專利名稱：Fgf受體3基因檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因檢測方法，尤其涉及成纖維細(xì)胞生長因子受體3(FGFR3)基因的檢測方法。
背景技術(shù)：
成纖維細(xì)胞生長因子受體3(FGFR3)廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞，具有重要功能。已經(jīng)證實(shí)FGFR3在胚胎發(fā)育、器官發(fā)生、細(xì)胞分化中發(fā)揮著重要的作用。FGFR3基因的異常表達(dá)能夠?qū)е露喾N疾病，包括軟骨發(fā)育不良以及多種腫瘤。研究表明慢性骨髓白血病、惡性漿細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤等疾病均可發(fā)現(xiàn)FGFR3的過量表達(dá)，而經(jīng)移植治療的慢性骨髓白血病人白細(xì)胞中FGFR3的表達(dá)量顯著下降。因此，F(xiàn)GFR3有可能作為病理檢驗(yàn)和療效評價的標(biāo)志分子。
對于FGFR3的表達(dá)水平，目前本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為其包含兩層含義，第一是mRNA表達(dá)水平，第二是蛋白質(zhì)表達(dá)水平。對于蛋白質(zhì)表達(dá)水平，可以通過免疫的方法來檢測FGFR3蛋白表達(dá)水平，但該方法的靈敏度較低，同時僅僅是半定量方法，所以實(shí)踐中較少采用?，F(xiàn)有技術(shù)中對FGFR3的表達(dá)水平的檢測方法所涉及的主要是定量檢測FGFR3的mRNA表達(dá)水平。
對于FGFR3的mRNA表達(dá)水平可以通過傳統(tǒng)的Northern等分子生物學(xué)方法進(jìn)行定量。但是需要的RNA量很大，會對病人造成較大創(chuàng)傷，難以在臨床診斷中應(yīng)用。因此現(xiàn)有技術(shù)中主要通過基于PCR擴(kuò)增的方法來進(jìn)行定量。
Dvorak等建立了兩項(xiàng)基于PCR擴(kuò)增的在mRNA水平定量FGFR3表達(dá)水平的檢測系統(tǒng)，分別是競爭性RT-PCR系統(tǒng)，和Taqman熒光定量法，請參見Dvorak P，Dvorakova D，Doubek M，F(xiàn)aitova J，Pacholikova J，Hampl A，Mayer J.Increased expression offibroblast growth factor receptor 3 in CD34+BCR-ABL+cells frompatients with chronic myeloid leukemia.Leukemia.2003Dec；17(12)2418-25。在該現(xiàn)有技術(shù)所披露的兩種方法中，前者的靈敏度較低，而后者利用Taqman法，成本較高。
競爭性RT-PCR方法是通過在反應(yīng)體系中加入競爭模板，然后通過反應(yīng)終點(diǎn)內(nèi)源性模板與競爭性模板比例推知反應(yīng)始點(diǎn)內(nèi)源性模板的方法。該方法首先要建立競爭模板，費(fèi)時費(fèi)力。其次，在定量檢測時，樣品與競爭模板間濃度差別不能過大，需要反復(fù)調(diào)節(jié)兩者間比例。另外，其檢測操作煩瑣，靈敏度和準(zhǔn)確性不高。
Taqman法利用了FGFR3的特異引物擴(kuò)增出一段FGFR3的基因片段，而后依賴特異Taqman探針定量檢測FGFR3的表達(dá)水平。其中，Taqman探針在自由狀態(tài)不發(fā)射熒光，而一旦與特異DNA片段結(jié)合，并為引導(dǎo)DNA聚合的Taq酶所識別而切斷后就將發(fā)射熒光，由此能夠?qū)崟r反應(yīng)PCR擴(kuò)增的進(jìn)程。Taqman法的靈敏度和準(zhǔn)確性都較好，但需要使用特殊的熒光標(biāo)記探針和相應(yīng)的試劑，所以成本較高，限制了在臨床分析中的應(yīng)用。
因此，針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，需要一種快速、準(zhǔn)確、低成本的檢測FGFR3基因表達(dá)水平的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種成纖維細(xì)胞生長因子受體3(FGFR3)基因的檢測方法。該方法用于定量檢測FGFR3的mRNA表達(dá)水平。
本發(fā)明運(yùn)用SYBR Green I進(jìn)行實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測。
根據(jù)本發(fā)明第一方面提供的一種FGFR3基因的定量檢測方法，包括以下步驟(a)提供引物，其中所述FGFR3基因的上游引物FGFR3P1為5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’，下游引物FGFR3P2為5’-GCCCAGTA ACAGTACAGAACGA-3’；(b)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)確定線性空間；以及(c)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)建立FGFR3的標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測樣品中FGFR3的量，該標(biāo)準(zhǔn)曲線為突破閾值循環(huán)數(shù)與總RNA加入量(亦即不同稀釋度的FGFR3量)的對數(shù)值之間的線性關(guān)系，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用樣品的突破閾值循環(huán)數(shù)求得樣品中FGFR3的量；其中進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)采用熒光染料染色來實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增。
