專利名稱：人親環(huán)素a蛋白對神經(jīng)細胞分化的影響及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術中新基因、新蛋白的開發(fā)與應用領域。具體地說涉及利用雙向電泳和質譜技術發(fā)現(xiàn)維甲酸誘導分化后的神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y中親環(huán)素A表達降低。在SH-SY5Y細胞中過表達親環(huán)素A，再給予維甲酸誘導，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達親環(huán)素A可以阻礙SH-SY5Y細胞的分化過程。PCNA免疫印跡檢測和細胞生長曲線實驗發(fā)現(xiàn)轉染親環(huán)素A的細胞增殖速度增高。結果揭示了親環(huán)素A可以阻礙神經(jīng)母細胞瘤細胞的分化過程并促進細胞增殖，可作為篩選神經(jīng)母細胞瘤診斷標志物及治療藥物的候選分子靶標。
背景技術：
基因組被稱為是“生命的藍圖”，機體中的每一個細胞都有這本藍圖，但細胞在功能和形態(tài)上卻千差萬別。造成這一現(xiàn)象的原因是在細胞中絕大多數(shù)生物學功能的實現(xiàn)是由蛋白質來完成的，與基因組不同，蛋白質組在時間和空間上是動態(tài)變化的?；诨蚪M學的高通量mRNA表達分析微陣列技術對基因功能研究產(chǎn)生了顯著影響，但這種方法也有局限，mRNA的豐度不總是與蛋白質的豐度相一致，酵母細胞的大規(guī)模研究顯示二者之間的相關系數(shù)僅約0.4(Gygi，S.P et al.，Mol CellBiol.1999，191720-30)。利用蛋白質組學策略，比較正常和病理情況下以及不同處理條件下細胞中蛋白質的表達變化，可以發(fā)現(xiàn)與病理改變或處理因素相關的蛋白質以及疾病特異性蛋白質，它們既可以作為探索疾病發(fā)病機制的線索，也可作為疾病診斷的分子標記，以及藥物治療和開發(fā)的靶標。而其中對于腫瘤的蛋白質組研究最為廣泛和集中。
神經(jīng)母細胞瘤是兒童期最常見的實體瘤和次常見的惡性腫瘤，14歲之前兒童平均發(fā)病率每10萬人約為1.3例(Carlsen，N.L.Am J Pediatr Hematol Oncol.199214(2)103-10)。它起源于神經(jīng)嵴未分化的神經(jīng)外胚層細胞(Stefano Cianfarani & PaolaRossi.Eur.J.Pediatr.1997，156256-261)。部分神經(jīng)母細胞瘤可自然退化，并可被多種物質誘導分化，維甲酸是其中之一。神經(jīng)母細胞瘤發(fā)病的分子機制已有一定進展，治療方法也有許多改進，但臨床療效并無多大提高。體外研究發(fā)現(xiàn)，維甲酸能誘導神經(jīng)母細胞瘤分化，在研究神經(jīng)元的分化機理時這種細胞模型得以廣泛應用。
親環(huán)素A(Cyclophilin A)是免疫抑制劑環(huán)孢霉素A(Cyclosporin A)的細胞內受體，在免疫應答中介導T細胞活化。環(huán)孢霉素A正是通過與親環(huán)素A的結合，抑制后者的T細胞活化能力，從而發(fā)揮其免疫抑制效應。親環(huán)素A還具有脯氨酰異構酶活性，幫助蛋白質折疊，這種活性類似分子伴侶的功能。親環(huán)素A在各組織中廣泛表達，其中在腦組織中表達最高，免疫組化顯示它只在神經(jīng)元中表達而不在膠質細胞中表達(Goldner FM & Patrick JW.J Comp Neurol.1996，372(2)283-93.)，但它在神經(jīng)組織中的功能還不清楚。

發(fā)明內容
親環(huán)素A是免疫抑制劑環(huán)孢霉素A(Cyclosporin A)的細胞內受體，在免疫應答中介導T細胞活化。它在各組織中廣泛表達，其中在腦組織中表達最高，但它在神經(jīng)組織中的功能還不清楚。
