人體軟骨細胞可以用增 加的細胞生長來響應(yīng)這種信號。而且，用于PEMF刺激的軟骨細胞生 長的作用的可能的生物機理是通過釋放NO完成的。軟骨細胞對NO 供體的類似響應(yīng)支持該理論。盡管不是結(jié)論性的，但是數(shù)據(jù)證實 PEMF治療后增加的細胞生長被NO介導(dǎo)，或者說在PEMF引起細胞 生長增加的機理中NO是一個必需的步驟。
實施例4
在原始成骨細胞培養(yǎng)物中的BMP生成的PEMF刺激取決于信 號結(jié)構(gòu)和暴露時間引言作為在脊推融合手術(shù)和用于治療長骨中的頑固性不愈合的輔助手段，PEMF作為非手術(shù)性療法已被證實有效。試點研究已經(jīng)證明成 骨細胞對信號結(jié)構(gòu)和時間會不同地響應(yīng)。 一個重要的不同包括用沉積 基質(zhì)代替細胞增殖的傾向?；贐MP在脊推融合和非愈合中的被證 實的功效以及基于表明BMP-2和BMP-4 #皮PEMF刺激的嘗試 (Bodamyali， 1998)，我們的研究集中在更好地理解以前的細胞響應(yīng)是 否可能與BMP調(diào)節(jié)相關(guān)。目標(biāo)本研究比較了用電容耦合傳輸?shù)膬煞NPEMF波形結(jié)構(gòu)，將原始 骨細胞培養(yǎng)物中的生物化學(xué)和形態(tài)變化與BMP調(diào)節(jié)相聯(lián)系。方法將正常人體成骨細胞設(shè)定在10cm2的各培養(yǎng)室中。通過利用作為 耦合電容的鈮導(dǎo)線將幾個室串聯(lián)連接，可以同時將多個信號施加到若 干室中。刺激由 一連續(xù)系列的60/28微秒矩形雙極性脈沖(被記為"信 號A")或200/28微秒矩形雙極性脈沖(被記為"信號B")構(gòu)成，該 刺激將1.2 mV/cm (在A信號的情況下)或2.4 mV/cm (在B信號的情 況下)的峰-峰電場均勻地施加給培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物暴露30分鐘(1) 或兩小時(2)，每天兩次，得到用于比較的組A1、 A2、 B1和B2。 通過ELISA分析法對先前被用于膜蛋白質(zhì)測定的等分試樣分析BMP 蛋白質(zhì)，將先前被用于測定鈣和理解形態(tài)的基質(zhì)用于分離RNA,該 RNA隨后通過使用已知可獲得的用于(18sRNA)BMP-2和BMP-7的 序列引物的兩步逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)來進行分析。刺 激增殖的信號和刺激基質(zhì)沉積的信號都被分析以便于BMP調(diào)節(jié)和蛋 白質(zhì)表達功能。使用來自7天、14天、21天的時間點上的樣本，以 確保對分析的相同比較。結(jié)果該試驗的主要的結(jié)果有六個方面1 ) BMP蛋白質(zhì)和用于BMP 的mRNA響應(yīng)兩種刺激(尤其是"A"信號)而增加；2)每天傳送兩 次的30分鐘刺激與兩小時治療相比在21天時提供BMP-2表達增加 接近40倍，其大部分的增加是在14天到21之間的期間獲得的；3) "A"信號的30分鐘刺激提供了 BMP-7表達的15倍增加，同樣也是在 14天到21天之間的分析最為顯著；4 )在"B"信號的情況中發(fā)現(xiàn)BMP-2 或BMP-7僅適度增加；5)該研究首次證實BMP-7表達通過PEMF 刺激而促進；6)盡管增殖評價是定性的，但BMP沉積的致有絲分裂 性質(zhì)與以前的公開文獻一致。評價PEMF短期時間內(nèi)對變形的細胞系 的作用的文獻表明BMP-3和BMP-6都沒有被刺激(Yajima， 1996)。 我們沒有對我們的模型評價這些生長因子。結(jié)論由于大部分研究已經(jīng)表明BMP-2具有形態(tài)形成和致有絲分裂的 性能，所以細胞響應(yīng)"A"信號而增殖也就并不奇怪。兩種信號結(jié)構(gòu)產(chǎn) 生了很不相同的效果，這可以通過SNR分析潛在地進行解釋，該SNR 分析表明在設(shè)定Ca/CaM轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的情況下，信號"B，，的用量可以大 于信號"A，，的IO倍。