上述方法還包括建立18S的標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測樣品中18S的量的步驟。其中建立18S的標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測樣品中18S的量時擴(kuò)增18S所用的上游引物18SP1為5’-TTCGGAACTGAGGC CATGAT-3’；下游引物18SP2為5’-TTTCGCTCTGGTCC GTCTTG-3’。該方法，還包括用樣品中FGFR3的量除以樣品中18S的量得到樣品中FGFR3的相對量的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其中PCR擴(kuò)增的條件為反應(yīng)體積15-25μl，優(yōu)選20μl；引物濃度0.05-1umol/l，優(yōu)選0.5umol/l；MgCl2濃度0.5-10mmol/l，優(yōu)選2.5mmol/l；退火條件為45度-60度，時間10秒-60秒，優(yōu)選52度25秒。進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的方法，還包括提取總RNA和進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的步驟。
根據(jù)上述方法，其中采用熒光染料染色來實(shí)時檢測的熒光檢測溫度為75度。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面提供的一種FGFR3基因的定量檢測方法，包括以下步驟(a)提供引物，其中所述FGFR3基因的上游引物FGFR3P1為5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’；下游引物FGFR3P2為5’-GCCCAGTAACAGTACAGAACGA-3’；(b)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，檢測樣品A中FGFR3的Ct值Cta1和樣品中18S的Ct值Cta2；樣品B中FGFR3的Ct值Ctb1和樣品中18S的Ct值Ctb2；(c)利用下述公式計(jì)算樣品A和樣品B中FGFR3的表達(dá)量相差倍數(shù)樣品A中FGFR3/樣品B中FGFR3＝2(Ctb1-Ctb2-Cta1+Cta2)，其中，Ct值為突破閾值循環(huán)數(shù)，即進(jìn)行PCR擴(kuò)增時開始進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期的循環(huán)數(shù)，并且，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)采用熒光染料染色來實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增。
根據(jù)上述方法，其中還包括提取總RNA和進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的步驟。并且采用熒光染料染色來實(shí)時檢測的熒光檢測溫度為75度。
根據(jù)本發(fā)明的檢測方法能夠精確定量、靈敏度高、線性范圍廣且成本較低。


圖1A示出了FGFR3基因特異條帶電泳分析。其中，1100pg總RNA經(jīng)RT-PCR反應(yīng)；2100pg總RNA的無RT反應(yīng)對照；3無模板對照；4分子量標(biāo)記。
圖1B示出了FGFR3特異條帶與引物二聚體的熔解曲線分析，其中曲線1100pg總RNA經(jīng)RT-PCR反應(yīng)(雙峰)；曲線2100pg總RNA的無RT反應(yīng)對照；曲線3無模板對照。
圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例中的FGFR3線性區(qū)間分析。
圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例中的18S標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖4示出了FGFR3和18S擴(kuò)增效率相同。
圖5示出了對擴(kuò)增的FGFR3特異片段序列測定。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了一種FGFR3基因的定量檢測方法，包括以下步驟
