專利名稱：軟骨發(fā)育不全致病基因突變檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型提供了一種軟骨發(fā)育不全致病基因突變檢測(cè)試劑盒，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
成纖維細(xì)胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor3, FGFR3)位于4pl6.3，cDNA長4. 4kb，編碼840個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，包含19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子。FGFR3是骨骼發(fā)育過程中重要的調(diào)控分子，主要通過抑制軟骨細(xì)胞增生、分化來抑制軟骨形成過程，其功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變可以導(dǎo)致軟骨發(fā)育不全。軟骨發(fā)育不全是小兒遺傳性侏儒癥中最常見的類型，發(fā)病率為1/15000 1/26000，呈常染色體顯性遺傳，該病外顯率為100%。目前國外以及中國臺(tái)灣地區(qū)報(bào)道的突變，97%以上位于FGFR3基因第10外顯子的1138位核苷酸，其中95%為G — A的堿基轉(zhuǎn)換，其余為G — C的顛換；兩種突變都導(dǎo)致了FGFR3第380位甘氨酸殘基被精氨酸殘基取代。研究顯示FGFR3跨膜區(qū)基因1138位核苷酸突變后，引發(fā)FGFR3功能持續(xù)地、不依賴配體地激活，突變的受體拒絕配體介導(dǎo)的調(diào)控，引起FGFR3負(fù)向調(diào)控骨骼的生長，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨發(fā)育不全。本實(shí)用新型將樣本采集、軟骨發(fā)育不全致病基因突變體檢測(cè)整合在一個(gè)試劑盒內(nèi)，使用更方便快捷，且成本更低。本實(shí)用新型基于直接測(cè)序技術(shù)，可以對(duì)PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA序列分析，明確突變位點(diǎn)，是現(xiàn)有基因突變檢測(cè)方法中最直接最準(zhǔn)確的方法，且可以實(shí)現(xiàn)機(jī)械化自動(dòng)化，使測(cè)序工作更加簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果判讀更直觀。發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型提供了一種軟骨發(fā)育不全致病基因是否發(fā)生突變的檢測(cè)試劑盒，包括包裝盒體(I)，包裝盒體(I)內(nèi)的中間設(shè)有口腔拭子(2)，一側(cè)設(shè)有樣本保存管(3)、含有正向引物的試管(4)、含有反向引物的試管(5)、另一側(cè)設(shè)有含有PCR擴(kuò)增試劑的試管(6)、含有PCR產(chǎn)物純化試劑的試管(7)和含DNA測(cè)序試劑的試管(8)。能夠快速檢測(cè)軟骨發(fā)育不全致病基因的突變體。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本實(shí)用新型提供了一種軟骨發(fā)育不全致病基因突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于將樣本采集、軟骨發(fā)育不全致病基因突變體檢測(cè)整合在一個(gè)試劑盒內(nèi)，使用更方便快捷，且成本更低。步驟1.采集檢測(cè)樣品用口腔拭子⑵在被測(cè)者口腔左右兩腮分別各上下刮20次，保證采集到足量的細(xì)胞樣本，采集完畢，樣本保存于樣本保存管(3)中。步驟2.采用硅膠吸附法抽提樣本的基因組DNA。步驟3:PCR擴(kuò)增PCR 擴(kuò)增試劑(6)(總體積為 Iml)的成分包含20mM Tris-HCL(PH8. O)、IOOmMKCL、500uM dNTPs、3mM MgCl2 溶液、0.1U Taq DNA 聚合酶/ul。檢測(cè)在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，每個(gè)樣本分為I個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔放入FGFR3正反向引物(4) (5)各0.5ul (引物濃度為lOumol/L)，加入檢測(cè)樣品2ul，PCR反應(yīng)液7. 5ul,去離子水4. 5ul,反應(yīng)孔總體積15ul。反應(yīng)條件為95°C預(yù)熱10分鐘；再進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的95°C、45秒，60°C、45秒，72°C、60秒；72°C、7分鐘后，降溫至4°C。步驟4 =PCR產(chǎn)物純化每一個(gè)反應(yīng)孔反應(yīng)體系總體積為7ul，由PCR產(chǎn)物純化試劑4ul和PCR產(chǎn)物3ul組成。反應(yīng)條件為37°C、60分鐘；80°C、15分鐘。步驟5 DNA測(cè)序反應(yīng)每一個(gè)反應(yīng)孔反應(yīng)體系總體積為5ul，由PCR純化產(chǎn)物Iul、DNA測(cè)序試劑Iul、測(cè)序引物Iul和去離子水2ul組成。反應(yīng)條件為96°C 2分鐘；25個(gè)循環(huán)的96°C、10秒；50°C、5 秒；60°C、4 分鐘；60°C、4 分鐘。反應(yīng)結(jié)束后每管加入Iul 125mM乙二胺四乙酸EDTA和無水乙醇15ul，室溫沉淀15分鐘；3650轉(zhuǎn)/分，4°C離心30分鐘，輕輕倒去上清液；每孔加30ul 70%乙醇，3650轉(zhuǎn)/分，4°C離心15分鐘，倒去上清液；室溫放置20分鐘后加入HIDI溶液8ul，上測(cè)序儀。步驟6:結(jié)果分析在測(cè)序儀上進(jìn)行結(jié)果讀取，用軟件Chromas查閱測(cè)序檢測(cè)結(jié)果。