本發(fā)明利用雙向凝膠電泳技術分析了維甲酸誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y分化前后的蛋白質組改變，并用質譜對差異表達的蛋白進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)親環(huán)素A在表達后降低。細胞過表達實驗揭示親環(huán)素A可以阻礙神經(jīng)母細胞瘤細胞的分化過程并對細胞增殖有促進作用，可作為篩選神經(jīng)母細胞瘤診斷標志物及治療藥物的候選分子靶標。
1.本發(fā)明首先用維甲酸誘導人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y向神經(jīng)元分化，同時用未經(jīng)全反式維甲酸處理的細胞作為對照。維甲酸誘導分化后的細胞生長速度降低，形態(tài)發(fā)生了明顯的神經(jīng)元樣改變。
2.制備細胞總蛋白進行雙向電泳，用銀染方法進行染色。從分化前后的雙向電泳圖譜中發(fā)現(xiàn)了73個差異表達的蛋白點，分化后表達降低的51個；表達增加的22個。從凝膠上切下差異點，經(jīng)胰酶膠內消化，進行基質輔助激光解析電離—飛行時間質譜(MALDI-TOF)最終鑒定出共40個差異表達的蛋白。親環(huán)素A是表達后降低的蛋白之一，用ESI離子阱質譜對結果進行了進一步驗證，表明親環(huán)素A在神經(jīng)母細胞瘤細胞分化后降低。該結果提示親環(huán)素A蛋白可作為篩選神經(jīng)母細胞瘤診斷標志物的候選分子靶標。
3.本發(fā)明用半定量RT-PCR和Western印跡對細胞模型及質譜鑒定結果的可靠性進行了驗證，結果表明細胞模型和質譜鑒定結果都是可信的。且SH-SY5Y分化前后親環(huán)素A的表達在mRNA水平和蛋白水平基本一致。該結果提示親環(huán)素A蛋白在分化后的表達改變在轉錄水平就發(fā)生了，提示如果將親環(huán)素A作為藥物治療的候選分子靶標，可針對其轉錄水平進行調控。
4.本發(fā)明將親環(huán)素A克隆到真核表達載體pcDNA3.1/myc-His(-)B中，并將其轉染SH-SY5Y細胞，經(jīng)抗生素G418篩選，獲得穩(wěn)定表達重組親環(huán)素A的細胞株，并經(jīng)RT-PCR和Western印跡驗證，證明得到過表達親環(huán)素A的穩(wěn)定轉染細胞。用維甲酸同樣處理，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達親環(huán)素A的SH-SY5Y細胞可以阻礙細胞分化過程，但不能完全抑制。Western印跡分析表明，分化后的細胞中NF-M和c-Ret表達都增加，與未轉染細胞和轉染空載體細胞一致。但是Western印跡檢測PCNA(增殖細胞核抗原)發(fā)現(xiàn)，轉染親環(huán)素A的細胞誘導分化后PCNA仍有一定表達，而未轉染細胞和轉染空載體細胞誘導分化后檢測不到PCNA表達。
5.測定分化后細胞的生長曲線，與Western檢測結果一致，轉染親環(huán)素A的細胞增殖速度高于未轉染細胞和轉染空載體的細胞。由此推測，親環(huán)素A可以阻礙神經(jīng)母細胞瘤細胞的分化過程，并進而影響細胞增殖速度。該結果提示在對神經(jīng)母細胞瘤進行治療時，針對親環(huán)素A進行相應的調控，對治療效果可能具有積極的作用。
小結親環(huán)素A在維甲酸誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞分化后表達降低，且可以阻礙神經(jīng)母細胞瘤細胞的分化過程并對細胞增殖有促進作用，可作為篩選神經(jīng)母細胞瘤診斷標志物及治療藥物的候選分子靶標。
以上所述及的實驗內容和結果也即本發(fā)明的技術指標。


圖1.全反式維甲酸處理前后神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y形態(tài)變化A.溶劑處理的對照細胞；B.維甲酸處理的分化后細胞。
圖2.(A)未分化神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y的雙向電泳膠圖(B)維甲酸處理神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y誘導分化后的雙向電泳膠圖等電點由左至右方向pH3-10線性，分子量由上至下方向依次從高到低。