(a)提供引物，其中所述FGFR3基因的上游引物FGFR3P1為5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’；下游引物FGFR3P2為5’-GCCCAGTA ACAGTACAGAACGA-3’；(b)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，建立FGFR3的標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測樣品中FGFR 3的量，該標(biāo)準(zhǔn)曲線為突破閾值循環(huán)數(shù)與總RNA加入量(亦即不同稀釋度的FGFR3量)的對數(shù)值之間的線性關(guān)系，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用樣品的突破閾值循環(huán)數(shù)得到樣品中FGFR3的量；其中進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)采用熒光染料染色來實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增。
根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例的FGFR3基因的定量檢測方法，還包括建立18S的標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測樣品中18S的量的步驟。其中建立18S的標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測樣品中18S的量時擴(kuò)增18S所用的上游引物18SP1為5’-TTCGGAACTGAGGCCATGAT-3’；下游引物18SP2為5’-TTTCGCTCTGGTCCGTCTTG-3’。
在根據(jù)本發(fā)明提供的方法中，F(xiàn)GFR3基因的上游引物、下游引物用于擴(kuò)增出特異的FGFR3基因片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，定量是否準(zhǔn)確依賴于擴(kuò)增出的片段是否特異，擴(kuò)增的效率是否足夠高。所以，F(xiàn)GFR3基因的上游引物、下游引物對于準(zhǔn)確定量檢測FGFR3基因的表達(dá)水平至關(guān)重要。如果引物存在缺陷，將會導(dǎo)致擴(kuò)增得到的片斷無特異性或者特異性較差，使擴(kuò)增產(chǎn)物中包含F(xiàn)GFR3基因以外的物質(zhì)，這將嚴(yán)重地影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
在根據(jù)本發(fā)明提供的方法中所用的FGFR3基因的上游引物、下游引物是從眾多引物中挑選出的，其中上游引物FGFR3P1為5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’；下游引物FGFR3P2為5’-GCCCAGTAACAGTACAGAACGA-3’。該對引物對于擴(kuò)增FGFR3基因具有良好的特異性。該引物的優(yōu)點(diǎn)在下面結(jié)合圖1A和圖1B進(jìn)行說明。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，在試驗(yàn)中無法提供絕對相同的條件對不同的樣本進(jìn)行檢測(例如器壁的粘附總是難以避免的)。這樣就會使檢測結(jié)果產(chǎn)生誤差。為了盡可能地減小這種誤差的產(chǎn)生，在根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例中使用一個內(nèi)參照物18S來減小操作中的誤差。請參照文獻(xiàn)Daniel R.McCulloch，Pascal Akl，Hemamali Samaratunga，et al.Expression of the DisintegrinMetalloprotease，ADAM-10，in Prostate Cancer and Its Regulation byDihydrotestosterone，Insulin-Like Growth Factor I，and EpidermalGrowth Factor in the Prostate Cancer Cell Model LNCaP.ClinicalCancer Research Vol.10，314-323，January 2004。其中，內(nèi)對照物18S使用上游引物18SP1 5’-TTCGGAACTGAGGCCATGAT-3’；下游引物18SP2 5’-TTTCGCTCTGGTCCGTCTTG-3’；用于實(shí)時定量內(nèi)對照18S。由于樣品中FGFR3基因的量可以變化，而18S的量是相對穩(wěn)定的，利用18S作為內(nèi)參照物可以降低不同樣品之間由于操作條件的差異而產(chǎn)生的誤差。18S基因的上游和下游引物用于擴(kuò)增18S基因特異片段，18S主要作為內(nèi)參照用來校準(zhǔn)FGFR3所得結(jié)果。樣品中FGFR3的量除以樣品中18S的量得到校準(zhǔn)后的樣品中FGFR3的相對量。