圖1為本實(shí) 用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為FGFR3基因第10號(hào)外顯子實(shí)驗(yàn)無突變結(jié)果示意圖；圖3為FGFR3基因第10號(hào)外顯子實(shí)驗(yàn)有突變結(jié)果示意具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例步驟1.采集檢測(cè)樣品用口腔拭子⑵在被測(cè)者口腔左右兩腮分別各上下刮20次，保證采集到足量的細(xì)胞樣本，采集完畢，樣本保存于樣本保存管(3)中。步驟2.采用硅膠吸附法抽提樣本的基因組DNA。步驟3:PCR擴(kuò)增PCR 擴(kuò)增試劑(6)(總體積為 Iml)的成分包含20mM Tris-HCL(PH8. O)、IOOmMKCL、500uM dNTPs、3mM MgCl2 溶液、0.1U Taq DNA 聚合酶/ul。檢測(cè)在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，每個(gè)樣本分為I個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔放入FGFR3正反向引物(4) (5)各O. 5ul (引物濃度為lOumol/L)，加入檢測(cè)樣品2ul，PCR反應(yīng)液7. 5ul,去離子水4. 5ul,反應(yīng)孔總體積15ul。反應(yīng)條件為95°C預(yù)熱10分鐘；再進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的95°C、45秒，60°C、45秒，72°C、60秒；72°C、7分鐘后，降溫至4°C。每一個(gè)反應(yīng)孔反應(yīng)體系總體積為7ul，由PCR產(chǎn)物純化試劑4ul和PCR產(chǎn)物3ul組成。反應(yīng)條件為37°C、60分鐘；80°C、15分鐘。[0036]每一個(gè)反應(yīng)孔反應(yīng)體系總體積為5ul，由PCR純化產(chǎn)物Iul、DNA測(cè)序試劑Iul、測(cè)序引物Iul和去離子水2ul組成。反應(yīng)條件為96°C 2分鐘；25個(gè)循環(huán)的96°C、10秒；50°C、5 秒；60°C、4 分鐘；60°C、4 分鐘。 反應(yīng)結(jié)束后每管加入Iul 125mM乙二胺四乙酸EDTA和無水乙醇15ul，室溫沉淀15分鐘；3650轉(zhuǎn)/分，4°C離心30分鐘，輕輕倒去上清液；每孔加30ul 70%乙醇，3650轉(zhuǎn)/分，4°C離心15分鐘，倒去上清液；室溫放置20分鐘后加入HIDI溶液8ul，上測(cè)序儀。步驟4:結(jié)果分析在測(cè)序儀上進(jìn)行結(jié)果讀取，用軟件ChiOmas查閱測(cè)序檢測(cè)結(jié)果。1.未檢出突變未發(fā)現(xiàn)FGFR3基因存在突變，分析結(jié)果如圖2所示；2.檢出突變發(fā)現(xiàn)FGFR3基因第10外顯子上存在G1138A點(diǎn)突變，分析結(jié)果如圖3所示。
權(quán)利要求1.軟骨發(fā)育不全致病基因突變檢測(cè)試劑盒，其特征是由包裝盒體(I)，包裝盒體(I)內(nèi)的中間設(shè)有口腔拭子(2)，一側(cè)設(shè)有樣本保存管(3)、含有正向引物的試管(4)、含有反向引物的試管(5)、另一側(cè)設(shè)有含有PCR擴(kuò)增試劑的試管￠)、含有PCR產(chǎn)物純化試劑的試管(7)和含DNA測(cè)序試劑的試管⑶。
專利摘要本實(shí)用新型提供了一種軟骨發(fā)育不全致病基因是否發(fā)生突變的檢測(cè)試劑盒，包裝盒體(1)，包裝盒體(1)內(nèi)的中間設(shè)有口腔拭子(2)，一側(cè)設(shè)有樣本保存管(3)、含有正向引物的試管(4)、含有反向引物的試管(5)、另一側(cè)設(shè)有含有PCR擴(kuò)增試劑的試管(6)、含有PCR產(chǎn)物純化試劑的試管(7)和含DNA測(cè)序試劑的試管(8)。試管排列位置固定如圖1所示。能夠快速檢測(cè)軟骨發(fā)育不全致病基因的突變體，可應(yīng)用于軟骨發(fā)育不全的早期診斷和產(chǎn)前篩查。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK202865231SQ2012203748
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者卞雪蓮, 張奕, 王校 申請(qǐng)人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司