圖3.雙向電泳凝膠局部放大后部分差異點的分析Control代表對照組，RA代表維甲酸處理組。
圖4.差異點C28酶切產(chǎn)物的MALDI-TOF質譜5.(A)差異蛋白點C28一個肽片段(母離子質量916.60)的串聯(lián)質譜圖及分析結果(B)差異蛋白點C28LC-MS/MS串聯(lián)質譜分析檢索結果圖6.半定量RT-PCR(A)和Western印跡(B)檢測NF-M和c-Ret以確定細胞模型可靠性。半定量RT-PCR檢測親環(huán)素A(CypA)分化前后mRNA表達水平。
圖7.從人胎腦文庫中擴增親環(huán)素A，構建到pcDNA3.1/myc-His(-)B真核表達載體中。(A)PCR從人胎腦文庫中擴增親環(huán)素A(B)EcoRI和BamHI雙酶切鑒定圖8.ATRA處理前后不同細胞的形態(tài)學變化A.ATRA處理前未轉染SH-SY5Y細胞，B.ATRA處理后未轉染SH-SY5Y細胞，C.ATRA處理前轉染空載體SH-SY5Y細胞，D.ATRA處理后轉染空載體SH-SY5Y細胞，E.ATRA處理前轉染重組親環(huán)素A的SH-SY5Y細胞，F(xiàn).ATRA處理后轉染重組親環(huán)素A的SH-SY5Y細胞。
圖9.在SH-SY5Y細胞中過表達親環(huán)素A.(A)RT-PCR驗證重組親環(huán)素A(rCypA)的表達1未轉染2轉染空載體3轉染重組的親環(huán)素A(B)在不同處理的幾組SH-SY5Y細胞中檢測幾種蛋白表達。1、3、5泳道分別為維甲酸誘導前的未轉染、轉染空載體和轉染重組的親環(huán)素A；2、4、6泳道分別為維甲酸誘導后的未轉染、轉染空載體和轉染重組的親環(huán)素A(C)不同處理組的SH-SY5Y細胞生長曲線。
實施例在下面的實施例中進一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1.實驗中涉及到的引物

實施例2.全反式維甲酸誘導神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y分化將神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液中，待細胞滿度達到80％時，在培養(yǎng)液中加入全反式維甲酸(ATRA)，至終濃度為10μM，持續(xù)誘導8天。
細胞在顯微鏡下的形態(tài)出現(xiàn)明顯變化貼壁生長的分化前細胞呈梭形，胞體較小，且細胞生長速率較快；維甲酸處理8天以后，基本上所有細胞形態(tài)發(fā)生明顯的神經(jīng)元樣改變，胞體變大變圓，從胞體長出多個神經(jīng)突起，長度可達胞體直徑兩倍以上，類似神經(jīng)元的軸突，同時細胞增殖速率降低甚至部分停止。用純溶劑處理的對照組細胞則沒有明顯的形態(tài)學和生長速率的改變，說明溶劑對SH-SY5Y細胞沒有可觀察到的分化誘導作用，可以用于本實驗研究，見圖1。這和大量的已報道結果相一致，說明本研究的細胞模型中維甲酸可以誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y分化為神經(jīng)元樣細胞。
實施例3.SH-SY5Y誘導分化前后細胞總蛋白雙向電泳分離及差異點分析雙向凝膠電泳利用蛋白質等電點和分子量的差異可以一次性分離復雜蛋白質混合物，其中包含了蛋白質等電點、分子量和表達豐度的相關信息。蛋白質在雙向電泳膠圖中的位置代表了該蛋白質的等電點和分子量，其染色強度則代表該蛋白質的相對表達豐度。本發(fā)明利用雙向凝膠電泳分離維甲酸誘導神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y分化前后的蛋白質并觀察其改變，圖2A是分化前SH-SY5Y細胞總蛋白雙向凝膠電泳分離的膠圖，圖2B是分化后的雙向電泳膠圖。將分化前后的雙向電泳凝膠圖譜用ImageMaster 2D Elite軟件輔助分析，表達豐度差異超過兩倍的蛋白點考慮為差異表達的蛋白質，發(fā)現(xiàn)了共73個差異表達的蛋白點，其中分化前表達較高(也即分化后表達降低)的為51個，用Cn表示(C代表對照組control，n代表原始分析序號)；分化后表達較高(也即分化后表達增加)的22個，用Rn表示(R代表維甲酸處理組retinoic acid，n代表原始分析序號)，這些差異點都在圖2的膠圖中標出。