在根據(jù)本發(fā)明提供的方法中，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線有兩個目的。第一，是為了確定本發(fā)明的方法的適用范圍。在一定范圍內(nèi)，不同濃度的樣本之間存在一定的線性關(guān)系，在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，利用樣本之間的線性關(guān)系可以確定某一樣品的濃度。但是如果被測樣品的濃度超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，利用線性關(guān)系推導(dǎo)出的濃度的準(zhǔn)確性就無法保證。第二，是為定量不同樣本提供相比較的依據(jù)。確定線性空間范圍的方法如下首先，準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)樣品。即將血液來源的總RNA經(jīng)NQ1處理去除可能的DNA污染，并使用Access RT-PCR system以隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。其次，按不同稀釋度稀釋cDNA標(biāo)準(zhǔn)品，例如106稀釋、105稀釋、104稀釋、103稀釋、102稀釋、10稀釋，或者分別46稀釋、45稀釋、44稀釋、43稀釋、42稀釋、4稀釋等。稀釋倍數(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以改變的。然后，以經(jīng)過稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，并實(shí)時熒光檢測。熒光檢測利用的是一種熒光染料Sybr green I。擴(kuò)增反應(yīng)利用FGFR3P1/P2；18SP1/P2進(jìn)行。最后，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以顯示出線性空間的范圍(在該范圍內(nèi)各點(diǎn)之間線性關(guān)系良好)?？梢岳斫獾氖牵_定線性空間所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線也可以用作測定樣品中FGFR3的量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。但是為了結(jié)果的準(zhǔn)確性，通常在測定樣品中FGFR3的量時另外建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Sybr green I是一種熒光染料，此染料在自由狀態(tài)不釋放熒光，而一旦和雙鏈DNA相結(jié)合機(jī)會釋放出強(qiáng)烈的熒光。因此在PCR過程中隨著產(chǎn)物的增加，熒光信號會逐漸加強(qiáng)，因此可以通過實(shí)時檢測熒光信號來反應(yīng)PCR的擴(kuò)增。(Morrison，TB，Weis，JJ and WittwerCT.，quantification of low copy transcripts by continuous SYBR GreenI monitoring during amplification.1998，Biotechniques 24，954-959)。Sybr green I與雙鏈DNA間屬于非特異結(jié)合，利用sybr green I進(jìn)行熒光定量必須避免任何非特異條帶的產(chǎn)生。在本發(fā)明的擴(kuò)增條件下，F(xiàn)GFR3條帶非常特異，不存在非特異條帶的影響。引物二聚體也能夠與sybr green I相結(jié)合并產(chǎn)生熒光，過多的引物二聚體同樣影響定量的準(zhǔn)確性。調(diào)整檢測溫度是消除引物二聚體影響的有效方法。通常熒光檢測溫度應(yīng)高于引物二聚體解鏈溫度并低于基因特異條帶解鏈溫度3到4度，從而保證信號值完全反映基因特異條帶的擴(kuò)增。熔解曲線分析表明FGFR3特異條帶與引物二聚體的解鏈溫度有較大差別，可以通過上述方法進(jìn)行區(qū)分，實(shí)驗(yàn)中采用74-77攝氏度為熒光采集溫度，優(yōu)選75℃，有效地排除了引物二聚體的干擾，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確。
FGFR3反應(yīng)條件的優(yōu)化。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)確定FGFR3擴(kuò)增系統(tǒng)參數(shù)如下反應(yīng)體積15-25μl，優(yōu)選20μl；引物濃度0.05-1umol/l，優(yōu)選0.5umol/l；MgCl2濃度0.5-10mmol/l，優(yōu)選2.5mmol/l；退火條件為45度-60度，時間10秒-60秒，優(yōu)選52度25秒。FGFR3的擴(kuò)增條件為，預(yù)變性95度15分鐘，擴(kuò)增40個循環(huán)94度15秒，52度25秒，72度20秒，75度5秒，并讀熒光信號。18S的擴(kuò)增條件為，預(yù)變性95度15分鐘，擴(kuò)增40個循環(huán)94度15秒，60度70秒，78度5秒，并讀熒光信號。
本發(fā)明的第二方面提供了另外一種簡便的FGFR3基因的定量檢測方法，即ΔΔCt法，其包括以下步驟(a)提供引物，其中所述FGFR3基因的上游引物FGFR3P1為5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’；下游引物FGFR3P2為5’-GCCCAGTA ACAGTACAGAACGA-3’；(b)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，檢測樣品A中FGFR3的Ct值Cta1和樣品中18S的Ct值Cta2；樣品B中FGFR3的Ct值Ctb1和樣品中18S的Ct值Ctb2(c)利用下述公式計(jì)算樣品中FGFR3的相對量樣品A中FGFR3/樣品B中FGFR3＝2(Ctb1-Ctb2-Cta1+Cta2)，其中，Ct值為突破閾值循環(huán)數(shù)，即進(jìn)行PCR擴(kuò)增時開始進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期的循環(huán)數(shù)。檢測樣品A(第一樣品)中FGFR3的Ct值為Cta1和該樣品中18S的Ct值為Cta2；樣品B(第二樣品，標(biāo)準(zhǔn)樣)中FGFR3的Ct值為Ctb1和該樣品中18S的Ct值為Ctb2。并且，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)采用熒光染料染色來實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增。