盡管由"B，，信號提供了過大的基質(zhì)沉積，但也許 更未預(yù)料到的是標(biāo)準(zhǔn)化的BMP-2和BMP-7水平。骨形成敏銳地依靠 生長因子和表面微細結(jié)構(gòu)的平衡。事實上，平滑表面的存在超越了細 胞對BMP-2的響應(yīng)，并且加重了畸形的礦化作用。如果在響應(yīng)"B" 信號中觀察到高度的基質(zhì)機化和沉積，BMP自身內(nèi)部和本身的(in and of )轉(zhuǎn)導(dǎo)似乎不足以發(fā)生骨形成，并且可以提供單獨通過不同的 目標(biāo)才幾理而發(fā)生。實施例5個案研究用PEMF刺激治療骨質(zhì)疏松癥 一個骨質(zhì)疏松癥病人(女性、年齡50歲、起始的T- - 3.092)使用采用信號B( 200/30 )的電刺激， 一周使用4~5天，每天使用3~ 5小時。該病人在一年的時間內(nèi)持續(xù)相同的藥物治療、營養(yǎng)補充和活 動。在6個月和12個月時進行骨密度掃描，發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)量密度增加16 %和29 % 。
權(quán)利要求
1.一種用于調(diào)節(jié)骨、軟骨或其它結(jié)締組織的發(fā)育或修復(fù)的方法，包括用電信號對正在發(fā)育或再生的組織刺激足以調(diào)節(jié)該組織的發(fā)育或修復(fù)的時段的步驟，其中，所述電信號包括A類、B類、C類或D類信號。
2. 如權(quán)利要求l的方法，還包括用第二電信號刺激正在發(fā)育的 組織的步驟，其中，所述第二電信號包括A類、B類、C類或D類信 號。
3. 如權(quán)利要求2的方法，其中，A類信號包括具有p長度的長 分量和具有a長度的短分量。
4. 如權(quán)利要求2的方法，其中，A類信號包括持續(xù)時間為約60 微秒的長分量和持續(xù)時間為約28微秒的短分量。
5. 如權(quán)利要求2的方法，其中，B類信號包括具有Y長度的長 分量和具有a長度的短分量。
6. 如權(quán)利要求2的方法，其中，B類信號包括持續(xù)時間為約200 微秒的長分量和持續(xù)時間為約28微秒的短分量。
7. 如權(quán)利要求2的方法，其中，所述兩種電信號被同時或依次 施加，以促進所述組織中的細胞的增殖、分化、或基質(zhì)生成。
8. 如權(quán)利要求l的方法，其中，所述組織包括祖細胞。
9. 如權(quán)利要求l的方法，其中，所述祖細胞選自干細胞、未定 向祖細胞、定向祖細胞、多能祖細胞或多向性祖細胞。
10. 如權(quán)利要求l的方法，其中，所述電刺激增加了 BMP-2或 BMP-7的生成。
11. 如權(quán)利要求l的方法，其中，所述電刺激調(diào)節(jié)一氧化氮的產(chǎn)生。
12. —種用于生成或修復(fù)骨、軟骨或結(jié)締組織的方法，該方法包 括用電信號刺激正在發(fā)育或再生的組織的步驟，其中，所述電信號包 括A類、B類、C類或D類電信號。
13，如權(quán)利要求12的方法，還包括結(jié)合所述電信號的機械裝載 的步驟。
14. 如權(quán)利要求12的方法，其中，所述電刺激使用電容耦合電 極來完成。
15. —種用于生成或修復(fù)骨、軟骨或其它結(jié)締組織的方法，包括 如下步驟用第一電信號刺激所述組織以刺激組織形成細胞的增殖、 分化或基質(zhì)生成；然后用第二電信號刺激正在發(fā)育的所述組織以剌激 所述組織形成細胞的增殖、分化或基質(zhì)/礦物生成。
16. 如權(quán)利要求15的方法，其中，所述第一電信號包括A類信 號，所述第二電信號包括B類信號。
17. 如權(quán)利要求15的方法，其中，A類信號包括具有p長度的 長分量和具有a長度的短分量。
18. 如權(quán)利要求15的方法，其中，A類信號包括持續(xù)時間為約 60微秒的長分量和持續(xù)時間為約28微秒的短分量。