圖3是對局部膠圖放大后顯示的部分差異點結果。其中C28即為后來質譜鑒定為親環(huán)素A的蛋白點。
附本實驗中使用的部分溶液配方及實驗步驟如下，未提及的按本領域公知的方法進行。
細胞總蛋白提取裂解液8M尿素，4％(w/v)CHAPS，40mM Tris，0.5％IPG buffer(pH3-10)，60mM DTT，0.1mg/ml PMSF。
重泡脹液8M尿素，2％CHAPS，0.5％IPG buffer，50mM DTT。
SDS平衡液50mMTris-HCl(pH8.8)，6M尿素，30％甘油，2％SDS，微量溴酚藍。固定液50％甲醇，5％冰乙酸銀染增敏液30％乙醇，0.2％硫代硫酸鈉，6.8％乙酸鈉。
硝酸銀溶液
0.25％銀染顯色液2.5％碳酸鈉，400ppm 37％甲醛溶液。
銀染終止液40mM EDTA-Na2雙向電泳實驗步驟A.第一向等電聚焦1)從冰箱取出-20℃保存的IPG膠條(18cm長)，室溫放置平衡。
2)蛋白質上樣量為500μg/strip。吸取一定量蛋白質樣品，補加1M DTT 17.5μl，IPG緩沖液3.5μl，補充重泡脹液至350μl，加入0.5μl 0.2％溴酚藍。
3)振蕩混勻樣品，12000g離心1分鐘，轉移混合液至等電聚焦電泳槽。
4)取出一根室溫平衡的IPG膠條，用眼科彎頭鑷子夾住膠條的酸性端(帶箭頭一端)，同時用另一把鑷子剝開并夾緊膠條上的保護膜緩慢向堿性端(平端)剝離。
5)夾住膠條的堿性平端，膠面向下將膠條的酸性尖端放入電泳槽正極端。按住膠條酸性端，將堿性端緩慢向下放，在此過程中多次提起放下，使含樣品的電泳液完全充滿膠條下，并防止氣泡發(fā)生。
6)向放置好膠條的等電聚焦電泳槽中加入覆蓋油，將膠條完全覆蓋，以防止電泳液蒸發(fā)。
7)根據(jù)IPGphor等電聚焦電泳儀上標示的平板電極極性放置好電泳槽，同時跑多根膠條時等間距平行放置，關閉電源上蓋。
8)打開電源，選擇設置好的程序開始等電聚焦過程。

B.第二向SDS-PAGE1)從等電聚焦電泳儀上取下聚焦完成的IPG膠條，裝入含10ml平衡液A(10ml平衡液中加入100mg DTT)的玻璃平衡管，用石蠟膜封口后放于萬向搖床上平衡15分鐘。
2)取出IPG膠條，放入含10ml平衡液B(10ml平衡液中加入250mg碘代乙酰胺)的新平衡管中，石蠟膜封口后置搖床平衡15分鐘。
3)將平衡好IPG膠條的支持膜側向下靠在吸水紙上吸去多余液體，小心將膠條放置在預先制備好的第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠頂部，避免在膠條和二向膠之間產(chǎn)生氣泡。加入0.5％低熔點瓊脂糖溶液以固定膠條位置。
4)與電泳裝置連接的恒溫水浴在開始電泳半小時前提前設置在15℃預冷，待瓊脂糖凝固后，將組裝好的凝膠板放入Bio-Rad Protean II電泳槽，上下槽加入適量電泳緩沖液，選擇恒流模式按照預設的程序(見下表)進行SDS-PAGE分離，直至溴酚藍前沿達到凝膠下緣。

銀染步驟1)固定小心取下電泳完成的2D膠，放入250ml固定液中，水平搖床慢速搖動1小時。棄掉舊固定液，重復固定一次。
2)增敏將固定液換成增敏液，慢速搖動1小時。
3)漂洗MilliQ水漂洗凝膠，每次8分鐘，重復5次。
4)浸銀將凝膠放入250ml 0.25％硝酸銀溶液，慢速搖動1小時。
5)漂洗MilliQ水漂洗凝膠，每次1分鐘，重復3次。
6)顯色加入250ml顯色液，慢速搖動，邊顯色邊觀察。
7)終止顯色程度達到要求時，快速換成終止液，終止顯色反應。慢速搖動1小時。
8)漂洗MilliQ水漂洗凝膠，每次10分鐘，重復兩次。凝膠即可進行掃描分析或保存。
實施例4.差異蛋白的MALDI-TOF鑒定分析將雙向凝膠電泳發(fā)現(xiàn)的差異蛋白點用胰酶消化后，進行MALDI-TOF質譜分析。將這些PMF肽指紋圖在Data Explorer軟件中處理以后得到的肽質量數(shù)據(jù)，用MASCOT搜索引擎(www.matrixscience.com)搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，從73個差異點中得到了40個蛋白質鑒定結果。其中差異點C28的質譜圖(見圖4)可以看出得到了典型的肽質量指紋圖，背景噪音相對信號峰很小，質譜分辨率足以將信號峰的同位素峰分離；數(shù)據(jù)庫檢索結果表明C28代表的蛋白是親環(huán)素A。