在本發(fā)明的第二方面中，進(jìn)行了18S和FGFR3擴(kuò)增效率異同的測定血液來源的總RNA 100ng經(jīng)隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，2倍梯度稀釋，分別求算每個稀釋度18S和FGFR3的Ct值，以每個稀釋度的ΔCt值(FGFR3和18S Ct值之差)對相對稀釋倍數(shù)的對數(shù)值作圖。經(jīng)線性回歸分析，所得直線斜率值小于0.1時可以認(rèn)為18S與FGFR3具有相同擴(kuò)增效率。由于FGFR3是需要檢測的目的基因，在不同的樣品中其表達(dá)量會有較大的差別，由于18S是一種看家基因，其表達(dá)量在不同的樣品中基本相同。因此18S被用來作為內(nèi)參照，以此來校準(zhǔn)檢測時所加入的總RNA量。
相對ΔΔCt法而言，使用常規(guī)實(shí)時定量RT-PCR法成本較高。ΔΔCt法由于不需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，節(jié)省了試劑消耗能夠有效降低成本。應(yīng)用ΔΔCt法的前提是目標(biāo)基因和內(nèi)對照基因的擴(kuò)增效率必須相等。根據(jù)(ABI PRISM 7700 Sequence Detection System UserBulletin 2.P/N 4303859B，Stock No.777802-002)提供的方法，我們檢驗(yàn)了梯度稀釋后18S和FGFR3之間ΔCt的變化。ΔCt成線性分布，方程斜率為0.0232，所以18S和FGFR3的擴(kuò)增效率基本相同，參見圖4。所以，在本發(fā)明中還可以使用ΔΔCt法來檢驗(yàn)不同樣本間的表達(dá)差異。
方法和優(yōu)選條件儀器lightcycler熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司；高速冷凍離心機(jī)購自德國Heraeus公司；Genequant pro紫外分光光度儀購自美國Amercia公司。凝膠成相系統(tǒng)購自美國Kadak公司。
試劑Trizol試劑購自美國Invitrogen公司(CA)；AccessRT-PCR system、無RNA酶污染的DNA酶NQ1購自美國Promega公司；QuantiTectTMSYBRGreen PCR Kit(Qiagen sybr green I定量PCR試劑盒)購自德國Qiagen公司。引物由上海生工生物有限公司合成。
引物實(shí)時定量FGFR3基因的上游引物FGFR3P1為5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’；下游引物FGFR3P2為5’-GCCCAGTAACAGTACAGAACGA-3’；內(nèi)對照物18S使用上游引物18SP1 5’-TTCGGAACTGAGGC CATGAT-3’；下游引物18SP2 5’-TTTCGCTCTGGTCC GTCTTG-3’；用于實(shí)時定量內(nèi)對照18S。
a.提供如前所述的引物。
b.提取總RNA，在細(xì)胞樣品中加入Trizol 1ml，用注射器吹打至完全消化溶解。每管加入氯仿約200μl，震蕩15秒，置室溫放置3分鐘。離心12000g，4℃，15分鐘。上層水相回收到新EP管中，每管加入異丙醇500μl，混勻，置室溫10分鐘，離心12000g，4℃，10分鐘。棄上清，每管加75％乙醇1ml，混勻，離心7500g，4℃，5分鐘。棄上清，吸干殘留液，風(fēng)干10分鐘。每管加DEPC-H2O，30μl，置-80℃保存。上述條件為優(yōu)選條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對其中的條件進(jìn)行適當(dāng)改變。
c.進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，建立FGFR3的標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測樣品中FGFR3的量。該步驟中利用標(biāo)準(zhǔn)樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)樣一般選擇FGFR3表達(dá)水平較高的白血病人樣品。該標(biāo)準(zhǔn)樣一般可以先經(jīng)過多次選擇，找到合適的樣品，然后都用該樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品。在開始選擇時一般是隨機(jī)選擇，然后在確定FGFR3表達(dá)水平較高的樣品。