19. 如權(quán)利要求15的方法，其中，B類信號包括具有y長度的 長分量和具有a長度的短分量。
20. 如權(quán)利要求15的方法，其中，B類信號包括持續(xù)時間為約 200微秒的長分量和持續(xù)時間為約28微秒的短分量。
21. —種電容耦合橋電極，包括由陽極化金屬制成的電極。
22. 如權(quán)利要求21的電極，其中，所述陽極化金屬是鈮、鉭、 鈦、鋯、鉬、鵠、釩、鋁或不銹鋼。
23. —種包括細胞和電刺激器的系統(tǒng)，該電刺激器將A類信號 或B類信號傳輸給所述細胞。
24. 如權(quán)利要求23的系統(tǒng)，還包括用于機械裝載所述細胞的裝置。
25. 如權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中，A類信號包括持續(xù)時間為約 20微秒至100微秒的長分量和持續(xù)時間為約5微秒至95微秒的短分
26. 如權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中，A類信號包括持續(xù)時間為約60微秒的長分量和持續(xù)時間為約28微秒的短分量。
27. 如權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中，B類信號包括持續(xù)時間為約 100微秒至1000微秒的長分量和持續(xù)時間為約5微秒至75微秒的短 分量。
28. 如權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中，B類信號包括持續(xù)時間為約 200微秒的長分量和持續(xù)時間為約28微秒的短分量。
29. 如權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中，所述細胞選自干細胞、未定 向祖細胞、定向祖細胞、多能祖細胞、多向性祖細胞或處于其它分化 階段的細胞。
30. 如權(quán)利要求23的培養(yǎng)系統(tǒng)，還包括由陽極化金屬制成的電 容耦合橋電極。
31， 一種用于制備適合于移植的組織的試劑盒，包括細胞和提供 電刺激波形的電刺激器，其中所述電刺激波形包括A類、B類、C類 或D類信號；其中所述波形促進所述細胞增殖、分化或基質(zhì)生成為適 于移植的組織。
32. 如權(quán)利要求31的試劑盒，還包括可生物降解的或生物穩(wěn)定 的支架。
33. 如權(quán)利要求32的試劑盒，其中所述支架由選自天然或合成 聚合物的材料制成。
34. 如權(quán)利要求32的試劑盒，其中，所述支架與生長促進分子 或粘合促進分子相結(jié)合。
35. 如權(quán)利要求31的試劑盒，還包括用于機械裝載所述細胞的裝置。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)骨、軟骨、或其它結(jié)締組織的生長、發(fā)育和修復(fù)的組合物和方法。還提供了裝置和刺激波形，以不同地調(diào)節(jié)成骨細胞、軟骨細胞、和其它結(jié)締組織細胞的行為，從而促進體外或體內(nèi)應(yīng)用的增殖、分化、基質(zhì)形成或礦化?？梢允褂镁哂须姾善胶獾男盘柕倪B續(xù)模式和脈沖段模式的細胞刺激。骨、軟骨、和其它結(jié)締組織生長通過經(jīng)由電刺激釋放一氧化氮而被部分地刺激，并且可以通過同時供給NO供體和NO合酶抑制劑來調(diào)節(jié)。骨、軟骨和其它結(jié)締組織生長通過響應(yīng)促進細胞分化的電刺激釋放BMP-2和BMP-7而被部分地刺激。所述方法和裝置對促進骨折修復(fù)、軟骨和結(jié)締組織修復(fù)、以及對用于移植的工程組織都是有用的。
文檔編號A61N1/00GK101237904SQ200680028374
公開日2008年8月6日 申請日期2006年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日
發(fā)明者J·W·科隆博格, S·L·戈爾頓, T·甘尼 申請人:康奧尼斯有限公司