附MALDI-TOF實驗步驟1)凝膠點用MilliQ水漂洗3次，每次5分鐘。
2)加入500μl新鮮配制的銀染脫色液，室溫脫色15分鐘。重復脫色2次。
3)MilliQ水漂洗膠點5次，每次5分鐘。
4)盡可能吸盡漂洗水，真空抽干。
5)向干膠點上直接加10μl胰酶消化液(其中含0.5μg胰酶)，4℃水化30分鐘。
6)再加入100μl消化緩沖液，37℃消化過夜(約16小時)。
7)吸出消化液(此時其中含有消化的肽段)，轉移至1.5ml離心管中。
8)加入100μl肽抽提溶液，37℃保溫1小時。
9)合并前兩步的抽提液，真空濃縮抽干。
10)吸取0.5μl基質溶液點在MALDI樣品靶上，在其未干之前立即加入0.5μl樣品或標準品到基質中。
11)室溫下使溶劑揮發(fā)至少15分鐘。然后將樣品靶轉移入質譜儀的真空室中。
12)先用超過離子化閾值較多的激光強度獲得初步質譜，然后降低激光強度同時調整電壓、delayed extraction參數(shù)等使質譜結果優(yōu)化，并用標準品校正質譜儀。
13)重復以上操作，獲取未知樣品的質譜圖，并進一步用質譜圖中的胰酶峰(2163.05，2273.15)做內標校正質譜圖。
銀染脫色液銀染脫色液A為30mM鐵氰酸鉀，銀染脫色液B為100mM硫代硫酸鈉。脫色混合液配制將5×脫色液A(500mM Na2S2O3)50ml與5×脫色液B(150mM鐵氰酸鉀)50ml混合，補水至500ml，混勻備用。(注脫色液應現(xiàn)用現(xiàn)配)實施例5.差異蛋白C28的ESI離子阱質譜鑒定分析從MALDI-TOF分析中鑒定差異蛋白點C28為親環(huán)素A。為了確認MALDI-TOF結果的可靠性，本研究進一步用ESI-離子阱質譜對差異蛋白點C28的胰酶消化產(chǎn)物進行串聯(lián)質譜分析。圖5A是差異點C28一個肽片段的串聯(lián)質譜分析結果。肽斷裂理論圖譜中大多數(shù)b離子和y離子都可以在實際串聯(lián)質譜圖中找到，并且除末端幾個氨基酸以外其它都是連續(xù)的，說明串聯(lián)質譜分析的結果可靠性很高。下面的圖5B中可以看出，從C28串聯(lián)質譜分析中共鑒定出親環(huán)素A的6個肽片段，覆蓋全部氨基酸序列的33.33％，總質量的35.47％。綜合MALDI-TOF MS和LC/MS串聯(lián)質譜分析結果，可以判斷差異蛋白點C28就是親環(huán)素A。上述結果表明該蛋白在誘導分化后表達降低。
附ESI-離子阱質譜實驗步驟將抽干的肽混合物用20μl 0.1％甲酸溶液溶解，0.45μm濾膜過濾。將濾液上到預先平衡的毛細管反相色譜柱上(ThermoHypersil C18，Biobasic，180μm×10cm)進行分析。所用洗脫條件為從5％乙睛/95％水上升到65％乙腈/35％水，50分鐘；在20分鐘內上升到95％乙腈/5％水，保持95％乙腈/5％水洗脫15分鐘。用數(shù)據(jù)依賴掃描模式(data dependent scan mode)進行串聯(lián)質譜分析，每次全掃描(full scan)后進行三次MS/MS(MS/MS scan)掃描。
實施例6.結果驗證質譜鑒定蛋白質的原理是基于概率的搜索結果，因此本發(fā)明進一步用RT-PCR方法對親環(huán)素A的表達進行驗證，比較了蛋白質和mRNA表達水平之間的相關性。結果顯示誘導分化前后親環(huán)素A在mRNA水平和蛋白水平的表達基本一致。然后用半定量RT-PCR和Western印跡方法檢測雙向凝膠電泳中的差異表達蛋白c-Ret和神經(jīng)元特異性表達的中分子量神經(jīng)纖絲蛋白(NF-M)，結果表明誘導分化后c-Ret和神經(jīng)元特異性表達的中分子量神經(jīng)纖絲蛋白(NF-M)表達都增高，從而證明了本研究中細胞模型的可靠性。見圖6，A圖代表半定量RT-PCR結果；B圖代表Western印跡結果。