其中，RT-PCR反應(yīng)如下RNA樣品經(jīng)RQ1處理去除可能的DNA污染，使用Access RT-PCR system以隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA分別利用FGFR3P1/P2；18SP1/P2進(jìn)行實(shí)時定量PCR擴(kuò)增。優(yōu)選條件如下總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量，取2ug總RNA70℃水浴10分鐘，使用RQ1酶切，37℃水浴60分鐘。酶切后的RNA樣品經(jīng)酚抽提去除蛋白成分。加入糖元，乙醇重新沉淀總RNA。取純化的總RNA 1ug，利用隨機(jī)引物，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。取cDNA2ul，基因特異引物FGFR3P1/P2或18SP1/P2終濃度0.5uM，MgCl2濃度2.5mM，總體積20ul，使用Qiagen sybr green I定量PCR試劑盒(德國Qiagen公司)進(jìn)行擴(kuò)增。FGFR3的擴(kuò)增條件為，預(yù)變性95度15分鐘，擴(kuò)增40個循環(huán)94度15秒，52度25秒，72度20秒，75度5秒，并讀熒光信號。18S的擴(kuò)增條件為，預(yù)變性95度15分鐘，擴(kuò)增40個循環(huán)94度15秒，60度70秒，78度5秒，并讀熒光信號。
實(shí)施例1，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線。對標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行上述步驟a至b。
步驟cFGFR3實(shí)時定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的步驟如下用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的經(jīng)過RQ1酶切處理過的標(biāo)準(zhǔn)品總RNA 1ug經(jīng)隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。將此cDNA樣品按不同稀釋度稀釋，46稀釋、45稀釋、44稀釋、43稀釋、42稀釋、4稀釋。分別取每一數(shù)量級稀釋液1ul進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)時熒光檢測。使用FGFR3特異引物P1/P2可以從低至100pg的總RNA中擴(kuò)增得到大小正確(110bp)的特異條帶FGFR3-1(圖1A)，經(jīng)測序正確無誤(圖5)。相同條件下，無反轉(zhuǎn)錄對照和無模板對照中會形成較小的引物二聚體(圖1A)。根據(jù)圖1A可以看出，利用本發(fā)明提供的引物，沒有出現(xiàn)非特異產(chǎn)物，所以本發(fā)明提供的引物對于擴(kuò)增FGFR3基因具有良好的特異性。如圖1B所示，經(jīng)熔解曲線分析，特異條帶FGFR3-1熔解溫度為78.9度，引物二聚體熔解溫度為71.6度。因此將熒光檢測溫度設(shè)定為75度。而且，從圖1B中可以看出，F(xiàn)GFR3特異條帶與引物二聚體的熔解曲線的峰值明顯地分開，通過對熒光檢測溫度的適當(dāng)設(shè)定，引物二聚體不會對對檢測結(jié)果產(chǎn)生不利的影響。該熒光檢測溫度可以在74至77度之間，優(yōu)選75度。所以根據(jù)圖1B也可以看出，本發(fā)明提供的引物對于擴(kuò)增FGFR3基因具有良好的特異性。
以cDNA質(zhì)量對數(shù)值對Ct值作圖得到FGFR3的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用Excel進(jìn)行線性回歸分析。參見附圖2，該圖中有6個數(shù)據(jù)點(diǎn)，通過線性回歸分析發(fā)現(xiàn)線性關(guān)系良好，其R2達(dá)到0.9991，由此確定FGFR3實(shí)時定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)可以定量少至100pg血液RNA中FGFR3基因表達(dá)量。該標(biāo)準(zhǔn)曲線中顯示出線性空間的范圍在102至105pg血液RNA中FGFR3基因表達(dá)量。該線性空間范圍較大，也說明本發(fā)明所提供的方法具有適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。
需要說明的是，圖2中縱軸顯示的是總RNA加入量而不是總RNA的對數(shù)值。這只是為了直觀地顯示線性空間的范圍。實(shí)際上在圖2中橫軸的坐標(biāo)是指突破閾值循環(huán)數(shù)Ct值，而縱軸的坐標(biāo)是總RNA加入量的對數(shù)值。即，圖中顯示的縱坐標(biāo)10對應(yīng)的實(shí)際縱坐標(biāo)應(yīng)該是10的對數(shù)1，縱坐標(biāo)100對應(yīng)的實(shí)際縱坐標(biāo)應(yīng)該是100的對數(shù)2，依此類推。線性方程Y＝-0.2863X+8.3233中X是突破閾值循環(huán)數(shù)Ct值，Y是總RNA加入量的對數(shù)值。
圖3是內(nèi)參照物18S的標(biāo)準(zhǔn)曲線(建立方法與FGFR3的標(biāo)準(zhǔn)曲線相同)。其中橫軸X的坐標(biāo)是指突破閾值循環(huán)數(shù)Ct值，而縱軸Y的坐標(biāo)是總RNA加入量的對數(shù)值(圖3中縱軸顯示的是總RNA加入量)。線性方程為Y＝-0.2848X+6.0424。R2為0.9993，表明線性關(guān)系良好。
PCR產(chǎn)物測序通過對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，證明利用本發(fā)明提供的引物，提供的條件擴(kuò)所增出的產(chǎn)物的確是特異的FGFR3基因片段。其中，測序引物與實(shí)時定量所用引物相同，測序結(jié)果見圖5。這證明利用本發(fā)明提供的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不但具有良好的特異性，而且本發(fā)明的方法可靠性好。
步驟d.待測樣品RNA經(jīng)RQ1處理去除可能的DNA污染，使用Access RT-PCR system以隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。cDNA經(jīng)10倍稀釋，取1ul與上述6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品一起使用FGFR3特異引物FGFR3P1/P2，18S特異引物18sP1/P2擴(kuò)增。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2和圖3。所得Ct值，以及通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的相對含量見下表。

根據(jù)圖2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對于樣品1，根據(jù)線性方程Y＝-0.2863X+8.3233，當(dāng)FGFR3 Ct值X為20.22時，F(xiàn)GFR3相對含量的對數(shù)值Y為2.5343，F(xiàn)GFR3相對含量為342.2。對于樣品2，根據(jù)線性方程Y＝-0.2863X+8.3233當(dāng)FGFR3 Ct值X為17.68時，F(xiàn)GFR3相對含量的對數(shù)值Y為3.2615，F(xiàn)GFR3相對含量為1826.00。
根據(jù)圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對于樣品1，根據(jù)線性方程Y＝-0.2848+6.0424，當(dāng)18S Ct值X為12.81時，18S相對含量的對數(shù)值Y為2.3941，18S相對含量為247.80。對于樣品2，根據(jù)線性方程Y＝-0.2848+6.0424，當(dāng)18S Ct值X為12.15時，18S相對含量的對數(shù)值Y為2.5821，18S相對含量為382.03。
樣品中FGFR 3的量除以樣品中18S的量得到樣品中FGFR 3的相對量。對于樣品1，342.2除以247.80得到1.3809；對于樣品2，1826.00除以382.03得到4.7797。樣品2相對于樣品1的FGFR3含量為4.7797除以1.3809等于3.46。同理，樣品3相對于樣品1的FGFR3含量為2.87。
實(shí)施例2，測定18S與FGFR3擴(kuò)增效率。
利用實(shí)施例1中同樣的條件，血液來源的總RNA 100ng經(jīng)隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，2倍梯度稀釋，分別求算每個稀釋度18S和FGFR3的Ct值，以每個稀釋度的ΔCt值(FGFR3和18S Ct值之差)對相對稀釋倍數(shù)的對數(shù)值作圖。經(jīng)線性回歸分析，所得直線斜率值為0.0232。當(dāng)該斜率值小于0.1時可以認(rèn)為18S與FGFR3具有相同擴(kuò)增效率，所以18S與FGFR3具有相同擴(kuò)增效率。反應(yīng)條件參見實(shí)施例1。18S與FGFR3擴(kuò)增效率的測定結(jié)果如圖4所示。
待測樣品RNA經(jīng)RQ1處理去除可能的DNA污染，使用AccessRT-PCR system以隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。CDNA稀釋10倍，使用FGFR3特異引物FGFR3P1/P2，18S特異引物18sP1/P2擴(kuò)增。所得Ct值，以及通過Ct值利用下列公式求得的相對含量見下表。


公式樣品A中FGFR3/樣品B中FGFR3＝2(Ctb1-Ctb2-Cta1+Cta2)其中Ct值為突破閾值循環(huán)數(shù)，檢測樣品A(第一樣品，被測樣品)中FGFR3的Ct值為Cta1和該樣品中18S的Ct值為Cta2；樣品B(第二樣品，標(biāo)準(zhǔn)樣)中FGFR3的Ct值為Ctb1和該樣品中18S的Ct值為Ctb2。樣品2中FGFR3相對于樣品1中FGFR3的量為2(3.68)比較實(shí)施例1與實(shí)施例2的結(jié)果可知，采用實(shí)施例1中的方法與實(shí)施例2中的方法得到的結(jié)果基本相同。這說明采用實(shí)施例2中的簡便方法同樣可以得到可靠的結(jié)果。