實施例7.構建親環(huán)素A真核表達載體pcDNA3.1/mycHis(-)B是一種哺乳動物細胞表達載體，本發(fā)明將親環(huán)素A克隆到該載體中，并用重組克隆在細胞中穩(wěn)定過表達親環(huán)素A蛋白，獲得重組克隆pcDNA3.1/mycHis(-)B-CypA。其中pcDNA3.1/mycHis(-)B載體來自于Clonetech公司。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中人親環(huán)素A的mRNA序列設計引物CypA-U2和CypA-D2，表達載體中多克隆位點區(qū)域有EcoRI和BamHI限制酶切位點，而親環(huán)素A的mRNA對應序列中沒有其切點，因此在CypA-U2和CypA-D2的5’端分別加上EcoRI和BamHI限制酶切位點，并去掉終止密碼子與myc標簽融合表達。首先以人胎腦文庫的cDNA為模板，以CypA-U2和CypA-D2為引物，PCR擴增親環(huán)素A，PCR擴增親環(huán)素A的結果見圖7A，擴增的特異性很好，預期PCR產(chǎn)物大小為519bp，在500bp附近有非常強的擴增產(chǎn)物。連接到相應載體中后按本領域公知的方法提取質粒DNA，用EcoRI和BamHI進行雙酶切，酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖(見圖7B)顯示酶切片段在400～600bp之間符合期望大小。
實施例8.構建重組親環(huán)素A穩(wěn)定表達細胞株1)轉染前一天，在6孔板的每個孔中加入約2ml無抗生素培養(yǎng)基，其中含約2～4×105的SH-SY5Y細胞，使之在轉染之前達到90％滿度。
2)用250μl無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋pcDNA3.1/mycHis(-)B-CypA重組質粒DNA，質粒用量為4μg，輕輕混合。
3)使用前輕輕混勻Lipofectamine 2000，用250μl無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋10μlLipofectamine 2000，輕輕混合，室溫放置5分鐘。
4)5分鐘后立即將稀釋DNA和稀釋Lipofectamine 2000合并，輕輕混合并室溫放置20分鐘，以形成DNA-Lipofectamine 2000復合物。
5)將500μl DNA-Lipofectamine 2000復合物加入含細胞和培養(yǎng)基的孔中，搖動培養(yǎng)板使液體混勻。
6)5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24小時。
7)培養(yǎng)24小時后加入G418至終濃度500μg/ml，篩選穩(wěn)定轉染的細胞。連續(xù)用含500μg/ml G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)1周，直至對照未轉染細胞已完全死亡。然后將G418濃度降至200μg/ml，連續(xù)培養(yǎng)3周，得到穩(wěn)定轉染重組質粒的細胞群體。
實施例9.RT-PCR和Western印跡驗證重組親環(huán)素A的表達選擇CypA-U2作為上游引物，載體上重組位點下游的一段序列myc-D作為下游引物，只能從重組載體轉錄出的mRNA上擴增出預期PCR產(chǎn)物(～580bp)；空載體轉錄出的mRNA上因為沒有CypA-U2對應序列，不會有預期PCR產(chǎn)物；而內源性親環(huán)素A的mRNA上因沒有載體上myc-D對應的序列也不能擴增出預期PCR產(chǎn)物。因此這對引物可以用來驗證穩(wěn)定表達克隆是否可以表達重組親環(huán)素A的mRNA。分別提取未轉染的SH-SY5Y細胞、轉染空載體細胞和轉染重組親環(huán)素A細胞的總RNA，用oligo(dT)作引物進行逆轉錄反應得到三組cDNA。然后分別用這三種cDNA作模板，CypA-U2和myc-D作引物進行上述PCR反應。PCR擴增結果見圖9A，從圖中可見只有轉染了重組親環(huán)素A的樣品組有相應的擴增條帶。重組親環(huán)素A的COOH末端融合了載體上的myc標簽，融合蛋白分子量約23kD，可以用抗myc標簽的抗體檢測重組親環(huán)素A的表達，內源性親環(huán)素A沒有myc標簽，不會被標簽抗體檢測到。用ATRA處理未轉染的SH-SY5Y細胞、轉染空載體的細胞和轉染重組親環(huán)素A的細胞，分別提取處理前后的細胞總蛋白，用抗myc標簽抗體檢測重組親環(huán)素A的表達。Western印跡檢測結果見圖9B第一組。結果顯示轉染了重組親環(huán)素A的細胞在維甲酸誘導分化前后都能表達親環(huán)素A蛋白。
實施例10.ATRA處理過表達親環(huán)素A的SH-SY5Y細胞的形態(tài)學改變圖8是三種細胞在ATRA誘導前后的顯微照片，從圖中可以看出，ATRA處理前，細胞呈梭形；經(jīng)ATRA處理后，三種細胞都發(fā)生了明顯的形態(tài)學改變，出現(xiàn)神經(jīng)元樣表型變化，胞體變大變圓，邊緣變得模糊，從胞體發(fā)出若干神經(jīng)突起。表達重組親環(huán)素A的細胞也發(fā)生了相似的形態(tài)學改變，但是從形態(tài)學觀察細胞分化程度比兩組對照細胞稍低。從這些形態(tài)學改變可以推測，重組親環(huán)素A能夠阻礙ATRA誘導的神經(jīng)母細胞瘤分化過程，但不能夠完全抑制分化。
實施例11.Western印跡檢測相關蛋白的表達變化為了進一步檢驗結果的可靠性，用神經(jīng)元特異性蛋白NF-M的抗體和差異表達蛋白c-Ret的抗體檢測這兩種蛋白的表達，從蛋白質水平驗證形態(tài)學觀察的結果。用ATRA分別處理未轉染的SH-SY5Y細胞和兩種分別轉染空載體和重組親環(huán)素A的SH-SY5Y細胞，提取ATRA處理前后這三種細胞的總蛋白，用Western印跡檢測上述兩種蛋白質NF-M和c-Ret的表達(見圖9B)。結果顯示，ATRA處理以后，三種細胞的NF-M表達水平都明顯增加，其中穩(wěn)定表達重組親環(huán)素A的SH-SY5Y細胞中NF-M表達也有增加，差異表達蛋白質c-Ret的表達在三種細胞經(jīng)ATRA處理以后也明顯增加。在前述的形態(tài)學觀察中，穩(wěn)定表達親環(huán)素A的細胞分化程度和對照組細胞相比較低，而此處的Western印跡中，三組細胞經(jīng)ATRA處理后NF-M和c-Ret表達都增加，并無明顯差異。這說明三組細胞都可以進入分化過程，只是分化程度不完全相同，雖然形態(tài)學觀察有一定差異，但因為分化后細胞中都有NF-M和c-Ret表達，這種形態(tài)學上分化程度的差異無法由這兩種蛋白質體現(xiàn)出來。以上結果表明，親環(huán)素A可以阻礙ATRA誘導的分化過程，但并不能完全抑制這一過程。
綜合以上形態(tài)學觀察和Western印跡結果可以看出，過表達重組親環(huán)素A雖然不能完全抑制ATRA誘導神經(jīng)母細胞瘤分化為神經(jīng)元樣細胞，但可以阻礙分化進行的程度。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，過表達重組親環(huán)素A的細胞在ATRA處理以后的生長速率比未轉染細胞和轉染空載體的細胞要高。因此，本研究又用Western印跡檢測了可反映細胞生長速率的特征性蛋白——增殖細胞核抗原(proliferative cell nuclearantigen，PCNA)(見圖9B)，發(fā)現(xiàn)沒有用ATRA處理之前，所有三種細胞中都可以檢測到PCNA表達，兩種對照細胞的PCNA表達量相似，而表達重組親環(huán)素A的細胞中PCNA表達量稍高于對照組，這表明這些細胞的生長速率都很高，處于活躍增殖狀態(tài)；而在ATRA處理之后，三種細胞中PCNA表達都降低，但是降低的程度并不相同，未轉染的細胞和轉染空載體的細胞中PCNA的表達在該實驗條件下檢測不到，而轉染重組親環(huán)素A的細胞中PCNA還有可檢測到的表達水平。從這個結果可以看出，表達重組親環(huán)素A的細胞生長速率高于對照組細胞。