所以，根據(jù)本發(fā)明提供的方法，可以快速、準(zhǔn)確、低成本的檢測FGFR3基因表達(dá)水平。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種FGFR3基因的定量檢測方法，包括以下步驟(a)提供引物，其中所述FGFR3基因的上游引物FGFR3P1為5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’，下游引物FGFR3P2為5’-GCCCAGTAACAGTACAGAACGA-3’；(b)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，確定線性空間；以及(c)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，建立FGFR3的標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測樣品中FGFR3的量；其中所述進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)采用熒光染料染色來實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FGFR3基因的定量檢測方法，還包括建立18S的標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測樣品中18S的量的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的FGFR3基因的定量檢測方法，其中建立18S的標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測樣品中18S的量時擴(kuò)增18S所用的上游引物18SP1為5’-TTCGGAACTGAGGCCATGAT-3’；下游引物18SP2為5’-TTTCGCTCTGGTCCGTCTTG-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的FGFR3基因的定量檢測方法，還包括用樣品中FGFR3的量除以樣品中18S的量得到樣品中FGFR3的相對量的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的FGFR3基因的定量檢測方法，其中所述PCR擴(kuò)增的條件為反應(yīng)體積15-25μl，優(yōu)選20μl；引物濃度0.05-1umol/l，優(yōu)選0.5umol/l；MgCl2濃度0.5-10mmol/l，優(yōu)選2.5mmol/l；退火條件為45度-60度，時間10秒-60秒，優(yōu)選52度25秒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的FGFR3基因的定量檢測方法，其中還包括提取總RNA和進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的FGFR3基因的定量檢測方法，其中所述采用熒光染料染色來實(shí)時檢測的熒光檢測溫度為75度。
8.一種FGFR3基因的定量檢測方法，包括以下步驟(a)提供引物，其中所述FGFR3基因的上游引物FGFR3P1為5’-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3’，下游引物FGFR3P2為5’-GCCCAGTAACAGTACAGAACGA-3’；(b)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，檢測樣品A中FGFR3的Ct值Cta1和樣品中18S的Ct值Cta2，樣品B中FGFR3的Ct值Ctb1和樣品中18S的Ct值Ctb2；(c)利用下述公式計(jì)算樣品A和樣品B中FGFR3的表達(dá)量相差倍數(shù)樣品A中FGFR3/樣品B中FGFR3＝2(Ctb1-Ctb2-Cta1+Cta2)其中，所述Ct值為突破閾值循環(huán)數(shù)并且，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)采用熒光染料染色來實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中還包括提取總RNA和進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述采用熒光染料染色來實(shí)時檢測的熒光檢測溫度為75度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種FGFR 3基因的定量檢測方法，包括以下步驟(a)提供引物，其中該FGFR3基因的上游引物FGFR3P1為5’－TTAACACTTCTTACGCAATGCT－3’；下游引物FGFR3P2為5’－GCCCAGTA ACAGTACAGAACGA－3’；(b)進(jìn)行RT－PCR反應(yīng)確定線性空間；以及(c)進(jìn)行RT－PCR反應(yīng)建立FGFR 3的標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測樣品中FGFR 3的量；其中進(jìn)行RT－PCR反應(yīng)采用熒光染料染色來實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增。本發(fā)明還涉及一種FGFR 3基因的定量檢測方法，利用下述公式計(jì)算樣品A和樣品B中FGFR 3的表達(dá)量相差倍數(shù)樣品A中FGFR 3/樣品B中FGFR 3＝文檔編號C12Q1/68GK1873022SQ200510072338
公開日2006年12月6日 申請日期2005年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月30日
發(fā)明者陳彪, 蔡彥寧 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院