實施例12.細胞生長曲線測定為了驗證Western印跡檢測PCNA的結果，本研究進一步測定不同種類的SH-SY5Y細胞在ATRA誘導分化以后的生長曲線，觀察重組親環(huán)素A是否對SH-SY5Y細胞有生長促進作用。ATRA處理6天以后，分別接種以上三種細胞到6孔板內，每隔24小時對細胞進行計數(shù)。計數(shù)結果見下表5，根據(jù)表中數(shù)據(jù)繪制出細胞生長曲線(見圖9C)。從生長曲線圖可以看出，ATRA處理之后，三種細胞的生長速率都比處理之前顯著降低，未轉染細胞和轉染空載體細胞的生長速率沒有明顯差異，但是轉染重組親環(huán)素A的細胞比另外兩種細胞的生長速率有明顯差異，轉染重組親環(huán)素A的細胞生長速率要快。這和前面Western印跡檢測PCNA以及形態(tài)觀察的結果相一致，表明重組親環(huán)素A可以阻礙SH-SY5Y細胞的分化，保持相對較低的分化程度，從而表現(xiàn)為增殖速率比對照細胞更高。
權利要求
1.人的親環(huán)素A蛋白，其特征在于可以阻礙神經(jīng)母細胞瘤細胞的分化過程并促進細胞增殖，可作為篩選神經(jīng)母細胞瘤診斷標志物及治療藥物的候選分子靶標。
2.根據(jù)權利要求1所述的親環(huán)素A蛋白，其特征在于在維甲酸誘導分化后的神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y中表達降低。
3.根據(jù)權利要求1所述的親環(huán)素A蛋白，其特征在于在維甲酸誘導分化前后的神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y中mRNA和蛋白表達水平基本一致。
4.包括了權利要求1所述的親環(huán)素A蛋白對應核苷酸序列的真核表達載體。
5.包括了權利要求1所述的親環(huán)素A蛋白對應核苷酸序列的真核表達載體pcDNA3.1/myc-His(-)B-CypA。
6.制備重組親環(huán)素A穩(wěn)定表達細胞株的方法，包括用權利要求5所述的表達載體轉染寄主細胞，培養(yǎng)轉化體，抗生素篩選轉化體，獲得重組親環(huán)素A穩(wěn)定表達細胞株。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中寄主細胞是神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y。
8.根據(jù)權利要求1所述的親環(huán)素A蛋白，其特征在于在人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y中過表達可以阻礙維甲酸誘導的該細胞的分化。
9.根據(jù)權利要求1所述的親環(huán)素A蛋白，其特征在于在人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y中過表達對細胞增殖有促進作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白—親環(huán)素A，它可以阻礙神經(jīng)母細胞瘤細胞的分化過程并促進細胞增殖，和所述蛋白的診斷和治療價值。用全反式維甲酸誘導人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH－SY5Y分化并制備細胞總蛋白經(jīng)雙向電泳分離和質譜分析發(fā)現(xiàn)分化后親環(huán)素A表達降低，并用半定量RT－PCR對結果進行了驗證。在SH－SY5Y細胞中過表達親環(huán)素A，再給予維甲酸誘導，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達親環(huán)素A可以阻礙SH－SY5Y細胞的分化過程。PCNA免疫印跡檢測和細胞生長曲線實驗發(fā)現(xiàn)過表達親環(huán)素A的細胞增殖速度增高。結果揭示了親環(huán)素A能阻礙神經(jīng)母細胞瘤細胞的分化過程并促進細胞增殖，可作為篩選神經(jīng)母細胞瘤診斷標志物及治療藥物的分子靶標。
文檔編號C12N15/12GK1869067SQ200510071960
公開日2006年11月29日 申請日期2005年5月27日 優(yōu)先權日2005年5月27日
發(fā)明者花芳, 彭鯤鵬, 彭小忠, 袁建剛, 強伯勤 申請人:中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所